KR20230015331A - 항-cd47 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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용신 렌
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허치슨 메디파르마 리미티드
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Abstract

항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 그의 제조 방법 및 CD47-관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 용도를 제공한다.

Description

항-CD47 항체 및 그의 용도
본원은 2020년 4월 10일자로 출원된 CN 202010282924.0을 기반으로 하고 이에 대한 우선권을 주장하며, 내용 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 항체 및 특히 항-CD47 항체, 및 CD47-관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
CD47(분화 클러스터 47)은 1980년대에 인간 난소암의 종양 항원으로 처음 확인되었다. 인테그린-연관 단백질(IAP), 난소암 항원 OA3, Rh-관련 항원 및 MER6으로도 공지된 CD47은 단일 면역글로불린 유사 도메인 및 5개의 막 스패닝 영역을 갖는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 다중 막 수용체이다. 신호 조절 단백질 α(SIRPα)의 리간드로서, CD47은 SIRPα의 NH2 말단에서 V-유사 도메인에 결합한다. SIRPα는 대식세포, 과립구, 수지상 세포(DC), 비만 세포 및 이들의 전구체, 예를 들어, 조혈 줄기 세포를 비롯한 골수 세포상에서 주로 발현된다. 정상 세포상의 CD47은 대식세포상의 SIRPα에 결합하며, 이는 "나를 먹지 마시오" 신호를 방출 하여 대식세포의 식세포 기능을 억제한다. 이는 대식세포가 선천 면역계에서 자기와 비-자기를 구별하는 중요한 기전이다. CD47은 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 과립구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종(MM), 방광암 및 기타 고형 종양을 비롯한 인간 종양 세포와 조직상에서 널리 발현된다. 종양 세포는 대식세포 표면상의 SIRPα에 대한 고도로 발현된 CD47의 결합을 통해 대식세포의 식세포작용에서 벗어나 종양 성장을 촉진한다. 면역 관문 CD47은, 잠재적으로 유효하며 종양 면역요법에 널리 사용될 수 있는 표적으로 간주된다. 현재 CD47/SIRPα 상호작용을 표적화하는 다양한 특이적인 차단제가 개발되었다. 미만성 거대 B 세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 진행성 고형 종양의 치료를 위한 항-CD47 항체 및 SIRPα 융합 단백질을 포함한 약물과 관련하여 다수의 전임상 및 임상 시험이 수행되고 있다. 이러한 약물은 단독으로 또는 다른 항종양 약물과 함께 투여된다. Forty Seven 사가 개발한 항-CD47 항체 Hu5F9를 예로 들면, 22명의 림프종 환자의 치료에서 Hu5F9의 효과를 평가하기 위한 임상 1상 시험에서, Hu5F9와 리툭시맙의 조합은, 리툭시맙 단독 요법에 반응하지 않은 환자의 50%에서 객관적 관해를 나타낼 수 있었다. 2019년 발표된 임상 데이터에 따르면, Hu5F9와 아자시티딘을 병용투여한 재발성/불응성 급성 골수성 백혈병 환자 14명의 완전 관해율은 최대 36%이고, Hu5F9와 아자시티딘을 병용투여한 골수억제 증후군 환자 11명의 관해율은 최대 55%이다.
본 발명은 항종양 활성이 높고 적혈구의 유의한 응집을 일으키지 않는 신규의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 따라서 본 발명은 보다 많은 임상적 요구를 만족시킬 수 있다.
본 발명은 CD47 또는 그의 단편에 결합하는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 CD47 관련 질환의 치료 방법을 포함하는, 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역(VH)의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개를 포함하는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 VH의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같다.
하나의 태양에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2 및 HCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개를 포함하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 13 또는 17 또는 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역(VL)의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개를 포함하는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VL의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같다.
하나의 태양에서, 본 발명은 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개를 포함하는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 LCDR1은 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 15 또는 18 또는 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역(VH)의 3개의 CDR, 즉, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 가변 영역(VL)의 3개의 CDR, 즉 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VH의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같고, VL의 아미노산 서열은 서열 번호 2, 4, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같다.
일부 구현예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역(VH)의 3개의 CDR, 즉, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 가변 영역(VL)의 3개의 CDR, 즉, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 및 VL은
(1) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(2) 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(3) 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(4) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(5) 서열번호 7에 제시된 방화 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL
중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 13 또는 17 또는 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 15 또는 18 또는 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 1, 3, 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 2, 4, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 1, 3, 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 2, 4, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL은
(1) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(2) 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(3) 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(4) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(5) 서열번호 7에 제시된 방화 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL
중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역은 예를 들어, 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG4 불변 영역, 인간 IgG4P 불변 영역 또는 인간 IgG1TM 불변 영역을 포함한다. 본 발명의 인간 IgG4P 불변 영역은 S228P(EU에 따라 넘버링됨)의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 인간 IgG4이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1TM 불변 영역은 L234F, L235E 및 P331S(EU에 따라 넘버링됨)의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 인간 IgG1 불변 영역이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 κ 또는 λ 불변 영역과 같은 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단클론 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 쥐 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 공통 프레임워크 서열이다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전길이 항체, 단일-도메인 항체, 예를 들어 VHH, Fab, Fab', Fab'-SH, (Fab')2, 단쇄 항체, 예를 들어 scFv, Fv, dAb(도메인 항체) 또는 비스(다중)-특이적 항체이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 임의의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 바람직하게 핵산은 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 벡터 또는 발현 벡터를 제공하며, 여기서 벡터는 본 발명에 의해 제공된 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 재조합 생산에 적합하다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 하나 이상의 핵산, 또는 재조합 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체 또는 면역 융합체를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본 발명에 의해 제공된 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하고, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 약학 부형제, 예를 들어 담체 또는 부형제를 임의로 포함하는, 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 CD47-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 피실험자에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본 발명에 의해 제공된 핵산, 벡터 또는 숙주 세포, 본 발명에 의해 제공된 면역접합체 또는 면역 융합체, 또는 본 발명에 의해 제공된 약학 조성물을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 CD47-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, CD47-관련 질환은 다양한 혈액암 및 고형 종양, 예를 들어 비제한적으로 방광암, 결장직장암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, (악성)흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 자궁내막암, 신장암, (양성)흑색종, 전립선암, 갑상선암, 자궁경부암, 위암 및 간암을 포함한다.
본 발명의 CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 또한, CD47-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 다른 치료제 또는 치료 방식과 병용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 샘플에서 CD47 단백질의 검출, 또는 CD47-관련 질환의 진단/검출에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 구현예의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 그의 임의의 조합을 본원에 기재된 본 발명의 임의의 및 모든 항-CD47 항체 또는 그의 단편, 방법 및 용도에 적용할 수 있다.
도 1은 Raji 세포 표면상의 CD47에 대한 항체 HMA02h14-48의 결합 활성을 나타낸다.
도 2는 Toledo 세포 표면상의 CD47에 대한 항체 HMA02h14-48의 결합 활성을 나타낸다.
도 3은 REC-1 세포 표면상의 CD47에 대한 항체 HMA02h14-48의 결합 친화도를 나타낸다.
도 4는 인간 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용의 차단에서 항체 HMA02h14-48의 활성을 나타낸다.
도 5는 인간 MΦ에 의한 Raji 세포의 식세포작용에 대한 항체 HMA02h14-48의 효과를 나타낸다.
도 6은 인간 MΦ에 의한 Toledo 세포의 식세포작용에 대한 항체 HMA02h14-48의 효과를 나타낸다.
도 7은 인간 MΦ에 의한 REC-1 세포의 식세포작용에 대한 항체 HMA02h14-48의 효과를 나타낸다.
도 8은 인간 MΦ에 의한 HL-60 세포의 식세포작용에 대한 항체 HMA02h14-48의 효과를 나타낸다.
도 9는 시험관내에서 적혈구 응집에 대한 항체 HMA02h14-48의 효과를 나타낸다.
도 10은 인간 적혈구 표면상의 CD47에 결합하는 항체 HMA02h14-48의 능력을 나타낸다.
도 11은 Hu5F9 및 HMA02h14-48에 의한 Toledo 종양 성장의 억제를 나타낸다.
도 12는 Hu5F9 및 HMA02h14-48에 의한 REC-1 종양 성장의 억제를 나타낸다.
본 발명은 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단할 수 있고, 높은 항종양 활성을 가지며, 유의한 적혈구 응집 반응을 유도하지 않는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD47의 발현 억제(예를 들어, 세포 표면상에서 CD47 발현 억제), CD47의 활성 및/또는 신호 전달의 억제, 또는 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용의 차단에서와 같은 억제 활성을 나타낸다. 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체는 CD47(예를 들어 인간 CD47)과의 결합 또는 상호작용 후에 CD47의 발현 또는 활성을 완전히 또는 부분적으로 감소시키거나 조절한다. 항체와 인간 CD47 폴리펩티드 및/또는 펩티드 사이의 상호작용 후에, CD47의 생물학적 기능은 완전히, 유의하게 또는 부분적으로 감소되거나 조절된다. 본원에 기재된 항-CD47 항체와의 상호작용(예를 들어 상기 항체에의 결합)이 없는 CD47 발현 또는 활성 수준과 비교하여, 항-CD47 항체 존재하에서의 CD47 발현 또는 활성 수준은 적어도 95%까지 감소되며(예를 들어 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 감소되며), 이 경우 항체는 CD47의 발현 또는 활성을 완전히 억제할 수 있는 것으로 생각된다. 본원에 기재된 항-CD47 항체와의 상호작용(예를 들어 상기 항체에의 결합)이 없는 CD47 발현 또는 활성 수준과 비교하여, 항-CD47 항체 존재하에서의 CD47 발현 또는 활성 수준은 적어도 50%까지 감소되며(예를 들어 55%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90%까지 감소되며), 이 경우 CD47 항체는 CD47의 발현 또는 활성을 유의하게 억제할 수 있는 것으로 생각된다. 본원에 기재된 항-CD47 항체와의 상호작용(예를 들어 상기 항체에의 결합)이 없는 CD47 발현 또는 활성 수준과 비교하여, 항-CD47 항체 존재하에서의 CD47 발현 또는 활성 수준은 적어도 95% 미만까지 감소되며(예를 들어 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90%까지 감소되며), 이 경우 항체는 CD47의 발현 또는 활성을 부분적으로 억제할 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편 존재 하의 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용 수준을 본원에 기재된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편 부재 하의 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용 수준과 비교시, 본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55% 차단 , 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95% 또는 적어도 99%까지 차단한다.
본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 유의 수준의 세포 응집을 유도하지 않는다, 예를 들어 본 발명의 CD47 항체는 유의 수준의 적혈구 응집을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-CD47 항체 존재하의 적혈구 응집 수준이 종래 기술의 CD47 항체 Hu5F9 존재하의 적혈구 응집 수준과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%까지 감소하는 경우, 이는 본 발명의 CD47 항체가 유의 수준의 적혈구 응집을 유도하지 않음을 가리킨다.
당업계에 공지된 항체와 비교하여, 본 발명에 의해 제공된 항체는 또한 종양 모델에서 유의하게 유효하다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항체는 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 존재하에서 종양 부피는 항체 부재하의 경우와 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%, 또는 100%까지 억제된다. 예를 들어, 본 발명의 CD47 항체의 존재하에서 종양 세포를 포식하는 대식세포의 능력은 종래 기술의 CD47 항체의 존재하에서의 능력과 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 선행 기술 의 CD47 항체의 존재 하에 비해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%까지 증가한다.
본 발명은 또한 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법, 및 암 등을 치료 또는 예방하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
정의
달리 명시되지 않는 한, 본 발명은 당업계의 기술적 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학에서 통상적인 기법을 사용하여 구현될 것이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 과학기술 용어의 일부를 하기와 같이 정의한다. 본원의 다른 곳에서 달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 당업계의 정의 및 용어와 관련하여 전문가에 의한 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)]을 참조할 수 있다. 아미노산 잔기의 약어는, 통상적으로 사용되는 20개의 L-아미노산 중 하나를 지칭하기 위해 당업계에서 사용되는 표준 3-문자 및/또는 1-문자 코드이다. 본원(청구범위 포함)에서 사용된 단수 형태는 달리 명시적으로 명시되지 않는 한, 이에 상응하는 복수 형태를 포함한다.
용어 "약"은 당업자에 의해 측정된 특정 값 또는 조성의 허용 가능한 오차 범위 내의 값 또는 조성을 의미하며, 이는 값 또는 조성이 어떻게 측정 또는 결정되는지에 따른다, 즉, 측정 시스템의 한계에 따른다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내의 범위를 나타낼 수 있다. 대안적으로, "약"은 최대 5%, 10% 또는 20%(즉, ±5%, ±10% 또는 ±20%)의 범위를 지칭할 수 있다.
2개 이상의 선택 항목을 연결하는 데 사용될 때, "및/또는"이라는 용어는 선택 항목 중 어느 하나 또는 선택 항목 중 둘 이상을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "구성하다" 또는 "포함하다"는 언급된 요소, 정수 또는 단계를 포함하는 것을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "구성하다" 또는 "포함하다"라는 용어가 사용될 때, 달리 지시되지 않는 한, 이는 또한 언급된 요소, 정수 또는 단계로 구성된 경우를 포함한다. 예를 들어, 특정 서열을 "포함하는" 항체 가변 영역을 언급할 때, 이는 또한 특정 서열로 구성된 항체 가변 영역을 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어 "인테그린-연관 단백질(IAP)" 또는 "CD47"은 달리 명시되지 않는 한, 포유동물(예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트))을 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CD47을 지칭한다. 이 용어는 또한 "완전길이"의 가공되지 않은 CD47 및 세포내 가공에 의해 생성된 임의의 형태의 CD47 또는 이의 단편을 포함한다. 이 용어는 또한 이어맞추기 변이체 또는 대립유전자 변이체와 같은 CD47의 자연 발생 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, CD47은 인간으로부터의 완전길이 CD47 또는 그의 단편(예를 들어, 신호 펩티드가 결여된 그의 성숙한 단편)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 CD47은 NCBI 수탁 번호 NP_001768.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 일치하는 CD47 또는 그의 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 또한 CD47 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
"SIRPα"는 야생형 신호 조절 단백질 α, 또는 야생형 신호 조절 단백질 α의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 또는 비-재조합 폴리펩티드, 또는 신호 조절 단백질 α의 천연 또는 자연 발생 대립유전자 변이체를 의미한다.
용어 "항-CD47 항체", "항-CD47", "CD47 항체" 또는 "CD47에 결합하는 항체"는 항체가 CD47을 표적화하기 위한 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 CD47 단백질 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-CD47 항체는 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤5 nM, ≤4 nM, ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM, ≤0.9 nM 또는 ≤0.8nM의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전길이 인간 CD47 또는 그의 단편(특히 그의 세포외 결합 단편)에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전길이 CD47 또는 그의 단편을 포함하는 단백질에 결합한다. 일부 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 세포 표면상에서 발현된 CD47 또는 그의 단편에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 상대(예를 들어, 항원) 사이의 모든 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 표현될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 당업계에 공지된 분석의 예는 표면 플라스몬 공명(예를 들어, BIACORE) 또는 유사한 기법(예를 들어, ForteBio)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "CD47-관련 질환"은 CD47의 발현 또는 기능 또는 활성, 또는 CD47에 의해 매개되는 신호 전달의 활성과 관련된 비-생리학적 상태를 지칭하며, 이는 암을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 질환은 CD47-관련 신호 전달의 차단으로부터 이익을 얻을 것이다.
"면역 응답" 또는 "면역 반응"이라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용될 수 있으며, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구의 효과, 및 용해성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함)를 생산하는 상기 세포 또는 간의 효과를 지칭한다. 그 효과는 인체로부터의 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 침습성 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암세포 또는 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 손상, 파괴 또는 제거를 초래한다.
본원에 사용된 용어 "신호 전달"은 CD47이 그의 수용체에 결합하는 것과 같은 단백질-단백질 상호작용에 의해 일반적으로 개시되는 생화학적 인과 관계를 의미하며, 이러한 관계는 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로의 신호의 전송을 유도한다. 일반적으로 전송은 신호 전달을 유발하는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질상의 하나 이상의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기의 특이적인 인산화를 포함한다. 끝에서 두 번째 과정은 일반적으로 핵 사건을 포함하며, 이에 의해 유전자 발현의 변화가 일어난다.
본원에 사용된 용어 "활성" 및 "생물학적 활성" 또는 용어 "생물학적 특성" 및 "생물학적 특징"은 본원에서 호환가능하게 사용되며, 비제한적으로 에피토프/항원 친화도 및 특이성, 생체내에서 또는 시험관내에서 CD47 활성을 중화하거나 길항하는 능력, CD47 활성의 증대 또는 활성화, IC50, 항체의 생체내 안정성 및 항체의 면역원성을 포함한다. 당업계에 공지된 항체의 식별 가능한 다른 생물학적 특성 또는 특징에는 예를 들어 교차 반응성(즉, 일반적으로 표적 펩티드의 비인간 상동체, 또는 다른 단백질 또는 조직과의 교차 반응성), 및 포유동물 세포에서 높은 수준의 항체 발현을 유지하는 능력이 포함된다. 상기에서 언급한 특성 또는 특징은 ELISA, FACS 또는 BIACORE 플라스몬 공명 분석, 시험관내 또는 생체내 중화 분석, 사이토카인 또는 성장 인자의 수용체 결합, 생성 및/또는 분비, 신호 전달 및 다양한 공급원(인간, 영장류 또는 임의의 다른 공급원 포함)으로부터의 조직 섹션의 면역조직화학을 포함하여, 당해 분야에 주지된 기법을 사용하여 관찰되거나, 측정되거나 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 바람직한 생물활성을 갖는 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 따라서, 상기는 비제한적으로, 단클론 항체(완전길이 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, CrossMab 항체, 또는 카멜화된 단일-도메인 항체를 포함하여, 가장 광범위한 의미로 사용된다.
용어 "완전 항체", "완전길이 항체", 및 "온전한 항체"는 본원에서 호환가능하게 사용되며 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역(이하 VH로 약칭함)과 중쇄 불변영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(이하 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 영역 및 VL 영역은 고가변 영역(상보적 결정 영역(CDR)임)으로 추가 세분될 수 있으며, 그 사이에 보다 보존적인 영역(프레임워크 영역(FR)임)이 산재되어 있다. "상보성 결정 영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "CDR"은 서열이 고가변성이고 구조적으로 확립된 루프("고가변 루프")를 형성하고/하거나 항원 접촉 잔기("항원 접촉점")를 함유하는 항체 가변 도메인 중의 한 영역이다. CDR은 주로 항원 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 중쇄 및 경쇄의 CDR은 일반적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라 지칭되는데, 이들은 N-말단으로부터 순차적으로 넘버링된다. 항체 중쇄 가변 도메인에 위치한 CDR을 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이라고 하고, 항체 경쇄 가변 도메인에 위치한 CDR을 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이라고 한다. 각각의 VH 또는 VL은 아미노 말단에서 카복실 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 불변 영역은 항체가 항원에 결합하는 데 직접적으로 관여하지 않지만 다중 효과기 기능을 나타낸다.
주어진 VH 또는 VL 아미노산 서열에서, 각 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 예를 들어 하기를 포함하는 다양한 주지된 방식 또는 이들의 조합을 사용하여 결정될 수 있다: Chothia 방식(Chothia et al., Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)); Kabat 방식(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)), AbM(University of Bath) 및 Contact(University College London); North 방식(North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)). 본 발명에서 항-CD47 항체의 CDR의 경계는 당업계의 임의의 방식 또는 이들의 조합 및 개인 평가에 따라 결정될 수 있다.
항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 두 가지 유형(카파(κ) 및 람다(λ)라고 함) 중 하나로 분류될 수 있다. 항체의 중쇄는 그의 중쇄 불변 영역에 따른 아미노산 서열에 따라 크게 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 유형으로 분류될 수 있으며, 이 중 몇 가지 유형은 다시 하위부류, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다.
"IgG 형태의 항체"는 항체의 중쇄 불변 영역의 IgG 형태를 지칭한다. 예를 들어, IgG4 형태의 항체는 그의 중쇄 불변 영역이 IgG4로부터 유래됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다, 즉, 집단을 구성하는 다양한 항체가, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 에피토프에 대해 지시된다. 대조적으로, 통상적인(다클론) 항체 제제는 일반적으로 상이한 에피토프에 대해 지시되는(또는 상이한 에피토프에 대해 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 수식어 "단클론"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내며, 항체를 생성시키기 위해 임의의 특정 방법이 요구되는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편"은 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 일반적으로, 항원-결합 단편은 항체의 항원-결합 영역 또는 가변 영역의 적어도 하나의 단편(예를 들어, 하나 이상의 CDR)을 포함하고, 항체의 결합 특성 중 적어도 일부를 유지한다. 항원-결합 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, sc-Fv); 및 항체 단편으로부터 형성된 나노바디 및 다중특이적 항체를 포함한다. 항원-결합 활성이 몰 농도 기준으로 발현되는 경우, 결합 단편 또는 유도체는 일반적으로 이들이 유래하는 항체의 항원-결합 활성의 적어도 10%를 유지한다. 바람직하게는, 결합 단편 또는 유도체는 이들이 유래된 항체의 항원 결합 활성의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상을 유지한다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 그의 생물학적 활성을 유의하게 변화시키지 않는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있는 것으로 예상된다(항체의 "보존된 변이체" 또는 "기능적으로 보존된 변이체"로 지칭됨). 바람직한 태양에서, 보존적 치환은 하기 표 A에 나타낸 보존적 치환 잔기, 바람직하게는 표 A에 나타낸 바람직한 보존적 아미노산 치환 잔기로부터 유래된다.
[표 A]
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에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비-연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편"은 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 정제된 상태를 지칭한다. 예를 들어, "단리된"은 분자에 핵산, 단백질, 지질, 당, 또는 세포 파편 및 생육 배지와 같은 기타 물질과 같은 다른 생물분자가 실질적으로 없음을 의미할 수 있다. 그러나, 당업자에게 공지된 바와 같이, 용어 "단리된"은 본원에 기재된 항체의 실험적 또는 치료학적 적용을 유의하게 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 이러한 물질의 완전한 부재 또는 수, 완충액 또는 염의 부재를 의미하지 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과의 순도를 가질 수 있으며, 이 순도는 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정된다. 항체 순도를 평가하는 방법에 대한 검토는 예를 들어 문헌[Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87]을 참조하시오.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 제1 항체의 가변 도메인 및 제2 항체의 불변 도메인을 갖는 항체를 지칭하며, 여기서 제1 항체 및 제2 항체는 상이한 종으로부터 유래된다. 일반적으로 가변 도메인은 설치류와 같은 실험 동물의 항체로부터 획득되는 반면, 불변 도메인 서열은 인간 항체로부터 획득되며, 따라서 획득된 키메라 항체는 실험 동물로부터의 항체보다 인간 피실험자에서 불리한 면역 반응을 덜 유도할 듯 하다.
본원에 사용된 용어 "인간화된 항체"는 인간 및 비-인간(예를 들어, 마우스, 래트) 항체로부터의 서열을 함유하는 항체 형태를 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 고가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 프레임워크(FR) 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 임의로 포함할 수 있다. 일부의 경우에, 당업자에게 공지된 바와 같이, 아미노산 돌연변이는, 예를 들어 항체의 특정한 성질을 개선시키기 위해 인간화된 항체(예를 들어, 가변 도메인, 프레임워크 영역 및/또는 불변 영역(존재하는 경우))에 도입되며; 이러한 항체 형태는 여전히 본 발명의 "인간화된 항체"의 범위에 속한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 항체는 항체를 생성하기 위한 세포의 당 쇄를 가질 수 있다. 예를 들어, 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포에서 유래된 하이브리도마에서 생성되는 경우, 항체는 마우스 당 쇄를 포함할 수 있다. 대안적으로, 래트, 래트 세포 또는 래트 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생성되는 경우, 항체는 래트 당 쇄를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 천연 서열 Fc 영역은 다양한 Ig 하위유형 및 그의 동종이계 Fc 영역과 같은 다양한 자연 발생 면역글로불린 Fc 서열을 포함한다(Gestur Vidarsson et al., IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions, 20 October 2014, doi: 10.3389/fimmu.2014.00520.). 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄의 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실 말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단에 리신(Lys447)이 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라고도 함)에 따라 넘버링된다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역 변이체" 또는 "변이체 Fc 영역"은 본원에서 호환가능하게 사용되며, 천연 서열의 Fc 영역에 대해 변형된 Fc 영역이 포함됨을 의미한다. 본 발명의 Fc 영역 변이체는 아미노산을 구성하는, 아미노산에 대한 아미노산 변형에 따라 정의된다.
"약학적 부형제"라는 용어는 활성 물질과 함께 투여되는 희석제, 항원보강제(예를 들어, 프로인트 항원보강제(완전 및 불완전)), 부형제, 담체 또는 안정제 등을 지칭한다.
"약학 조성물"이라는 용어는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 조성물이 투여되는 피실험자에게 허용할 수 없는 독성을 갖는 추가 성분을 포함하지 않는 그러한 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 "면역접합체"는 세포독성제 또는 표지를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 다른 물질에 접합된 항체이다. "면역 융합체"는 하나 이상의 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 공유 결합에 의해 융합된 항체이다.
본원에 기재된 용어 "치료제"는 암과 같은 관련 질환의 예방 또는 치료에 유효한 모든 물질을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포사 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다.
"화학요법제"는 암 또는 면역계 질환의 치료에 유용한 화학적 소분자 약물을 포함한다.
"소분자 약물"이라는 용어는 생물학적 과정을 조절할 수 있는 저분자량의 유기 화합물을 지칭한다. "소분자"는 분자량이 10 kD 미만, 일반적으로 2 kD 미만, 바람직하게는 1 kD 미만인 분자로 정의된다. 소분자는 무기 분자, 유기 분자, 무기 성분을 함유하는 유기 분자, 방사성 원자를 함유하는 분자, 합성 분자, 펩티드 모방체 및 항체 모방체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치료제로서 소분자는 큰 분자보다 세포 침투에 더 뛰어나고 분해에 덜 민감하며 면역 반응을 촉발할 가능성이 적다.
본원에 사용된 용어 "면역조절제"는 면역 반응을 조절(억제 또는 강화)하는 천연 또는 합성 활성제 또는 약물을 지칭한다. 면역 반응은 체액성 반응 또는 세포성 반응일 수 있다. 면역조절제에는 면역억제제가 포함된다. 일부 구현예에서, 면역조절제는 면역 반응을 향상시키는 활성제 또는 약물, 예를 들어 암 치료에서 항암 면역 반응을 향상시키는 데 유익한 활성제 또는 약물을 포함한다.
본원에 사용된 "면역억제제", "면역억제 약물" 또는 "면역-억제제"는 면역억제 요법에서 면역계 활성을 억제 또는 예방하기 위한 치료제이다.
용어 "암종" 및 "암"은 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 장애를 기술하거나 설명한다. 이 정의에는 양성 및 악성 암과 휴지기 종양 또는 미세전이가 포함된다. "암"에는 고형 종양 및 혈액암이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 다양한 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 형질전환(즉, 숙주 세포 내로 이종 DNA의 도입) 목적으로 사용될 수 있는 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드 구성물을 지칭한다. 벡터의 한 유형은, 원형 이중 가닥 DNA 루프인 "플라스미드"이며, 이를 통해 추가적인 DNA 분절을 루프에 결찰시킬 수 있다. 벡터의 또 다른 유형은, 추가적인 DNA 분절을 게놈에 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 세균 복제 기원을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 일부 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 안내할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 발현 벡터는 벡터가 숙주 세포에 형질전환, 형질감염 또는 형질도입될 때 표적 유전자를 복제하여 발현할 수 있는 핵산을 지칭한다. 발현 벡터는 벡터 유지를 보장하고 필요한 경우 숙주에서 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기원을 포함한다.
본원에서 "피실험자" 또는 "환자" 또는 "개인"이라는 용어는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. "비-인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 용어 "치료 유효량", "치료 유효 용량" 및 "유효량"은, 세포, 조직 또는 피실험자에게 단독으로 또는 다른 치료 약물과 함께 투여했을 때 하나 이상의 질환 또는 상태의 증상 또는 질환 또는 상태의 발달을 유효하게 예방하거나 개선하는 본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 또한 증상의 개선을 생성시키기에 충분한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양, 예를 들어 관련된 의학적 상태를 치료, 치유, 예방 또는 개선하거나 또는 이와 같은 상태의 치료, 치유, 예방 또는 개선 속도를 증가시키기에 충분한 양을 지칭한다. 활성 성분만을 개인에게 투여하는 경우, 치료 유효량은 단지 그 성분만을 의미한다. 병용투여시 치료 유효량은 병용투여, 순차투여 또는 동시투여에 관계없이 치료 효과에 기여하는 유효 성분의 종합적인 양을 지칭한다. 치료제의 유효량은 진단 기준 또는 매개변수를 적어도 10%, 일반적으로 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 증가시킬 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 1) 진단된 병리학적 상태 또는 질환의 증상을 치유, 완화 및 경감시키고/시키거나 진단된 병리학적 상태 또는 질환의 진행을 정지시키는 치료학적 조치, 및 2) 병리학적 상태 또는 질환의 발달을 예방 및/또는 완화하는 예방 또는 예방적 조치를 포함한다. 따라서, 치료를 받는 피실험자에는 질환을 앓은 적이 있는 개인, 질환에 걸리기 쉬운 개인, 및 질환을 예방하고자 하는 개인이 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 치료에 관한 것이다. 일부 다른 구현예에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 예방에 관한 것이다.
본 발명에 따른 일부 구현예에서, 질환 또는 상태의 "치료"는 질환 또는 상태의 개선(즉, 질환 또는 그의 임상 증상 중 적어도 하나의 진행의 완화 또는 예방 또는 감소)을 지칭한다. 일부 다른 구현예에서, "치료"는 환자가 식별할 수 없는 물리적 매개변수를 포함하는 적어도 하나의 신체 매개변수를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다. 일부 다른 구현예에서, "치료"는 물리적으로(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리학적으로(예를 들어, 신체 매개변수의 안정화), 또는 둘 다에 따른 질환 또는 상태의 조절을 지칭한다. 질환의 치료 및/또는 예방을 평가하는 방법은 본원에 명시적으로 기술되지 않는 한 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 질환 또는 상태의 "예방"은 질환 또는 상태 또는 특정 질환 또는 상태의 증상의 발생 또는 발달의 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 암의 가족력이 있는 피실험자는 예방적 섭생의 후보이다. 일반적으로, 암과 관련하여, 용어 "예방"은 특히 암 위험이 있는 피실험자에서 암의 상태 또는 증상이 발병하기 전에 피실험자에게 약물을 투여하는 것을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 암을 "치료"한 후, 개인이 하기 중 하나 이상을 나타내는 경우 개별 환자는 성공적으로 치료된 것으로 간주된다: 암세포의 수가 감소하거나 암세포가 완전히 사라졌다; 종양 크기가 감소하였다; 말초 기관내로의 암세포의 침윤, 예를 들어 연조직 및 뼈로의 암세포의 확산이 억제되거나 없다; 종양 전이가 억제되거나 없다; 종양 성장이 억제되거나 없다; 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상이 완화되었다; 발병률과 사망률이 감소하였다; 삶의 질이 향상되었다; 종양 발생률, 빈도 또는 종양 발생성이 감소하였다; 종양 중 암 줄기 세포의 수 또는 빈도가 감소하였다; 종양 세포가 비-종양형성 상태로 분화하였다; 또는 이들 효과 중 일부의 조합.
"종양 성장의 억제"는 종양 세포 성장이 억제될 수 있는 임의의 기전을 지칭한다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 증식을 지연시킴으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 증식을 중지시킴으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포를 사멸시킴으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 세포자멸사를 유도함으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 분화를 유도함으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포에서 영양분을 박탈함으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 이동을 방지함으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 침입을 방지함으로써 억제된다.
본원에 사용된 바와 같이, "서열 일치성"은 비교 창에서 비교되는 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산에 기초한 서열의 일치성 정도를 의미한다. "서열 일치성 (백분율)"은 하기와 같이 계산될 수 있다: 비교 창에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 2개 서열 중 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)를 갖는 위치의 수를 측정하여 합치하는 위치의 수를 획득하고, 합치하는 위치의 수를 비교 창의 전체 위치 수(즉, 창 크기)로 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 일치성의 백분율을 산출한다. 서열 일치성의 백분율을 결정하기 위한 목적을 위한 최적의 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계에 공지된 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 서열의 완전길이 또는 비교되는 표적 서열 영역에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬에 적합한 매개변수를 결정할 수 있다. 본 발명에서 항체 서열의 경우, 후보 항체 서열을 참조 항체 서열과 최적으로 정렬한 후, 바람직한 구현예에서 kabat 넘버링 규칙에 따라 최적 정렬을 수행함으로써 아미노산 서열의 일치성 백분율을 결정한다.
본원에 사용된 용어 "응집"은 세포 응집을 의미하고, 용어 "혈구응집"은 특정 부류의 세포(즉, 적혈구)의 응집을 의미한다. 따라서 혈구응집은 일종의 응집이다.
본원에서 대조용 항체 "Hu5F9"는 특허 US 2015/0183874 A1에 개시된 5F9의 가변 영역 서열에 상응하는, GenScript에 의한 재조합 발현에 의해 형성된 IgG4P 형태의 항-CD47 항체이다. 대조용 항체 "SRF231"은 특허 US 20180201677 A1에 개시된 2.3D11의 가변 영역 서열에 상응하는, GenScript에 의한 재조합 발현에 의해 형성된 IgG4P 형태의 항-CD47 항체이다.
항-CD47 항체 및 그의 생성
본 발명의 항체는 항체를 생성하기 위한 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 임의의 적합한 형태의 CD47은 항체를 생성하기 위한 면역원(항원)으로서 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 임의의 CD47 변이체 또는 그의 단편이 면역원으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 쥐 단클론 항-인간 CD47 항체를 생성하는 하이브리도마 세포는 당업계에 주지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법에는 문헌[Kohler et al., (1975)(Nature 256: 495-497)]에 의해 최초로 개발된 하이브리도마 기법이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 표준 프로토콜에 따라, 마우스 비장 세포를 단리하고 PEG 또는 전기 융합에 의해 마우스 골수종 세포주와 융합시켰다. 이어서, CD47 결합 활성을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 스크리닝하였다. 본 발명의 하이브리도마 세포의 면역글로불린 가변 영역의 DNA 서열을 축퇴 프라이머 PCR에 기초한 방법에 의해 검출할 수 있다.
설치류(예를 들어, 마우스)로부터의 항체는 생체내에서 치료 약물로 사용될 때 원치 않는 항체 면역원성을 유발할 수 있다. 반복 사용은 인간의 치료 항체에 대한 면역 반응을 일으킨다. 이러한 종류의 면역 반응은 적어도 치료 효능의 상실을 초래할 것이며, 심한 경우 잠재적으로 치명적인 알러지 반응을 유발할 것이다. 설치류 항체의 면역원성을 감소시키는 한 가지 방법은, 마우스 항체 가변 영역이 인간 불변 영역과 융합된 키메라 항체의 생성을 포함한다(Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-43). 그러나, 키메라 항체에서 온전한 설치류 가변 영역의 유지는 여전히 환자에게 유해한 면역원성을 유발할 수 있다.
설치류 가변 영역에서 인간 프레임워크로의 CDR 이식(즉, 인간화)이 설치류 서열을 더욱 최소화하기 위해 사용되었다. 본 발명의 인간화된 항체의 경우, 쥐 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 생식세포계열 프레임워크에 삽입할 수 있다. Winter 등의 미국특허 제 5,225,539 호 및 Queen 등의 미국특허 제 5,530,101 호; 미국특허 제 5,585,089 호; 미국특허 제 5,693,762 호 및 미국특허 제 6,180,370 호를 참조하시오. 그러나 CDR 루프 교환은 원래 항체와 동일한 결합 특성을 가진 항체를 생성시킬 수 없다. 인간화된 항체에서는 항원 결합 친화도를 유지하기 위해 프레임워크 잔기(FR)(CDR 루프의 지지에 관여하는 잔기)를 추가로 변경해야 하는 경우가 종종 있다. 문헌[Kabat et al. (1991) J. Immunol. 147: 1709]. 간단히, 인간화된 형질전환 과정은 하기의 단계를 수반한다: A. 각 후보 항체의 유전자 서열을 인간 배아 항체의 유전자 서열과 정렬시켜 높은 상동성을 갖는 서열을 찾는 단계; B. HLA-DR 친화도를 분석하고 조사하여 친화도가 낮은 인간 배아 프레임워크 서열을 선택하는 단계; C. 컴퓨터 시뮬레이션 기술과 분자 도킹을 이용하여 가변 영역과 그 주변 영역의 프레임워크 아미노산 서열을 분석하고, 이들의 공간적 입체 결합 방식을 조사하는 단계. 정전기력, 반 데르 발스력, 친수성 및 엔트로피를 계산하여, CD47과 상호작용하고 후보 항체 유전자 서열에서 공간적 프레임워크를 유지할 수 있는 주요 아미노산 개체를 분석하고, 이를 선택된 인간 배아 유전자 프레임워크에 다시 이식하고, 이를 기반으로 확보해야 하는 프레임워크 영역 중의 아미노산 위치를 표시하고 인간화된 항체를 합성한다.
본 발명의 항체의 가변 영역 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계를 Kabat, Chothia, AbM, Contact 또는 North와 같은 다수의 주지된 방식 중 어느 하나를 사용하여 결정할 수 있다. 상이한 정의 시스템에 의해 획득된 동일한 항체의 가변 영역의 CDR의 경계가 상이할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 즉, 상이한 할당 시스템에 의해 정의된 동일한 항체의 가변 영역의 CDR 서열은 상이하다. 따라서, 본 발명에서 정의된 바와 같은 특정 CDR 서열을 갖는 항체를 정의하는 경우, 항체의 범위는 또한 특정 CDR 서열을 포함하는 가변 영역 서열을 갖는 항체도 포함한다. 그러나, 상이한 방식(예를 들어, 상이한 할당 시스템 또는 조합)의 적용으로 인해, 청구된 CDR 경계는 본 발명에서 정의된 바와 같은 특정 CDR 경계와 상이하다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 분자의 CDR 경계는 Kabat 할당 시스템에 기반하여 결정된다.
상이한 특이성(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 결합 부위)를 갖는 항체는 상이한 CDR을 갖는다. 그러나 CDR은 항체마다 다르지만, CDR 중 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원-결합에 직접 관여한다. 최소 중첩 영역을 항원 결합을 위한 "최소 결합 단위"를 제공하기 위해 Kabat, Chothia, AbM 및 North 방법 중 2개 이상을 사용하여 결정할 수 있다. 최소 결합 단위는 CDR의 하위 집합일 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 나머지 CDR 서열의 잔기는 항체의 구조 및 단백질 폴딩에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 제시된 CDR의 임의의 변이체를 고려한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR 변이체에서, 최소 결합 단위의 아미노산 잔기는 변경되지 않은 채로 남아 있을 수 있는 반면, Kabat 또는 IMGT에 따라 정의된 CDR의 나머지의 잔기는 보존적 아미노산 잔기로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2 및 HCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개를 포함하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열과 일치하거나 서열번호 11의 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 갖고, HCDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열과 일치하거나 서열번호 12의 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 갖고, HCDR3은 서열번호 13 또는 서열번호 17 또는 서열번호 21의 아미노산 서열과 일치하거나 서열번호 13 또는 서열번호 17 또는 서열번호 21의 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), LCDR2 및 LCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개를 포함하고, 여기서 LCDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열과 일치하거나 서열번호 14의 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 갖고, LCDR2는 서열번호 15 또는 서열번호 18 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 일치하거나 서열번호 15 또는 서열번호 18 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 갖고, LCDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열과 일치하거나 서열번호 16의 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한, 그의 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR에, 본원에 구체적으로 개시된 3개의 CDR에 비해 총 하나 이상 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 포함하고/하거나, 그의 경쇄 가변 영역의 3개의 CDR에, 본원에 구체적으로 개시된 3개의 CDR에 비해 총 하나 이상 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한, 본원에 구체적으로 개시된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역과 비교하여, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 하나 이상(바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하)의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 아미노산 보존적 치환)가 존재하고, 바람직하게는 아미노산 변화가 CDR 영역에서는 발생하지 않는, 상기와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 1, 3, 5, 6 또는 7 중에서 선택된 아미노산 서열과 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 2, 4, 8, 9 또는 10 중에서 선택된 아미노산 서열과 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 아미노산 변화는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 아미노산 변화는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 아미노산 변화는 CDR 외부 영역(예를 들어, FR)에서 발생한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 아미노산 변화는 중쇄 가변 영역 외부 및/또는 경쇄 가변 영역 외부 영역에서 발생한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역에서 발생한다.
일부 구현예에서, 아미노산 변화를 포함하는 본 발명의 항체는 본원에 개시된 특이적 항체에 필적하거나 또는 이에 유사한 특성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-CD47 항체는 CDR, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄 또는 중쇄에 대한 번역-후 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체는 완전길이 항체, 단일-도메인 항체, 예를 들어 VHH, Fab 항체, Fab' 항체, Fab'-SH, (Fab')2 항체, 단쇄 항체, 예를 들어 scFv, Fv, dAb(도메인 항체) 또는 비스(다중)-특이적 항체이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체는 IgG 형태의 임의의 항체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 형태의 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-CD47 항체는 IgG4P 형태의 항체이다, 즉 변형, Ser228Pro(S228P, EU에 따라 넘버링됨)가 쇄 변화를 피하거나 감소시키기 위해 인간 IgG4 불변 영역의 힌지 영역에서 수행된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명에 의해 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 함유하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역)을 포함할 수 있으며, 예를 들어 FcγR에 대한 결합을 향상시키거나 감소시키고 상응하는 기능을 향상시키거나 감소시키기 위한 다수의 인간 IgG1에 대한 변형이 문헌[Bruhns and Jφnsson published in Immunol Rev. 2015 Nov; 268 (1): 25-51, page 44]의 기사에 요약되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체는, 감소되거나 결핍된 FcγR 결합 활성을 갖는 Fc 영역 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역 변이체는 아미노산 치환을 갖고, 특히 아미노산 치환은 면역글로불린 중쇄의 위치 E233, L234, L235, N297, 및 P331에서의 다른 아미노산 치환 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, Fc 영역 변이체의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체의 글리코실화 정도를 증가 또는 감소시키도록 변형된다. 항체의 글리코실화 부위의 추가 또는 결실은 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위를 생성 또는 제거하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 글리코실화를 변화시킬 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있으며, 이는 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거함으로써 이 부위에서 글리코실화를 제거한다. 이 글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 미국특허 제 5,426,300 호에 기재되어 있다. 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 사카라이드를 변화시킬 수 있다. 일부 적용에서, 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC) 기능을 개선시키기 위해 푸코스 모듈을 제거하는 것과 같이, 원하지 않는 글리코실화 부위를 제거하는 변형이 유용하다. 다른 적용에서, 갈락토실화 변형이, 보체-의존적인 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체를, 당업계에 공지되어 있고 용이하게 입수가능한 추가의 비-단백질 부분을 포함하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 비-단백질 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디알칸, 폴리-1,3,6-트리알칸, 에틸렌/무수말레산 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항체 발현
본 발명은 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 본 발명의 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생성시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 숙주 세포를 배양하고, 항체 또는 항원-결합 단편을 정제하고 회수하는 것을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 임의의 상기 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 기재된 중쇄, 경쇄, 가변 영역 또는 상보성 결정 영역을 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 태양에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 19에 제시된 바와 같은 핵산에 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는다. 일부 태양에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 20에 제시된 바와 같은 핵산에 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는다.
하나의 태양에서, 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터의 선택은 상기 벡터를 발현시키고자 하는 숙주 세포에 의존한다. 일반적으로, 발현 벡터는 항-CD47 항체 쇄 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 기타 조절 서열(예를 들어, 인핸서)을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 항체 불변 영역을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 PTT5 벡터 또는 pCDNA 벡터, 예를 들어 pCDNA3.4이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함하여, 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현하는데 사용될 수 있는 원핵생물 숙주이다. 다른 적합한 미생물 숙주는 바실러스, 예를 들어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예를 들어 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas)를 포함한다. 이들 원핵생물 숙주에서, 일반적으로 숙주 세포와 양립할 수 있는 발현 조절 서열(예를 들어, 복제 기원)을 포함하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 포유동물 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 항-CD47 항체 폴리펩티드를 발현 및 생성시킨다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주, 또는 정상 인간 세포, 또는 불멸화된 동물 또는 인간 세포를 포함하는 외인성 발현 벡터를 갖는 포유동물 세포주일 수 있다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, Expire293 세포, HEK293 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마를 포함하여 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다.
하나의 태양에서, 본 발명은 항-CD47 항체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입시키고, 숙주 세포를 충분한 시간 동안 배양함으로써 숙주 세포에서 항체가 발현되게 하거나, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하여 항체를 생산하는 배지에 항체를 분비시킴을 포함한다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지에서 항체를 회수할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 제조된 항체 분자를 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등과 같은 공지된 이용가능한 기법에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은 또한, 순전하, 소수성 및 친수성과 같은 인자에 따라 변하며, 이는 당업자에게 자명하다. 본 발명의 항체 분자의 순도를 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 등을 포함하는 다양한 주지된 분석 방법에 의해 측정할 수 있다.
상이한 세포주에 의해 발현되거나 트랜스제닉 동물에서 발현되는 항체는 서로 상이한 글리코실화를 가질 가능성이 있다. 그러나, 본원에 제공된 핵산에 의해 암호화되거나 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체가, 항체의 글리코실화와 상관없이, 본 발명의 구성요소이다.
측정 방법
본원에 제공된 항-CD47 항체의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성을 당업계에 공지된 다양한 측정 방법에 의해 확인, 스크리닝 또는 특성화할 수 있다. 하나의 태양에서, 본 발명의 항체의 항원-결합 활성을 예를 들어 ELISA 및 웨스턴 블롯과 같은 공지된 방법에 의해 시험한다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 CD47에 대한 결합을 측정할 수 있으며, 예시적인 방법이 본원에 개시되어 있다.
본 발명은 또한 생물학적 활성을 갖는 항-CD47 항체를 확인하기 위한 측정 방법을 제공한다. 생물학적 활성은 예를 들어, CD47에 대한 결합(예를 들어, 인간 CD47에 대한 결합), 세포 표면상의 CD47에 대한 결합, 그의 리간드에 대한 CD47의 결합 차단, 적혈구 응집 촉진 활성에 대한 효과, 및 인간 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용에 대한 효과 등을 포함할 수 있다. 또한, 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체를 이러한 생물학적 활성에 대해 시험한다.
상기 언급된 임의의 시험관내 측정 방법에 사용하기 위한 세포는, CD47을 자연적으로 발현하거나 또는 CD47을 발현하도록 조작된 세포주, 예를 들어 종양 세포주를 포함한다. 이러한 세포는 또한 CD47을 발현하는 세포주 및 비정상적인 상황에서 CD47을 발현하는 CD47을 암호화하는 DNA로 형질감염된 세포주를 포함한다.
본 발명의 면역접합체 또는 면역융합체를, 항-CD47 항체를 대체하거나 보충하여 상기에 언급된 임의의 측정 방법을 수행하는 데 사용할 수 있음을 이해할 수 있다.
항-CD47 항체 및 기타 활성제의 조합을 사용하여 상기 언급된 임의의 측정 방법을 수행할 수 있음을 이해할 수 있다.
면역접합체 및 면역융합체
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 임의의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 기타 물질을 포함하는 면역접합체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 기타 물질은 예를 들어 세포에 유해한 임의의 작용제를 포함하는 세포독성제이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 면역 융합체를 제공한다.
일부 구현예에서, 면역접합체 및 면역융합체는 CD47-관련 질환의 예방 또는 치료에 사용된다.
약학 조성물
"약학 조성물"이라는 용어는 그 안에 함유된 활성 성분이 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태로 존재하게 하고 제제/제형이 투여되는 피실험자에게 허용할 수 없는 독성을 갖는 추가적인 성분을 함유하지 않는 바와 같은 제제/제형을 지칭한다.
"약학적 부형제"라는 용어는 치료제와 함께 투여되는 약학적 담체, 희석제, 항원보강제(예를 들어, 프로인트 항원보강제(완전 및 불완전)) 또는 부형제를 지칭한다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항체 및 약학적 부형제를 포함할 수 있다. 이들 약학 조성물은 진단 키트와 같은 키트에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적 담체"는 생리학적으로 양립가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 본 발명에 적합한 약학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어 수 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 약학 조성물이 정맥내 투여되는 경우 바람직한 담체는 수이다. 특히 주사용 용액의 경우, 염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 액체 담체로서 또한 사용할 수 있다.
적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 디올, 수, 에탄올 등을 포함한다. 부형제의 적용 및 그의 용도에 대해서, 또한 문헌["Handbook of Pharmaceutical Excipients", fifth edition, R.C. Rowe, P.J. Seskey and S.C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago]을 참조하시오. 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 작용제 등의 형태일 수 있다. 경구 제형은 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
본 발명은 CD47 또는 그의 항원-결합 단편에 결합하는 하나 이상의 단클론 항체, 및 본 발명의 핵산, 벡터 또는 숙주 세포, 또는 면역접합체 또는 융합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포, 또는 면역접합체, 또는 융합체, 또는 약학 조성물을 개선된 이동, 전달, 허용성 등을 제공하기 위해서, 공-투여용 제제에 적합한 약학적 담체, 부형제 및 기타 시약과 통합시킬 수 있다.
본원에 기재된 항-CD47 항체를 포함하는 약학 제제/제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 하나 이상의 임의의 약학적 부형제와 함께 혼합함으로써, 바람직하게는 수용액 또는 동결건조된 제제의 형태로, 제조할 수 있다. 예시적인 동결건조된 항체 제제/제형은 미국특허 제 6,267,958 호에 기재되어 있다. 수성 항체 제제/제형은 미국특허 제 6,171,586 호 및 WO 2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제제/제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물 또는 제제/제형은 또한 특정 질환의 치료에 필요한 하나 이상의 다른 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다른 치료제를 또한 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 치료제는 화학요법제, 방사선요법제, 사이토카인, 백신, 다른 항체, 면역조절제 또는 다른 생물거대분자 약물이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 또한 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
방법 및 용도
하나의 태양에서, 본 발명은 피실험자에서 CD47-관련 질환을 예방, 진단 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본원에 기재된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 이를 포함하는 면역접합체 또는 면역융합체 또는 약학 조성물, 또는 본원에 기재된 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 투여함을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 피실험자에서 CD47-관련 질환의 예방, 진단 또는 치료를 위한 약물의 생산 또는 제조에 있어서 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명에 의해 제공된 항-CD47 항체, 및 그의 항원-결합 단편, 및 이를 포함하는 약학 조성물을, 피실험자에서 CD47-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 치료제로서 사용할 수 있다. 표준 방법을 사용하여 확인된 피실험자의 CD47-관련 질환의 경우, 본 발명에 개시된 항-CD47 항체 및 그의 항원-결합 단편, 및 이를 포함하는 약학적 조성물 또는 면역접합체 또는 면역융합체, 또는 본원에 기재된 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 투여할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 용도는 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제 또는 치료 방식을 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 예를 들어 화학요법제, 방사선요법제, 사이토카인, 백신, 기타 항체, 면역조절제 또는 기타 생물거대분자 약물이다. 일부 구현예에서, 치료 방식은 수술; 및 방사선 요법, 국소 조사 또는 병소 조사 등을 포함한다.
상기에 언급된 병용 요법은 병용 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제제/제형에 함유됨) 및 별도 투여를 포함하며, 여기서 본 발명의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여는 추가적인 치료제 및/또는 항원보강제 및/또는 치료의 투여 전에, 이의 투여와 동시에 또는 이의 투여 후에 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CD47-관련 질환은 비제한적으로 암을 포함하는, 피실험자에서 비정상적인 CD47 발현, 활성 및/또는 신호 전달과 관련된 질환을 지칭한다. 일부 구현예에서, CD47-관련 질환에서, CD47을 암호화하는 핵산의 (수준 또는 함량)이 증가되거나, 또는 CD47 발현이 증가되거나, 또는 CD47 단백질 수준이 증가되거나, 또는 활성이 증가되거나, 또는 활성 신호 전달이 증가된다.
일부 구현예에서, 질환의 치료는 핵산 또는 단백질 수준에서 CD47의 억제로부터 이익을 얻거나, 또는 CD47의 그의 리간드에의 결합 또는 CD47-매개된 신호 전달의 차단으로부터 이익을 얻을 것이다.
일부 구현예에서, 피실험자는 포유동물, 예를 들어 영장류, 바람직하게는 고등 영장류, 예를 들어 인간(예를 들어, 본원에 기재된 질환을 앓고 있거나 본원에 기재된 질환을 앓을 위험이 있는 개인)일 수 있다. 하나의 구현예에서, 피실험자는 본원에 기재된 질환(예를 들어, 암)을 앓고 있거나 앓을 위험이 있다. 특정 구현예에서, 피실험자는 화학요법 및/또는 방사선 요법과 같은 다른 치료를 받고 있거나 받은 적이 있다.
일부 구현예에서, 암은 다양한 혈액암 및 고형 종양, 및 전이성 병변을 포함한다. 하나의 구현예에서, 고형 종양의 예는 악성 종양을 포함한다. 암은 초기, 중기 또는 말기, 또는 전이성 암일 수 있다. 암은 예를 들어 방광암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, (악성)흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 자궁내막암, 신장암, (양성)흑색종, 전립선암, 갑상선 암종, 자궁경부암, 위암 또는 간암이다. 일부 구현예에서, 림프종은 버킷 림프종, 미만성 대세포 림프종, 또는 외투 세포 림프종 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 백혈병은 전골수구성 백혈병이다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 경구, 비경구, 폐내 및 비강내 투여를 포함하여, 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있고, 국소 치료가 필요한 경우 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는, 부분적으로 투여가 단기간인지 장기간인지에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 다양한 시점에서의 단일 또는 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 투여 섭생이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화 및 투여될 것이다. 반드시 그런 것은 아니지만, 선택적으로, 항체를 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화한다. 이들 다른 작용제의 유효량은 제제/제형 중에 존재하는 항체의 양, 치료하고자 하는 상태 또는 질환의 유형, 및 상기에 논의된 기타 인자에 따라 달라진다. 질환을 예방 또는 치료하기 위해, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을, 치료하고자 하는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료를 목적으로 하는 지의 여부, 선행 치료, 환자의 병력 및 항체에 대한 반응 및 주치의의 판단에 따라 적합한 용량으로 투여할 것이다. 항체를 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 샘플에서 CD47의 존재를 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출 방법은 하기를 포함한다:
(a) 샘플을 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 접합체 또는 융합체와 접촉시키고;
(b) 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 접합체 또는 융합체 및 CD47 단백질의 복합체 형성을 검출한다.
본원에 사용된 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 구현예에서, 샘플은 혈액, 혈청, 또는 생물학적 기원의 다른 액체 샘플이다. 특정 구현예에서, 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 과증식성 또는 암성 병소 관련 병소에서 유래된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 암과 같은 CD47-관련 질환을 진단하기 위해, 예를 들어 본원에 기재된 질환의 치료 또는 진행, 및 개인의 진단 및/또는 병기결정을 평가(예를 들어, 모니터링)하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 표지된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 표지에는 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어, 형광 표지, 발색단 표지, 전자 밀도 표지, 화학발광 표지 및 방사성 표지), 및 예를 들어 효소 반응 또는 분자간 상호작용에 의해 간접적으로 검출되는 부분(예를 들어, 효소 또는 리간드)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CD47-관련 질환 진단용 키트를 제공한다.
본원에 제공된 일부 구현예에서, 샘플을 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료하기 전에 수득한다. 일부 구현예에서, 샘플을 다른 요법으로 치료하기 전에 수득한다. 일부 구현예에서, 샘플을 다른 요법으로 치료하는 동안 또는 그 후에 수득한다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예의 임의의 조합을 포함한다. 비록 구체적인 내용 및 실시예가 본 발명의 바람직한 구현예를 예시하기 위해 기재되지만, 이들은 단지 예시적이며 예로서 사용된 것임을 이해해야 한다. 본 발명은 또한 당업자에게 자명한 본 발명의 바람직한 구현예에 기초하여 변형된 구현예를 포함한다. 모든 목적을 위해서, 인용을 포함하여 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 내용 전체가 본원에 참고로 통합될 것이다.
구현예의 상세한 설명
실시예 1 하이브리도마-유래된 항체의 제조 및 스크리닝
항-CD47 항체를 하이브리도마 기법에 의해 수득하였다. Fc 태그된 인간 CD47의 세포외 도메인을 함유하는 재조합 단백질 CD47-Fc(ACROBiosystems, Cat: CD7-H5256)를 항원으로서 사용하여 마우스를 면역화시켰다. 재조합 단백질 CD47-Fc를 완전 또는 불완전 프로인트 항원보강제(Sigma-Aldrich)와 혼합하고 유화시킨 후, SJL 마우스(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd) 및 BALB/c 마우스(Yangzhou University Medical Center)를 면역화시켰다. 마우스에게 1회 라운드의 면역화(완전 프로인트 항원보강제) 및 2회 라운드의 추가 면역화(불완전 프로인트 항원보강제)를 실시하고 각 추가 면역화 후 혈액을 채취하였다. 재조합 인간 CD47-Fc( ACROBiosystems, Cat: CD7-H5256) 단백질에 면역화 후 마우스 혈청의 결합 활성을 ELISA 분석에 의해 검출하고, 동시에 인간 CD47을 과발현하는 CHO 세포(GenScript에 의해 구성됨)에 대한 마우스 혈청의 결합 효능을 유식 세포분석(FACS)에 의해 검출하였다. 더 높은 혈청 역가를 갖는 마우스의 비장 세포를 선택하여 골수종 세포주 SP2/0(ATCC)과 융합시켰다. 융합 4일 전에, 인간 CD47 세포외 도메인의 재조합 단백질 CD47-Fc를 추가 면역화를 위해 마우스에게 복강내 주사하였다. 융합 당일 마우스를 안락사시킨 후, 마우스 비장 세포를 균질화하여 단세포 현탁액을 수득하였다. 마우스 비장 세포를 전기 융합 장치를 사용하여 쥐 골수종 세포주 SP2/0(3:1)과 융합시켰다. 융합된 세포를 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 데옥시뉴클레오티드, GIBCO, Cat: 21060016)를 함유하는 배지에 재현탁하여 성공적으로 융합된 하이브리도마 세포를 스크리닝하였다. 하이브리도마 세포의 상등액을 수집하고 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 2회 라운드의 ELISA로 스크리닝하였다. 이어서, 하이브리드마의 분비 상등액의 활성을 CD47-관련된 기능 스크리닝 시험(예를 들어, 인간 CD47 또는 키노몰구스 원숭이 CD47과의 결합 특이성; 적혈구 응집 유도에 활성 없음; 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용 촉진 활성)에 의해 측정하고, 이어서 양성 하이브리도마 클론을 선택하고 단일 또는 수회 라운드 동안 서브클로닝하여 단클론을 수득하였다. 스크리닝 후, 125G4A4가 최종적으로 하이브리도마 클론으로서 선택되었다.
후보 하이브리도마 세포 125G4A4를 확대 배양하고, 배양 7-10일 후, 상등액을 수집하고, 원심분리하고, 여과하여 세포 및 파편을 제거하였다. 상등액을 Protein A 정제 컬럼(GenScript)에 통과시킨 다음, 0.05M 트리스 및 1.5M NaCl(pH 8.0)을 함유하는 완충액으로 세척하고 평형화한 다음, 0.1M 나트륨 시트레이트(pH 3.5)로 용출시키고; 용출액을 즉시 1M 트리스-HCl(pH 9)의 1/9 부피로 중화한 다음 PBS 완충액으로 투석하였다. 최종적으로, 추가 특성화를 위해 하이브리도마-유래된 항체 125G4A4를 수득하였다.
1.1 FACS에 의한 인간 CD47 단백질을 과발현하는 CHO-K1 세포에 대한 항체의 결합 활성 검출
인간 CD47 단백질(NCBI 수탁번호: NP_001768.1)을, 인간 CD47 단백질을 과발현하는 CHO-K1 세포주를 확립하기 위해 햄스터 난소 세포주 CHO-K1에서 과발현시켰다. 세포를 연속 희석된 항체 125G4A4 및 참조 항체 C0774CK230-C(즉, Hu5F9)(최고 농도 300 nM, 3배 희석, 총 12개의 농도 점)와 함께 4℃에서 50분 동안 공-배양하였다. 빙냉 PBS로 2회 세척 후에, 세포를 암실에서 4℃에서 40분 동안 iFluor647-표지된 염소 항-마우스 IgG(H+L) 항체(Genscript)와 함께 배양하였다. 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 이어서 Calibur(BD Biosciences) 유식 세포분석에 의해 형광 신호를 검출하고, 신호의 평균 형광 강도(MFI)에 따라, GraphPad를 사용하여 농도 의존 곡선에 피팅하고, EC50을 계산하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 최종적으로 수득된 하이브리도마-유래된 항체 125G4A4는 0.22 nM의 EC50과 함께, 인간 CD47 단백질을 과발현하는 CHO-K1에 대해 높은 결합 활성을 갖는다.
1.2 FACS에 의한 종양 세포 표면상의 CD47에 대한 항체의 결합 활성 검출
인간 CD47을 인간 버킷 림프종 세포주 Raji의 세포 표면상에서 내인성으로 발현시켰다. 항체 125G4A4 및 참조 항체 Hu5F9를 2% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS(FBS, Gibco, Cat: 10100147)로 연속 희석하였다(최고 농도 46.3 nM, 3배 희석, 총 8개의 농도 점). 희석된 항체를 Raji 세포(ATCC에서 구입)(5×105 세포/웰)와 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 공-배양하였다. 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, PE-표지된 마우스 항-인간 IgG Fc 항체(Biolegend, Cat: 409304)를 가하고 세포를 4℃ 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 이어서 형광 신호를 CantoII(BD Biosciences) 유식 세포분석에 의해 검출하고, 신호의 평균 형광 강도(MFI)에 따라, GraphPad를 사용하여 농도 의존 곡선에 피팅하고, EC50을 계산하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 하이브리도마-유래된 항체 125G4A4는 0.84 ± 0.02 nM의 EC50과 함께, Raji 세포에 대해 결합 활성을 갖는다.
1.3 항-CD47 항체에 의한 인간 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용 차단
인간 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하는 125G4A4의 능력을 검출하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 인간 IgG의 Fc 단편(ACROBiosystems, Cat: CD7-H5256)과 융합된 인간 CD47의 세포외 도메인을 함유하는 재조합 단백질 hCD47-Fc를 96-웰 플레이트에 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 PBST(0.5% 트윈-20을 함유하는 PBS)로 3회 세척한 후, 1% BSA를 함유하는 PBST를 첨가하여 플레이트를 2시간 동안 차단하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, 2.5 ㎍/㎖의 최종 농도로 SIRPα-His 재조합 단백질(ACROBiosystems, Cat: SIA-5225)과 함께 연속 희석된 항체 125G4A4 또는 참조 항체 Hu5F9(최고 농도 66.7 nM, 3배 희석, 총 8개의 농도 점)의 혼합물을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 코팅된 CD47 단백질에 의해 포획된 SIRPα를 검출하기 위해 양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 염소 항-His-태그 2차 항체(CWBIO, Cat: CW0285M)를 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 37℃에서 30분간 배양한 후, 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 TMD(Surmodics, Cat: TMBW-1000-01) 전개액을 첨가하고, 암실에서 15분 동안 배양하였다. 2N H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 종결시켰다. 마이크로플레이트 판독기에서 OD450을 판독하였다. 흡광도 값은 CD47에 결합된 SIRPα의 양을 반영한다. Graphpad를 사용하여 농도 의존 곡선에 피팅하고, SIRPα에 대한 CD47의 결합을 차단하기 위한 항-CD47 항체의 IC50을 계산하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 125G4A4는 3.06 nM의 IC50과 함께, CD47/SIRPα 상호작용을 유효하게 차단할 수 있다.
1.4 인간 적혈구 응집 유도에서 항-CD47 항체의 활성 검출
종래 기술에서, 대부분의 항-CD47 항체는 적혈구 응집을 유도하는 성질을 갖는 것으로 공지되어 있다. 이러한 특성은 치료학적 항-CD47 항체에 의한 치료에 존재하는 빈혈과 같은 임상적 부작용과 밀접한 관련이 있는 것으로 여겨지고 있다. 따라서 우리는 본 발명의 항-CD47 항체를, 적혈구 응집을 유도하는 성질이 없는 항체를 선별하기 위해 시험관내 적혈구 응집 실험으로 평가하였다. 방법은 하기와 같다: 건강한 공여자의 신선한 인간 혈액을 수집하고, 세포를 PBS로 5회 세척하고, 이어서 세포를 희석하여 10% 인간 적혈구를 함유하는 현탁액을 제조하고; 적혈구 현탁액을 실험 항체(항체 125G4A4 및 참조 항체 Hu5F9, 최고 농도 667 nM, 3배 희석, 총 12개 농도 점)와 혼합하고, 이어서 혼합물을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하고; 이를 실온에서 16시간 동안 배양하고, 이어서 사진을 촬영하고 웰 중의 세포의 현상에 따라 그 결과를 측정한다. 적혈구 응집이 발생하면 세포가 그물처럼 각 웰에 플레이팅되고, 음성 대조용 웰보다 직경이 큰 웰에 더 큰 시트형 세포층이 나타날 것이며; 반대로, 혈구 응집이 일어나지 않으면 적혈구가 웰 바닥에 침전되고 작은 점 모양의 세포 펠렛 침전이 웰에 나타날 것이다. 125G4A4는 실험에서 적혈구 응집을 유도하는 명백한 현상을 보이지 않는다.
1.5 인간 대식세포에 의한 종양 세포상의 항-CD47 항체의 식세포작용 촉진 효과 측정
대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진하는 본 발명의 항체 125G4A4의 능력을 유식 세포분석에 기초한 분석에 의해 검출하였다. 인간 혈액을 건강한 공여자로부터 신선하게 수집하였고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare, Cat: 17-1440-02)를 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 인간 총 단핵구 단리 키트(Miltenyi biotec, cat: 130-096-537)를 사용하여 단핵구를 추가로 단리하여 수득하였다. 단핵구의 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF, R&D Systems, Cat: 216-MC)를 첨가하고 단핵구를 연속 7일 동안 부착 배양하였다. 세포 식세포작용 실험 당일에, 상기 언급된 분화된 대식세포를 무혈청 배지에서 2시간 동안 굶겼다. 동시에, 표적 종양 세포 Raji를 설명서에서 권장하는 단계에 따라 CFSE(eBioscience, Cat: 65-0850-85)로 형광 표지하였다. CFSE-표지된 종양세포와 대식세포를 4:1의 비로 혼합하고, 검출된 농도의 실험 항체를 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 2회 세척하고, 이어서 트립신(Gibco, Cat: 25200072)으로 절단하고; APC 표지된 항-CD14 항체(Biolegend, Cat: 325608)를 첨가하고 30분 동안 2% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS에서 암실의 빙상에서 배양하였다. 세포를 2회 세척하고 유식 세포분석으로 분석하였다. CD14 양성 대식세포 집단에서 CFSE 양성 세포의 백분율을 계산하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 125G4A4는 종양 세포에 대한 대식세포의 식세포작용 기능을 유효하게 촉진할 수 있다.
[표 1] 하이브리도마-유래된 항체 125G4A4의 활성 및 기능의 측정
클론 번호
ID		 인간 CD47 단백질을 과발현하는 CHO-K1 세포에의 결합
(FACS, EC50, nM)		 Raji 세포의 표면상의 CD47에의 결합
(FACS, EC50, nM) (n = 3)		 인간 CD47 단백질에의 SIRPα의 결합 차단
(ELISA, IC50, nM)		 적혈구 응집 시험
(0.03-66.7 nM)		 Raji의 식세포작용 비율%
(항체 농도:
33 nM)
Hu5F9 0.37 0.3 ± 0.01 1.55 양성
(7.4-66.6 nM)		 36.5%
125G4A4 0.22 0.84 ± 0.02 3.06 음성 71.7%
실시예 2 하이브리도마-유래된 항체의 인간화
2.1 하이브리도마-유래된 항체의 가변영역 서열 측정
하이브리도마 서열분석 방법에 따라 하이브리도마 클론 125G4A4의 세포를 확대 배양하고; 전체 RNA를 TRIzol(Ambio에서 구매)로 추출하고 항체 특이적 프라이머(Takara, PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)를 사용하여 DNA로 역전사하고; 마우스 면역글로불린 V-영역을 암호화하는 유전자 단편을 항체-특이적 프라이머로 증폭시켰다. 하이브리도마-유래된 항체의 가변영역 서열을 서열분석을 통해 획득하였다. 125G4A4 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2에 제시된 바와 같고, 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 19 및 20에 제시된 바와 같다.
2.2 키메라 항체의 구성 및 발현
CD47의 작용 기전에 따라, 본 발명의 특정 구현예에서, 항체의 중쇄 불변 영역으로서 인간 IgG4의 불변 영역(S228P)을 사용하고, 항체의 경쇄 불변 영역으로서 인간 κ 경쇄 불변 영역 쇄를 사용한다. IgG4 코어 힌지 영역의 228번 위치에 있는 세린을 프롤린으로 돌연변이(S228P)시켜, 코어 힌지 영역에서 디설파이드 결합 연결을 강화시키고 IgG4 Fab 가지의 교환을 감소시켜, 절반 분자의 형성을 크게 줄일 수 있다. 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 유전자를 합성한 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를, EcoRI 및 BamHI에 의한 이중 효소 절단을 통해 벡터 PTT5에 상동성으로 재조합하였다. 정확한 서열분석 후에, 항체의 중쇄 및 경쇄를 1.5:1의 몰비로 HEK293 세포에 동시 형질감염시킨다. 120시간 배양 후에, 상등액을 원심분리에 의해 수집하고 정제하여 키메라 항체를 수득하였다.
인간화 설계 전에, 단백질 입체형태에 영향을 미치고 이에 의해 그의 기능에 영향을 미치지 않도록, CDR 영역 중의 일부 번역후 변형(PTM) 부위를 돌연변이시키는 것이 필요하다. PTM 분석에 따르면, 125G4A4의 CDR 중의 2개의 PTM 부위, 즉 중쇄 중의 하나의 NSS 글리코실화 부위 및 경쇄 중의 하나의 DG 이성질체화 부위가 확인되었다. NSS 글리코실화 부위와 DG 이성질체화 부위는 각각 QSS와 EG로 돌연변이되었다. 본 실시예에서 정제하여 수득한 돌연변이된 키메라 항체를 Ch-125G4-m35로 명명한다. Ch-125G4-m35 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 4에 제시된 바와 같다.
2.3 키메라 항체의 인간화된 설계
인간화를 위해 키메라 항체 125GA4m과 가장 높은 유사성을 갖는 인간 항체 주쇄 서열을 선택하기 위해서, 키메라 항체 125G4A4m의 가변 영역 서열을 PDB 항체 데이터베이스와 Blast 정렬시켰다. 125G4A4m의 중쇄 가변 영역은 인간 생식세포계열 IGHV1-69와 더 높은 서열 상동성을 가지며, 그의 경쇄 가변 영역은 인간 생식세포계열 IGKV1-16과 더 높은 서열 상동성을 갖는다. 이어서 가변 영역 CDR의 아미노산 서열과 그의 정확한 경계를 Kabat 할당 시스템에 의해 정의한다. 이어서, 쥐 항체의 가변 영역의 CDR 분절을 인간 주쇄 서열에 접목하여 인간화된 항체를 수득한다.
인간화된 항체의 활성을 유지하기 위해서, 가변 영역과 그 주변영역의 프레임워크 아미노산 서열을 컴퓨터 시뮬레이션 기술을 이용하여 거대분자 도킹 분석으로 분석하여 이들의 공간적 입체 결합 방식을 조사하였다. 정전기력, 반 데르 발스력, 친수성 및 엔트로피를 계산하여, CD47과 상호작용하고 후보 항체 유전자 서열에서 공간적 프레임워크를 유지할 수 있는 주요 아미노산 개체를 분석하고, 선택된 인간 항체 유전자 프레임워크에 다시 접목시킨다. 한편, 확보되어야 하는 프레임워크 영역 중의 아미노산 위치를 표시한다. 상기 과정에 기반하여, 인간화된 항체가 합성된다. 항체 프레임워크 영역 중의 일부 핵심 부위를 키메라 항체 Ch-125G4-m35의 항체 프레임워크 영역 서열로 역 돌연변이시켰다. 역 돌연변이의 수 및 배열에 따라, 다수의 상이한 인간화된 중쇄 가변영역(서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7) 및 경쇄 가변영역(서열번호 번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10)을 각각 설계하였다(표 2 참조). 최종적으로 결정된 본 발명의 인간화된 항체 Hu-125G4A4-48을 이하 HMA02h14-48로 명명한다. 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 7 및 8에 제시된 바와 같다.
[표 2] 125G4A4m 중쇄 및 경쇄 중의 역 돌연변이의 수 및 배열
서열 번호 돌연변이 수 돌연변이 부위
중쇄 가변 영역
서열번호 5 3 E73K, S76R, S82aT
서열번호 6 4 E73K, S76R, A78T, S82aT
서열번호 7 6 V67A, I69L, E73K, S76R, A78T, S82aT
경쇄 가변 영역
서열번호 8 1 F71Y
서열번호 9 2 T69Q, F71Y
서열번호 10 6 Q3K, S46T, S60L, T69Q, F71Y, Y87F
[표 3] 항-CD47 항체의 아미노산 서열
항체 중쇄 가변 영역 서열 경쇄 가변 영역 서열
125G4A4 서열번호 1 서열번호 2
ch-125G4-m35 서열번호 3 서열번호 4
Hu-125G4A4m-43 서열번호 6 서열번호 9
Hu-125G4A4m-44 서열번호 6 서열번호 10
Hu-125G4A4m-45 서열번호 5 서열번호 8
Hu-125G4A4m-46 서열번호 5 서열번호 9
Hu-125G4A4m-47 서열번호 5 서열번호 10
Hu-125G4A4m-48 서열번호 7 서열번호 8
Hu-125G4A4m-49 서열번호 7 서열번호 9
Hu-125G4A4m-50 서열번호 7 서열번호 10
[표 4] 항-CD47 항체(Kabat 정의)의 CDR 아미노산 서열
CDR 125G4A4 ch-125G4-m35 HMA02h14-48 및 그의 변이체
HCDR1 서열번호 11 서열번호 11 서열번호 11
HCDR2 서열번호 12 서열번호 12 서열번호 12
HCDR3 서열번호 13 서열번호 17 서열번호 17
LCDR1 서열번호 14 서열번호 14 서열번호 14
LCDR2 서열번호 15 서열번호 18 서열번호 18
LCDR3 서열번호 16 서열번호 16 서열번호 16
2.4 인간화된 항체의 발현
상기에 언급된 설계된 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 증폭시키고, 인간 항체를 발현하는 불변 영역을 포함하는 벡터에 클로닝하여 항체 발현 플라스미드(pCDNA3.4, Thermo Cat# A14697에서 구입)를 구성하였다. 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 Expire293 세포(Thermo Cat# A14525)에 공동-형질감염시켰다. 37℃에서 6일 동안 배양한 후, 상등액을 수집하였다. 상기에 언급된 방법에 따라, 항체의 추가 특성화를 위해 단백질 A 친화성 정제에 의해 재조합 항체를 수득하였다. 인간화된 항체는 IgG4 S228P(IgG4P) 하위유형이다.
실시예 3 인간화된 항체의 스크리닝
고도로 활성인 인간화된 항체를, 키노몰구스 원숭이 B 세포에 대한 인간화된 항체의 결합 능력, 종양 세포를 포식하는 인간 대식세포의 능력 및 적혈구 응집 유도 능력을 검출함으로써 스크리닝하였다.
키노몰구스 원숭이 B 세포에 대한 인간화된 항체의 결합 능력 검출: 유식 세포분석을 사용하여 키노몰구스 원숭이 B 세포 표면상의 CD47에 대한 일련의 인간화된 125G4A4 항체의 결합을 검출하였다. 방법은 하기와 같다: 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를, Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare, Cat: 17-1440-02)를 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 키노몰구스 원숭이의 혈액(Shanghai Yinuosi Bio-Technology Co., Ltd.에 의해 제공됨)으로부터 단리하였다. PBMC를 4℃에서 30분 동안 2% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS에서 일련의 인간화된 125G4A4 항체 또는 아이소타입 대조군(IgG4P)과 함께 배양하였다. 이어서 세포를 3회 세척하고 2% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS에서 2차 항체(PE-표지된 마우스 항-인간 IgG Fc 항체, Biolegend, Cat: 409304)와 함께 4℃의 암실에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 3회 세척하고 유식 세포분석으로 분석하였다. B 세포를, 키노몰구스 원숭이와 교차 반응성을 갖는 항-인간 CD20 항체(Brilliant Violet 421™ 표지된 항-인간 CD20 항체, Biolegend, Cat: 302330)로 표지하고, Canto II(BD Biosciences)에서 유식 세포분석에 의해 검출하여 그의 평균 형광 강도(MFI)를 획득하였다.
실시예 1.5 및 1.4에 기재된 방법에 따라, 종양 세포를 포식하는 대식세포의 능력 및 적혈구 응집 유도 능력을 각각 검출하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 일련의 인간화된 125G4A4 항체는 시험된 농도 하에서 키노몰구스 원숭이 B 세포상에서 발현된 CD47에 결합한다. 항체는 대식세포에 의한 종양 세포 Raji의 식세포작용을 촉진하며, 이 중 Hu-125G4A4m-48은 33 nM에서 가장 강력한 식세포작용 효율을 나타낸다. Hu-125G4A4m-48의 다른 활성은 키메라 항체 Ch-125G4m-m35의 활성과 유사하다. 더욱이, 역 돌연변이의 수는 더 적었다. 따라서, Hu-125G4A4m-48이 추가 시험을 위해 선택되었으며, 이를 이후에 HMA02h14-48로 명명하였다.
[표 5] 일련의 항-CD47 인간화된 항체의 시험관내 활성 시험
항체 역
돌연변이 수		 FACS에 의한 키노몰구스 원숭이 B 세포에 대한 결합 효율의 검출 Raji의 식세포작용 비율% 적혈구 응집
Max MFI,
항체 시험 농도
66.7 nM
Ch-125G4m-m35 값과의 비교, %		 항체 시험 농도 33 nM Ch-125G4m-m35 값과의 비교, % 항체 시험 농도
0.033 - 66.7 nM
Hu5F9 - 4118 90 18.3 양성
Ch-125G4m-m35 - 4551 100 30.2 100 음성
Hu-125G4A4m-43 6 3259 72 33.8 112 음성
Hu-125G4A4m-44 10 4512 99 33.3 110 음성
Hu-125G4A4m-45 4 2634 58 28.8 95 음성
Hu-125G4A4m-46 5 2522 55 31.4 104 음성
Hu-125G4A4m-47 9 4100 90 32.1 106 음성
Hu-125G4A4m-48 7 4195 92 35.6 118 음성
Hu-125G4A4m-49 8 4079 90 35.1 116 음성
Hu-125G4A4m-50 12 4839 106 34.5 114 음성
아이소타입 - 53 - 4.2 - 음성
실시예 4 FACS에 의한 종양 세포에 대한 HMA02h14-48의 결합 활성 측정
인간 CD47을 인간 버킷 림프종 세포주 Raji 세포(Shanghai Institutes for Biological Sciences, SIBS, CCL-86™/ATCC), 인간 미만성 대세포 림프종 Toledo 세포(ATCC® CRL-2631™) 및 인간 외투 세포 림프종 REC-1 세포(ATCC® CRL-3004™)의 표면상에서 내인성으로 발현시킨다. 선행 실시예 1.2에 기재된 검출 방법에 따라, 상기 언급된 종양 세포주의 표면상의 CD47에 대한 인간화된 항체 HMA02h14-48의 결합을 검출하기 위해 유식 세포분석을 사용하였다. 최고 항체 농도는 667 nM이었고, 항체를 연속적으로 희석하여 총 8개의 농도 점을 시험하였다.
도 1-3에 나타낸 바와 같이, HMA02h14-48과 Hu5F9는 모두 Raji, Toledo 및 REC-1을 포함한 종양 세포의 표면상의 CD47에 결합하였다. HMA02h14-48이 평탄역에 도달시의 최대 형광 강도는 Hu5F9의 경우보다 높으며, EC50 및 최대 형광 강도를 표 6에 나타낸다.
[표 6] 종양 세포 표면상의 CD47에 대한 항체 HMA02h14-48의 결합 활성
아이소타입 HMA02h14-48 Hu5F9
Raji EC50 (nM) / 1.2 0.75
Max MFI 175 7436 5958
Toledo EC50 (nM) / 2.2 1.4
Max MFI 50 6873 6703
REC-1 EC50 (nM) / 0.6 0.3
Max MFI 265 12629 10805
본 실시예 및 다른 실시예에서 사용된 음성 아이소타입 대조용 항체(아이소타입)는 인간 IgG4P이었으며, 이를 Shanghai Chempartner Co., Ltd.에서 구입하였다.
실시예 5: Biacore에 의한 인간 CD47에 대한 항체 HMA02h14-48의 결합 친화도 측정
Biacore를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)을 측정하여 결합 동역학 매개변수를 측정하였다. 이 기술은 항체와 항원의 결합(ka) 및 해리(kd)의 미시적인 속도 상수를 검출하는 데 사용되었다. ka 및 kd 값에 기초하여, 항체와 항원의 친화도 값을 획득할 수 있다. Biacore 장비(Biacore T200)와 시약은 모두 GE Healthcare에서 구입하였다. 항-인간 Fc 항체를 센서 칩 CM5에 고정화하였다. 정제된 항체(HMA02H14-48 및 Hu5F9)를 이동상 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% 트윈-20, pH 7.4)에 희석하고, 항-인간 Fc 항체가 코팅된 CM5 칩에 통과시켰다. 이어서 연속 희석된 인간 CD47-His(ACROBiosystems, Cat: CD7-H5227) 융합 단백질을 검출 칩에 통과시켜 항원과 항체의 결합을 측정한 다음, 이동상 완충액을 칩에 통과시켜 항체로부터 항원의 해리를 검출하였다. 항원과 항체의 결합 및 해리 신호 데이터를 상이한 농도에서 수집하였으며, Langmuir 모델에 의해 1:1로 피팅하여 항원과 항체의 친화도를 계산하였다.
표 7에 나타낸 바와 같이, HMA02h14-48은 7.77E-10(M)의 KD 값으로 높은 친화도로 인간 CD47에 결합한다.
[표 7] Biacore에 의한 인간 CD47에 대한 인간화된 항체 결합의 동역학 상수 측정
항체 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
HMA02h14-48 8.34E+05 6.48E-03 7.77E-10
Hu5F9 5.2E+07 1.01E-01 2.01E-09
실시예 6 ELISA에 의한 인간 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하는 HMA02h14-48의 활성의 검출
선행 실시예 1.3에 기재된 방법에 따라, 인간 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하는 HMA02h14-48의 능력을 검출하기 위해 ELISA를 사용하였다. 최고 항체 농도는 67 nM이었고, 항체를 연속적으로 희석하여 총 8개의 농도 점을 시험하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체 HMA02h14-48은 IC50 = 1.58 nM과 함께, 인간 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단한다.
실시예 7 인간 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용에 대한 HMA02h14-48의 효과
실시예 1.5에 기재된 방법에 따라, 인간 대식세포에 의한 인간 버킷 림프종 세포주 Raji 세포, 인간 미만성 거대 세포 림프종 Toledo 세포, 인간 외투 세포 림프종 REC-1 세포 및 인간 전골수구성 백혈병 세포주 HL-60 세포의 식세포작용 촉진에 대한 HMA02h14-48의 효과를 검출하였다. 최고 항체 농도는 100 ㎍/㎖이었고, 항체를 연속 희석하여 총 8개의 농도 점을 시험하였다.
결과는 참조 항체 Hu5F9 및 SRF231과 비교하여, HMA02h14-48이 대식세포에 의한 인간 버킷 림프종 세포주 Raji의 식세포작용을 유효하게 촉진할 수 있음을 보여주었다. 가장 높은 식세포작용 효율은 최대 36.5%였으며, 0.1 내지 100 ㎍/㎖의 다양한 농도에서 식세포작용 비율은 Hu5F9 및 SRF231보다 더 높았다. 인간 외투세포 림프종 REC-1에 대한 HMA02h14-48의 가장 높은 식세포작용 효율은 최대 84.6%였으며, 식세포작용 비율은 0.1 ㎍/㎖의 낮은 농도에서도 약 70%에서 유지될 수 있었는데, 이는 Hu5F9 및 SRF231의 경우보다 더 높았다. HMA02h14-48은 대식세포에 의한 Toledo 세포의 식세포작용을 촉진시켰고, 식세포작용 비율은 최대 94.2%였다. HMA02h14-48은 대식세포에 의한 종양 세포 HL-60의 식세포작용을 촉진할 수 있었으며, 가장 높은 식세포작용 효율은 최대 65%였다.
[표 8] 인간 MΦ에 의한 종양 세포의 식세포작용 촉진에 대한 항체 HMA02h14-48의 효과
식세포작용 비율(%)
HMA02h14-48 Hu5F9 SRF231
Toledo
100
10
1
0.1
0.01 ㎍/㎖
아이소타입 (100 ㎍/㎖)
94.0
94.2
93.8
73.9
43.5
11.3
92.5
91.8
92.2
74.2
54.8
11.3
/
Raji100
10,
1,
0.1
0.01 ㎍/㎖
아이소타입 (100 ㎍/㎖)
31.9
36.5
35.8
21.3
5.7
2.4
15.5
16.4
14.8
9.0
4.7
2.4
22.9
26.8
25.6
9.0
2.2
2.4
REC-1100
10
1
0.1
0.01 ㎍/㎖
아이소타입 (100 ㎍/㎖)
84.6
84.1
83.7
70.0
19.2
8.5
74.6
72.7
67.3
33.0
19.6
8.5
87.4
85.8
84.2
45.9
19.6
8.5
HL-60100
10
1
0.01 ㎍/㎖
아이소타입 (100 ㎍/㎖)
65.0
67.6
67.1
50.4
45.7
66.3
69.3
73
53.9
45.7
/
실시예 8 시험관내 적혈구 응집 유도에 대한 HMA02h14-48의 효과 검출
인간 적혈구를 PBS에서 10%로 희석하고, 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가 된 CD47 항체와 함께 실온에서 16시간 동안 배양하였다. 침전되지 않은 적혈구의 존재는 적혈구 응집을 입증하는 증거이다. 응집되지 않은 적혈구의 침전에 의해 형성된 흰색 점과 비교할 때, 침전되지 않은 적혈구는 음성 아이소타입 대조용 항체의 경우 보다 더 큰 망상 영역을 형성할 수 있었다(도 9 참조). 음성 아이소타입 대조용 항체(아이소타입)의 결과를 정상 표준으로서 사용하였다.
실시예 1.4에 기재된 방법에 따라, 항체 HMA0214-48이 적혈구 응집을 유도하는지 여부를 확인하기 위해 상기 항체를 시험하였다. 최고 항체 농도는 667 nM이었고, 항체를 연속적으로 희석하여 총 12개의 농도 점을 시험하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, CD47 항체 Hu5F9는 그의 농도가 0.9 nM 이상일 때 적혈구 응집을 유의하게 유도할 수 있음을 나타내었다. 대조적으로, 본 발명의 항체 HMA02h14-48은 0.004 내지 667 nM의 상이한 농도에서 시험관내 인간 적혈구의 유의한 혈구응집을 유도하지 않았다.
실시예 9 FACS에 의한 인간 적혈구에 대한 HMA02h14-48의 결합 활성의 검출
종래 기술에서 치료학적 항-CD47 항체를 임상적으로 사용하는 경우, 빈혈과 같은 부작용이 종종 발생하는 것으로 공지되어 있다. 일반적으로 항-CD47 항체는 적혈구 표면상의 CD47에 결합하여 대식세포에 의한 적혈구의 식세포작용을 일으키는 것으로 여겨진다. 이것은 빈혈의 또 다른 주요 원인이 될 수 있다. 본 발명에서, 유식 세포분석을 사용하여, HMA02h14-48이 인간 적혈구에 결합하는 능력을 검출하여 항체의 위험성을 평가하였다. 구체적으로, 건강한 공여자의 적혈구를 4℃에서 30분 동안 2% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS에서 희석된 HMA02h14-48(최대 농도 667 nM, 총 8개의 시험 농도 점)과 함께 배양하였다. 이어서 세포를 3회 세척하고, 2% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS에서 2차 항체(PE-표지된 마우스 항-인간 IgG Fc 항체, Biolegend, Cat: 409304)와 함께 4℃의 암실에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 이어서 Canto II(BD Biosciences) 유식 세포분석에 의해 형광 신호를 검출하였다. 신호의 평균 형광 강도(MFI)에 따라, GraphPad를 사용하여 농도 의존 곡선에 피팅하고, EC50을 계산하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 인간 적혈구 표면상의 CD47에 결합된 HMA02h14-48의 최대 평균 형광 강도는 대조용 항체 Hu5F9의 경우보다 낮았다. 최대 평균 형광 강도 및 그의 EC50을 표 9에 나타내었다.
[표 9] 인간 적혈구 표면상의 CD47에 대한 항체 HMA02h14-48의 결합 활성
HMA02h14-48 Hu5F9
EC50 (nM) 3.9 3.4
Max MFI 1165 2380
실시예 10 인간화된 항체 HMA02h14-48에 의한 Toledo 종양 성장의 억제
목적: 본 발명의 항체의 항-종양 활성을 연구하기 위해 NOD-Scid 마우스에서 Toledo 피하 종양 모델을 확립하였다.
방법: 인간 미만성 거대 B-세포 림프종 세포 Toledo(ATCC® CRL-2631™)를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지와 함께 배양하였다. 종양 세포를 RPMI1640에 현탁시키고 수컷 NOD-Scid 마우스(Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.)의 오른쪽 옆구리에 1 x 107 세포/마우스의 용량으로 피하 이식하였다.
종양 세포 접종 15일 후에, 마우스를 종양 부피에 따라 무작위로 6개 그룹으로 분류하고, Hu5F9 및 HMA02h14-48 항체를 각각 PBS로 희석하고, 10 ㎎/㎏의 용량으로 표 10에 나타낸 일정에 따라 투여하였다. 음성 아이소타입 대조용 항체(아이소타입) IgG4P는 Shanghai ChemPartner Co., Ltd.에서 구입하였다.
[표 10] Hu5F9 및 HMA02h14-48의 투여 섭생
시험된 샘플 그룹 투여 용량
(㎎/㎏ Х 횟수)		 매주 총 용량
(㎎/㎏)		 투여량 섭생 마우스의 수
아이소타입 10 Х 3 30 1, 4 및 7일에 복강내 주사 6
Hu5F9 Hu5F9-H 10 Х 3 30 1, 4 및 7일에 복강내 주사 6
Hu5F9-L 10 Х 1 10 1일에 복강내 주사 6
HMA02h14-48 HMA-H 10 Х 3 30 1, 4 및 7일에 복강내 주사 6
HMA-M 10 Х 2 20 1 및 4일에 복강내 주사 6
HMA-L 10 Х 1 10 1일에 복강내 주사 6
참고: 분류일은 0일로서 정의되며, 약물투여 다음날이 1일이다.
마우스의 종양 부피(종양 부피 = 0.5 × 긴 직경 × 짧은 직경2) 및 체중을 규칙적으로 측정하였다. 종양 부피 및 체중의 변화를 Excel 소프트웨어의 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계적으로 분석하였으며, 여기서 p < 0.05는 유의한 통계적 차이를 나타낸다. 투여 후 각 항체 처리 그룹의 종양 퇴행률을 계산하였다.
각 처리 그룹에서 종양 퇴행률을 계산하는 공식은 [(D0 평균 종양 부피 - Dt 평균 종양 부피)/D0 평균 종양 부피] × 100%이다.
마우스의 상대적인 체중 계산 공식은 (측정 당일 마우스의 체중/분류 시의 마우스 체중) × 100%이다.
결과:
실험 결과를 표 11 및 도 11에 나타낸다.
아이소타입 대조용 항체 그룹의 종양은 잘 성장한 반면, 치료 항체 처리 그룹의 피하 종양 부피는 완전히 퇴행될 때까지 초기 부피와 비교하여 점차적으로 감소 하였다. 다양한 용량으로 투여된 Hu5F9 및 HMA02h14-48 항체를 갖는 그룹은 11일에 측정시 완전한 종양 퇴행의 효과(100%의 퇴행률)를 달성하였고, 대조군에서 대조용 항체와 비교하여, 종양 부피 감소는 통계적으로 유의하였다. 투여 중단 후, 동물을 67일까지 관찰하였으며, 여전히 종양 재성장의 징후는 없었다. 또한, HMA02h14-48을 다양한 용량으로 투여한 그룹의 동물들은 양호한 상태였으며, 처리 전과 비교하여 21일째 마우스의 체중에는 유의한 차이가 없었다. 21일째 고용량의 Hu5F9를 투여한 그룹의 마우스 체중은 0일째에 비해 약 5% 감소하였지만 초기 체중과 비교하여 통계적 차이는 없었고(p > 0.05); Hu5F9의 저용량 그룹에서는 체중 감소가 없었으며, 이는 체중에 대한 Hu5F9의 가능한 용량 관련 효과를 시사한다.
상기 데이터에 기초하여, Hu5F9 및 HMA02h14-48 항체 처리는 모두 매우 유의한 항종양 효과를 나타내었다. 10 ㎎/㎏의 어느 한 항체의 단일 용량은 종양의 완전한 퇴행으로 이어졌고 지속 기간이 길다.
[표 11] Toledo 피하 이식된 종양 성장에 대한 Hu5F9 및 HMA02h014-48의 효과
그룹 동물의 수
(시작/21일)		 종양 부피(㎣) 상대적인 체중(%)
0일 11일 21일 21일
아이소타입 6/6 199 ± 18 1524 ± 238 3646 ± 631 111.3
Hu5F9-H 6/6 200 ± 23 0 ± 0**
(100%)		 0 ± 0**
(100%)		 94.5
Hu5F9-L 6/6 196 ± 14 0 ± 0**(100%) 0 ± 0**
(100%)		 100.3
HMA-H 6/6 199 ± 26 0 ± 0**
(100%)		 0 ± 0**
(100%)		 99.1
HMA-M 6/6 199 ± 24 0 ± 0**(100%) 0 ± 0**
(100%)		 100.3
HMA-L 6/6 199 ± 18 0 ± 0**
(100%)		 0 ± 0**
(100%)		 100.4
참고: **는 p < 0.01이고; 괄호 안의 숫자는 종양 퇴행률이다.
실시예 11 인간화된 항체 HMA02h14-48에 의한 REC-1 종양 성장의 억제
목적: 본 발명의 항체의 항-종양 활성을 연구하기 위해 NOD-Scid 마우스에서 REC-1 피하 종양 모델을 확립하였다.
방법: 인간 외투 세포 림프종 세포 REC-1(ATCC® CRL-3004™)을 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 종양 세포를 RPMI1640에 현탁시키고 수컷 NOD-Scid 마우스(Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.)의 오른쪽 옆구리에 5 × 106 세포/마우스의 용량으로 피하 이식하였다.
종양 세포 접종 11일 후에, 마우스를 종양 부피에 따라 무작위로 5개 그룹으로 분류하고, Hu5F9 및 HMA02h14-48 항체를 PBS로 희석하고, 표 12에 기재된 일정에 따라 마우스에게 투여하였다. 항체 Hu5F9는 GenScript에 의해 제조되었으며, 항체 HMA02h14-48은 실시예 2의 방법에 따라 제조하였다. 아이소타입 대조용 항체(아이소타입) IgG4p는 Shanghai ChemPartner Co., Ltd로부터 구입하였다.
[표 12] Hu5F9 및 HMA02h14-48의 투여 섭생
시험된 샘플 그룹 투여 용량
(㎎/㎏ Х 횟수)		 총 용량
(㎎/㎏)		 투여량 섭생 마우스의 수
아이소타입 10 Х 1 10 1일에 복강내 주사 6
Hu5F9 Hu5F9-M 3 Х 1 3 1일에 복강내 주사 6

HMA02h14-48		 HMA-L 1 Х 1 1 1일에 복강내 주사 6
HMA-M 3 Х 1 3 1일에 복강내 주사 6
HMA-H 10 Х 1 10 1일에 복강내 주사 6
참고: 분류일은 0일로서 정의되고, 약물 투여 다음날이 1일이다.
마우스의 종양 부피(종양 부피 = 0.5 × 긴 직경 × 짧은 직경2) 및 체중을 규칙적으로 측정하였다. 투여 후 21일째에 항체 처리 그룹의 종양 억제율 및 종양 퇴행률을 계산하였다.
종양 억제율을 계산하는 공식은 하기와 같다: [(대조군의 평균 종양 부피 변화 - 처리 그룹의 평균 종양 부피 변화)/대조군의 평균 종양 부피 변화] × 100%. 종양 부피 및 체중의 변화를 Excel 소프트웨어에서 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계적으로 분석하였으며, 여기서 p < 0.05는 유의한 통계적 차이를 나타낸다.
각 처리 그룹에서 종양 퇴행률을 계산하는 공식은 [(D0 평균 종양 부피 - Dt 평균 종양 부피)/D0 평균 종양 부피] × 100%이다.
마우스의 상대적인 체중 계산 공식은 (측정 당일 마우스의 체중/분류 시 마우스의 체중) × 100%이다.
결과:
실험 결과를 표 13 및 도 12에 나타낸다.
투여 12일 후, 아이소타입 그룹과 비교하여, 종양 성장 억제율은 3 ㎎/㎏의 Hu5F9 단일 용량으로 처리된 그룹에서 16.7%(p > 0.05)이고; 종양 성장 억제율은 1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏의 HMA02h14-48의 단일 용량을 가진 그룹에서 각각 3.8%(p > 0.05), 54.7%(p < 0.01) 및 107.2%(p < 0.001)이었다. 고용량의 HMA02h14-48 항체로 처리된 그룹은 10일째에 완전한 종양 퇴행(100%의 퇴행률)을 달성하였다. 또한, 다른 처리 그룹에서 마우스의 상대적인 체중에는 유의한 차이가 없었다.
종합하면, HMA02h14-48 항체는 REC-1 모델에서 용량 의존적 효과를 나타내었고, 10 ㎎/㎏의 단일 용량은 완전한 종양 퇴행으로 이어졌다.
[표 13] REC-1 피하 이식된 종양 성장에 대한 Hu5F9 및 HMA02h14-48의 효과
그룹 동물의 수
(시작/12일)		 종양 부피(㎣) 종양 억제율(%) 상대적인 체중(%)
0일 12일 12일 12일
아이소타입-10 ㎎/㎏ 6/6 226 ± 50 3403 ± 570 - 111.8
Hu5F9-3 ㎎/㎏ 6/6 227 ± 49 2875 ± 659 16.7 112.1
HMA02h14-48-1 ㎎/㎏ 6/6 225 ± 36 3283 ± 889 3.8 111.0
HMA02h14-48-3 ㎎/㎏ 6/6 224 ± 52 1664 ± 890 54.7** 109.7
HMA02h14-48-10 ㎎/㎏ 6/6 228 ± 65 0 ± 0
(100%) 		107.2** 101.2
참고: **는 p < 0.01이고; 괄호 안의 숫자는 종양 퇴행률이다.
본 발명의 서열:
Figure pct00002
Figure pct00003
SEQUENCE LISTING <110> HUTCHISON MEDIPHARMA LIMITED <120> Anti-CD47 antibody and uses thereof <130> PF210205PCT <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Ile Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Ile Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Ile Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Ile Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Arg Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Arg Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 106 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 Ser Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 Tyr Ile Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 15 Arg Ala Lys Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 16 Leu Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 17 Leu Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 18 Arg Ala Lys Arg Leu Val Glu 1 5 <210> 19 <211> 360 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 19 caggtccagc ttcagcagtc tgggactgaa ctggcaaaac ccggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctgggta cacgtttact agttattata tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacaaa ttctggagtg gattggatac attgatcctg ccaatgatta tagtgactac 180 aatcagaatt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag gacaacctac 240 atgcaactga ccagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aagattgggc 300 tacggtaata gctccccttt tgactactgg ggccaaggca ccactctcat agtatcttca 360 <210> 20 <211> 318 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 20 gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctgtaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattcat aactatttaa gttggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaaaagat tggtagatgg ggtcccatta 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaatttattt ttgtctacag tatgatgagt tgtacacgtt cggagggggg 300 accaggctgg aaataaaa 318 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably N or Q or H, D, K, R or E, or a conservative amino acid thereof <400> 21 Leu Gly Tyr Gly Xaa Ser Ser Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably D or E or N or Q, or a conservative amino acid thereof <400> 22 Arg Ala Lys Arg Leu Val Xaa 1 5

Claims (21)

  1. (1) 중쇄 가변 영역(VH)의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개(여기서 VH의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같다); 및/또는
    (2) 경쇄 가변 영역(VL)의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개(여기서 VL의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같다)
    를 포함하는, 단리된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 여기서 VH 및 VL이
    (1) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (2) 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (3) 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (4) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
    (5) 서열번호 7에 제시된 방화 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL
    중에서 선택되는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. (1) 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2 및 HCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개(여기서 HCDR1은 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 13 또는 17 또는 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다); 및/또는
    (2) 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3 중에서 선택된 1 내지 3개(여기서 LCDR1은 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 15 또는 18 또는 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다)
    를 포함하는, 단리된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    (1) 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2 및 HCDR3(여기서 HCDR1은 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 13 또는 17 또는 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다); 및/또는
    (2) 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3(여기서 LCDR1은 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 15 또는 18 또는 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다)
    를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (1) HCDR1이 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
    (2) LCDR1이 서열번호 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (1) 서열번호 1, 3, 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는
    (2) 서열번호 2, 4, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 일치하거나 또는 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서,
    VH가 서열번호 1, 3, 5, 6 및 7 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호 2, 4, 8, 9 및 10 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서,
    중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL이
    (1) 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (2) 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (3) 서열번호 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (4) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
    (5) 서열번호 7에 제시된 방화 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL
    중에서 선택되는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH가 서열번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG1TM 불변 영역, 인간 IgG4 불변 영역 또는 인간 IgG4P 불변 영역을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    쥐 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    완전길이 항체, 단쇄 항체, 단일-도메인 항체, 예를 들어 VHH, Fab, Fab', Fab'-SH, (Fab')2, 단쇄 항체, 예를 들어 scFv, Fv, dAb(도메인 항체) 또는 비스(다중)-특이적 항체인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산.
  15. 제14항의 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 벡터 또는 발현 벡터로서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 재조합 생산에 적합한 벡터.
  16. 제15항의 하나 이상의 재조합 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체 또는 면역 융합체.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제14항의 핵산, 제15항의 벡터, 제16항의 숙주 세포, 또는 제17항의 면역접합체 또는 면역 융합체를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 부형제를 임의로 포함하는, 약학 조성물.
  19. 개인에게, 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제14항의 핵산, 제15항의 벡터, 제16항의 숙주 세포, 제17항의 면역접합체 또는 면역 융합체, 또는 제18항의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    암이 혈액암 및 고형 종양, 예를 들어 방광암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, (악성)흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 자궁내막암, 신장암, (양성)흑색종, 전립선암, 갑상선암, 자궁경부암, 위암, 간암, 결장암, 난소암, 요로상피암 등을 포함하는, 방법.
  21. 샘플에서 CD47 단백질을 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제17항의 면역접합체 또는 면역 융합체와 접촉시키고;
    (b) 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 면역접합체 또는 면역융합체와 CD47 단백질간의 복합체 형성을 검출함
    을 포함하는, 방법.
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