WO2019072274A1

WO2019072274A1 - 一种激动型4-1bb单克隆抗体

Info

Publication number: WO2019072274A1
Application number: PCT/CN2018/116705
Authority: WO
Inventors: 崔文俊; 郭树华
Original assignee: 瑞阳(苏州)生物科技有限公司
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-04-18

Abstract

一种激动型4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的CDR3区；所述的轻链可变区包括：氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的CDR1区，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的CDR2区及氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的CDR3区。上述针对h4-1BB的单克隆抗体能够特异性结合h4-1BB，进而激活T细胞，通过免疫调节作用对治疗多种癌症具有应用潜力。

Description

一种激动型 4-1BB单克隆抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及抗体，尤其是特异性结合人 4-1BB的单克隆抗体。

背景技术

[0002] T淋巴细胞的激活需要双重信号刺激，第一信号为 T细胞表面的抗原识别受体 ( TCR) 与 MHC分子 _抗原肽的特异性结合提供的抗原识别信号，第二信号是抗原提呈细胞（APC) 表面的共刺激分子与 T细胞表面相应受体结合所提供的共刺激信号（Chambers C A, et al. 1999. CurrOpin Cell Biol, 11(2): 203-210) 。只有在这双重信号的共同作用下， T细胞才能有效活化，增殖进而发挥相应的生物学功育^，若缺乏共刺激信号， T细胞则处于无能或无应答状态（Se_O S K, _et al. 2003. J Immunol, 171(2): 576-583) 。

[0003] CD28是最早发现的共刺激分子， CD28/B7协同刺激信号主要在 T细胞活化前期起作用，促进其增殖并维持短期的存活（Boulougouris G,et al. 1998. J Immunol, 161(8): 3919-3924) ， 4-1BB/4-1BBL是独立于 CD28/B7之外的关键共刺激信号，与 CD28/B7在 T细胞活化中作用的时期不同， 4-1BB/4-1BBL产生的协同刺激信号主要作用于应答晚期，能协同 CD28进一步活化 T细胞，尤其对于维持 CD8+T细胞的生存和效应功能是必不可少的。

[0004] 4-1BB (CD137; TNFRSF9) 属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是 I型跨膜糖蛋白，以单体或二聚体的形式表达于活化的 T细胞表面，主要是 CD8+T细胞，也表达于 CD4+T细胞、 NK细胞、 CD4+CD25+调节性 T细胞等。

[0005] 早期研究表明， 4-1BB分子是一个激活型共刺激分子，它既能提供共刺激信号激活 T细胞，使 T细胞活化、增殖、分泌细胞因子并增强其细胞毒活性，同时它也介导反向共刺激信号，诱导 APC活化增殖和分泌细胞因子（Vin_ay D S, _et al. 2006. J Mol Med (Berl), 84(9):

726-736) 。体外实验表明， 4-188信号能通过促进。08+1¹细胞和。04+1¹细胞增殖以及细胞因子分泌，发挥增强细胞抗感染、抑制肿瘤生长的免疫调节作用。动物肿瘤模型中，应用 4-1BB单克隆抗体或 4-1BBL基因转入肿瘤细胞可有效诱导细胞介导的抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤消退。在针对 4-1BB/4-1BBL缺陷型小鼠病毒感染后 CD8+T的数量和功能的研究中发现， 4-1BB/4-1BBL相互作用不但可以增强病毒特异性 CD8 T细胞的杀伤功能，而且可以促进记忆 T细胞的存活和增殖，控制病毒感染（Fuse S, et al. 2007. J Immunol, 178(8): 5227-5236) 。后续研究发现， 4-1BB分子在免疫调节中不仅有共刺激活性，还有抑制作用。激动型 4-1BB抗体作用于自身免疫性疾病模型时， IFN-Y、 IDO和 TGF-β的表达上调, CD11+CD8+调节 T细胞大量增殖，进而抑制 CD 4+T细胞增殖及其功能，抑制自身免疫性疾病的发展进程（Kim Y H, et al. 2009. J LeukocBiol, 85(5):

817-825) 。 4-lBB途径的活化不但会通过促进 T细胞向移植器官的浸润，缩短移植器官的存活时间加重宿主抗移植物排斥反应，还会促进 CD4+及 CD8+T细胞介导的移植物抗宿主反应，因此阻断供体 T细胞与受体之间的 4-1BB途径可降低宿主抗移植物排斥反应的发生。

[0006] 因此可以通过干预 4-1BB信号途径的作用来调节淋巴细胞的免疫功能，即可以通过针对人 4-1BB的抗体激活或阻断 4-1BB/4-1BBL信号通路，进而达到治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、病毒感染或移植物抗宿主反应等疾病的目的。

技术问题

问题的解决方案

技术解决方案

[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性结合人 4-1BB的抗体，并且不阻断 h4-lBBL与 M-1BB的结合。本发明还通过激动型 4-1BB单克隆抗体激活 4-1BB/ 4-1BBL信号途径，增强 T细胞介导的免疫反应，发挥抗肿瘤、抗感染及对自身免疫性疾病的调节作用。

[0008] 为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

[0009] 本发明的目的是提供一种激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括：氨基酸序列如 SEQ ID NO:l所示的 CDR1区，氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示的 CDR2区及氨基酸序列如 SEQ ID NO:3所示的 CDR3区；所述的轻链可变区包括：氨基酸序列如 SEQ ID

NO:4所示的 CDR1区，氨基酸序列如 SEQ ID NO:5所示的 CDR2区及氨基酸序列如 SEQ ID NO:6所示的 CDR3区。

[0010] 根据一个实施方案，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如 S

EQ ID NO:7所示的重链可变区。

[0011] 根据另一个实施方案，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如 SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。

[0012] 根据一个优选实施方式，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如 SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如 SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。

[0013] 根据一些实施方案，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体具有如下一种或多种性质

[0014] (a) 与人 4-1BB特异性结合，

[0015] (b) 激活 T细胞，

[0016] (c) 抑制肿瘤细胞生长，

[0017] (d) 治疗癌症。

[0018] 根据一个具体实施方案，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体包括重链和轻链。

[0019] 本发明中，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体为 IgG、 IgA、 IgE、 IgM或 IgD，优选为 IgG。

[0020] 进一步地，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体为 IgGl、 IgG2、 IgG3或 IgG4，优选为 IgGl亚类。

[0021] 本发明的另一个目的是提供一种人源化抗人 4-1BB

抗体，所述的人源化抗人 4-1BB抗体为所述的激动型 4-1BB单克隆抗体经人源化改造而成。

[0022] 根据一个优选实施方式，所述的人源化抗人 4-1BB抗体包括轻链和重链，所述的轻链序列如 SEQ ID NO:9所示，所述的重链序列如 SEQ ID NO: 10所示。

[0023] 本发明的第三个目的是提供一种所述的人源化抗人 4-1BB抗体的制备方法，将所述的激动型 4-1BB单克隆抗体采用模板替换的方法进行人源化改造。 [0024] 本发明的第四个目的是提供一种激动型 4-1BB单克隆抗体的衍生物，所述的激动型 4-1BB单克隆抗体的衍生物为上述激动型 4-1BB单克隆抗体的氨基酸序列经修饰后的抗体或者是人源化抗人 4- 1BB抗体的氨基酸序列经修饰后的抗体。

[0025] 本发明的第五个目的是提供一种编码上述激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或者是人源化抗人 4- 1BB抗体的核酸。

[0026] 本发明的第六个目的是提供一种表达上述核酸的宿主细胞。

[0027] 本发明的第七个目的是提供一种上述激动型 4-1BB单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

[0028] (a) 抗原免疫小鼠，制备杂交瘤细胞；

[0029] (b) 筛选阳性杂交瘤细胞；

[0030] (c) 克隆抗体轻重链可变区的核酸序列，并与人 IgGl的恒定区连接后构建真核表达载体；

[0031] (d) 转染宿主细胞表达抗体，经纯化后得到抗 4-1BB的单克隆抗体。

[0032] 本发明的第八个目的是提供一种上述激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段在制备抑制肿瘤细胞生长、炎症及自身反应性疾病的发展进程方面的药物中的应用。

[0033] 本发明的第九个目的是提供一种药物组合物，包括上述激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药物可接受的载体。

[0034] 由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

[0035] 本发明提供了针对 M-1BB的单克隆抗体或人源化抗人 4-1BB抗体，其能够特异性结合 h4-lBB，进而激活 T细胞。本发明的抗体通过免疫调节作用对治疗多种癌症具有应用潜力。

发明的有益效果

对附图的简要说明

附图说明

[0036] 图 1为杂交瘤分泌的抗体 abl人 PBMC的体外活化作用结果图；

[0037] 图 2为 abl嵌合抗体对人 PBMC的体外活化作用结果图；

[0038] 图 3为 abl嵌合抗体与人 4-1BB的特异性结合结果图； [0039] 图 4为 abl嵌合抗体的物种交叉反应性结果图；

[0040] 图 5为采用 ELISA检测人源化前后 abl抗体的结合活性的变化结果图；

[0041] 图 6为 abl人源化单抗对小鼠 MC38肿瘤模型的肿瘤体积影响的结果图。

本发明的实施方式

[0042] 本发明所述"抗体（antibody, Ab) "即免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig) ，是一种特异性结合抗原的糖蛋白，由 B细胞接受抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生。抗体以一个或多个 Y型单体形式存在，单体由两条重链和两条轻链组成，其中，重链包括 3个高度可变区即 H-CDR1、 H-CDR2、 H-CDR3及三个恒定区即 (CH1、 CH2、 CH3) ，轻链包括 3个高度可变区即 L-CDR1、 L-CDR2、 L-CDR3 及一个恒定区。重链分为、 σ、 γ、 α及 ε链，根据重链的不同，抗体可分为 IgM 、 IgD、 IgG、 IgA及 IgE五种类型，而轻链有 κ和 λ两种类型。抗体轻重链的可变区是抗原结合部位，负责识别及结合抗原，恒定区与抗体的生物学效应相关。

[0043] 本发明所述"嵌合抗体"是指人免疫球蛋白的恒定区与鼠源抗体的可变区拼接而成的基因工程抗体。

[0044] 本发明所述"单克隆抗体"是指针对某一特定的抗原表位，高度同源的抗体。其与多克隆抗体针对某一抗原上多个抗原决定基不同，不易与不同抗原产生交叉反应，具有高度特异性。

[0045] 本发明所述"抗原结合片段 "是指保留与抗原结合活性的抗体的一个或多个部分

[0046] 本发明所述"抗人 4-1BB的抗体 "是指能与人 4-1BB特异性结合的抗体。

[0047] 本发明所述"激动剂 "是指本文中涉及的抗人 4-1BB的抗体，其通过结合人 4-1BB 激活 4-1BB/4-1BBL信号通路，促进 Τ细胞的活化，增殖及细胞因子的分泌，而且能进一步增加 Τ细胞表面的共刺激分子的表达。

[0048] 本发明所述"特异性结合"是指该抗体在特定条件下与某物种的抗原相互作用，而不与该抗原同家族的其它抗原反应的能力。抗体的特异性结合作用可以用 ELI

SA、 FACS、 Western blot等方法确定。

[0049] 本发明所述"核酸"是指基因组、 cDNA及其重组的核酸分子，其是与同一来源的其它组分相分离的。本文中的核酸是编码感兴趣的目的蛋白的基因片段。

[0050] 本发明所述"载体"是指能存活于宿主细胞并自主复制，含有多个限制酶切位点及标记基因的 DNA分子，能够将编码目的蛋白的核酸序列导入宿主细胞，并表达其携带的遗传信息的一种运载工具。

[0051] 本发明所述"宿主细胞"是指表达目的基因序列的外源基因表达系统。宿主细胞包括原核生物细胞及真核生物细胞。

[0052] 在一些实施方案中，所述抗体包括氨基酸序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示的 H-CDR1 区，氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示的 H-CDR2区及氨基酸序列如 SEQ ID NO:3所示的 H-CDR3区，在其它的一些实施方案中，所述抗体包括氨基酸序列如 SEQ ID NO:4所示的 L-CDRl区，氨基酸序列如 SEQ ID NO:5所示的 L-CDR2区及氨基酸序列如 SEQ ID NO:6所示的 L-CDR3区。

[0053] 本发明提供的抗体或抗原结合片段，其包含如 SEQ ID NO:7所示的重链可变区，如 SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。

[0054] 具体地， SEQ ID NO: 1： GYAFTNYWLG。

[0055] 具体地， SEQ ID NO:2: DIYPGNGNSYYNEKFKG。

[0056] 具体地， SEQ ID NO:3: SSSYYRDVMDY。

[0057] 具体地， SEQ ID NO:4: RASENIYSYLV。

[0058] 具体地， SEQ ID NO:5: NAKTLAE。

[0059] 具体地， SEQ ID NO:6: QHHYGTPLT。

[0060] 具体地， SEQ ID NO:7:

DVMDYWGQGTS VTVSS =

[0062] 具体地， SEQ ID NO:8:

KR。

[0064] 在一些实施方案中，本文提及的抗体，至少具有一种下述性质: [0065] (a) 与人 4-1BB特异性结合

[0066] (b) 激活 T细胞

[0067] (c) 抑制肿瘤细胞生长

[0068] (d) 治疗癌症。

[0069] 本文中提到的抗人 4-1BB抗体的类别可以是 IgG、 IgA、 IgE、 IgM或 IgD。优选 I gG类，其中 IgG又分为 IgGl、 IgG2、 IgG3和 IgG4四个亚类，优选 IgGl亚类。抗人 4- 1BB抗体可以使用本领域通用的方法进行类别转换。

[0070] 本文中提到的抗体可以通过本领域已知的方法生产，包括 B细胞杂交瘤技术，重组抗体技术等。

[0071] 本文中提供了本发明中任何的抗 4-1BB抗体的抗原结合片段。

[0072] 抗原结合片段可包含所述抗体的任一序列，其中，抗原结合片段包括的氨基酸序列如下：

[0073] (a) 抗 4-1BB抗体的重链；

[0074] (b) 抗 4-1BB抗体的轻链；

[0075] (c) 抗 4- 1BB抗体的重链的可变区；

[0076] (d) 抗 4- 1BB抗体的轻链的可变区；

[0077] (e) 抗 4-1BB抗体的一个或多个 CDR;

[0078] (f) 抗 4-1BB抗体的重链的三个 CDR及轻链的三个 CDR。

[0079] 一方面，本文提供了任何抗人 4-1BB抗体的衍生物。

[0080] 在一些方面，抗人 4-1BB抗体的衍生物来自示例抗体（"原始抗体"）的氨基酸序列的修饰，同时原始抗体氨基酸序列的分子结构保持不变。原始抗体的框架区、高度可变区及恒定区的氨基酸序列都可以能发生氨基酸插入、缺失、取代或组合。

[0081] 本发明的抗体可能会发生一种氨基酸被性质相似的氨基酸取代的过程，该过程称为保守取代，保守取代产生的抗体一般不影响抗体的结合活性。取代类型如下：丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。 [0082] 本发明的抗体可以利用原核表达系统如大肠杆菌或真核表达系统如 CHO细胞进行抗体的制备。其中，哺乳动物表达体系是表达本发明的抗体的最优的选择。用于表达抗体的宿主细胞包括： CHO细胞、 HEK 293细胞、酵母、 COS (非洲绿猴纤维母细胞细胞系)细胞系， NS0骨髓瘤细胞及 Sp2/0细胞。

[0083] 本发明的抗体可用于调节 T细胞活性，增强细胞介导的免疫反应。本发明的抗体适于治疗癌症、辅助其它药物治疗癌症及抑制自身免疫性疾病。

[0084] 实施例 1 : 杂交瘤的制备

[0085] 本发明提供的抗体的重链和轻链的可变区最初从杂交瘤细胞中获取。所述杂交瘤细胞的制备是通过人 4-lBB-Fc融合蛋白与等量 IFA重复免疫 BalbA^ 3次，取具有合适抗体滴度的已免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按常规方法进行细胞融合。

[0086] 杂交瘤上清的筛选

[0087] ELISA筛选与人 4-1BB结合的杂交瘤细胞：为筛选抗 h4-lBB的阳性杂交瘤细胞，以 PBS缓冲液稀释 h4-lBB-Fc融合蛋白为 0.5 g/mL， ΙΟΟμ 孔包被 ELISA板， 4 °C过夜。然后弃去溶液， PBST洗涤三次，再用 3%BSA-PBST， 37°C封闭 lh。弃去溶液， PBST洗板三次，之后加入 ΙΟΟμί杂交瘤上清， 37。C孵育 lh。如前述方法洗涤 ELISA板，与过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG-F 抗体 37°C共孵育 lh后洗板，加 TMB底物 10(VL， 37°C孵育 20min，最后用 50μί硫酸终止，于酶标仪上， 450 nm处读板。

[0088] ELISA筛选不与人 IgG结合的杂交瘤细胞：为筛选抗 M-1BB的阳性杂交瘤细胞，以 PBS缓冲液稀释 MgG为 l g/mL， ΙΟΟμϋ孔包被 ELISA板， 4°C过夜。然后弃去溶液， PBST洗涤三次，再用 3%BSA-PBST， 37。C封闭 lh。弃去溶液， PBST洗板三次，之后加入 ΙΟΟμί杂交瘤上清， 37°C孵育 lh。如前述方法洗涤 ELISA板，与过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG-Fcy抗体 37°C共孵育 lh后洗板， jTOTMB底物 100μ L， 37°C孵育 20min，最后用 50μί硫酸终止，于酶标仪上， 450nm处读板。

[0089] FACS筛选与人 4-1BB结合的杂交瘤细胞：为筛选到能与 M-1BB结合的杂交瘤细胞，将表达 M-1BB的 CHO-K1与杂交瘤上清共孵育后，再与 ifl_UOr 647标记的羊抗鼠 IgG二抗结合，同时使用对应的母本细胞系做阴性对照，小鼠 IgG做同型对照，商业化的 anti-4- IBB mAb作为阳性对照，并用 FACS分析。

[0090] 抗体的激活特性：体外实验测定抗体对人 PBMC的 T细胞活化作用。首先从人 P

BMC中分离 CD3+T细胞，用 anti-CD3 mAb活化得到的 CD3+T细胞，与杂交瘤上清共孵育，再通过 ELISA的方法测定 IFN-γ分泌，通过 IFN-γ分泌的测定间接反应抗体对 T细胞的激活活性。结果如图 1所示,杂交瘤产生的分泌的抗体 abl能够显著的刺激 T细胞的活性,促进 T细胞分泌 IFN-γ.

[0091] 分泌的抗体能与 M-1BB结合的杂交瘤细胞进一步扩增并亚克隆。阳性杂交瘤细胞计数后，用有限稀释法将每株母克隆亚两块 96孔板，直至抗体分泌阳性率大于 95%，扩大培养并及时液氮冻存。

[0092] 实施例 2: 抗 M-1BB嵌合抗体的制备

[0093] 抗体 cDNA的制备：以异硫氰酸胍 -苯酚-氯仿法提取实施例 1制得的杂交瘤细胞总 RNA，以 RNA为模板，采用 cDNA合成试剂盒合成 cDNA第一条链。

[0094] 抗体可变区基因克隆及序列分析：采用文献报道的通用引物，以 cDNA第一条链为模板， PCR扩增抗体 VH和 VL序列， VH和 VL分别与 T载体连接，并转化大肠杆菌，经菌落 PCR鉴定阳性菌后进行测序，测序结果用 IMGT/QUEST及 IgBlast 分析软件对抗体的轻链和重链基因进行了确认。

[0095] 嵌合抗体的真核表达载体的构建：将鼠源性抗体重链 V区序列和人 IgGl CH基因进行拼接到 PRBH5载体，将轻链的 V区序列和人 IgG CK基因进行拼接到 pRBL2 载体。再进行测序鉴定，测定结果显示其包含如 SEQ ID NO: 11所示的重链可变区核苷酸序列和如 SEQ ID NO: 12所示的轻链可变区核苷酸序列。

[0096] SEQ ID NO: l l

[0097] caggttcagctgcagcagtctggagctgagctggtaaggcctgggacttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggatac gccttcactaactactggctaggttgggtaaagcagaggcctggacatggacttgagtggattggagatatttaccctggaaa tggaaattcttactataatgagaagttcaagggaagagccacactgactgcagacaaatcctcgagcacagtctatatgcagc tcagtagcctgacatctgaggactctgttgtctatttctgtacaagatcatcctcatactatagggatgttatggactactggggtc aaggaacctcagtcaccgtctcctcg

[0098] SEQ ID NO: 12

[0099] gacatccagatgactcagtctccagcctccctatctgcatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgagcaagtgaa aatatttacagttatttagtatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcaactcctggtctataatgcaaaaaccttagcaga aggtgtgtcatcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttctctgaagatcaacagcctgcagcctgaagattttgg gagttattactgtcaacatcattatggaactccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgg

[0100] 嵌合抗体的表达、纯化：以试剂盒抽提的重组质粒通过阳离子聚合物法转染 H EK 293F细胞，同时转染空质粒作为对照。 6d后，收集转染质粒的 HEK 293F细胞的培养上清，用 Protein A亲和柱分离纯化嵌合抗体。将纯化后抗体用 PBS进行透析。

[0101] 实施例 3: 抗体的体外活性鉴定

[0102] 抗体的亲和力：利用 BIAcore T200测定实施例 2制得的纯化后的抗体与 M-1BB 的结合动力学。采用氨基偶联的方法将 lmg/mL的抗原（h4-lBB-Fc融合蛋白）偶联于 CM5芯片表面，抗体的浓度在 0.3125-5.(Vg/mL以 3( L/min流速结合 300s，随后进行 300s的解离。 Biacore T200记录的数据采用 Biacore T200 Evaluation Software进行分析。结果如表 1所示。

[0103] 表 1

[] [表 1]

[0104] 抗体的激活特性：体外实验测定实施例 2制得的纯化后的抗体对人 PBMC的活化作用。首先使用抗凝采血管采血，将采血管里的血液和抗凝素的混合物加入离心管中，使用 DPBS均匀洗涤采血管， 2000 rpm/min离心 10 min，弃上层血浆，下层血细胞加入等体积的 DPBS稀释，再将其缓慢加入 Ficoll中， 2000 rpm/min离心 10 min，进行密度梯度离心分层。弃去上清液，缓慢吸出 PBMC并加入 DPBS洗涤 PBMC , 2000 rpm/min离心 10 min，弃去上清，采用 DPBS 重悬 PBMC, 1200 rpm/min, 离心 10

min，弃上清液，吸取完全培养基（RPMI1640+10wt%FBS+l wt

%PS) 重悬 PBMC细胞密度至 5x107 cells/mL。

采用 anti-CD3 mAb (

活化 PBMC细胞 (2x105 cell/well) , 再与抗 h4-lBB 单克隆抗体（l(Vg/mL以 3倍梯度稀释，共 8个浓度梯度）共孵育，同时以 CD28

为阳性对照，最后经 ELISA的方法测定 IFN-γ分泌，通过 IFN-γ分泌的测定间接反应抗体对 PBMC细胞的激活活性。 abl嵌合抗体对对人 PBMC中 T淋巴细胞的体外活化作用见图 2。其中， abl嵌合抗体对 PBMC的活化作用明显呈现浓度依赖性。

[0106] 实施例 4: 抗体的结合特异性

[0107] ELISA测定抗人 4-1BB抗体 abl的结合特异性。人 OX-40或 4-1BB蛋白（1 g/mL ) 包被 ELISA板， 4°C孵育过夜； PBST (0.1% Tween 20) 洗涤 3次，再以 3% BSA封闭 lh; 洗涤 3次，加入实施例 2制得的纯化后的抗人 4-1BB抗体 abl，孵育 1 h; 洗涤 3次，加入辣根过氧化物酶（HRP) 标记的羊抗人 IgG (1:2000稀释），孵育 l h; 洗涤 3次，然后加入底物溶液（TMB) ，室温避光显色；最后，加入终止液 (2NH₂S0₄) ，于 450nm处读取光密度 (optical density; OD) 值。结果显示，克隆号为 58A10H5的抗人 4-1BB抗体可以特异性结合人 4-1BB, 而不与其同家族成员 OX-40发生非特异结合，如图 3所示。

[0108] 实施例 5: 抗体的物种交叉反应性

[0109] 采用 ELISA方法鉴定该抗体与食蟹猴 4-1BB分子的交叉反应活性，以人 4-1BB或食蟹猴 4-1BB (1

包被 ELISA板， 4°C孵育过夜； PBST (0.1% Tween 20 ) 洗涤 3次，再以 3%BSA封闭 1

h; 洗涤 3次，加入实施例 2制得的纯化后的抗人 4-1BB抗体，孵育 lh; 洗涤 3次，加入辣根过氧化物酶（HRP) 标记的羊抗人 IgG (1:2000稀释），孵育 1 h; 洗涤 3次，然后加入底物溶液（TMB) ，室温避光显色；最后，加入终止液 (2NH₂S0₄) ，于 450nm处读取光密度 (optical density; OD) 值。结果见图 4 ，由拟合曲线可知，该抗体与人 4-1BB蛋白的 EC50为 0.67nM，与食蟹猴 4-1BB 蛋白的 EC50为 2.67 nM, 表明本实验的抗人 4-1BB抗体与食蟹猴 4-1BB蛋白之间具有交叉反应活性。

[0110] 实施例 6: 人源化抗人 4-1BB抗体

[0111] 为进一步降低抗人 4-1BB抗体 abl的免疫原性，本文采用模板替换的方法进行人源化改造。首先采用 Blastp在线检索与抗体 VH或 VL的氨基酸序列同源的人源抗体。然后利用 easymodeller生成抗体的三维空间模型。再将模型导入 SAVES服务器，判定模型的可行性。根据抗体序列与人源序列对比信息分析，选取同源度最高的抗体胚系基因作为人源化抗体模板，利用 IMGT网站划分模板与目标抗体的框架区和高度可变区，将目标抗体的可变区替换模板的可变区，结合模建结果和抗体可变区序列获得关键氨基酸的序列信息，再将鼠源可变区中的关键氨基酸回复突变，获得人源化抗体序列。轻链序列见 SEQ ID

NO:9, 重链序列见 SEQ ID NO: 10。最后合成人源化抗体基因，并构建至本实验室的表达载体（pRBH5/pRBL2) 中，将嵌合抗体和人源化抗体，转染 HEK293细胞，并采用 Protein A纯化后，采用 ELISA检测人源化前后抗体的结合活性的变化。结果见图 5。

[0112] SEQ ID NO:9

[0114] SEQ ID NO: 10

YRDVMDYWGQGTLVTVSS

[0116] 实施例 7: 抗人 4-1BB抗体 abl人源化单克隆抗体的抗肿瘤活性

[0117] 将实施例 6中获得的 abl的人源化后的重链可变区序列分别与人 IgGl， IgG4的重链恒定区序列进行拼接，获得人源化的 abl

IgGl , IgG4重链完整序列。序列见 SEQ ID NO: 13， SEQ ID NO:14。

[0118] SEQ ID N013:

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID N014:

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[0122] 将实施例 6中获得的 abl的人源化后的轻链可变区序列与人 kappa轻链的恒定区序列进行拼接，获得人源化的 abl轻链完整序列。序列见 SEQ ID NO: 15。

[0123] SEQ ID NO: 15

[0125] 通过包含人源化 abl完整序列的表达载体瞬时转染 CHO-K1细胞，并通过 Protein A亲和层析纯化以及离子交换层析纯化获得用于小鼠肿瘤模型体内药效实验所需的人源化 abl IgGl抗体和 IgG4抗体。

[0126] 将 MC38结肠癌细胞 5x10 ⁵个 /0.1 mL接种于雌性 B-M-1BB人源化小鼠右侧前肋部皮下，待肿瘤生长到约 150 mm ³时按肿瘤体积随机分组，每组 6只，共 2组，分别为：对照组 (PBS溶剂)和实验组 (人源化 abl IgGl和人源化 abl IgG4)。给药途径为腹腔注射,给药剂量为 10mg/kg体重,给药频率为 ldos/3天，共 8次给药，分组给药第 21天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重 2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，动物安乐死，剥取肿瘤称重、拍照，计算相对肿瘤抑制率 (TGI) 和瘤重抑制率 (IRTW；)。抗人 4-1BB单抗对小鼠 MC38肿瘤模型的肿瘤体积变化结果见图 6。由结果分析可知其 abl IgGl和 abl

IgG4的相对肿瘤抑制率 (TGI)分别为 99.84%和 94.61%，接受给药的动物肿瘤基本上完全消失。

Claims

权利要求书

[权利要求 1] 一种激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括：氨基酸序列如 SEQ ID

ΝΟ:1所示的 CDR1区，氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示的 CDR2区及氨基酸序列如 SEQ ID NO:3所示的 CDR3区；所述的轻链可变区包括：氨基酸序列如 SEQ ID NO:4所示的 CDRl区，氨基酸序列如 SEQ ID NO:5所示的 CDR2区及氨基酸序歹 ij如 SEQ ID NO:6所示的 CDR3区。

[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如 SEQ ID NO:7所示的重链可变区。

[权利要求 3] 根据权利要求 1所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段包括如 SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。

[权利要求 4] 根据权利要求 1至 3中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型 4-1BB单克隆抗体具有如下一种或多种性质：

(a) 与人 4-1BB特异性结合，

(b) 激活 T细胞，

(C) 抑制肿瘤细胞生长，

(d) 治疗癌症。

[权利要求 5] 根据权利要求 1至 3中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型 4-1BB单克隆抗体包括重链和轻链。

[权利要求 6] 根据权利要求 1至 3中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型 4-1BB单克隆抗体为 IgG、 IgA 、 IgE、 IgM或 IgD。

[权利要求 7] 根据权利要求 6所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型 4-1BB单克隆抗体为 IgGl、 IgG2、 IgG3或 IgG4。

根据权利要求 6所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述的激动型 4-1BB单克隆抗体为 IgGl。

一种人源化抗人 4- 1BB抗体，其特征在于：所述的人源化抗人 4-1BB 抗体为权利要求 1至 8中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体经人源化改造而成。

根据权利要求 9所述的人源化抗人 4-1BB抗体，其特征在于：所述的人源化抗人 4-1BB抗体包括轻链和重链，所述的轻链序列如 SEQ ID NO:9所示，所述的重链序列如 SEQ ID NO: 10所示。

一种如权利要求 9或 10所述的人源化抗人 4-1BB抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求 1至 8中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体采用模板替换的方法进行人源化改造。

一种激动型 4-1BB单克隆抗体的衍生物，其特征在于：所述的激动型

4-1BB单克隆抗体的衍生物为权利要求 1至 8中任一项所述的激动型 4-1

BB单克隆抗体的氨基酸序列经修饰后的抗体或者权利要求 9或 10所述的人源化抗人 4-1BB抗体的氨基酸序列经修饰后的抗体。

一种编码权利要求 1至 8中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求 9或 10所述的人源化抗人 4-1BB抗体的核酸。

一种表达权利要求 13所述的核酸的宿主细胞。

一种如权利要求 1至 8中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(a) 抗原免疫小鼠，制备杂交瘤细胞；

(b) 筛选阳性杂交瘤细胞；

(C) 克隆抗体轻重链可变区的核酸序列，并与人 IgGl的恒定区连接后构建真核表达载体；

(d) 转染宿主细胞表达抗体，经纯化后得到抗 4-1BB的单克隆抗体 [权利要求 16] —种如权利要求 1至 8中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求 9或 10所述的人源化抗人 4-1BB抗体在制备抑制肿瘤细胞生长、炎症及自身反应性疾病的发展进程方面的药物中的应用。

[权利要求 17] —种药物组合物，其特征在于：包括权利要求 1至 8中任一项所述的激动型 4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求 9或 10所述的人源化抗人 4-1BB抗体，以及药物可接受的载体。