CN116390953A - 靶向人密蛋白18.2的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种靶向密蛋白18.2的分离的抗体或其抗原结合部分。所述抗体可以是单域抗体，或者其单体可变结构域可以与重链恒定区(诸如人IgG1Fc)融合。本申请还提供了包含所述抗体的药物组合物，以及使用所述药物组合物治疗疾病的方法。

Description

靶向人密蛋白18.2的抗体及其用途
背景技术
抗体疗法在各种管辖范围内被批准用于治疗多种癌症，并且显著改善了患者结局(Komeev等人,(2017)Cytokine 89:127-135)。一旦与癌抗原结合，则抗体可能会诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、激活补体系统，或阻止受体与其配体相互作用，所有这些都可能导致癌细胞死亡。美国FDA批准的抗体药物包括阿仑单抗、纳武单抗、利妥昔单抗和德瓦鲁单抗。
密蛋白(CLDN)是形成细胞旁屏障的表面蛋白家族，并且控制细胞间的分子流动。迄今为止，在哺乳动物中已经报道了24个密蛋白成员。不同的密蛋白成员在不同的组织上表达，并且它们的表达水平和功能与癌症有关。
密蛋白18具有两种同种型。密蛋白18.1蛋白(或简称为密蛋白18.1(Claudin18.1)或密蛋白18.1(Claudin18.1))在正常肺和胃上皮细胞上选择性表达。密蛋白18.2蛋白(或简称为密蛋白18.2(Claudin 18.2)或密蛋白18.2(Claudin18.2))在正常组织中具有高度限制性的表达模式。已经在相当比例的胃腺癌和胰腺腺癌中观察到密蛋白18.2的高水平表达，使得密蛋白18.2成为治疗胃腺癌和胰腺腺癌的治疗策略的有希望的靶点。
已经在某些癌症的治疗中研究了抗密蛋白18.2抗体。例如，由GanymedPharmaceuticals AG开发的嵌合抗密蛋白18.2IgG1抗体Claudiximab(IMAB362)已经在治疗晚期胃食管和胰腺癌的临床试验中进行了研究。
需要具有所期望治疗功效的另外的抗密蛋白18.2抗体。
发明内容
在一方面，本披露提供了一种分离的抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR1区、CDR2区和CDR3区的单体可变结构域，该CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下的氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID NO:52、53和54；
(2)分别为SEQ ID NO:55、56和57；
(3)分别为SEQ ID NO:58、59和60；
(4)分别为SEQ ID NO:61、62和63；
(5)分别为SEQ ID NO:64、65和66；
(6)分别为SEQ ID NO:76、77和78；
(7)分别为SEQ ID NO:82、83和84；
(8)分别为SEQ ID NO:85、86和87；
(9)分别为SEQ ID NO:88、89和90；
(10)分别为SEQ ID NO:91、92和93；
(11)分别为SEQ ID NO:94、95和96；
(12)分别为SEQ ID NO:103、104和105；
(13)分别为SEQ ID NO:106、107和108；
(14)分别为SEQ ID NO:112、113和114；
(15)分别为SEQ ID NO:115、116和117；
(16)分别为SEQ ID NO:121、122和123；
(17)分别为SEQ ID NO:124、125和126；
(18)分别为SEQ ID NO:127、128和129；
(19)分别为SEQ ID NO:133、134和135；
(20)分别为SEQ ID NO:136、137和138；
(21)分别为SEQ ID NO:139、140和141；
(22)分别为SEQ ID NO:142、143和144；
(23)分别为SEQ ID NO:145、146和147；
(24)分别为SEQ ID NO:148、149和150；
(25)分别为SEQ ID NO:151、152和153；
(26)分别为SEQ ID NO:154、155和156；
(27)分别为SEQ ID NO:157、158和159；
(28)分别为SEQ ID NO:160、161和162；
(29)分别为SEQ ID NO:163、164和165；
(30)分别为SEQ ID NO:169、170和171；
(31)分别为SEQ ID NO:172、173和174；
(32)分别为SEQ ID NO:175、176和177；
(33)分别为SEQ ID NO:178、179和180；
(34)分别为SEQ ID NO:181、182和183；
(35)分别为SEQ ID NO:184、185和186；
(36)分别为SEQ ID NO:190、191和192；
(37)分别为SEQ ID NO:193、194和195；
(38)分别为SEQ ID NO:196、197和198；或者
(39)分别为SEQ ID NO:199、200和201；
或在CDR1、CDR2和CDR3的任一个或多个中包含多达约3个氨基酸取代(诸如1、2或3个氨基酸取代)的上述任一种的变体。
在该抗体或其抗原结合部分的一些实施例中，CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下的氨基酸序列：
分别为SEQ ID NO:64、65和66；
分别为SEQ ID NO:76、77和78；
分别为SEQ ID NO:124、125和126；
分别为SEQ ID NO:136、137和138；
分别为SEQ ID NO:145、146和147；
分别为SEQ ID NO:175、176和177；或者
分别为SEQ ID NO:199、200和201；
或在CDR1、CDR2和CDR3的任一个或多个中包含多达约3个氨基酸取代(诸如1、2或3个氨基酸取代)的上述任一种的变体。
在一些实施例中，CDR1区、CDR2区和CDR3区包含下列之一的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:64、65和66；分别为SEQ ID NO:76、77和78；分别为SEQ ID NO:124、125和126；分别为SEQ ID NO:136、137和138；分别为SEQ ID NO:145、146和147；分别为SEQ ID NO:175、176和177；或者分别为SEQ ID NO:199、200和201。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分包含单体可变结构域内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，该单体可变结构域具有在SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49和50中任一个中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分与密蛋白18.2，优选人密蛋白18.2特异性结合。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分是单域抗体(sdAb)或VHH结构域。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分是骆驼科的、嵌合的、人的或人源化的。
在一些实施例中，单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列。
在一些实施例中，单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组的氨基酸序列。
在另一方面，本披露提供了一种包含单体可变结构域的抗体或其抗原结合部分，该单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，氨基酸序列选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组。
在另一方面，本披露提供了一种双特异性分子、免疫缀合物或嵌合抗原受体，其包含本文所述的任何抗体或其抗原结合部分的抗体或其抗原结合部分。
在另一方面，本披露提供了一种编码本文所述的任何抗体(或其抗原结合部分)或双特异性分子、免疫缀合物或嵌合抗原受体的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。还提供了一种含有该核酸分子的表达载体和一种含有该表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本披露提供了一种药物组合物，其包含(1)本文所述的抗体或其抗原结合部分，或本文所述的双特异性分子、免疫缀合物或嵌合抗原受体，和(2)药学上可接受的载体。药物组合物可以进一步包含细胞毒性剂。
在另一方面，本披露提供了一种用于治疗受试者癌症疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的一种或多种药物组合物。癌症疾病可以选自由胃癌、胰腺癌、结肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌组成的组。
附图说明
图1(包括子部分A-F)显示了与对照抗体和阴性对照相比，本披露抗体的某些实施例与过表达人密蛋白18.2或密蛋白18.1的HEK293细胞的FACS结合曲线。A-D显示了来自本披露的示例抗体的结果。E和F：IMAB362抗体用作阳性对照，并且PBS用作阴性对照。
图2(包括子部分A-E)显示了针对过表达人密蛋白18.1的HEK293细胞的本披露抗体的某些实施例的FACS结合测定的剂量-反应曲线。
图3(包括子部分A-F)显示了针对过表达人密蛋白18.2的HEK293细胞的本披露抗体的某些实施例的FACS结合测定数据的剂量-反应曲线。
图4(包括子部分A-E)显示了针对过表达小鼠密蛋白18.2的HEK293细胞的本披露抗体的某些实施例的FACS结合测定数据的剂量-反应曲线。
图5(包括子部分A-H)显示了本披露抗体的某些实施例的CDC测定结果。
图6(包括子部分A-G)显示了本披露抗体的某些实施例的ADCC测定结果。
图7(包括子部分A-B)显示了针对过表达人密蛋白18.2的HEK293细胞的本披露抗体的某些实施例的FACS结合测定数据的剂量-反应曲线。
图8(包括子部分A-B)显示了针对过表达人密蛋白18.1的HEK293细胞的本披露抗体的某些实施例的FACS结合测定的剂量-反应曲线。
图9(包括子部分A-C)显示了本披露抗体的某些实施例的ADCC测定结果。
图10显示了本披露抗体的某些实施例的CDC测定结果。
图11(包括子部分A-B)显示了本披露抗体的某些实施例的ADCC测定结果。
图12(包括子部分A-B)显示了针对过表达人密蛋白18.2的CHO-K1细胞的本披露抗体的某些实施例的FACS结合测定数据的剂量-反应曲线。
具体实施方式
如本文所用抗体的术语“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个片段，其保留了结合抗原的能力(例如，密蛋白18.2蛋白)。这可以包括含有单个可变结构域的重链可变区，以及包含这种结构域和与其化学连接的另一个多肽片段的较大分子。这种单链抗体也旨在包含在术语“抗原结合部分”中。
如本文所用的“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。特异性结合密蛋白18.2蛋白的分离的抗体基本上不含不结合密蛋白18.2蛋白的抗体。特异性结合人密蛋白18.2的分离的抗体也可以特异性结合其他抗原，诸如人密蛋白18.1蛋白或来自其他物种的密蛋白18.2蛋白。分离的抗体还可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子的制剂。
术语“单域抗体”或“sdAb”是指包含具有三个互补决定区(CDR)的单个单体可变抗体结构域的单个抗原结合多肽，其能够与抗原结合，而不与相应的含CDR的多肽配对。在一些情况下，单域抗体是从骆驼科重链抗体(HCAb)工程化的，并且还称为HCAb的VHH结构域或片段。单域抗体是一种仅重链抗体的抗原结合部分。VHH还可以被称为纳米抗体。骆驼科sdAb是已知最小的抗原结合抗体片段之一(参见例如，Hamers-Casterman等人,Nature363:446-8(1993)；Greenberg等人,Nature374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。作为实例，在本披露的实例中具有SEQ IDNO:1-50的氨基酸序列的特定单结构域抗体被称为sdAb-1(或sdab-1)、sdAb-2(或sdab-2)、sdAb-3(或sdab-3)、……、sdAb-50(或sdab-50)。
如本文所用,“与人密蛋白18.2特异性结合”的抗体或分子是指与人密蛋白18.2蛋白结合但基本上不与非密蛋白18.2蛋白结合的抗体或多肽分子。
如本文所用，术语“融合蛋白(fused protein)”、“融合蛋白(fusion protein)”、“融合抗体(fusion antibody)”或“融合抗体(fused antibody)”是指同时包括单域抗体(例如，VHH)部分和IgG恒定区Fc(诸如IgG1 Fc区)的抗体分子，其中这两个部分例如通过重组方法化学连接。例如，sdAb可以与IgG的天然铰链区直接融合到IgG Fc区。sdAb位于融合抗体中IgG Fc的上游，即更靠近N末端，其中sdAb和IgG Fc区被铰链区插入。融合抗体蛋白在本文中可以被称为其组成部分，例如，sdab-1-hIgG1Fc是指由sdab-2与人IgG1 Fc区(具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列)融合而成的融合蛋白或抗体，sdab-2-hIgG1Fc是指由sdab-2与人IgG1 Fc区融合而成的融合蛋白或抗体等。
如本文所用，术语“骆驼科抗体”旨在包括具有可变区的抗体(或更具体地是单结构域抗体或VHH片段)，其中框架区和CDR区都来源于骆驼科种系仅重链抗体序列。此外，如果该抗体含有恒定区，则该恒定区也可以来源于骆驼科种系抗体序列。本发明的骆驼科抗体可以包括并非由骆驼科种系抗体序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变引入的突变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“骆驼科抗体”并不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种的种系的CDR序列已经被移植到骆驼科框架序列上的抗体。
术语“嵌合抗体”是指通过将来自非人(例如，骆驼科)来源的遗传物质与来自人类的遗传物质组合而制备的抗体。或者更一般地，嵌合抗体是具有由不同物种的遗传物质产生的不同部分的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指来自非人(例如，骆驼科)物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加与人类天然产生的抗体变体的相似性。
如本文在两种或更多种核酸或蛋白质/肽的上下文中所用的术语“同一性”百分比是指当为了最大对应性进行比较和比对(如果需要，引入缺口)时，两种或更多种序列或亚序列具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量同一性百分比。可以用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件在本领域中是熟知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其变体。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。在某些实施例中，受试者是人。
本领域技术人员使用多种方法/系统来定义抗体的CDR。这些系统和/或定义经过了多年的发展和完善，并且包括Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact。Kabat定义是基于序列可变性，并且是常用的。Chothia定义是基于结构环区域的位置。IMGT系统是基于可变结构域结构内的序列可变性和位置。AbM定义是Kabat和Chothia之间的妥协。Contact定义是基于对可用抗体晶体结构的分析。示例性系统是Kabat和Chothia的组合。另一个示例性系统是Kabat。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区已经描述于：Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。涵盖如上述每篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中作为比较。CDR预测算法和接口是本领域已知的，包括例如Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。在本段中引用的参考文献的内容通过引用以其整体并入本文，以用于本申请中并且可能包含在本文的一项或多项权利要求中。
表1：CDR定义
Figure BDA0004154543030000091
1残基编号遵循Kabat等人的命名法(同上)。
2残基编号遵循Chothia等人的命名法(同上)。
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法(同上)。
4残基编号遵循Lefranc等人的命名法(同上)。
5残基编号遵循Honegger和Plückthun的命名法(同上)。
靶向人密蛋白18.2的抗体(或抗人密蛋白18.2抗体)
在一方面，本披露提供了一种分离的抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR1区、CDR2区和CDR3区的单体可变结构域，该CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下的氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID NO:52、53和54；
(2)分别为SEQ ID NO:55、56和57；
(3)分别为SEQ ID NO:58、59和60；
(4)分别为SEQ ID NO:61、62和63；
(5)分别为SEQ ID NO:64、65和66；
(6)分别为SEQ ID NO:76、77和78；
(7)分别为SEQ ID NO:82、83和84；
(8)分别为SEQ ID NO:85、86和87；
(9)分别为SEQ ID NO:88、89和90；
(10)分别为SEQ ID NO:91、92和93；
(11)分别为SEQ ID NO:94、95和96；
(12)分别为SEQ ID NO:103、104和105；
(13)分别为SEQ ID NO:106、107和108；
(14)分别为SEQ ID NO:112、113和114；
(15)分别为SEQ ID NO:115、116和117；
(16)分别为SEQ ID NO:121、122和123；
(17)分别为SEQ ID NO:124、125和126；
(18)分别为SEQ ID NO:127、128和129；
(19)分别为SEQ ID NO:133、134和135；
(20)分别为SEQ ID NO:136、137和138；
(21)分别为SEQ ID NO:139、140和141；
(22)分别为SEQ ID NO:142、143和144；
(23)分别为SEQ ID NO:145、146和147；
(24)分别为SEQ ID NO:148、149和150；
(25)分别为SEQ ID NO:151、152和153；
(26)分别为SEQ ID NO:154、155和156；
(27)分别为SEQ ID NO:157、158和159；
(28)分别为SEQ ID NO:160、161和162；
(29)分别为SEQ ID NO:163、164和165；
(30)分别为SEQ ID NO:169、170和171；
(31)分别为SEQ ID NO:172、173和174；
(32)分别为SEQ ID NO:175、176和177；
(33)分别为SEQ ID NO:178、179和180；
(34)分别为SEQ ID NO:181、182和183；
(35)分别为SEQ ID NO:184、185和186；
(36)分别为SEQ ID NO:190、191和192；
(37)分别为SEQ ID NO:193、194和195；
(38)分别为SEQ ID NO:196、197和198；或者
(39)分别为SEQ ID NO:199、200和201；
或在CDR1、CDR2和CDR3的任一个或多个中包含多达约3个氨基酸取代(诸如1、2或3个氨基酸取代)的上述任一种的变体。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合部分包含含有CDR1区、CDR2区和CDR3区的单体可变结构域，该CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下的氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID NO:52、53和54；
(2)分别为SEQ ID NO:55、56和57；
(3)分别为SEQ ID NO:58、59和60；
(4)分别为SEQ ID NO:61、62和63；
(5)分别为SEQ ID NO:64、65和66；
(6)分别为SEQ ID NO:76、77和78；
(7)分别为SEQ ID NO:82、83和84；
(8)分别为SEQ ID NO:85、86和87；
(9)分别为SEQ ID NO:88、89和90；
(10)分别为SEQ ID NO:91、92和93；
(11)分别为SEQ ID NO:94、95和96；
(12)分别为SEQ ID NO:103、104和105；
(13)分别为SEQ ID NO:106、107和108；
(14)分别为SEQ ID NO:112、113和114；
(15)分别为SEQ ID NO:115、116和117；
(16)分别为SEQ ID NO:121、122和123；
(17)分别为SEQ ID NO:124、125和126；
(18)分别为SEQ ID NO:127、128和129；
(19)分别为SEQ ID NO:133、134和135；
(20)分别为SEQ ID NO:136、137和138；
(21)分别为SEQ ID NO:139、140和141；
(22)分别为SEQ ID NO:142、143和144；
(23)分别为SEQ ID NO:145、146和147；
(24)分别为SEQ ID NO:148、149和150；
(25)分别为SEQ ID NO:151、152和153；
(26)分别为SEQ ID NO:154、155和156；
(27)分别为SEQ ID NO:157、158和159；
(28)分别为SEQ ID NO:160、161和162；
(29)分别为SEQ ID NO:163、164和165；
(30)分别为SEQ ID NO:169、170和171；
(31)分别为SEQ ID NO:172、173和174；
(32)分别为SEQ ID NO:175、176和177；
(33)分别为SEQ ID NO:178、179和180；
(34)分别为SEQ ID NO:181、182和183；
(35)分别为SEQ ID NO:184、185和186；
(36)分别为SEQ ID NO:190、191和192；
(37)分别为SEQ ID NO:193、194和195；
(38)分别为SEQ ID NO:196、197和198；或者
(39)分别为SEQ ID NO:199、200和201。
在该抗体或其抗原结合部分的一些实施例中，CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下的氨基酸序列：
分别为SEQ ID NO:64、65和66；
分别为SEQ ID NO:76、77和78；
分别为SEQ ID NO:124、125和126；
分别为SEQ ID NO:136、137和138；
分别为SEQ ID NO:145、146和147；
分别为SEQ ID NO:175、176和177；或者
分别为SEQ ID NO:199、200和201；
或在CDR1、CDR2和CDR3的任一个或多个中包含多达约3个氨基酸取代(诸如1、2或3个氨基酸取代)的上述任一种的变体。
在该抗体或其抗原结合部分的一些实施例中，CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下的氨基酸序列：
分别为SEQ ID NO:64、65和66；
分别为SEQ ID NO:76、77和78；
分别为SEQ ID NO:124、125和126；
分别为SEQ ID NO:136、137和138；
分别为SEQ ID NO:145、146和147；
分别为SEQ ID NO:175、176和177；或者
分别为SEQ ID NO:199、200和201。
在一些实施例中，CDR1区、CDR2区和CDR3区包含下列之一的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:64、65和66；分别为SEQ ID NO:76、77和78；分别为SEQ ID NO:124、125和126；分别为SEQ ID NO:136、137和138；分别为SEQ ID NO:145、146和147；分别为SEQ ID NO:175、176和177；或者分别为SEQ ID NO:199、200和201。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分包含单体可变结构域内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，该单体可变结构域具有在SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49和50中任一个中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分与密蛋白18.2，优选人密蛋白18.2特异性结合。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分是单域抗体(sdAb)或VHH结构域，即没有常规重链恒定区。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分是单域抗体。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分是骆驼科的、嵌合的、人的或人源化的。
在一些实施例中，单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:1-50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:1-50和202-213组成的组的氨基酸序列。
在一些实施例中，单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列。
在一些实施例中，单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组的氨基酸序列。
在另一方面，本披露提供了一种包含单体可变结构域的抗体或其抗原结合部分，该单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，氨基酸序列选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组。
在另一方面，本披露提供了一种包含单体可变结构域的抗体或其抗原结合部分，该单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分包含单体可变结构域，该单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
抗体与细胞表面上Fc受体的结合触发了许多重要和多样的生物反应，包括吞噬和破坏抗体包被的颗粒、清除免疫复合物、由杀伤细胞溶解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞毒作用或ADCC)、释放炎症介质、胎盘转移和控制免疫球蛋白产生。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合部分包含Fc区。人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区的氨基酸序列是本领域普通技术人员已知的。在一些情况下，已经在天然抗体中鉴定出具有氨基酸变异的Fc区。在一些实施例中，经修饰的抗体(例如，经修饰的Fc区)提供经改变的效应子功能，这些效应子功能进而影响抗体的生物特征。在一些实施例中，恒定区修饰增加了抗体的血清半衰期。在一些实施例中，恒定区修饰增加或增强了抗体的ADCC和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)。
本文所述的抗体或其抗原结合部分可以进一步包含与单体可变结构域融合的IgGFc区。例如，IgG Fc区可以是包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的人IgG1 Fc区。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分(例如，sdAb)融合到人IgG1 Fc区的N末端。
在另一方面，本披露提供了一种双特异性分子、免疫缀合物(或抗体药物缀合物)或嵌合抗原受体，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合部分。
术语“双特异性分子”是指与至少一种其他功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体配体)连接的本披露抗体。双特异性分子可以具有至少两个不同的结合位点或靶分子，并且可以包括具有三种或更多种特异性的分子。
术语“免疫缀合物”是指本披露的抗体与治疗剂缀合，该治疗剂诸如细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂等。在ADC中，该抗体和治疗剂可以经由可裂解的接头(诸如肽基、二硫化物)缀合。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指将确定的特异性移植到免疫效应细胞(典型的是T细胞)上并增强T细胞功能的工程化受体。新一代CAR包含胞外结合结构域，其包含单域抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(主要是CD3-ζ的胞内结构域，其是T细胞活化信号的主要传递者，加上一个或多个共刺激结构域)。CAR可以进一步具有增强T细胞扩增、持久性和抗肿瘤活性的因子，诸如细胞因子和共刺激配体。
在另一方面，本披露提供了一种编码本文所述的任何抗体(或其抗原结合部分)或双特异性分子、免疫缀合物或嵌合抗原受体的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。含有包含核酸分子的表达载体的宿主细胞(例如，CHO细胞或淋巴细胞，或微生物，诸如大肠杆菌，和真菌，诸如酵母)可以用于产生本披露的抗体，优选单克隆抗体。
在一个实施例中，编码本披露的部分或全长抗体的DNA可以通过标准分子生物学技术获得，被插入一个或多个表达载体中，使得基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。术语“可操作地连接”旨在意指将抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。术语“调控序列”旨在包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于，例如，Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，诸如来源于自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒，例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调控序列，诸如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。再进一步地，调控元件由不同来源的序列构成，诸如SRα启动子系统，其含有来自人T细胞白血病1型病毒的SV40早期启动子和长末端重复序列的序列(Takebe等人,(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。选择与所用表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。
可以将编码DNA的抗体插入表达载体中。重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。编码DNA的抗体可以被克隆到载体中，使得信号肽被框内连接到编码DNA的抗体的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
为了表达sdAb(或sdAb-IgGFc)，通过标准技术将编码抗体链的一个或多个表达载体转染到宿主细胞中。不同形式的术语“转染”旨在涵盖常用于将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。用于表达本披露抗体的哺乳动物宿主细胞包括HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO细胞)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足够的时间以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选地允许抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
术语“EC50”，也称为半最大有效浓度，是指抗体或其抗原结合部分(诸如抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白或抗密蛋白18.2sdAb)在特定的暴露时间后给出半最大反应的浓度。
在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分(例如，sdAb或sdAb-Fc融合蛋白)以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小或约0.1nM或更小的半最大有效浓度(EC50)结合密蛋白18.2(例如，人密蛋白18.2)。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小或约0.1nM或更小的EC50结合人密蛋白18.2。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分以约40nM或更小的EC50结合人密蛋白18.2。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分以约20nM或更小的EC50结合人密蛋白18.2。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分以约10nM或更小的EC50结合人密蛋白18.2。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分以约1nM或更小的EC50结合人密蛋白18.2。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合部分以约0.1nM或更小的EC50结合人密蛋白18.2。
药物组合物和治疗方法
在另一方面，本披露提供了一种药物组合物，其包含一种或多种本发明的抗体，或本文所述的双特异性分子、免疫缀合物或嵌合抗原受体，以及根据常规技术的药学上可接受的载体。
该组合物可以包含一种或多种另外的药物活性成分，诸如另一种抗体、药物，例如细胞毒性剂或抗肿瘤剂。本发明的药物组合物还可以在与例如另一种抗癌剂、另一种抗炎剂等的组合疗法中施用。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。这些包括但不限于生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂等。合适载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
该药物组合物可以适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、表皮和其他施用途径。根据施用途径，活性成分可以用一种材料包衣或以其他方式装载在一种材料或结构中，以保护其免受酸和可能使其失活的其他自然条件的作用。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除了肠施用和局部施用之外的、通常通过注射的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。可替代地，本发明的抗体可以经由非肠胃外途径施用，诸如局部、经表皮或经粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部。
在另一方面，本披露提供了一种用于治疗受试者(例如，人类或非人类哺乳动物)的疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。该疾病可以是选自由胃癌、胰腺癌、结肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌组成的组的癌症。在某些实施例中，该癌症是胃癌。在某些实施例中，该癌症是胰腺癌。在某些实施例中，受试者是人。
在向受试者施用组合物时，可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。可以基于受试者、待治疗的疾病等施用单次推注或分剂量。如本文所用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，适于作为待治疗受试者的单一剂量。每个单位含有预定量的活性成分，计算该活性成分以与所需的药物载体结合产生所期望的治疗效果。可以使用缓释配制品，在这种情况下需要减少施用频率。
对于本披露抗体的施用，剂量可以范围为受试者体重的约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。合适的治疗方案可以是每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次等。本发明的抗密蛋白18.2抗体的示例剂量方案可以包括经由静脉内施用的1mg/kg体重或3mg/kg体重。
本发明的靶向密蛋白18.2的抗体的“治疗有效量”或“治疗有效量”优选导致疾病症状严重性的降低、疾病无症状期的频率和/或持续时间的增加、预防或降低由于疾病折磨引起的损伤或残疾的可能性，或抑制或延缓疾病的进展。例如，对于治疗携带肿瘤的受试者，相对于未治疗的受试者，“治疗有效量”的抗体组合物可以将肿瘤生长抑制至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，仍更优选至少约80％。
实例
以下实例旨在仅是本发明的示例，并且因此不应视为以任何方式限制本发明。
实例1：抗密蛋白18.2sdAb的产生
动物免疫
在当前的动物福利法规下，用重组人密蛋白18.2-His蛋白(GenScript)免疫美洲驼。对于免疫，将抗原以在PBS溶液中的形式施用或者将抗原配制为与CFA(完全弗氏佐剂；初次免疫)或IFA(不完全弗氏佐剂；加强免疫)的乳液。将抗原在颈部皮下施用。每只动物接受6次乳液注射，包括用200μg在CFA乳液中的抗原进行初次免疫，随后以1周的间隔用100μg在IFA乳液中的抗原进行3次加强免疫，以及随后以1周的间隔用50μg在IFA乳液中的抗原进行2次注射。在多轮免疫后，采集了200ml的血液样品。通过梯度离心从血液样品中分离外周血淋巴细胞(PBL)，作为美洲驼重链抗体(HCAb)的遗传来源。
噬菌体展示文库构建
根据制造商的方案，使用TRIZOL试剂(Thermo Fisher Scientific，目录号15596026)从如上所述分离的淋巴细胞中提取总RNA，将其用作RT-PCR的起始材料，以扩增编码sdAb的基因片段。对于基因扩增，根据制造商的方案，使用PRIMESCRIPT第1链cDNA合成试剂盒(Takara，目录号6110A)，用寡(dT)20引物将分离的RNA逆转录成cDNA。设计了6个正向和2个反向特异性简并引物来扩增VHH片段。
通过两步PCR方法扩增VHH片段的可变区。将第一次PCR的DNA产物在第二次PCR中用作模板。将含有VHH PCR片段的扩增的第二PCR产物进行凝胶纯化和酶消化，随后插入噬菌粒质粒中。通过电穿孔将重组质粒转入大肠杆菌细胞中，产生了其大小大于1×109的噬菌体展示文库。根据标准方案制备文库噬菌体，并在-80℃下过滤灭菌后作为储备储存。
噬菌体展示淘选
首先用过表达人密蛋白18.1的CHO-K1细胞对构建的噬菌体文库进行反筛选，随后使用由GenScript开发的标准程序用过表达人密蛋白18.2的CHO-K1细胞进行淘选。进行两轮选择，并且分析每个选择输出的富集因子(洗脱液中存在的噬菌体相对于对照的数量)、多样性和密蛋白18.2阳性克隆的百分比(FACS)。基于这些参数，选择最佳选择用于进一步筛选，将其作为库亚克隆到可溶性表达载体中用于高通量筛选。在具有sdAb编码序列的读框中，编码C末端His标签的载体。挑取菌落并在96深孔板(1ml体积)中生长，并且通过添加IPTG和0.1％ Triton诱导上清液中的sdAb表达。
通过FACS鉴定抗密蛋白18.2特异性sdAb先导物
为了验证sdAb的细胞表面抗原结合，通过FACS分析上清液中表达的sdAb与表达密蛋白18.2的HEK293细胞结合的能力。它们与表达密蛋白18.1的HEK293细胞的结合还通过FACS进行了评价。收获表达人密蛋白18.2的HEK293细胞，并且与本文所述的抗密蛋白18.2sdAb一起孵育，随后与FITC标记的抗His标签抗体(Genscript，目录号A01620)一起孵育。然后用流式细胞术分析样品。典型的结合图显示于图1中。抗密蛋白18.2mAb特异性结合人密蛋白18.2表达细胞(实线)，而不是密蛋白18.1蛋白表达细胞(虚线)。当实线与为未经工程化的亲代HEK293细胞的背景灰色曲线融合时，表示为阴性结合。通过阳性对照抗体IMAB362(Claudiximab)和PBS对照照亮靶结合模式，并且通过荧光团(iFluor 647)标记的山羊抗人IgG Fc二抗(Jackson，目录号109-605-098)检测IMAB362结合亲和力。对这些sdAb进行测序，并且选择独特的克隆用于进一步表征。经鉴定/测试的sdAb(或克隆)的序列显示于本文所附的序列表中。
sdAb-Fc融合蛋白的产生
通过将抗密蛋白18.2sdAb与人IgG1 Fc区(具有天然IgG1铰链区)融合，产生抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白构建体。为CHO-3E7细胞瞬时表达制备了构建体的maxiprep。通过含有蛋白A琼脂糖树脂的柱，通过色谱法纯化了表达的抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白。
实例2：抗密蛋白18.2sdAb的体外表征
通过FACS测定的人密蛋白18.1细胞结合
为了进一步研究在构建sdAb-hIgG-Fc融合蛋白后仅结合密蛋白18.2而不结合密蛋白18.1的抗体结合特异性，将表达人密蛋白18.1的HEK293细胞与100μl抗密蛋白18.2sdAb在3倍系列稀释中孵育，从300nM的浓度开始，随后进行荧光团(iFluor647)标记的山羊抗人IgG Fc二抗(Jackson，目录号109-605-098)孵育。然后用流式细胞术分析样品。用几何平均值生成抗体-抗原结合曲线。用GraphPad Prism v6.02软件绘制原始数据，用四参数最佳拟合值程序分析EC50。
在这些抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白中，如图2所示，仅包括sdab-6-hIgG1Fc、sdab-10-hIgG1Fc、sdab-16-hIgG1Fc、sdab-20-hIgG1Fc、sdab-23-hIgG1Fc和sdab-46-hIgG1Fc的6种蛋白质显示出与人密蛋白18.1的高结合亲和力。其他sdAb-Fc融合蛋白对人密蛋白18.1显示无结合亲和力或结合亲和力弱。为了进一步鉴定它们与人密蛋白18.1的结合特异性，通过流式细胞术选择对人密蛋白18.1无结合亲和力或结合亲和力弱的所有sdAb-Fc融合蛋白进行第2轮结合测定。如图8所示，它们都不与人密蛋白18.1结合。
通过FACS测定的人密蛋白18.2细胞结合
在分析了与人密蛋白18.1的非特异性结合后，选择这些不具有/具有弱密蛋白18.1结合亲和力的候选物，以检测它们与人密蛋白18.2的结合亲和力。为了验证抗体产物的细胞表面密蛋白18.2抗原结合，将表达人密蛋白18.2的HEK293细胞与100μl抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白在3倍系列稀释中孵育，从300nM的浓度开始，随后进行荧光团(iFluor 647)标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗孵育。然后用流式细胞术分析样品。用几何平均值生成抗体-抗原结合曲线。用GraphPad Prism v6.02软件绘制原始数据，用四参数最佳拟合值程序分析EC50。
在这些抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白中，如图3所示，除了sdab-7-hIgG1Fc、sdab-17-hIgG1Fc和sdab-39-hIgG1Fc之外，大部分抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白以高亲和力结合人密蛋白18.2表达细胞。为了进一步鉴定它们与人密蛋白18.2的结合亲和力，通过流式细胞术选择结合亲和力高的所有sdAb-Fc融合蛋白进行第2轮结合测定。如图7所示，当与IMAB362的参考mAb比较时，除了sdAb-45-hIgG1Fc之外，它们都被证实具有相似或更高的结合亲和力。
通过FACS测定的小鼠密蛋白18.2细胞结合
为了检查这些融合蛋白与小鼠密蛋白18.2的结合亲和力，收获表达小鼠密蛋白18.2的CHO-K1细胞，并与100μl抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白在3倍系列稀释中孵育，从300nM的浓度开始，随后进行荧光团(iFluor 647)标记的山羊抗人IgG Fc二抗(Jackson，目录号109-605-098)孵育。然后用流式细胞术分析样品。用几何平均值生成抗体-抗原结合曲线。用GraphPad Prism v6.02软件绘制原始数据，用四参数最佳拟合值程序分析EC50。
在本披露的抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白中，如图4所示，除了sdab-17-hIgG1Fc之外，大部分抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白以高亲和力结合小鼠密蛋白18.2表达细胞。
抗密蛋白18.2抗体诱导的补体依赖性细胞毒作用(CDC)测定
抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)效应是抗人密蛋白18.2治疗性抗体针对人胃癌或胃食管癌的主要作用机制。使用CDC测定功能性评估候选抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白。简言之，培养并收获过表达人密蛋白18.2的靶细胞系CHO-K1，并且将其接种在96孔板中。相应地将抗体样品添加到板中，并将板在37℃/5％ CO2下孵育30分钟。然后将纯化的正常人血清添加到板中，并将板进一步孵育4小时。将板从培养箱中取出，并且收集上清液并用Cell
Figure BDA0004154543030000221
测定试剂盒(Promega，目录号G7573)进行分析。通过PheraStar(AMG)捕获发光数据用于细胞活力分析。将两种阳性对照，包括IMAB362(Zolbetuximab)和370E2B12C3(在WO 202013567 A1中披露)用于比较。以靶细胞裂解％相比于候选抗体浓度表示的CDC测定结果显示于图5中。除了sdab-17-hIgG1Fc和sdab-27-hIgG1Fc之外，所有sdAb-Fc融合蛋白都显示出比IMAB362的参考mAb更好的CDC活性。当与370E2B12C3比较时，许多sdAb-Fc融合蛋白显示出相当的活性，包括sdab-2-hIgG1Fc、sdab-4-hIgG1Fc、sdab-9-hIgG1Fc、sdab-25-hIgG1Fc、sdab-29-hIgG1Fc、sdab-32-hIgG1Fc、sdab-33-hIgG1Fc、sdab-35-hIgG1Fc、sdab-36-hIgG1Fc、sdab-38-hIgG1Fc、sdab-40-hIgG1Fc、sdab-42-hIgG1Fc、sdab-43-hIgG1Fc、sdab-44-hIgG1Fc、sdab-45-hIgG1Fc、sdab-48-hIgG1Fc和sdab-50-hIgG1Fc。
抗密蛋白18.2抗体诱导的ADCC测定
比较了抗密蛋白18.2sdab-Fc融合蛋白的ADCC效应。以靶细胞裂解％相比于候选抗体浓度表示的ADCC测定结果显示于图6中。对于测定程序，培养、收获靶细胞系，过表达人密蛋白18.2的CHO-K1，并接种到96孔板中。将使用相同氨基酸序列的IMAB362(Zolbetuximab)在室内合成的样品或阳性对照添加到板中，并将板在37℃/5％ CO2下孵育30分钟。将NK92细胞用作效应细胞，并添加到板中，并且在相同条件下孵育6小时。取出测定板并短暂离心。按照制造商的说明(Roche)，收集上清液并转移到新的板上进行LDH活性测定。通过FlexStation 3捕获吸光度数据，并且通过GraphPad Prism 6.0进行分析。将两种阳性对照，包括IMAB362(Zolbetuximab)和370E2B12C3(WO 202013567 A1)用于比较。以靶细胞裂解％相比于候选抗体浓度表示的ADCC测定结果显示于图6中。所有sdAb-Fc融合蛋白都显示出比IMAB362的参考mAb更好的ADCC活性。
实例3：抗体人源化和分析
抗体人源化和表征
基于抗体可变结构域序列，分析CDR和FR并进行同源性建模，以获得sdab-09、sdab-25、sdab-29、sdab-32、sdab-42和sdab-50的亲代美洲驼抗体的建模结构。通过以下方法进行抗体人源化：1)计算框架残基的溶剂可及表面积。2)基于结果，鉴定被掩埋的框架残基(即溶剂可及表面积<15％)。3)选择与sdAb对应物共享高序列同一性的sdAb的人受体。4)将美洲驼sdAb的CDR直接移植到人受体框架上，以获得无任何回复突变的移植抗体序列。5)通过可发展性评估分析移植序列中的翻译后修饰和化学降解，包括脱酰胺、异构化氧化和糖基化等。6)鉴定PTM热点，如N-糖基化位点、异常脯氨酸残基、脱酰胺位点、异构化位点、氧化位点和不成对的半胱氨酸残基等，其可能影响移植抗体的结合活性和可制造性。
对于sdAb-Fc融合蛋白构建，将抗密蛋白18.2人源化sdAb融合到人IgG1 Fc区的N末端。这些人源化抗体融合蛋白在CHO-3E7细胞中表达。在24小时后，用胰蛋白胨N-1补充物增强表达/分泌。在37℃和5％ CO2中振荡培养6天后，收集上清液，并且如上所述用蛋白-A珠纯化人源化抗体。将人源化抗体保存在PBS中用于分析。
抗密蛋白18.2抗体诱导的ADCC测定
比较了所有人源化抗体的ADCC效应。对于测定程序，培养、收获靶细胞系，过表达人密蛋白18.2的CHO-K1或KATO III，并以1×104个细胞接种到96孔板中。将使用相同氨基酸序列的IMAB362(Zolbetuximab)在室内合成的人源化抗体样品或阳性对照添加到板中，并将板在37℃/5％ CO2下孵育30分钟。将NK92细胞用作效应细胞，并添加到板中，并且在相同条件下孵育6小时。取出测定板并短暂离心。按照制造商的说明(Roche)，收集上清液并转移到新的板上进行LDH活性测定。通过FlexStation 3捕获吸光度数据，并且通过GraphPadPrism 6.0进行分析。当将过表达人密蛋白18.2的CHO-K1靶细胞系用于ADCC生物测定时，如图9所示，CLDN18.2-vhh50-1.1、CLDN18.2-vhh50-2.1、CLDN18.2-vhh29-3.1、CLDN18.2-vhh32-1.2和CLDN18.2-vhh25-1.1的人源化sdAb先导物表现出比IMAB362的参考抗体好得多的ADCC活性。另外，CLDN18.2-vhh09-1.3、CLDN18.2-vhh42-1.1、CLDN18.2-vhh42-2.2、CLDN18.2-vhh29-1.1、CLDN18.2-vhh29-2.1、CLDN18.2-vhh29-2.3、CLDN18.2-vhh50-2.3和CLDN18.2-vhh25-2.1的人源化sdAb先导物显示出比IMAB362的参考抗体稍高的ADCC活性。当将过表达人密蛋白18.2的KATO III靶细胞系用于ADCC生物测定时，如图11所示，CLDN18.2-vhh50-1.1、CLDN18.2-vhh50-2.1、CLDN18.2-vhh29-3.1、CLDN18.2-vhh32-1.2、CLDN18.2-vhh09-1.3和DN18.2-vhh25-1.1的人源化sdAb先导物表现出比IMAB362的参考抗体好得多的ADCC活性。
抗密蛋白18.2抗体诱导的补体依赖性细胞毒作用(CDC)测定
使用CDC测定功能性评估抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白的人源化候选物。简言之，培养并收获5000个过表达人密蛋白18.2的靶细胞系CHO-K1细胞，并且将其接种在96孔板中。将5倍系列稀释中的抗体样品(从50μg/ml的浓度开始)添加到板中，并将板在37℃/5％ CO2下孵育30分钟。然后将纯化的正常人血清添加到板中，并将板进一步孵育4小时。将板从培养箱中取出，并且收集上清液并用Cell
Figure BDA0004154543030000241
测定试剂盒(Promega，目录号G7573)进行分析。通过PheraStar(AMG)捕获发光数据用于细胞活力分析。将IMAB362(Zolbetuximab)用作比较的参考抗体。CDC测定结果显示于图10中。所有人源化sdAb-Fc融合蛋白都显示出比IMAB362的参考mAb高得多的CDC活性。
通过FACS进行的人密蛋白18.2表达细胞结合测定
为了验证抗体产物的细胞表面密蛋白18.2抗原结合，将表达人密蛋白18.2的CHO-K1细胞与100μl人源化抗密蛋白18.2sdAb-Fc融合蛋白在3倍系列稀释中孵育，从300nM的浓度开始，随后进行荧光团(iFluor 647)标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗孵育。然后用流式细胞术分析样品。用几何平均值生成抗体-抗原结合曲线。用GraphPad Prism v6.02软件绘制原始数据，用四参数最佳拟合值程序分析EC50。
如图12所示，所有人源化sdAb先导物都表现出比IMAB362的参考抗体更高的结合亲和力。
序列表
下面列出实例中克隆的完整氨基酸序列。带下划线的氨基酸序列分别表示给定克隆的CDR1、CDR2、CDR3。
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GTQVTVSS
>sdab-41(SEQ ID NO:41)
QVQLVESGGDLVQAGGSLRLSCAASGSPFGFVVMGWYRQAPGKQRDMVATLTSSGAT
TYADSVKGRFTLSRENAKNTIHLQMNSLKPEDTAVYYCRAVLRSGDNWMAAANEYW
GQGTHVTVSS
>sdab-42(SEQ ID NO:42)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLACAASGRAIGTYDTNWYRQAPGQQREFVAFINYRGGGA
TYADSVKDRFTISRDNAANTVYLQMNSLKPEDTAIYLCNAHERFPMGRPPYDYWGQGT
QVTVTS
>sdab-43(SEQ ID NO:43)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGPARNNYYMGWFRQAPGKERELVARINLSGSSI
YYADSVKGRFTISRDNAKNTMSLQMNSLKPGDAARYYCHARDIVPGAQDYWGQGTQV
TVSA
>sdab-44(SEQ ID NO:44)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIYRINTVAWYRQAPGKQRELVAEITSSGNRDY
ADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYSCNAFIIPSVGLFTSRTYWGRGTQV
TVSS
>sdab-45(SEQ ID NO:45)
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSISGINYMAWYRQAPGKQRDLVARAWTTGPPTYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTGVYYCTANTLTSGYWGQGIQVTVSS
>sdab-46(SEQ ID NO:46)
AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASPTIFVTDVMAWYRQAPGNQRELVATLLGRSTTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNTLKPEDTAVYYCNLHRNLFNKIDNYWGQGTQVTVSS
>sdab-47(SEQ ID NO:47)
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGNFLNIVTMGWYRQAPGKQRELVATTTRGGTTNYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNADIIPGFLQQLTVHWGQGAQVTVSS
>sdab-48(SEQ ID NO:48)
QVKLEESGGGLVQAGGSLGLSCAASGTILHVMVMGWYRQAPGKQRELVATQTIGGTTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNTLTPGDTAVYYCNADVVYGLARSGNYWGPGTQVTVSS
>sdab-49(SEQ ID NO:49)
QVQLVESGGDLVQAGGSLRLSCAASGSPFGFVVMGWHRQAPGKQRELVAMLTSSGTTNYADSVKGRFTLSRENTKNTVHLQMNKLKPEDTAVYYCRAVLRSGSDWRAAANEYWGQGTHVTVSS
>sdab-50(SEQ ID NO:50)
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIYRINAMAWYRQAPGKQREYVAEITSTGNTDYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYSCNAFIIPSVGMFTSRTYWGRGTQVTVSS
人IgG1 Fc区：(SEQ ID NO:51)
EPKSGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK下列蛋白质序列是人源化sdAb序列：
>CLDN18.2-vhh09-1.3(SEQ ID NO:202)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSDLFISIMGWYRQAPGKGREWVSDISRGGKTNY
ADAVKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQISNPFWGDYWGQGTLVTV
SS
>CLDN18.2-vhh42-1.1(SEQ ID NO:203)
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRAIGTYDTNWYRQAPGKGREFVAFINYRGGGA
TYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHERFPMGRPPYDYWGQG
TLVTVSS
>CLDN18.2-vhh42-2.2(SEQ ID NO:204)
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYDTNWYRQAPGKGREFVAFINYRGGGA
TYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHERFPMGRPPYDYWGQG
TLVTVSS
>CLDN18.2-vhh50-1.1和CLDN18.2-vhh50-2.1(SEQ ID NO:205)它们共享相同的蛋白质序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIYRINAMAWYRQAPGKGREYVSEITSTGNTDY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFIIPSVGMFTSRTYWGQGTLV
TVSS
>CLDN18.2-vhh50-2.3(SEQ ID NO:206)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIYRINAMAWYRQAPGKGREWVSEITSTGNTD
YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFIIPSVGMFTSRTYWGQGTL
VTVSS
>CLDN18.2-vhh29-1.1(SEQ ID NO:207)EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGSIYRINNM AWYRQAPGKGRELVSEITSSGNTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFIIPSVGVFISRTFWGQGTTVTVSS
>CLDN18.2-vhh29-2.1(SEQ ID NO:208)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGSIYRINNMAWYRQAPGKGRELVSEITSSGNTLYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFIIPSVGVFISRTFWGQGTLVTVSS
>CLDN18.2-vhh29-2.3(SEQ ID NO:209)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGSIYRINNMAWYRQAPGKGREWVSEITSSGNTLYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFIIPSVGVFISRTFWGQGTLVTVSS
>CLDN18.2-vhh29-3.1(SEQ ID NO:210)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIYRINNMAWYRQAPGKGRELVSEITSSGNTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFIIPSVGVFISRTFWGQGTLVTVSS
>CLDN18.2-vhh32-1.2(SEQ ID NO:211)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSTYMGWFRQAPGKGRELVSRIAGGGQINYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHYWMDYWGQGTLVTVSS
>CLDN18.2-vhh25-1.1(SEQ ID NO:212)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIYRINNMAWYRQAPGKGRELVSESTSGGNFIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFIIPSVGVFASRTYWGQGTLVTVSS
>CLDN18.2-vhh25-2.1(SEQ ID NO:213)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIYRINNMAWYRQAPGKGRELVSESTSGGNFIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFIIPSVGVFASRTYWGQGTLVTVSS
下表显示了各个克隆的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
Figure BDA0004154543030000351
/>
Figure BDA0004154543030000361
虽然上面已经结合一个或多个实施例描述了本发明，但应理解的是，本发明不限于这些实施例，并且该描述旨在覆盖所有替换、修改和等同物，如可能包括在所附权利要求的精神和范围内。
本文所引用的所有参考文献均通过引用以其全部内容结合。

Claims (22)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其包含：
包含CDR1区、CDR2区和CDR3区的单体可变结构域，所述CDR1区、CDR2区和CDR3区包含以下的氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID NO:52、53和54；
(2)分别为SEQ ID NO:55、56和57；
(3)分别为SEQ ID NO:58、59和60；
(4)分别为SEQ ID NO:61、62和63；
(5)分别为SEQ ID NO:64、65和66；
(6)分别为SEQ ID NO:76、77和78；
(7)分别为SEQ ID NO:82、83和84；
(8)分别为SEQ ID NO:85、86和87；
(9)分别为SEQ ID NO:88、89和90；
(10)分别为SEQ ID NO:91、92和93；
(11)分别为SEQ ID NO:94、95和96；
(12)分别为SEQ ID NO:103、104和105；
(13)分别为SEQ ID NO:106、107和108；
(14)分别为SEQ ID NO:112、113和114；
(15)分别为SEQ ID NO:115、116和117；
(16)分别为SEQ ID NO:121、122和123；
(17)分别为SEQ ID NO:124、125和126；
(18)分别为SEQ ID NO:127、128和129；
(19)分别为SEQ ID NO:133、134和135；
(20)分别为SEQ ID NO:136、137和138；
(21)分别为SEQ ID NO:139、140和141；
(22)分别为SEQ ID NO:142、143和144；
(23)分别为SEQ ID NO:145、146和147；
(24)分别为SEQ ID NO:148、149和150；
(25)分别为SEQ ID NO:151、152和153；
(26)分别为SEQ ID NO:154、155和156；
(27)分别为SEQ ID NO:157、158和159；
(28)分别为SEQ ID NO:160、161和162；
(29)分别为SEQ ID NO:163、164和165；
(30)分别为SEQ ID NO:169、170和171；
(31)分别为SEQ ID NO:172、173和174；
(32)分别为SEQ ID NO:175、176和177；
(33)分别为SEQ ID NO:178、179和180；
(34)分别为SEQ ID NO:181、182和183；
(35)分别为SEQ ID NO:184、185和186；
(36)分别为SEQ ID NO:190、191和192；
(37)分别为SEQ ID NO:193、194和195；
(38)分别为SEQ ID NO:196、197和198；
(39)分别为SEQ ID NO:199、200和201；或者
在所述CDR1、CDR2和CDR3的任一个或多个中包含多达约3个氨基酸取代的其变体。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR1区、所述CDR2区和所述CDR3区包含以下的氨基酸序列：
分别为SEQ ID NO:64、65和66；
分别为SEQ ID NO:76、77和78；
分别为SEQ ID NO:124、125和126；
分别为SEQ ID NO:136、137和138；
分别为SEQ ID NO:145、146和147；
分别为SEQ ID NO:175、176和177；
分别为SEQ ID NO:199、200和201；或者
在所述CDR1、CDR2和CDR3的任一个或多个中包含多达约3个氨基酸取代的上述任一种的变体。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR1区、所述CDR2区和所述CDR3区包含以下的氨基酸序列：
分别为SEQ ID NO:64、65和66；
分别为SEQ ID NO:76、77和78；
分别为SEQ ID NO:124、125和126；
分别为SEQ ID NO:136、137和138；
分别为SEQ ID NO:145、146和147；
分别为SEQ ID NO:175、176和177；或者
分别为SEQ ID NO:199、200和201。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其与密蛋白18.2，优选人密蛋白18.2特异性结合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其是单域抗体(sdAb)或VHH结构域。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其是骆驼科的、嵌合的、人的或人源化的。
7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述单体可变结构域包含与选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组的氨基酸序列。
11.一种包含单体可变结构域的抗体或其抗原结合部分，所述单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50和202-213组成的组的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述单体可变结构域包含选自由SEQ ID NO:5、9、25、29、32、42、50和202-213组成的组的氨基酸序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其进一步包含与所述单体可变结构域融合的IgG Fc区。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述IgG Fc区是包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列的人IgG1 Fc区。
15.一种双特异性分子、免疫缀合物或嵌合抗原受体，其包含如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
16.一种核酸分子，其编码如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或如权利要求15所述的双特异性分子、免疫缀合物或嵌合抗原受体。
17.一种表达载体，其含有如权利要求16所述的核酸分子。
18.一种宿主细胞，其含有如权利要求17所述的表达载体。
19.一种药物组合物，其包含如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或如权利要求15所述的双特异性分子、免疫缀合物或嵌合抗原受体，以及药学上可接受的载体。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其进一步包含细胞毒性剂。
21.一种用于治疗受试者的癌症疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求19或20所述的药物组合物。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述癌症疾病选自由胃癌、胰腺癌、结肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌组成的组。
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