CN116390755A

CN116390755A - 抗pd-1/cd40双特异性抗体及其用途

Info

Publication number: CN116390755A
Application number: CN202180069673.0A
Authority: CN
Inventors: 刘柏宏; 杨毅; 沈月雷
Original assignee: Youhe Pharmaceutical Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Youhe Pharmaceutical Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2023-07-04
Also published as: JP2023545521A; EP4229096A4; EP4229096A1; MX2023004275A; BR112023006989A2; AU2021359495A1; US20230220082A1; WO2022078357A1; IL302042A; KR20230092932A; CA3197463A1

Abstract

本公开涉及抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)，其中该抗原结合蛋白构建体特异性结合两种不同抗原(例如，PD‑1和CD40)。

Description

抗PD-1/CD40双特异性抗体及其用途

优先权声明

本申请要求于2020年10月14日提交的PCT申请号PCT/CN2020/120918和于2021年4月2日提交的PCT申请号PCT/CN2021/085335的权益。这两篇专利的全部内容通过引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)。

背景技术

双特异性抗体是可以同时结合两种不同类型的抗原或两种不同表位的人造蛋白。这种双重特异性开辟了广泛的应用，包括将T细胞重定向至肿瘤细胞、双重靶向不同疾病介质以及将有效载荷(payload)递送至靶向位点。卡妥索单抗(catumaxomab，抗EpCAM和抗CD3)和贝林妥欧单抗(blinatumomab，抗CD19和抗CD3)的获批已成为双特异性抗体研发的重要里程碑。

双特异性抗体具有多种应用。因此，需要继续开发基于双特异性抗体的各种治疗剂。

发明内容

本公开涉及抗原结合蛋白构建体，其中该抗原结合蛋白构建体特异性结合两种或更多种不同抗原(例如，PD-1和CD40)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体是靶向PD-1和CD40的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体通过多种机制有效治疗癌症。例如，双特异性抗体可阻断PD-1/PD-L1通路，从而激活免疫应答。此外，双特异性抗体可桥接T细胞和APC细胞，以促进抗原呈递并激活APC细胞中的CD40通路此外，双特异性抗体可以PD-1依赖性方式激活CD40通路，从而放大肿瘤微环境或肿瘤引流淋巴结中的免疫应答信号。该机制还可降低整体免疫激活并减少副作用，例如在肝中的毒性。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体不能通过Fc受体介导的(例如，FCγRIIB介导的)CD40聚集(clustering)激活CD40通路，从而进一步降低毒性，例如在表达高水平FCγRIIB的组织(诸如肝)中的毒性。

在一方面，本公开提供了抗原结合蛋白构建体，该抗原结合蛋白构建体包含特异性结合PD-1的第一抗原结合位点和特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体在其结合表达PD-1的细胞时诱导CD40通路的激活。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体在存在一个或多个表达PD-1的细胞的情况下诱导CD40通路的激活。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体在肿瘤微环境或肿瘤引流淋巴结中诱导CD40通路的激活。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体在不存在一个或多个表达PD-1的细胞的情况下不诱导CD40通路的激活。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体能够激活CD40通路，其中CD40通路的激活取决于抗原结合蛋白构建体与表达PD-1的细胞的结合。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点结合表达PD-1的细胞。在一些实施方案中，表达PD-1的细胞是T细胞、NK细胞或骨髓细胞(例如，T细胞)。在一些实施方案中，表达PD-1的细胞是T细胞。在一些实施方案中，细胞是髓样细胞(例如，巨噬细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)或T细胞)。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点结合表达CD40的细胞。在一些实施方案中，表达CD40的细胞是抗原呈递细胞。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体包含Fc区。在一些实施方案中，第二抗原结合位点与Fc区连接。在一些实施方案中，第二抗原结合位点与Fc区的C末端连接。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体不能通过Fc受体(例如，FCγRIIB)介导的机制或Fc受体(例如，FCγRIIB)介导的聚集激活CD40。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体不能诱导Fc受体(例如，FCγRIIB)介导的聚集。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体是双特异性抗体。

在一些实施方案中，特异性结合PD-1的第一抗原结合位点包括ScFv或VHH结构域。在一些实施方案中，特异性结合PD-1的抗原结合位点包括PD-1配体(例如，PD-L1)或其可溶性部分。在一些实施方案中，特异性结合CD40的第二抗原结合位点包括ScFv或VHH结构域。在一些实施方案中，特异性结合CD40的第二抗原结合位点包括CD40配体(例如，CD40L)或其可溶性部分。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包含如本文所述的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含如本文所述的重链可变区和轻链可变区。

在一些实施方案中，PD-1配体包含与SEQ ID NO:159的氨基酸19-238具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，CD40配体包含与SEQID NO:160的氨基酸47-261具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。

在一方面，本公开涉及抗原结合蛋白构建体，该抗原结合蛋白构建体包含第一重链可变区和第一轻链可变区，在一些实施方案中，该第一重链可变区和该第一轻链可变区彼此结合，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点；第二重链可变区和第二轻链可变区，在一些实施方案中，该第二重链可变区和该第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体包含第一多肽和第二多肽，该第一多肽包含第一重链可变区、第一重链恒定区2(CH2)和第一重链恒定区3(CH3)；该第二多肽包含第二重链可变区、第二重链恒定区2(CH2)和第二重链恒定区3(CH3)。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体包含第三多肽和第四多肽，该第三多肽包含第一轻链可变区；该第四多肽包含第二轻链可变区。

在一些实施方案中，第二多肽还包含第二轻链可变区。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体包含第三多肽，该第三多肽包含第一轻链可变区。

在一些实施方案中，第一多肽还包含第一轻链可变区。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体包含第一多肽和第二多肽，该第一多肽包含第一重链可变区、第二重链可变区和第二轻链可变区；该第二多肽包含第一轻链可变区。

在一些实施方案中，第一多肽还包含重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)。

在一些实施方案中，第一重链可变区(VH1)包含互补决定区(CDR)1、2和3。在一些实施方案中，VH1 CDR1区包含与选择的VH1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，VH1 CDR2区包含与选择的VH1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，VH1 CDR3区包含与选择的VH1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；第一轻链可变区(VL1)包含CDR1、2和3。在一些实施方案中，VL1CDR1区包含与选择的VL1CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，VL1CDR2区包含与选择的VL1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，VL1CDR3区包含与选择的VL1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所选的VH1 CDR1、2和3氨基酸序列、所选的VL1 CDR1、2和3氨基酸序列是以下项中的一者：

(1)根据Kabat编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，所选的VL1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；

(2)根据Chothia编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、20和21所示，所选的VL1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、23和24所示；

(3)根据Kabat编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示，所选的VL1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示；

(4)根据Chothia编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25、26和27所示，所选的VL1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28、29和30所示；

(5)根据Kabat编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、14和15所示，所选的VL1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16、17和18所示；以及

(6)根据Chothia编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:31、32和33所示，所选的VL1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、35和36所示。

在一些实施方案中，第二重链可变区(VH2)包含CDR1、2和3。在一些实施方案中，VH2 CDR1区包含与选择的VH2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，VH2CDR2区包含与选择的VH2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，VH2 CDR3区包含与选择的VH2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；第二轻链可变区(VL2)包含CDR1、2和3。在一些实施方案中，VL2 CDR1区包含与选择的VL2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，VL2 CDR2区包含与选择的VL2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，VL2 CDR3区包含与选择的VL2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所选的VH2 CDR1、2和3氨基酸序列以及所选的VL2 CDR1、2和3氨基酸序列是以下项中的一者：

(1)根据Kabat编号规则，所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:59、60和61所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:62、63和64所示；

(2)根据Chothia编号规则，所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:77、78和79所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:80、81和82所示；

(3)根据Kabat编号规则，所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:65、66和67所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:68、69和70所示；

(4)根据Chothia编号规则，所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:83、84和85所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:86、87和88所示；

(5)根据Kabat编号规则，所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:71、72和73所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:74、75和76所示；以及

(6)根据Chothia编号规则，所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:89、90和91所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:92、93和94所示。

在一些实施方案中，本公开涉及抗原结合蛋白构建体，其中

(1)根据Kabat编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，所选的VL1 CDR1、2、3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；所选的VH2CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:65、66和67所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:68、69和70所示；或者

(2)根据Chothia编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、20和21所示，所选的VL1 CDR1、2、3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、23和24所示；所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:83、84和85所示，所选的VL2CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:86、87和88所示。

在一些实施方案中，第一重链可变区包含与SEQ ID NO:40、41、42或53具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:43、44、45或54具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第一重链可变区包含与SEQ ID NO:46、47、48、49或55具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:50、51、52或56具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第一重链可变区包含与SEQ ID NO:57具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:58具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第二重链可变区包含与SEQ ID NO:98、99、100或120具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:101、102、103、104或121具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第二重链可变区包含与SEQ ID NO:105、106、107、108、122、126或128具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第二轻链可变区包含与SEQ IDNO:109、110、111、123、127或129具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第二重链可变区包含与SEQ ID NO:112、113、114、115或124具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:116、117、118、119或125具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第一重链可变区包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第二重链可变区包含与SEQ ID NO:108或126具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:110或127具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:130具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第三多肽包含与SEQ ID NO:131具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:132或133具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:130具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；第二多肽包含与SEQ ID NO:132或133具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；第三多肽包含与SEQ ID NO:131具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:134或135具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第二多肽包含与SEQ ID NO:136具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:137或138具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第二多肽包含与SEQ ID NO:139具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体是双特异性抗体。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体是Fab-scFv-Fc。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体是TrioMab、具有共有轻链的双特异性抗体、CrossMab、2:1CrossMab、2:2CrossMab、Duobody、双可变结构域抗体(DVD-Ig)、scFv-IgG、IgG-IgG形式抗体、Fab-scFv-Fc形式抗体、TF、ADAPTIR、双特异性T细胞衔接体(BiTE)、BiTE-Fc、双亲和重靶向抗体(DART)、DART-Fc(具有Fc的DART)、四价DART、串联双抗体(TandAb)、scFv-scFv-scFv、ImmTAC、三特异性纳米抗体或三特异性杀伤衔接体(TriKE)。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体包含来自IgG1或IgG4的一个或多个重链恒定结构域。

在一些实施方案中，该一个或多个重链恒定结构域包含LALA突变和/或杵臼(knob-into-hole，KIH)突变。

在一方面，本公开涉及双特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性抗体或其抗原结合片段包含第一重链多肽、第一轻链多肽、第二重链多肽和第二轻链多肽，该第一重链多肽包含第一重链可变区，该第一轻链多肽包含第一轻链可变区，该第二重链多肽包含第二重链可变区，该第二轻链多肽包含第二轻链可变区。

在一些实施方案中，第一重链可变区和第一轻链可变区彼此结合，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点，第二重链可变区和第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，本公开涉及双特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性抗体或其抗原结合片段包含：第一重链可变区(VH1)，该VH1包含互补决定区(CDR)1、2和3，在一些实施方案中，该VH1 CDR1区包含与选择的VH1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VH1 CDR2区包含与选择的VH1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VH1 CDR3区包含与选择的VH1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；第一轻链可变区(VL1)，该VL1包含CDR1、2和3，在一些实施方案中，该VL1 CDR1区包含与选择的VL1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VL1 CDR2区包含与选择的VL1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VL1 CDR3区包含与选择的VL1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；第二重链可变区(VH2)，该VH2包含互补决定区(CDR)1、2和3，在一些实施方案中，该VH2 CDR1区包含与选择的VH2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VH2 CDR2区包含与选择的VH2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VH2 CDR3区包含与选择的VH2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；和第二轻链可变区(VL2)，该VL2包含CDR1、2和3，在一些实施方案中，该VL2 CDR1区包含与选择的VL2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VL2 CDR2区包含与选择的VL2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VL2 CDR3区包含与选择的VL2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所选的VH1 CDR1、2和3氨基酸序列、所选的VL1 CDR1、2和3氨基酸序列、所选的VH2 CDR1、2和3氨基酸序列以及所选的VL2 CDR1、2和3氨基酸序列是以下项中的一者：

(1)根据Kabat编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，所选的VL1 CDR1、2、3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；所选的VH2CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:65、66和67所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:68、69和70所示；以及

在一些实施方案中，第一重链多肽包含与SEQ ID NO:130具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，第一轻链多肽包含与SEQ ID NO:131具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一方面，本公开涉及双特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性抗体或其抗原结合片段包含重链多肽、轻链多肽和单链可变片段多肽，该重链多肽包含第一重链可变区，该轻链多肽包含第一轻链可变区，该单链可变片段多肽包含第二重链可变区和第二轻链可变区。在一些实施方案中，第一重链可变区和第一轻链可变区彼此结合，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点，第二重链可变区和第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，单链可变片段多肽从N末端至C末端包含：第二重链可变区、接头肽序列、第二轻链可变区、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)。

在一些实施方案中，接头肽序列包括与ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:152)具有至少80％的同一性的序列。

在一些实施方案中，本公开涉及如本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性抗体或其抗原结合片段包含：第一重链可变区(VH1)，该VH1包含互补决定区(CDR)1、2和3，在一些实施方案中，该VH1 CDR1区包含与选择的VH1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VH1 CDR2区包含与选择的VH1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VH1 CDR3区包含与选择的VH1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；第一轻链可变区(VL1)，该VL1包含CDR1、2和3，在一些实施方案中，该VL1 CDR1区包含与选择的VL1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VL1 CDR2区包含与选择的VL1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VL1 CDR3区包含与选择的VL1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；第二重链可变区(VH2)，该VH2包含互补决定区(CDR)1、2和3，在一些实施方案中，该VH2CDR1区包含与选择的VH2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VH2CDR2区包含与选择的VH2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VH2CDR3区包含与选择的VH2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；和第二轻链可变区(VL2)，该VL2包含CDR1、2和3，在一些实施方案中，该VL2 CDR1区包含与选择的VL2CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VL2 CDR2区包含与选择的VL2CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，该VL2 CDR3区包含与选择的VL2CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开涉及双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(1)重链多肽包含与SEQ ID NO:130具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，轻链多肽包含与SEQ ID NO:131具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；并且

(2)单链可变片段多肽包含与SEQ ID NO:132或133具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一方面，本公开涉及双特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性抗体或其抗原结合片段包含重链多肽和轻链多肽，该重链多肽包含第一重链可变区，并且该轻链多肽包含第一轻链可变区。在一些实施方案中，单链可变片段多肽与重链多肽的C末端连接。在一些实施方案中，单链可变片段多肽包含第二重链可变区和第二轻链可变区。在一些实施方案中，第一重链可变区和第一轻链可变区彼此结合，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点，并且第二重链可变区和第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，单链可变片段多肽通过第一接头肽序列与第一重链多肽连接。

在一些实施方案中，第一接头肽序列包括与GGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:153)具有至少80％的同一性的序列。

在一些实施方案中，单链可变片段多肽从N末端至C末端包含：第二轻链可变区、第二接头肽序列和第二重链可变区。

在一些实施方案中，第二接头肽序列包括与GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:154)具有至少80％的同一性的序列。

(2)根据Chothia编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、20和21所示，并且所选的VL1 CDR1、2、3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、23和24所示；所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:83、84和85所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:86、87和88所示。

在一些实施方案中，本公开涉及如本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(1)重链多肽包含与SEQ ID NO:134或135具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；和

(2)轻链多肽包含与SEQ ID NO:136具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

(1)重链多肽包含与SEQ ID NO:137或138具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；和

(2)轻链多肽包含与SEQ ID NO:139具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

在一方面，本公开提供了双特异性抗体，该双特异性抗体包含：包含Fc区的抗PD-1抗体和特异性结合CD40的抗原结合位点。在一些实施方案中，抗原结合位点与抗PD-1抗体的Fc区连接。

在一些实施方案中，双特异性抗体在存在一个或多个表达PD-1的细胞的情况下诱导免疫细胞中CD40通路的激活。在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗原结合位点包括ScFv或VHH结构域。在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗原结合位点包括CD40配体(例如，CD40L)或其可溶性部分。在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗原结合位点与Fc区的C末端连接。在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗原结合位点插入到Fc区(例如，在3A位点处)。

在一方面，本公开提供了抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)，该抗原结合蛋白构建体包含含有Fc区的抗体和特异性结合CD40的抗原结合位点(例如，一个或两个抗原结合位点)，或由其组成，其中该抗体特异性结合靶标。在一些实施方案中，抗原结合位点与抗体的Fc区连接。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体在存在一个或多个表达靶标的细胞的情况下诱导免疫细胞中CD40通路的激活。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体能够激活CD40通路。在一些实施方案中，CD40通路的激活取决于抗原结合蛋白构建体与表达靶标的细胞的结合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体在肿瘤微环境或肿瘤引流淋巴结中诱导CD40通路的激活。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体在不存在一个或多个表达靶标的细胞的情况下不诱导CD40通路的激活。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体不能通过Fc受体介导的机制或Fc受体介导的聚集激活CD40通路。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体在不存在表达PD-1的细胞的情况下不能激活CD40通路。

在一些实施方案中，靶标是免疫检查点分子。在一些实施方案中，靶标是癌症特异性抗原或癌症相关抗原。在一些实施方案中，靶标是PD-1。在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗原结合位点包括ScFv或VHH结构域。在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗原结合位点包括CD40配体(例如，CD40L)或其可溶性部分。在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗原结合位点与Fc区的C末端连接。在一些实施方案中，特异性结合CD40的抗原结合位点插入到Fc区(例如，在3A位点处)。

在一方面，本公开涉及抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物包含与治疗剂共价结合的如本文所述的抗原结合蛋白构建体或如本文所述的双特异性抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。

在一方面，本公开涉及治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含如本文所述的抗原结合蛋白构建体、如本文所述的双特异性抗体或抗原结合片段、或如本文所述的抗体药物缀合物。

在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。

在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、头颈癌、肾细胞癌(RCC)、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌(Merkel-cellcarcinoma)、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。

在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤或恶性血液肿瘤。

在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用抗CTLA4抗体、抗Her2抗体或靶向肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。

在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用化学疗法。

在一方面，本公开涉及降低肿瘤生长速率的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的组合物，该组合物包含如本文所述的抗原结合蛋白构建体、如本文所述的双特异性抗体或抗原结合片段、或如本文所述的抗体药物缀合物。

在一方面，本公开涉及杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的组合物，该组合物包含如本文所述的抗原结合蛋白构建体、如本文所述的双特异性抗体或抗原结合片段、或如本文所述的抗体药物缀合物。

在一方面，本公开涉及药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的抗原结合蛋白构建体或如本文所述的双特异性抗体或抗原结合片段，和药学上可接受的载体。

在一方面，本公开涉及药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的抗体药物缀合物，和药学上可接受的载体。

在一方面，本公开涉及双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段包含：特异性结合CD40的单链可变片段多肽。在一些实施方案中，单链可变片段多肽与双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段的重链多肽的C末端连接。

在一些实施方案中，双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段特异性结合癌症特异性抗原或癌症相关抗原。

在一些实施方案中，双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段特异性结合免疫检查点分子。

在一方面，本公开提供了核酸，该核酸包含编码如本文所述的任何多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸编码双特异性抗体。在一些实施方案中，核酸是cDNA。

在一方面，本公开提供了载体，该载体包含本文所述的核酸中的一种或多种核酸。

在一方面，本公开提供了细胞，该细胞包含本文所述的载体。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。在一方面，本公开提供了细胞，该细胞包含本文所述的核酸中的一种或多种核酸。

如本文所用，术语“抗原结合蛋白构建体”是(i)包括一个或多个抗原结合结构域的单一多肽或(ii)一起形成一个或多个抗原结合结构域的两个或更多个多肽(例如，相同或不同的多肽)的复合物。本文描述了抗原结合蛋白构建体的非限制性示例和方面。

如本文所用，术语“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”是指能够特异性结合抗原的一个或多个蛋白质结构域(例如，由来自单个多肽的氨基酸形成或由来自两个或更多个多肽(例如，相同或不同的多肽)的氨基酸形成)。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以与天然存在的抗体的特异性和亲和力相似的特异性和亲和力结合抗原或表位。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是抗体或其片段。抗原结合结构域的一个示例是由VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域可包括替代骨架。在一些实施方案中，抗原结合结构域是配体(例如，PD-L1、CD154或其可溶性部分)。例如，抗原可以是PD-1受体，并且抗原结合结构域(例如，PD-L1的可溶性部分)可特异性结合PD-1受体。在一些实施方案中，抗原结合结构域是VHH结构域。本文描述了抗原结合结构域的非限制性示例。

如本文所用，术语“抗体”是指含有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任一者或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任一者)，并且能够特异性结合抗原或表位的任何抗原结合分子。抗体的非限制性示例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、嵌合抗体、重链抗体、单结构域抗体(纳米抗体)、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可含有人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如双特异性抗体、单链抗体、双抗体、直链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中该抗体的该部分能够特异性结合抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段含有至少一个可变结构域(例如，重链可变结构域或轻链可变结构域)。抗体片段的非限制性示例包括例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段和VHH。如本文所用，“VHH”是重链抗体的可变结构域。

如本文所用，术语“人抗体”是指由来源于人的核酸(例如，重排的人免疫球蛋白重链或轻链基因座)编码的抗体。在一些实施方案中，人抗体从人中收集或在人细胞培养物(例如，人杂交瘤细胞)中产生。在一些实施方案中，人抗体在非人细胞(例如，小鼠或仓鼠细胞系)中产生。在一些实施方案中，人抗体在细菌或酵母细胞中产生。在一些实施方案中，人抗体在含有未经重排或重排的人免疫球蛋白基因座(例如，重链或轻链人免疫球蛋白基因座)的转基因非人动物(例如，牛)中产生。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人抗体，其含有最少的来源于非人(例如，小鼠)免疫球蛋白的序列，并含有来源于人免疫球蛋白的序列。在非限制性示例中，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中该受体抗体的高变区(例如，CDR)残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人抗体(例如，供体抗体)，例如小鼠、大鼠或兔抗体的高变区(例如，CDR)残基替换。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人(例如，小鼠)免疫球蛋白残基替换。在一些实施方案中，人源化抗体可含有在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可进行这些修饰以进一步改进抗体性能。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部的部分，其中全部或基本上全部的高变环(CDR)对应于非人(例如，小鼠)免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白的框架区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。人源化抗体可使用本领域已知的分子生物学方法来产生。本文描述了用于产生人源化抗体的方法的非限制性示例。

如本文所用，术语“嵌合抗体”指含有存在于至少两个不同物种中的序列的抗体(例如，来自两个不同哺乳动物物种的抗体，诸如人和小鼠抗体)。嵌合抗体的非限制性示例是含有非人(例如，小鼠)抗体的可变结构域序列(例如，轻链和/或重链可变结构域序列的全部或部分)和人抗体的恒定结构域的抗体。嵌合抗体的其他示例在本文中描述并且是本领域已知的。

如本文所用，术语“多特异性抗原结合蛋白构建体”是包括特异性结合两个或更多个不同表位的两个或更多个不同抗原结合结构域的抗原结合蛋白构建体。两个或更多个不同表位可以是相同抗原(例如，细胞表面上存在的单个多肽)上或不同抗原(例如，同一细胞表面上存在的或不同细胞表面上存在的不同蛋白质)上的表位。在一些方面，多特异性抗原结合蛋白构建体结合两个不同表位(即，“双特异性抗原结合蛋白构建体”)。在一些方面，多特异性抗原结合蛋白构建体结合三个不同表位(即，“三特异性抗原结合蛋白构建体”)。在一些方面，多特异性抗原结合蛋白构建体结合四个不同表位(即，“四特异性抗原结合蛋白构建体”)。在一些方面，多特异性抗原结合蛋白构建体结合五个不同表位(即，“五特异性抗原结合蛋白构建体”)。每种结合特异性可以任何合适的化合价存在。本文描述了多特异性抗原结合蛋白构建体的非限制性示例。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合两个不同表位的抗体。表位可以在同一抗原上或在不同抗原上。

如本文所用，当提及抗体时，短语“特异性结合”是指相比于其他分子，抗体优选地与其靶分子(例如，PD-1)相互作用，因为相互作用取决于靶分子上特定结构(即，抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，试剂识别并结合包括特定结构的分子，而非通常情况下的所有分子。特异性结合靶分子的抗体可被称为靶特异性抗体。例如，特异性结合PD-1分子的抗体可被称为PD-1特异性抗体或抗PD-1抗体。

除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的，并不旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用方式整体并入本文。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

从下文的具体实施方案和附图以及权利要求中可以清楚地了解本发明的其他特征和优点。

附图说明

图1A是双特异性抗体Fab-ScFV-IgG的示意性结构。

图1B是双特异性抗体ScFV-HC-IgG的示意性结构。

图2A示出了Fab-ScFV-IgG4的凝胶电泳结果。M为marker。Fab-ScFV-IgG4在泳道2。

图2B示出了ScFV-HC-IgG4的凝胶电泳结果。M为marker。ScFV-HC-IgG4在泳道3。

图3示出了由抗PD1抗体1A7-H2K3-IgG4(PD-1)、Fab-ScFV-IgG4或ScFV-HC-IgG4激活后的Jurkat-Luc-hPD-1细胞中的发光水平。抗体阻断PD1/PD-L1通路，从而激活Jurkat-Luc-hPD-1细胞。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图4A示出了在存在CHO-K1-hPD1和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自抗PD-1抗体1A7-H2K3-IgG4和抗CD40抗体6A7-H4K2-IgG2 1:1比例的组合(PD-1+CD40)、Fab-ScFV-IgG4和ScFV-HC-IgG4。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图4B示出了在存在选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自抗PD-1抗体1A7-H2K3-IgG4和抗CD40抗体6A7-H4K2-IgG2 1:1比例的组合(PD-1+CD40)、Fab-ScFV-IgG4和ScFV-HC-IgG4。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图5示出了在存在CHO-K1-hFcγRIIB和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(CD40)、Fab-ScFV-IgG4和ScFV-HC-IgG4。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图6A示出了在存在选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(CD40)、ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图6B示出了在存在Jurkat-PD1细胞和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(CD40)、ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图6C示出了在存在CHO-K1-hFcγRIIB细胞和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(CD40)、ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图7是示出了注射小鼠结肠癌细胞MC38，并用双特异性抗体ScFV-HC-IgG4或ScFV-HC-IgG1-LALA处理的B-hCD40小鼠的体重随时间变化的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图8是示出了注射小鼠结肠癌细胞MC38，并用双特异性抗体ScFV-HC-IgG4或ScFV-HC-IgG1-LALA处理的B-hCD40小鼠的体重变化百分比随时间变化的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图9是示出了注射小鼠结肠癌细胞MC38，并用双特异性抗体ScFV-HC-IgG4或ScFV-HC-IgG1-LALA处理的不同组B-hCD40小鼠的平均肿瘤体积的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图10是示出了注射B16F10-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重随时间变化的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图11是示出了注射B16F10-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重变化百分比随时间变化的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图12是示出了注射B16F10-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠的平均肿瘤体积的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图13示出了用MC38-hPD-L1细胞注射，并用单特异性或双特异性抗体处理的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠在分组后第25天的平均肿瘤体积。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图14是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重随时间变化的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图15是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重变化百分比随时间变化的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图16是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠的平均肿瘤体积的图。注射生理盐水(PS)溶液作为对照。

图17A示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠在分组后第7天的小鼠血液ALT水平。

图17B示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠在分组后第13天的小鼠血液ALT水平。

图17C示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠在分组后第7天的小鼠血液AST水平。

图17D示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠在分组后第13天的小鼠血液AST水平。

图17E示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用PBS处理的G1组B-hPD-1/hCD40小鼠中小鼠肝和肾脏的代表性组织学切片图像。

图17F示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用塞鲁单抗(Selicrelumab)处理的G2组B-hPD-1/hCD40小鼠中小鼠肝和肾的代表性组织学切片图像。

图17G示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2处理的G3组B-hPD-1/hCD40小鼠中小鼠肝和肾的代表性组织学切片图像。

图17H示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4处理的G4组B-hPD-1/hCD40小鼠中小鼠肝和肾的代表性组织学切片图像。

图17I示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用ScFV-HC-IgG4处理的G5组B-hPD-1/hCD40小鼠中小鼠肝和肾的代表性组织学切片图像。

图17J示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4和抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(Combo)处理的G1组B-hPD-1/hCD40小鼠中小鼠肝和肾的代表性组织学切片图像。

图18A是双特异性抗体PD1-C40-6A7-FV3A的示意性结构。

图18B示出了PD1-C40-6A7-FV3A的凝胶电泳结果。M为marker。PD1-C40-6A7-FV3A在泳道4。

图18C示出了在存在CHO-K1-hFcγRIIB细胞和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(CD40)、Fab-ScFv-IgG4和PD1-C40-6A7-FV3A。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图18D示出了在存在CHO-K1-hPD-1细胞(CHO PD-1)和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自抗PD-1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4和抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(PD-1+CD40)、Fab-ScFv-IgG4和PD1-C40-6A7-FV3A。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图19列出了通过Kabat编号定义的抗PD1抗体25-1A7、18-3F1和3-6G1的CDR序列。

图20列出了通过Chothia编号定义的抗PD1抗体25-1A7、18-3F1和3-6G1的CDR序列。

图21列出了人、小鼠和嵌合PD-1的氨基酸序列。

图22列出了人源化和小鼠抗PD1抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。

图23列出了通过Kabat编号定义的抗CD40抗体03-7F10、06-6A7和07-4H6的CDR序列。

图24列出了通过Chothia编号定义的抗CD40抗体03-7F10、06-6A7和07-4H6的CDR序列。

图25列出了人、小鼠和嵌合CD40的氨基酸序列。

图26列出了人源化和小鼠抗CD40抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。

图27是示出了注射B16F10-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照。

图28是示出了注射B16F10-hPD-L1细胞，并用单特异性或双特异性抗体处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的肿瘤体积随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照。

图29A是示出了注射B16F10-hPD-L1细胞，并用0.1-30mg/kg双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA处理的B-hPD-1/hCD40小鼠(G2-G7)在分组后70天时间内的肿瘤体积的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图29B是示出了注射B16F10-hPD-L1细胞，并用0.1mg/kg-30mg/kg双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G2-G7)处理的B-hPD-1/hCD40小鼠在分组后70天时间内的存活百分比的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图30A是一组直方图，其示出了在MC38肿瘤模型中，CD45+白细胞中小鼠CD3+ T细胞的百分比(I)；CD45+白细胞中小鼠CD8+ T细胞的百分比(II)；以及T细胞中CD8+ T细胞与Treg细胞的比率(III)。

图30B是一组直方图，其示出了在MC38肿瘤模型中，CD8+ T细胞中人PD-1(CD279)阳性细胞的百分比(I)；Treg细胞中人PD-1阳性细胞的百分比(II)；CD4+(非Treg)T细胞中人PD-1阳性细胞的百分比(III)；以及NK细胞中人PD-1阳性细胞的百分比(IV)。

图30C是一组直方图，其示出了在MC38肿瘤模型中，小鼠CD45+白细胞中树突细胞(DC)的百分比(I)；小鼠CD45+白细胞中髓源性抑制细胞(MDSC)的百分比(II)；DC细胞中CD80+细胞的百分比(III)；以及DC细胞中MHCII+细胞的百分比(IV)。

图30D是一组直方图，其示出了在B16F10肿瘤模型中，CD45+白细胞中小鼠CD3+ T细胞的百分比(I)；CD45+白细胞中小鼠CD8+ T细胞的百分比(II)；以及T细胞中CD8+ T细胞与Treg细胞的比率(III)。

图30E是一组直方图，其示出了在B16F10肿瘤模型中，CD8+ T细胞中人PD-1(CD279)阳性细胞的百分比(I)；Treg细胞中人PD-1阳性细胞的百分比(II)；CD4+(非Treg)T细胞中人PD-1阳性细胞的百分比(III)；以及NK细胞中人PD-1阳性细胞的百分比(IV)。

图30F是一组直方图，其示出了在B16F10肿瘤模型中，小鼠CD45+白细胞中树突细胞(DC)的百分比(I)；小鼠CD45+白细胞中髓源性抑制细胞(MDSC)的百分比(II)；DC细胞中CD80+细胞的百分比(III)；DC细胞中CD86+细胞的百分比(IV)；以及DC细胞中MHCII+细胞的百分比(V)。

图31A至图31B示出了流式细胞术分析的策略。

图32是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2-G4)、双特异性抗体(G5和G6)或单特异性抗体的组合(G7和G8)处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图33是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2-G4)、双特异性抗体(G5和G6)或单特异性抗体的组合(G7和G8)处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重变化随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图34是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2-G4)、双特异性抗体(G5和G6)或单特异性抗体的组合(G7和G8)处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的肿瘤体积随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图35是示出了注射单克隆抗体(G2和G3)、具有不同结构的双特异性抗体(G4-G7)或双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G8)的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图36是示出了注射单克隆抗体(G2和G3)、具有不同结构的双特异性抗体(G4-G7)或双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G8)的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重变化随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图37是双特异性抗体1A7-塞鲁单抗-DART-IgG4的DART-Fc的示意性结构。DART是指双亲和重靶向抗体。

图38A示出了注射PBS(G1)、单克隆抗体(G2和G3)、具有不同结构的双特异性抗体(G4-G7)或双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G8)的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠在分组后第7天的小鼠血液ALT水平。

图38B示出了注射PBS(G1)、单克隆抗体(G2和G3)、具有不同结构的双特异性抗体(G4-G7)或双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G8)的不同组B-hPD-1/hCD40小鼠在分组后第7天的小鼠血液AST水平。

图39是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2和G3)、单特异性抗体的组合(G4)或双特异性抗体(G5-G6)处理，或注射PBS溶液作为对照(G1)的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重随时间变化的图。

图40是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2和G3)、单特异性抗体的组合(G4)或双特异性抗体(G5-G6)处理，或注射PBS溶液作为对照(G1)的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重变化随时间变化的图。

图41是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2和G3)、单特异性抗体的组合(G4)或双特异性抗体(G5-G6)处理，或注射PBS溶液作为对照(G1)的B-hPD-1/hCD40小鼠的肿瘤体积随时间变化的图。

图42A示出了在存在Jurkat-PD1细胞和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自BsAb帕博利珠单抗-seli-HC-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FV3A-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FVKH-IgG4、1A7-塞鲁单抗-DART-IgG4，以及抗CD40单克隆抗体塞鲁单抗-IgG2。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图42B示出了在存在Jurkat-PD1细胞和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自BsAb帕博利珠单抗-6A7-HC-IgG1-LALA、SdAb-6A7-FVHC-IgG1-LALA、帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4；抗CD40单克隆抗体APX005M-IgG1-S267E和6A7-H4K2-IgG2。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图42C示出了在不存在Jukat-luc-PD1细胞和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自BsAb帕博利珠单抗-seli-HC-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FV3A-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FVKH-IgG4、1A7-塞鲁单抗-DART-IgG4，以及抗CD40单克隆抗体塞鲁单抗-IgG2。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图42D示出了在不存在Jukat-luc-PD1细胞和选择的抗体的情况下，Jurkat-Luc-hCD40细胞中的发光水平。抗体选自BsAb帕博利珠单抗-6A7-HC-IgG1-LALA、SdAb-6A7-FVHC-IgG1-LALA、帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4；抗CD40单克隆抗体APX005M-IgG1-S267E和6A7-H4K2-IgG2。发光信号表示为相对光单位(Rlu)。

图43A至图43B示出了PD1/CD40双特异性抗体诱导的CD40信号传导通路激活的假设机制。

图44A是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2、G3和G4)、双特异性抗体(G5-G7)或单特异性抗体的组合(G8和G9)处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重随时间变化的图。注射PS溶液作为对照(G1)。

图44B是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2、G3和G4)、双特异性抗体(G5-G7)或单特异性抗体的组合(G8和G9)处理的B-hPD-1/hCD40小鼠的体重变化随时间变化的图。注射PS溶液作为对照(G1)。

图44C是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用单克隆抗体(G2、G3和G4)、双特异性抗体(G5-G7)或单特异性抗体(G8和G9)的组合处理的B-hPD-1/hPD-L1/hCD40小鼠的肿瘤体积随时间变化的图。注射PS溶液作为对照(G1)。

图45是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用ScFV-HC-IgG1-LALA(G2和G5)、阿替利珠单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G3和G6)或阿维鲁单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G4和G7)处理的B-hPD-1/hPD-L1/hCD40小鼠的体重随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图46是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用ScFV-HC-IgG1-LALA(G2和G5)、阿替利珠单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G3和G6)或阿维鲁单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G4和G7)处理的B-hPD-1/hPD-L1/hCD40小鼠的体重变化随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图47是示出了注射MC38-hPD-L1细胞，并用ScFV-HC-IgG1-LALA(G2和G5)、阿替利珠单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G3和G6)或阿维鲁单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G4和G7)处理的B-hPD-1/hPD-L1/hCD40小鼠的肿瘤体积随时间变化的图。注射PBS溶液作为对照(G1)。

图48列出了本公开所述的序列。

具体实施方式

双特异性抗体或其抗原结合片段是可同时结合两个不同表位(例如，在两个不同抗原上)的人造蛋白。

在一些实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合片段可通过修饰免疫球蛋白(例如，IgG)来构建。例如，抗PD-1IgG的Fab区可用靶向CD40的scFv结构域替换。另选地，靶向CD40的scFv结构域可与抗PD-1IgG重链的C末端连接。

在一些实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合片段可具有两条臂(臂A和B)。每条臂具有一个重链可变区和一个轻链可变区，形成抗原结合结构域(或抗原结合位点)。

双特异性抗体或其抗原结合片段可以是IgG样和非IgG样的。IgG样双特异性抗体可以具两条Fab臂和一个Fc区，并且这两条Fab臂结合不同的抗原。非IgG样双特异性抗体或抗原结合片段可以是例如化学连接的Fab(例如，两个Fab区化学连接)和单链可变片段(scFv)。例如，scFv可具有两个重链可变区和两个轻链可变区。在一些实施方案中，一条臂是scFv多肽。在一些实施方案中，两条臂都是scFv多肽。

抗PD-1/CD40抗原结合蛋白构建体

免疫系统可区分体内的正常细胞和被认为是“外来的”细胞，这使得免疫系统攻击外来细胞，而不影响正常细胞。这种机制有时涉及被称为免疫检查点的蛋白质。免疫检查点是免疫系统中开启信号(共刺激分子)或者关闭信号的分子。

检查点抑制剂可防止免疫系统攻击正常组织，从而预防自身免疫性疾病。许多肿瘤细胞也表达检查点抑制剂。这些肿瘤细胞通过“拉拢”(co-opt)某些免疫检查点途径(特别是在对肿瘤抗原特异性的T细胞中)逃避免疫监视(Creelan，Benjamin C.“Update onimmune checkpoint inhibitors in lung cancer”，Cancer Control 21.1(2014年)：第80-89页)。因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用启动的，所以它们很容易被针对配体和/或其受体的抗体阻断。

本公开提供了具有如本文所述的各种形式的抗PD1/CD40抗原结合蛋白构建体。不希望受理论的束缚，假设在存在PD-1表达细胞的情况下，PD1/CD40双特异性抗体可有效地激活CD40信号传导途径，其机制可能是CD40聚集在PD-1表达细胞和CD40表达细胞的接触面。双特异性抗体可促进CD40和PD1分子在接触表面的富集。这种富集进一步增加了CD40聚集，从而激活了CD40通路。

PD-1

PD-1(程序性死亡-1)是免疫检查点，通过促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)同时减少调节性T细胞(抗炎性、抑制性T细胞)的凋亡的双重机制来防御自身免疫。

PD-1主要表达于T细胞和初始B细胞表面；PD-1的两种配体(PD-L1和PD-L2)在抗原呈递细胞(APC)中广泛表达。PD-1与其配体的相互作用在免疫应答的负调节中起重要作用。抑制PD-1与其配体的结合可使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤作用，从而达到杀伤肿瘤组织和治疗癌症的效果。

PD-L1在许多不同癌症的肿瘤细胞上表达。通过结合T细胞上的PD-1使得其被抑制，PD-L1表达是肿瘤细胞用来逃避免疫攻击的主要机制。从概念上讲，PD-L1的过表达可能是由两种机制引起，即先天机制和适应性机制。癌细胞上PD-L1的内在表达与这些肿瘤细胞中的细胞/遗传畸变有关。包括AKT和STAT通路的细胞信号传导的激活导致PD-L1表达增加。在原发性纵隔B细胞淋巴瘤中，MHC II类反式激活因子(CIITA)与PD-L1或PD-L2发生基因融合，导致这些蛋白的过表达。PD-L1和PD-L2所位于的染色体9p23-24的扩增导致这两种蛋白在经典霍奇金淋巴瘤中的表达增加。适应性机制与肿瘤微环境中PD-L1表达的诱导有关。PD-L1可响应于干扰素γ而在肿瘤细胞上被诱导。在微卫星不稳定性结肠癌中，PD-L1主要在肿瘤中的髓样细胞上表达，进而抑制细胞毒性T细胞功能。

使用PD-1阻断来增强抗肿瘤免疫源于慢性感染模型中的观察结果，在这些模型中，阻止PD-1相互作用逆转了T细胞耗竭。类似地，阻断PD-1阻止了T细胞PD-1/肿瘤细胞PD-L1或T细胞PD-1/肿瘤细胞PD-L2相互作用，从而恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫。

关于PD-1的详细描述以及抗PD-1抗体治疗癌症的应用描述于Topalian,SuzanneL.等人，“Safety,activity,and immune correlates of anti–PD-1antibody incancer”，New England Journal of Medicine 366.26(2012年)：第2443-2454页；Hirano,Fumiya等人，“Blockade of B7-H1 and PD-1by monoclonal antibodies potentiatescancer therapeutic immunity”，Cancer research 65.3(2005年)：第1089-1096页；Raedler,Lisa A.“Keytruda(pembrolizumab):first PD-1inhibitor approved forpreviously treated unresectable or metastatic melanoma”，American health&drugbenefits 8.Spec Feature(2015年)96；Kwok,Gerry等人，“Pembrolizumab(Keytruda)”，(2016年)：第2777-2789页；US 20170247454；US 9,834,606B；和US 8,728,474；这些文献中的每一篇通过引用方式整体并入。

CD40

CD40(也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5或TNFRSF5)是在抗原呈递细胞(APC)诸如树突细胞(DC)、巨噬细胞、B细胞和单核细胞以及许多非免疫细胞和广泛的肿瘤上表达的肿瘤坏死因子受体超家族成员。在激活的T辅助细胞上与其三聚体配体CD154(也被称为CD40配体或CD40L)的相互作用导致APC激活，从而诱导适应性免疫。

从生理学上讲，通过CD40在APC上的信号传导被认为代表T细胞辅助的主要组成部分，并且在很大程度上介导辅助T细胞授权(license)APC的能力。例如，CD40在DC上的连接诱导共刺激分子和MHC分子的表面表达增加，促炎细胞因子的产生和T细胞触发增强。CD40在静息B细胞上的连接增加了抗原呈递功能和增殖。

在临床前模型中，大鼠抗小鼠CD40 mAb在治疗CD40+B细胞淋巴瘤中显示出显著的治疗活性(80％-100％的小鼠治愈并以CD8 T细胞依赖的方式免疫再攻毒)，并且对各种CD40阴性肿瘤也有效。这些mAb能够清除患有近终末期疾病的小鼠的大块肿瘤。CD40mAb已在临床试验中进行了研究，并用于治疗黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、血液恶性肿瘤，尤其是非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病和晚期实体瘤。

治疗性抗CD40抗体显示从强激动到拮抗的各种活性。目前，对于这种异质性还没有令人满意的解释。激动性CD40 mAb的主要机理是激活宿主APC，以在患者中诱导具有临床意义的抗肿瘤T细胞应答。这些应答包括不依赖T细胞但依赖巨噬细胞的肿瘤消退引发。CD40激活的巨噬细胞可变为杀瘤细胞，至少在胰腺癌中，还可能促进肿瘤间质耗竭，从而诱导体内肿瘤塌陷。重要的是，这些机制不需要肿瘤表达CD40，因此有理由在许多临床试验中纳入多种肿瘤患者。如果这些策略的目的是激活DC、巨噬细胞或两者，则CD40 mAb的目标不一定是例如通过补体介导的细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀死其结合的细胞。因此，通过设计，强激动性抗体不介导CDC或ADCC。

相比之下，其他人CD40 mAb可介导CDC和ADCC对抗CD40+肿瘤，这些肿瘤诸如几乎所有B细胞恶性肿瘤、一部分黑色素瘤和某些癌。最后，有一些证据表明CD40结合在肿瘤细胞上促进凋亡，并且这可以在不涉及任何免疫效应子途径的情况下完成。这已被证明适用于CD40+B细胞恶性肿瘤和某些实体瘤，诸如CD40+癌和黑色素瘤。

CD40及其功能的详细描述可参见例如，Vonderheide等人，“AgonisticCD40antibodies and cancer therapy”，(2013年)：第1035-1043页；Beatty等人，“CD40agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreaticcarcinoma in mice and humans”，Science 331.6024(2011年)：第1612-1616页；Vonderheide等人，“Clinical activity and immune modulation in cancer patientstreated with CP-870,893,a novel CD40 agonist monoclonal antibody”，Journal ofClinical Oncology 25.7(2007年)：第876-883页；这些文献中的每一篇通过引用方式整体并入。

在一些实施方案中，本公开提供了特异性结合两种不同抗原(例如，PD-1和CD40)的抗原结合构建体(例如，双特异性抗体)。在一些实施方案中，抗原结合构建体(例如，双特异性抗体)可桥接PD-1表达细胞(例如，T细胞)和CD40表达细胞(例如，APC细胞)，从而促进抗原呈递、CD40连接和/或T细胞激活。在一些实施方案中，抗原结合构建体可阻断PD-1/PD-L1通路，从而激活免疫应答。在一些实施方案中，抗原结合构建体(例如，双特异性抗体)可激活抗原呈递细胞(APC)细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)中的CD40通路，从而诱导抗肿瘤应答。在一些实施方案中，由抗原结合构建体(例如，双特异性抗体)诱导的CD40激活仅在表达PD-1的细胞存在时发生(例如，通过桥接效应)。因此，抗原结合构建体(例如，双特异性抗体)可在局部肿瘤微环境内诱导免疫应答，而不会引起全身免疫激活，其可诱导副作用，例如在肝中的毒性。此外，在一些实施方案中，抗原结合构建体(例如，双特异性抗体)不能通过Fc受体(例如，FCγRIIB)介导的CD40聚集激活CD40通路。在一些实施方案中，如本文所述的方法进一步降低了在高FCγRIIB表达组织，例如肝和/或肾中的毒性。

此外，紧邻肿瘤下游的淋巴结(肿瘤引流淋巴结(TDLN))可因上游肿瘤的存在而发生极大的改变。肿瘤引流淋巴结(TDLN)富集了与PD-L1+常规树突细胞密切相关的肿瘤特异性PD-1+ T细胞。靶向TDLN的PD-1通路阻断可通过用前体耗竭T细胞(progenitor-exhausted T cell)接种肿瘤位点来诱导增强的抗肿瘤T细胞免疫，从而改善肿瘤控制。在TDLN中，调节性T细胞(Treg)的数量和抑制活性也增加。这些Treg细胞中的一些Treg细胞可针对特异性肿瘤衍生的抗原从头生成。在一些情况下，在TDLN中呈递新抗原不仅不能引发保护性免疫应答，而且还主动产生全身耐受性。因此，在一方面，抗原结合构建体(例如，双特异性抗体)还可诱导肿瘤引流淋巴结中的免疫应答，抑制肿瘤引流淋巴结中的Treg细胞活性，并抑制对肿瘤抗原的全身耐受性。

在一些实施方案中，本公开提供了降低抗CD40单克隆抗体(例如，塞鲁单抗)的毒性的方法。该方法包括制备包含抗CD40单克隆抗体的抗原结合片段的多特异性(例如，双特异性)抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体具有针对PD-1的抗原结合片段。在一些实施方案中，多特异性(例如，双特异性)抗体具有如本文所述的结构。在一些实施方案中，通过血液生化试验(例如，通过测量ALT和/或AST水平)或肝的组织病理学检查来评价毒性。在一些实施方案中，与未修饰的抗CD40单克隆抗体的毒性相比，如本文所述的方法可将抗CD40单克隆抗体的毒性降低小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含IgG4的CH1、CH2和/或CH3结构域(例如，CH2和CH3结构域)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含杵臼(KIH)突变。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在第一多肽链中包含IgG4的CH1、CH2、CH3结构域，在第二多肽链中包含IgG4的CH2、CH3结构域。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:149、150或151具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含IgG1的CH1、CH2和/或CH3结构域(例如，CH1、CH2和CH3结构域)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含LALA突变。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在第一多肽链中包含IgG1的CH1、CH2、CH3结构域，在第二多肽链中包含IgG1的CH1、CH2、CH3结构域。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:147或148具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含在IgG(例如，IgG1或IgG4)重链恒定结构域3(CH3)的C末端缺失赖氨酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，与包含IgGCH3的C末端赖氨酸残基的抗体或抗原结合片段相比，IgG CH3结构域的C末端赖氨酸残基的缺失将抗体或其抗原结合片段的降解水平降低例如至少或约10％、20％、30％、40％或50％。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定结构域(CL)。在一些实施方案中，CL包含与SEQ ID NO:146具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列。

在一方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性抗体或其抗原结合片段包含：

(a)重链多肽，该重链多肽优选地从N末端至C末端包含：第一重链可变区(VH1)、重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)；

(b)轻链多肽，该轻链多肽优选地从N末端至C末端包含：第一轻链可变区(VL1)和轻链恒定区(CL)；和

(c)单链可变片段多肽，该单链可变片段多肽优选地从N末端至C末端包含：scFv结构域、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)。

在一些实施方案中，scFv结构域从N末端至C末端包含：第二重链可变区、接头肽序列、第二轻链可变区。

在一些实施方案中，scFv结构域从N末端至C末端包含：第二轻链可变区、接头肽序列、第二重链可变区。

在一些实施方案中，第一重链可变区和第一轻链可变区彼此结合，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点。在一些实施方案中，第二重链可变区和第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

在一些实施方案中，第二重链可变区、接头肽序列和第二轻链可变区一起形成特异性结合CD40的scFv结构域。在一些实施方案中，接头肽序列包括与SEQ ID NO:152、153或154具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，CH1、CH2、CH3和/或CL结构域来自人IgG(例如，IgG1或IgG4)。在一些实施方案中，人IgG(例如，IgG1或IgG4)包含KIH和/或LALA突变。

在一些实施方案中，重链多肽的序列如SEQ ID NO:130所示。在一些实施方案中，轻链多肽的序列如SEQ ID NO:131所示。在一些实施方案中，单链可变片段多肽的序列如SEQ ID NO:132或133(例如，SEQ ID NO:132)所示。在一些实施方案中，Fab-ScFV-IgG4的PD-1重链和轻链的序列分别如SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:131所示；并且Fab-scFv-IgG4的CD40臂的序列如SEQ ID NO:132所示。

在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段具有图1A所示的示意性结构。在一些实施方案中，重链多肽的序列与SEQ ID NO:166具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性。在一些实施方案中，轻链多肽的序列与SEQ ID NO:167具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性。在一些实施方案中，单链可变片段肽的序列与SEQ ID NO:206具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段的PD-1臂的重链序列和轻链序列分别如SEQ IDNO:166和SEQ ID NO:167所示；并且本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段的CD40臂的序列如SEQ ID NO:173中所示。

(a)第一重链多肽，该第一重链多肽优选地从N末端至C末端包含：第一重链可变区(VH1)、重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)、重链恒定区3(CH3)、第一接头肽序列和scFv结构域；

(b)第一轻链多肽，该第一轻链多肽优选地从N末端至C末端包含：第一轻链可变区(VL1)和第一轻链恒定区(CL)。

在一些实施方案中，scFv结构域从N末端至C末端包含：第二轻链可变区(VL2)、第二接头肽序列和第二重链可变区(VH2)。

在一些实施方案中，scFv结构域从N末端至C末端包含：第二重链可变区(VH2)、第二接头肽序列和第二轻链可变区(VL2)。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)或TNF受体超家族成员4(TNFRSF4或OX40)。在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合PD-1。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点特异性结合癌症特异性抗原或癌症相关抗原。如本文所用，术语“癌症特异性抗原”是指在癌细胞表面特异性表达的抗原。这些抗原可用于鉴定肿瘤细胞。正常细胞几乎不表达癌症特异性抗原。一些示例性的癌症特异性抗原包括例如，CD20、PSA、PSCA、PD-L1、Her2、Her3、Her1、β-连环蛋白、CD19、CEACAM3、EGFR、c-Met、EPCAM、PSMA、CD40、MUC1和IGF1R等。PSA主要在前列腺癌细胞上表达，并且Her2主要在乳腺癌细胞上表达。如本文所用，术语“癌症相关抗原”是指以相对高的水平在癌细胞上表达，但也可以相对低的水平在正常细胞上表达的抗原。CD55、CD59、CD46和许多粘附分子(诸如N-钙黏着蛋白、VE-钙黏着蛋白、NCAM、Mel-CAM、ICAM、NrCAM、VCAM1、ALCAM、MCAM等)是癌症相关抗原。尽管癌特异性抗原和癌相关抗原都在癌细胞表面表达，但癌特异性抗原和癌相关抗原之间的差异在于癌相关抗原还在正常细胞上表达，但与在癌细胞上的水平相比，表达水平较低。相比之下，癌特异性抗原几乎不在正常细胞上表达，即使在正常细胞上表达，其量也极低。

在一些实施方案中，第二重链可变区和第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第二抗原结合位点包含ScFv或VHH或由其组成。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点与抗体(例如，IgG)的Fc区连接。在一些实施方案中，第二抗原结合位点与Fc区的C末端连接。在一些实施方案中，第二抗原结合位点插入到Fc区，例如在3A位点处。

3A位点是指Fc中的区域，其中可插入非天然肽而不干扰免疫球蛋白的功能或融合多肽的生物活性。3A位点从位置344开始至位置382(EU编号)。在一些实施方案中，非天然多肽替换融合位点处的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个或39个氨基酸，或插入到该融合位点处的任意两个氨基酸之间。在一些实施方案中，融合位点位于位置351至362的区域(EU编号)。在一些实施方案中，非天然多肽替换融合位点处的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或所有氨基酸(例如，351-362)，或插入到该融合位点处的任意两个氨基酸之间，例如，插入在位置351-352、352-353、353-354、354-355、355-356、356-357、357-358、358-359、359-360、360-361或361-362处。在一些实施方案中，两个残基选自根据EU编号的重链CH3结构域的位置350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362和363中任意两个位置。在一些实施方案中，非天然多肽在融合位点处替换氨基酸358-362。

在一些实施方案中，抗CD40 scFv与抗PD-1单克隆抗体的重链CH3结构域中的每一者融合。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段具有图18A所示的示意性结构。在一些实施方案中，融合重链多肽具有与SEQ ID NO:161具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，轻链多肽具有与SEQ ID NO:141至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，融合重链多肽包含如本文所述的抗PD-1重链可变区。在一些实施方案中，轻链多肽包含如本文所述的抗PD-1轻链可变区。

在一些实施方案中，融合重链多肽具有与SEQ ID NO:168具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，轻链多肽具有与SEQ ID NO:169具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合片段还包含：与第一重链多肽具有至少90％、95％或100％的同一性的第二重链多肽；和与第一轻链多肽具有至少90％、95％或100％的同一性的第二轻链多肽。

在一些实施方案中，第二轻链可变区、接头肽序列和第二重链可变区一起形成特异性结合CD40的scFv结构域。在一些实施方案中，第一连接肽序列包括与SEQ ID NO:153或154具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，第二接头肽序列包括与SEQ ID NO:153或154具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，CH1、CH2、CH3和/或CL结构域来自人IgG(例如，IgG1或IgG4)。在一些实施方案中，人IgG(例如，IgG1或IgG4)包含KIH和/或LALA突变。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可阻断PD-1/PD-L1通路。

在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段具有图1B所示的示意性结构。在一些实施方案中，第一重链多肽的序列如SEQ ID NO:134或135所示。在一些实施方案中，第一轻链多肽的序列如SEQ ID NO:136所示。在一些实施方案中，第一重链多肽的序列如SEQ ID NO:137或138所示。在一些实施方案中，第一轻链多肽的序列如SEQ IDNO:139所示。在一些实施方案中，ScFv-HC-IgG4的经修饰重链的序列如SEQ IDNO:134所示，ScFv-HC-IgG4的轻链的序列如SEQ ID NO:136所示。在一些实施方案中，ScFv-HC-IgG1-LALA的经修饰重链的序列如SEQ ID NO:137所示，ScFv-HC-IgG1-LALA的轻链的序列如SEQID NO:139所示。

在一些实施方案中，第一重链多肽的序列包含与SEQ ID NO:162具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列，并且第一轻链多肽的序列包含与SEQ ID NO:163具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，第一重链多肽的序列包含与SEQ ID NO:164具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列，并且第一轻链多肽的序列包含与SEQ ID NO:165具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，第一重链多肽的序列包含与SEQ ID NO:175具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列，第一轻链多肽的序列包含与SEQ ID NO:176具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，第一重链多肽的序列包含与SEQ ID NO:177具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列，第一轻链多肽的序列包含与SEQ ID NO:178具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。

在一些实施方案中，第一重链多肽的序列包含与SEQ ID NO:172具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列，第一轻链多肽的序列包含与SEQ ID NO:174具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，该双特异性抗体或其抗原结合片段包含多肽链，该多肽链优选地从N末端至C末端包含：与PD-1结合的单可变结构域(VHH)，任选的CH1、CH2、CH3，接头肽序列，和scFv结构域。在一些实施方案中，VHH包含与SEQ ID NO:204具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。

在一些实施方案中，选择的抗PD-1抗体的可变区(例如，VH和/或VL)用于根据它们的序列替换如本文所述的双特异性抗体的相应抗PD-1可变区(例如，VH和/或VL)。例如，所选的抗PD-1抗体的VH序列可选自SEQ ID NO:179、181、183、185、187、189、207或209；所选的抗PD-1抗体的VL序列可选自SEQ ID NO:180、182、184、186、188、190、208或210。

在一些实施方案中，选择的抗PD-1抗体的VH和VL均用于根据其序列替换如本文所述的双特异性抗体的相应VH和VL。例如，所选的抗PD-1抗体的VH是SEQ ID NO:179，所选的抗PD-1抗体的VL是SEQ ID NO:180；所选的抗PD-1抗体的VH是SEQ ID NO:181，所选的抗PD-1抗体的VL是SEQ ID NO:182；所选的抗PD-1抗体的VH是SEQ ID NO:183，所选的抗PD-1抗体的VL是SEQ ID NO:184；所选的抗PD-1抗体的VH是SEQ ID NO:185，所选的抗PD-1抗体的VL是SEQ ID NO:186；所选的抗PD-1抗体的VH是SEQ ID NO:187，所选的抗PD-1抗体的VL是SEQID NO:188；所选的抗PD-1抗体的VH是SEQ ID NO:189，所选的抗PD-1抗体的VL是SEQ IDNO:190；所选的抗PD-1抗体的VH是SEQ ID NO:207，所选的抗PD-1抗体的VL是SEQ ID NO:208；所选的抗PD-1抗体的VH是SEQ ID NO:209，所选的抗PD-1抗体的VL是SEQ ID NO:210。

在一些实施方案中，选择的抗CD40抗体的可变区(例如，VH和/或VL)用于根据它们的序列替换如本文所述的双特异性抗体的相应抗CD40可变区(例如，VH和/或VL)。例如，所选的抗PD-1抗体的VH序列可选自SEQ ID NO:191、193、195、197或199；所选的抗PD-1抗体的VL序列可选自SEQ ID NO:192、194、196、198或200。

在一些实施方案中，选择的抗CD40抗体的VH和VL均用于根据其序列替换如本文所述的双特异性抗体的相应VH和VL。例如，所选的抗CD40抗体的VH是SEQ ID NO:191，所选的抗CD40抗体的VL是SEQ ID NO:192；所选的抗CD40抗体的VH是SEQ ID NO:193，所选的抗CD40抗体的VL是SEQ ID NO:194；所选的抗CD40抗体的VH是SEQ ID NO:195，所选的抗CD40抗体的VL是SEQ ID NO:196；所选的抗CD40抗体的VH是SEQ ID NO:197，所选的抗CD40抗体的VL是SEQ ID NO:198；所选的抗CD40抗体的VH是SEQ ID NO:199，所选的抗CD40抗体的VL是SEQ ID NO:200。

抗CD40抗体和抗原结合片段

本公开提供了特异性结合CD40的若干种抗体及其抗原结合片段。抗PD-1/CD40抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)或各种抗原结合蛋白构建体可包括来源于这些抗体的抗原结合位点。

本文所述的抗体和抗原结合片段能够结合CD40。本公开提供了例如小鼠抗CD40抗体03-7F10(“7F10”)、06-6A7(“6A7”)和07-4H6(“4H6”)，嵌合抗体，以及它们的人源化抗体。

7F10和7F10衍生抗体(例如，人源化抗体)的CDR序列包括如Kabat编号所定义的重链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:59-61)和轻链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:62-64)。CDR也可由Chothia系统定义。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列如SEQ ID NO:77-79所示，并且轻链可变结构域的CDR序列如SEQ ID NO:80-82所示。

类似地，6A7和6A7衍生抗体的CDR序列包括如Kabat编号所定义的重链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:65-67)和轻链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:68-70)。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列如SEQ ID NO:83-85所示，并且轻链可变结构域的CDR如SEQ IDNO:86-88所示。

4H6和4H6衍生抗体的CDR序列包括如Kabat编号所定义的重链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:71-73)和轻链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:74-76)。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列如SEQ ID NO:89-91所示，并且轻链可变结构域的CDR如SEQ ID NO:92-94所示。

还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于小鼠抗体的人源化方法不同(例如，序列可被不同的氨基酸取代)，抗体的重链和轻链可具有多于一个版本的人源化序列。人源化7F10抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:98-100所示。人源化7F10抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:101-104所示。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:98-100)中的任一条序列可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:101-104)中的任一条序列配对。

类似地，人源化6A7抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:105-108所示。人源化6A7抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:109-111所示。重链可变区和轻链可变区也可被修饰以增加稳定性或相互作用。6A7-H4可被进一步修饰以获得SEQ ID NO:126。6A7-K2可被进一步修饰以获得SEQ ID NO:127。类似地，小鼠6A7抗体的重链可变区可被进一步修饰以获得SEQ ID NO:128。小鼠6A7抗体的轻链可变区可被进一步修饰以获得SEQ ID NO:129。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:105-108、126和128)中的任一条序列可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:109-111、127和129)中的任一条序列配对。人源化4H6抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:112-115所示。人源化4H6抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:116-119所示。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:112-115)中的任一条序列可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:116-119)中的任一条序列配对。

如图26所示，人源化百分比意指在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)数据库中，重链或轻链可变区序列与人抗体序列相比的同一性百分比。最优比对(top hit)意指重链或轻链可变区序列与特定物种比与其他物种更接近。例如，与人为最优比对意指该序列与人比与其他物种更接近。与人和食蟹猴为最优比对意指该序列与人和食蟹猴序列具有相同的同一性百分比，且与其他物种序列相比，这些同一性百分比最高。在一些实施方案中，人源化百分比大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。关于如何确定人源化百分比和如何确定最优比对的详细描述是本领域已知的，并且描述于例如Jones,Tim D.等人，“The INNs and outs of antibodynonproprietary names”，MAbs.，第8卷第1期，Taylor&Francis，2016年，其通过引用方式整体并入本文。高人源化百分比通常具有多种优点，例如，在人体内更安全且更有效，被人受试者耐受的可能性更大，和/或具有副作用的可能性更小。

此外，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可含有一个、两个或三个选自以下项的重链可变区CDR：SEQ ID NO:59-61、SEQ ID NO:65-67、SEQ ID NO:71-73、SEQ ID NO:77-79、SEQ ID NO:83-85和SEQ ID NO:89-91；和/或一个、两个或三个选自以下项的轻链可变区CDR：SEQ ID NO:62-64、SEQ ID NO:68-70、SEQ ID NO:74-76、SEQ IDNO:80-82、SEQ ID NO:86-88和SEQ ID NO:92-94。

在一些实施方案中，抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH)，其中CDR1区包含与选择的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选择的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR3区包含与选择的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成；和包含CDR1、2、3的轻链可变区(VL)，其中CDR1区包含与选择的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选择的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR3区包含与选择的VLCDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成。所选的VH CDR1、2、3氨基酸序列和所选的VL CDR1、2、3氨基酸序列示于图23(Kabat CDR)和图24(Chothia CDR)。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:59的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:60的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:61的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:65的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:66的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:67的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:71的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:72的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:73的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:77的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:78的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:79的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:83的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:84的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:85的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:89的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:90的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:91的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:62的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:63的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:64的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:68的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:69的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:70的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:74的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:75的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:76的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:80的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:81的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:82的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:86的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ IDNO:87的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:88的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:92的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:93的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:94的CDR。

插入、缺失和取代可在CDR序列内，也可在CDR序列的一个或两个末端。

本公开还提供了结合CD40的抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含与选择的VH序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，该轻链可变区包含与选择的VL序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所选的VH序列是SEQ ID NO:98、99、100或120，所选的VL序列是SEQ ID NO:101、102、103、104或121。在一些实施方案中，所选的VH序列是SEQ ID NO:105、106、107、108、122、126或128，所选的VL序列是SEQ ID NO:109、110、111、123、127或129。在一些实施方案中，所选的VH序列是SEQ ID NO:112、113、114、115或124，所选的VL序列是SEQ ID NO:116、117、118、119或125。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可具有3个VH CDR，其与如本文所述的任何VH序列的CDR相同。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可具有3个VL CDR，其与如本文所述的任何VL序列的CDR相同。

本公开还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，该多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如图23或图24所示的CDR，或具有如图26所示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，所配对的多肽结合CD40(例如，人CD40)。

抗CD40抗体和抗原结合片段也可以是抗体或抗体片段和多特异性(例如，双特异性)抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)。本文提供的其他抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性(多聚体，例如，双特异性)抗体、人抗体、嵌合抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、单链抗体、细胞内制备的抗体(即，内抗体)及它们的抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG抗体或其抗原结合片段。

抗体片段适用于提供的方法，只要它们保留全长抗体的期望亲和力和特异性即可。因此，结合CD40的抗体片段将保留结合CD40的能力。Fv片段是含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，其可以是天然共价的，例如scFv。在这种构型中，正是每个可变结构域的三个CDR相互作用限定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR或其子集共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包括特异性于某抗原的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于整个结合位点。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体，其包含一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)结合CD40(例如，人CD40)的scFv结构域。

在一些实施方案中，抗CD40 scFv与IgG(例如，IgG4)Fc区的重链恒定结构域2(CH2)的N末端连接。在一些实施方案中，抗CD40 scFv与IgG(例如，IgG1或IgG4)Fc区的C末端连接。在一些实施方案中，抗CD40 scFv插入到IgG(例如，IgG1或IgG4)的Fc区，例如在3A位点处。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的一条多肽链与抗CD40 scFv连接。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段的两条多肽链与抗CD40 scFv连接。

在一些实施方案中，抗CD40 scFv从N末端至C末端包含：重链可变区(VH)、接头肽和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，抗CD40 scFv从N末端至C末端包含：轻链可变区(VL)、接头肽和重链可变区(VH)。在一些实施方案中，VL-接头肽-VH结构提高了抗体或其抗原结合片段的表达(例如，提高至少或约10％、20％、30％、40％或50％)。免疫球蛋白重链(VH)或免疫球蛋白轻链(VL)包含如图23或图24所示的CDR，或具有如图26所示的序列。在一些实施方案中，接头肽包含与SEQ ID NO:152、153或154具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，抗CD40 scFv包含与SEQ ID NO:155、156、157或158具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

抗PD-1抗体和抗原结合片段

本公开提供了特异性结合PD-1的抗体及其抗原结合片段。抗PD-1/CD40抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可包括来源于这些抗体的抗原结合位点。

本文所述的抗体和抗原结合片段能够结合PD-1。本公开提供了小鼠抗PD-1抗体25-1A7(“1A7”)、18-3F1(“3F1”)和3-6G1(“6G1”)及它们的人源化抗体。

1A7和1A7衍生抗体(例如，人源化抗体)的CDR序列包括如Kabat编号所定义的重链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:1-3)和轻链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:4-6)。CDR也可由Chothia系统定义。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列如SEQ ID NO:19-21所示，轻链可变结构域的CDR序列如SEQ ID NO:22-24所示。

类似地，3F1和3F1衍生抗体的CDR序列包括如Kabat编号所定义的重链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:7-9)和轻链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:10-12)。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列如SEQ ID NO:25-27所示，轻链可变结构域的CDR如SEQ ID NO:28-30所示。

6G1和6G1衍生抗体的CDR序列包括如Kabat编号所定义的重链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:13-15)和轻链可变结构域的CDR(SEQ ID NO:16-18)。根据Chothia编号，重链可变结构域的CDR序列如SEQ ID NO:31-33所示，轻链可变结构域的CDR如SEQ ID NO:34-36所示。

还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于小鼠抗体的人源化方法不同(例如，序列可被不同的氨基酸取代)，抗体的重链和轻链可具有多于一个版本的人源化序列。图22提供了这些人源化序列的人源化百分比。

人源化1A7抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:40-42所示。人源化1A7抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43-45所示。这些重链可变区序列(SEQ IDNO:40-42)中的任一条序列可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:43-45)中的任一条序列配对。

类似地，人源化3F1抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:46-49所示。人源化3F1抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50-52所示。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:46-49)中的任一条序列可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:50-52)中的任一条序列配对。

此外，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可含有一个、两个或三个选自以下项的重链可变区CDR：SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:7-9、SEQ ID NO:13-15、SEQ ID NO:19-21、SEQ ID NO:25-27和SEQ ID NO:31-33；和/或一个、两个或三个选自以下项的轻链可变区CDR：SEQ ID NO:4-6、SEQ ID NO:10-12、SEQ ID NO:16-18、SEQ ID NO:22-24、SEQ ID NO:28-30和SEQ ID NO:34-36。

在一些实施方案中，抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH)，其中CDR1区包含与选择的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选择的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR3区包含与选择的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成；和包含CDR1、2、3的轻链可变区(VL)，其中CDR1区包含与选择的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选择的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR3区包含与选择的VLCDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成。所选的VH CDR1、2、3氨基酸序列和所选的VL CDR1、2、3氨基酸序列示于图19(Kabat CDR)和图20(Chothia CDR)。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:1的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:2的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:3的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:7的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:8的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:9的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:13的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ IDNO:14的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:15的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:19的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:20的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:21的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:25的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:26的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:27的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的重链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:31的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:32的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:33的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:4的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:5的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:6的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:10的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:11的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:12的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:16的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:17的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:18的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:22的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:23的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:24的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:28的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:29的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:30的CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含含有以下CDR中的一个、两个或三个CDR的轻链可变结构域：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:34的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:35的CDR；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:36的CDR。

本公开还提供了结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含与选择的VH序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成，该轻链可变区包含与选择的VL序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所选的VH序列是SEQ ID NO:40、41、42或53，所选的VL序列是SEQ ID NO:43、44、45或54。在一些实施方案中，所选的VH序列是SEQ ID NO:46、47、48、49或55，所选的VL序列是SEQ IDNO:50、51、52或56。在一些实施方案中，所选的VH序列是SEQ ID NO:57，所选的VL序列是SEQID NO:58。

本公开还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，该多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白重链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如图19或图20所示的CDR，或具有如图22所示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，所配对的多肽结合PD-1。

抗PD-1抗体和抗原结合片段也可以是抗体或抗体片段和多特异性(例如，双特异性)抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)。本文提供的其他抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性(多聚体，例如，双特异性)抗体、人抗体、嵌合抗体(例如，人-小鼠嵌合体)、单链抗体、细胞内制备的抗体(即，内抗体)及它们的抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG抗体或其抗原结合片段。

抗体片段适用于提供的方法，只要它们保留全长抗体的期望亲和力和特异性即可。因此，结合PD-1的抗体片段将保留结合PD-1的能力。Fv片段是含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，其可以是天然共价的，例如scFv。在这种构型中，正是每个可变结构域的三个CDR相互作用限定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR或其子集共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包括特异性于某抗原的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于整个结合位点。

抗体特征

抗PD1、抗CD40或抗PD-1/CD40抗原结合蛋白构建体(例如，抗体、双特异性抗体或其抗体片段)可包括来源于如本文所述的任何抗PD-1抗体、抗CD40抗体或其任何抗原结合片段的抗原结合位点。

本文所述的抗体或其抗原结合片段可结合PD-1，并阻断PD-1与PD-L1之间的结合和/或PD-1与PD-L2之间的结合。通过阻断PD-1与PD-L1之间的结合和/或PD-1与PD-L2之间的结合，抗PD-1/CD40抗体破坏PD-1抑制通路(例如，通过阻断PD-1和PD-L1相互作用)并上调免疫应答。

可使用一般技术来测量抗体对抗原的亲和力，包括例如ELISA、RIA和表面等离子体共振(SPR)。亲和力可根据动力学速率常数的商(KD＝koff/ka)推导。在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可以小于0.1s^-1、小于0.01s^-1、小于0.001s^-1、小于0.0001s^-1或小于0.00001s^-1的解离速率(koff)结合PD-1(例如，人PD-1、小鼠PD-1和/或嵌合PD-1)。在一些实施方案中，解离速率(koff)大于0.01s^-1、大于0.001s^-1、大于0.0001s^-1或大于0.00001s^-1。在一些实施方案中，解离速率(koff)小于1.4×10^-3s^-1、1.3×10^-3s^-1或1.2×10^-3s^-1。

在一些实施方案中，动力学结合速率(kon)大于1×10²/Ms、大于1×10³/Ms、大于1×10⁴/Ms、大于1×10⁵/Ms或大于1×10⁶/Ms。在一些实施方案中，动力学结合速率(ka)小于1×10⁵/Ms、小于1×10⁶/Ms或小于1×10⁷/Ms。在一些实施方案中，动力学结合速率(ka)大于1.0×10⁵/Ms、1.2×10⁵/Ms或1.4×10⁵/Ms。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可以小于1×10^-6M、小于1×10^-7M、小于1×10^-8M、小于1×10^-9M或小于1×10^-10M的KD结合PD-1(例如，人PD-1、小鼠PD-1和/或嵌合PD-1)。在一些实施方案中，KD小于30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一些实施方案中，KD大于1×10^- ⁷M，大于1×10^-8M、大于1×10^-9M或大于1×10^-10M。在一些实施方案中，抗体以小于或等于约10nM、9.5nM、9nM、8.5nM或8nM的KD结合人PD-1。

抗PD-1/CD40抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)也可包括来源于如本文所述的任何抗CD40抗体或其抗原结合片段的抗原结合位点。在一些实施方案中，本文所述的抗PD1/CD40抗体或其抗原结合片段可阻断CD40与CD40L之间的结合。在一些实施方案中，通过结合CD40，抗体也可促进CD40信号传导途径并上调免疫应答。因此，在一些实施方案中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段是CD40激动剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是CD40拮抗剂。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可以小于0.1s^-1、小于0.01s^-1、小于0.001s^-1、小于0.0001s^-1或小于0.00001s^-1的解离速率(koff)结合CD40(例如，人CD40、小鼠CD40和/或嵌合CD40)。在一些实施方案中，解离速率(koff)大于0.01s^-1、大于0.001s^-1、大于0.0001s^-1或大于0.00001s^-1。在一些实施方案中，解离速率(koff)小于5×10^-4s^-1、4×10^-4s^-1或3×10^-4s^-1。

在一些实施方案中，动力学结合速率(kon)大于1×10²/Ms、大于1×10³/Ms、大于1×10⁴/Ms、大于1×10⁵/Ms或大于1×10⁶/Ms。在一些实施方案中，动力学结合速率(ka)小于1×10⁵/Ms、小于1×10⁶/Ms或小于1×10⁷/Ms。在一些实施方案中，动力学结合速率(ka)大于1.0×10⁵/Ms、1.5×10⁵/Ms、2×10⁵/Ms或2.5×10⁵/Ms。

亲和力可根据动力学速率常数的商(KD＝koff/ka)推导。在一些实施方案中，KD小于1×10^-6M、小于1×10^-7M、小于1×10^-8M、小于1×10^-9M或小于1×10^-10M。在一些实施方案中，KD小于30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一些实施方案中，KD大于1×10^-7M、大于1×10^-8M、大于1×10^-9M、大于1×10^-10、大于1×10^-11M或大于1×10^-12M。在一些实施方案中，抗体以小于或等于约3.5nM、3nM、2.5nM、2nM或1.5nM的KD结合人CD40。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可以与PD-1单克隆抗体(例如，1A7-H2K3-IgG4)的EC₅₀值相比约50％、约80％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍或约5倍的EC₅₀值(例如，通过报告细胞激活测定确定)阻断PD-1/PD-L1通路。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可以小于或约100μg/mL、50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、4μg/mL、3μg/mL、2μg/mL或1μg/mL的EC₅₀值(例如，通过报告细胞激活测定确定)阻断PD-1/PD-L1通路。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可以小于或约1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL或0.02μg/mL的EC₅₀值(例如，通过报告细胞激活测定确定)桥接T细胞(例如，表达PD-1)和抗原呈递细胞(例如，表达CD40)。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可激活抗原呈递细胞(例如，激活APC细胞中的CD40通路)。在一些实施方案中，与PD-1表达细胞不存在时的APC细胞激活(例如，反式激活)相比，PD-1表达细胞的存在可使APC细胞激活增加至少或约1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍或更多倍。

在一些实施方案中，表达PD-1或其他靶标的细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞或髓样细胞)和APC细胞通过如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)的桥接可刺激APC细胞上的CD40聚集至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可使免疫应答、CD40或CD40相关通路的活性、APC细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)的活性或数量和/或T细胞(例如CD8+和/或CD4+细胞)的活性或数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可通过FCγRIIB以小于或约1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL或0.02μg/mL的EC₅₀值(例如，通过报告细胞激活测定确定)激活APC细胞(例如，表达CD40)。

在一些实施方案中，与CD40单克隆抗体(例如，6A7-H4K2-IgG2)相比，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可使FCγRIIB受体介导的细胞(例如，APC细胞)激活降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或500倍。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)是CD40激动剂。在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可增加表达CD40的靶细胞中的CD40信号转导。

抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)的阻断效应或细胞激活可通过EC₅₀测量。半最大有效浓度(EC₅₀)是指诱导基线和最大值之间一半的应答的药物浓度。在一些实施方案中，EC₅₀小于或约50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL、0.008μg/mL、0.006μg/mL、0.005μg/mL或0.001μg/mL。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可将肿瘤微环境或肿瘤引流淋巴结中的免疫应答信号扩增至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可使整体免疫激活降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。

在一些实施方案中，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可具有类似的肿瘤抑制作用(例如，由TGI％表示)，其剂量水平小于或约90％、80％、70％、60％、50％或小于靶向相同抗原的单克隆抗体(例如，包含相同重链可变区和/或轻链可变区的单克隆抗体)的剂量水平。

在一些实施方案中，当以类似剂量水平施用时，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)具有为靶向相同抗原的单克隆抗体的肿瘤生长抑制效应的至少或约1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍或50倍高的肿瘤生长抑制效应。在一些实施方案中，与PD-1表达细胞不存在时的肿瘤生长抑制作用相比，PD-1表达细胞的存在可使肿瘤生长抑制作用增加至少或约1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍或更多倍。

在一些实施方案中，当以类似剂量水平施用时，与靶向相同抗原的单克隆抗体相比，如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)具有降低至少或约10％、20％、30％、40％或50％的体内毒性(例如，血液AST、ALT水平)。

在一些实施方案中，与施用相似剂量水平的靶向相同抗原的单克隆抗体的动物相比，施用如本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)的动物(例如，小鼠)具有降低至少10％、20％、30％、40％或50％的炎性水平(例如肝和/或肾的病变程度)。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，抗CD40抗体、抗PD-1抗体或双特异性抗体)具有大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)。在一些实施方案中，抗体具有小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的肿瘤生长抑制百分比。TGI％可例如在治疗开始后3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天，或在治疗开始后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月确定。如本文所用，肿瘤生长抑制百分比(TGI％或TGI_TV％)使用下式计算：

TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％

Ti是第i天时治疗组中的平均肿瘤体积。T0是第零天时治疗组中的平均肿瘤体积。Vi是第i天时对照组中的平均肿瘤体积。V0是第零天时对照组中的平均肿瘤体积。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)具有功能性Fc区。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是吞噬作用。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是ADCC和吞噬作用。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)不具有功能性Fc区。例如，抗体或抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段。

抗体和抗原结合片段

本公开提供抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)。抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可包含抗CD40抗体或其抗原结合片段，以及抗PD-1抗体或其抗原结合片段。这些抗原结合蛋白构建体(例如双特异性抗体)、抗CD40抗体、抗PD-1抗体和其抗原结合片段可具有多种形式。

通常，抗体(也被称为免疫球蛋白)由两类多肽链组成，即轻链和重链。本公开的非限制性抗体可以是完整的、包含两条重链和两条轻链的四免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以是任何同种型(包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD)或亚同种型(包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等)。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可包含轻链的两个相同拷贝和/或重链的两个相同拷贝。各自含有一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链通过其恒定区内的二硫键彼此结合以形成抗体的“茎”。各自含有一个可变结构域(或可变区VL)和一个恒定结构域(或恒定区)的轻链分别通过二硫键结合一条重链。每条轻链的可变区与其所结合的重链的可变区对齐。轻链和重链的可变区均含有三个高变区，它们夹在更保守的框架区(FR)之间。

这些高变区(称为互补决定区(CDR))形成包含抗体的主要抗原结合表面的环。四个框架区大部分采用β-折叠构象，并且CDR形成连接，并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的CDR通过框架区紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗原结合位点的形成。

通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定该抗体的CDR区的方法是众所周知的，并且通常使用CDR的许多定义。Kabat定义是基于序列变异性，并且Chothia定义是基于结构环区的位置。这些方法和定义描述于例如Martin，“Protein sequence and structure analysisof antibody variable domains”，Antibody engineering，Springer BerlinHeidelberg，2001年，第422-439页；Abhinandan等人，“Analysis and improvements toKabat and structurally correct numbering of antibody variable domains”，Molecular immunology 45.14(2008年)：第3832-3839页；Wu,T.T.和Kabat,E.A.(1970年)J.Exp.Med.第132卷：第211-250页；Martin等人，Methods Enzymol.第203卷：第121-53页(1991年)；Morea等人，Biophys Chem.第68卷(第1-3期)：第9-16页(1997年10月)；Morea等人，J Mol Biol.，第275卷(第2期)：第269-294页(1998年1月)；Chothia等人，Nature，第342卷(第6252期)：第877-883页(1989年12月)；Ponomarenko和Bourne，BMC StructuralBiology，第7卷：第64页(2007年)；这些文献中的每一篇通过引用方式整体并入本文。除非在本公开中特别指出，否则在本公开中使用Kabat编号作为默认编号。

CDR对于识别抗原的表位是重要的。如本文所用，“表位”是靶分子的能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的最小部分。表位的最小尺寸可以是约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸，但这些氨基酸不必在抗原一级结构的连续线性序列中，因为表位可以取决于基于抗原二级和三级结构的抗原三维构型。

在一些实施方案中，抗体是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，它们的恒定区不同，特别是它们的铰链和上部CH2结构域不同。IgG亚类的序列和差异是本领域已知的，并且描述于例如Vidarsson等人，“IgG subclasses and allotypes:from structure toeffector functions”，Frontiers in immunology 5(2014年)；Irani等人，“Molecularproperties of human IgG subclasses and their implications for designingtherapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases”，Molecularimmunology 67.2(2015年)：第171-182页；Shakib,Farouk编著，“The human IgGsubclasses:molecular analysis of structure,function and regulation”，Elsevier，2016年，这些文献中的每一篇通过引用方式整体并入本文。

抗体还可以是来源于任何物种(例如人、啮齿动物、小鼠、大鼠、骆驼科动物)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体和包括与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是抗体的保留完整抗体的特异性结合活性的一部分，即，抗体的能够特异性结合完整抗体的靶分子上的表位的任何部分。它包括例如Fab、Fab'、F(ab')₂和这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是例如scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体和包括为抗体结合结构域或与其同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性示例包括例如完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链、或来自完整抗体重链或轻链的单个CDR。

在一些实施方案中，scFv具有两个重链可变结构域和两个轻链可变结构域。在一些实施方案中，scFv具有两个抗原结合位点(抗原结合位点：A和B)，并且两个抗原结合位点可以不同的亲和力结合各自的靶抗原。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可结合两种不同的抗原或两种不同的表位。

在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可包含一个、两个或三个选自图19、图20、图23和图24的重链可变区CDR。在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可包含一个、两个或三个选自图19、图20、图23和图24的轻链可变区CDR。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)可缀合至治疗剂。包含抗体或其抗原结合片段的抗体药物缀合物可共价或非共价结合治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂(例如，松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、美登木素生物碱(诸如DM-1和DM-4)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺及类似物)。

单链Fv(scFv)或抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区)，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，使得scFv形成用于抗原结合的期望结构。

Fab片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')₂抗体片段包含一对Fab片段，这些片段通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在它们的羧基末端附近共价连接。抗体片段的其他化学偶联也是本领域已知的。

双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含在同一多肽链中与VL连接的VH(VH和VL)。通过使用因太短而不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。

线性抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合位点。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。

抗体的多聚化可通过抗体的天然聚集或通过本领域已知的化学或重组连接技术来实现。例如，一定百分比的纯化抗体制剂(例如，纯化IgG1分子)自发形成含有抗体同二聚体和其他高级抗体多聚体的蛋白质聚集体。

在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体可通过工程化一对抗体分子之间的界面以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化来制备。例如，该界面可包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一条或多条小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿“腔”。这提供了一种机制，可使异二聚体的产率高于其他不需要的终产物(诸如同二聚体)。该方法描述于例如WO 96/27011中，其通过引用方式整体并入本文。

双特异性抗体包括交联或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中抗体中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体可与生物素偶联。也可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂和交联技术是本领域熟知的，并公开于美国专利号4,676,980中，其通过引用方式整体并入本文。

从抗体片段产生双特异性抗体的方法也是本领域已知的。例如，双特异性抗体可使用化学连接制备。Brennan等人(Science，第229卷：第81页，1985年)描述了一种方法，其中将完整抗体通过蛋白水解切割产生F(ab')₂片段。这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下被还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab'片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'TNB衍生物中的一种转化为Fab'硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'TNB衍生物混合，形成双特异性抗体。

本文所述的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)中的任一者可缀合至稳定化分子(例如，增加抗体或其抗原结合片段在受试者或溶液中的半衰期的分子)。稳定分子的非限制性示例包括：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白质(例如血清白蛋白，诸如人血清白蛋白)。稳定分子的缀合可增加抗体或抗原结合片段在体外(例如，在组织培养物中或以药物组合物形式储存时)或在体内(例如，在人体内)的半衰期或延长其生物活性。

抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)也可具有各种形式。许多不同形式的抗原结合构建体是本领域已知的，并且描述于例如Suurs等人，“Areview of bispecific antibodies and antibody constructs in oncology andclinical challenges”，Pharmacology&therapeutics(2019年)，其通过引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体是BiTe、(scFv)₂、纳米抗体-HSA、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、scFv-CH-CL-scFv、HSAbody、scDiabody-HAS或串联scFv。在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体是VHH-scAb、VHH-Fab、双重scFab、F(ab')₂、双抗体、crossMab、DAF(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、杵臼结构(knobs-in-holes)共同轻链、杵臼结构组件、电荷对、Fab臂交换、SEEDbody、LUZ-Y、Fcab、κλ-body、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG、双抗体-CH3、三抗体(triple body)、微型抗体(miniantibody)、微抗体(minibody)、TriBi微抗体(TriBi minibody)、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、F(ab')₂-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、sc双抗体-Fc、双抗体-Fc、串联scFv-Fc、内抗体、坞闸结构(dock and lock)、lmmTAC、IgG-IgG缀合物、Cov-X-Body或scFv1-PEG-scFv2。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体可以是TrioMab。在TrioMab中，两条重链来自不同的物种，其中不同的序列限制重链-轻链配对。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体具有两条不同的重链和一条共有轻链。重链的异二聚化作用可以基于杵臼结构或一些其他重链配对技术。

在一些实施方案中，可以使用CrossMAb技术产生双特异性抗体。可使用CrossMAb技术在双特异性异二聚体IgG抗体中实现正确的轻链结合，该技术允许产生各种双特异性抗体形式，包括双-(1+1)、三-(2+1)和四-(2+2)价双特异性抗体，以及基于非Fc串联抗原结合片段(Fab)的抗体。这些形式可以使用结构域交叉从任何现有的抗体对衍生，而不需要鉴定共有轻链、翻译后加工/体外化学组装或引入一组能实现正确轻链结合的突变。该方法描述于Klein等人，“The use of CrossMAb technology for the generation of bi-andmultispecific antibodies”，MAbs.，第8卷第6期，Taylor&Francis，2016年，其通过引用方式整体并入。在一些实施方案中，重链中的CH1和轻链中的CL结构域交换。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体可以是2:1CrossMab。将另外的Fab片段添加到CrossMab的VH结构域的N末端。CrossMab中添加的Fab片段通过实现二价结合而增加亲合力。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体可以是2:2CrossMab。该四价双特异性抗体通过将Fab片段与CrossMab的各C末端融合而产生。这些Fab片段可如下交叉：它们的CH1与它们的CL交换。VH与它们的CL融合，并且VL与它们的CH1融合。Fab片段中的CrossMab技术确保了特异性配对。亲合力可通过双重二价结合来增强。

抗原结合蛋白构建体可以是Duobody。IgG4抗体中天然存在的Fab交换机制与IgG1抗体中的受控物质类似，这种机制被称为受控Fab交换。该形式可确保重-轻链之间的特异性配对。

在双重可变结构域抗体(DVD-Ig)中，将另外的VH和可变轻链(VL)结构域添加到各N末端以用于双特异性靶向。这种形式与IgG-scFv类似，但是添加的结合结构域单独结合它们各自的N末端，而不是scFv结合每个重链N末端。

在scFv-IgG中，两个scFv与重链的C末端连接(CH3)。scFv-IgG形式具有两个不同的二价结合位点，因此也被称为四价。scFv-IgG不存在重链和轻链配对问题。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体可具有IgG-IgG形式。两个完整IgG抗体通过化学连接重链的C末端缀合。

抗原结合蛋白构建体也可具有Fab-scFv-Fc形式。在Fab-scFv-Fc形式中，组装了轻链、重链和含有Fc区和scFv的第三条链。它可确保高效的制备和纯化。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白构建体可以是TF。三个Fab片段通过二硫桥连接。TF形式不具有Fc区。

ADAPTIR具有与Fc区的两侧结合的两个scFv。它放弃了完整IgG作为其构建体的基础，但保留了Fc区以延长半衰期并促进纯化。

双特异性T细胞衔接体(“BiTE”)由一条肽链上的两个scFv、VLA VHA和VHB VLB组成。它仅具有结合结构域，没有Fc区。

在BiTE-Fc中，Fc区与BiTE构建体融合。Fc区的添加提高了半衰期，从而延长了有效浓度，避免了连续静脉给药(IV)。

双亲和重靶向(DART)抗体具有连接相反片段的两条肽链，即VLA与VHB和VLB与VHA，并且在它们的C末端具有将它们融合在一起的硫键。在DART中，硫键可使其稳定性与BiTE相比提高。

在DART-Fc中，Fc区连接到DART结构。它可通过组装三条链而产生，其中两条链通过二硫键连接，如DART。一条链含有一半的Fc区，该区域将与第三条链二聚化，仅表达Fc区。Fc区的添加提高了半衰期，从而延长了有效浓度，避免了连续静脉给药(IV)。

在四价DART中，组装了四条肽链。基本上，生成两个DART分子，其具有一半的Fc区，并将二聚化。该形式与两个靶标都有二价结合，因此它是一个四价分子。

串联双抗体(TandAb)包含两个双抗体。每个双抗体由VHA和VLB片段组成，并且VHA和VLB片段共价结合。这两个双抗体与肽链连接。与由两个scFv组成的双抗体相比，其稳定性提高。它具有两个二价结合位点。

ScFv-scFv-毒素包括毒素和两个具有稳定接头的scFv。它可以用于特异性递送有效载荷。

在模块scFv-scFv-scFv中，一个针对TAA的scFv用短的可识别肽标签化，并组装成由两个scFv组成的bsAb，其中一个scFv针对CD3，一个scFv针对该可识别肽。

在ImmTAC中，稳定且可溶的T细胞受体与识别CD3的scFv融合。通过使用TCR，ImmTAC适于靶向加工的蛋白质，例如细胞内蛋白质。

三特异性纳米抗体具有两个单可变结构域(纳米抗体)，以及用于延长半衰期的另外的模块。添加额外的模块以提高半衰期。

在三特异性杀伤衔接体(TriKE)中，两个scFv通过掺入人IL-15的多肽接头连接。添加连接IL-15的接头以增加NK的存活和增殖。

(a)重链多肽：该重链多肽优选地从N末端至C末端包含：第一轻链可变区(VL1)、第一连接肽序列、第二重链可变区(VH2)、任选的重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)；以及

(b)轻链多肽，该轻链多肽优选地从N末端至C末端包含：第二轻链可变区(VL2)、第二接头肽序列、第一重链可变区(VH1)、第一轻链可变区(VL1)和任选的轻链恒定区(CL)。

在一些实施方案中，VH1和VL1彼此相互作用，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此相互作用，形成特异性结合CD40的第一抗原结合位点。

在一些实施方案中，VH1和VL1彼此相互作用，形成特异性结合CD40的第一抗原结合位点。在一些实施方案中，VH2和VL2彼此相互作用，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点。

在一些实施方案中，第一和/或第二接头肽包含与SEQ ID NO:205具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，CH1、CH2、CH3和/或CL结构域来自人IgG(例如，IgG1或IgG4)。在一些实施方案中，人IgG(例如，IgG1或IgG4)包含KIH和/或LALA突变。

在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体或其抗原结合片段具有图37所示的示意性结构。在一些实施方案中，重链多肽如SEQ ID NO:170所示，并且轻链多肽如SEQ IDNO:171所示。

制备抗原结合蛋白构建体的方法

可使用分离的人蛋白片段作为免疫原，使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术产生抗体。多克隆抗体可通过多次注射(例如，皮下或腹膜内注射)抗原肽或蛋白在动物体内产生。在一些实施方案中，抗原肽或蛋白与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，抗原肽或蛋白可缀合至在待免疫的物种中具有免疫原性的药剂。动物可注射超过一次(例如两次、三次或四次)的抗原肽或蛋白。

可使用全长多肽或蛋白，或另选地其抗原肽片段作为免疫原。蛋白质的抗原肽包含该蛋白质的氨基酸序列的至少8个(例如，至少10个、15个、20个或30个)氨基酸残基，并且涵盖该蛋白质的表位，使得针对该肽产生的抗体与该蛋白质形成特异性免疫复合物。

免疫原通常用于通过免疫合适的受试者(例如，表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可含有例如重组表达的或化学合成的多肽。该制剂还可包括佐剂(诸如弗氏完全或不完全佐剂)或类似的免疫刺激剂。

多克隆抗体可如上所述通过以多肽或其抗原肽(例如，蛋白质的一部分)作为免疫原免疫合适的受试者来制备。可通过标准技术，诸如用酶联免疫吸附测定(ELISA)，使用固定化多肽或肽随时间监测经免疫的受试者中的抗体滴度。如有需要，可从哺乳动物(例如，从血液)中分离抗体分子，并通过熟知的技术(诸如蛋白A或蛋白G层析)进一步纯化，以获得IgG级分。在免疫后的适当时间，例如，当特异性抗体滴度最高时，可从受试者获得产生抗体的细胞，并用于通过标准技术，诸如最初由Kohler等人(Nature，第256卷：第495-497页，1975年)所述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunol.Today，第4卷：第72页，1983年)、EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.，第77-96页，1985年)或三源杂交瘤技术(trioma technique)制备单克隆抗体。产生杂交瘤的技术是众所周知的(一般参见Current Protocols in Immunology，1994年，Coligan等人(编著)，John Wiley&Sons,Inc.，纽约，NY)。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养物上清液中结合目的多肽或表位的抗体，例如使用标准ELISA测定来检测。

本文所述的抗体或抗原结合片段的变体可通过将适当的核苷酸变化引入编码本文所述的人、人源化或嵌合抗体或其抗原结合片段的DNA中，或通过肽合成来制备。此类变体包括例如，在构成抗体或抗原结合结构域的抗原结合位点的氨基酸序列内的残基的缺失、插入或取代。在此类变体的群体中，一些抗体或抗原结合片段将对靶蛋白具有增加的亲和力。可进行缺失、插入和/或组合的任何组合，以获得对靶标具有增加的结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入抗体或抗原结合片段的氨基酸改变也可改变或引入新的翻译后修饰至抗体或抗原结合片段，诸如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量、改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列，使得不同的糖通过细胞中存在的酶连接)、或引入新的糖基化位点。

本文公开的抗体可来源于任何物种的动物，包括哺乳动物。天然抗体的非限制性示例包括来源于人、灵长类动物(例如，猴和猿)、牛、猪、马、绵羊、骆驼科动物(例如，骆驼和美洲驼)、鸡、山羊和啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠和兔)(包括经基因工程化以产生人抗体的转基因啮齿类动物)的抗体。

噬菌体展示(淘选)可用于优化具有期望的结合亲和力的抗体序列。在该技术中，编码单链Fv的基因(包括VH或VL)可插入到噬菌体外壳蛋白基因，使该噬菌体在其外侧“展示”scFv，而在其内部包含该蛋白的基因，从而产生了基因型与表型之间的联系。然后可针对靶抗原筛选这些展示噬菌体，以检测所展示的抗原结合位点与靶抗原之间的相互作用。因此，可在称为体外选择的过程中筛选并扩增大的蛋白质文库，并且可获得具有期望的结合亲和力的抗体序列。

人和人源化抗体包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(或与来源于人种系免疫球蛋白序列的抗体具有相同氨基酸序列)的抗体。人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。

人源化抗体通常具有嫁接有非人CDR的人构架(FR)。因此，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸序列。这些非人氨基酸残基通常被称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变结构域。人源化基本上可通过例如用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。这些方法描述于例如Jones等人，Nature，第321卷：第522-525页(1986年)；Riechmann等人，Nature，第332卷：第323-327页(1988年)；Verhoeyen等人，Science，第239卷：第1534-1536页(1988年)；这些文献中的每一篇通过引用方式整体并入本文。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体，其中完整人V结构域的一小部分被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是小鼠抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被来自人抗体中类似位点的残基取代。

更重要的是，抗体人源化的同时保留对抗原的高特异性和亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现这个目标，人源化抗体可通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性的人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员通常可获得的并且熟悉的。可获得说明和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方法，可从受体和导入序列中选择和组合FR残基，以便获得期望的抗体特征，诸如增加的对靶抗原的亲和力。

相对于原始序列的同一性或同源性通常是在将候选序列与原始序列进行比对并在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列内存在的与人、人源化或嵌合抗体或片段内存在的序列相同的氨基酸残基的百分比。

在一些实施方案中，可对抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)进行共价修饰。这些共价修饰可通过化学或酶促合成，或通过酶促或化学切割进行。通过使抗体或片段的靶向氨基酸残基与能够与选择的侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体或抗体片段的其他类型的共价修饰引入分子中。

在一些实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏(直接或间接)连接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过计算Asn297处糖链内岩藻糖相对于连接至Asn297的所有糖结构(例如，复合型、杂合型和高甘露糖结构)的总和的平均量来确定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱法(例如WO 2008/077546中所述)测量的。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号；或Kabat编号中的位置314)；然而，由于抗体中微小的序列变异，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。在一些实施方案中，为了降低聚糖异质性，抗体的Fc区可被进一步工程化以用丙氨酸替换位置297处的天冬酰胺(N297A)。

在一些实施方案中，为通过避免Fab臂交换来促进生产效率，抗体的Fc区被进一步工程化以用脯氨酸替换IgG4的位置228(EU编号)处的丝氨酸(S228P)。关于S228突变的详细描述描述于例如Silva等人，“The S228P mutation prevents in vivo and in vitroIgG4Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novelquantitative immunoassays and physiological matrix preparation”，Journal ofBiological Chemistry，290.9(2015年)：第5462-5469页，其通过引用方式整体并入。

在一些实施方案中，引入Leu234Ala/Leu235Ala(EU编号)(LALA)突变以破坏抗体效应子功能。

在一些实施方案中，本文所述的方法被设计成制备双特异性抗体。双特异性抗体可通过工程化一对抗体分子之间的界面以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化来制备。例如，该界面可包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一条或多条小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿“腔”。这提供了一种机制，可使异二聚体的产率高于其他不需要的终产物(诸如同二聚体)。该方法描述于例如WO 96/27011中，其通过引用方式整体并入本文。

在一些实施方案中，可使用杵臼(KIH)技术，其包括工程化CH3结构域以在各重链中产生“杵”或“臼”以促进异二聚化。KIH技术描述于例如Xu,Yiren等人，

“Production of bispecific antibodies in'knobs-into-holes'using acell-free expression system”，MAbs，第7卷第1期，Taylor&Francis，2015年，其通过引用方式整体并入。在一些实施方案中，一条重链具有T366W和/或S354C(杵)取代(EU编号)，而另一条重链具有Y349C、T366S、L368A和/或Y407V(臼)取代(EU编号)。在一些实施方案中，一条重链具有以下取代中的一者或多者：Y349C和T366W(EU编号)。另一条重链可具有以下取代中的一者或多者：E356C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)。此外，还可在两个取代的IgG的铰链区都引入取代(-ppcpScp-->-ppcpPcp-)。

此外，可使用阴离子交换层析来纯化双特异性抗体。阴离子交换层析是一种使用含有带正电荷的基团(诸如二乙基氨基乙基(DEAE))的离子交换树脂基于物质的电荷来分离物质的方法。在溶液中，树脂涂覆有带正电的抗衡离子(阳离子)。阴离子交换树脂将与带负电的分子结合，置换抗衡离子。可使用阴离子交换层析基于蛋白质的等电点(pI)来纯化蛋白质。等电点定义为蛋白质不具有净电荷时的pH。当pH＞pI时，蛋白质具有净负电荷，而当pH＜pI时，蛋白质具有净正电荷。因此，在一些实施方案中，可将不同的氨基酸取代引入两条重链，使得包含两条臂A的同二聚体的pI与包含两条臂B的同二聚体的pI不同。具有臂A和臂B的双特异性抗体的pI将介于同二聚体的两个pI之间。因此，两种同二聚体和双特异性抗体可在不同的pH条件下释放。本公开表明，可将一些氨基酸残基取代引入重链以调节pI。

因此，在一些实施方案中，Kabat编号位置83处的氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，在位置1、6、43、81和105(Kabat编号)中的一个或多个位置的氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，在位置13和105(Kabat编号)中的一个或多个位置的氨基酸残基是天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，在位置13和42(Kabat编号)中的一个或多个位置的氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸或甘氨酸。

双特异性抗体还可以包括例如交联或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中抗体中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体可与生物素偶联。也可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂和交联技术是本领域熟知的，并公开于美国专利号4,676,980中，其通过引用方式整体并入本文。

重组载体

本公开还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，本文公开的编码多肽的多核苷酸)的重组载体(例如，表达载体)、引入这些重组载体的宿主细胞(即，使得这些宿主细胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的载体)，以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。

如本文所用，“载体”是将载体引入宿主细胞时能够将一种或多种目的多核苷酸递送至该宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已经引入该表达载体的宿主细胞中递送一种或多种目的多核苷酸并将其表达为编码的多肽。因此，在表达载体中，通过与该载体内或宿主细胞的基因组中在目的多核苷酸的整合位点处或附近或两侧的调控元件(诸如启动子、增强子和/或poly-A尾)可操作地连接，将该目的多核苷酸定位以在该载体中表达，使得该目的多核苷酸将在引入该表达载体的宿主细胞中被翻译。

载体可通过本领域已知的方法引入宿主细胞，例如电穿孔、化学转染(例如，DEAE-葡聚糖)、转化、转染和感染和/或转导(例如用重组病毒)。因此，载体的非限制性示例包括病毒载体(其可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体和与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。

在一些实施方案中，使用病毒表达系统(例如，牛痘或其他痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入本文公开的多核苷酸(例如，本文公开的编码多肽的多核苷酸)，其可涉及使用非致病性(缺陷性)、有复制能力的病毒，或可使用复制缺陷性病毒。在后一种情况下，病毒繁殖通常仅在互补病毒包装细胞中发生。合适的系统公开于例如Fisher-Hoch等人，1989年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷：第317-321页；Flexner等人，1989年，Ann.N.Y.AcadSci.，第569卷：第86-103页；Flexner等人，1990年，Vaccine，第8卷：第17-21页；美国专利号4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner-Biotechniques，第6卷：第616-627页，1988年；Rosenfeld等人，1991年，Science，第252卷：第431-434页；Kolls等人，1994年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第91卷：第215-219页；Kass-Esisler等人，1993年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷：第11498-11502页；Guzman等人，1993年，Circulation，第88卷：第2838-2848页；和Guzman等人，1993年，Cir.Res.，第73卷：第1202-1207页。将DNA整合到此类表达系统中的技术是本领域普通技术人员所熟知的。DNA也可以是“裸露的”，如例如Ulmer等人，1993年，Science，第259卷：第1745-1749页；和Cohen，1993年，Science，第259卷：第1691-1692页。可通过将DNA包被在高效转运到细胞中的可生物降解珠上增加裸DNA的摄取。

为了表达，可将包含本文公开的编码抗体或编码多肽的多核苷酸的DNA插入片段可操作地连接到合适的启动子(例如，异源启动子)，诸如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子等。其他合适的启动子是本领域技术人员已知的。表达构建体还可含有转录起始、终止位点，并且在转录区中包含用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可包括在待翻译多肽的起始处的翻译起始密码子和在待翻译多肽末端的适当位置的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。

如上所述，表达载体可包括至少一个可选择标记。此类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因和用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的代表性示例包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞；昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地贪夜蛾Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、Bowes黑色素瘤和HEK 293细胞；以及植物细胞。用于本文所述宿主细胞的合适的培养基和条件是本领域已知的。

用于细菌的非限制性载体包括获自Qiagen的pQE70、pQE60和pQE-9；获自Stratagene的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；和获自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。非限制性真核载体包括获自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及获自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合适的载体对本领域技术人员来说将是显而易见的。

适用的非限制性细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子和trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子(诸如劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus，RSV)的启动子)和金属硫蛋白启动子(诸如小鼠金属硫蛋白-I启动子)。

在酿酒酵母中，可使用许多含有组成型或诱导型启动子的载体，诸如α因子、醇氧化酶和PGH。关于综述，参见Ausubel等人(1989年)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，New York，N.Y，和Grant等人，Methods Enzymol.，第153卷：第516-544页(1997年)。

将构建体引入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现。这些方法描述于许多标准实验室手册中，诸如Davis等人，Basic Methods In Molecular Biology(1986年)，其通过引用方式整体并入本文。

可通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核生物对编码本公开的抗体的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常为约10-300bp，其作用是增加给定宿主细胞类型中启动子的转录活性。增强子的示例包括位于碱基对100-270的复制起点后侧(lateside)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。

为了使翻译好的蛋白质分泌到内质网腔、细胞周质间隙或细胞外环境中，可将适当的分泌信号并入表达的多肽中。信号可以是多肽的内源性信号，也可以是异源信号。

多肽(例如，抗体)可以修饰的形式表达，诸如融合蛋白(例如，GST融合蛋白)或带有组氨酸标签，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括另外的异源功能区。例如，可将另外的氨基酸(特别是带电荷的氨基酸)的区域添加到多肽的N末端以改善在宿主细胞中、在纯化过程中或在随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。此外，可将肽部分添加到多肽中以促进纯化。这些区域可在最终制备多肽之前去除。将肽部分添加到多肽中以引起分泌或排泄、提高稳定性并促进纯化等是本领域熟知的常规技术。

本公开还提供了与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的核酸序列，以及与如本文所述的任何氨基酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的氨基酸序列。

本公开还提供了与如本文所述的任何核苷酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性的核酸序列，以及与如本文所述的任何氨基酸序列具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开涉及编码本文所述的任何肽的核苷酸序列或由如本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸序列少于10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、500个或600个核苷酸。在一些实施方案中，氨基酸序列少于5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、350个或400个氨基酸残基。

在一些实施方案中，氨基酸序列(i)包括氨基酸序列；或(ii)由氨基酸序列组成，其中该氨基酸序列是如本文所述的序列中的任一者。

在一些实施方案中，核酸序列(i)包含核酸序列；或(ii)由核酸序列组成，其中该核酸序列是如本文所述的序列中的任一者。

为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的将这些序列进行比对(例如，可为了最佳比对而在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位，并且可为了比较目的而忽略非同源序列)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，这些分子在该位置处是相同的。考虑到需要被引入以实现两个序列的最佳比对的空位的数量和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数。为了说明的目的，序列的比较和两条序列之间的同一性百分比的测定可使用Blossum 62评分矩阵来完成，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。

也可确定序列同源性(例如，氨基酸序列同源性或核酸同源性)的百分比。如何确定序列同源性的百分比是本领域已知的。在一些实施方案中，具有相似理化性质(同源性百分比)的保守氨基酸残基，例如亮氨酸和异亮氨酸，可用于测量序列相似性。具有相似理化性质的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括例如具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在许多情况下，同源性百分比高于同一性百分比。

本公开提供了编码如本文所述的多肽中的任一者的一种或多种核酸。在一些实施方案中，核酸(例如cDNA)包括编码如本文所述的重链多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸包括编码如本文所述的轻链多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸包括编码如本文所述的scFv多肽的多核苷酸。

在一些实施方案中，载体可具有如本文所述的核酸中的两者，其中载体编码共同结合PD-1的VL区和VH区。在一些实施方案中，提供了一对载体，其中每个载体包含如本文所述的核酸中的一者，其中该对载体共同编码共同结合PD-1的VL区和VH区。在一些实施方案中，载体包括如本文所述的核酸中的两者，其中载体编码共同结合CD40的VL区和VH区。在一些实施方案中，提供了一对载体，其中每个载体包含如本文所述的核酸中的一者，其中该对载体共同编码共同结合CD40的VL区和VH区。

载体也可构建为表达特异性抗体或多肽。在一些实施方案中，可构建载体以共表达一条或多条抗体多肽链。在一些实施方案中，载体从5'端到3'端可含有巨细胞病毒启动子(CMV)、编码第一多肽链的序列、多聚腺苷酸化(PolyA)、CMV、编码第二多肽链的序列、PolyA、猿猴空泡病毒40终止子(SV40)和谷氨酰胺合成酶标记(GS)的序列。在一些实施方案中，可构建载体以表达抗CD40抗体scFv多肽链。

治疗方法

本文所述的方法包括用于治疗与癌症相关的病症的方法。通常，方法包括向需要或已经确定需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所述的工程化抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)。

如本文所用，“治疗”意指改善与癌症相关的病症的至少一种症状。通常，癌症导致死亡；因此，治疗可使预期寿命增加(例如，至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年)。施用治疗有效量的本文所述的药剂以治疗与癌症相关的病症将使癌细胞数量减少和/或症状减轻。

如本文所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞，即以快速增殖细胞生长为特征的异常状态或状况。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论其组织病理学类型或侵袭阶段如何。如本文所用的术语“肿瘤”是指癌细胞，例如癌细胞团。可使用本文所述的方法治疗或诊断的癌症包括各种器官系统的恶性肿瘤，诸如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和泌尿生殖道的恶性肿瘤；以及腺癌，其包括恶性肿瘤，诸如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一些实施方案中，本文所述的药剂被设计为治疗或诊断受试者中的癌。术语“癌”是本领域公认的，并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾癌或黑色素瘤。示例性癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢的组织形成的癌。该术语还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指来源于腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的，并且是指间充质衍生的恶性肿瘤。

在一些实施方案中，癌症是化疗耐药性癌症。

在一方面，本公开还提供了用于治疗受试者中的癌症的方法、降低受试者中肿瘤体积随时间的增加速率的方法、降低形成转移的风险的方法或降低在受试者中形成另外的转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可终止、减缓、延迟或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可使受试者中癌症的一种或多种症状的数量、严重性和/或持续时间减少。

在一方面，本公开具有包括向有需要的受试者，例如患有或鉴定或诊断为患有癌症的受试者施用治疗有效量的本文公开的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)或抗体药物缀合物的方法，该癌症例如乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，癌症是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。在一些实施方案中，受试者患有霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者患有三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌或头颈癌。

在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、血液系统恶性肿瘤，尤其是非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病或晚期实体瘤。

在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗热肿瘤。热肿瘤是可能引发强免疫应答的肿瘤。热肿瘤通常在其表面具有许多分子，这些分子允许T细胞攻击并杀死肿瘤细胞。本文所述的方法可进一步提高免疫应答，促进CD8+ T细胞的增殖和浸润，以及/或者减少肿瘤中髓源性抑制细胞的数量。

在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗冷肿瘤。冷肿瘤是不太可能引发强免疫应答的肿瘤。冷肿瘤往往被能够抑制免疫应答并阻止T细胞攻击并杀死肿瘤细胞的细胞包围。本文所述的方法可有效地促进DC细胞的增殖、浸润和/或激活，从而增加抗原呈递细胞的活性。在一些实施方案中，如本文所述的方法可下调T细胞中PD-1的表达，从而进一步降低PD-1与PD-L1之间的相互作用并提高免疫应答。如本文所用，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述了根据本发明的方法为其提供治疗的动物(人或非人)。本发明考虑了兽医和非兽医应用。人患者可以是成人或青少年(例如，18岁以下的人)。除了人之外，患者包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包括例如非人灵长类动物(例如，猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物、猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛和其他家养动物、农场动物和动物园动物。

在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。癌症患者可用本领域已知的各种方法鉴定。

如本文所用，“有效量”是指足以实现有益或期望结果的量或剂量，这些结果包括终止、减缓、延迟或抑制疾病(例如癌症)的进展。有效量将根据例如抗体、抗原结合片段、抗体药物缀合物、抗体编码多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和/或其组合物待施用的受试者的年龄和体重，症状的严重性和施用途径而变化，因此可基于个体确定施用。

有效量可在一次或多次给药中施用。例如，抗体、抗原结合片段或抗体药物缀合物的有效量是足以改善、终止、稳定、逆转、抑制、减缓和/或延迟患者中自身免疫性疾病或癌症的进展的量，或者是足以改善、终止、稳定、逆转、减缓和/或延迟细胞(例如，活检细胞、本文所述的癌细胞中的任一者或细胞系(例如，癌细胞系))在体外增殖的量。如本领域所理解的，抗体、抗原结合片段或抗体药物缀合物的有效量可根据，尤其是患者病史以及其他因素(诸如所用抗体的类型(和/或剂量))变化。

本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗体药物缀合物和/或组合物的有效量和给药方案可以凭经验确定，并且做出此类确定在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将根据例如将接受本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗体药物缀合物和/或组合物的哺乳动物，施用途径，所用的本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗原结合片段、抗体药物缀合物和/或组合物的具体类型以及施用于哺乳动物的其他药物而变化。选择抗体或抗原结合片段的合适剂量的指导可参见关于抗体和抗原结合片段的治疗用途的文献，例如Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等人编著，NogesPublications，Park Ridge，N.J.，1985年，第22章第303-357页；Smith等人，Antibodies inHuman Diagnosis and Therapy，Haber等人编著，Raven Press，纽约，1977年，第365-389页。

有效量的抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)的典型日剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可小于100mg/kg、50mg/kg、40mg/kg、30mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施方案中，剂量可大于30mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约或至少30mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。

在本文所述的方法的任一者中，至少一种抗体、其抗原结合片段或抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)、抗体药物缀合物或药物组合物(例如，本文所述的抗体、抗原结合片段、抗体药物缀合物或药物组合物中的任一者)和任选地至少一种另外的治疗剂可至少每周一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次或每天三次)施用于受试者。在一些实施方案中，至少两种不同的抗体和/或抗原结合片段以同一组合物(例如，液体组合物)施用。在一些实施方案中，至少一种抗体、其抗原结合片段、抗原结合蛋白构建体(例如，双特异性抗体)或抗体药物缀合物和至少一种另外的治疗剂以同一组合物(例如，液体组合物)施用。在一些实施方案中，至少一种抗体或抗原结合片段和至少一种另外的治疗剂以两种不同的组合物(例如，含有至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物和含有至少一种另外的治疗剂的固体口服组合物)施用。在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂以丸剂、片剂或胶囊剂的形式施用。在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂以缓释口服制剂施用。

在一些实施方案中，可在施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体药物缀合物或药物组合物(例如，本文所述的抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物中的任一者)之前或之后向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种另外的治疗剂和至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体药物缀合物或药物组合物(例如，本文所述的抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物中的任一者)，使得受试者中该一种或多种另外的治疗剂和该至少一种抗体或抗原结合片段(例如，本文所述的抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物中的任一者)的生物活性期存在重叠。

在一些实施方案中，可在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间段内)向受试者施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段、抗体药物缀合物或药物组合物(例如，本文所述的抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物中的任一者)。熟练的医学专业人员可使用本文所述的方法中的任一者来确定治疗期的长度，以诊断或跟踪治疗有效性(例如，观察癌症的至少一种症状)。如本文所述，熟练的医学专业人员还可改变施用于受试者的抗体或抗原结合抗体片段、抗体药物缀合物(和/或一种或多种另外的治疗剂)的身份和数量(例如，增加或减少)，并且还可基于治疗有效性的评估(例如，使用本文所述和本领域已知的方法中的任一者)来调节(例如，增加或减少)施用于受试者的至少一种抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或多种另外的治疗剂)的剂量或频率。

在一些实施方案中，可向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。该另外的治疗剂可包括一种或多种抑制剂，该一种或多种抑制剂选自B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、双重PI3K/mTOR抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，以及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)抑制剂(例如，epacadostat)。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可包括一种或多种抑制剂，该一种或多种抑制剂选自HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、激活的刺猬信号传导途径(hedgehog signaling pathway)的抑制剂和选择性降解雌激素受体的药剂。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可包括一种或多种治疗剂，该一种或多种治疗剂选自曲贝替定(Trabectedin)、白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、曲巴尼布(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕博西尼(Palbociclib)、依维莫司(everolimus)、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼(regorafenib)、Reolysin、爱宁达(Alimta)、Zykadia、Sutent、西罗莫司(temsirolimus)、阿昔替尼(axitinib)、索拉非尼(sorafenib)、Votrient、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、长春碱、沙利度胺(Thalomid)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、来那度胺(lenalidomide)、氮胞苷(azacytidine)、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicin)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)和恩扎妥林(enzastaurin)。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可包括一种或多种治疗剂，该一种或多种治疗剂选自佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择蛋白激动剂。

在一些实施方案中，向受试者施用卡铂、白蛋白结合型紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX或FOLFIRI。

在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体或抗GITR抗体。

在一些实施方案中，在不存在PD-1表达细胞(例如，T细胞)的情况下，PD1/CD40双特异性抗体不能有效激活抗原呈递细胞(APC)中的CD40信号传导途径。

在一些实施方案中，在存在PD-1表达细胞的情况下，PD1/CD40双特异性抗体可有效激活CD40信号传导途径。

药物组合物和施用途径

本文还提供含有本文所述的抗原结合蛋白构建体、抗体(例如，双特异性抗体)、抗原结合片段或抗体药物缀合物中的至少一者(例如，一者、两者、三者或四者)的药物组合物。本文所述的抗原结合蛋白构建体、抗体、抗原结合片段或抗体药物缀合物中的任一者的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以任何组合存在于药物组合物中。药物组合物可以本领域已知的任何方式配制。

药物组合物被配制成与它们的预期施用途径(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)相容。组合物可包括无菌稀释剂(例如，无菌水或盐水)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂、抗细菌剂或抗真菌剂(诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)、螯合剂(诸如乙二胺四乙酸)、缓冲剂(诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)和等渗剂(诸如糖(例如，葡萄糖)、多元醇(例如，甘露糖醇或山梨糖醇)或盐(例如，氯化钠))，或它们的任何组合。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体(参见例如，美国专利号4,522,811)。组合物的制剂可被配制并包封在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。当需要时(如例如在可注射制剂中)，可通过例如使用包衣(诸如卵磷脂)或表面活性剂来保持适当的流动性。可通过包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)延长抗体或其抗原结合片段的吸收。另选地，可通过植入物和微囊化递送系统实现控释，其可包括可生物降解的、生物相容的聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸；Alza公司和Nova制药公司)。

可将含有本文所述的抗原结合蛋白构建体、抗体、抗原结合片段、抗体药物缀合物中的任一者的一种或多种的组合物配制成用于以剂量单位形式(即，含有预定量的活性化合物的物理上离散的单位，以便于施用和剂量均匀性)肠胃外(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)施用。

可通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物(例如，猴)中确定组合物的毒性和疗效。可确定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比率。优选显示高治疗指数的药剂。当药物表现出不期望的副作用时，应注意最大程度地减少潜在的损害(即，减少不期望的副作用)。可通过其他标准药学方法确定毒性和疗效。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适当剂量的用于受试者(例如，人)的任何给定药剂。一种或多种(例如，一种、两种、三种或四种)抗原结合蛋白构建体、抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的抗体或抗体片段中的任一者)的治疗有效量将是治疗受试者(例如，鉴定为患有癌症的人受试者)或鉴定为有患病风险的受试者(例如，先前患过癌症但现在已经治愈的受试者)中的疾病(例如，杀死癌细胞)、降低受试者(例如，人)中的疾病的一种或多种症状的严重性、频率和/或持续时间的量。本文所述的抗原结合蛋白构建体、抗体或抗原结合片段中的任一者的有效性和剂量可由医疗保健专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法以及通过观察受试者(例如，人)中的疾病的一种或多种症状来确定。某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排(例如，疾病或病症的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及其他疾病的存在)。

示例性剂量包括毫克或微克量的本文所述的抗原结合蛋白构建体、抗体或抗原结合片段或抗体药物缀合物中的任一者/千克受试者体重(例如，约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；或约0.1mg/kg至约0.5mg/kg)。虽然这些剂量涵盖了广泛范围，但本领域普通技术人员将理解，治疗剂(包括抗原结合蛋白构建体、抗体及其抗原结合片段)的药效各不相同，并且有效量可通过本领域已知的方法来确定。通常，首先施用相对低的剂量，之后主治的医疗保健专业人员或兽医专业人员(在治疗应用的情况下)或研究人员(当仍在开发阶段工作时)可逐渐增加剂量，直到获得适当的反应。此外，应当理解，任何特定受试者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，排泄速率和抗体或抗体片段在体内的半衰期。

药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。本公开还提供了制备如本文所述的用于各种用途的抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物的方法。

实施例

本发明在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1：抗PD-1/CD40双特异性抗体的制备

设计了两种抗PD-1/CD40双特异性抗体(BsAb)。如图1A所示，Fab-ScFV-IgG BsAb具有包含重链和轻链的抗PD-1臂，以及包含与IgG的CH2和CH3结构域连接的单链可变片段(scFv)的抗CD40臂。如图1B所示，ScFV-HC-IgG BsAb具有与抗PD-1单克隆抗体的重链C末端中的每一者连接的抗CD40 scFv。与PD-1抗体1A7相关的序列描述于PCT/CN2018/077016中，其通过引用方式整体并入本文。与CD40抗体6A7相关的序列描述于PCT/CN2018/096494中，其通过引用方式整体并入本文。

将表达BsAb各多肽链的载体共转染到CHO细胞中。培养14天后，收集细胞上清液，并通过蛋白A亲和层析纯化，再通过尺寸排阻层析(SEC)纯化，得到双特异性抗体。双特异性抗体的恒定区选自人IgG1或IgG4。特别地，IgG1还引入突变，例如LALA(L234A/LS235A)突变，以降低Fc受体结合亲和力。这些Fc突变可通过使抗体效应子功能最小化来改善抗体安全性。

制备用于表达这些抗体的各种载体以进行以下实验。在以下实验中，Fab-ScFV-IgG和ScFV-HC-IgG中的抗PD-1的VH和VL来源于抗PD1抗体1A7-H2K3。抗CD40 ScFV的VH和VL来源于6A7-H4K2抗CD40抗体。

在Fab-ScFV-IgG抗体中，还将杵臼(KIH)突变引入恒定区。Fab-ScFV-IgG4的PD-1臂包括1A7-H2K3的VH和具有KIH突变的IgG4恒定区(SEQ ID NO:41和150)。ScFV臂包括6A7-H4K2的VH和VL(SEQ ID NO:108和110；或SEQ ID NO:126和127)和具有相应KIH突变的IgG4恒定区(SEQ ID NO:151)。在ScFV-HC-IgG中，利用接头序列将抗CD40ScFV添加到抗PD-1抗体的C末端。

如图2A至图2B所示，用非还原凝胶电泳(6％分离凝胶)检测纯化的BsAb。每条泳道加入2μg蛋白质。结果显示所有的BsAb都被表达并正确组装。

实施例2：抗体结合亲和力

BsAb对人PD-1(hPD-1)或人CD40(hCD40)的结合亲和力通过Biacore系统确定。人PD-1蛋白(人PD-1/PDCD1蛋白，His标签)和人CD40蛋白(人CD40/TNFRSF5蛋白，His标签)均购自ACRO Biosystems，目录号分别为PD1-H5221和CD0-H5228。结果汇总于下表中。

表1

表2

结果表明，两种类型的双特异性抗体均具有与亲本单克隆抗体相当的结合亲和力。因此，Fc区突变(例如，LALA突变)不影响结合亲和力。

实施例3：Jurkat-luc-hPD1报告细胞激活测定

进行实验以测试BsAb Fab-ScFV-IgG4和ScFV-HC-IgG4是否可阻断PD-1/PD-L1通路。

将基底细胞CHO-aAPC-hPD-L1(Promega，目录号：J1255)接种在96孔板中(细胞密度：4×10⁴个细胞/孔)，并在37℃下温育过夜。将双特异性抗体Fab-ScFV-IgG4、ScFV-HC-IgG4和抗PD-1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4连续稀释(3倍)，最高浓度为100μg/mL。测定缓冲液是补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基。第二天，将效应细胞Jurkat-Luc-hPD-1(Promega，目录号：J1255)以120g离心10分钟，然后接种在96孔板中(细胞密度5×10⁴个细胞/孔)。然后，弃去接种CHO-aAPC-hPD-L1的培养板上清，然后将50μL Jurkat-Luc-hPD-1细胞与25μL抗体一起加入每个孔中。将上述96孔板在37℃培养箱中温育6小时。温育后，取出培养板，加入75μL Bio-lite萤光素酶检测试剂(诺唯赞生物科技股份有限公司，目录号：DD1201-02-AB)，在室温下温育5-10分钟。然后将培养板置于发光检测器中检测荧光信号。如果抗体可阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用，则效应细胞将报告信号。

如图3和表3所示，BsAb均表现出对PD-1/PD-L1通路的阻断作用。因为Fab-ScFV-IgG4以单条抗PD-1臂结合PD-1，相比于1A7-H2K3-IgG4和ScFV-HC-IgG4是采用两条抗PD-1臂，Fab-ScFV-IgG4的EC₅₀值相对更高。

表3

抗体名称	EC₅₀值(μg/mL)	R²值
			1A7-H2K3-IgG4	5.605	0.9968
Fab-ScFV-IgG4	23.37	0.999
			ScFV-HC-IgG4	4.356	0.9997

实施例4：双特异性抗体的T细胞/APC细胞桥接效应

以下使用报告细胞进行实验，以测试BsAb Fab-ScFV-IgG4和ScFV-HC-IgG4是否可桥接T细胞和APC细胞。

将基底细胞CHO-K1-hPD1接种在96孔板中(细胞密度：5×10⁴个细胞/孔)，并在37℃下温育过夜。将BsAb Fab-ScFV-IgG4和ScFV-HC-IgG4连续稀释(3倍)，最高浓度为5μg/mL。同时，将抗PD-1抗体1A7-H2K3-IgG4和抗CD40抗体6A7-H4K2-IgG2以1:1的比例组合，然后连续稀释(3倍)，最高浓度为10μg/mL(每种单克隆抗体5μg/mL)。测定缓冲液是补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基。第二天，将效应细胞Jurkat-Luc-hCD40(Promega，目录号：JA2125)以120g离心10分钟，然后接种在96孔板中(细胞密度5×10⁴个细胞/孔)。然后，弃去接种CHO-K1-hPD1的培养板上清，然后将50μL Jurkat-Luc-hCD40细胞与25μL抗体一起加入每个孔中。将上述96孔板在37℃培养箱中温育6小时。温育后，取出培养板，加入75μL Bio-lite萤光素酶检测试剂(诺唯赞生物科技股份有限公司，目录号：DD1201-02-AB)，在室温下温育5-10分钟。然后将培养板置于发光检测器中检测荧光信号。

如图4A所示，当CHO-K1-hPD1细胞存在时，Fab-ScFV-IgG4和ScFv-HC-IgG4均反式激活报告细胞。相比之下，单克隆抗体的组合不激活报告细胞。这可能是因为CD40的激活需要CD40的聚集，而这种聚集是由基底细胞促进的。如图4B所示，在不存在CHO-K1-hPD1的情况下，BsAb和单克隆抗体组合都不激活报告细胞。EC₅₀值如下表所示。因此，测试的双特异性抗体能够桥接T细胞和APC细胞。

表4

抗体名称	EC₅₀值(μg/mL)	R²值
			Fab-ScFV-IgG4	0.0103	0.9938
ScFV-HC-IgG4	0.0108	0.9943

此处，Jurkat-Luc-hCD40细胞不表达PD-1，并用于验证APC细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)中CD40通路激活。T细胞(例如，表达PD-1或其他靶标)和APC细胞通过BsAb的桥接可刺激APC细胞上的CD40聚集，从而放大肿瘤微环境中的免疫应答信号。结果还表明，双特异性抗体对CD40通路的激活取决于它们与表达PD-1的细胞的桥接效应。由于表达PD-1的免疫细胞将被募集到肿瘤微环境中，并且PD-1表达通常在肿瘤微环境中被上调，因此该机制也可在很大程度上将免疫激活限制在肿瘤微环境，并减少副作用，例如在肝中的毒性。此外，肿瘤引流淋巴结具有抗原呈递细胞和表达PD-1的T细胞。双特异性抗体可有效增加肿瘤引流淋巴结中的免疫应答。同时，它可以抑制调节性T细胞(Treg)的抑制活性，从而抑制系统耐受性。

实施例5：Fc受体介导的报告细胞激活测定

进行实验以测试BsAb Fab-ScFV-IgG4和ScFV-HC-IgG4是否可以通过FcR交联(例如，通过FCγRIIB受体)激活报告细胞。

将基底细胞CHO-K1-hFcγRIIB(Promega，目录号：JA2251)接种在96孔板中(细胞密度：5×10⁴个细胞/孔)，并在37℃下温育过夜。将抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2和双特异性抗体Fab-ScFV-IgG4、ScFV-HC-IgG4连续稀释(3倍)，最高浓度为10μg/mL。测定缓冲液是补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基。第二天，将效应细胞Jurkat-Luc-hCD40(Promega，目录号：JA2251)以120g离心10分钟，然后接种在96孔板中(细胞密度5×10⁴个细胞/孔)。然后，弃去接种CHO-K1-hFcγRIIB的培养板上清，然后将50μL Jurkat-Luc-hCD40细胞与25μL抗体一起加入每个孔中。将上述96孔板在37℃培养箱中温育6小时。温育后，取出培养板，加入75μL Bio-lite萤光素酶检测试剂(诺唯赞生物科技股份有限公司，目录号：DD1201-02-AB)，在室温下温育5-10分钟。然后将培养板置于发光检测器中检测荧光信号。

如图5和表5所示，当CHO-K1-hFcγRIIB细胞存在时，Fab-ScFV-IgG4激活报告细胞，其EC₅₀与抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2相当。然而，ScFV-HC-IgG4未表现出FCγRIIB受体介导的报告细胞激活。

表5

抗体名称	EC₅₀值(μg/mL)	R²值
			6A7-H4K2-IgG2	0.0203	0.997
Fab-ScFV-IgG4	0.0543	0.998

CD40抗体6A7-H4K2-IgG2可通过FCγRIIB受体交联激活报告细胞。然而，当抗CD40scFv与Fc区连接时，FCγRIIB不能通过FCγRIIB介导的聚集激活CD40通路。因为ScFV-HC-IgG4未表现出FCγRIIB受体介导的报告细胞激活，所以ScFV-HC-IgG4可有效降低表达高水平FCγRIIB的组织中的毒性，例如在肝中的毒性。

表6汇总了两种双特异性抗体Fab-ScFV-IgG和ScFV-HC-IgG的体外活性。因为当CHO-K1-hPD1细胞存在时，ScFV-HC-IgG4在APC细胞中表现出CD40通路激活，但未表现出FCγRIIB受体介导的T细胞激活，所以ScFV-HC-IgG4和Fab-ScFV-IgG4都可以FcR非依赖性方式有效治疗癌症。

表6

CD40活性	Fab-ScFV-IgG4	ScFV-HC-IgG4	mAb或组合
				无基底细胞	无	无	无
CHO-K1-hPD1	有	有	无
				CHO-K1-hFCγRIIB	有	无	有

实施例6：ScFV-HC-IgG亚型对报告细胞的激活

进行该实验以测试ScFV-HC-IgG的亚型(包括ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA)是否可以在存在表达PD-1的基底细胞的情况下激活报告细胞。该实验的进行与实施例4中所述的步骤类似，不同之处在于用Jurkat-hPD1替代基底细胞CHO-K1-hPD1。在图6A中未使用基底细胞。如图6B和表7所示，BsAb ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA以及抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2均激活了报告细胞。

表7

抗体名称	EC₅₀值(μg/mL)	R²值
			CD40	0.0089	0.9612
ScFV-HC-IgG4	0.0079	0.9473
			ScFV-HC-IgG4-LALA	0.0065	0.9642

还评价了在存在CHO-K1-hFcγRIIB细胞的情况下的报告细胞激活。如图6C所示，ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA均未表现出FCγRIIB受体介导的报告细胞激活，这与图5所示的结果一致。因此，ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA主要依赖表达PD-1的细胞激活APC细胞中的CD40通路。

实施例7：双特异性抗体抑制肿瘤生长的体内测试

为了在体内测试双特异性抗体并预测这些抗体在人体内的作用，准备了人源化CD40小鼠模型。人源化CD40小鼠模型被工程化以表达嵌合CD40蛋白(SEQ ID NO:97)，其中小鼠CD40蛋白的胞外区被相应的人CD40胞外区替换。小鼠CD40的氨基酸残基20-192(SEQID NO:96)用人CD40的氨基酸残基20-192(SEQ ID NO:95)替换。通过将CD40人源化小鼠与PD-1人源化小鼠杂交，还生成了双人源化CD40/PD-1小鼠模型。人源化PD1小鼠模型被工程化以表达嵌合PD1蛋白(SEQ ID NO:39)，其中小鼠PD1蛋白的胞外区被相应的人PD1胞外区替换。小鼠PD1的氨基酸残基31-141(SEQ ID NO:38)用人PD1的氨基酸残基31-141(SEQ IDNO:37)替换。

人源化小鼠模型(例如，B-hCD40小鼠)或双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)提供了一种新的工具，用于通过显著降低人与表达小鼠CD40或PD-1的普通小鼠的临床结果之间的差异来测试临床环境中的新的治疗方法。关于人源化CD40、人源化PD-1或双人源化CD40/PD-1小鼠模型的详细描述可参见PCT/CN2018/091845和PCT/CN2017/090320；这些专利中的每一篇通过引用方式整体并入本文。

BsAb抗结肠癌的体内结果

在结肠癌模型中测试双特异性抗体ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA对体内肿瘤生长的作用。将MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)皮下注射到CD40人源化B-hCD40小鼠中。当小鼠中的肿瘤体积达到100mm³-150mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hCD40小鼠分别注射生理盐水(PS)(G1)、4mg/kg ScFV-HC-IgG4(G2)或4mg/kg ScFV-HC-IgG1-LALA(G3)。给药频率为每周两次(共给药4次)。

基于小鼠的体重以4mg/kg计算注射体积。测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并以0.5×(长轴)×(短轴)²计算肿瘤的体积。在以下时间测量小鼠的体重：注射前、将小鼠分成不同的组时(在第一次抗体注射前)、抗体注射期间(每周两次)以及安乐死前。

使用下式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI％)：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％。Ti是第i天时治疗组中的平均肿瘤体积。T0是第零天时治疗组中的平均肿瘤体积。Vi是第i天时对照组中的平均肿瘤体积。V0是第零天时对照组中的平均肿瘤体积。

采用t检验进行统计学分析。TGI％高于60％表示肿瘤生长受到明显抑制。P＜0.05是表示显著差异的阈值。

表8

组别	抗体	剂量(mg/kg)	途径	给药频率	给药总次数
						G1	PS(对照)	-	i.p.	BIW	4
G2	ScFV-HC-IgG4	4mg/kg	i.p.	BIW	4
						G3	ScFV-HC-IgG1-LALA	4mg/kg	i.p.	BIW	4

在整个处理期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的平均体重均有不同程度的增加(图7和图8)。在处理期结束时，在不同组之间未观察到明显的体重差异。结果显示ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA对小鼠耐受性良好，无明显毒性。

用ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA处理的组中的肿瘤体积如图9所示。还计算了第20天(分组后20天)的TGI％，如下表所示。

表9

结果显示在不存在表达人PD-1的细胞的情况下，双特异性抗体ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA不抑制肿瘤生长。

BsAb抗黑色素瘤的体内结果

在黑色素瘤模型中测试双特异性抗体ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA对体内肿瘤生长的作用。将表达人PD-L1的B16F10细胞(黑色素瘤细胞)(B16F10-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到100mm³-150mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠注射生理盐水(PS)(G1)、3mg/kg抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G2)、3mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G3)、4mg/kg ScFV-HC-IgG1-LALA(G4)、4mg/kg ScFV-HC-IgG4(G5)、3mg/kg抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4与3mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(G6)或4mg/kg双特异性抗体PD-1-MOCK-ScFV-HC-IgG4(G7)。BsAb PD-1-MOCK-ScFV-HC-IgG4具有与ScFV-HC-IgG相同的结构，但scFv靶向OX40，而不靶向CD40。给药频率为每周两次(共给药4次)。

基于小鼠的体重计算注射体积。测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并以0.5×(长轴)×(短轴)²计算肿瘤的体积。在以下时间测量小鼠的体重：注射前、将小鼠分成不同的组时(在第一次抗体注射前)、抗体注射期间(每周两次)以及安乐死前。

表10

在整个处理期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的平均体重均有不同程度的增加(图10和图11)。在处理期结束时，不同组中小鼠的体重均增加。

用抗体处理的组中的肿瘤体积如图12所示。还计算了第14天和第21天(分组后14或21天)的TGI％，如下表所示。P值基于第21天的数据。图12中还包含第25天的数据。

表11

注意：*因为在第21天前有六只小鼠的肿瘤体积超过3000mm³，所以在早期对它们进行了安乐死。

结果显示，与单克隆抗体相比，双特异性抗体ScFV-HC-IgG4和ScFV-HC-IgG1-LALA以较高的TGI％抑制肿瘤生长。特别地，4mg/kg的ScFV-HC-IgG4(G5)和ScFV-HC-IgG1-LALA(G4)与6mg/kg的抗PD1和抗CD40抗体的组合(G6)相比具有相似的TGI％。结果还表明，抗CD40 scFv结构域对肿瘤抑制具有协同作用。

此外，PD-1-MOCK-ScFV-HC-IgG4(G7)的TGI％与抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G2)的TGI％相当，但(例如，在第21天)远低于ScFV-HC-IgG4(G5)和ScFV-HC-IgG1-LALA(G4)的TGI％。这表明ScFV-HC-IgG4(G5)和ScFV-HC-IgG1-LALA(G4)诱导的肿瘤抑制作用部分地由表达PD-1的细胞(例如，T细胞)和表达CD40的细胞(例如，APC细胞)桥接诱导。

BsAb抗结肠癌的体内结果

在结肠癌模型中测试双特异性抗体ScFV-HC-IgG4、ScFV-HC-IgG1-LALA和Fab-ScFV-IgG4对体内肿瘤生长的作用。将表达人PD-L1的MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)(MC38-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约400mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组7只)。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠注射生理盐水(NC；G1)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G2)、1mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G3)、1.35mg/kg ScFV-HC-IgG4(G4)、1mg/kg Fab-ScFV-IgG4(G5)或1mg/kg抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4与1mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(Combo(PD-1+CD40)；G6)。给药频率为每周两次(共给药5次)。详细信息如下表所示。

表12

基于小鼠的体重计算注射体积。测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并以0.5×(长轴)×(短轴)²计算肿瘤的体积。

上述组中的小鼠在分组后第25天的肿瘤体积如图13所示。结果显示双特异性抗体ScFV-HC-IgG4和Fab-ScFV-IgG4抑制肿瘤生长。特别地，ScFV-HC-IgG4(G4；1.35mg/kg)和Fab-ScFV-IgG4(G5；1mg/kg)与2mg/kg抗PD1和抗CD40抗体的组合(G6)相比具有相似的TGI_TV％。

在不同的实验中，还包括ScFv-HC-IgG1-LALA和抗PD-1单克隆抗体

(帕博利珠单抗)(VH SEQ ID NO:207；VL SEQ ID NO:208)。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠注射生理盐水(NC；G1)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G2)、1mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G3)、1.35mg/kg ScFV-HC-IgG4(G4)、1mg/kg ScFV-HC-IgG1-LALA(G5)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4与1mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(Combo(PD-1+CD40)；G6)或1mg/kg抗PD1单克隆抗体帕博利珠单抗与1mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(Combo(帕博利珠单抗+CD40)；G7)。给药频率为每周两次(共给药5次)。详细信息如下表所示。

表13

在整个处理期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的平均体重均有不同程度的增加(图14和图15)。在处理期结束时，不同组中小鼠的体重均增加。

用抗体处理的组中的肿瘤体积如图16所示。还计算了第18天和第25天(分组后18和25天)的TGI％，如下表所示。由于对照组中大量小鼠死亡，第25天的P值不可用。下表中的P值是根据第18天的数据计算的。

表14

结果显示ScFV-HC-IgG1-LALA(G5)抑制肿瘤生长，其TGI％(例如在第18天)高于ScFV-HC-IgG4(G4)。此外，1A7-H2K3-IgG4和6A7-H4K2-IgG2的组合(G6)与帕博利珠单抗和6A7-H4K2-IgG2的组合(G7)相比表现出相当的肿瘤抑制作用。

实施例8：双特异性抗体毒性体内测试

在结肠癌模型中测试双特异性抗体ScFV-HC-IgG4的体内毒性。将表达人PD-L1的MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)(MC38-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约100mm³-150mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组3只)。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠分别注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)(G1)、20mg/kg塞鲁单抗(重链SEQ ID NO:144；轻链SEQ ID NO:145)(G2)、20mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G3)、20mg/kg抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G4)、26mg/kg ScFV-HC-IgG4(G5)或20mg/kg抗PD1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4与20mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(Combo；G6)。给药频率为每周三次(共给药3次)。详细信息如下表所示。

表15

血液生化试验

在分组后第7天和第13天，抽取小鼠血液以测试丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬酰胺转氨酶(AST)水平。如图17A至图17D所示，与其他组小鼠相比，用塞鲁单抗(G2)处理的小鼠表现出最高水平的血液ALT和AST水平。此外，与用单克隆抗体(G3和G4)或其组合(G6)处理的小鼠相比，用ScFV-HC-IgG4(G5)处理的小鼠表现出相似的ALT和AST水平。

肝的组织病理学检查

在分组后第13天，分离小鼠肝脏并在显微镜下检查。G1组和G5组小鼠的肝脏无明显异常变化。G2组三只小鼠均出现慢性炎症，例如成纤维细胞增殖，损伤程度为中度。在G3组中，三只小鼠的肝脏均出现局灶性间质炎性细胞浸润，损伤程度为轻度。在G4组中，一只小鼠的肝脏出现局灶性血管周炎性细胞浸润，损伤程度为轻度。在G7组中，三只小鼠的肝脏均出现局灶性间质炎性细胞浸润。其中一只小鼠中的损伤程度为轻微，另两只小鼠中的损伤程度为轻度。

详细的肝损伤程度如下表所示。损伤程度由肝间质/血管周炎性细胞浸润或慢性肝脏炎症(主要是成纤维细胞增殖)确定。各组小鼠肝和肾的代表性组织切片图像如图17E至图17J所示。

表16

损伤程度	G1	G2	G3	G4	G5	G6
							NVL*	3	0	0	2	3	0
轻微(+)	0	0	3	1	0	1
							轻度(+)	0	0	0	0	0	2
中度(+)	0	3	0	0	0	0
							重度(+)	0	0	0	0	0	0

*：非可见损伤

实施例9：PD1-C40-6A7-FV3A的纯化和报告细胞激活

制备PD1-C40-6A7-FV3A

如图18A所示，BsAb PD1-C40-6A7-FV3A具有与抗PD-1单克隆抗体每条重链CH3结构域融合的抗CD40 scFv。具体地，抗CD40 scFv与抗PD-1单克隆抗体重链CH3结构域的位置358至362(根据EU编号)融合。PD1-C40-6A7-FV3A的融合重链序列如SEQ ID NO:161所示。PD1-C40-6A7-FV3A的轻链序列与其亲本抗体PD1-1A7-H2K3-IgG4的轻链相同，该轻链如SEQID NO:141所示。序列来源于抗PD-1抗体1A7和抗CD40抗体6A7。

如图18B所示，通过非还原凝胶电泳(6％分离凝胶)检测纯化的PD1-C40-6A7-FV3A。在凝胶上检测到单一条带(泳道4)，表明PD1-C40-6A7-FV3A以高纯度表达。此外，测得PD1-C40-6A7-FV3A的浓度为84μg/mL。

对hCD40的结合亲和力

通过Biacore系统测定对人CD4(hCD40)的结合亲和力。PD1-C40-6A7-FV3A及其亲本单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的结果汇总于下表中。

表17

样品	分析	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
					PD1-C40-6A7-FV3A	hCD40	6.08E+05	2.55E-04	4.19E-10
C40(6A7-H4K2-IgG2)	hCD40	1.05E+05	3.22E-04	3.06E-09

结果表明，PD1-C40-6A7-FV3A具有与亲本单克隆抗体相当的结合亲和力。

Fc受体介导的报告细胞激活测定

进行实验以测试PD1-C40-6A7-FV3A是否可以通过Fc受体(例如，FCγRIIB)激活报告细胞。如实施例5所述进行类似的实验步骤。

如图18C所示，当CHO-K1-hFcγRIIB细胞存在时，Fab-ScFV-IgG4和抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2均激活报告细胞。然而，PD1-C40-6A7-FV3A未表现出FCγRIIB受体介导的报告细胞激活。

结果显示当抗CD40 scFv与抗PD-1抗体的重链CH3结构域融合时，Fc受体(例如，FCγRIIB)不能通过Fc受体(例如，FCγRIIB)介导的聚集激活CD40通路。因为PD1-C40-6A7-FV3A未表现出Fc受体介导的报告细胞激活，所以PD1-C40-6A7-FV3A可有效降低组织中的毒性，特别是表达高水平FCγRIIB的组织，例如肝组织。

T细胞/APC细胞桥接效应

以下使用报告细胞进行实验，以测试PD1-C40-6A7-FV3A是否可以桥接T细胞和APC细胞。如实施例4所述进行类似的实验步骤。

如图18D所示，当CHO-K1-hPD1细胞存在时，Fab-ScFV-IgG4和PD1-C40-6A7-FV3A均反式激活报告细胞。相比之下，单克隆抗体的组合不激活报告细胞。

结果还表明，PD1-C40-6A7-FV3A对CD40通路的激活取决于其与表达PD-1的细胞的桥接效应。由于表达PD-1的免疫细胞将被募集到肿瘤微环境中，并且PD-1表达通常在肿瘤微环境中被上调，因此该机制也可在很大程度上将免疫激活限制在肿瘤微环境，并减少副作用，例如在肝中的毒性。此外，肿瘤引流淋巴结具有抗原呈递细胞和表达PD-1的T细胞。双特异性抗体可有效增加肿瘤引流淋巴结中的免疫应答。同时，它可以抑制调节性T细胞(Treg)的抑制活性，从而抑制系统耐受性。

对FcRn的结合亲和力

通过

系统测定对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。PD1-C40-6A7-FV3A和抗PD-1单克隆抗体1A7的结果汇总于下表中。

表18

捕获1溶液	分析物1溶液	KD(M)
			PD1-C40-6A7-FV3A	FcRn	1.68E-06
PD-1(1A7-H2K3-IgG4)	FcRn	2.21E-06

结果显示PD1-C40-6A7-FV3A对FcRn的结合亲和力与抗PD-1抗体(1A7-H2K3-IgG4)相当，表明抗CD40 scFv在抗PD-1抗体重链CH3结构域的位置358至362(根据EU编号)区域的融合不影响FcRn结合。

实施例10：ScFV-HC-IgG1-LALA与市售抗PD-1单克隆抗体之间的药效比较

目前在全球范围内已有约十种抗PD-1单克隆抗体获批上市。获批的抗PD-1单克隆抗体包括由默克公司(Merck&Co.)研发的

(帕博利珠单抗)；由百时美施贵宝(Bristol Myers Squibb，BMS)研发的

(纳武利尤单抗，VH SEQ ID NO:209；VL SEQID NO:210)；由赛诺菲(Sanofi S.A.)和再生元制药公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)联合研发的

(西米普利单抗，VH SEQ ID NO:185；VL SEQ ID NO:186)；由信达生物制药公司(Innovent Biologics,Inc.)研发的

(信迪利单抗，VH SEQ ID NO:183；VL SEQ ID NO:184)；由百济神州(BeiGene)研发的替雷利珠单抗(BGB-A317，VH SEQID NO:187；VL SEQ ID NO:188)；以及由君实生物研发的特瑞普利单抗(VH SEQ ID NO:181；VL SEQ ID NO:182)。此外，还有多种抗PD-1单克隆抗体处于临床和临床前阶段。在该实验中，将双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA的体内药效与这些获批的抗PD-1单克隆抗体的药效进行比较。

实验如下进行。在小鼠黑色素瘤模型中测试五种抗PD-1抗体帕博利珠单抗、西米普利单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗和双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA对体内肿瘤生长的抑制作用。具体地，将表达人PD-L1的B16F10细胞(黑色素瘤细胞)(B16F10-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约100mm³-150mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组7只)。在对照组中，向B-hPD-1/hCD40小鼠注射PBS(G1)。在治疗组(G2-G7)中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠分别注射3mg/kg的帕博利珠单抗(G2)、3mg/kg的西米普利单抗(G3)、3mg/kg的信迪利单抗(G4)、3mg/kg的替雷利珠单抗(G5)、3mg/kg的特瑞普利单抗(G6)或4mg/kg的双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G7)。给药频率为每周两次(共给药4次)。每周测量两次肿瘤体积，并记录小鼠的体重。当小鼠的肿瘤体积达到3000mm³时进行安乐死。

表19

实验结果显示在上述给药剂量和频率下，治疗组小鼠对所有抗PD-1单克隆抗体和ScFV-HC-IgG1-LALA的耐受性良好。如图27所示，在整个实验期间，小鼠的平均体重无显著性差异。然而，对于肿瘤体积(图28)，双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G7)表现出最好的药效(TGI_TV％)。

表20

实施例11：ScFV-HC-IgG1-LALA的体内药效和毒性

在多种肿瘤模型中测试双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA的体内毒性和药效。例如，将B16F10-hPD-L1细胞皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到100mm³-150mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组7只)。

在对照组G1中，向B-hPD-1/hCD40小鼠注射生理盐水(PS)。在治疗组G2-G7中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠分别注射0.1mg/kg-30mg/kg(即，0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg)的双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA。给药频率为每周两次(共给药4次)。每周测量两次肿瘤体积，并记录小鼠的体重。当小鼠的肿瘤体积达到3000mm³时进行安乐死。实验在分组后第70天终止。

与前面的结果相似，实验结果显示在上述剂量水平和给药频率下，治疗组小鼠对不同剂量的ScFV-HC-IgG1-LALA的耐受性非常好，并且在整个实验期间小鼠体重的平均值无显著差异。然而，对于肿瘤体积(图29A)和小鼠存活率(图29B)，TGI_TV％显示出增加趋势，即随着剂量水平的增加，小鼠存活率显著提高。具体地，在分组后第21天，小鼠的存活数量如下：G1组(PBS)3只；G2组(0.1mg/kg)2只；G3组(0.3mg/kg)5只，具有可观察到的疗效(TGI_TV％＝29.7％)；G4组(1mg/kg)6只，具有显著的疗效(TGI_TV％＝62.6％)；G5组(3mg/kg)7只，包括2只无肿瘤小鼠，具有显著的疗效(TGI_TV％＝78.3％)；G6组(10mg/kg)7只，包括5只无肿瘤小鼠，具有显著的疗效(TGI_TV％＝99.4％)；以及G7组(30mg/kg)7只，包括4只无肿瘤小鼠，具有显著的疗效(TGI_TV％＝87.3％)。到第21天时其余小鼠(未存活的小鼠)因肿瘤体积超过3000mm³被安乐死。对照组中的所有小鼠在分组后第21天均达到安乐死标准，第18天和第21天的肿瘤体积和TGI_TV％，以及实验期结束时(第70天)的存活状态汇总如下。

表21

在实验期结束时，由于肿瘤体积过大，对G1-G4组中的所有小鼠进行安乐死；G5-G7组中存活的小鼠的数量分别为2、4和4。这表明双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA在小鼠中的药效与剂量相关。此外，ScFV-HC-IgG1-LALA在G6组(10mg/kg)和G7组(30mg/kg)中的疗效相似，表明10mg/kg是ScFV-HC-IgG1-LALA在体内的饱和剂量水平。

实施例12：肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析

TILs分析如下进行。将MC38-hPD-L1细胞皮下注射入双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。在注射后第11天、第14天和第18天，通过腹腔注射(i.p.)分别给药PBS(G1)、3mg/kg抗PD-1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G2)、3mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G3)、4mg/kg双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G4)或3mg/kg抗PD-1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4与3mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G5)的组合。在注射后第21天，对来自对照组G1和治疗组G2-G5的肿瘤组织进行TILs分析。测试结果如图30A至图30C所示。

在类似的实验中，将B16F10-hPD-L1细胞皮下注射入双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。在注射后第9天和第13天，通过腹腔注射(i.p.)分别给药PBS(G1)、3mg/kg抗PD-1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G2)、3mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G3)、4mg/kg双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G4)或3mg/kg抗PD-1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4与3mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G5)的组合。在注射后第15天，对来自对照组G1和治疗组G2-G5的肿瘤组织进行TILs分析。测试结果如图30D至图30F所示。

根据图30A-III和图30D-III中的结果，在MC38肿瘤模型和B16F10肿瘤模型中，与对照组(G1)相比，双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA组(G4)有效提高了T细胞中CD8+T细胞与Treg细胞的比率(CTLS/Tregs)。

此外，PD-1表达的分析结果(图30B和图30E)显示，在MC38肿瘤模型和B16F10肿瘤模型中，双特异性抗体组(G4)中CD8+ T细胞、Treg细胞、CD4+(非Treg)T细胞或NK细胞中PD-1阳性细胞的比例与单克隆抗体组(G2或G3)和对照组(G1)相比显著降低。特别是在B16F10肿瘤模型中，CD8+ T细胞中PD-1阳性细胞的比例显著降低(P＜0.0001，参见图30E至图30I)，表明在用ScFV-HC-IgG1-LALA处理后，PD-1在这些细胞表面上的表达被下调。

进一步分析髓源细胞。在MC38肿瘤模型中，白细胞(CD45+)中树突细胞(DC)和髓源性抑制细胞(MDSC)的百分比显示出下降趋势(图30C-I和图30C-II)。相比之下，在B16F10肿瘤模型中，白细胞中这两种细胞类型(CD45+)的百分比显示出上升趋势(图30F-I和图30F-II)。结合MC38肿瘤模型(图30C-III和图30C-IV)和B16F10肿瘤模型(图30F-III和图30F-IV)中DC细胞激活(CD80/CD86+DC和MHCII+DC)的检测结果，发现在MC38肿瘤模型中，双特异性抗体组(G4)与单克隆抗体组(G2或G3)和抗体组合组(G5)相比表现出更好的促进杀伤T细胞增殖/浸润的作用和降低骨髓来源的抑制细胞(髓源性抑制细胞，MDSC)比例的作用；在B16F10肿瘤模型中，双特异性抗体组(G4)与单克隆抗体组(G2或G3)和抗体组合组(G5)相比，主要促进DC细胞的增殖/浸润和激活，以及CD8+ T细胞中PD-1比例的下调。MC38肿瘤模型具有热肿瘤的特点。结果表明，在热肿瘤模型中，双特异性抗体能够有效促进CD8+ T细胞的增殖和浸润，减少髓源性抑制细胞的数量。在具有冷肿瘤特点的B16F10-PDL1肿瘤模型中，双特异性抗体能够有效促进DC细胞的增殖、浸润和激活，并下调PD1在CD8+ T细胞中的表达。流式细胞术分析的策略如图31A至图31B所示。

实施例13：ScFV-HC-IgG结构中不同PD-1抗体的替换

选择两种市售抗PD-1单克隆抗体特瑞普利单抗和帕博利珠单抗，并根据它们的序列，用它们的可变区替换ScFV-HC-IgG1-LALA双特异性抗体的抗PD-1可变区。将得到的抗体分别命名为特瑞普利单抗-6A7-HC-IgG1-LALA(重链序列如SEQ ID NO:162所示，轻链序列如SEQ ID NO:163所示)和帕博利珠单抗-6A7-HC-IgG1-LALA(重链序列如SEQ ID NO:164所示，轻链序列如SEQ ID NO:165所示)。

与先前的体内药效实验相似，在结肠癌小鼠模型中测试了双特异性抗体特瑞普利单抗-6A7-HC-IgG1-LALA和帕博利珠单抗-6A7-HC-IgG1-LALA对体内肿瘤生长的作用。将表达人PD-L1的MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)(MC38-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约400mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组6只)。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠注射磷酸盐缓冲盐水(PBS，G1)、1mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2(G2)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体特瑞普利单抗(G3)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体帕博利珠单抗(G4)、1.35mg/kg(基于相似摩尔量)特瑞普利单抗-6A7-HC-IgG1-LALA(G5)、1.35mg/kg帕博利珠单抗-6A7-HC-IgG1-LALA(G6)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体特瑞普利单抗与1mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(G7)或1mg/kg抗PD1单克隆抗体帕博利珠单抗与1mg/kg抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的组合(G8)。给药频率为每周两次(共给药5次)。详细信息如下表所示。

表22

在整个处理期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的平均体重均有不同程度的增加(图32和图33)。在处理期结束时，不同组中小鼠的体重均增加。

用抗体处理的组中的肿瘤体积如图34所示。还计算了第17天和第21天(分组后17天和21天)的TGI_TV％，如下表所示。由于对照组中的大量小鼠因肿瘤体积超标而被安乐死，因此第21天的P值无法获得。下表中的P值是基于第17天的数据计算的。

表23

结果显示特瑞普利单抗-6A7-HC-IgG1-LALA(G5)和帕博利珠单抗-6A7-HC-IgG1-LALA(G6)均抑制肿瘤生长，其TGI_TV％(例如，在第21天)高于单克隆抗体(G2、G3和G4)和抗体组合(G7和G8)。特别地，G5组中所有小鼠存活，并且其中一只小鼠的肿瘤完全消失。结果表明，不同的抗PD-1抗原结合片段可与ScFV-HC-IgG结构上的抗CD40scFv一起使用，以获得更好的药效。

实施例14：ScFV-HC-IgG结构中不同CD40 scFv的替换

CD40是一种关键的免疫共刺激途径受体，其存在于免疫系统中的抗原呈递细胞(APC)的表面，并在激活先天性和适应性免疫系统机制中起关键作用。目前正在研发的抗CD40抗体包括例如，由Apexigen研发的APX005M(VH SEQ ID NO:191；VL SEQ ID NO:192)、由罗氏公司(Roche)研发的RG7876(塞鲁单抗)、由Viela Bio研发的VIB4920和由AlligatorBiosciences研发的ADC-1013。在该实验中，选择抗CD40单克隆抗体中的两种抗体，即塞鲁单抗和APX005M来产生与帕博利珠单抗联用的双特异性抗体。所得抗体具有ScFV-HC-IgG的结构，如图1B所示，并且这些抗体命名为帕博利珠单抗-Seli-FVHC-IgG4(重链序列如SEQID NO:175所示，轻链序列如SEQ ID NO:176所示)和帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4(重链序列如SEQ ID NO:177所示，轻链序列如SEQ ID NO:178所示)。此外，1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4中的PD-1抗原结合位点与CD40抗原结合位点交换，产生塞鲁单抗-1A7-FVHC-IgG4(重链序列如SEQ ID NO:201所示，轻链序列如SEQ ID NO:202所示)。

在结肠癌小鼠模型中测试双特异性抗体帕博利珠单抗-Seli-FVHC-IgG4和帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4对体内肿瘤生长的作用。具体地，将表达人PD-L1的MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)(MC38-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约400mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组6只)。

与先前的体内药效实验相似，在结肠癌小鼠模型中测试了双特异性抗体帕博利珠单抗-Seli-FVHC-IgG4、帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4和塞鲁单抗-1A7-FVHC-IgG4对体内肿瘤生长的作用。将表达人PD-L1的MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)(MC38-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约400mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组6只)。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠注射生理盐水(PS，G1)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体帕博利珠单抗(G2)、1mg/kg抗CD40单克隆抗体APX005M(IgG1-S267E)(G3)、塞鲁单抗-IgG2(G4)、1.35mg/kg帕博利珠单抗-Seli-FVHC-IgG4(G5)、1.35mg/kg帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4(G6)、1.35mg/kg塞鲁单抗-1A7-FVHC-IgG4(G7)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体帕博利珠单抗与1mg/kg抗CD40单克隆抗体APX005M的组合(G8)或1mg/kg抗PD1单克隆抗体帕博利珠单抗与1mg/kg抗CD40单克隆抗体塞鲁单抗的组合(G8)。给药频率为每周两次(共给药6次)。详细信息如下表所示。

表23

分组后14天，各组的平均体重无明显差异(图44A和图44B)。不同组中的所有小鼠体重均增加。各组的肿瘤体积如图44C所示。结果显示帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4(G6)比单克隆抗体(G2)和(G3)或联合治疗(G8)具有更好的药效。

实施例15：不同结构的双特异性抗体的体内毒性测试

构建了多种结构形式的PD-1/CD40双特异性抗体。具体地，使用塞鲁单抗的scFv和抗PD-1单克隆抗体1A7的序列产生四种具有不同结构的双特异性抗体，并测试它们的毒性。获得的抗体命名如下：1A7-塞鲁单抗-FVKH-IgG4(结构如图1A所示，重链序列如SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:173所示，轻链序列如SEQ ID NO:167所示)；1A7-塞鲁单抗-FV3A-IgG4(结构如图18A所示，重链序列如SEQ ID NO:168所示，轻链序列如SEQ ID NO:169所示)，其包含用塞鲁单抗的相应序列取代抗CD40抗体6A7序列；1A7-塞鲁单抗-DART-IgG4(结构如图37所示，重链序列如SEQ ID NO:170所示，轻链序列如SEQ ID NO:171所示)；1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4(结构如图1B所示，重链序列如SEQ ID NO:172所示，轻链序列如SEQ ID NO:174所示)。

本领域已知塞鲁单抗毒性相对较大。在小鼠中测试了多种结构形式的PD-1/CD40双特异性抗体的毒性。将双人源化CD40/PD-1小鼠(约7周龄)根据其体重随机分成8组(每组3只)。随机选择下列抗体中的一种，并在分组当天和其后每隔3天给药：抗CD40单克隆抗体塞鲁单抗(G2)、抗PD-1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G3)、1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4(G4)、1A7-塞鲁单抗-FV3A-IgG4(G5)、1A7-塞鲁单抗-DART-IgG4(G6)、1A7-塞鲁单抗-FVKH-IgG4(G7)和双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G8)。对照组(G1)注射PBS。

表25

如图35至图36所示，实验结果显示与对照组小鼠相比，仅G2组小鼠的体重显示出显著减轻，而其他治疗组小鼠的体重未显示出显著差异。

在分组后第7天，收集外周血以检测天冬酰胺转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的浓度。如图38A至图38B所示，ALT和AST检测结果显示G2组小鼠(给药抗CD40单克隆抗体塞鲁单抗)的ALT和AST转氨酶的浓度最高。双特异性抗体组(G4-G8)中的转氨酶浓度低于G2组中的转氨酶浓度。具体地，仅G4和G6组小鼠显示出转氨酶浓度增加的趋势。其他组小鼠的转氨酶浓度与G1组小鼠相近。

在分组后第10天，分离小鼠肝脏并在显微镜下检查。结果如下表所示，其显示双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G8)的毒性低于单克隆抗体(G2-G3)和其他双特异性抗体(G4-G7)的毒性。事实上，双特异性抗体ScFV-HC-IgG1-LALA未显示出任何毒性作用。

结果表明，具有各种形式的PD-1/CD40双特异性抗体可显著降低抗CD40抗体的毒性。

表26

*：非可见损伤

实施例16：BsAb抗结肠癌的体内结果

与先前的体内药效实验相似，在结肠癌小鼠模型中测试了上述抗体对体内肿瘤生长的作用。将表达人PD-L1的MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)(MC38-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约400mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组8只)。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠注射磷酸盐缓冲盐水(PBS，G1)、1mg/kg抗CD40单克隆抗体塞鲁单抗(塞鲁单抗-IgG2，G2)、1mg/kg抗PD-1单克隆抗体1A7-H2K3-IgG4(G3)、1mg/kg塞鲁单抗与1mg/kg 1A7-H2K3-IgG4的组合(G4)、1.35mg/kg1A7-塞鲁单抗-FV3A-IgG4(G5)或1.35mg/kg 1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4(G6)。给药频率为每周两次(共给药6次)。详细信息如下表所示。

表27

在整个处理期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的平均体重均有不同程度的增加(图39和图40)。在处理期结束时，不同组中小鼠的体重均增加。

用抗体处理的组中的肿瘤体积如图41所示。还计算了第17天(分组后17天)的TGI_TV％，如下表所示。下表中的P值是基于第17天的数据计算

表28

结果显示，1A7-塞鲁单抗-FV3A-IgG4(G5)和1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4(G6)均抑制肿瘤生长，其TGI_TV％(例如，在第17天)比单克隆抗体(G2和G3)和抗体组合(G4)高。结果表明，不同结构形式的PD-1/CD40双特异性抗体可以优异的疗效显著抑制肿瘤生长。

实施例17：双特异性抗体的T细胞/APC细胞桥接效应

进行实验以测试由PD1/CD40 BsAb诱导的CD40激活是否依赖于PD-1表达细胞的存在。如下产生两种PD-1/CD40双特异性抗体：

帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4：将APX005M的scFv序列与抗PD-1单克隆抗体帕博利珠单抗重链的C末端连接，得到双特异性抗体帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4。

SdAb-6A7-FVHC-IgG1-LALA：SdAb是抗PD-1纳米抗体(或骆驼科单结构域抗体)(单可变结构域(VHH)序列如公开信息的SEQ ID NO:204所示)。将抗CD40单克隆抗体6A7-H4K2-IgG2的scFv序列与SdAb的C末端连接，得到双特异性抗体SdAb-6A7-FVHC-IgG1-LALA。

将效应细胞Jurkat-Luc-hCD40和基底细胞Jurkat-hPD1接种在96孔板中(细胞密度5×10⁴个细胞/孔)，并在37℃下温育。将BsAb帕博利珠单抗-6A7-HC-IgG1-LALA、帕博利珠单抗-Seli-FVHC-IgG4、SdAb-6A7-FVHC-IgG1-LALA、1A7-塞鲁单抗-FV3A-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FVKH-IgG4、1A7-塞鲁单抗-DART-IgG4、帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4；和抗CD40抗体APX005M(IgG1-S267E)、塞鲁单抗-IgG2和6A7-H4K2-IgG2进行连续稀释(3倍)，最高浓度为3μg/mL。向每个孔中加入25μL抗体，并在37℃培养箱中温育6小时。温育后，取出培养板，加入75μL Bio-lite萤光素酶检测试剂(诺唯赞生物科技股份有限公司，目录号：DD1201-02-AB)，在室温下温育5-10分钟。然后将培养板置于发光检测器中检测荧光信号。对照实验以类似的步骤进行，但不存在基底细胞Jurkat-luc-hPD1。

如图42A至图42B所示，当基底细胞Jurkat-luc-hPD1存在时，仅BsAb(即，帕博利珠单抗-6A7-HC-IgG1-LALA、帕博利珠单抗-Seli-FVHC-IgG4、SdAb-6A7-FVHC-IgG1-LALA、1A7-塞鲁单抗-FV3A-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FVHC-IgG4、1A7-塞鲁单抗-FVKH-IgG4、1A7-塞鲁单抗-DART-IgG4和帕博利珠单抗-APX005M-FVHC-IgG4)反式激活报告细胞。相比之下，除了塞鲁单抗-IgG2以外，单克隆抗CD40抗体不激活报告细胞。如图42C至图42D所示，在不存在基底细胞Jurkat-luc-hPD1的情况下，BsAb和单克隆抗体(除了塞鲁单抗-IgG2以外)都不激活报告细胞。

结果表明，本文所述的双特异性抗体对CD40通路的激活取决于CD40的聚集，其可能通过与PD-1表达细胞上的PD-1交联实现。对于塞鲁单抗-IgG2，该抗CD40抗体可在无交联活性(例如，不与FCγRIIB交联)的情况下激活CD40。

实施例18：多种抗PD-1抗体和抗CD40抗体可变结构域的替换

进一步进行实验以测试各种抗PD-1抗体中的VH和VL或另选地VHH是否可用于替换ScFV-HC-IgG1双特异性抗体中的抗PD-1可变区。此外，还测试了各种抗CD40单克隆抗体的VH和VL。这些抗体及它们的序列如下所列。

表29

与先前的体内药效实验类似，在小鼠模型中测试这些双特异性抗体对体内肿瘤生长的作用。将表达人PD-L1的癌细胞(例如，MC38-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约300mm³-500mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组6只)。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠注射磷酸盐缓冲盐水(PBS，G1)、1mg/kg抗CD40单克隆抗体(G2)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体(G3)、1.35mg/kg ScFV-HC-IgG1-LALA(G4)与1mg/kg抗PD1单克隆抗体与1mg/kg抗CD40单克隆抗体的组合(G5)。给药频率为每周两次，给药次数适当(例如，共给药5次)。在整个处理期间监测每只小鼠的体重和肿瘤体积。预期这些具有ScFV-HC-IgG1-LALA形式(例如，图1B)的抗PD1/CD40双特异性抗体在治疗癌症方面具有优异的药效和低水平的毒性。

此外，进行实验以测试这些FV3A形式(例如，图18A)的抗体的药效。在该结构下，抗CD40抗原结合位点插入到抗PD-1抗体的3A位点。

表30

在小鼠模型中测试这些双特异性抗体对体内肿瘤生长的作用。将表达人PD-L1的癌细胞(例如，MC38-hPD-L1)皮下注射到双人源化CD40/PD-1小鼠(B-hPD-1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约300mm³-500mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组6只)。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hCD40小鼠注射磷酸盐缓冲盐水(PBS，G1)、1mg/kg抗CD40单克隆抗体(G2)、1mg/kg抗PD1单克隆抗体(G3)、1.35mg/kg PD1-C40-FV3A(G4)和1mg/kg抗PD1单克隆抗体与1mg/kg抗CD40单克隆抗体的组合(G5)。给药频率为每周两次，给药次数适当(例如，共给药5次)。在整个处理期间监测体重和肿瘤体积。预期这些具有PD1-C40-FV3A形式(例如，图18A)的抗PD1/CD40双特异性抗体在治疗癌症方面具有优异的药效和低水平的毒性。

此外，进行实验以测试这些Fab-ScFV-IgG4形式(例如，图1A)的抗体的药效。在该结构下，抗PD-1臂包含重链和轻链，并且抗CD40臂包含与IgG4的CH2和CH3结构域连接的单链可变片段(scFv)。或者，抗PD-1臂仅具有一条重链，并且VHH与任选的CH1、CH2和CH3连接。

表31

此外，进行实验以测试这些含Fc的DART形式(图37)的抗体对表31中所列VH、VL和VHH的药效。预期这些抗PD1/CD40双特异性抗体在治疗癌症方面也具有优异的药效和低水平的毒性。

实施例19：双特异性抗体抗结肠癌的体内结果

阿替利珠单抗是由基因泰克公司(Genentech)研发的人源化抗PD-L1单克隆抗体(VH SEQ ID NO:211；VL SEQ ID NO:212)。阿维鲁单抗是由默克(Merck)/辉瑞(Pfizer)研发的人抗PD-L1单克隆抗体(VH SEQ ID NO:213；VL SEQ ID NO:214)。在该实验中，本文所述的双特异性抗体的抗PD-1臂的VH和VL序列(例如，如图1B所示)用抗PD-L1抗体的VH和VL序列替代。此外，将获得的PD-L1/CD40双特异性抗体的药效与本文公开的相应PD-1/CD40双特异性抗体的药效进行比较。

与先前的体内药效实验相似，在结肠癌小鼠模型中测试了抗体ScFV-HC-IgG1-LALA、阿替利珠单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(重链序列如SEQ ID NO:215所示，轻链序列如SEQ ID NO:216所示)和阿维鲁单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(重链序列如SEQ ID NO:217所示，轻链序列如SEQ ID NO:218所示)对体内肿瘤生长的作用。将表达人PD-L1的MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)(MC38-hPD-L1)皮下注射到人源化PD1/PD-L1/CD40小鼠(B-hPD-1/hPD-L1/hCD40小鼠)中。当小鼠中的肿瘤体积达到约100mm³-150mm³时，基于肿瘤体积将小鼠随机分成不同的组(每组6只)。人源化PD-L1小鼠的详细信息可参见例如PCT申请号PCT/CN2017/099574和US10945418B2，其通过引用方式整体并入本文。

在每组中，通过腹腔注射(i.p.)向B-hPD-1/hPD-L1/hCD40小鼠(具有人源化PD-1、人源化PD-L1和人源化CD40基因的小鼠)注射磷酸盐缓冲盐水(PBS，G1)、1mg/kg抗PD-1/CD40抗体ScFV-HC-IgG1-LALA(G2)、1mg/kg抗PD-L1/CD40双特异性抗体阿替利珠单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G3)、1mg/kg抗PD-L1/CD40双特异性抗体阿维鲁单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G4)、3mg/kg ScFV-HC-IgG1-LALA(G5)、3mg/kg阿替利珠单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G6)或3mg/kg阿维鲁单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G7)。给药频率为每周两次(共给药4次)。详细信息如下表所示。

表32

在整个处理期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的平均体重均有不同程度的增加(图45和图46)。在处理期结束时，不同组中小鼠的体重均增加。

用抗体处理的组中的肿瘤体积如图47所示。还计算了第21天(分组后21天)的TGI_TV％，如下表所示。下表中的P值是基于第21天的数据计算的。

表33

结果显示在相同的剂量水平下，ScFV-HC-IgG1-LALA抗体显示出比阿替利珠单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA或阿维鲁单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA显著更好的体内药效。剂量水平越高，治疗越有效。

更具体地，结果显示在不同剂量水平下，ScFV-HC-IgG1(G2、G5)以高于阿替利珠单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G3、G6)或阿维鲁单抗-6A7-FVHC-IgG1-LALA(G4、G7)的TGI_TV％(69.6％、92.5％)抑制肿瘤生长，并且剂量越高，疗效越好。因此，数据证明具有ScFV-HC-IgG1形式的不同分子在B-hPD-1/hPD-L1/hCD40小鼠中具有不同的疗效。

其他实施例

应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式对本发明进行了描述，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 祐和医药科技（北京）有限公司

<120> 抗PD-1/CD40双特异性抗体及其用途

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<150> PCT/CN2020/120918

<151> 2020-10-14

<150> PCT/CN2021/085335

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp

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Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

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Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln

65 70 75 80

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Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

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Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys

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Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

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Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Phe

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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

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Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Pro Asn His Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr

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Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly

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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

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Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

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Thr Leu Thr Val Ser Ser

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Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr

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Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

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Asn Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

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Ser Arg Ser Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser

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Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

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Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

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Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Val Ser Ser

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

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Pro Asn His Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Gly Asn Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Asn His Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr

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Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr

210 215 220

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

Lys

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full-length PD-1 light chain of Fab-ScFV-IgG4

<400> 131

Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp

20 25 30

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

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275 280 285

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

305 310 315 320

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

325 330 335

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65 70 75 80

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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

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<213> Artificial Sequence

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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

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195 200 205

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275 280 285

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305 310 315 320

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

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Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Ile His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Thr Thr Val Ala Thr Thr Tyr Tyr Trp Tyr Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Ile Pro Met Phe Asp Thr Ala Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

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Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Tyr Ala Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

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Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Trp Tyr Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Asn Tyr Ala Phe His Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ala Tyr Ser Ser Pro Tyr

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Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp

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Met Gly Tyr Ile Asn Ser Ala Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

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Leu Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr

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Tyr Val Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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50 55 60

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65 70 75 80

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Gly Tyr Gly Ile Ser

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Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

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Leu Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

65 70 75 80

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Trp Thr

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Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr

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Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

35 40 45

Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly

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20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Ser Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Thr Tyr Pro His

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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Cys

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<223> Mitazalimab VL

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Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asn Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Lys Ser

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Ile Ser Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

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<223> selicrelumab VL

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr

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210 215 220

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225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

325 330 335

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

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450 455 460

Gly Gly Gly Ser Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

465 470 475 480

Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

485 490 495

Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

500 505 510

Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

515 520 525

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

530 535 540

Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

545 550 555 560

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

565 570 575

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

580 585 590

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

595 600 605

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

610 615 620

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

625 630 635 640

Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser

645 650 655

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660 665 670

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

675 680 685

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser

690 695 700

Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

705 710 715 720

Ser

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<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Selicrelumab-1A7-FVHC-IgG4 (light chain)

<400> 202

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SdAb-6A7-FVHC-IgG1-LALA (heavy chain)

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Arg Ala Cys Gly Ser Ser Trp Leu Gly Ala Glu Ser Trp

100 105 110

Ala Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp

115 120 125

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

130 135 140

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Val Tyr Tyr Cys Thr Arg His Gly Asn Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly

690 695 700

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

705 710

<210> 218

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Avelumab-6A7-FVHC-IgG1-LALA (light chain)

<400> 218

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

Claims

1.一种抗原结合蛋白构建体，所述抗原结合蛋白构建体包含特异性结合PD-1的第一抗原结合位点和特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一抗原结合位点结合表达PD-1的细胞。

3.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第二抗原结合位点结合表达CD40的细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体能够激活CD40通路，其中所述CD40通路的激活取决于所述抗原结合蛋白构建体与表达PD-1的细胞的结合。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体在一个或多个表达PD-1的细胞存在的情况下诱导CD40通路的激活。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体在肿瘤微环境或肿瘤引流淋巴结中诱导CD40通路的激活。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体在不存在一个或多个表达PD-1的细胞的情况下不诱导CD40通路的激活。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述表达PD-1的细胞是T细胞、B细胞、NK细胞或髓样细胞(例如，巨噬细胞、髓源性抑制细胞(MDSC))。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述表达CD40的细胞是抗原呈递细胞。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含Fc区，其中所述第二抗原结合位点与所述Fc区连接。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含Fc区，其中所述第二抗原结合位点与所述Fc区的C末端连接。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含Fc区，其中所述抗原结合蛋白构建体不能通过Fc受体介导的机制激活CD40通路。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体是双特异性抗体。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中特异性结合PD-1的所述第一抗原结合位点包括ScFv或VHH结构域。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中特异性结合PD-1的所述抗原结合位点包括PD-1配体(例如，PD-L1)或其可溶性部分。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中特异性结合CD40的所述第二抗原结合位点包括ScFv或VHH结构域。

17.根据权利要求1-15中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中特异性结合CD40的所述第二抗原结合位点包括CD40配体(例如，CD40L)或其可溶性部分。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一抗原结合位点包含重链可变区和轻链可变区。

19.根据权利要求18所述的抗原结合蛋白构建体，其中

所述第一抗原结合位点的所述重链可变区(VH1)包含互补决定区(CDR)1、2和3，其中所述VH1 CDR1区包含与选择的VH1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH1 CDR2区包含与选择的VH1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH1 CDR3区包含与选择的VH1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；和

所述第一抗原结合位点的所述轻链可变区(VL1)包含CDR1、2和3，其中所述VL1CDR1区包含与选择的VL1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL1 CDR2区包含与选择的VL1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL1 CDR3区包含与选择的VL1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，

其中所选的VH1 CDR1、2和3氨基酸序列、所选的VL1 CDR1、2和3氨基酸序列是以下项中的一者：

20.根据权利要求1-19中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第二抗原结合位点包含重链可变区和轻链可变区。

21.根据权利要求20所述的抗原结合蛋白构建体，其中

所述第二抗原结合位点的所述重链可变区(VH2)包含CDR1、2和3，其中所述VH2CDR1区包含与选择的VH2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH2 CDR2区包含与选择的VH2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH2 CDR3区包含与选择的VH2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；和

所述第二抗原结合位点的所述轻链可变区(VL2)包含CDR1、2和3，其中所述VL2CDR1区包含与选择的VL2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL2 CDR2区包含与选择的VL2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL2 CDR3区包含与选择的VL2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，

其中所选的VH2 CDR1、2和3氨基酸序列以及所选的VL2 CDR1、2和3氨基酸序列是以下项中的一者：

22.一种抗原结合蛋白构建体，所述抗原结合蛋白构建体包含

第一重链可变区和第一轻链可变区，其中所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区彼此结合，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点；以及

第二重链可变区和第二轻链可变区，其中所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

23.根据权利要求22所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含

第一多肽，所述第一多肽包含所述第一重链可变区、第一重链恒定区2(CH2)和第一重链恒定区3(CH3)；和

第二多肽，所述第二多肽包含所述第二重链可变区、第二重链恒定区2(CH2)和第二重链恒定区3(CH3)。

24.根据权利要求23所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含

第三多肽，所述第三多肽包含所述第一轻链可变区；和

第四多肽，所述第四多肽包含所述第二轻链可变区。

25.根据权利要求23所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第二多肽还包含所述第二轻链可变区。

26.根据权利要求25所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含第三多肽，所述第三多肽包含所述第一轻链可变区。

27.根据权利要求23或25所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一多肽还包含所述第一轻链可变区。

28.根据权利要求22所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含

第一多肽，所述第一多肽包含所述第一重链可变区、所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区；和

第二多肽，所述第二多肽包含所述第一轻链可变区。

29.根据权利要求28所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一多肽还包含重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)。

30.根据权利要求22-29中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中

所述第一重链可变区(VH1)包含互补决定区(CDR)1、2和3，其中所述VH1 CDR1区包含与选择的VH1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH1CDR2区包含与选择的VH1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH1 CDR3区包含与选择的VH1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；和

所述第一轻链可变区(VL1)包含CDR1、2和3，其中所述VL1 CDR1区包含与选择的VL1CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL1 CDR2区包含与选择的VL1CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL1 CDR3区包含与选择的VL1CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，

31.根据权利要求22-30中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中

所述第二重链可变区(VH2)包含CDR1、2和3，其中所述VH2 CDR1区包含与选择的VH2CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH2 CDR2区包含与选择的VH2CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH2 CDR3区包含与选择的VH2CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；和

所述第二轻链可变区(VL2)包含CDR1、2和3，其中所述VL2 CDR1区包含与选择的VL2CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL2 CDR2区包含与选择的VL2CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL2 CDR3区包含与选择的VL2CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，

32.根据权利要求30或31所述的抗原结合蛋白构建体，其中

(1)根据Kabat编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，并且所选的VL1 CDR1、2、3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；所选的VH2CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:65、66和67所示，所选的VL2CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:68、69和70所示；或者

33.根据权利要求22-32中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一重链可变区包含与SEQ ID NO:40、41、42或53具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:43、44、45或54具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

34.根据权利要求22-31中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一重链可变区包含与SEQ ID NO:46、47、48、49或55具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:50、51、52或56具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

35.根据权利要求22-31中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一重链可变区包含与SEQ ID NO:57具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:58具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

36.根据权利要求22-31中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第二重链可变区包含与SEQ ID NO:98、99、100或120具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:101、102、103、104或121具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

37.根据权利要求22-32中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第二重链可变区包含与SEQ ID NO:105、106、107、108、122、126或128具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:109、110、111、123、127或129具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

38.根据权利要求22-31中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第二重链可变区包含与SEQ ID NO:112、113、114、115或124具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:116、117、118、119或125具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

39.根据权利要求22-32、33和37中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一重链可变区包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二重链可变区包含与SEQ ID NO:108或126具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:110或127具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

40.根据权利要求26所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:130具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:131具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

41.根据权利要求26或40所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第二多肽包含与SEQID NO:132或133具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

42.根据权利要求26所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一多肽包含与SEQ IDNO:130具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；所述第二多肽包含与SEQ ID NO:132或133具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；所述第三多肽包含与SEQ IDNO:131具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

43.根据权利要求28或29所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一多肽包含与SEQID NO:134或135具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:136具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

44.根据权利要求28或29所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述第一多肽包含与SEQID NO:137或138具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:139具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

45.根据权利要求1-44中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体是双特异性抗体。

46.根据权利要求1-44中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体是Fab-scFv-Fc。

47.根据权利要求1-44中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体是TrioMab、具有共有轻链的双特异性抗体、CrossMab、2:1CrossMab、2:2CrossMab、Duobody、双可变结构域抗体(DVD-Ig)、scFv-IgG、IgG-IgG形式抗体、Fab-scFv-Fc形式抗体、TF、ADAPTIR、双特异性T细胞衔接体(BiTE)、BiTE-Fc、双亲和重靶向抗体(DART)、DART-Fc、四价DART、串联双抗体(TandAb)、scFv-scFv-scFv、ImmTAC、三特异性纳米抗体或三特异性杀伤衔接体(TriKE)。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含来自IgG1或IgG4的一个或多个重链恒定结构域。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的抗原结合蛋白构建体，其中所述抗原结合蛋白构建体包含一个或多个重链恒定结构域，并且所述一个或多个重链恒定结构域包含LALA突变和/或杵臼(KIH)突变。

50.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含

第一重链多肽，所述第一重链多肽包含第一重链可变区；

第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包含第一轻链可变区；

第二重链多肽，所述第二重链多肽包含第二重链可变区；和

第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包含第二轻链可变区，

其中所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区彼此结合，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点，所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

51.根据权利要求50所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含

所述第一重链可变区(VH1)，所述VH1包含互补决定区(CDR)1、2和3，其中所述VH1 CDR1区包含与选择的VH1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH1 CDR2区包含与选择的VH1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH1 CDR3区包含与选择的VH1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；

所述第一轻链可变区(VL1)，所述VL1包含CDR1、2和3，其中所述VL1 CDR1区包含与选择的VL1 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL1 CDR2区包含与选择的VL1 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL1CDR3区包含与选择的VL1 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；

所述第二重链可变区(VH2)，所述VH2包含互补决定区(CDR)1、2和3，其中所述VH2 CDR1区包含与选择的VH2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH2 CDR2区包含与选择的VH2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VH2 CDR3区包含与选择的VH2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；和

所述第二轻链可变区(VL2)，所述VL2包含CDR1、2和3，其中所述VL2 CDR1区包含与选择的VL2 CDR1氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL2 CDR2区包含与选择的VL2 CDR2氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列，所述VL2CDR3区包含与选择的VL2 CDR3氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；

其中所选的VH1 CDR1、2和3氨基酸序列、所选的VL1 CDR1、2和3氨基酸序列、所选的VH2CDR1、2和3氨基酸序列以及所选的VL2 CDR1、2和3氨基酸序列是以下项中的一者：

(1)根据Kabat编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，所选的VL1 CDR1、2、3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:65、66和67所示，所选的VL2CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQID NO:68、69和70所示；以及

(2)根据Chothia编号规则，所选的VH1 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、20和21所示，所选的VL1 CDR1、2、3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、23和24所示；所选的VH2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:83、84和85所示，所选的VL2 CDR1、2、3氨基酸序列分别如SEQ ID NO:86、87和88所示。

52.根据权利要求50或51所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链可变区包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二重链可变区包含与SEQ ID NO:108或126具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:110或127具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

53.根据权利要求50-52中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链多肽包含与SEQ ID NO:130具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第一轻链多肽包含与SEQ ID NO:131具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

54.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含

重链多肽，所述重链多肽包含第一重链可变区；

轻链多肽，所述轻链多肽包含第一轻链可变区；和

单链可变片段多肽，所述单链可变片段多肽包含第二重链可变区和第二轻链可变区，其中所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区彼此结合，形成特异性结合PD-1的第一抗原结合位点，所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区彼此结合，形成特异性结合CD40的第二抗原结合位点。

55.根据权利要求54所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述单链可变片段多肽从N末端至C末端包含：所述第二重链可变区、接头肽序列、所述第二轻链可变区、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)。

56.根据权利要求55所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述接头肽序列包括与ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:152)具有至少80％的同一性的序列。

57.根据权利要求54-56中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含

58.根据权利要求54-57中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链可变区包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二重链可变区包含与SEQ ID NO:108或126具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:110或127具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

59.根据权利要求54-58中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(1)所述重链多肽包含与SEQ ID NO:130具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述轻链多肽包含与SEQ ID NO:131具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；和

(2)所述单链可变片段多肽包含与SEQ ID NO:132或133具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

60.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含

重链多肽，所述重链多肽包含第一重链可变区；和

轻链多肽，所述轻链多肽包含第一轻链可变区；

其中，一单链可变片段多肽与所述重链多肽的C末端连接；其中所述单链可变片段多肽包含第二重链可变区和第二轻链可变区；

61.根据权利要求60所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述单链可变片段多肽通过第一接头肽序列与所述第一重链多肽连接。

62.根据权利要求61所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一接头肽序列包括与GGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:153)具有至少80％的同一性的序列。

63.根据权利要求60-62中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述单链可变片段多肽从N末端至C末端包含：所述第二轻链可变区、第二接头肽序列和所述第二重链可变区。

64.根据权利要求63所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二接头肽序列包含与GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:154)具有至少80％的同一性的序列。

65.根据权利要求60-64中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含

66.根据权利要求60-65中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链可变区包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第一轻链可变区包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二重链可变区包含与SEQ ID NO:108或126具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列，所述第二轻链可变区包含与SEQ ID NO:110或127具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

67.根据权利要求60-66中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(1)所述重链多肽包含与SEQ ID NO:134或135具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；和

(2)所述轻链多肽包含与SEQ ID NO:136具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

68.根据权利要求60-66中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(1)所述重链多肽包含与SEQ ID NO:137或138具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列；和

(2)所述轻链多肽包含与SEQ ID NO:139具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

69.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含：

包含Fc区的抗体，其中所述抗体特异性结合靶标，和

特异性结合CD40的抗原结合位点，

其中所述抗原结合位点与所述抗体的Fc区连接。

70.根据权利要求69所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在存在一个或多个表达所述靶标的细胞的情况下诱导免疫细胞中CD40通路的激活。

71.根据权利要求69所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体能够激活CD40通路，其中所述激活CD40通路取决于所述抗原结合蛋白构建体与表达所述靶标的细胞的结合。

72.根据权利要求69所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在肿瘤微环境或肿瘤引流淋巴结中诱导CD40通路的激活。

73.根据权利要求69所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在不存在一个或多个表达所述靶标的细胞的情况下不诱导CD40通路的激活。

74.根据权利要求69-73中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体不能通过Fc介导的机制激活CD40通路。

75.根据权利要求69-74中任一项所述的双特异性抗体，其中所述靶标是免疫检查点分子。

76.根据权利要求69-74中任一项所述的双特异性抗体，其中所述靶标是癌症特异性抗原或癌症相关抗原。

77.根据权利要求69-74中任一项所述的双特异性抗体，其中所述靶标是PD-1。

78.根据权利要求69-77中任一项所述的双特异性抗体，其中特异性结合CD40的所述抗原结合位点包括ScFv或VHH结构域。

79.根据权利要求69-77中任一项所述的双特异性抗体，其中特异性结合CD40的所述抗原结合位点包括CD40配体(例如，CD40L)或其可溶性部分。

80.根据权利要求69-79中任一项所述的双特异性抗体，其中特异性结合CD40的所述抗原结合位点与所述Fc区的C末端连接。

81.根据权利要求69-79中任一项所述的双特异性抗体，其中特异性结合CD40的所述抗原结合位点插入到所述Fc区。

82.一种抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物包含与治疗剂共价结合的根据权利要求1-49中任一项所述的抗原结合蛋白构建体或根据权利要求50-81中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段。

83.根据权利要求82所述的抗体药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。

84.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-49中任一项所述的抗原结合蛋白构建体、根据权利要求50-81中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段、或根据权利要求82或83所述的抗体药物缀合物。

85.根据权利要求84所述的方法，其中所述受试者患有实体瘤。

86.根据权利要求84所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、头颈癌、肾细胞癌(RCC)、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。

87.根据权利要求84所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤或恶性血液肿瘤。

88.根据权利要求84-87中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用抗CTLA4抗体、抗Her2抗体或靶向肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。

89.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用化学疗法。

90.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括

向有此需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-49中任一项所述的抗原结合蛋白构建体、根据权利要求50-81中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段、或根据权利要求82或83所述的抗体药物缀合物。

91.一种杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含根据权利要求1-49中任一项所述的抗原结合蛋白构建体、根据权利要求50-81中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段、或根据权利要求82或83所述的抗体药物缀合物。

92.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-49中任一项所述的抗原结合蛋白构建体、根据权利要求50-81中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段、或根据权利要求82或83所述的抗体药物缀合物，和药学上可接受的载体。