TW202306984A - 抗ｃｄ１３７抗體及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了結合人CD137的抗原結合片段、將CD137識別為一種抗原和至少一種其他抗原的多特異性抗體、包含CD137抗體的藥物組成物，以及該抗體、多特異性抗體或該組成物用於治療疾病諸如癌症之用途。

Description

抗CD137抗體及使用方法
本文揭露了特異性結合人和石蟹獼猴（Macaca fascicularis）CD137（TNF受體超家族成員9（TNFRSF9））而不具有與其他人TNF受體成員的交叉反應性的抗體，以及分離的核酸、載體和宿主細胞。該等抗體可用於與其他形式諸如腫瘤相關抗原、免疫檢查點或免疫刺激因子一起構建多特異性抗體。最後，本文揭露的抗CD137抗體可用於治療多種癌症。
CD137也稱為TNF受體超家族成員9（TNFRSF9）、ILA或4-1BB，係TNF-受體超家族的成員，在T細胞的選殖擴增擴增、存活和發育中起重要作用。CD137係一種30 kDa的I型膜糖蛋白，其具有細胞外結構域（含有四個富含半胱胺酸的假重複序列（CRD））、短螺旋跨膜結構域和胞質傳訊結構域（Kwon等人, (1989) Proc Natl Acad Sci U S A [美國國家科學院院刊], 86, 1963-7）。
CD137在各種細胞群上表現，包括活化的CD4 +和CD8 +T細胞、調節性T細胞（Treg）、樹突細胞（DC）、單核細胞、肥大細胞、嗜酸性球和腫瘤內皮細胞。CD137活化在CD8+ T細胞活化和存活中起重要作用（Lee等人, (2002) J Immunol [免疫學雜誌], 169, 4882-8；Pulle等人, (2006) J Immunol [免疫學雜誌], 176, 2739-48）。它維持和增強效應子功能並誘導Th1細胞介素產生（Bartkowiak等人, (2015) Front Oncol [腫瘤學前沿], 5, 117；Shuford等人, (1997) J Exp Med [實驗醫學雜誌], 186, 47-55）。在與其唯一的配體CD137配體（CD137L、4-1BBL或TNFSF9）結合後，CD137傳訊導致經由NF-κB通路活化的促存活分子的表現增加（Wang等人 (2009) Immunol Rev [免疫學綜述], 229, 192-215）。
幾項研究已經證明，CD137的接合（藉由CD137L或激動性抗體）可以藉由促進T細胞活性來抑制腫瘤生長（Dubrot等人, (2010) Cancer Immunol Immunother [癌症免疫學與免疫治療], 59, 1223-33；Gauttier等人, (2014) Int J Cancer [國際癌症期刊], 135, 2857-67；Sallin等人, (2014) Cancer Immunol Immunother [癌症免疫學與免疫治療], 63, 947-58；McMillin等人, (2006) Hum Gene Ther [人類基因治療方法], 17, 798-806）。已經在體外（Hurtado等人, (1997) J Immunol [免疫學雜誌], 158, 2600-9）和體內（Takahashi等人, (1999) J Immunol [免疫學雜誌], 162, 5037-40）證明了CD137活化對抑制活化誘導的細胞死亡（AICD）的作用。
CD4+和CD8+ T細胞均已顯示對CD137刺激有反應，然而，CD8+細胞中T細胞功能的增強似乎更大（Shuford等人, (1997) J Exp Med [實驗醫學雜誌], 186, 47-55；Gramaglia等人, (2000) Eur J Immunol [歐洲免疫學雜誌], 30, 392-402）。
此外，CD137促效劑可以與幾種免疫調節劑協同作用，包括CpG、TRAIL、CD40、OX40、DR5、PD-1/PD-L1、CTLA4、Tim3、IL-2和IL-12（Taraban等人, (2002) Eur J Immunol [歐洲免疫學雜誌], 32, 3617-27；Curran等人, (2011) PLoS One [公共科學圖書館：綜合], 6, e19499；Gray等人, (2008) Eur J Immunol [歐洲免疫學雜誌], 38, 2499-511；Wei等人, (2013) PLoS One [公共科學圖書館：綜合], 8, e84927；Guo等人, (2013) J Transl Med [轉化醫學雜誌], 11, 215；Kwong等人, (2013) Cancer Res [癌症研究], 73, 1547-58；Lee等人, (2004) J Immunother [免疫治療雜誌], 27, 201-10）。CD137促效劑也已經被證明可以改善狼瘡、膠原誘導的關節炎和實驗性自體免疫性腦脊髓炎動物模型中的自體免疫（Vinay等人, (2006) J Immunol [免疫學雜誌], 177, 5708-17）。
幾種CD137抗體正在臨床開發中。烏瑞魯單抗（Urelumab）（BMS-66513）係由百時美施貴寶公司（Bristol-Myers squibb）開發的全人非配體阻斷IgG4抗體。目前正在進行幾項針對多種適應症的I期和II期研究。在烏瑞魯單抗的I期和II期研究（NCT00309023、NCT00612664、NCT01471210）中已經觀察到嚴重的肝毒性（IV級肝炎）（Segal等人, (2017) Clin Cancer Res [臨床癌症研究], 23, 1929-1936；Timmerman等人, (2020) Am J Hematol [美國血液學雜誌], 95, 510-520；Chester等人, Blood [血液], 131, 49-57）。烏托魯單抗（Utomilumab）係一種配體阻斷IgG2抗體，並且顯示出毒性降低，III-IV級副作用較少，並且對於高達10 mg/kg的劑量沒有報導劑量限制性毒性（Fisher等人, (2012) Cancer Immunol Immunother [癌症免疫學與免疫治療], 61, 1721-33；Segal等人, (2018) Clin Cancer Res [臨床癌症研究], 24, 1816-1823；Gopal等人, (2020) Clin Cancer Res [臨床癌症研究], 26, 2524-2534）。
已證明在肝髓樣細胞上活化CD137後產生介白素-27對肝毒性至關重要（Bartkowiak等人, (2018) Clin Cancer Res [臨床癌症研究], 24, 1138-1151）。為了避免由CD137活化引起的全身毒性，同時在腫瘤微環境中保持良好的抗腫瘤功效，腫瘤相關抗原（TAA）引導的CD137多特異性抗體可以降低毒性。不拘泥於任何一種作用機制，CD137 x TAA多特異性抗體將僅在TAA也存在時交聯CD137受體，從而導致腫瘤微環境中的免疫細胞刺激。因此，CD137 x TAA多特異性抗體可以大大降低全身毒性的可能性。
尚無批准的針對CD137的治療性抗體，並且對於靶向CD137的治療劑的醫療需求仍未得到滿足。本揭露內容包含針對人CD137的特異性抗體和抗體片段。此外，本文揭露的CD137 VH結構域片段可用於與其他形式諸如TAA、免疫檢查點或免疫刺激因子一起構建多特異性抗體。CD137抗體單獨地或與其他形式的抗體組合可潛在地用於治療或預防癌症、自體免疫性疾病或感染性疾病。
本揭露關於特異性結合CD137的抗CD137抗體及其抗原結合抗體片段。
在一個實施方式中，本揭露提供了結合人CD137的抗體或其抗原結合片段。
本揭露涵蓋以下實施方式。
一種特異性結合人CD137的抗體或其抗原結合抗體片段。
一種特異性結合人CD137的抗體抗原結合片段，其包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 29的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 30的HCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 22的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 16的HCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 15的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 16的HCDR3；或 (vi) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 4的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 5的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 6的HCDR3。
該抗體抗原結合片段，其包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 33至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (ii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (iii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 19至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (iv) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；或 (v) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 103至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
該抗體抗原結合片段，其中SEQ ID NO: 33、24、19、9或103中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
該抗體抗原結合片段，其包含： (i) 包含SEQ ID NO: 33的重鏈可變區（VH）； (ii) 包含SEQ ID NO: 24的重鏈可變區（VH）； (iii) 包含SEQ ID NO: 19的重鏈可變區（VH）； (iv) 包含SEQ ID NO: 9的重鏈可變區（VH）； (v) 包含SEQ ID NO: 103的重鏈可變區（VH）。
該抗體抗原結合片段，其為重鏈（scFv）、重鏈Fab片段、重鏈Fab'片段或重鏈F(ab') 2片段。
一種多特異性抗體，其包含特異性結合人CD137的至少第一抗原結合結構域，其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 29的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 30的HCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 22的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 16的HCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 15的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 16的HCDR3；或 (iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 4的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 5的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 6的HCDR3， 以及特異性結合人腫瘤相關抗原（TAA）的至少第二抗原結合結構域。
該多特異性抗體，其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 33的重鏈可變區（VH）； (ii) 包含SEQ ID NO: 24的重鏈可變區（VH）； (iii) 包含SEQ ID NO: 19的重鏈可變區（VH）； (iv) 包含SEQ ID NO: 9的重鏈可變區（VH）； (v) 包含SEQ ID NO: 103的重鏈可變區（VH）， 以及特異性結合人腫瘤相關抗原（TAA）的至少第二抗原結合結構域。
該多特異性抗體，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
該雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係1 + 1形式。
該雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係1 + 2形式。
該雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係2 + 2形式。
該雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係2 + 2形式。
該雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 239至SEQ ID NO: 280中的任何序列。
該雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 246。
該雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 251。
該抗體或抗體片段，其中該抗體或其抗體片段具有抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC）。
該抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段具有降低的糖基化或無糖基化或係低岩藻糖基化的。
該抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含增加的二等分GlcNac結構。
該抗體或抗體片段，其中該Fc結構域係IgG1。
該抗體或抗體片段，其中該Fc結構域係IgG4。
一種藥物組成物，其包含如請求項1至15中任一項所述之抗體或抗體片段，進一步包含藥學上可接受的載劑。
一種治療癌症之方法，其包括向有需要的患者投與有效量的該抗體或抗體片段。
該方法，其中該癌症係胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
該方法，其中該抗體或抗體片段與另一種治療劑組合投與。
該方法，其中該治療劑係紫杉醇或紫杉醇藥劑、多西他賽、卡鉑、托泊替康、順鉑、伊立替康、多柔比星、來那度胺或5-氮雜胞苷。
該方法，其中該治療劑係抗PD-1抗體。
一種分離的核酸，其編碼該抗體或抗體片段。
一種載體，其包含該核酸。
一種宿主細胞，其包含該核酸或載體。
一種用於生產抗體或抗體片段之方法，其包括培養宿主細胞以及從培養物中回收該抗體或抗體片段。
在一個實施方式中，該抗體或其抗原結合片段包含一或多個互補決定區（CDR），該一或多個互補決定區包含選自由SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30組成之群組的胺基酸序列。
在另一個實施方式中，該抗體或其抗原結合片段包含：包含一或多個重鏈互補決定區（HCDR）的重鏈可變區，該一或多個重鏈互補決定區包含選自由SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30組成之群組的胺基酸序列。
在另一個實施方式中，該抗體或其抗原結合片段包含：包含三個重鏈互補決定區（HCDR）的重鏈可變區，這三個重鏈互補決定區係包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的HCDR1；包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的HCDR2；以及包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的HCDR3。
在另一個實施方式中，該抗體或其抗原結合片段包含：包含三個重鏈互補決定區（HCDR）的重鏈可變區，這三個重鏈互補決定區係包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 22的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的HCDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 29的HCDR2，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 30的HCDR3。
在一個實施方式中，本揭露的抗體或其抗原結合片段包含：(a) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 103的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 103中的任一個至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方式中，本揭露的抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 103的胺基酸序列或在SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 103的胺基酸序列中具有一個、兩個或三個胺基酸取代的胺基酸序列。
在一個實施方式中，本揭露的抗體或其抗原結合片段包含： (a) 包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的重鏈可變區， (b) 包含SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的重鏈可變區， (c) 包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的重鏈可變區， (d) 包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的重鏈可變區， (e) 包含SEQ ID NO: 103的胺基酸序列的重鏈可變區。
在一個實施方式中，本揭露的抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。在更特定的實施方式中，本揭露的抗體包含野生型人IgG1（也稱為人IgG1wt或huIgG1）或IgG2的Fc結構域。在另一個實施方式中，本揭露的抗體包含具有S228P和/或R409K取代（根據EU編號系統）的人IgG4的Fc結構域。
在一個實施方式中，本揭露的抗體以1 × 10 -6M至1 × 10 -10M的結合親和力（K D）結合CD137。在另一個實施方式中，本揭露的抗體以約1 × 10 -6M、約1 × 10 -7M、約1 × 10 -8M、約1 × 10 -9M或約1 × 10 -10M的結合親和力（K D）結合CD137。
在另一個實施方式中，本揭露的抗人CD137抗體顯示對石蟹獼猴CD137的跨物種結合活性。
在一個實施方式中，本揭露的抗體具有強的Fc介導的效應子功能。抗體介導對表現CD137的靶細胞的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。
本揭露關於分離的核酸，該等分離的核酸包含編碼抗體或抗原結合片段的胺基酸序列的核苷酸序列。在一個實施方式中，分離的核酸包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 104的VH核苷酸序列或與SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 104具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，並且編碼本揭露的抗體或抗原結合片段的VH區。
在另一方面，本揭露關於包含CD137抗體或其抗原結合片段和視需要藥學上可接受的賦形劑的藥物組成物。
在又一方面，本揭露關於治療受試者的疾病之方法，該方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的CD137抗體或其抗原結合抗體片段或CD137抗體藥物組成物。在另一個實施方式中，待由該抗體或抗原結合片段治療的疾病係癌症。
本揭露關於抗體或其抗原結合抗體片段或CD137抗體藥物組成物用於治療疾病諸如癌症之用途。
定義
除非在本文件的其他地方具體定義，否則本文所用的所有其他技術和科學術語具有本領域的普通技術者通常理解的含義。
如本文所用，包括所附申請專利範圍，除非上下文另外明確說明，否則如「一個」、「一種」和「該」的單數形式包括它們相應的複數指代。
除非上下文另外明確說明，否則術語「或」意指術語「和/或」並且可與術語「和/或」互換使用。
如本文所用的術語「抗癌劑」係指可用於治療細胞增殖性障礙（如癌症）的任何藥劑，包括但不限於細胞毒性劑、化療劑、放射療法和放射治療劑、靶向性抗癌劑、和免疫治療劑。
術語「CD137」或「TNFRSF9」、「ILA」或「41BB」係指人CD137的胺基酸序列（SEQ ID NO: 47），其也可在登錄號Q07011（TNR9_HUMAN）或U03397找到。CD137的核酸序列如SEQ ID NO: 48所示。
如本文所用的術語「投與（administration/administering）」和「治療（treating/treatment）」，當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，意指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與該動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體接觸。細胞的處理涵蓋試劑與細胞的接觸以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。術語「投與」和「治療」還意指藉由試劑、診斷劑、結合化合物或另一種細胞進行的例如細胞的體外和離體處理。本文中的術語「受試者」包括任何生物，較佳的是動物，更較佳的是哺乳動物（例如，大鼠、小鼠、狗、貓、兔），最較佳的是人。在一方面，治療任何疾病或障礙係指改善該疾病或障礙（即，減緩或阻止或減少疾病或其至少一種臨床症狀的發展）。在另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指緩解或改善至少一個身體參數，包括患者可能無法辨別的那些。在又另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指在身體上（例如，可辨別症狀的穩定化）、在生理上（例如，身體參數的穩定化）或兩者上調節疾病或障礙。在又另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指預防或延遲疾病或障礙的發作或發展或進展。
在本揭露的上下文中，術語「受試者」係哺乳動物，例如，靈長類動物，較佳的是高等靈長類動物，例如人（例如，患有本文所述之障礙或處於患上本文所述之障礙的風險中的患者）。
如本文所用的術語「親和力」係指抗體與抗原之間相互作用的強度。在抗原內，抗體的可變區通過非共價力與抗原在許多位點相互作用。通常，相互作用越多，親和力越強。
如本文所用的術語「抗體」係指免疫球蛋白家族的多肽，其可以非共價地、可逆地和以特異性方式結合相應的抗原。例如，天然存在的IgG抗體係包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈的四聚體。每條重鏈由重鏈可變區（本文縮寫為VH）和重鏈恒定區構成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3構成。每條輕鏈由輕鏈可變區（本文縮寫為VL）和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域CL構成。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區（CDR），其間插有更保守的區域，稱為框架區（FR）。每個VH和VL由從胺基末端到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個框架區（FR）構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子（包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）以及經典補體系統的第一組分（Clq））的結合。
術語「抗體」包括但不限於單株抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和抗獨特型（抗Id）抗體。抗體可為任何同種型/類別（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）或亞類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）。
在一些實施方式中，抗CD137抗體包含至少一個抗原結合位點，至少一個可變區。在一些實施方式中，抗CD137抗體包含來自本文所述之CD137抗體的抗原結合片段。在一些實施方式中，抗CD137抗體係分離的或重組的。
本文中的術語「單株抗體」或「mAb」或「Mab」係指基本上同質的抗體的群體，即，除了可能少量存在的可能天然發生的突變外，該群體中包含的抗體分子在胺基酸序列上係相同的。相比之下，常規（多株）抗體製劑典型地包括在其可變結構域中包含不同胺基酸序列的多種不同抗體，特別地其互補決定區（CDR），它們通常對不同的表位具有特異性。修飾語「單株」指示獲得自基本上均質的抗體群體的抗體的特徵並且不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。可以藉由熟悉該項技術者已知的方法獲得單株抗體（mAb）。參見，例如Kohler等人, Nature [自然] 1975 256:495-497；美國專利案號4,376,110；Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY [分子生物學現代方法] 1992；Harlow等人, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL [抗體：實驗室手冊], Cold spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室] 1988；以及Colligan等人, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY [當代免疫學方案] 1993。本文揭露的抗體可為任何免疫球蛋白類別（包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA），及其任何亞類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）。產生單株抗體的融合瘤可以在體外或在體內培養。高效價的單株抗體可以在體內產生中獲得，其中將來自單個融合瘤的細胞腹膜內注射到小鼠中，例如原始引發的Balb/c小鼠，以產生含有高濃度所需抗體的腹水。可以使用熟悉該項技術者熟知的柱層析方法從這樣的腹水，或從培養上清液中純化同種型IgM或IgG的單株抗體。
通常，基本抗體結構單元包含四聚體。每個四聚體包括兩對相同的多肽鏈，每對包含一條「輕鏈」（約25 kDa）和一條「重鏈」（約50-70 kDa）。每條鏈的胺基末端部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多個胺基酸的可變區。重鏈的羧基末端部分可以定義為主要負責效應子功能的恒定區。典型地，人輕鏈被分類為κ和λ輕鏈。此外，人重鏈典型地分類為α、δ、ε、γ或μ，並且分別將抗體的同種型定義為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區藉由約12個或更多個胺基酸的「J」區連接，重鏈還包括約10個以上胺基酸的「D」區。
每個輕鏈/重鏈（VL/VH）對的可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中，兩個結合位點通常在一級序列中係相同的。
典型地，重鏈和輕鏈的可變結構域包含三個高變區，也稱為「互補決定區（CDR）」，其位於相對保守的框架區（FR）之間。CDR通常由框架區對齊，使得能夠結合特異性表位。一般而言，從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈可變結構域兩者都包含FR-1（或FR1）、CDR-1（或CDR1）、FR-2（FR2）、CDR-2（CDR2）、FR-3（或FR3）、CDR-3（CDR3）和FR-4（或FR4）。CDR和框架區的位置可以使用本領域熟知的多種定義確定，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT（參見，例如Johnson等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 29:205-206 (2001)；Chothia和Lesk, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], 196:901-917 (1987)；Chothia等人, Nature [自然], 342:877-883 (1989)；Chothia等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 227:799-817 (1992)；Al-Lazikani等人, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], 273:927-748 (1997)）、ImMunoGenTics（IMGT）編號（Lefranc, M.-P., The Immunologist [免疫學者], 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P.等人, Dev. Comp.Immunol.[發育與比較免疫學], 27, 55-77 (2003)（「IMGT」編號方案））。抗原結合位點的定義還在以下文獻中描述：Ruiz等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 28:219-221 (2000)；和Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res. [核酸研究], 29:207-209 (2001)；MacCallum等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 262:732-745 (1996)；和Martin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 86:9268-9272 (1989)；Martin等人, Methods Enzymol. [酶學方法], 203:121-153 (1991)；和Rees等人, 在Sternberg M. J. E.（編）, Protein Structure Prediction [蛋白質結構預測], Oxford University Press [牛津大學出版社], 牛津, 141-172 (1996)中。例如，根據Kabat，重鏈可變結構域（VH）中的CDR胺基酸殘基編號為31-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3）；並且輕鏈可變結構域（VL）中的CDR胺基酸殘基編號為24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）。根據Chothia，VH中的CDR胺基酸編號為26-32（HCDR1）、52-56（HCDR2）和95-102（HCDR3）；VL中的胺基酸殘基編號為26-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）和91-96（LCDR3）。藉由結合Kabat和Chothia的CDR定義，CDR在人VH中編號為26-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3），在人VL中編號為胺基酸殘基24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）。根據IMGT，VH中的CDR胺基酸殘基編號為約26-35（HCDR1）、51-57（HCDR2）和93-102（HCDR3），VL中的CDR胺基酸殘基編號為約27-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）和89-97（LCDR3）（編號根據Kabat）。根據IMGT，可以使用程式IMGT/DomainGap Align確定抗體的CDR區。
術語「高變區」係指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自「CDR」（例如輕鏈可變結構域中的LCDR1，LCDR2和LCDR3以及重鏈可變結構域中的HCDR1，HCDR2和HCDR3）的胺基酸殘基。參見Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學上感興趣的蛋白質序列], 第5版 Public Health Service [公共衛生署], National Institutes of Health [國立衛生研究院], 貝塞斯達, 馬里蘭州（藉由序列定義抗體的CDR區）；還參見Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196: 901-917（藉由結構定義抗體的CDR區）。術語「框架」或「FR」殘基意指除了本文定義為CDR殘基的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
除非另外說明，否則「抗原結合片段」係指抗體的抗原結合片段，即保留與全長抗體結合的抗原特異性結合的能力的抗體片段，例如保留一或多個CDR區的片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如，單鏈Fv（ScFv））；奈米抗體以及從抗體片段形成的多特異性抗體。
如本文所用，抗體「特異性結合」靶蛋白，係指與其他蛋白相比，抗體表現出優先結合靶蛋白，但這種特異性不需要絕對的結合特異性。在描述抗原（例如蛋白質）與抗體或抗原結合抗體片段之間的相互作用的上下文中使用的抗體「特異性結合」或「選擇性結合」係指決定抗原在蛋白質和其他生物製劑的異質群體中（例如在生物樣本、血液、血清、血漿或組織樣本中）的存在的結合反應。因此，在某些指定的免疫測定條件下，抗體或其抗原結合片段與特定抗原特異性結合係背景水平的至少兩倍，並且不以顯著量與樣本中存在的其他抗原特異性結合。在一方面，在指定的免疫測定條件下，抗體或其抗原結合片段與特定抗原的特異性結合係背景結合水平的至少十（10）倍，並且不以顯著量與樣本中存在的其他抗原特異性結合。
本文中的術語「人抗體」意指僅包含人免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如果在小鼠、小鼠細胞或源自小鼠細胞的融合瘤中產生，人抗體可以含有鼠碳水化合物鏈。類似地，「小鼠抗體」或「大鼠抗體」意指分別僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。
術語「人源化」或「人源化抗體」意指含有來自非人（例如鼠）抗體以及人抗體的序列的抗體形式。此類抗體含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗體將包含基本上至少一個、並且典型地兩個可變結構域的全部，其高變環的全部或基本上全部對應於非人免疫球蛋白的那些，並且FR的全部或基本上全部係人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體還將視需要包含免疫球蛋白恒定區（Fc）的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。當有必要區分人源化抗體與親本齧齒動物抗體時，將前綴「hum」、「hu」、「Hu」或「h」添加到抗體殖株名稱中。人源化形式的齧齒動物抗體會通常包含親本齧齒動物抗體的相同CDR序列，但是可包括某些胺基酸取代以增加親和力，增加人源化抗體的穩定性，除去翻譯後修飾或出於其他原因。
術語「相應的人種系序列」係指編碼人可變區胺基酸序列或亞序列的核酸序列，與由人種系免疫球蛋白可變區序列編碼的所有其他已知可變區胺基酸序列相比，其與參考可變區胺基酸序列或亞序列具有最高確定的胺基酸序列同一性。相應的人種系序列也可以指與所有其他評估的可變區胺基酸序列相比，與參考可變區胺基酸序列或亞序列具有最高胺基酸序列同一性的人可變區胺基酸序列或亞序列。相應的人種系序列可以僅是框架區，僅互補決定區，框架和互補決定區，可變區段（如上定義），或包含可變區的序列或亞序列的其他組合。可以使用本文所述之方法確定序列同一性，例如使用BLAST、ALIGN或本領域已知的另一種比對演算法比對兩個序列。相應的人種系核酸或胺基酸序列可以與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。此外，如果抗體含有恒定區，則恒定區也衍生自此類人序列，例如人種系序列，或突變形式的人種系序列或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗體，例如Knappik等人, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 296:57-86, 2000中所述。
術語「平衡解離常數（K D，M）」係指解離速率常數（kd，時間 -1）除以締合速率常數（ka，時間 -1，M -l）。平衡解離常數可以使用本領域任何已知的方法測量。本揭露的抗體通常將具有小於約10 -7或10 -8M，例如小於約10 -9M或10 -10M，在一些方面，小於約10 -11M、10 -12M或10 -13M的平衡解離常數。
本文中的術語「癌症」或「腫瘤」具有如本領域理解的最廣泛的含義，並且係指哺乳動物中典型地以不受調控的細胞生長為特徵的生理病症。在本揭露的上下文中，癌症不限於某個類型或位置。
在本揭露的上下文中，當提及胺基酸序列時，術語「保守取代」意指用新胺基酸取代原始胺基酸，該新胺基酸基本上不改變抗體或片段的化學、物理和/或功能性質，例如其與CD137的結合親和力。胺基酸的常見保守取代係本領域熟知的。
適用於確定百分比序列同一性和序列相似性的演算法之實例係BLAST演算法，其分別描述於Altschul等人, Nuc.Acids Res.[核酸研究] 25:3389-3402, 1977和Altschul等人, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 215:403-410, 1990中。用於進行BLAST分析的軟體可通過國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information）揭露獲得。此演算法包括首先藉由鑒定查詢序列中短字長W鑒定高得分序列對（HSP），當與數據庫序列中相同字長比對時，其匹配或滿足一些正值閾值得分T。T被稱為鄰域字得分閾值。該等初始鄰域字命中作為開始搜索以找到包含它們的較長HSP的值。字命中沿著每個序列在兩個方向上延伸，直到累積比對得分可以增加為止。對於核苷酸序列，使用參數M（一對匹配殘基的獎勵得分；始終 ＞ 0）和N（錯配殘基的罰分；始終 ＜ 0）來計算累積得分。對於胺基酸序列，使用得分矩陣來計算累積得分。在以下情況下，將停止字命中在每個方向上的延伸：累積比對得分從其最大實現值下降了數量X；由於一或多個負得分殘基比對的累積，累積得分趨於零或更低；或者到達任一序列的末端。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程式（對於核苷酸序列）默認使用字長（W）11，期望值（E）10，M = 5，N = -4並比較兩條股。對於胺基酸序列，BLAST程式預設使用字長3，期望值（E）10和BLOSUM62得分矩陣（參見Henikoff和Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 89: 10915）比對（B）50，期望值（E）10，M = 5，N = -4並比較兩條股。
BLAST演算法還對兩個序列之間的相似性進行統計分析（參見例如Karlin和Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 90:5873-5787, 1993）。BLAST演算法提供的一種相似性度量係最小總和概率（P(N)），其提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較中最小總和概率小於約0.2，更較佳的是小於約0.01，最較佳的是小於約0.001，則認為該核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的百分比同一性也可以使用已併入ALIGN程式（版本2.0）的演算法，使用PAM120重量殘基表，12的空位長度罰分和4的空位罰分來確定（E. Meyers和W. Miller, Comput. Appl. Biosci. [生物科學中的電腦應用] 4: 11-17, (1988)）。此外，可以使用已併入GCG套裝軟體中的GAP程式中的演算法確定兩個胺基酸序列之間的百分比同一性，使用BLOSUM62矩陣或PAM250矩陣，空位權重為16、14、12、10、8、6或4，並且長度權重為1、2、3、4、5或6（Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 48:444-453, (1970)）。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，並且係指單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知的核苷酸類似物或經修飾的主鏈殘基或連接的核酸，它們係合成的，天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以與參考核苷酸相似的方式代謝。此類類似物之實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸（PNA）。
在核酸的上下文中，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個多核苷酸（例如DNA）區段之間的功能關係。典型地，它係指轉錄調節序列與轉錄序列的功能關係。例如，啟動子或強化子序列如果在合適的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則可操作地連接至編碼序列。通常，可操作地連接至轉錄序列的啟動子轉錄調節序列與轉錄序列在物理上鄰接，即它們係順式作用的。然而，一些轉錄調節序列（如強化子）不需要在物理上鄰接或緊鄰它們增強其轉錄的編碼序列。
在一些方面，本揭露提供了組成物，例如藥學上可接受的組成物，其包含與至少一種藥學上可接受的賦形劑一起配製的如本文所述之至少一種抗CD137結合抗體。如本文所用，術語「藥學上可接受的賦形劑」包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。賦形劑可適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊柱或表皮投與（例如藉由注射或輸注）。
本文揭露的組成物可為多種形式。該等包括例如液體、半固體和固體劑型，如液體溶液（例如可注射和輸注溶液）、分散液或懸浮液、脂質體和栓劑。合適的形式取決於預期的投與方式和治療應用。典型的合適組成物係可注射或輸注溶液的形式。一種合適的投與方式係腸胃外（例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌內）。在一些實施方式中，該抗體藉由靜脈內輸注或注射來投與。在某些實施方式中，該抗體藉由肌內或皮下注射來投與。
如本文所用的術語「治療有效量」係指當投與於受試者以治療疾病、或疾病或障礙的至少一種臨床症狀時，足以影響該疾病、障礙或症狀的治療的抗體之量。「治療有效量」可以隨抗體，疾病，障礙，和/或疾病或障礙的症狀，疾病、障礙、和/或疾病或障礙的症狀的嚴重程度，待治療的受試者的年齡，和/或待治療的受試者的體重而變化。在任何給定情況下的合適量對於熟悉該項技術者而言係顯而易見的，或者可以藉由常規實驗確定。在組合療法的情況下，「治療有效量」係指用於有效治療疾病、障礙或病症的組成對象的總量。
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療本揭露中所述之治療病症或障礙。這種投與涵蓋以基本上同時的方式共同投與該等治療劑。這種投與也涵蓋在多個容器中或在每種活性成分的獨立容器（例如，膠囊、粉末和液體）中共同投與。可以將粉末和/或液體在投與之前重構或稀釋到所需劑量。此外，這種投與也涵蓋在大致相同的時間或在不同的時間以順序方式使用每種類型的治療劑。在任何一種情況下，治療方案將在治療本文所述之病症或障礙方面提供藥物組合的有益作用。
如本文所用，短語「與…組合」意指將抗CD137抗體、抗原結合片段或含有抗CD137的多特異性抗體在投與另外的治療劑的同時、就在該投與前或就在該投與後投與於受試者。在某些實施方式中，將抗CD137抗體、抗原結合片段或含有抗CD137的多特異性抗體作為與另外的治療劑的共同配製物來投與。
本揭露提供了特異性結合人CD137的抗體、抗原結合片段或含有抗CD137的多價抗體。此外，本揭露提供了具有所需的藥物動力學特徵和其他期望的屬性的抗體，並且因此可用於降低癌症的可能性或治療癌症。本揭露進一步提供了包含抗體或抗原結合片段的藥物組成物以及製備和使用此類藥物組成物用於預防和治療癌症和相關障礙之方法。 抗CD137抗體
本揭露提供了特異性結合CD137的抗體或其抗原結合片段。本揭露的抗體或抗原結合片段包括但不限於如下所述產生的抗體或其抗原結合片段。
本揭露提供了特異性結合CD137的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 103的胺基酸序列（表1）的VH結構域。本揭露還提供了特異性結合CD137的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含具有表1中列出的HCDR（重鏈互補決定區）中的任一個的胺基酸序列的HCDR。在一方面，本揭露提供了特異性結合CD137的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含（或替代性地，由其組成）包含表1中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多個HCDR。
本揭露的其他抗體或其抗原結合片段包括已被改變，但在CDR區中與表1中揭露的CDR區具有至少60%、70%、80%、90%、95%或99%百分比同一性的胺基酸。在一些方面，其包括胺基酸改變，其中當與表1中描述的序列中描繪的CDR區相比時，在CDR區中改變不超過1、2、3、4或5個胺基酸。
本揭露的其他抗體包括其中胺基酸或編碼胺基酸的核酸已被改變，但與表1中描述的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%或99%百分比同一性的那些。在一些方面，其包括胺基酸序列的改變，其中當與表1中描述的序列中描繪的可變區相比時，在可變區中改變不超過1、2、3、4或5個胺基酸，同時保持基本上相同的治療活性。
本揭露還提供了編碼VH結構域抗體和特異性結合CD137的抗體的全長重鏈的核酸序列。可以優化此類核酸序列以在哺乳動物細胞中表現。 [表1]
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-7207 (IMGT) SEQ ID NO: 1 HCDR1 (IMGT) GFRLDTTE
SEQ ID NO: 2 HCDR2 (IMGT) IMGISGST
SEQ ID NO: 3 HCDR3 (IMGT) ARVVDSLFDDSAVFDY
BGA-7207 (Kabat) SEQ ID NO: 4 HCDR1 (Kabat) TTEVG
SEQ ID NO: 5 HCDR2 (Kabat) TIMGISGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 6 HCDR3 (Kabat) VVDSLFDDSAVFDY
BGA-7207 (Chothia) SEQ ID NO: 7 HCDR1 (Chothia) GFRLDTT
SEQ ID NO: 8 HCDR2 (Chothia) MGISGS
SEQ ID NO: 6 HCDR3 (Chothia) VVDSLFDDSAVFDY
BGA-7207 SEQ ID NO: 9 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRLDTTEVGWVRQAPGKGLEWVSTIMGISGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVDSLFDDSAVFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 10 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCAGATTGGACACCACCGAAGTAGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCACCATCATGGGTATTAGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCGATTCCCTCTTTGATGACAGCGCCGTTTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
BGA-4712 (IMGT) SEQ ID NO: 11 HCDR1 (IMGT) GFMLSAED
SEQ ID NO: 12 HCDR2 (IMGT) ILDFGGST
SEQ ID NO: 13 HCDR3 (IMGT) ARVVYHAGGGVTFDY
BGA-4712 (Kabat) SEQ ID NO: 14 HCDR1 (Kabat) AEDVG
SEQ ID NO: 15 HCDR2 (Kabat) AILDFGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 16 HCDR3 (Kabat) VVYHAGGGVTFDY
BGA-4712 (Chothia) SEQ ID NO: 17 HCDR1 (Chothia) GFMLSAE
SEQ ID NO: 18 HCDR2 (Chothia) LDFGGS
SEQ ID NO: 16 HCDR3 (Chothia) VVYHAGGGVTFDY
BGA-4712 SEQ ID NO: 19 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 20 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
BGA-4712-M3 (IMGT) SEQ ID NO: 21 HCDR1 (IMGT) GFTLSAED
SEQ ID NO: 12 HCDR2 (IMGT) ILDFGGST
SEQ ID NO: 13 HCDR3 (IMGT) ARVVYHAGGGVTFDY
BGA-4712-M3 (Kabat) SEQ ID NO: 14 HCDR1 (Kabat) AEDVG
SEQ ID NO: 22 HCDR2 (Kabat) AILDFGGSTYYAESVKG
SEQ ID NO: 16 HCDR3 (Kabat) VVYHAGGGVTFDY
BGA-4712-M3 (Chothia) SEQ ID NO: 23 HCDR1 (Chothia) GFTLSAE
SEQ ID NO: 18 HCDR2 (Chothia) LDFGGS
SEQ ID NO: 16 HCDR3 (Chothia) VVYHAGGGVTFDY
BGA-4712-M3 SEQ ID NO: 24 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 25 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG   
BGA-5623 (IMGT) SEQ ID NO: 26 HCDR1 (IMGT) GFTVSAED
SEQ ID NO: 27 HCDR2 (IMGT) ILDKGGST
SEQ ID NO: 28 HCDR3 (IMGT) ARIVYHAGGGVTFDT
BGA-5623 (Kabat) SEQ ID NO: 14 HCDR1 (Kabat) AEDVG
SEQ ID NO: 29 HCDR2 (Kabat) AILDKGGSTYYAESVKG
SEQ ID NO: 30 HCDR3 (Kabat) IVYHAGGGVTFDT
BGA-5623 (Chothia) SEQ ID NO: 31 HCDR1 (Chothia) GFTVSAE
SEQ ID NO: 32 HCDR2 (Chothia) LDKGGS
SEQ ID NO: 30 HCDR3 (Chothia) IVYHAGGGVTFDT
BGA-5623 SEQ ID NO: 33 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 34 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BGA-7556 SEQ ID NO: 103 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 104 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
表位和結合相同表位的抗體的鑒定
本揭露提供了結合人CD137的表位的抗體及其抗原結合片段。在某些方面，抗體和抗原結合片段可以結合CD137的相同表位。
本揭露還提供了結合與表1中描述的抗CD137抗體相同的表位的抗體及其抗原結合片段。因此，其他抗體及其抗原結合片段可以基於它們在結合測定中與其他抗體交叉競爭（例如，以統計學顯著的方式競爭性抑制其結合）的能力來鑒定。測試抗體抑制本揭露的抗體及其抗原結合片段結合CD137的能力證明測試抗體可與該抗體或其抗原結合片段競爭結合CD137。不受任何一種理論的束縛，這種抗體可以結合CD137上的與其競爭的抗體或其抗原結合片段相同或相關（例如，在結構上相似或在空間上鄰近）的表位。在某些方面，結合CD137上的與本揭露的抗體或其抗原結合片段相同的表位的抗體係人或人源化單株抗體。這種人或人源化單株抗體可以如本文所述製備和分離。 Fc區的改變
在其他方面，藉由用不同的胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變抗體的效應子功能。例如，可以用不同的胺基酸殘基替代一或多個胺基酸，使得抗體對效應配體具有改變的親和力，但保留親本抗體的抗原結合能力。親和力改變的效應子配體可為例如Fc受體或補體的C1組分。此方法描述於例如Winter等人的美國專利案號5,624,821和5,648,260中。
在另一方面，可以用一或多個不同的胺基酸殘基替代一或多個胺基酸殘基，使得抗體具有改變的C1q結合和/或降低的或消除的補體依賴性細胞毒性（CDC）。此方法描述於例如Idusogie等人的美國專利案號6,194,551中。
另一方面，改變一或多個胺基酸殘基從而改變抗體固定補體的能力。此方法描述於例如Bodmer等人的公開WO 94/29351中。在特定的方面，本揭露的抗體或其抗原結合片段的一或多個胺基酸被IgG1亞類和κ同種型的一或多個同種異型胺基酸殘基替代。同種異型胺基酸殘基還包括但不限於IgG1、IgG2和IgG3亞類的重鏈恒定區以及κ同種型的輕鏈恒定區，如Jefferis等人, MAbs [單株抗體] 1:332-338 (2009)所述。
在另一方面，藉由修飾一或多個胺基酸來修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC）的能力和/或增加抗體對Fcγ受體的親和力。此方法描述於例如Presta的公開WO 00/42072中。此外，已經繪製了在人IgG1上與FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點，並且已經描述了具有改善的結合的變體（Shields等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 276:6591-6604, 2001）。
在另一方面，CD137抗體或抗原結合片段的糖基化被修飾。例如，可以製備無糖基化抗體（即，抗體缺乏或具有降低的糖基化）。例如，可以改變糖基化以增加抗體對「抗原」的親和力。這種碳水化合物修飾可以藉由例如改變抗體序列內的一或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一或多個胺基酸取代，其導致消除一或多個可變區框架糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這種無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。此方法描述於例如Co等人的美國專利案號5,714,350和6,350,861中。
另外地或替代性地，可以製備具有改變的糖基化類型的抗體，諸如包含減少量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或包含增加的二等分GlcNac結構的抗體。已經證明此類改變的糖基化模式增加抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變的糖基化途徑的宿主細胞中表現抗體來實現。具有改變的糖基化途徑的細胞已經在本領域中描述並且可以用作宿主細胞，在其中表現重組抗體從而產生具有改變的糖基化的抗體。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破壞的FUT8基因的細胞系，其編碼岩藻糖基轉移酶，使得在這種細胞系中表現的抗體表現出低岩藻糖基化。Presta的公開WO 03/035835描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞，其具有降低的將岩藻糖連接至Asn（297）-連接的碳水化合物的能力，也導致在該宿主細胞中表現的抗體的低岩藻糖基化（也參見Shields等人, (2002) J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 277:26733-26740）。Umana等人的WO 99/54342描述了被工程化以表現糖蛋白修飾的糖基轉移酶（例如，β(1,4)-N乙醯胺基葡萄糖轉移酶III（GnTIII））的細胞系，使得在工程化的細胞系中表現的抗體表現出增加的二等分GlcNac結構，這導致抗體的ADCC活性增加（還參見Umana等人, Nat. Biotech.[自然生物技術] 17:176-180, 1999）。
在另一方面，如果所需的ADCC降低，許多先前的報導顯示人抗體亞類IgG4僅具有適度的ADCC並且幾乎沒有CDC效應子功能（Moore等人, 2010 MAbs [單株抗體], 2:181-189）。然而，發現天然IgG4在應激條件下（如在酸性緩衝劑中或在升高的溫度下）較不穩定（Angal, 1993 Mol Immunol [分子免疫學], 30:105-108；Dall'Acqua等人, 1998 Biochemistry [生物化學], 37:9266-9273；Aalberse等人, 2002 Immunol[免疫學], 105:9-19）。降低的ADCC可以藉由將抗體可操作地連接至用降低FcγR結合或C1q結合活性的改變的組合工程化的IgG4 Fc，從而降低或消除ADCC和CDC效應子功能來實現。考慮到抗體作為生物藥物的物理化學性質，IgG4的較不期望的固有特性之一係其兩條重鏈在溶液中動態分離以形成半抗體，這導致通過稱為「Fab臂交換」的過程在體內產生雙特異性抗體（Van der Neut Kolfschoten M等人, 2007 Science [科學], 317:1554-157）。228位（EU編號系統）絲胺酸突變為脯胺酸表現出對IgG4重鏈分離的抑制作用（Angal, 1993 Mol Immunol [分子免疫學], 30:105-108；Aalberse等人, 2002 Immunol [免疫學], 105:9-19）。據報導，鉸鏈區和γFc區中的一些胺基酸殘基對抗體與Fcγ受體的相互作用具有影響（Chappel等人, 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 88:9036-9040；Mukherjee等人, 1995 FASEB J [美國實驗生物學學會聯合會雜誌], 9:115-119；Armour等人, 1999 Eur J Immunol [歐洲免疫學雜誌], 29:2613-2624；Clynes等人, 2000 Nature Medicine [自然醫學], 6:443-446；Arnold, 2007 Annu Rev immunol [免疫學年鑒], 25:21-50）。此外，在人群中一些罕見的IgG4同種型也可引起不同的物理化學特性（Brusco等人, 1998 Eur J Immunogenet [歐洲免疫遺傳學雜誌], 25:349-55；Aalberse等人, 2002 Immunol [免疫學], 105:9-19）。為了產生具有低ADCC和CDC但具有良好穩定性的CD137抗體，可以修飾人IgG4的鉸鏈區和Fc區並引入許多改變。該等經修飾的IgG4 Fc分子可在SEQ ID NO: 83-88，Li等人的美國專利案號8,735,553中找到。 CD137抗體產生
抗CD137抗體、抗原結合片段和多特異性抗體可藉由本領域已知的任何方法產生，包括但不限於抗體四聚體的重組表現、化學合成和酶消化，而全長單株抗體可藉由例如融合瘤或重組產生獲得。重組表現可以來自本領域已知的任何合適的宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本揭露還提供了編碼本文所述抗體的多核苷酸，例如編碼包含本文所述之互補決定區的重鏈或輕鏈可變區或區段的多核苷酸。在一些方面，編碼重鏈可變區的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 104組成之群組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
本揭露的多核苷酸可以編碼抗CD137抗體的可變區序列。它們還可以編碼抗體的可變區和恒定區。一些多核苷酸序列編碼包含示例性抗CD137抗體之一的重鏈和輕鏈的可變區的多肽。
本揭露還提供了用於產生抗CD137抗體的表現載體和宿主細胞。表現載體的選擇取決於表現載體的預期宿主細胞。通常，表現載體含有可操作地連接至編碼抗CD137抗體鏈或抗原結合片段的多核苷酸的啟動子和其他調節序列（例如，強化子）。在一些方面，除了在誘導條件的控制下，使用誘導型啟動子來防止插入序列的表現。誘導型啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可以在非誘導條件下、而不在偏向宿主細胞更好耐受其表現產物的編碼序列的群體的情況下擴大經轉化的生物體的培養。除啟動子外，其他調節元件也可為有效表現抗CD137抗體或抗原結合片段所需要或期望的。該等元件典型地包括ATG起始密碼子和相鄰的核糖體結合位點或其他序列。此外，藉由包含適合於使用中的細胞系統的強化子，可以提高表現效率（參見，例如，Scharf等人, Results Probl.Cell Differ. [細胞分化中的結果和問題]20:125, 1994；以及Bittner等人, Meth. Enzymol. [酶學方法], 153:516, 1987）。例如，SV40強化子或CMV強化子可以用來增加哺乳動物宿主細胞中的表現。
用於攜帶並表現抗CD137抗體鏈的宿主細胞可為原核或真核的。大腸桿菌係一種可用於選殖和表現本揭露多核苷酸的原核宿主。其他適用的微生物宿主包括桿菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），和其他腸桿菌科（enterobacteriae），如沙門氏菌屬（Salmonella）、沙雷氏菌屬（Serratia）和各種假單胞菌屬（Pseudomonas）種。在該等原核宿主中，還可以製備表現載體，其典型地含有與宿主細胞相容的表現控制序列（例如複製起點）。此外，將存在任何數量的多種熟知的啟動子，如乳糖啟動子系統、色胺酸（trp）啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子典型地視需要用操縱子序列控制表現，並具有核糖體結合位點序列等，用於啟動和完成轉錄和翻譯。其他微生物如酵母也可用於表現抗CD137多肽。也可以使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體的組合。
在其他方面，哺乳動物宿主細胞用於表現和產生本揭露的抗CD137多肽。例如，它們可為表現內源性免疫球蛋白基因的融合瘤細胞系或攜帶外源性表現載體的哺乳動物細胞系。該等包括任何正常死亡或正常或異常永生化動物或人細胞。例如，已經開發了幾種能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HEK 293細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞和融合瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽一般在例如Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y.[從基因到殖株，紐約VCH出版社，紐約市], 1987中討論。用於哺乳動物宿主細胞的表現載體可以包括表現控制序列，如複製起點、啟動子和強化子（參見例如Queen等人, Immunol. Rev. [免疫學綜述] 89:49-68, 1986）和必要的加工資訊位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可為組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的、和/或可調控的或可調節的。有用的啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素誘導型CMV啟動子（如人立即早期CMV啟動子）、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-強化子組合。 CD137多特異性抗體
在一個實施方式中，本文揭露的抗CD137抗體可以摻入抗CD137xTAA多特異性抗體中，其中TAA係針對任何人腫瘤相關抗原（TAA）的抗體或其片段。抗體分子係多特異性抗體分子，例如，其包含多個抗原結合結構域，其中至少一個抗原結合結構域序列特異性結合CD137，而第二抗原結合結構域序列特異性結合TAA。在一個實施方式中，多特異性抗體包含第三、第四或第五抗原結合結構域。在一個實施方式中，多特異性抗體係雙特異性抗體、三特異性抗體或四特異性抗體。在每個實例中，多特異性抗體包含至少一個抗CD137抗原結合結構域和至少一個抗TAA抗原結合結構域。
在一個實施方式中，多特異性抗體係雙特異性抗體。如本文所用，雙特異性抗體僅特異性結合兩種抗原。雙特異性抗體包含特異性結合CD137的第一抗原結合結構域和特異性結合TAA的第二抗原結合結構域。這包括包含特異性結合CD137的重鏈可變結構域和特異性結合TAA的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的雙特異性抗體。在另一個實施方式中，雙特異性抗體包含特異性結合CD137的抗體的抗原結合片段和特異性結合TAA的抗原結合片段。包含抗原結合片段的雙特異性抗體、抗原結合片段可為Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(ScFv)或scFv。
先前的實驗（Coloma和Morrison Nature Biotech.[自然生物技術] 15: 159-163 (1997)）描述了四價 雙特異性抗體，其藉由在lgG3抗丹磺醯基抗體的C末端（CH3-scFv）之後或鉸鏈（鉸鏈-scFv）之後融合編碼單鏈抗丹磺醯基抗體Fv（scFv）的DNA進行工程化。本揭露提供了具有至少兩個抗原結合結構域的多價抗體（例如四價抗體），其可藉由編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表現容易地產生。本文的多價抗體包含三至八個，但較佳的是四個抗原結合結構域，其特異性結合至少兩種抗原。
本揭露提供了包含VD1-CL-(X1)n-VD2-CH1-Fc或VD1-CH-(X1)n-VD2-CL-Fc的雙特異性四價抗體，其中VD1係第一可變結構域，VD2係第二可變結構域，Fc係Fc區的一條多肽鏈，CH或CL係恒定重鏈結構域或恒定輕鏈結構域，並且(X1)n係至少2個胺基酸的連接子。
在一個實施方式中，雙特異性四價抗體可為四條多肽鏈的多聚體，兩條重鏈各自包含第一VH結構域（VH1）、第一CH1結構域、第二VH結構域（VH2），Fc區包含第二CH1、鉸鏈、CH2、CH3和兩條輕鏈，每條輕鏈包含第一VL結構域（VL1）、第一CL區、第二VL結構域（VL2）和第二CL區。在另一個實施方式中，雙特異性四價抗體可以包含與單個Fc結構域連接在一起的多個抗體Fab片段。例如，Fab1可以通過多肽連接子連接到Fab2（其包含Fab之一的CH1結構域）、鉸鏈區，然後是Fc結構域的CH2和CH3。例如，抗TAA Fab可以通過連接子從抗TAA Fab的CL結構域連接到抗CD137 Fab的VH結構域和從抗CD137 Fab的CH1結構域、鉸鏈區、CH2和CH3結構域連接。在另一個實例中，抗CD137 Fab可以通過連接子從抗CD137 Fab的CL結構域連接到抗TAA Fab的VH結構域和從抗TAA Fab的CH1結構域、鉸鏈區、CH2和CH3結構域連接。 連接子
還應理解，多特異性抗體的多肽鏈的結構域和/或區可被各種長度的連接子區分開。在一些實施方式中，表位結合結構域藉由連接子區與彼此CL、CH1、鉸鏈、CH2、CH3或整個Fc區分開。例如，VL1-CL-（連接子）VH2-CH1這種連接子區可以包含隨機分類的胺基酸，或一組受限的胺基酸。此類連接子區可為柔性的或剛性的（參見US 2009/0155275）。
已經藉由以下方式構建了多特異性抗體：使用或不使用柔性連接子基因融合兩種單鏈Fv（scFv）或Fab片段（Mallender等人, J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 1994 269:199-206；Macket等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.[美國國家科學院院刊]1995 92:7021-5；Zapata, Protein Eng.[蛋白質工程] 1995 8.1057-62），經由二聚化裝置諸如白胺酸拉鍊（Kostelny等人, J. Immunol.[免疫學雜誌] 1992148:1547-53；de Kruif等人J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 1996 271:7630-4）和Ig C/CH1結構域（Muller等人, FEBS Lett.[歐洲生化學會聯合會快報]422:259-64）；藉由雙抗體（Holliger等人, (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA.[美國國家科學院院刊]1998 90:6444-8；Zhu等人, Bio/Technology (NY) [生物/技術（紐約）] 1996 14:192-6）；Fab-scFv融合（Schoonjans等人, J. Immunol.[免疫學雜誌] 2000 165:7050-7）；以及微型抗體形式（Pack等人, Biochemistry [生物化學] 1992.31:1579-84；Pack等人, Bio/Technology [生物/技術] 1993 11:1271-7）。
本文揭露的多特異性抗體在其一或多個表位結合結構域、CL結構域、CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域或Fc區之間包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多個胺基酸殘基的連接子區。在一些實施方式中，胺基酸甘胺酸和絲胺酸包含連接子區內的胺基酸。在另一個實施方式中，連接子可為GS（SEQ ID NO:239）、GGS（SEQ ID NO: 240）、GSG（SEQ ID NO: 241）、SGG（SEQ ID NO: 242）、GGG（SEQ ID NO: 243）、GGGS（SEQ ID NO: 244）、SGGG（SEQ ID NO: 245）、GGGGS（SEQ ID NO: 246）、GGGGSGS（SEQ ID NO: 247）、GGGGSGS（SEQ ID NO: 248）、GGGGSGGS（SEQ ID NO: 249）、GGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 250）、GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 251）、AKTTPKLEEGEFSEAR（SEQ ID NO: 252）、AKTTPKLEEGEFSEARV（SEQ ID NO: 253）、AKTTPKLGG（SEQ ID NO: 254）、SAKTTPKLGG（SEQ ID NO: 255）、AKTTPKLEEGEFSEARV（SEQ ID NO: 256）、SAKTTP（SEQ ID NO: 257）、SAKTTPKLGG（SEQ ID NO: 258）、RADAAP（SEQ ID NO: 259）、RADAAPTVS（SEQ ID NO: 260）、RADAAAAGGPGS（SEQ ID NO: 261）、RADAAAA(G 4S) 4（SEQ ID NO: 262）、SAKTTP（SEQ ID NO: 263）、SAKTTPKLGG（SEQ ID NO: 264）、SAKTTPKLEEGEFSEARV（SEQ ID NO: 265）、ADAAP（SEQ ID NO: 266）、ADAAPTVSIFPP（SEQ ID NO: 267）、TVAAP（SEQ ID NO: 268）、TVAAPSVFIFPP（SEQ ID NO: 269）、QPKAAP（SEQ ID NO: 270）、QPKAAPSVTLFPP（SEQ ID NO: 271）、AKTTPP（SEQ ID NO: 272）、AKTTPPSVTPLAP（SEQ ID NO: 273）、AKTTAP（SEQ ID NO: 274）、AKTTAPSVYPLAP（SEQ ID NO: 275）、ASTKGP（SEQ ID NO: 276）、ASTKGPSVFPLAP（SEQ ID NO: 277）、GENKVEYAPALMALS（SEQ ID NO: 278）、GPAKELTPLKEAKVS（SEQ ID NO: 279）和GHEAAAVMQVQYPAS（SEQ ID NO: 280）或它們的任何組合（參見WO 2007/024715）。 二聚化特異性胺基酸
在一個實施方式中，多特異性抗體包含至少一個二聚化特異性胺基酸改變。二聚化特異性胺基酸改變導致「突起到孔中」相互作用，並增加正確多特異性抗體的組裝。二聚化特異性胺基酸可以在CH1結構域或CL結構域或其組合內。用於將CH1結構域與其他CH1結構域（CH1-CH1）和CL結構域與其他CL結構域（CL-CL）配對的二聚化特異性胺基酸至少可以在WO 2014082179、WO 2015181805和WO 2017059551的揭露內容中找到。二聚化特異性胺基酸也可以在Fc結構域內，並且可以與CH1或CL結構域內的二聚化特異性胺基酸組合。 檢測和診斷方法
本揭露的抗體或抗原結合片段可用於多種應用，包括但不限於檢測CD137之方法。在一方面，抗體或抗原結合片段可用於檢測生物樣本中CD137的存在。如本文所用的術語「檢測」包括定量或定性檢測。在某些方面，生物樣本包括細胞或組織。在其他方面，此類組織包括相對於其他組織以更高水平表現CD137的正常和/或癌性組織。
在一方面，本揭露提供了檢測生物樣本中CD137的存在之方法。在某些方面，該方法包括在允許抗體與抗原結合的條件下，將生物樣本與抗CD137抗體或其抗原結合片段接觸，並檢測抗體與抗原之間是否形成複合物。生物樣本可以包括但不限於尿液、組織、痰或血液樣本。
還包括診斷與CD137表現相關的障礙之方法。在某些方面，該方法包括使測試細胞與抗CD137抗體或其抗原結合片段接觸；藉由檢測抗CD137抗體或其抗原結合片段與CD137多肽的結合來測定測試細胞表現的CD137的表現水平（定量或定性）；以及將測試細胞的表現水平與對照細胞（例如，與測試細胞相同組織來源的正常細胞或非CD137表現細胞）中的CD137表現水平進行比較，其中與對照細胞相比，測試細胞中較高水平的CD137表現表明存在與CD137表現相關的障礙。 治療方法
本揭露的抗體或抗原結合片段可用於多種應用，包括但不限於治療CD137相關障礙或疾病之方法。在一方面，CD137相關障礙或疾病係癌症。在CD137xTAA多特異性抗體的情況下，癌症可為TAA特異性的，CD137起將免疫細胞募集到TAA表現腫瘤的作用。
在一方面，本揭露提供了治療癌症之方法。在某些方面，該方法包括向有需要的患者投與有效量的抗CD137抗體、其抗原結合片段或含有CD137的多特異性抗體。癌症可包括但不限於胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
本文揭露的抗CD137抗體或抗原結合片段可以藉由任何合適的方式投與，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果需要用於局部治療、病灶內或腫瘤內投與。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥可以藉由任何合適的途徑，例如藉由注射，如靜脈內或皮下注射，這部分取決於投與是短暫的還是長期的。本文考慮了多種給藥方案，包括但不限於單次投與或在不同時間點的多次投與、推注投與、和脈衝輸注。
本揭露的抗體或抗原結合片段可以以符合良好醫學實踐的方式配製、給藥和投與。關於這點要考慮的因素包括治療的特定障礙、治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的起因、藥劑的遞送位點、投與方法、投與方案、和醫療從業者已知的其他因素。抗體不需要但視需要與目前用於預防或治療所研究的障礙的一或多種藥劑一起配製。此類其他藥劑的有效量取決於配製物中存在的抗體的量、障礙或治療的類型、以及上文討論的其他因素。該等通常以與如本文所述相同的劑量和投與途徑使用，或以本文所述劑量的約1%-99%使用，或以經驗/臨床確定為合適的任何劑量和任何途徑使用。
為預防或治療疾病，本揭露的抗體、其抗原結合片段或多特異性抗體的合適的劑量將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重程度和病程、投與抗體是用於預防還是治療目的、先前療法、患者的臨床病史和對抗體的響應、以及主治醫生的判斷。抗體適當地以一次或經一系列治療投與於患者。取決於疾病的類型和嚴重性，約1 μg/kg至100 mg/kg的抗體可為用於向患者投與的初始候選劑量，無論是例如藉由一次或多次分開投與，還是藉由連續輸注。取決於上述因素，一個典型的日劑量可以為約1 μg/kg至100 mg/kg或更多。對於幾天或更長時間內的重複投與，取決於病症，治療通常會持續直到出現疾病症狀的期望抑制。此類劑量可以間歇地投與，例如每週或每三週（例如使得患者接受約兩次至約二十次投與）。投與初始高負載劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，其他劑量方案可能是有用的，並且治療的進展很容易藉由常規技術和測定來監測。 組合療法
在一個方面，本揭露的CD137抗體、其抗原結合片段或多特異性抗體可以與其他治療劑組合使用。可以與本揭露的CD137抗體一起使用的其他治療劑包括：但不限於化療劑（例如，紫杉醇或紫杉醇藥劑；（例如Abraxane®）、多西他賽；卡鉑；拓撲替康；順鉑；伊立替康、多柔比星、來那度胺、 5-氮雜胞苷、異環磷醯胺、奧沙利鉑、培美曲塞二鈉、環磷醯胺、依託泊苷、地西他濱、氟達拉濱、長春新鹼、苯達莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他濱、黴法蘭、噴司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二鈉）、酪胺酸激酶抑制劑（例如EGFR抑制劑（例如厄洛替尼）、多激酶抑制劑（例如MGCD265、RGB-286638）、CD-20靶向劑（例如利妥昔單抗、奧法木單抗、RO5072759、LFB-R603）、CD52靶向劑（例如阿侖單抗）、普賴蘇穠、達貝泊汀α、來那度胺、Bcl-2抑制劑（例如奧利默森鈉）、極光激酶抑制劑（例如MLN8237、TAK-901）、蛋白酶體抑制劑（例如硼替佐米）、CD-19靶向劑（例如MEDI-551、MOR208）、MEK抑制劑（例如ABT-348）、JAK-2抑制劑（例如INCB018424）、mTOR抑制劑（例如坦羅莫司、依維莫司）、BCR/ABL抑制劑（例如伊馬替尼）、ET-A受體拮抗劑（例如ZD4054）、TRAIL受體2（TR-2）促效劑（例如CS-1008）、EGEN-001、Polo樣激酶1抑制劑（例如BI 672）。
本揭露的抗CD137xTAA抗體可與其他治療劑（例如其他免疫檢查點抗體）組合使用。此類免疫檢查點抗體可包括抗PD1抗體。抗PD1抗體可包括但不限於替雷利珠單抗、帕博利珠單抗（Pembrolizumab）或納武利尤單抗（Nivolumab）。替雷利珠單抗揭露於US 8,735,553中。帕博利珠單抗（以前稱為MK-3475）揭露於US 8,354,509和US 8,900,587中，並且係人源化lgG4-K免疫球蛋白，其靶向PD1受體並抑制PD1受體配體PD-L1和PD-L2的結合。帕博利珠單抗已被批准用於轉移性黑色素瘤和轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）的適應症，並且正在進行用於治療頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）和難治性何杰金氏淋巴瘤（cHL）的臨床研究。納武利尤單抗（如由百時美施貴寶公司所揭露的）係全人lgG4-K單株抗體。納武利尤單抗（殖株5C4）揭露於美國專利案號US 8,008,449和WO 2006/121168中。納武利尤單抗被批准用於治療黑色素瘤、肺癌、腎癌、和何杰金氏淋巴瘤。 藥物組成物和配製物
還提供了包含抗CD137抗體、其抗原結合片段、多特異性抗體或包含編碼抗CD137抗體、其抗原結合片段或多特異性抗體的序列的多核苷酸的組成物，包括藥物配製物。在某些實施方式中，組成物包含結合CD137的一或多種CD137抗體或其抗原結合片段，或包含編碼結合CD137的一或多種CD137抗體或其抗原結合片段的序列的一或多種多核苷酸。該等組成物還可包含合適的載劑，如本領域熟知的藥學上可接受的賦形劑，包括緩衝劑。
藉由將具有所需純度的這種抗體或抗原結合片段與一或多種視需要的藥學上可接受的載劑混合來製備本文所述之抗CD137抗體或其抗原結合片段的藥物配製物（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition [雷明頓藥物科學第16版], Osol, A.編(1980)），呈凍乾配製物或水溶液的形式。藥學上可接受的載劑在所採用的劑量和濃度下對於接受者通常是無毒性的，並且包括但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑（如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨；氯化本索寧；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，如鈉；金屬絡合物（例如Zn-蛋白絡合物）；和/或非離子型界面活性劑，如聚乙二醇（PEG）。本文的示例性藥學上可接受的載劑進一步包括間質藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白（sHASEGP），例如人可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，如rHuPH20（HYLENEX ®，百特國際有限公司（Baxter International, Inc.））。在美國專利案號US 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一方面，將sHASEGP與一或多種另外的糖胺聚糖酶如軟骨素酶組合。
示例性凍乾抗體配製物描述於美國專利案號6,267,958中。水性抗體配製物包括美國專利案號6,171,586和WO 2006/044908中所述的那些，後者的配製物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。可以製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有該抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質，該基質為成形製品的形式，例如膜或微膠囊。用於體內投與的配製物通常是無菌的。無菌性可以例如通過無菌過濾膜過濾而容易地實現。 實例 實例1.     合成人VH抗體庫的構建
合成文庫基本上使用種系3-23（SEQ ID NO: 45和46）構建。藉由使用簡並寡核苷酸的組合誘變進行重鏈CDR（HCDR）的隨機化（表2）。如Meetei（Meetei等人, (1998) Anal. Biochem [分析生物化學], 264, 288-91；Meetei等人, (2002) Methods Mol Biol [分子生物學方法], 182, 95-102）所述，藉由聚合酶鏈反應經由多個位點特異性突變進行HCDR1和HCDR2區的隨機化。對於CDR3區，合成了8至14（Kabat定義）的不同長度的簡並寡核苷酸（英傑公司（Invitrogen）），並藉由剪接重疊延伸PCR引入了多樣性。誘變步驟後的PCR產物由NcoI/NotI雙重消化並連接到噬菌粒載體pCANTAB-5E中。然後將該等庫轉化到大腸桿菌TG1細菌中，並藉由隨機殖株的DNA Sanger定序驗證（分析 ＞ 96個殖株）。在使用KM13輔助噬菌體的拯救步驟之後，藉由用PEG/NaCl直接從培養上清液中沈澱兩次來純化噬菌體。
設計文庫以模擬人的庫，特別是HCDR1和HCDR2區中常見的胺基酸分佈。已經證明，在CDR1位置引入帶負電荷的胺基酸不僅顯著提高了膠體穩定性，而且提高了人VH結構域的表現和純化產率（Dudgeon等人, (2013) Protein Eng Des Sel [蛋白質工程設計與選擇], 26, 671-4；Dudgeon等人,(2012) Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 109, 10879-84）。因此，設計了兩種不同的簡並寡核苷酸用於具有高比例帶負電荷胺基酸的HCDR1隨機化。對於HCDR3的多樣化，使用NNY和NNK來獲得最大程度的庫多樣性（表2）。另外，構建了具有確定的HCDR3長度（Kabat定義）的各個子文庫（表3）。轉化到大腸桿菌中後獲得總大小為1.38 × 10 11的文庫。 [表2].用於文庫構建的寡核苷酸
名稱 SEQ ID NO 序列
HCDR1a SEQ ID NO: 35 CTGCGCCGCGTCTGGATTCABNTTBNMCNMCVAHGACDTRGGTTGGGTGCGTCAAGCGC
HCDR1b SEQ ID NO: 36 CTGCGCCGCGTCTGGATTCABNTTBGACNMCNMCVAHDTRGGTTGGGTGCGTCAAGCGC
HCDR2 SEQ ID NO: 37 GGACTGGAATGGGTCTCCRSCATCWBKRRHWBKRRHGGTTCGACATACTATGCGG
HCDR3-8 SEQ ID NO: 38 GGTGTACTACTGCGCCCGCRNCNNKNNKNNKNNKNTCGABWWCTGGGGACAGGGCACC
HCDR3-9 SEQ ID NO: 39 GTGTACTACTGCGCCCGCRNCNNKNNKNNKNNKNNKNTCGABWWCTGGGGACAGGGCAC
HCDR3-10 SEQ ID NO: 40 GTGTACTACTGCGCCCGCRNCNNKNNKNNKNNKNNKNNKTTBGATTACTGGGGACAGGG
HCDR3-11 SEQ ID NO: 41 GTGTACTACTGCGCCCGCRNCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNYTTTGATTACTGGGGAC
HCDR3-12 SEQ ID NO: 42 GTACTACTGCGCCCGCRNCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNYTTTGATTACTGGGGAC
HCDR3-13 SEQ ID NO: 43 GTACTACTGCGCCCGCRNCNNYNNYNNYNNYNNYNNYNNYNNYNNYTTTGATTACTGGG
HCDR3-14 SEQ ID NO: 44 GTACTACTGCGCCCGCRNCNNYNNYNNYNNYNNYNNYNNYNNYNNYNNYTTTGATTACTGGGGAC
3-23種系AA SEQ ID NO: 45 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
3-23種系DNA SEQ ID NO: 46 GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTAGCGGCAGCGGCGGTAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCCGTGTATTATTGCGCGCGT
多樣化的位置以粗體顯示（編碼的胺基酸（括號中的密碼子））：ABN，25%Ile、16.67%Arg、Ser、8.33%Met和33.33%Thr；TTB，66.67%Phe和33.34%Leu；NMC，12.5%Ala、12.5%Asp、12.5%His、12.5%Asn、12.5%Pro、12.5%Ser、12.5%Thr、12.5%Tyr；VAH，11.11%Glu、Lys、Gln和22.22%Asp、Asn、His；DTR，16.67%Ile、33.33%Leu、16.67%Met和33.33%Val；RSC，25%Ala、25%Gly、25%Ser和25%Thr；WBK，8.33%Cys、Phe、Ile、Leu、Met、Arg、Trp、25%Ser和16.67%Thr；RRH，8.33%Glu、Lys、Arg、16.66%Asp、Gln、Ser和25%Gly；RNC，12.5%Ala、12.5%Asp、12.5%Gly、12.5%Ile、12.5%Gln、12.5%Arg、12.5%Ser和12.5%Thr；NTC，25%Phe、25%Leu、25%Val、25%Ile；GAB，66.67%Asp、33.33%Glu；WWC，25%Phe、25%ILe、25%Gln、25%Tyr；NNY，6.25%Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、ILe、Leu、Gln、Phe、Arg、Thr、Val、Tyr和12.5%Ser；NNK全部20個AAs。 [表3].合成人VH文庫的構建
文庫編號 多樣性 實際文庫大小
HCDR1 HCDR2 HCDR3
HC-8/9 7.68E + 03 2.27E + 03 8.19E + 08 3.00E + 10
HC-10 7.68E + 03 2.27E + 03 1.02E + 09 2.40E + 10
HC-11 7.68E + 03 2.27E + 03 7.68E + 09 1.50E + 10
HC-12 7.68E + 03 2.27E + 03 1.54E + 11 1.50E + 10
HC-13 7.68E + 03 2.27E + 03 3.08E + 11 3.20E + 10
HC-14 7.68E + 03 2.27E + 03 4.61E + 12 2.20E + 10
實例2.    重組蛋白和穩定細胞系的產生 用於噬菌體活動和結合測定的CD137重組蛋白
為了發現與人和獼猴CD137交叉結合但不與其他人TNF受體成員脫靶結合的抗CD137的VH結構域抗體，設計並表現了幾種重組蛋白用於噬菌體淘選和篩選（參見表4）。將全長人CD137（SEQ ID NO: 47）的cDNA編碼區根據CD137 GenBank序列（登錄號：NM_001561.4，該基因可獲自Sinobio，目錄號：HG10041-M）排序。將人CD137配體（TNFSF9）（SEQ ID NO: 57）根據（登錄號：NM_003811.3，該基因可獲自Sinobio，目錄號：HG15693-G）排序。將猴（獼猴）CD137（SEQ ID NO: 63）根據（登錄號：NM_001266128.1，該基因可獲自Genscript，目錄號：OMb00270）排序。將全長人CD40（SEQ ID NO: 69）根據（登錄號：NM_001250.4，該基因可獲自Sinobio，目錄號：HG10774-M）排序。將OX40（SEQ ID NO: 75）根據（登錄號：NM_003327.2，該基因可獲自Sinobio，目錄號：HG10481-UT）排序。簡言之，對由huCD137的胺基酸（AA）24-183（SEQ ID NO: 49）組成的細胞外結構域（ECD）的編碼區、由人CD137配體的AA 71-254（SEQ ID NO: 59）組成的ECD的編碼區、由cynoCD137的AA 24-186（SEQ ID NO: 65）組成的ECD的編碼區和由人CD40的AA 1-194（SEQ ID NO: 71）組成的ECD的編碼區進行了PCR擴增。對mIgG2a Fc（SEQ ID NO: 55）的編碼區進行了PCR擴增，然後藉由重疊PCR與人CD137、人CD137配體、猴CD137或人CD40的ECD軛合，以製備mIgG2a Fc融合蛋白。然後將PCR產物選殖到基於pcDNA3.1的表現載體（美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑公司（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA））中，產生五個重組mIgG2a Fc融合蛋白表現質體：人CD137 ECD-mIgG2a、人CD137配體mIgG2a、cyno CD137 ECD-mIgG2a和人CD40 ECD-mIgG2a。替代性地，將由huCD137（SEQ ID NO: 47）的AA 24-183（SEQ ID NO: 49）組成的ECD的編碼區和由人OX40（SEQ ID NO: 77）的AA 1-216組成的ECD的編碼區也選殖到基於pcDNA3.1的表現載體（美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑公司）中，其C末端與6xHis標籤融合，從而分別產生人CD137-his和人OX40-his。為了產生重組融合蛋白，將質體瞬時轉染到基於HEK293的哺乳動物細胞表現系統（內部開發）中，並在裝備有旋轉振盪器的CO 2培養箱中培養5-7天。收集含有重組蛋白的上清液並離心澄清。使用蛋白A柱（目錄號：17127901，通用生命科學公司（GE Life Sciences））或Ni-NTA瓊脂糖（目錄號：R90115，英傑公司）純化重組蛋白。將所有重組蛋白用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）透析，並以小等分試樣保存在-80°C冰箱中。 穩定表現細胞系
為了建立表現全長人CD137（huCD137）的穩定細胞系，將huCD137序列選殖到反轉錄病毒載體pFB-Neo（目錄號：217561，美國的安捷倫公司（Agilent））中。根據先前的方案（Zhang等人, (2005) Blood [血液], 106, 1544-1551）產生雙嗜性反轉錄病毒載體。將含有huCD137的載體轉導到Hut78細胞（ATCC，TIB-161）或NK92-mi細胞（ATCC，CRL-2408）中，以產生huCD137表現細胞系Hut78/huCD137或NK92-mi/huCD137。藉由在含有10% FBS和G418的培養基中培養來選擇表現huCD137的細胞系，然後藉由FACS驗證。 [表4].重組CD137蛋白的序列
構建體 SEQ ID NO： 序列
人CD137 FL AA SEQ ID NO: 47 MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
人CD137 FL DNA SEQ ID NO: 48 ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTCAACTTTGAGAGGACAAGATCATTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
人CD137 AA 24-183 SEQ ID NO: 49 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGH
人CD137 24-183 DNA SEQ ID NO: 50 CTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACAC
人CD137 -his SEQ ID NO: 51 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHHHHHHHGGGLNDIFEAQKIEWHE
人CD137 -his DNA SEQ ID NO: 52 CTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACCATCACCATCACCATCACGGAGGCGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA
人CD137 ECD-mIgG2a AA SEQ ID NO: 53 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
人CD137 ECD-mIgG2a DNA SEQ ID NO: 54 CTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
mIgG2a AA SEQ ID NO: 55 EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
mIgG2a DNA SEQ ID NO: 56 GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
人CD137配體AA SEQ ID NO: 57 MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
人CD137配體cDNA SEQ ID NO: 58 ATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAATAA
人CD137配體71-254 AA SEQ ID NO: 59 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
人CD137配體71-254 DNA SEQ ID NO: 60 CGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
人CD137配體-mIgG2a AA SEQ ID NO: 61 EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
人CD137配體-mIgG2a DNA SEQ ID NO: 62 GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCACGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
cyno CD137 FL AA SEQ ID NO: 63 MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQIIFFLALTSTVVLFLLFFLVLRFSVVKRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
cyno CD137 FL DNA SEQ ID NO: 64 ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTGAACTTTGAGAGGACAAGATCCTTGCAGGATCTGTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAGTCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAAGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCATTTCAGGATATCACTGCCTGGGGGCAGAATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAATTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAATGACCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGCGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCAGGAGCATCCTCTGCGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTTCTTTCTTGCGCTGACTTCGACTGTGGTACTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCGTGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGAGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCGGTACAAACCACTCAAGAGGAAGATGGATGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTGA
cyno CD137 ECD 24-186 AA SEQ ID NO: 65 LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQ
cyno CD137 ECD 24-186 DNA SEQ ID NO: 66 CTGCAGGATCTGTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAGTCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAAGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCATTTCAGGATATCACTGCCTGGGGGCAGAATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAATTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAATGACCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGCGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCAGGAGCATCCTCTGCGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAG
cyno CD137 ECD-mIgG2a AA SEQ ID NO: 67 LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
cyno CD137 ECD-mIgG2a DNA SEQ ID NO: 68 CTGCAGGATCTGTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAGTCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAAGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCATTTCAGGATATCACTGCCTGGGGGCAGAATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAATTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAATGACCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGCGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCAGGAGCATCCTCTGCGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
人CD40 AA SEQ ID NO: 69 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
人CD40 DNA SEQ ID NO: 70 ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCCCTGGTGGTGATCCCCATCATCTTCGGGATCCTGTTTGCCATCCTCTTGGTGCTGGTCTTTATCAAAAAGGTGGCCAAGAAGCCAACCAATAAGGCCCCCCACCCCAAGCAGGAACCCCAGGAGATCAATTTTCCCGACGATCTTCCTGGCTCCAACACTGCTGCTCCAGTGCAGGAGACTTTACATGGATGCCAACCGGTCACCCAGGAGGATGGCAAAGAGAGTCGCATCTCAGTGCAGGAGAGACAGTGA
huCD40 ECD AA (1-194) SEQ ID NO: 71 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRA
huCD40 ECD DNA (1-194) SEQ ID NO: 72 ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCC
人CD40 ECD-mIgG2a AA SEQ ID NO: 73 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRASEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
人CD40 ECD-mIgG2a DNA SEQ ID NO: 74 ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAGTTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCTAGCGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTACTCACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
人OX40 AA SEQ ID NO: 75 MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
人OX40 DNA SEQ ID NO: 76 ATGTGCGTGGGGGCTCGGCGGCTGGGCCGCGGGCCGTGTGCGGCTCTGCTCCTCCTGGGCCTGGGGCTGAGCACCGTGACGGGGCTCCACTGTGTCGGGGACACCTACCCCAGCAACGACCGGTGCTGCCACGAGTGCAGGCCAGGCAACGGGATGGTGAGCCGCTGCAGCCGCTCCCAGAACACGGTGTGCCGTCCGTGCGGGCCGGGCTTCTACAACGACGTGGTCAGCTCCAAGCCGTGCAAGCCCTGCACGTGGTGTAACCTCAGAAGTGGGAGTGAGCGGAAGCAGCTGTGCACGGCCACACAGGACACAGTCTGCCGCTGCCGGGCGGGCACCCAGCCCCTGGACAGCTACAAGCCTGGAGTTGACTGTGCCCCCTGCCCTCCAGGGCACTTCTCCCCAGGCGACAACCAGGCCTGCAAGCCCTGGACCAACTGCACCTTGGCTGGGAAGCACACCCTGCAGCCGGCCAGCAATAGCTCGGACGCAATCTGTGAGGACAGGGACCCCCCAGCCACGCAGCCCCAGGAGACCCAGGGCCCCCCGGCCAGGCCCATCACTGTCCAGCCCACTGAAGCCTGGCCCAGAACCTCACAGGGACCCTCCACCCGGCCCGTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGTTGCCGCCATCCTGGGCCTGGGCCTGGTGCTGGGGCTGCTGGGCCCCCTGGCCATCCTGCTGGCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCTGA
人OX40 ECD (1-216) AA SEQ ID NO: 77 MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVA
人OX40 ECD (1-216) DNA SEQ ID NO: 78 ATGTGCGTGGGGGCTCGGCGGCTGGGCCGCGGGCCGTGTGCGGCTCTGCTCCTCCTGGGCCTGGGGCTGAGCACCGTGACGGGGCTCCACTGTGTCGGGGACACCTACCCCAGCAACGACCGGTGCTGCCACGAGTGCAGGCCAGGCAACGGGATGGTGAGCCGCTGCAGCCGCTCCCAGAACACGGTGTGCCGTCCGTGCGGGCCGGGCTTCTACAACGACGTGGTCAGCTCCAAGCCGTGCAAGCCCTGCACGTGGTGTAACCTCAGAAGTGGGAGTGAGCGGAAGCAGCTGTGCACGGCCACACAGGACACAGTCTGCCGCTGCCGGGCGGGCACCCAGCCCCTGGACAGCTACAAGCCTGGAGTTGACTGTGCCCCCTGCCCTCCAGGGCACTTCTCCCCAGGCGACAACCAGGCCTGCAAGCCCTGGACCAACTGCACCTTGGCTGGGAAGCACACCCTGCAGCCGGCCAGCAATAGCTCGGACGCAATCTGTGAGGACAGGGACCCCCCAGCCACGCAGCCCCAGGAGACCCAGGGCCCCCCGGCCAGGCCCATCACTGTCCAGCCCACTGAAGCCTGGCCCAGAACCTCACAGGGACCCTCCACCCGGCCCGTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGTTGCC
人OX40 ECD-His AA SEQ ID NO: 79 MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAHHHHHH
人OX40 ECD-His DNA SEQ ID NO: 80 ATGTGCGTGGGGGCTCGGCGGCTGGGCCGCGGGCCGTGTGCGGCTCTGCTCCTCCTGGGCCTGGGGCTGAGCACCGTGACGGGGCTCCACTGTGTCGGGGACACCTACCCCAGCAACGACCGGTGCTGCCACGAGTGCAGGCCAGGCAACGGGATGGTGAGCCGCTGCAGCCGCTCCCAGAACACGGTGTGCCGTCCGTGCGGGCCGGGCTTCTACAACGACGTGGTCAGCTCCAAGCCGTGCAAGCCCTGCACGTGGTGTAACCTCAGAAGTGGGAGTGAGCGGAAGCAGCTGTGCACGGCCACACAGGACACAGTCTGCCGCTGCCGGGCGGGCACCCAGCCCCTGGACAGCTACAAGCCTGGAGTTGACTGTGCCCCCTGCCCTCCAGGGCACTTCTCCCCAGGCGACAACCAGGCCTGCAAGCCCTGGACCAACTGCACCTTGGCTGGGAAGCACACCCTGCAGCCGGCCAGCAATAGCTCGGACGCAATCTGTGAGGACAGGGACCCCCCAGCCACGCAGCCCCAGGAGACCCAGGGCCCCCCGGCCAGGCCCATCACTGTCCAGCCCACTGAAGCCTGGCCCAGAACCTCACAGGGACCCTCCACCCGGCCCGTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGTTGCCCATCACCATCACCATCAC
實例3.    抗huCD137 VH結構域抗體的產生 噬菌體展示淘選和篩選
使用標準方案藉由噬菌體展示進行噬菌體展示選擇（Silacci等人, (2005) Proteomics [蛋白質組學], 5, 2340-50；Zhao等人, (2014) PLoS One [公共科學圖書館：綜合], 9, e111339）。簡言之，在第1輪和第2輪中使用了在免疫管（目錄號470319，賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher））中的10 µg/ml固定化人CD137 ECD-mIgG2a。在第3輪和第4輪中使用Hut78/huCD137細胞進行選擇。用補充有1% Tween 20（MPBST）的5%奶粉（w/v）的PBS溶液阻斷免疫管1小時。用PBST（補充有0.05% Tween 20的PBS緩衝液）洗滌後，每個子文庫的5 × 10 12個（第1輪）或5 × 10 11個（第2輪）噬菌體被MPBST中的人CD40 ECD-mIgG2a耗竭1小時，然後與抗原一起孵育1小時。對於第三輪和第四輪選擇，使用Hut78/huCD137細胞（第3輪）和HEK293（ATCC，CRL-1573）細胞作為耗竭細胞進行細胞淘選。用PBST洗滌後，用100 mM三乙胺（西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich））洗脫結合的噬菌體。洗脫的噬菌體用於感染對數中期的大腸桿菌TG1細菌，並接種到補充有2%葡萄糖和100 µg/ml胺苄青黴素的TYE瓊脂板上。在四輪選擇之後，挑選單個殖株並使用標準方案製備含有噬菌體的上清液。噬菌體ELISA和FACS用於篩選抗huCD137 VH結構域抗體。
對於噬菌體ELISA，用抗原包被Maxisorp免疫板，並用5%奶粉（w/v）的PBS緩衝液阻斷。將噬菌體上清液用MPBST阻斷30分鐘，然後添加到ELISA板的孔中1小時。用PBST洗滌後，使用HRP軛合的抗M13抗體（通用電氣醫療集團）和3,3',5,5'-四甲基聯苯胺底物（目錄號：00-4201-56，美國的伊生物技術公司（eBioscience））檢測結合的噬菌體。使用Hut78/huCD137細胞藉由流式細胞術進一步驗證ELISA陽性殖株。將表現CD137的細胞（10 5個細胞/孔）與ELISA陽性噬菌體上清液一起孵育，然後與Alexa Fluro-647標記的抗M13抗體（通用電氣醫療集團）結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。
挑選在FACS篩選中顯示陽性信號並結合huCD137和cynoCD137但不結合huOX40和huCD40的殖株並對其進行定序。鑒定了來自93個陽性殖株的約76個獨特序列，並且許多株來自兩個子文庫HC-10和HC-13（圖1A至圖1B）。 Fc融合VH抗體的表現和純化
藉由比較序列同源性分析VH序列，並基於序列相似性分組。根據Kabat（Wu和Kabat (1970) J. Exp. Med.[實驗醫學雜誌] 132:211-250）和IMGT（Lefranc (1999) Nucleic Acids Research[核酸研究] 27:209-212）系統藉由序列注釋和藉由基於互聯網的序列分析來定義互補決定區（CDR）。兩個代表性靠前殖株BGA-7207和BGA-4712的胺基酸和DNA序列在下表5中列出。在藉由SPR對結合曲線進行序列檢查和分析之後，然後使用內部開發的表現載體將抗huCD137 VH結構域抗體構建為人Fc融合VH抗體形式（VH-Fc）。如圖2A所示，VH結構域抗體在人Fc的N末端與其間的G4S（SEQ ID NO: 246）連接子融合。使用了人IgG1（SEQ ID NO: 85）的Fc無效形式（沒有與FcγR結合的惰性Fc）。藉由轉染到293G細胞中並藉由使用蛋白A柱（目錄號17543802，通用生命科學公司）純化來實現Fc融合VH抗體的表現和製備。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。 [表5].兩種所選擇的抗huCD137 VH結構域抗體的胺基酸和DNA序列
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-7207 SEQ ID NO: 9 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRLDTTEVGWVRQAPGKGLEWVSTIMGISGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVDSLFDDSAVFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 10 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCAGATTGGACACCACCGAAGTAGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCACCATCATGGGTATTAGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCGATTCCCTCTTTGATGACAGCGCCGTTTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 81 VH-Fc EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRLDTTEVGWVRQAPGKGLEWVSTIMGISGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVDSLFDDSAVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 82 VH-Fc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCAGATTGGACACCACCGAAGTAGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCACCATCATGGGTATTAGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCGATTCCCTCTTTGATGACAGCGCCGTTTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
BGA-4712 SEQ ID NO: 19 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 20 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 83 VH-Fc EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 84 VH-Fc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
惰性Fc SEQ ID NO: 85 Fc無效形式IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 86 Fc無效形式IgG1 DNA GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
實例4.    抗huCD137 VH結構域抗體的功能篩選
首先使用含有VH-Fc蛋白的上清液對所選擇的具有強激動作用的抗huCD137 VH結構域抗體進行功能篩選。簡言之，將96孔白色/透明底板（賽默飛世爾科技公司）與3 µg/ml抗hu CD3（英傑公司，目錄號16-0037-85）以50 µl/孔預孵育5分鐘，然後用PBS緩衝液洗去。接下來，將Hut78/huCD137細胞以5 × 10 5個細胞/ml重新懸浮，並以50 µl/孔（25,000孔/孔）直接鋪板到預包被的板中。將含有各種VH-Fc蛋白的上清液與細胞混合。替代性地，對於具有Fc融合的純化的VH結構域抗體，以25、5、1、0.2、0.04、0.008或0.0016 µg/ml以50 µl/孔一式兩份添加純化的VH-Fc蛋白製劑的劑量滴定。添加山羊抗hu IgG（H&L）聚苯乙烯顆粒（6.46 µm）（目錄號HUP-60-5，球體技術公司（Spherotech））作為交聯劑。將測定板在37°C下孵育過夜，並在24小時後測量IL-2的濃度。將數據繪製為與僅含培養基的孔中的濃度相比的IL-2倍數增加。圖2B示出了使用含有VH-Fc蛋白的上清液的代表性篩選結果，並且其中一個殖株BGA-4712已經顯示能夠以劑量依賴性方式刺激Hut78/huCD137細胞中的IL-2產生（圖2C）。 實例5.    純化的抗huCD137 VH結構域抗體的表徵 通過ELSIA表徵純化的抗體
對於抗原ELISA，用抗原包被Maxisorp免疫板，並用3% BSA（w/v）的PBS緩衝液（阻斷緩衝液）阻斷。將單株VH結構域抗體用阻斷緩衝液阻斷30 min，然後添加到ELISA板的孔中1小時。用PBST洗滌後，使用HRP軛合的抗人IgG抗體（西格瑪公司，A0170）和3,3',5,5'-四甲基聯苯胺底物（目錄號：00-4201-56，美國的伊生物技術公司）檢測結合的抗體。所有選擇的殖株都顯示與cynoCD137發生交叉反應，而不與人OX40 ECD和人CD40 ECD結合。 通過SPR分析表徵純化的抗體
藉由使用BIAcoreTM T-200（通用生命科學公司）的SPR測定對抗huCD137 VH結構域抗體進行表徵。簡言之，將抗人IgG（Fc）抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片（目錄號：BR100839，通用生命科學公司）上。抗huCD137結構域抗體流過晶片表面並被抗人IgG（Fc）抗體捕獲。然後使人CD137 ECD-mIgG2a的連續稀釋液（6.0 nM至2150 nM）流過晶片表面，並藉由使用一對一Langmuir結合模型（BIA評估軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（k on）和解離速率（k off）。將平衡解離常數（K D）計算為比率k off/k on。 通過流式細胞術表徵純化的抗體
對於流式細胞術，將人CD137 +表現細胞（10 5個細胞/孔）與各種濃度的純化的VH結構域抗體一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司（BioLegend, USA））結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司）定量細胞螢光。配體競爭也應用於基於流式細胞術的測定。簡言之，在連續稀釋的人CD137配體mIgG2a存在下，將Hut78/huCD137與Fc融合VH結構域抗體（VH-Fc）一起孵育，隨後用Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司）進行檢測。
然後表徵所選擇的VH結構域抗體的親和力、細胞結合和配體競爭。一個代表性靠前殖株BGA-4712的SPR研究、FACS分析和配體競爭結果在圖3中示出。 實例6.     使用抗CD137 VH結構域抗體BGA-4712和抗CEA抗體構建CD137xCEA多特異性抗體
為了探索比單一抗體治療更有效的基於CD137的作用機制（MOA），已經構建並測試了多種利用抗huCD137 VH結構域抗體的多特異性形式。在此，已經採用多種形式來產生基於CD137的T細胞接合劑（TCE），其中第一抗原結合結構域針對腫瘤相關抗原（TAA），而第二抗原結合結構域靶向CD137活化受體。例如，抗CEA抗體的第一抗原結合結構域（SEQ ID NO: 87和89）用於與抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712的第二抗原結合結構域（SEQ ID NO: 17）以如下所示的具體定義的形式配對（表6）。對於該構建體，使用惰性Fc（SEQ ID NO: 85）。藉由轉染到293G細胞中並藉由使用蛋白A柱（目錄號17543802，通用生命科學公司）純化來實現該等多特異性抗體的表現和製備。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。 形式A（A-CD137xCEA）
形式A提供具有Fab × VH組態的對稱IgG樣多特異性分子。如圖4A所示，抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712與抗CEA抗體的Fc（CH3結構域）的c末端融合，在它們（SEQ ID NO: 89和91）之間具有一個G4S連接子。 形式B（B-CD137xCEA）
形式B也提供具有Fab × VH組態的對稱IgG樣多特異性分子。如圖4B所示，抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712與抗CEA抗體的輕鏈（Cκ）的c末端融合，在它們（SEQ ID NO: 87和93）之間具有一個G4S連接子。 形式C（C-CD137xCEA）
形式C提供具有Fab × VH組態的對稱VH抗體樣多特異性分子。如圖4C所示，抗CEA抗體的Fab區與抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712的VH的N末端融合，在它們（SEQ ID NO: 89和95）之間具有一個G4S連接子。 形式D（D-CD137xCEA）
形式D也提供具有Fab × VH組態的對稱IgG樣多特異性分子。如圖4D所示，抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712與抗CEA抗體的重鏈（Vh）的N末端融合，在它們（SEQ ID NO: 89和97）之間具有一個G4S連接子。
各種CD137xCEA多特異性抗體的產率和生化特性總結在表7中。對於兩種分子A-CD137xCEA和D-CD137xCEA，基於SEC-HPLC譜，單體都高於95%（表7）。藉由基於流式細胞術的測定，證明了在形式A中抗CEA臂的親和力降低非常小，而在形式D中抗CEA臂的親和力顯著降低（圖5A）。還證明了在形式A中CD137臂的親和力降低，而在形式D中的影響很小或沒有影響（圖5D）。 [表6].多種形式的CD137xCEA多特異性抗體的胺基酸和DNA序列
構建體 鏈 SEQ ID NO 序列
A-CD137xCEA A-BGA-4712/CEA重鏈AA SEQ ID NO: 91 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
A-BGA-4712/CEA重鏈DNA SEQ ID NO: 92 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
抗CEA Ab輕鏈AA SEQ ID NO: 89 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CEA Ab輕鏈DNA SEQ ID NO: 90 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
B-CD137xCEA 抗CEA Ab重鏈AA SEQ ID NO: 87 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗CEA Ab重鏈DNA SEQ ID NO: 88 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
B-BGA-4712/CEA輕鏈AA SEQ ID NO: 93 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
B-BGA-4712/CEA輕鏈DNA SEQ ID NO: 94 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGCGGGGGAGGCGGGTCCGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
C-CD137xCEA C-BGA-4712/CEA重鏈AA SEQ ID NO: 95 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSSSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
C-BGA-4712/CEA重鏈DNA SEQ ID NO: 96 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACGGGGGAGGCGGGTCCGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGTCTGGTGGAGGCGGTTCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCTGCTGCCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
抗CEA Ab輕鏈AA SEQ ID NO: 89 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CEA Ab輕鏈DNA SEQ ID NO: 90 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
D-CD137xCEA D-BGA-4712/CEA重鏈AA SEQ ID NO: 97 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSSSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
D-BGA-4712/CEA重鏈DNA SEQ ID NO: 98 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGTCCGGTGGAGGCGGTTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
抗CEA Ab輕鏈AA SEQ ID NO: 89 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CEA Ab輕鏈DNA SEQ ID NO: 90 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
[表7].產率和生化特性的總結
抗體形式 產率（mg/L） HMW（%） 單體（%） LMW（%） 人CD137 ECD-mIgG2a SPR KD（M） CT26/CEA EC50（μg/ml） Hut78/huCD137 EC50（μg/ml）
A-CD137xCEA 30.00 1.28 96.34 2.39 3.60E-07 0.75 0.57
D-CD137xCEA 11.00 1.80 98.19% 0.0 7.80E-08 3.78 2.28
實例7.     基於CD137的多特異性抗體A-CD137xCEA以TAA（腫瘤相關抗原）依賴性方式活化CD137 基於CD137的多特異性抗體在CD137表現細胞中誘導CD137活化
為了測試基於CD137的多特異性抗體誘導CD137 +細胞對CEA +腫瘤細胞刺激的反應的能力，使用Hut78/huCD137測試CD137活化。根據先前描述的方案（Zhang等人, Blood. [血液] 2005 106(5):1544-51），藉由反轉錄病毒轉導到CT26細胞（ATCC CRL-2638）中產生CEA表現CT26（CT26/CEA）細胞。在OKT3預包被的96孔板中，在CD137xCEA多特異性構建體的存在下，將Hut78/huCD137細胞與CT26/CEA或CT26（CEA陰性）細胞共培養過夜，並測量介白素-2（IL-2）作為Hut78/huCD137細胞中CD137活化的指示劑。如圖6A所示，在CEA +CT26/CEA細胞存在下，A-CD137xCEA以劑量依賴性方式誘導Hut78/huCD137細胞分泌IL-2。在沒有CEA +CT26/CEA細胞的情況下沒有觀察到IL-2的誘導。 基於CD137的多特異性抗體在人周邊血單核細胞（PBMC）中誘導CD137活化
藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司（Sigma-St. Louis MO））分離法從健康供體的全血中分離人周邊血單核細胞（PBMC）。根據先前描述的方案（Zhang等人, Blood. [血液] 2005 106(5):1544-51），藉由反轉錄病毒轉導到HEK293（ATCC CRL-1573）中產生OS8表現HEK293（HEK293/OS8）細胞。為了確定CD137xCEA多特異性抗體是否可以在CEA +腫瘤細胞存在下活化T細胞，將PBMC（2 × 10 5個/孔）與HEK293/OS8和CT26/CEA細胞在CD137xCEA多特異性抗體存在下共培養48小時。藉由測量PBMC中的IFN-γ來確定CD137xCEA多特異性抗體對CD137的活化。結果表明，在CEA表現細胞存在下，A-CD137xCEA可以在PBMC中誘導顯著的CD137活化（圖6B）。 實例8.     翻譯後修飾的去除
為了去除翻譯後修飾（PTM）位點並改善表現，藉由在HCDR和基於多特異性構建體A-CD137xCEA中的BGA-4712序列的構架區中引入突變來進行工程化。取代包括BGA-4712 VH區中的胺基酸改變F28R、M29T、V35M、D62E、S75A和N84S。工程化產生A-CD137xCEA-M1（M28T、V34M、D62E、S75A和N84S）、A-CD137xCEA-M2（F27R、M28T、V35M、D62E、S75A和N84S）、A-CD137xCEA-M3（M28T、D62E、S75A和N84S）、A-CD137xCEA-M4（F27R、M28T、D62E、S75A和N84S）、A-CD137xCEA-M5（M28T、V35M、S75A和N84S）、A-CD137xCEA-M6（F27R、M28T、V35M、S75A和N84S）、A-CD137xCEA-M7（M28T、S75A和N84S）和A-CD137xCEA-M8（F27R、M28T、S75A和N84S），並且所有抗體都與親本A-CD137xCEA具有相似的結合特異性，並且沒有任何改變消除結合。在保持特異性的同時，還考慮了胺基酸組成和表現水平。使用在特定位置含有突變的引物和定點誘變套組（kit）（目錄號FM111-02，中國北京的全式金公司（TransGen, Beijing, China））進行所有突變。藉由序列分析驗證所需的突變。該等A-CD137xCEA變體在如實例6所述之結合（表8）和功能測定中測試。對於親和力測定，A-CD137xCEA被抗人Fc表面捕獲，並用於基於表面電漿共振（SPR）技術的親和力測定。表8總結了SPR測定的變體結合概況的結果。還證實了上述所有變體與Hut78/huCD137細胞的結合（圖8）。結果顯示A-CD137xCEA-M3（SEQ ID NO: 101-102）中的BGA-4712-M3（SEQ ID NO: 24-25）與親本抗體BGA-4712（SEQ ID NO: 19-20）相當。BGA-4712-M3的序列揭露於表9中。還證明了A-CD137xCEA-M3可以在如上文實例7（圖8）中所述之基於PBMC的細胞介素釋放測定中誘導CD137活化。結果進一步證明，在CEA +CT26/CEA細胞存在下，A-CD137xCEA-M3可以劑量依賴性方式誘導IL-2。在不存在CEA表現細胞的情況下，沒有觀察到IL-2的誘導，因此沒有觀察到CD137的活化（圖8）。 [表8].藉由SPR比較A-CD137xCEA結合親和力
抗huCD137 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
A-CD137xCEA-M1 7.77E + 03 4.55E-03 5.86E-07
A-CD137xCEA-M2 4.52E + 04 1.05E-02 2.32E-07
A-CD137xCEA-M3 1.05E + 04 2.67E-03 2.55E-07
A-CD137xCEA-M4 1.27E + 05 2.47E-02 1.94E-07
A-CD137xCEA-M5 8.89E + 03 5.74E-03 6.46E-07
A-CD137xCEA-M6 1.48E + 04 1.14E-02 7.67E-07
A-CD137xCEA-M7 1.13E + 04 3.00E-03 2.66E-07
A-CD137xCEA-M8 2.90E + 05 5.34E-02 1.84E-07
A-CD137xCEA 5.97E + 03 2.15E-03 3.60E-07
[表9].BGA-4712-M3的序列資訊
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-4712-M3 SEQ ID NO: 24 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 25 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
BGA-4712-M3-mutFc SEQ ID NO: 99 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 100 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
A-CD137xCEA-M3 SEQ ID NO: 101 AA GSATMDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 102 DNA GGATCCGCCACCATGGATATGAGAGTTCCTGCTCAATTGCTGGGGTTGCTCTTGCTCTGGTTTCCTGGCTCGAGAAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGTGAAAGCTTCGTCAG
實例9.     駱駝化
重鏈抗體（VHH）係一種單結構域抗體，並且可以從駱駝和美洲駝產生，因為它們缺乏CH1結構域（Harmsen等人, (2007) Appl Microbiol Biotechnol [應用微生物學與生物技術], 77, 13-22；Kastelic等人, (2009) J Immunol Methods [免疫學方法雜誌], 350, 54-62）。
VHH係能夠結合抗原的最小（約120個胺基酸）抗體片段。除了較小的尺寸外，VHH通常比常規抗體更穩定和可溶。因此，該等單結構域抗體可以作為雙特異性和多特異性構建體的模組化構建單元起作用（Els Conrath等人, (2001) J Biol Chem [生物化學雜誌], 276, 7346-50）。已經開發了「駱駝化」策略來產生在分離的人VH結構域上具有有利性質的自主人VH結構域抗體（aVH）（Riechmann等人, (1999) J Immunol Methods [免疫學方法雜誌], 231, 25-38）。人們普遍認為，種系中的一系列取代（Val37至Phe/Tyr，Gly44至Glu，Leu45至Arg，Trp47至Gly/Leu，Trp103至Arg/Gly）促成了那些非常理想的性質（Vincke等人, (2009) J Biol Chem [生物化學雜誌], 284, 3273-84；Nguyen等人, (2000) Embo J [歐洲分子生物學學會會刊], 19, 921-30；Kunz等人, (2018) Sci Rep [科學報告], 8, 7934）。基於分離的人VH結構域產生結合物的其他嘗試也已經嘗試並取得了成功（Jespers等人, (2004a) Nat Biotechnol [自然-生物技術], 22, 1161-5；Jespers等人, (2004b) J Mol Biol [分子生物學雜誌], 337, 893-903；Barthelemy等人, (2008) J Biol Chem [生物化學雜誌], 283, 3639-54）。已經證明，儘管來自許多人類家族的共有結構域在分離表現時容易聚集，但人VH3具有更有利的性質（Ewert等人, (2002) Biochemistry [生物化學], 41, 3628-36；Ewert等人, (2003) BJ Mol Biol [分子生物學雜誌], 325, 531-53）。
為了改善所選擇的VH結構域抗體的生物化學和生物物理性質，基於BGA-4712-M3（SEQ. NO. 24-25）應用「駱駝化」策略。考慮因素包括胺基酸組成、熱穩定性（Tm）、表面疏水性和等電點（pI），同時保持功能活性。取代主要在框架2（FW2）和框架4（FW4）中進行，諸如V37F或Y、G44/E、L45/R或G或Y，以及W47/G或S或F或L或R或Y、W103/R（Kabat定義，表10）。如前在實例6中所述，變體以Fc融合VH和A-CD137xCEA多特異性抗體形式表現。鑒定了沒有顯著親和力降低的取代（表11）。結果證明，W103R在BGA-4712-M3中的變化顯示出改善的溶解度、非特異性結合和產率，並且被命名為BGA-7556。總之，結果顯示形式A-CD137xCEA（SEQ. NO. 107-108）中的BGA-7556（SEQ. NO. 103-104）在結合親和力方面與親本抗體BGA-4712（SEQ. NO. 19-20）非常相似。BGA-7556的序列資訊列於表12中。 [表10].用於取代的殘基之總結
殘基 AA取代
V37 F、Y
G44 E
L45 R、G、Y
W47 G、S、F、L、R、Y
W103 R
[表11].結合親和力的比較
抗體 形式 SEC-HPLC（%） KD (M) Hut78/huCD137細胞的EC50（µg/ml）
BGA-4712-M3 Fc融合VH 97.98 1.69E-07 2.37
BGA-4712-M3 形式A-CD137xCEA 97.06 2.55E-07 0.52
BGA-7556 Fc融合VH 98.36 2.00E-07 5.71
BGA-7556 形式A-CD137xCEA 92.30 6.69E-07 3.23
[表12].Fc融合VH和A-CD137xCEA多特異性抗體形式中BGA-4712-M3和BGA-7556的序列資訊
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-7556 SEQ ID NO: 103 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 104 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BGA-7556-mutFc SEQ ID NO: 105 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 106 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
形式A- BGA-7556    SEQ ID NO: 107 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 108 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
實例10.   親和力成熟文庫的產生
為了進一步探索潛在有效的基於CD137的作用機制（MOA），我們旨在藉由噬菌體展示產生具有改善的藥物開發性的親和力成熟的BGA-4712-M3變體。另外，我們推測使用與CH3結構域（SEQ ID NO: 109-110）的c-末端融合的BGA-4712-M3形式的親和力成熟文庫可以使我們獲得不具有CH3干擾的親和力成熟變體的最高可能性（圖9），如表13所示。文庫構建如前所述。簡言之，藉由標準分子生物學技術使用噬菌粒載體pCANTAB 5E（通用電氣醫療集團（GE Healthcare））構建噬菌粒，該噬菌粒被設計成在M13噬菌體的表面上展示CH3-G4S（連接子）-BGA-4712-M3作為與基因-3次要外殼蛋白片段的N末端的融合體。在基因3序列之前有一個琥珀終止密碼子，以允許直接從噬菌粒殖株表現CH3融合蛋白的二聚體。使用噬菌粒作為模板來構建含有2.0 × 10 8個獨特成員的噬菌體展示文庫。所有三個CDR隨機化，但每個CDR在每個殖株中具有最多一個突變，HCDR3除外，其可具有兩個同時突變。每個位置用編碼任何胺基酸的NNK密碼子（IUPAC編碼）或琥珀終止密碼子隨機化。組合的VH文庫設計具有5.0 × 10 6個獨特全長殖株的潛在多樣性和分別具有0、1、2和3個突變的殖株的約0.02%、1.1%、17%和82%的預期分佈。由於HCDR3區域中的引物設計，預期一小部分重鏈殖株具有4個突變。藉由如Meetei等人, (1998) Anal. Biochem [分析生物化學], 264, 288-91、Meetei等人, (2002) Methods Mol Biol [分子生物學方法], 182, 95-102）所述之聚合酶鏈反應經由多個位點特異性突變並經由剪接重疊延伸PCR進行HCDR1、HCDR2和HCDR3區的隨機化。然後將所得片段凝膠純化，並在NcoI/NotI消化後與pCANTAB 5E連接。藉由電穿孔將純化的連接物轉化到TG1細菌中。來自每個文庫的48個殖株的定序證實了每個位置的隨機化（未示出），儘管由於取樣深度有限，並非在每個位置都可觀察到所有的胺基酸突變。超過61%的文庫具有全長隨機殖株，足以覆蓋設計的所有潛在多樣性，即使在寡核苷酸合成和文庫構建中存在適度的摻入偏差，也會產生2.0 × 10 8個獨立殖株。 [表13].序列資訊
構建體 SEQ ID NO    序列
CH3 SEQ ID NO: 109 AA GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 110 DNA GGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
CH3- BGA-4712-M3 SEQ ID NO：  111 AA GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：  112 DNA GGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
實例11.   親和力成熟的BGA-4712-M3變體的產生 文庫選擇和篩選
使用標準方案藉由噬菌體展示進行親和力成熟的BGA-4712-M3變體的產生（Silacci等人, (2005) Proteomics [蛋白質組學], 5, 2340-50；Zhao等人, (2014) PLoS One [公共科學圖書館：綜合], 9, e111339）。對於第一輪和第二輪選擇，在免疫管（目錄號470319，賽默飛世爾科技公司）中對固定化的人CD137 ECD-mIgG2a或人CD137 ECD-his進行熱變性選擇（Jespers等人, (2004a) Nat Biotechnol [自然-生物技術], 22, 1161-5）。簡言之，免疫管用人CD137 ECD-mIgG2a或人CD137 ECD-HIS（10 ug/ml的PBS溶液）在4°C下預包被過夜。將親和力成熟文庫加熱至70°C持續10 min，然後冷卻至4°C持續30 min。將熱變性的噬菌體文庫與預包被的免疫管一起孵育1小時。對於第三輪和第四輪選擇，使用Hut78/huCD137細胞和HEK293細胞作為耗竭細胞進行細胞淘選。在四輪篩選之後，挑選單個殖株並如標準方案所述製備含有噬菌體的上清液。對ELISA陽性殖株定序，並分析突變位點。 CDR中的突變頻率分析
在四輪選擇之後，每個HCDR中的突變頻率相對較高。HCDR1的突變率為78.13%，HCDR2為93.75%，HCDR3為96.85%。HCDR1包含更多樣的改變。殘基29在11.45%的殖株中從Leu突變為Ile，在30.21%的殖株中從Leu突變為Val。位置26、28、30和31的突變頻率不高，並且沒有明顯的模式，其包括大的、疏水的極性殘基，諸如Tyr、Phe、Thr和Asn。對於HCDR2，F55在90.63%殖株中出現突變。殘基55從殖株中的Phe突變為Asn（22.18%）、Phe突變為Lys（22.18%）、Phe突變為Ser（11.46%）和Phe突變為Gln（9.38%）。也有少量含有其他殘基改變的殖株，諸如Leu、Gly、Tyr、Thr和His。HCDR3在至少90%的殖株中具有發生在三個位點的改變，並且它們中的兩個在約50%的殖株中發生了額外的突變。殘基109從Phe突變為類似的疏水殘基，諸如Tyr和Trp。殘基99從Val突變為Tyr（15.63%）和從Val突變為Ile（28.13%）。殖株的殘基110從Tyr變為Thr（55.20%）和從Tyr變為Leu（7.29%）。圖10示出了四輪選擇後HCDR區的序列。 所選擇的變體的表現
所有突變都被引入BGA-7556（SEQ ID NO: 103-104）中以產生親和力成熟的變體，BGA-3386除外，其突變被引入BGA-4712-M3（SEQ ID NO: 24-25）中。所有變體均以單株抗體（VH-Fc）和它們相應的多特異性抗體形式A（A-CD137xCEA）表現，如實例5和6所述。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-10 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。 所選擇的變體的表徵
藉由使用BIAcore™ T-200（通用生命科學公司）的SPR測定和流式細胞術進行親和力成熟殖株的親和力比較，如實例5所述。簡言之，將抗人IgG（Fc）抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片（目錄號：BR100839，通用生命科學公司）上。抗huCD137單株抗體或多特異性抗體流過晶片表面並被抗人IgG（Fc）抗體捕獲。然後使人CD137 ECD-mIgG2a的連續稀釋液（6.0 nM至2150 nM）流過晶片表面，並藉由使用一對一Langmuir結合模型（BIA評估軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（k on）和解離速率（k off）。將平衡解離常數（K D）計算為比率k off/k on。對於流式細胞術，將表現CD137的細胞（10 5個細胞/孔）與各種濃度的純化的抗體一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司）結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司）定量細胞螢光。此外，對於多特異性抗體，還使用內部製備的重組CEA蛋白藉由SPR測定測量對人CEA的親和力。還藉由流式細胞術證明了與表現CEA的細胞的結合。序列資訊顯示在表16中，抗huCD137抗體的SPR測定的結合概況的結果總結在表14和表15中。選擇對人CD137具有不同親和力的三種變體用於進一步表徵。 [表14].親和力成熟的BGA-4712變體作為Fc融合體的親和力比較
殖株編號 形式 SEC-HPLC（%） KD (M)
BGA-5623 Fc融合VH 97.62 5.03E-08
BGA-2690 97.82 6.75E-05
BGA-3849 98.75 7.63E-08
BGA-7916 97.57 8.77E-08
BGA-4988 97.71 1.03E-06
BGA-5164 99.07 1.38E-05
BGA-3953 97.29 4.83E-08
BGA-5385 97.86 1.00E-07
BGA-9468 97.56 1.90E-07
BGA-3285 97.83 1.86E-07
BGA-9442 98.6 1.51E-07
BGA-7746 97.68 1.93E-07
BGA-8425 98.2 9.34E-08
BGA-6468 92.00 1.12E-08
BGA-4712-M3 97.98 1.69E-07
BGA-7556 98.36 2.00E-07
[表15].親和力成熟的BGA-4712變體的親和力比較
殖株編號 形式 SEC-HPLC（%） KD (M)
形式A -BGA-5623 A-CD137xCEA 94.55 9.48E-08
形式A - BGA-2690 - -
形式A - BGA-3849 - -
形式A- BGA-7916 98.38 2.03E-07
形式A- BGA-4988 98.43 -
形式A - BGA-5164 98.36 -
形式A - BGA-3953 96.19 1.15E-07
形式A - BGA-5385 97.18 1.54E-07
形式A - BGA-9468 98.55 8.73E-07
形式A - BGA-3285 97.32 7.98E-07
形式A - BGA-9442 98.67 1.64E-07
形式A - BGA-7746 97.66 2.45E-07
形式A - BGA-8425 95.69 1.89E-07
形式A - BGA-3386 87.00 2.14E-08
形式A - BGA-4712-M3 97.06 2.89E-07
形式A - BGA-7556 92.3 6.49E-07
[表16].親和力成熟的BGA-4712變體的序列資訊
SEQ ID NO: 33 BGA-5623 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 34 BGA-5623 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 113 BGA-2690 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSREDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGSSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 114 BGA-2690 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCAGAGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTCGGTTCTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 115 BGA-3849 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSHEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 116 BGA-3849 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCCATGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCCGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 117 BGA-7916 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 118 BGA-7916 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 119 BGA-4988 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDRGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 120 BGA-4988 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCGGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 121 BGA-5164 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDHGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 122 BGA-5164 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 123 BGA-3953 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 124 BGA-3953 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 125 BGA-5385 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDHGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVIYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 126 BGA-5385 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTATCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 127 BGA-9468 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHSGGGVTFDLRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 128 BGA-9468 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATTCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 129 BGA-3285 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 130 BGA-3285 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 131 BGA-9442 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDLRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 132 BGA-9442 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 133 BGA-7746 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 134 BGA-7746 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCAGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACGCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 135 BGA-8425 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 136 BGA-8425 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 137 BGA-3386 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 138 BGA-3386 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 139 BGA-5623-mutFc-AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 140 BGA-5623-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 141 BGA-2690- mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSREDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGSSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 142 BGA-2690 mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCAGAGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTCGGTTCTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 143 BGA-3849-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSHEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 144 BGA-3849 mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCCATGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCCGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 145 BGA-7916-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDTRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 146 BGA-7916-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 147 BGA-4988-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDRGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDTRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 148 BGA-4988-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCGGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
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SEQ ID NO: 169 形式A BGA-2690 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSREDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGSSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 170 形式A BGA-2690 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCAGAGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTCGGTTCTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 172 形式A BGA-3849 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCCATGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCCGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 174 形式A BGA-7916 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATtcGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 176 形式A BGA-4988 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCGGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 178 形式A BGA-5164 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGcTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 179 形式A BGA-3953 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 180 形式A BGA-3953 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATtcGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 181 形式A BGA-5385 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDHGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVIYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 182 形式A BGA-5385 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTATCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 183 形式A BGA-9468 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHSGGGVTFDLRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 184 形式A BGA-9468 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATTCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 185 形式A BGA-3285 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 186 形式A BGA-3285 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 187 形式A BGA-9442 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDLRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 188 形式A BGA-9442 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 189 形式A BGA-7746 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 190 形式A BGA-7746 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCAGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACGCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 191 形式A BGA-8425 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 192 形式A BGA-8425 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 193 形式A BGA-3386 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 194 形式A BGA-3386 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
實例13.抗CD137抗體BGA-5623之結合概況
BGA-5623由人IgG1 Fc融合體產生，並藉由使用BIAcore™ T-200（通用生命科學公司）的SPR測定表徵其結合動力學。簡言之，將抗人IgG（Fc）抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片（目錄號：BR100839，通用生命科學公司）上。抗huCD137結構域抗體流過晶片表面並被抗人IgG（Fc）抗體捕獲。然後使人CD137 ECD-mIgG2a或cyno CD137 ECD-mIgG2a的連續稀釋液（6.0 nM至2150 nM）流過晶片表面，並藉由使用一對一Langmuir結合模型（BIA評估軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（k on）和解離速率（k off）。將平衡解離常數（K D）計算為比率k off/k on。結果表明，BGA-5623對cynoCD137的親和力高於對huCD137的親和力，如下表17所示。為了評估抗huCD137 VH結構域抗體與活細胞上的天然huCD137的結合活性，轉染Hut78細胞以過表現人CD137。將表現Hut78/huCD137的活細胞接種在96孔板中，並與連續稀釋的抗huCD137 VH結構域抗體一起孵育。將山羊抗人IgG用作二抗來檢測抗體與細胞表面的結合。與人天然CD137的劑量依賴性結合的EC 50值藉由用GraphPad Prism™將劑量反應數據與四參數邏輯模型擬合來確定。如圖26所示，BGA-5623對活細胞上的天然CD137表現出高結合親和力。 [表17].藉由SPR的親和力比較
樣本 種類 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
BGA-5623（IgG1） huCD137 4.05E + 04 3.22E-03 7.94E-08
cynoCD137 1.62E + 05 1.97E-03 1.22E-08
[表18].胺基酸和DNA序列
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-5623 SEQ ID NO: 33 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 34 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 195 IgG1 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 196 IgG1 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 197 IgG4 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 198 IgG4 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAATCCAAGTATGGTCCGCCATGTCCACCGTGCCCGGCACCCGAGTTTTTGGGAGGGCCTAGTGTGTTTTTGTTTCCTCCTAAGCCAAAGGACACGCTTATGATTAGTCGCACACCCGAGGTTACCTGTGTAGTGGTGGACGTATCACAAGAGGATCCGGAAGTCCAATTTAATTGGTACGTCGACGGAGTGGAAGTCCACAATGCAAAGACCAAGCCTAGGGAAGAACAGTTCAATTCTACCTATCGCTGGTCTGTACTCACTGTACTCCACCAGGATTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAATGCAAGGTTTCCAACAAAGGGCTCCCCTCTTCCATTGAGAAAACTATTAGCAAGGCTAAAGGCCAACCCAGAGAACCACAGGTTTATACCCTTCCACCTTCCCAGGAGGAGATGACGAAGAATCAGGTTAGTCTTACGTGCCTCGTTAAAGGATTCTACCCTTCAGATATCGCAGTTGAATGGGAGTCTAACGGGCAACCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCGCCGGTGCTGGACTCAGATGGTAGTTTCTTTCTTTACAGTCGGCTTACCGTCGACAAGTCACGCTGGCAGGAGGGAAATGTATTCTCCTGCAGCGTAATGCACGAAGCTCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCACTGAGCCTTTCTCTGGGTAAG
實例14.   BGA-5623之表位作圖
為了表徵BGA-5623的結合表位，基於來自先前報導的CD137的晶體結構的資訊（Bitra等人, (2018) J Biol Chem [生物化學雜誌], 293, 9958-9969；Chin等人, (2018) Nat Commun [自然通訊] 9, 4679），將人CD137的17個胺基酸殘基單獨突變為丙胺酸以產生17個單突變huCD137變體。
CD137突變體與野生型CD137一起在HEK293細胞（ATCC CRL-1573）中瞬時表現。藉由流式細胞術分析它們被BGA-5623識別和結合。藉由使用公開可獲得的烏瑞魯單抗序列在內部產生的烏瑞魯單抗類似物（SEQ ID NO: 199-202）用於同一測定以監測CD137突變體的表現。在該測定中，將人CD137或CD137突變體表現細胞（10 5個細胞/孔）與2 µg/ml純化的BGA-5623-mutFc（Fc融合VH Ab）或烏瑞魯單抗類似物一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司）結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司）定量細胞螢光。所有結果用野生型CD137結合信號的螢光讀數平均值作為標準進行標準化。為了簡化數據分析，如果特異性突變型CD137的抗體的FACS結合信號下降到或低於25%，則該位點的胺基酸被認為對於表位係關鍵的。如圖12A所示，BGA-5623的表位在CD137的胺基酸F36、I44、P47、P49和S52處具有重要的結合殘基。
為了進一步研究BGA-5623表位，表現並純化具有單AA取代的人CD137 ECD突變體以準備用於ELISA。此外，藉由使用可公開獲得的烏托魯單抗序列在內部產生烏托魯單抗類似物抗體（SEQ ID NO: 203-206）。藉由直接ELISA，藉由BGA-5623分析CD137突變體和野生型CD137的結合。簡言之，將各50 ng野生型或突變型CD137包被在ELISA板中。阻斷後，向板中加入100 μl濃度為2 μg/ml的BGA-5623-mutFc、烏瑞魯單抗類似物或烏托魯單抗類似物抗體，並藉由HRP-連接的二抗檢測各抗體的結合信號。在使用野生型或突變型huCD137的ELISA結合測定中，胺基酸F36A、P47A和P49A顯著削弱CD137與BGA-5623的結合（圖12A-B）。在胺基酸F36A處的改變僅輕微降低了烏瑞魯單抗或烏托魯單抗類似物的結合，這可能表明F36A在CD137的構象完整性中起關鍵作用。相比之下，在胺基酸P47A或P49A處的改變均不破壞烏瑞魯單抗或烏托魯單抗類似物與CD137的結合，這表明BGA-5623、烏瑞魯單抗類似物或烏托魯單抗具有不同的表位。該數據表明，胺基酸F36A、P47A和P49A係抗體BGA-5623的表位中的關鍵殘基。圖13所示的CD137的分子模型顯示，當CD137處於其折疊構象時，胺基酸F36A、P47A和P49A彼此靠近，但位於CD137的兩個不同的結構域CRD1和CRD2中。 [表19].胺基酸和DNA序列
抗體 SEQ ID NO    序列
烏瑞魯單抗類似物 SEQ ID NO: 199 重鏈AA QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 200 重鏈DNA CAAGTTCAACTTCAGCAGTGGGGAGCGGGTCTCTTGAAGCCTAGTGAGACGCTGAGCCTGACCTGTGCAGTCTACGGGGGTTCATTTTCTGGGTACTACTGGTCCTGGATACGCCAAAGCCCAGAGAAAGGCCTGGAATGGATTGGGGAGATAAATCACGGGGGTTATGTGACATATAATCCTTCTCTTGAGAGCCGGGTCACGATATCTGTTGACACAAGTAAAAATCAGTTCTCCCTCAAACTGAGCTCCGTTACCGCAGCAGACACTGCCGTTTACTACTGTGCGCGGGACTATGGGCCAGGTAATTACGATTGGTACTTCGACCTGTGGGGTAGAGGAACGCTGGTCACTGTAAGCAGTGCATCTACAAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCCCTTGCACCATGTTCACGGAGCACTAGTGAAAGCACTGCCGCGCTCGGGTGTCTCGTTAAGGATTATTTTCCGGAGCCTGTCACTGTCTCTTGGAACTCTGGTGCACTGACATCAGGCGTTCACACGTTCCCTGCAGTACTCCAGAGCTCAGGATTGTACAGCCTGTCCAGTGTAGTTACAGTGCCTTCCTCCTCCCTTGGAACAAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCATAAGCCCAGCAATACGAAAGTAGACAAACGAGTCGAATCCAAGTATGGTCCGCCATGTCCACCGTGCCCGGCACCCGAGTTTTTGGGAGGGCCTAGTGTGTTTTTGTTTCCTCCTAAGCCAAAGGACACGCTTATGATTAGTCGCACACCCGAGGTTACCTGTGTAGTGGTGGACGTATCACAAGAGGATCCGGAAGTCCAATTTAATTGGTACGTCGACGGAGTGGAAGTCCACAATGCAAAGACCAAGCCTAGGGAAGAACAGTTCAATTCTACCTATCGCTGGTCTGTACTCACTGTACTCCACCAGGATTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAATGCAAGGTTTCCAACAAAGGGCTCCCCTCTTCCATTGAGAAAACTATTAGCAAGGCTAAAGGCCAACCCAGAGAACCACAGGTTTATACCCTTCCACCTTCCCAGGAGGAGATGACGAAGAATCAGGTTAGTCTTACGTGCCTCGTTAAAGGATTCTACCCTTCAGATATCGCAGTTGAATGGGAGTCTAACGGGCAACCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCGCCGGTGCTGGACTCAGATGGTAGTTTCTTTCTTTACAGTCGGCTTACCGTCGACAAGTCACGCTGGCAGGAGGGAAATGTATTCTCCTGCAGCGTAATGCACGAAGCTCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCACTGAGCCTTTCTCTGGGTAAG
SEQ ID NO: 201 輕鏈AA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 202 輕鏈DNA GAAATCGTGCTGACCCAATCACCTGCGACCCTCTCCCTTAGCCCTGGAGAACGAGCAACTCTCAGTTGCAGAGCAAGCCAGAGCGTCAGCTCATATCTCGCATGGTATCAACAAAAACCAGGCCAAGCTCCTAGACTGTTGATTTATGATGCCTCTAACCGGGCGACTGGCATACCAGCCCGCTTTAGCGGGTCTGGGAGTGGCACTGATTTTACGCTCACGATTTCATCTTTGGAGCCAGAAGATTTCGCTGTATACTACTGTCAACAAAGGTCAAACTGGCCGCCTGCACTTACGTTCGGCGGGGGTACCAAGGTGGAGATTAAGAGGACAGTTGCGGCGCCATCAGTTTTTATATTCCCACCCTCCGATGAGCAGTTGAAAAGTGGCACGGCATCAGTTGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTATCCACGGGAGGCGAAAGTCCAATGGAAAGTGGACAATGCGCTTCAGAGCGGGAACTCTCAGGAGAGTGTCACTGAACAGGATTCAAAGGACTCCACGTACTCACTCTCATCCACTCTCACCCTTTCAAAGGCGGATTACGAAAAGCATAAGGTCTACGCTTGTGAGGTAACACATCAGGGGCTTTCCAGTCCTGTAACCAAGAGCTTCAATCGCGGCGAATGC
烏托魯單抗類似物 SEQ ID NO: 203 重鏈AA EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 204 重鏈DNA GAAGTTCAACTGGTACAGTCCGGTGCTGAAGTTAAAAAACCCGGAGAGAGTCTGAGAATCTCTTGCAAGGGGTCTGGGTACTCTTTTAGTACATATTGGATATCTTGGGTGAGACAAATGCCGGGGAAAGGCCTCGAATGGATGGGCAAGATTTATCCCGGAGACAGCTATACAAATTACTCACCTAGTTTTCAAGGTCAGGTAACTATCAGCGCGGACAAATCCATAAGTACGGCCTATCTGCAATGGTCTTCCTTGAAGGCATCCGACACGGCGATGTATTACTGCGCAAGAGGGTATGGTATATTCGATTACTGGGGGCAGGGCACTCTCGTTACCGTGAGCAGCGCTTCAACAAAAGGCCCATCTGTCTTCCCTCTCGCGCCTTGCTCCCGCTCTACTTCAGAGTCAACAGCTGCTCTGGGGTGCTTGGTGAAGGATTACTTTCCTGAACCGGTTACTGTCAGCTGGAATTCTGGGGCTTTGACGAGCGGAGTTCACACTTTCCCAGCTGTACTGCAAAGTTCTGGACTTTACAGCTTGAGCTCCGTGGTGACAGTGCCGAGCTCAAACTTCGGTACGCAGACATATACATGCAATGTGGATCATAAACCCAGCAATACGAAAGTAGATAAGACAGTCGAAAGGAAGTGTTGTGTAGAGTGCCCACCGTGCCCCGCCCCTCCGGTTGCAGGCCCATCAGTGTTTCTCTTCCCGCCCAAACCTAAGGACACGCTGATGATTTCACGAACGCCCGAGGTCACCTGTGTCGTAGTCGATGTGTCCCATGAGGACCCAGAAGTTCAGTTCAATTGGTATGTAGACGGCGTGGAGGTACACAATGCAAAAACGAAACCACGCGAGGAACAGTTCAATAGTACGTTCCGGGTCGTGAGTGTGCTCACGGTGGTTCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAAGAATATAAGTGCAAAGTATCCAATAAAGGCCTGCCCGCACCCATCGAAAAAACTATAAGTAAAACTAAAGGGCAACCGCGAGAGCCTCAGGTCTATACTTTGCCACCGTCACGCGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTAAGTCTTACTTGCTTGGTCAAGGGGTTCTACCCCTCAGATATAGCGGTGGAGTGGGAATCCAATGGCCAACCCGAGAACAATTACAAGACAACACCACCAATGCTGGACTCTGACGGGAGTTTCTTTCTGTATAGTAAACTTACCGTCGATAAATCACGCTGGCAGCAAGGCAACGTATTCTCATGCTCAGTAATGCATGAAGCCTTGCATAATCACTACACTCAGAAAAGCCTGTCCCTCTCTCCAGGTAAG
SEQ ID NO: 205 輕鏈AA SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 206 輕鏈DNA AGCTACGAGTTGACTCAGCCACCATCCGTCAGTGTTAGCCCCGGACAGACGGCGTCAATTACTTGTAGTGGAGACAACATTGGCGATCAGTACGCCCATTGGTATCAGCAAAAACCGGGTCAATCACCAGTTCTGGTGATATATCAGGATAAGAATCGACCATCAGGGATTCCAGAGAGGTTCTCAGGTAGTAACTCAGGTAACACAGCTACTCTGACCATAAGTGGTACCCAGGCTATGGACGAAGCAGACTACTACTGCGCCACCTACACAGGCTTCGGATCACTTGCGGTTTTCGGGGGCGGAACCAAACTAACCGTTCTTGGGCAACCTAAGGCTGCCCCGTCCGTGACTCTTTTTCCTCCGTCTTCCGAAGAGCTTCAAGCCAATAAAGCAACCTTGGTATGTTTGATTTCCGATTTTTACCCTGGAGCGGTGACGGTGGCATGGAAAGCTGATTCAAGCCCTGTGAAAGCTGGGGTGGAAACTACTACGCCGTCCAAACAGAGCAATAATAAGTACGCGGCCTCCAGCTATTTGTCACTTACCCCGGAGCAATGGAAGTCACACCGAAGTTACAGTTGTCAAGTTACTCACGAAGGCAGCACTGTTGAAAAGACCGTAGCACCCACCGAATGCTCA
實例15.  配體競爭
人CD137結合其主要配體人CD137配體（CD137L），親和力較弱，Kd為約三位數M（Chin等人, (2018) Nat Commun [自然通訊] 9, 4679）。上述實例14中的表位作圖結果顯示CD137的胺基酸殘基F36A、P47A和P49A係構成BGA-5623抗體的表位的一部分的關鍵胺基酸殘基。此外，配體沿受體CRD-2的全長和CRD-3的A2模體結合CD137，並且受體與配體之間的介面主要由氫鍵和凡得瓦相互作用介導（Bitra等人, (2018) J Biol Chem [生物化學雜誌], 293, 9958-9969）。基於該數據，假設BGA-5623抗體可以阻斷CD137/CD137配體相互作用。用人IgG4 Fc融合產生BGA-5623。對於CD137配體競爭ELISA，用人CD137 ECD-mIgG2a包被Maxisorp免疫板，並用3% BSA（w/v）的PBS緩衝液（阻斷緩衝液）阻斷。將VH結構域抗體BGA-5623用阻斷緩衝液阻斷30分鐘，並在連續稀釋的人CD137配體ECD-mIgG2a存在下添加到ELISA板的孔中1小時。用PBST洗滌後，使用HRP軛合的抗人IgG抗體（西格瑪公司，A0170）和3,3',5,5'-四甲基聯苯胺底物（目錄號：00-4201-56，美國的伊生物技術公司）檢測結合的抗體（圖14A）。為了藉由流式細胞術測定CD137配體競爭，在連續稀釋的BGA-5623（IgG4）存在下，將CD137穩定轉導的細胞系Hut78/huCD137與人CD137配體ECD-mIgG2a一起孵育，然後用山羊抗鼠IgG-APC檢測（圖14B）。如圖14所示，BGA-5623與CD137配體競爭並減少CD137/CD137配體相互作用。 實例16.脫靶特異性的評估
通過ELISA評估BGA-5623的脫靶特異性。如上文實例5所述進行抗原ELISA。TNF受體家族成員諸如TNFRSF1A（CD120a）（目錄號10872-H08H，中國的義翹神州公司（Sino Biological, China））、TNFRSF1B（CD120b）（目錄號10417-H08H1，中國的義翹神州公司）、TNFRSF4（OX40）（SEQ ID NO: 77）、TNFRSF5（CD40）（SEQ ID NO: 71）、TNFRSF7（CD27）（目錄號10039-H08B1，中國的義翹神州公司）、TNFRSF9（CD137）（SEQ ID NO: 49）和TNFRSF18（GITR）（目錄號13643-H08H，中國的義翹神州公司）以10 µg/ml的濃度在4°C下包被在96孔板中過夜。添加了與野生型IgG1 Fc（SEQ ID NO: 195）融合的BGA-5623。如圖15所示，沒有觀察到與其他TNF受體家族成員的結合。 實例17.   具有不同親和力的多特異性抗體形式A-CD137xCEA中BGA-4712變體的表徵
選擇具有高、中和低親和力的三種BGA-4712變體（BGA-2164、BGA-6468和BGA-9442）用於效力比較。如上文實例5所述進行SPR研究和FACS分析，並示於表20和圖16中。對於流式細胞術，將人CD137 +或人CEA +表現細胞（10 5個細胞/孔）與各種濃度的純化的VH結構域抗體一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司）結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司）定量細胞螢光。三種測試的多特異性抗體之間的CEA結合沒有顯著差異，而如預期的，藉由流式細胞術觀察到針對人CD137的不同結合親和力。接下來，應用如上文實例7中所述之基於PBMC的細胞介素釋放測定來評估該等具有不同親和力的BGA-4712變體在多特異性抗體形式A-CD137xCEA中的效力。如表20所示，由該等變體誘導的CD137活化與CD137臂親和力增加成正比。當考慮其他生物物理特性諸如SEC-HPLC中的非特異性結合和聚集時，選擇BGA-5623來進一步表徵和研究可能影響CD137活化的參數。 [表20].具有不同親和力的多特異性抗體形式A-CD137xCEA中BGA-4712變體的比較
形式/殖株 形式 細胞結合EC50（μg/ml） 功能
CT26/CEA Hut78/huCD137 EC50（μg/ml） 最高
形式A-BGA-5623 A-CD137xCEA 0.38 0.38 0.3412 2512
形式A-BGA-9442 0.5 0.5 0.2325 1722
形式A BGA-3386 0.21 0.21 0.07681 1953
實例18.可能影響體外CD137活化的參數
上述數據表明，除了親和力、受體密度和CD137中的表位位置以及分子形式之外，還有其他關鍵參數，諸如模組比率、模組取向、連接子長度和Fc功能，其可以顯著影響細胞介素釋放（Il-2和IFN-γ）。因此，為了合理設計基於CD137的多特異性抗體，我們採用系統方法來探究該等參數如何影響CD137激動作用。該等多特異性抗體的表現和製備如上文實例6所述進行。
首先，我們構建了具有不同模組比率諸如2 : 4、1 : 1和1 : 2的CD137xCEA多特異性抗體變體，即BE-718（A-BGA-5623-BGA-5623）（SEQ ID NO: 207和89）、BE-942（ZW 1 + 1）（SEQ ID NO: 211, 213和215）（其為1 + 1組態的BGA-5623）和BE-755（ZW1 + 2）（SEQ ID NO: 211、213和217）（其為1 + 2組態的BGA-5623）（圖17）。對於具有「ZW」名稱的抗體構建體，惰性Fc用於該等多特異性抗體，並使用Zymeworks的Azymetric™平臺組裝Fab × VH組態，其中ZW1突變（鏈A：T350V/L351Y/F405A/Y407V；鏈B：T350V/T366L/K392L/T394W）被引入重鏈的CH3結構域中以允許有效的異二聚體形成（Von Kreudenstein等人, (2013) Mabs [單株抗體] 5(5):646-54）。對於代表模組比率為2 : 2的多特異性抗體的BE-189（A-BGA-5623）（SEQ ID NO: 167和89），我們能夠研究模組比率如何影響細胞介素釋放。如上文實例7中所述，將高CEA表現細胞系CT26/CEA與PBMC（2 × 10 5個/孔）和HEK293/OS8細胞（其可觸發T細胞活化的第一信號）一起用於體外CD137活化測定。如表21和圖18所示，模組比率為2 : 2的多特異性抗體被證明是有效的CD137促效劑，沒有CD137內在活化，這表明BE-189（形式A-BGA-5623）以CEA依賴性方式活化CD137。相比之下，模組比率為2 : 4的多特異性抗體BE-718（A-BGA-5623-BGA-5623）顯示即使在不存在CEA表現細胞的情況下也活化CD137。
接著，我們研究了模組取向和Fc功能如何影響CD137活化。在本實驗中，我們構建了BE-740（A-IgG1-BGA-5623）（SEQ ID NO: 209和89），其與A-BGA-5623完全相同，只是用野生型IgG1 Fc替代惰性Fc。我們還分別構建了BE-562（E-muFc-BGA-5623）（SEQ ID NO: 219和89）和BE-375（E-IgG1-BGA-5623）（SEQ ID NO: 221和89）。如圖19所示，這兩種多特異性抗體與A-BGA-5623和A-IgG1-BGA-5623共用同一對抗CEA抗體和抗huCD137 VH結構域（CEA和BGA-5623），但是方向相反。如實例7所述，使用基於PBMC的細胞介素釋放測定來定量CD137活化的效力。基於體外結果，證明A-BGA-5623和A-IgG1-BGA-5623在CD137活化方面比E-muFc-BGA-5623和E-IgG1-BGA-5623更有效。此外，根據該實驗，Fc功能似乎對CD137活化的影響極小（圖20）。
最後，評估了連接Fc和VH結構域抗體的連接子對CD137活化的影響。A-(G4S)3- BGA-5623（BE-244）（SEQ ID NO: 223和89）藉由用(G4S) 3（SEQ ID NO: 251）的15 AA連接子取代G4S而產生。同樣，使用基於PBMC的細胞介素釋放測定來比較效力。如圖21和表21所示，連接子長度對CD137活化的影響極小。 [表21].體外CD137活化的關鍵參數
代碼 替代名稱 mAb對 模組比率 Fc 蛋白A純化後的SEC-HPLC（%） 功能測定EC50（μg/ml）
BE-189 A-BGA-5623 BGA-5623/CEA 2 + 2 惰性Fc 94.55 0.31  
BE-718 A-BGA-5623-BGA-5623 2 + 4 惰性Fc 89.47 0.01  
BE-740 A-IgG1- BGA-5623 2 + 2 wt-IgG1 98.71 0.17  
BE-942 ZW1 + 1 1 + 1 LALADS 92.65 25.06  
BE-755 ZW1 + 2 1 + 2 LALADS 83.19 1.16  
BE-562 E-muFc- BGA-5623 2 + 2 惰性Fc 98.17 4.69  
BE-375 E-IgG1- BGA-5623 2 + 2 wt-IgG1 97.76 1.76  
BE-244 A-(G4S)3- BGA-5623 2 + 2 惰性Fc 98.84 0.18  
[表22].CD137xCEA多特異性抗體的胺基酸和DNA序列
構建體 SEQ ID NO： 序列
BE718 A-BGA-5623- BGA-5623重鏈AA SEQ ID NO: 207 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE718 A-BGA-5623- BGA-5623重鏈DNA SEQ ID NO: 208 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGATCGGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BE-740 AA SEQ ID NO: 209 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-740 DNA SEQ ID NO: 210 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BE-942 （ZW1 + 1）抗CEA重鏈AA SEQ ID NO: 211 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAWLGCEVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLESSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
BE-942 （ZW1 + 1）抗CEA重鏈DNA SEQ ID NO: 212 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGACCAAGCGTGTTCCCACTGGCACCCAGCTCCAAGAGCACCTCCGGAGGAACAGCATGGCTGGGATGCGAGGTGACCGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACAGTGTCTTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACATTTCCTGCCGTGCTGGAGTCTAGCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCTGTGGTGACCGTGCCTAGCTCCTCTCTGGGCACCCAGACATATATCTGTAACGTGAATCACAAGCCATCTAATACAAAGGTGGATAAGAAGGTGGAGCCAAAGTCCTGCGACAAGACCCACACATGCCCACCTTGTCCAGCACCAGAGGCAGCAGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGAGCGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCTGCCCCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCAAAGGGACAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCAAGCCGCGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGCTGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTATCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCAGAGAACAATTACCTGACCTGGCCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATTCTAAGCTGACAGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAG
BE-942 （ZW1 + 1）抗CEA輕鏈AA SEQ ID NO: 213 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVAIFPPSDERLKSGTASVVCVLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSRLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BE-942 （ZW1 + 1）抗CEA輕鏈DNA SEQ ID NO: 214 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAAAGGACAGTGGCAGCACCAAGCGTGGCAATCTTCCCACCTTCCGACGAGAGACTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGCGTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCTACATATAGCCTGAGCTCCAGGCTGACCCTGTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGCGGCGAGTGT
BE-942 （ZW1 + 1）抗CD137重鏈AA SEQ ID NO: 215 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
BE-942 （ZW1 + 1）抗CD137重鏈DNA SEQ ID NO: 216 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAGCCAAAGTCCTCCGACAAGACCCACACATGCCCACCTTGTCCAGCACCAGAGGCAGCAGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGAGCGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCTGCCCCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCAAAGGGACAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACGTGTATCCTCCAAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCAGAGAACAATTATAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCGCCCTGGTGTCTAAGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAG
BE-755 （ZW1 + 2）抗CD137重鏈AA SEQ ID NO: 217 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
BE-755 （ZW1 + 2）抗CD137重鏈DNA SEQ ID NO: 218 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGAGCGAGGTGCAGCTGCTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTGACCGTGTCCAGCGAGCCAAAGTCCTcCGACAAGACCCACACATGCCCACCTTGTCCAGCACCAGAGGCAGCAGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGAGCGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCTGCCCCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCAAAGGGACAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACGTGTATCCTCCAAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCAGAGAACAATTATAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCGCCCTGGTGTCTAAGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAG
BE-562（E-mutFc）重鏈AA SEQ ID NO: 219 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
BE-562（E-mutFc）重鏈DNA SEQ ID NO: 220 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAGCCAAAGTCCTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC
BE-375（E-wtIgG1 Fc）重鏈AA SEQ ID NO: 221 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
BE-375（E-wtIgG1 Fc）重鏈DNA SEQ ID NO: 222 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAGCCCAAATCTTcTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC
BE-244（A-（G4S）3）重鏈AA SEQ ID NO: 223 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-244（A-（G4S）3）重鏈DNA SEQ ID NO: 224 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGCGGAGGATCTGGTGGCGGTGGGTCCGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
實例19.單劑CD137 x CEA多特異性抗體的體內功效
為了確定CD137 x CEA多特異性抗體BE-189和BE-740針對CEA+腫瘤細胞的體內功效，將CT26/CEA細胞（1 x 10 6）皮下注射到BALB/c背景的人源化CD137小鼠中。從腫瘤注射當天開始，每週兩次給予BE-189（3 mg/kg）、BE-740（3 mg/kg）、抗CEA Ab（SEQ ID NO: 87和89）（3mg/kg）、烏瑞魯單抗類似物（3 mg/kg）或媒介物對照（每組6隻小鼠）。與媒介物對照相比，BE-189（A-BGA-5623）和烏瑞魯單抗類似物誘導腫瘤生長的顯著抑制（P ＜ 0.001），如圖22所示。 實例20.腫瘤靶向CD137促效劑的設計
激動性抗huCD137抗體已經在臨床環境中顯示出毒性，這可以表明全身性Fc
Figure 02_image001
R交聯對於CD137活化並不理想。目的係在腫瘤部位特異性地實現有效的CD137刺激，而無需對廣泛的癌症進行全身性CD137活化。為了克服Fc
Figure 02_image001
R交聯的依賴性，我們產生了具有以下特徵的TAA x CD137多特異性抗體，如圖23所示。該特異性構建體包括模組比率為2 : 2的IgG融合樣多特異性抗體形式、結合TAA（例如，CEA、GPC3、Claudin6或Trop2）的二價F(ab')2片段、在CH3的C末端融合的VH結構域片段（其結合huCD137），以及huIgG1的Fc無效形式（其不具有FcγR結合但保留FcRn結合）。產生的靶向腫瘤的CD137促效劑的產率和生化特性總結於表23中，序列資訊示出於表24中。選擇具有改善的生物物理特性和更好產率的抗CEA抗體的變體來構建CD137xCEA。圖24A-D示出了CD137xCEA（圖24A-B）和磷脂醯肌醇蛋白聚糖3（GPC3）x CD137（圖24C-D）的代表性細胞結合結果。 [表23].產率和生化特性的總結
構建體 代碼 單體（%） TAA KD（M） huCD137（M）
CEA x CD137 BE-146 99.09 6.50E-09 1.67E-07
Claudin6 x CD137 BE-268 99.76 * *
Trop2 x CD137 BE-907 98.5 * *
GPC3 x CD137 BE-830 99.03 1.47E-09 1.82E-07
*未解決 [表24].TAA x CD137的胺基酸和DNA序列
構建體 SEQ ID NO 序列
BE-146重鏈AA SEQ ID NO: 225 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-146 重鏈 DNA SEQ ID NO: 226 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BE-146 輕鏈AA SEQ ID NO: 89 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BE-146輕鏈DNA SEQ ID NO: 90 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
BE-268 重鏈AA SEQ ID NO: 227 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQKFKGKATLTIDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGYVLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-268 重鏈DNA SEQ ID NO: 228 GAAGTGCAACTTCAACAATCAGGACCTGAACTTGTGAAACCTGGAGCATCAATGAAGATTTCGTGCAAAGCATCAGGATACTCATTTACAGGATACACAATGAACTGGGTGAAACAATCACACGGAAAGAATTTGGAATGGATCGGACTTATCAACCCTTACAACGGAGGAACATCATACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCTACTCTTACAATCGATAAATCATCATCAACAGCATACATGGAACTTCTTTCACTTACATCAGAAGATTCAGCAGTGTACTACTGCGCAAGAGATTACGGATACGTGCTTGATTACTGGGGGCAGGGGACAACACTTACAGTGTCATCAGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BE-268 輕鏈AA SEQ ID NO: 229 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYLHWFQQKPGTSPKLWVYSTSNLPSGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSIYPPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BE-268 輕鏈DNA SEQ ID NO: 230 CAAATCGTGCTTACACAATCACCTGCAATCATGTCAGCATCACCTGGAGAGAAGGTTACTATCACATGCTCAGCATCATCATCAGTGTCATACCTTCACTGGTTTCAACAGAAGCCCGGGACATCACCTAAACTTTGGGTGTACTCAACATCAAACCTTCCTTCAGGAGTGCCTGCAAGATTTGGAGGATCAGGATCAGGAACATCATACTCACTTACAATCTCAAGAATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACATACTACTGCCAACAAAGATCAATCTACCCTCCTTGGACATTTGGAGGAGGAACAAAGTTGGAGATCAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
BE-907 重鏈AA SEQ ID NO: 231 QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-907 重鏈DNA SEQ ID NO: 232 CAAGTGCAACTGCAACAATCTGGCTCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCAACTATGGCATGAACTGGGTGAAGCAAGCCCCTGGCCAAGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCTACACTGGGGAGCCCACCTACACAGATGACTTCAAAGGTAGATTTGCCTTCAGCCTGGACACCTCTGTGAGCACAGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAGGCTGATGACACAGCTGTGTATTTCTGTGCTAGAGGGGGCTTTGGCAGCAGCTACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAAGGCAGCCTGGTGACTGTGAGCTCTGCTAGCACCAAAGGCCCTTCTGTGTTCCCCCTGGCCCCCTCATCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGCCTTAGGCTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGAGCTGGAATTCTGGGGCCCTGACCTCTGGGGTGCATACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGAGCTCTGGCCTGTACAGCCTGAGCTCTGTGGTGACAGTGCCTAGCAGCAGCCTGGGCACACAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAAACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCCCCTGCTGCTGGCCCCTCTGTGTTCCTTTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGATGGGGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGGCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGGCAGCCTAGAGAGCCCCAAGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTGAGCCTGTGGTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATTGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAAGGCAATGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGTAAGGGGGGTGGGGGCTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGGGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGCAGTCTAAGACTGAGCTGTGCTGCCTCTGGCTTTACAGTGTCTGCTGAGGATGTGGGCTGGGTAAGACAAGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGTCTGCCATCCTGGACAAGGGGGGCAGCACCTACTATGCTGAGTCTGTGAAGGGCAGATTTACCATTAGCAGAGATAATGCCAAGAATACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAGAGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGCTAGAATTGTGTACCATGCTGGGGGGGGGGTGACTTTTGACACAAGAGGCCAAGGCACCCAAGTGACAGTGAGCAGC
BE-907 輕鏈AA SEQ ID NO: 233 DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BE-907 輕鏈DNA SEQ ID NO: 234 GATATCCAACTTACACAATCACCTTCATCACTTTCGGCCTCGGTAGGCGATAGGGTGTCAATCACATGCAAAGCATCACAAGATGTGTCAATCGCAGTGGCATGGTACCAACAGAAGCCCGGTAAGGCTCCCAAACTTCTTATCTACTCAGCATCATACAGATACACAGGAGTGCCTGATAGATTCAGTGGCTCAGGATCAGGAACAGATTTCACTTTGACAATCTCATCACTTCAACCTGAAGATTTCGCTGTCTACTACTGCCAACAACACTACATCACACCTCTTACATTTGGAGCAGGAACAAAGGTAGAGATCAAGCGAACCGTGGCAGCACCTTCAGTGTTTATCTTTCCTCCTTCAGATGAACAACTTAAATCAGGAACTGCGTCGGTAGTTTGTCTTCTTAACAACTTCTATCCCAGAGAAGCAAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAACGCACTTCAATCAGGAAACTCACAAGAATCAGTGACAGAACAAGATTCAAAGGACTCCACATACTCACTTTCATCAACACTTACACTTTCAAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCATGCGAAGTGACACACCAAGGACTTTCATCACCTGTGACAAAGTCGTTCAACAGAGGAGAATGC
BE-830 重鏈AA SEQ ID NO: 235 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-830重鏈DNA SEQ ID NO: 236 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTATACCTTCACAGACTACGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCACCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGCCCTGGACCCTAAGACCGGCGATACAGCCTATAGCCAGAAGTTTAAGGGCAGAGTGACCCTGACAGCCGACAAGTCCACCTCTACAGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTGACCAGCGAGGATACAGCCGTGTACTATTGTACCCGGTTCTACTCCTATACATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BE-830輕鏈AA SEQ ID NO: 237 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BE-830輕鏈DNA SEQ ID NO: 238 GACGTGGTCATGACACAGTCCCCTCTGTCTCTGCCAGTGACCCCAGGAGAGCCTGCCTCTATCAGCTGCAGGAGCTCCCAGAGCCTGGTGCACTCCAACCGCAATACATACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACACTGAAGATCTCCCGGGTGGAGGCAGAGGATGTGGGCGTGTACTATTGTTCTCAGAATACCCACGTGCCCCCTACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
實例21.CD137xCEA以CEA依賴性方式誘導T細胞活化
在不同的體外實驗中評估了CD137xCEA多特異性抗體BE-146的功能性。我們首先使用來自健康供體的人周邊血單核細胞（PBMC）用提供第一刺激信號的CD137xCEA和HEK293/OS8活化人T細胞。藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司）分離法從健康供體的全血中分離PBMC。為了確定在CEA +腫瘤細胞存在下CD137xCEA是否可以誘導從人PBMC釋放細胞介素，將PBMC（1 x 10 5個/孔）與CEA +MKN45細胞（2 x 10 5個/孔）和HEK293/OS8（1 x 10 5個/孔）細胞在96孔v型底板中共培養2天。藉由ELISA確定來自PBMC的IL-2和IFN-γ釋放。這在圖25A中示意性地示出。結果顯示CD137xCEA可以誘導顯著的細胞介素釋放（圖25B-C）。PBMC來自測試的2個供體。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。
我們接下來研究了CD137xCEA是否可以增強抗原特異性CD8+T細胞功能。藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司）分離法從健康供體的全血中分離人周邊血單核細胞（PBMC）。使用人全T細胞分離套組（美天旎公司（Miltenyi），目錄號130-096-535）分離T細胞。為了確定在CEA+腫瘤細胞存在下BE-146是否可以誘導從人T細胞釋放細胞介素，將T細胞（1 x 10 5個/孔）與CEA+ MKN45細胞（2 x 10 5個/孔）和HEK293/OS8（1 x 10 5個/孔）細胞在96孔v型底板中共培養2天（圖26A）。藉由ELISA確定T細胞的IL-2和IFN-γ釋放。結果顯示多特異性抗體BE-146可誘導顯著的IL-2（圖26B）和IFN-γ（圖26C）釋放。
然後我們研究了CD137xCEA是否可以誘導CEA依賴性反應。藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司）分離法從健康供體的全血中分離人周邊血單核細胞（PBMC）。為了確定CD137xCEA誘導的從人PBMC釋放的細胞介素是否是CEA依賴性的，將PBMC（1 x 10 5個/孔）與作為靶細胞的HEK293或CEA過表現HEK293細胞（HEK293/CEA）（1 x 10 5個/孔）和HEK293/OS8（1 x 10 5個/孔）細胞在96孔v型底板中共培養2天。藉由ELISA確定來自PBMC的IL-2和IFN-γ釋放。結果顯示多特異性抗體BE-146可誘導來自PBMC的顯著的IL-2和IFN-γ釋放，針對過表現CEA的HEK293細胞，但不針對沒有CEA轉導的HEK293細胞（圖27A-B）。
此外，進行了一系列實驗以確定來自CD137xCEA構建體的誘導反應是否可以被可溶性CEA阻斷。藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司）分離法從健康供體的全血中分離人周邊血單核細胞（PBMC）。為了確定BE-146誘導的從人PBMC釋放的細胞介素是否可以被可溶性CEA阻斷，在不同濃度的重組可溶性CEA存在下，將PBMC（1 × 10 5個/孔）與MKN45（1 × 10 5個/孔）和HEK293/OS8（1 × 10 5個/孔）細胞在96孔v型底板中共培養2天。藉由ELISA確定來自PBMC的IL-2和IFN-γ釋放。結果顯示多特異性抗體BE-146誘導來自PBMC的IL-2（圖28A）和IFN-γ（圖28B）釋放，並且該釋放未被50 ng/ml或500 ng/ml可溶性CEA顯著阻斷。僅極高濃度的CEA（5000 ng/ml）導致減少。
該等數據表明，在（CD3ε或T細胞受體刺激）存在下，CD137xCEA誘導強烈的CEA依賴性T細胞活化。 實例22.CD137xCEA減少體內腫瘤
為了確定CD137xCEA多特異性抗體BE-146針對CEA+腫瘤細胞的體內功效，將MC38/CEA細胞（1 x 10 6）皮下注射到C57BL/6背景的人源化CD137小鼠中。當平均腫瘤體積達到約100 mm 3時，將小鼠在注射後第5天隨機化。從第5天開始，每週一次給予BE-146（0.5 mg/kg）或烏瑞魯單抗類似物（0.5 mg/kg）或媒介物對照。與媒介物對照相比，BE-146和烏瑞魯單抗類似物兩者誘導腫瘤生長的顯著抑制（P ＜ 0.001）（圖29）。 實例23.抗PD-1抗體與CD137xCEA的組合治療誘導腫瘤消退增加
為了研究CEA x CD137多特異性抗體BE-146和針對CEA +腫瘤細胞的抗PD-1抗體的組合治療功效，將CT26/CEA細胞（1 x 10 6）皮下注射到BALB/c背景的人源化CD137小鼠中。當平均腫瘤體積達到約100 mm 3時，將小鼠在注射後第4天隨機化。從第4天開始，每週一次給予BE-146（0.6 mg/kg）、抗PD-1抗體（0.3 mg/kg）或兩者的組合。與媒介物對照或單劑治療相比，BE-146和抗PD-1的組合誘導顯著增加的抗腫瘤作用。（圖30） 實例24.CD137xCEA不誘導體內肝毒性
將BE-146或烏瑞魯單抗類似物抗體（30 mg/kg）注射到C57BL/6背景的人源化CD137小鼠中，每週一次，共三次給藥。在第22天收集血液並藉由血液生化測試進行分析。與媒介物對照相比，高劑量的烏瑞魯單抗類似物而非BE-146誘導指示肝毒性的丙胺酸轉胺酶（ALT）和天冬胺酸轉胺酶（AST）濃度的顯著增加。此外，在烏瑞魯單抗類似物治療組的肝組織中觀察到炎性細胞增加的微觀變化，而在BE-146治療組中沒有觀察到顯著的微觀變化。（圖31）。因此，CD137xTAA係一種有希望的無肝毒性癌症免疫療法的組合夥伴，包括檢查點抑制劑和T細胞接合物。 實例25.其他CD137xTAA組合以TAA靶標依賴性方式誘導T細胞活化
Claudin6+腫瘤細胞和Trop2+腫瘤細胞的相同概念用於測試其他CD137xTAA組合。使用來自健康供體的PBMC用Claudin6 x CD137（BE-268）或Trop2 x CD137（BE-907）活化人T細胞，並用HEK293/OS8提供讀數。對於BE-268，將具有不同Claudin6表現水平（1 x 10 4個細胞/孔）的癌細胞系在96孔U底板（Corning™ Costar™ 9018）中共培養2天。Claudin6高表現的PA-1細胞和Claudin6中等表現的Bewo細胞購自ATCC。Claudin6表現陰性的MKN45細胞購自JCRB細胞庫。為了測定BE-907，根據先前描述的方案（Zhang等人, Blood. [血液] 2005 106(5):1544-51）生成Trop2表現細胞系Mc38/Trop2。藉由ELISA確定T細胞的IFN-γ釋放。結果表明，BE-268和BE-907均可誘導顯著的IFN-γ釋放（圖32和圖33）。如所預期的，該等結果表明BE-268和BE-907以Claudin6和Trop2依賴性方式誘導強T細胞活化。 實例26.CD137xGPC3以GPC3依賴性方式誘導T細胞活化
另一種測試的TAA係Glypican 3（GPC3）。產生了GPC3+腫瘤細胞。如上所述，從健康供體獲得人周邊血單核細胞（PBMC），以用CD137xGPC3（BE-830）和OS8活化人T細胞以提供讀數。為了使系統非常簡單，根據先前描述的方案（Zhang等人, Blood. [血液] 2005 106(5):1544-51），藉由反轉錄病毒轉導到HepG2（ATCC、HB8065）、Huh7（JCRB、JCRB0403）和Hep3B（ATCC、HB8064）中，產生OS8表現GPC3+細胞系HepG2 OS8、Huh7 OS8-HiBit和Hep3B OS8-HiBit。另外產生了具有OS8（SK-HEP-1 OS8-HiBit）的SK-HEP-1（ATCC，HTB-52），其對於GPC3表現呈陰性並且用作陰性對照。在指定濃度（0.0001-10 μg/ml）的BE-830存在下以2 : 1的E : T比率進行共培養2天，並藉由商業ELISA套組測定IFN-γ和IL-2。如圖34所示，在具有GPC3表現的人HCC細胞系中，無論GPC3的表現水平如何，BE-830在誘導共培養的PBMC中的IFN-γ釋放方面顯示出類似的功能作用。BE-830似乎在與GPC3高表現HepG2細胞共培養的PBMC中刺激更高的IL-2產生。該等數據表明，類似於CEA構建體BE-146，多特異性抗體BE-830具有功能活性。 實例27.BE-830減少體內腫瘤
為了確定BE-830針對GPC3+腫瘤細胞的體內功效，將Hepa1-6T/hGPC3細胞（1 x 10 7）皮下注射到C57BL/6背景的人源化CD137小鼠中。在腫瘤注射當天開始，每週兩次給予BE-830（0.5、3或10 mpk）和媒介物對照（每組5隻小鼠）。與媒介物相比，0.5 mg/kg劑量的BE-830顯示腫瘤抑制，與媒介物對照具有統計學顯著差異（P ＜ 0.01）（圖35）。 實例28.晶體結構解析度
為了更好地理解抗CD137單結構域抗體臂如何能夠高親和力結合CD137，以及CD137/CD137L相互作用的強效促效劑，確定了與CD137複合的VHH（BGA-5623）的晶體結構。 CD137和VHH（BGA-5623）的表現、純化和結晶
在HEK293G細胞中表現含有四個CRD（1-4；胺基酸24-162）的人CD137細胞外結構域，其攜帶有C121S、N138D和N149Q突變。將編碼CD137的cDNA選殖到具有N末端分泌序列和C末端TEV切割位點隨後是Fc標籤的pMAX載體中。將含有分泌的CD137-Fc融合蛋白的培養上清液與Mab Select Sure™樹脂（GE醫療生命科學公司（GE Healthcare Life Sciences））在4°C下混合3小時。用含有20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl的緩衝液洗滌蛋白質，然後用50 mM乙酸（用5 M NaOH將pH值調節至3.5）洗脫，最後用1/10 CV 1.0 M Tris-HCl pH 8.0中和。將洗脫的蛋白質與TEV蛋白酶（10 : 1莫耳比）混合，並在4°C下用緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl）透析過夜。將混合物上樣到Ni-NTA柱（凱傑公司（Qiagen））和Mab Select Sure樹脂上以除去TEV蛋白酶和Fc標籤，然後使用HiLoad 16/600 Superdex™ 75pg柱（GE醫療生命科學公司）在緩衝液（20 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl）中藉由粒徑排阻層析法進一步純化流出物。
將編碼VHH（BGA-5623）的DNA序列選殖到具有N末端HIS-MBP標籤隨後是TEV蛋白酶位點的PET21a載體中。在OD600為0.6-1.0時，用1 mM IPTG在18°C下誘導Shuffle T7中的蛋白質表現16小時。藉由以7,000g離心10分鐘收穫細胞。將細胞沈澱重新懸浮在裂解緩衝液（50 mM Na 3PO 4pH 7.0、300 mM NaCl）中，並在冰上超音波裂解。然後將裂解物在4°C下以48,000 g離心30分鐘。將上清液與Talon樹脂混合並在4°C下分批次處理3小時。用含有5 mM咪唑的裂解緩衝液洗滌樹脂，用含有另外100 mM咪唑的裂解緩衝液洗脫蛋白質。將洗脫液與TEV蛋白酶（10 : 1莫耳比）混合，並在4°C下用緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl）透析過夜。將混合物上樣到Talon柱上以除去TEV蛋白酶和HIS-MBP標籤，然後使用HiLoad 16/600 Superdex™ 75pg柱（GE醫療生命科學公司）在緩衝液（20 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl）中藉由粒徑排阻層析法進一步純化流出物。
將純化的CD137與過量的純化的VHH（BGA-5623）混合（1 : 1.5莫耳比）以產生CD137/VHH（BGA-5623）複合物。然後使用HiLoad 16/600 Superdex™ 75pg柱（GE醫療生命科學公司）在緩衝液（20 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl）中藉由凝膠過濾進一步純化複合物。CD137/VHH（BGA-5623）複合物（10 mg/ml）在0.6 M Li 2SO4、0.01 M NiCl 2、0.1 M Tris pH 9.0中結晶。將用逐步5% D-(+)-蔗糖冷凍保護至最終20%濃度的晶體在液氮中快速冷凍。此外，將apoVHH（BGA-5623）在1.2 M (NH 4) 2SO 4、0.1 M檸檬酸pH 5.0中結晶。將晶體用7%甘油冷凍保護並在液氮中快速冷凍。在Spring-8同步加速器輻射設備（日本的兵庫公司（Hyogo, Japan））的束線BL45XU處收集X射線繞射數據。 數據收集和結構解析
在Spring-8同步輻射設備（日本的兵庫公司）中配備ZOO（Hirata, K.等人, Acta Crystallogr D Struct Biol [晶體結構生物學學報], 2019. 75(Pt 2): 138-150）自動數據收集系統的束線BL45XU處在100克耳文的低溫冷卻條件下收集X射線繞射數據。採用XDS（Kabsch W., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr [晶體生物學晶體學報], 2010. 66 (Pt 2): 125-32）的集成數據處理軟體KAMO（Yamashita等人, Acta Crystallogr D Struct Biol [晶體結構生物學學報], 2018. 74 (Pt 5): 441-449）處理繞射圖像。人CD137（PDB: 6MGP）和VHH模型（PDB:4U3X）的結構用作檢索模型。藉由分子替換程式PHASER（McCoy等人, Phaser crystallographic software [Phaser結晶學軟體]. J Appl Crystallogr [應用結晶學雜誌], 2007. 40(Pt 4): 658-674）找到最初的解決方案。然後使用程式COOT（Emsley等人, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr [晶體生物學晶體學報], 2004. 60(Pt 12 Pt 1): 2126-32）手動反覆運算構建該模型並使用PHENIX（Adams等人, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr [晶體生物學晶體學報], 2010. 66(Pt 2): 213-21）進行細化。將最終模型細化為可接受的R和R自由值以及拉氏構象圖（Ramachandran）統計（藉由Molprobity計算）。數據處理和細化統計可以在表25中找到。 [表25] 數據收集和細化統計
晶體 apoVHH（BGA-5623）    VHH（BGA-5623）/CD137複合物
數據收集   
X射線源 BL45XU BL45XU
波長（Å） 1.0 1.0
空間群 P4 12 12 I4 1
晶胞尺寸   
a（Å） 68.342 123.943
b（Å） 68.342 123.943
c（Å） 102.952 57.877
α(°) 90 90
ß（°） 90 90
ϒ（°） 90 90
解析度（Å） 56.94-1.70 (1.80-1.70) a 87.64-2.58 (2.73-2.58)
Rsym（%） 18.0 (145.8) 21.4 (209.3)
＜I/σ＞ 14.3 (1.6) 12.3 (1.2)
CC 1/2 99.8 (56.1) 99.7 (44.4)
冗餘度 11.6 (5.9) 6.8 (6.6)
完整度（%） 97.3 (84.3) 99.9 (99.4)
細化   
解析度（Å） 48.33-1.70 43.82-2.58
反射次數 26791 14038
R工作/R空閒 b（%） 19.84/23.46 22.8/28.9
r.m.s.d. c鍵/角 0.006/0.892 0.010/1.314
原子數   
蛋白質 1787 1959
水 204 5
B因子   
蛋白質 27.37 83.97
水 36.42 66.79
拉氏構象圖   
推薦值（%） 98.71 94.21
允許值（%） 1.29 3.47
離群值（%） 0 2.32
a括號中的值係最高解析度殼層的值。 b根據細化期間留出的約5%的反射而計算 cr.m.s.d.，均方根偏差 結合人CD137的VHH（BGA-5623）的結構
與CD137複合的VHH（BGA-5623）在I4 1空間群中結晶，一個複合物在不對稱單元中，並繞射到2.58 Å。結合人CD137的VHH（BGA-5623）的結構顯示VHH（BGA-5623）與CD137L結合部分地空間連接（圖36）。VHH（BGA-5623）與CD137之間的埋入表面積為約571 Å 2。VHH（BGA-5623）相互作用聚集在CD137 CRD2結構域周圍。該等相互作用主要由VHH（BGA-5623）CDR2和CDR3介導，並與CD137更廣泛地接觸。VHH（BGA-5623）CDR1不直接接觸CD137，而CDR3在CD137結合時經歷從非結構化環到ß折疊的顯著構象變化（圖37）。VHH（BGA-5623）CDR2 Leu52、Tyr58接觸CD137殘基Pro50、Asn51。VHH（BGA-5623）CDR3殘基Gly100A、Gly100B、Val100C、Thr100D、Phe100E接觸CD137殘基Phe36、Pro47、Pro49、Arg60、Cys62、Ile64。此外，FR2 Leu45和Trp47接觸CD137殘基Pro47、Cys48、Pro49、Pro50，該等殘基對CD137結合有顯著貢獻。VHH（BGA-5623）使用氫鍵和疏水相互作用的組合與CD137相互作用。例如，FR2 Trp47與CD137殘基Pro47、Cys48、Pro49和Pro50形成強疏水接觸。CDR3殘基Phe100E與CD137殘基Phe36和Pro47形成疏水相互作用。FR2殘基Trp47和CDR3殘基Gly100A分別與CD137殘基Pro47和Ile64形成一個氫鍵。CDR3殘基Val100C與CD137殘基Cys62形成兩個氫鍵（圖38）。
基於VHH（BGA-5623）/CD137複合物的晶體結構，確定了與VHH（BGA-5623）接觸的CD137的殘基（即，與VHH結合的CD137的表位殘基）和與CD137接觸的VHH（BGA-5623）的殘基（即，與CD137接觸的VHH的互補位殘基）。下表26示出了它們接觸的CD137和VHH（BGA-5623）的殘基，如使用3.7 Å的接觸距離嚴格性所評估的，其係凡得瓦（非極性）相互作用力最高的點。 [表26] CD137的表位殘基及其相應的VHH（BGA-5623）的互補位殘基
CD137    VHH（BGA-5623）   
Phe 36 Thr 100D
      Phe 100E
Pro 47 Leu 45
      Trp 47
      Phe 100E
Cys 48 Trp 47
Pro 49 Trp 47
      Val 100C
      Thr 100D
Pro 50 Trp 47
      Tyr 58
Asn 51 Leu 52
Arg 60 Thr 100D
Cys 62 Gly 100B
      Val 100C
Ile 64 Gly 100A
VHH（BGA-5623）殘基按照Kabat命名法編號。
無
[圖1A]係從每個子文庫鑒定的人抗huCD137 VH結構域抗體之總結。圖1B係來自每個子文庫的人抗huCD137 VH結構域抗體之圖解系統發生樹。使用DNASTAR的Megalign™軟體對候選抗huCD137 VH結構域抗體的VH序列進行比對。序列同源性在系統發生樹中顯示。 [圖2A]示出了人Fc融合VH抗體形式（VH-Fc）之示意圖。VH結構域抗體在惰性Fc（無FcγR結合）的N末端與其間的G4S連接子融合。圖2B示出了使用含有VH-Fc蛋白的上清液之代表性篩選結果，並且圖2C示出了一個殖株BGA-4712已經證明能夠以劑量依賴性方式刺激Hut78/huCD137細胞中的IL-2產生。 [圖3A至圖3C]係代表性抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712之結合概況。圖3A示出了藉由表面電漿共振（SPR）測定純化的人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712的親和力。圖3B描繪了藉由流式細胞術測定人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712結合。圖3C示出了藉由huCD137配體（人CD137配體-ECD-mIgG2a融合蛋白）相互作用對人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712之阻斷。藉由流式細胞術測定純化的人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712與表現CD137的Hut78/huCD137細胞（Hut78/huCD137）之結合。 [圖4A-D]係示例性CD137xCEA多特異性抗體形式之示意圖。 [圖5A至圖5B]係藉由流式細胞術的CD137xCEA多特異性抗體的細胞結合之比較。圖5A示出了與表現CEA的細胞CT26/CEA之結合。圖5B示出了與表現CD137的細胞Hut78/huCD137之結合。 [圖6A-B]證明A-CD137xCEA在CEA +腫瘤細胞存在下刺激PBMC產生IFN-γ。圖6A示出了CD137xCEA多特異性抗體A-CD137xCEA之一誘導CD137表現細胞系Hut78/huCD137產生Il-2。圖6B示出了CD137xCEA多特異性抗體A-CD137xCEA之一以劑量依賴性方式誘導人周邊血單核細胞（PBMC）產生IFN-γ。 [圖7]係藉由流式細胞術測定的優化的A-CD137xCEA BGA-4712變體與表現CD137的細胞Hut78/huCD137之結合。 [圖8]示出了在基於PBMC的細胞介素釋放測定中的CD137活化，表明A-CD137xCEA-M3的功能在去除PTM位點後得以保持。 [圖9A]係抗huCD137 VH結構域抗體的噬菌體展示CH3融合之示意圖。VH結構域抗體融合在CH3的C末端，以模擬雙特異性形式A-CD137xCEA。 [圖9B]證明了藉由ELISA，含有CH3-BGA-4712-M3的上清液可以結合CD137（人CD137-ECD mIgG2a）。BGA-4712（VH-Fc）用作陽性對照，而huIgG用作陰性對照。在VH區具有W47G或W47F或W47Y突變的CH3-BGA-4712-M3未能結合預包被的人CD137-ECD-mIgG2a。 [圖10]示出了四輪選擇後BGA-4712-M3的CDR區序列標識。 [圖11]係藉由流式細胞術對抗huCD137 VH結構域抗體BGA-5623之結合測定，證明在親和力成熟後與CD137的結合得到改善。 [圖12A-B]示出了人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-5623之表位作圖。圖12A係基於細胞的結合測定中的代表性篩選結果。藉由烏瑞魯單抗類似物監測huCD137突變體的表現。圖12B示出了純化的huCD137突變體的BGA-5623結合。 [圖13]示出了huCD137單體的分子建模。 [圖14A]證明通過ELISA測定的CD137配體與人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-5623競爭。 [圖14B]證明CD137 x CEA多特異性抗體BGA-5623可以在基於細胞的配體競爭測定中減少CD137/CD137配體相互作用。 [圖15]藉由ELISA證明BGA-5623不與其他TNF受體家族成員脫靶結合。 [圖16A-B]示出了藉由表面電漿共振（SPR）對純化的BGA-7556變體的親和力測定。 [圖17]係用於研究可能影響體外CD137活化的其他參數諸如模組比率的CD137xCEA多特異性抗體形式之示意圖。 [圖18]證明模組比率為2 : 4的雙特異性抗體A-41A11/41A11可激活CD137，無論CEA +腫瘤細胞存在還是不存在。 [圖19]係用於研究可能影響體外CD137活化的其他參數諸如Fc功能和模組取向的CD137xCEA多特異性抗體形式之示意圖。 [圖20]證明所研究的CD137xCEA多特異性抗體在CEA +腫瘤細胞存在下僅刺激PBMC產生IFN-γ。 [圖21]證明在CEA +腫瘤細胞存在下，連接子長度對體外CD137活化的影響極小。 [圖22]示出了形式A-BGA-5623誘導體內腫瘤生長的顯著抑制，但A-IgG1-BGA-5623不誘導。 [圖23]係設計的腫瘤靶向TAA x CD137多特異性抗體形式之示意圖。 [圖24A-B]示出了BE-146與MKN45（圖24A）和Hut78/huCD137細胞（圖24B）之結合。圖24C-D示出了BE-830與HepG2（圖24C）和Hut78/huCD137細胞（圖24D）之結合。 [圖25A-C]證明CEA x CD137多特異性抗體BE-146誘導來自人PBMC的IL-2和IFN-γ釋放。圖25A係在MKN45細胞存在下通過用BE-146和HEK293/OS8細胞共刺激huPBMC而活化CD137之示意圖。圖25B-C示出了BE-146可誘導來自人PBMC的IL-2（圖25B）和IFN-γ（圖25C）。測試了來自2個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。 [圖26A-B]證明CEA x CD137多特異性抗體BE-146誘導來自人T細胞的IL-2和IFN-γ釋放。圖26B示出了BE-146可誘導來自人PBMC的IL-2和IFN-γ（圖26C）。測試了來自2個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。 [圖27A-B]證明CEA x CD137誘導的反應係CEA依賴性的。圖27A示出BE-146可誘導來自PBMC的顯著的IL-2和IFN-γ釋放（圖27B），針對過表現CEA的HEK293細胞，但不針對沒有CEA轉導的HEK293細胞。測試了來自3個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。 [圖28A-B]示出了CD137xCEA誘導的反應沒有被重組可溶性CEA顯著阻斷。結果示出BE-146誘導的來自PBMC的IL-2（圖28A）和IFN-γ（圖28B）釋放未被50 ng/ml或500 ng/ml可溶性CEA顯著阻斷。測試了來自2個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。 [圖29]示出了BE-146和烏瑞魯單抗類似物誘導腫瘤生長的顯著抑制。 [圖30]示出了BE-146和抗PD-1的組合誘導顯著增加的抗腫瘤作用。 [圖31]示出BE-146在體內不具有肝毒性。高劑量的烏瑞魯單抗類似物而不是BE-146誘導丙胺酸轉胺酶（ALT）和天冬胺酸轉胺酶（AST）濃度顯著增加，並增加肝臟中的炎性細胞浸潤。 [圖32]示出了Claudin6 x CD137（BE-268）誘導來自人PBMC的IFN-γ釋放。使用具有不同Claudin6表現水平的癌細胞系。PA-1高表現Claudin6，Bewo中等表現Claudin6，並且MKN45對於Claudin6表現為陰性。BE-268的IFN-γ釋放與Claudin6的表現水平相關。 [圖33]示出了Trop2 x CD137（BE-907）誘導來自人PBMC的IFN-γ釋放。測試了來自2個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。 [圖34A-B]證明GPC3 x CD137多特異性抗體BE-830在GPC3存在下誘導來自人PBMC的顯著細胞介素釋放，諸如IL-2（圖34A）和IFN-γ（圖34B）。 [圖35]示出了BE-830和烏瑞魯單抗類似物誘導腫瘤生長的顯著抑制。 [圖36]示出了VHH（BGA-5623）對於CD137與CD137L的部分競爭性結合。VHH（BGA-5623）/CD137的晶體結構通過CD137與CD137L/CD137複合物（PDB：6MGP）重疊。CD137、CD137L和VHH分別以黑色、白色和灰色著色。 [圖37]表明VHH（BGA-5623）的CDR3在CD137結合後經歷顯著的構象變化。黑色的CD137結合VHH（BGA-5623）與白色的apoVHH（BGA-5623）重疊。 [圖38]示出了VHH（BGA-5623）/CD137複合物的結合表面上的原子相互作用。VHH（BGA-5623）與CD137之間的結合介面識別BGA-5623（互補位殘基）和CD137（表位殘基）的某些關鍵殘基。CD137的CRD1和2結構域示出為覆蓋有白色透明表面的灰色底圖。互補位殘基以黑色著色。

Claims (30)

  1. 一種特異性結合人CD137的抗體抗原結合片段，其包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 29的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 30的HCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 22的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 16的HCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 15的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 16的HCDR3；或 (iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 4的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 5的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 6的HCDR3。
  2. 如請求項1所述之抗體片段，其包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 33至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (ii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (iii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 19至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (iv) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；或 (v) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 103至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
  3. 如請求項2所述之抗體片段，其中SEQ ID NO: 33、24、19、9或103中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
  4. 如請求項1所述之抗體片段，其包含： (i) 包含SEQ ID NO: 33的重鏈可變區（VH）； (ii) 包含SEQ ID NO: 24的重鏈可變區（VH）； (iii) 包含SEQ ID NO: 19的重鏈可變區（VH）； (iv) 包含SEQ ID NO: 9的重鏈可變區（VH）； (v) 包含SEQ ID NO: 103的重鏈可變區（VH）。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之抗體抗原結合片段，其為重鏈（scFv）、重鏈Fab片段、重鏈Fab'片段或重鏈F(ab') 2片段。
  6. 一種多特異性抗體，其包含特異性結合人CD137的至少第一抗原結合結構域，其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 29的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 30的HCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 22的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 16的HCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 14的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 15的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 16的HCDR3；或 (vi) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 4的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 5的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 6的HCDR3， 以及特異性結合人腫瘤相關抗原（TAA）的至少第二抗原結合結構域。
  7. 如請求項6所述之多特異性抗體，其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 33的重鏈可變區（VH）； (ii) 包含SEQ ID NO: 24的重鏈可變區（VH）； (iii) 包含SEQ ID NO: 19的重鏈可變區（VH）； (iv) 包含SEQ ID NO: 9的重鏈可變區（VH）； (v) 包含SEQ ID NO: 103的重鏈可變區（VH）， 以及特異性結合人腫瘤相關抗原（TAA）的至少第二抗原結合結構域。
  8. 如請求項7所述之多特異性抗體，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
  9. 如請求項8所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係1 + 1形式。
  10. 如請求項8所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係1 + 2形式。
  11. 如請求項8所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係2 + 2形式。
  12. 如請求項8所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係2 + 2形式。
  13. 如請求項8至13中任一項所述之雙特異性抗體，其進一步包含連接子，其中該連接子係SEQ ID NO: 239至SEQ ID NO: 280中的任何序列。
  14. 如請求項13所述之雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 246。
  15. 如請求項13所述之雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 251。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之抗體或抗體片段，其中該抗體或其抗體片段具有抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC）。
  17. 如請求項1至15中任一項所述之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段具有降低的糖基化或無糖基化或係低岩藻糖基化的。
  18. 如請求項1至15中任一項所述之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含增加的二等分GlcNac結構。
  19. 如請求項1至15中任一項所述之抗體或抗體片段，其中該Fc結構域係IgG1。
  20. 如請求項19所述之抗體或抗體片段，其中該IgG1降低了ADCC。
  21. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至15中任一項所述之抗體或抗體片段，進一步包含藥學上可接受的載劑。
  22. 一種治療癌症之方法，其包括向有需要的患者投與有效量的如請求項1或請求項6所述之抗體或抗體片段。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該癌症係胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
  24. 如請求項23所述之方法，其中該抗體或抗體片段與另一種治療劑組合投與。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該治療劑係紫杉醇或紫杉醇藥劑、多西他賽、卡鉑、托泊替康、順鉑、伊立替康、多柔比星、來那度胺或5-氮雜胞苷。
  26. 如請求項24所述之方法，其中該治療劑係抗PD-1抗體。
  27. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至15中任一項所述之抗體或抗體片段。
  28. 一種載體，其包含如請求項27所述之核酸。
  29. 一種宿主細胞，其包含如請求項27所述之核酸或如請求項28所述之載體。
  30. 一種用於生產抗體或抗體片段之方法，該方法包括培養如請求項29所述之宿主細胞以及從培養物中回收該抗體或抗體片段。
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