CN110003332B - Cd137抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种抗体或其抗原结合片段，其以1×10‑9M以下的KD值与CD137蛋白相结合。所述的抗体或其抗原结合片段对于CD137蛋白的特异性识别结合能力强、可激活NF‑κB信号通路、促进PBMC细胞增殖，和/或诱导免疫细胞分泌细胞因子。本申请还提供了所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗或预防癌症或自身免疫病的药物中的应用。

Description

CD137抗体及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种CD137抗体及其应用。
背景技术
CD137(CD137/TNFRSF9)是第一个被确定为可能的免疫治疗靶标的TNFRSF成员。除了活化的NK和NKT细胞外，CD137由调节性T细胞(Treg)和几种先天免疫细胞群体组成型表达，包括DCs，肥大细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。CD137通过联系来调停行为TNF受体相关因子1和2(TRAF1和TRAF2)以及调节免疫细胞功能的主转录因子核因子κB(NF-κB)的活化。在T细胞中，CD137配体作用于CD137后，通过TRAF2(肿瘤坏死因子受体相关因子2，Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2)、TRAF1和MAPK等途径向细胞内传递信号，参与T细胞的活化、细胞因子的分泌以及调控单核细胞的增殖和分化。它还有助于维持记忆CD8T细胞及其再活化后的细胞溶解活性。同时，CD137通过刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增强NK细胞的增殖，IFN-g的产生和细胞溶解。CD137对肿瘤反应性T细胞存在优先表达及增加T细胞募集到肿瘤部位的能力，可以保护T细胞免受激活诱导的细胞死亡(AICD)，同时增强T细胞的毒活性，典型地为CD137介导的细胞毒性CD8T细胞(CTLs)抗肿瘤反应。
然而，目前已研发的CD137抗体对于CD137蛋白的特异性识别结合能力有限、对NF-κB信号通路的激活能力有限、促进PBMC细胞增殖有限，和/或诱导免疫细胞分泌细胞因子的能力有限，因此亟待开发新的CD137抗体以用于新药研发。
发明内容
本申请提供了一种CD137抗体及其应用。本申请提供的CD137抗体具有下列性质中的一种或多种：1)能够以较高的亲和力和特异性结合CD137蛋白；2)能够刺激或激活CD137蛋白；3)特异性结合CD137蛋白时的抗体滴度可高达1：104以上；4)能够激活NF-κB信号通路；5)能够促进PBMC细胞增殖；6)能够刺激免疫细胞分泌细胞因子；7)能够用于杀伤癌细胞；和8)能够用于治疗自身免疫疾病。本申请还提供所述CD137抗体的制备方法和应用。
一方面，本申请提供了一种抗体或其抗原结合片段，其以1×10-9M以下的KD值与CD137蛋白相结合。
在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段结合CD137蛋白时的滴度为1∶105以上。例如，其结合CD137蛋白时的滴度为1∶104或更高。
在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段与CD137配体竞争对CD137蛋白的结合。
在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段激活NF-κB信号通路。
在某些实施方式中，所述NF-κB包括选自下组的一个或多个亚基：Rel(cRel)、p65(NF-κB3)、RelB、p50(NF-κB1)和p52(NF-κB2)。在某些实施方式中，所述激活NF-κB信号通路包括上调NF-κB荧光素酶报告基因的表达水平。
在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段促进PBMC细胞增殖。
在某些实施方式中，所述PBMC细胞增殖包括增加所述PBMC细胞的增殖倍数。在某些实施方式中，所述PBMC细胞增殖包括缩短所述PBMC细胞的细胞周期。
在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段刺激免疫细胞分泌细胞因子。
在某些实施方式中，所述细胞因子包括干扰素和白细胞介素。例如，所述细胞因子选自以下组：IFN-α、IFN-β和IFN-γ。又例如，所述细胞因子选自以下组：IL2、IL6和IL12。
在某些实施方式中，所述免疫细胞包括T细胞。
在某些实施方式中，当与CD137蛋白结合时，本申请的抗体或其抗原结合片段与所述CD137蛋白的胞外结构域中的一个或多个表位结合。在某些实施方式中，当与CD137蛋白结合时，本申请的抗体或其抗原结合片段与位于相应于人CD137蛋白的第30位至第100位中的一个或多个表位结合。在某些实施方案中，所述人CD137蛋白的第30位至第100位的氨基酸序列如SEQ ID NO：95所示。
在某些实施方案中，当与CD137蛋白结合时，本申请的抗体或其抗原结合片段结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：L24、P27、N30、D38、N39、R41、N42、S46、A56、G57、R60、T61、K69、R75、E77、T89、P90和S100。
在某些实施方案中，当与CD137蛋白结合时，本申请的抗体或其抗原结合片段不与位于相应于人CD137蛋白的第110位至第170位中的表位结合。在某些实施方式中，所述人CD137蛋白的第110位至第170位的氨基酸序列如SEQ ID NO：94所示。在某些实施方案中，当与CD137蛋白结合时，本申请的抗体或其抗原结合片段不与位于相应于人CD137蛋白的第115位至第156位中的表位结合。在某些实施方式中，所述人CD137蛋白的第115位至第156位的氨基酸序列如SEQ ID NO：93所示。
在某些实施方式中，当与CD137蛋白结合时，本申请的抗体或其抗原结合片段不与选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基结合：K115、C121、R134、R154、V156、S161、P162、D164、L165和A169。
在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段通过与CD137特异性结合而杀伤癌细胞和/或抑制癌细胞的增殖。
在某些实施方案中，所述癌细胞选自下组：胃癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、头颈癌细胞和膀胱癌细胞。
在某些实施方案中，本申请的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合所述CD137蛋白，其中所述参比抗体包含抗体重链和轻链，该参比抗体包含轻链CDR1-3，且所述轻链CDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：71；且所述轻链CDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：72；以及所述轻链CDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQID NO：33、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：73，且该参比抗体包含重链CDR1-3，且所述重链CDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66和SEQID NO：76；且所述重链CDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67和SEQ IDNO：77；以及所述重链CDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68和SEQ IDNO：78。
在某些实施方案中，所述参比抗体的重链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：91，且所述参比抗体的轻链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：85。在某些实施方案中，所述参比抗体的重链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100，且所述参比抗体的轻链包含下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：97。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
在某些实施方式中，所述CD137蛋白为人CD137蛋白。例如，所述CD137蛋白包含SEQID NO.99所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。
在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链。例如，所述抗体轻链可包含LCDR1，且所述LCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：71。在某些实施方式中，所述抗体轻链包含LCDR2，且所述LCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：72。在某些实施方式中，所述抗体轻链包含LCDR3，且所述LCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：73。
在某些实施方式中，所述抗体轻链包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：85。在某些实施方式中，所述抗体轻链包含下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：97。在某些实施方式中，所述抗体轻链包含人Igκ恒定区。
在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段包含抗体重链。例如，所述抗体重链可包含HCDR1，且所述HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：76。在某些实施方式中，所述抗体重链包含HCDR2，且所述HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：77。在某些实施方式中，所述抗体重链包含HCDR3，且所述HCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：78。
在某些实施方式中，所述抗体重链包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：87、SEQ IDNO：89和SEQ ID NO：91。在某些实施方式中，所述抗体重链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100。在某些实施方式中，所述抗体重链包括人IgG恒定区。在某些实施方式中，所述人IgG恒定区包含人IgG2恒定区。在某些实施方式中，所述人IgG恒定区包含人IgG2a恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组：c2H10、c3F3、c3F10、c20A11、c34F2、c9A7、c6F5和c8G6。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。
另一方面，本申请提供了宿主细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供了制备所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在使得所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本申请所述的宿主细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段以及任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗癌症或自身免疫病的药物中的用途。
另一方面，本申请提供了用于制备预防或治疗癌症或自身免疫病的药物的所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本申请提供了治疗或预防与癌症或自身免疫病的方法，其包括向有需要的受试者使用所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述癌症选自以下组：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。在某些实施方式中，所述自身免疫病选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。
另一方面，本申请提供了抗体或其抗原结合片段，其用于：1)制备预防或治疗癌症或自身免疫病；2)抑制CD137蛋白与CD137配体结合；3)刺激免疫细胞分泌细胞因子；4)激活NF-κB信号通路；和/或5)促进PBMC细胞增殖。
在某些实施方式中，所述癌症选自以下组：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。在某些实施方式中，所述自身免疫病选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段与所述CD137配体竞争对所述CD137蛋白的结合。在某些实施方式中，所述CD137蛋白为人CD137蛋白。
在某些实施方式中，所述细胞因子包括干扰素和白细胞介素。例如，所述细胞因子选自以下组：IFN-α、IFN-β和IFN-γ。又例如，所述细胞因子选自以下组：IL2、IL6和IL12。
在某些实施方式中，所述激活NF-κB信号通路包括使NF-κB荧光素酶报告基因的表达水平的上调。
在某些实施方式中，所述PBMC细胞增殖包括增加所述PBMC细胞的增殖倍数。在某些实施方式中，所述PBMC细胞增殖包括缩短所述PBMC细胞的细胞周期。
另一方面，本申请提供了抑制CD137与CD137配体结合的方法，其包括施用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了刺激免疫细胞分泌细胞因子的方法，其包括施用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述细胞因子选自以下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL2、IL6和IL12。在某些实施方式中，所述免疫细胞包括T细胞。
另一方面，本申请提供了激活NF-κB信号通路的方法，其包括施用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了促进PBMC细胞增殖的方法，其包括施用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述PBMC细胞增殖包括增加所述PBMC细胞的增殖倍数和/或缩短所述PBMC细胞的细胞周期。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1A-1B以及图2A-2H显示的是本申请中鼠抗人CD137抗体与CD137配体的竞争结合信号。
图3显示的是本申请中人源化CD137抗体激活NF-κB信号通路产生的荧光值变化。
图4显示的是本申请中鼠抗人CD137抗体促进PBMC细胞增殖的结果。
图5A-5B分别显示的是CD137抗体促进IL2和IFNγ表达的结果。
图6显示的是CD137抗体抑制MC38肿瘤生长的结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。本申请所述的CD137抗体可以以较高的亲和力特异性结合CD137蛋白，能够刺激或激活CD137蛋白，激活NF-κB信号通路，能够促进PBMC细胞增殖，能够刺激免疫细胞分泌细胞因子，能够用于杀伤癌细胞和能够用于治疗自身免疫疾病。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
在本申请中，术语“抗原结合部分”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下的片段来实现：(1)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(2)F(ab’)2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)和(7)可任选地通过接头连接的两个或以上分离的CDR的组合。此外，还可包括由VL和VH配对形成的一价单链分子Fv(scFv)(参见Bird等(1988)Science 242：423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。所述“抗原结合部分”还可包括免疫球蛋白融合蛋白，所述融合蛋白包含选自以下的结合结构域：(1)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(2)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；和(3)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
在本申请中，术语“CD137蛋白”又叫4-1BB蛋白，是30kDa的I型膜糖蛋白，其作为55kDa的同源二聚体表达。其是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)基因家族的成员。其可参与调节细胞增殖、分化和程序性细胞死亡。所述受体首先在小鼠中描述(B.Kwon等，P.N.A.S.USA，86：1963-7(1989))，随后在人中鉴定(M.Alderson等，Eur.J.Immunol.，24：2219-27(1994)；Z.Zhou等，Immunol.Lett.，45：67(1995))(参见W095/07984和WO96/29348，和美国专利6,569,997)。人和小鼠形式的CD137在氨基酸水平有60％的同一性。保守的序列存在细胞质结构域以及分子的5个其它区域中，表明这些残基对于CD137分子的功能而言可能是重要的(参见Z.Zhou等，Immunol.Lett.，45：67(1995))。CD137的表达主要在淋巴细胞系诸如活化的T-细胞，活化的天然杀伤(NK)细胞，NKT-细胞，CD4、CD25调节T-细胞上，也在活化的胸腺细胞以及皮内淋巴细胞上。此外，CD137也在骨髓源性细胞诸如树突细胞，单核细胞，中性粒细胞，以及嗜酸性细胞上表达。尽管CD137表达主要限制在免疫/炎性细胞，有报道描述其在与少数来自炎性位点和肿瘤的组织相关的内皮细胞上表达。
在本申请中，术语“NF-κB”通常是指位于B细胞免疫球蛋白的κ轻链上的，参与细胞的生长、粘附、炎症反应和分化的一种转录因子。NF-κB家族在哺乳动物体内共分为5种亚基，包括RelA(p65)、c_Rel、RelB、NF-κB1(p50/p65)和NF-κB2(p52/pl00)。NF-κB1(p50/p65)为异源二聚体，p50由其前体p100水解而成，含核定位信号(Nuclear LocatizationSignal，NLS)；而p65含转录活化区域(transcriptionactivation domain)，参与基因转录的起始调节，并可促进p50与DNA的结合。当特异性的p65与细胞浆内抑制性蛋白IκB(包括7种亚型：IκBα、IκBβ、IκBε、p105/IκBγ、p100/IκBδ、IκBζ和Bcl-3结合，就阻碍了与p50形成二聚体，使静止于细胞浆中的NF-κB处于p65-IκB二聚体的无活性状态。当细胞受到炎症因子、免疫相关因子和TNF等多种信号刺激时，NF-κB可以被激活。NF-κB的激活途径有多种，其中经典的激活途径为在细胞受刺激后，IκBs首先被活化的IκB激酶(IKK)磷酸化。磷酸化的IκBα在泛素连接酶(ubiquitin-conjugating enzymes)的作用下进一步泛素化，即在已磷酸化的IκBα的N端21和22位的赖氨酸处分别共价结合上泛素分子，最终被磷酸化并被泛素化的IκBα发生构象变化，被ATP依赖性26S蛋白酶(proteasome)识别并降解，释放出游离的p65，使之与由p100裂解而来的p50结合成为p65-p50的二聚体进入核内。NF-κB结合到存在于调控DNA上的κB序列，从而启动下游基因转录，如TNF、IL-1和A20的编码基因等。研究表明，NF-κB的失活是指新合成的IκB进入细胞核中与NF-κB结合，从而降低NF-κB与DNA的亲和力，使得NF-κB从结合部位解离下来，重新又回到细胞质中等待激活。NF-κB的活化在肿瘤的形成过程中起到了重要作用。肿瘤细胞的存活需要由新生血管提供必需的氧气和营养，所以肿瘤必须分泌趋化信号如生长因子(如VEGF，MCP-1)和细胞因子来诱导新生血管的形成，而NF-κB则调节这些趋化因子的表达。另外，NF-κB也调节和肿瘤转移相关的分子表达，癌症转移需要癌细胞进出血管壁，而跨越血管壁的能力要由某些特殊的分子调节。这些特殊的分子又受到炎性细胞及肿瘤细胞的细胞因子调节。这些特殊的细胞因子包括细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和内皮白细胞粘附分子(ELAM-1)等，也要在NF-κB活化后才能表达，而肿瘤微环境中的血流压力波动和间歇性氧不足都会活化NF-κB。因此，NF-κB的活化不仅促成了癌细胞对血管壁的跨越，而且又诱导了新生血管形成所需的趋化因子的基因转录。NF-κB的活化还可以阻断细胞凋亡，促进细胞的增殖。研究表明NF-κB在抑制肿瘤凋亡中起到调解作用。除肿瘤细胞外，NF-κB在多种细胞中都有抗凋亡作用，如B细胞、T细胞、粒细胞、巨噬细胞和神经细胞。NF-κB的抗凋亡作用可能通过调控编码抗凋亡因子如IL-1和IL-6等的基因表达来实现。另外，NF-κB能够调控细胞周期蛋白(比如cyclinD1和CDK2激酶)的表达，从而影响细胞循环。NF-κB引起肿瘤增生的另一种机制是持续性的活化。NF-κB的活化发生在抑制性亚基(IκB)降解之后，它从细胞浆进入细胞核。在细胞核内NF-κB与DNA上的κB位点结合，调节许多参与机体应激反应的蛋白表达，这些表达最终导致肿瘤的形成。如果NF-κB在核内持续存在，就具有持续活化作用。
在本申请中，术语“PBMC细胞”通常是指外周血中具有单个核的细胞(Peripheralblood mononuclearcell，PBMC)，包括淋巴细胞和单核细胞。在本申请中，分离所述外周血单核细胞可使用Ficoll-hypaque(葡聚糖-泛影葡胺)密度梯度离心法，根据血液中各成分的比重差异进行分离。
在本申请中，术语“细胞因子”通常是指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。所述细胞因子可具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。在本申请中，所述细胞因子可包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子和生长因子。例如，所述细胞因子为白细胞介素。在本申请中，白细胞介素通常是指能够促进T和/或B淋巴细胞和/或造血细胞的发育和分化的分泌蛋白或信号分子。白介素可以由辅助CD4T淋巴细胞，以及通过单核细胞，巨噬细胞和内皮细胞合成。如本文所用，白介素(IL)可以包括IL2、IL6和IL12。如白细胞介素可以包括全长白介素或片段(例如截短形式)或其变体，其基本上保持相应野生型白细胞介素的生物学活性(例如，具有生物活性至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或甚至至少100％的相应野生型白细胞介素的生物活性)。本文所用的白细胞介素可以来自任何哺乳动物物种。在一些实施方案中，白细胞介素来自选自人、马、牛、鼠、猪、兔、猫、狗、大鼠、山羊、绵羊和非人灵长类动物的物种。在一些实施方案中，白细胞介素可以是突变形式。例如，白细胞介素可以是超IL-2(也称为sIL2，参见Nature 484，529-533，2612)，其可以通过修饰IL-2以增加其对IL-2Rβ的结合亲和力而获得。sIL-2中的突变主要是细胞因子的核心，分子动力学模拟表明，进化型突变使IL-2稳定，将IL-2Rβ结合位点中螺旋的灵活性降低到类似于优化的受体结合构象当绑定到CD25。与IL-2相比，sIL-2诱导细胞毒性T细胞的优异扩增，导致体内抗肿瘤反应改善，引起T调节细胞扩张少，肺水肿减少。例如，在本申请中，所述细胞因子包括选自下组的一种或多种：IL2、IL6和IL12。例如，所述细胞因子为“干扰素”。主要的干扰素是IFN-α、IFN-β和γ-IFN-γ。一般白细胞干扰素称为IFN-α，纤维原细胞干扰素为IFN-β，T细胞干扰素为IFN-γ。还有第四种干扰素，淋巴母细胞干扰素，它是由“Namalwa”细胞系(来源于Burkitt’s淋巴瘤)产生。干扰素用作治疗性蛋白药物，可治疗多种疾病例如多发性硬化症、肿瘤、病毒性疾病如SARS或丙型肝炎病毒感染。
在本申请中，术语“KD”可与“KD”互换使用，通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，单位为M(mol/L)。KD可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓度来计算，具体计算方式如公式所示：KD＝c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知，KD值越大，说明解离越多，代表物质A、B之间的亲和力越弱；反之，KD值越小，说明解离越少，代表物质A、B之间的亲和力越强。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指仅有一种类型得免疫细胞制造出来的抗体。即，包含该群的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇修饰语″单克隆″不是被解释为需要通过任何特殊方法产生抗体。例如，所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生单克隆抗体也可以得自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal.，Nature，352：624-628(1991)和Markset al.，Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术进行。
在本申请中，术语“单链抗体”(scFv)通常是指是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接子(linker)连接而成的分子。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指将来自一个物种的可变区与来自另一个物种的恒定区融合而成的抗体。所述抗体中，每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指使用遗传工程技术将衍生自非人物种(例如小鼠或大鼠)的抗体、免疫球蛋白结合蛋白和多肽对人体的免疫原性降低，同时仍保留原始抗体的抗原结合特性的改造抗体。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.，Nature321：522(1986))及其变体；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen，et al.，1988Science239：1534-1536；Riechmann，et al.，1988Nature 332：323-337；Tempest，et al.，Bio/Technol 19919：266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen，et al.，1989ProcNatl Acad Sci USA 86：10029-10033；Co，et al.，1991Proc Natl Acad Sci USA88：2869-2873；Co，et al.，1992J Immunol 148：1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark，et al.，“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18antibodies.”In：Metcalf B W，Dalton B J，eds.Cellular adhesion：moleculardefinition to therapeutic potential.New York：Plenum Press，1994：291-312)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，术语“IgG”通常是指免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)。IgG是人的免疫球蛋白之一，其他还有lgA、lgM、IgD和lgE。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75％。根据IgG分子中的γ链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG在免疫中发挥重要的作用。
在本申请中，术语“表位”通常是指抗原决定簇，即指分子中被免疫系统识别(例如被抗体识别)的部分。例如，表位是被免疫系统识别的抗原上不连续的三维位点。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位根据结构，可分为构象表位和非构象表位(线性表位)。构象表位与非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下前者丧失结合，而后者则不会。只位于抗原物质表面、易与抗原识别受体或抗体结合的表位可称为功能性表位；位于分子内部、无免疫原性的表位可称为隐藏性表位。
在本申请中，术语“胞外结构域”通常是指蛋白质的细胞外结构域(extracellulardomain)。例如，CD137蛋白的胞外结构域富含半胱氨酸，CD137蛋白c末端的胞外结构域含22个氨基酸长度的疏水区，无信号段序列，无潜在的n-糖基位点。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制、将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间的核酸分子。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本申请中，术语“重组宿主细胞”通常指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指哺乳动物中的机体(例如，细胞或其组成部分)在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的赘生物。在本申请中，肿瘤可以包括淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和血液肿瘤等。例如，本申请中的肿瘤可包括胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和/或胆囊癌等。
在本申请中，术语“自身免疫病”通常是指生内源性细胞和/或组织再生的自身免疫病。这些自身免疫病包括但不限于系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。例如，本申请中的自身免疫病可选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和/或类风湿性关节炎。
在本申请中，术语“药物上可接受的佐剂”通常是指任何与所施用的活性成分相容的溶剂、分散介质、涂层、等渗剂和吸收延迟剂等载体。
在本申请中，术语“增加”通常指使得水平(例如细胞增殖的水平)整体提高，例如提高5％或更多、10％或更多、20％或更多，50％或更多，或75％或更多的能力。
在本申请中，术语“缩短”通常指使得时间(例如细胞周期)整体缩短，例如缩短5％或更多、10％或更多、20％或更多，50％或更多，或75％或更多的能力。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
抗体或其抗原结合片段
在一个方面，本申请提供了一种抗体或其抗原结合片段，其以5×10-9M以下(例如，所述KD的值可为不高于约5×10-9M、不高于约1×10-9M、不高于约9×10-10M、不高于约8×10-10M、不高于约7×10-10M、不高于约6×10-10M、不高于约5×10-10M、不高于约4×10-10M、不高于约3×10-10M、不高于约2×10-10M、不高于约1×10-10M或不高于约1×10-11M或以下)的KD值与CD137蛋白相结合。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段，结合CD137蛋白时的滴度为1∶104(例如，所述的滴度可为不低于5∶105、4∶105、3∶105、2∶105、1∶105、5∶106)或更高。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可与CD137配体竞争对CD137蛋白的结合。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可激活NF-κB信号通路。例如，所述NF-κB可包含选自下组的一个或多个亚基：Rel(cRel)、p65(NF-κB3)、RelB、p50(NF-κB1)和p52(NF-κB2)。例如，所述激活NF-κB信号通路可包括使NF-κB荧光素酶报告基因的表达水平上调(例如，上调约至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍或更多)。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可促进PBMC细胞增殖。例如，所述PBMC细胞增殖可包括增加(例如，可约提高5％或更多、10％或更多、20％或更多，50％或更多，或75％或更多)所述PBMC细胞的增殖倍数。例如，所述PBMC细胞增殖可包括缩短(例如，可缩短5％或更多、10％或更多、20％或更多，50％或更多，或75％或更多)所述PBMC细胞的细胞周期。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可刺激免疫细胞分泌细胞因子。例如，所述细胞因子可选自以下组：IFN-α、IFN-β和IFN-γ。又例如，所述细胞因子可选自以下组：IL2、IL6和IL12。例如，所述免疫细胞可包括T细胞。
当与CD137蛋白结合时，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可与所述CD137蛋白的胞外结构域中的一个或多个表位结合。例如，当与CD137蛋白结合时，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可与位于相应于人CD137蛋白的第30位至第100位中的一个或多个表位结合。例如，所述人CD137蛋白的第30位至第100位的氨基酸序列如SEQ ID NO：95所示。例如，当与CD137蛋白结合时，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可结合选自选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：L24、P27、N30、D38、N39、R41、N42、S46、A56、G57、R60、T61、K69、R75、E77、T89、P90和S100。其中，“氨基酸A-数字X”的形式表示第X位的氨基酸残基为氨基酸A。其中，“人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基”可以是指人CD137蛋白氨基酸残基，或者，具有与所述人CD137蛋白氨基酸残基相同的氨基酸种类和相应的相对位置的、位于不同于人的其他物种的CD137蛋白中的氨基酸残基。
例如，当与CD137蛋白结合时，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：N30、A56、G57、R60和T61(这些氨基酸残基可称为人CD137N&E)；或者选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：N30、D38、N39、R41、S46、A56、G57、R60和T61(这些氨基酸残基可称为人CD137N&E)1；或者选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：N30、A56、G57、R60、T61、K69、R75和E77(这些氨基酸残基可称为人CD137N&E2)；或者选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：L24、P27、N42、T89、P90和S100(这些氨基酸残基可称为人CD137N&E 3)；或者选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：L24、P27、N30、D38、N39、R41、N42、S46、A56、G57、R60、T61、K69、R75、E77、T89、P90和S100(这些氨基酸残基可称为人CD137N&E4)。
在某些实施方式中，当与CD137蛋白结合时，本申请所述的抗体或其抗原结合片段不与位于相应于人CD137蛋白的第110位至第170位(例如第115位至第156位)中的表位结合。所述人CD137蛋白的第110位至第170位的氨基酸序列可如SEQ ID NO：94所示。所述人CD137蛋白的第115位至第156位的氨基酸序列可如SEQ ID NO：93所示。
在某些实施方式中，当与CD137蛋白结合时，本申请的抗体或其抗原结合片段不与选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基结合：K115、C121、R134、R154、V156、S161、P162、D164、L165和A169。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可通过与CD137特异性结合而杀伤癌细胞和/或抑制癌细胞的增殖。例如，所述癌细胞选自下组：胃癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、头颈癌细胞和膀胱癌细胞。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
本申请所述的CD137蛋白可为人CD137蛋白。例如，所述CD137蛋白可包含SEQ IDNO：99所示的氨基酸序列，或者与其具有至少约70％(例如，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或至少约100％)序列同一性的其变体或片段。
本申请所述的抗原结合片段可选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可包含抗体轻链。例如，所述抗体轻链可包含人Igκ恒定区。
例如，所述抗体轻链可包含LCDR1，且所述LCDR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：71。例如，所述抗体轻链可包含LCDR2，且所述LCDR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：72。又例如，所述抗体轻链可包含LCDR3，且所述LCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：73。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段中的抗体轻链可包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：74和SEQ ID NO：85。在某些实施方式中，所述抗体轻链可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：97。
在某些实施方式中，编码所述轻链可变区VL包含下述任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：86。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可包含抗体重链。例如，所述抗体重链可包括人IgG恒定区。其中，所述人IgG恒定区可包含人IgG2恒定区。例如，所述人IgG恒定区可包含人IgG2a恒定区。
例如，所述抗体重链可包含HCDR1，且所述HCDR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：76。例如，所述抗体重链可包含HCDR2，且所述HCDR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：77。又例如，所述抗体重链可包含HCDR3，且所述HCDR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：78。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段中的抗体重链可包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：91。在某些实施方式中，所述抗体重链可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100。
所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合CD137)，且与其具有至少70％(例如，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合CD137)，且在其基础上包含一个或多个(例如，1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。
在某些实施方式中，编码所述重链可变区VH的序列可包含下述任一项所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQID NO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：92。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：2；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：3；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：6；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQID NO：7；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：8。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c2H10或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：4；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ IDNO：9。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c2H10或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：2；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：3；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：6；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：7；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：8。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体c2H10或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ IDNO：4；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：9。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c2H10或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：11；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：12；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：13；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：16；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：17；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：18。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c3F3或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：14；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：19。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c3F3或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：11；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：12；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：13；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：16；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：17；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：18。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体c3F3或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：14；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：19。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c3F3或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：21；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：22；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：23；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：26；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：27；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：28。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c3F10或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：24；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：29。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c3F10或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：21；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：22；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：23；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：26；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：27；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：28。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体c3F10或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：24；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：29。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c3F10或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：31；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：32；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：33；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：36；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：37；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：38。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c20A11或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：34；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：39。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c20A11或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：31；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：32；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：33；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：36；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：37；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：38。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体c20A11或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：34；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：39。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c20A11或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：41；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：42；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：43；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：46；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：47；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：48。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c34F2或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：44；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：49。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c34F2或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：41；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：42；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：43；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：46；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：47；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：48。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体c34F2或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：44；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：49。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c34F2或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：51；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：52；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：53；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：56；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：57；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：58。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c9A7或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：54；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：59。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c9A7或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：51；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：52；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：53；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：56；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：57；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：58。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体c9A7或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：54；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：59。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c9A7或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：61；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：62；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：63；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：66；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：67；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：68。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c6F5或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：64；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：69。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c6F5或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：61；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：62；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：63；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：66；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：67；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：68。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体c6F5或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：64；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：69。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c6F5或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：71；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：72；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：73；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：76；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：77；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：78。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c8G6或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：74；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：79。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c8G6或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：71；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：72；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：73；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：76；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：77；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：78。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体c8G6或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：74；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：79。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体c8G6或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体可选自下组：c2H10、c3F3、c3F10、c20A11、c34F2、c9A7、c6F5和c8G6。
其中，所述抗体c2H10与CD137蛋白结合时，可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：所述人CD137N&E2和所述人CD137N&E4。其中，所述抗体c3F3与CD137蛋白结合时，可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：所述人CD137N&E。其中，所述抗体c3F10与CD137蛋白结合时，可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：所述人CD137N&E、所述人CD137N&E 1、所述人CD137N&E 3和所述人CD137N&E 4。其中，所述抗体c6F5与CD137蛋白结合时，可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：所述人CD137N&E 3和所述人CD137N&E4。其中，所述抗体c9A7与CD137蛋白结合时，可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：所述人CD137N&E 1和所述人CD137N&E 4。其中，所述抗体c20A11与CD137蛋白结合时，可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：所述人CD137N&E 3和所述人CD137N&E 4。其中，所述抗体c34F2与CD137蛋白结合时，可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：所述人CD137N&E 1和所述人CD137N&E4。其中，所述抗体c8G6与CD137蛋白结合时，可结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：所述人CD137N&E1。
在某些实施方式中，可对本申请所述抗体进行人源化改造。在某些实施方式中，所述人源化改造可完全保留CDR区的氨基酸序列，仅对FR区进行人源化改造。例如，可以对抗体c6F5进行人源化改造，获得人源化抗体Hu6F5、Hu6F5-1和Hu6F5-2。
在本申请中，所述人源化抗体可包括重链和轻链。在某些实施方式中，所述人源化抗体重链可包含选自下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100。在某些实施方式中，所述人源化抗体的轻链可包含下述的氨基酸序列或其变体：SEQ IDNO：97。
在本申请中，所述人源化抗体可包括重链可变区和轻链可变区。在某些实施方式中，所述人源化抗体重链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列或其变体：SEQ IDNO：87、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：91。在某些实施方式中，所述人源化抗体轻链可变区可包含下述氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO：86。
在本申请中，所述人源化抗体的重链可变区可包括HCDR1-3。在某些实施方式中，所述人源化抗体中的HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：66；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：67；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：68。在本申请中，所述人源化抗体的轻链可变区可包括LCDR1-3。在某些实施方式中，所述人源化抗体中的LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：61；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：62；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：63。例如，本申请所述人源化抗体Hu6F5、Hu6F5-1和Hu6F5-2可包括与抗体c6F5相同的HCDR1-3和LCDR1-3，所述HCDR1-3的氨基酸序列可分别依次如SEQ ID NO：66-68所示，所述LCDR1-3的氨基酸序列可分别依次如SEQ ID NO：61-62所示。
例如，本申请所述的人源化抗体可包括Hu6F5，其重链可包括SEQ ID NO：98，其轻链可包括SEQ ID NO：97；其重链可变区可包括SEQ ID NO：87，其轻链可变区可包括SEQ IDNO：85；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：66；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：67；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：68，其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：61；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：62；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：63。
例如，本申请所述的人源化抗体可包括Hu6F5-1，其重链可包括SEQ ID NO：99，其轻链可包括SEQ ID NO：97；其重链可变区可包括SEQ ID NO：89，其轻链可变区可包括SEQID NO：85；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：66；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO：67；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：68，其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：61；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：62；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：63。
例如，本申请所述的人源化抗体可包括Hu6F5-2，其重链可包括SEQ ID NO：100，其轻链可包括SEQ ID NO：97；其重链可变区可包括SEQ ID NO：91，其轻链可变区可包括SEQID NO：85；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：66；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO：67；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：68，其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：61；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：62；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO：63。
在另一个方面，本申请还提供了一种所述的抗体或其抗原结合片段，其用于：1)制备预防或治疗癌症或自身免疫病；2)抑制CD137蛋白与CD137配体结合；3)刺激免疫细胞分泌细胞因子；4)激活NF-κB信号通路；和/或5)促进PBMC细胞增殖。
在本申请中，所述癌症可选自以下组胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。在本申请中，所述自身免疫病可选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。
在本申请中，所述的抗体或其抗原结合片段可以与所述CD137配体竞争对所述CD137蛋白的结合。例如，所述CD137蛋白为人CD137蛋白。
在本申请中，所述的细胞因子可以包括干扰素和白细胞介素。例如，所述细胞因子可选自以下组：IFN-α、IFN-β和IFN-γ。又例如，所述细胞因子可以选自以下组：IL2、IL6和IL12。
在本申请中，所述激活NF-κB信号通路可包括使NF-κB荧光素酶报告基因的表达水平上调。
在本申请中，所述PBMC细胞增殖可以包括增加所述PBMC细胞的增殖倍数。也可包括缩短所述PBMC细胞的细胞周期。
核酸、载体、宿主细胞和制备方法
在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗体或其抗原结合片段。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗体或其抗原结合片段，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。例如，所述表达载体可以为pDR1、pcDNA3.4(+)、pDHFF或pCHO 1.0。
在另一方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293A细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述宿主细胞可以为COS、CHO、NSO、sf9、sf21、DH5a、BL21(DE3)或TG1。
在另一个方面，本申请提供了制备所述抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法可包括，在使得所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
在某些情形中，所述方法还可包括分离和/或纯化所述抗体或其抗原结合片段的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的抗体或其抗原结合片段。例如，还可以通过使用高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
药物组合物、应用
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段以及任选地药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述药物组合物可以用于抑制肿瘤生长。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，可以减小肿瘤大小(甚至基本消除肿瘤)，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。
本申请所述的药物组合物可以包含治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段。所述治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的病症或病症(例如癌症)和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面，本申请提供了所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗癌症或自身免疫病的药物中的用途。
另一方面，本申请提供了用于制备预防或治疗癌症或自身免疫病的药物的所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本申请提供了治疗或预防与癌症或自身免疫病的方法，其包括施用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
在本申请中，所述癌症可选自以下组胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。在本申请中，所述自身免疫病可选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。
另一方面，本申请提供了抑制CD137与CD137配体结合的方法，其包括施用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了刺激免疫细胞分泌细胞因子的方法，其包括施用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
在本申请中，所述细胞因子可选自以下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL2、IL6和IL12。在本申请中，所述免疫细胞可包括T细胞。
另一方面，本申请提供了激活NF-κB信号通路的方法，其包括向有需要的受试者使用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了促进PBMC细胞增殖的方法，其包括向有需要的受试者使用所述的抗体或其抗原结合片段和/或所述的药物组合物。
在本申请中，所述PBMC细胞增殖可包括增加(例如，可提高5％或更多、10％或更多、20％或更多，50％或更多，或75％或更多)所述PBMC细胞的增殖倍数和/或缩短(例如，可缩短5％或更多、10％或更多、20％或更多，50％或更多，或75％或更多)所述PBMC细胞的细胞周期。
另一方面，本申请还提供了以下实施方式：
1抗体或其抗原结合片段，其以1×10-9M以下的KD值与CD137蛋白相结合。
2根据实施方式1所述的抗体或其抗原结合片段，其结合CD137蛋白时的滴度为1∶104或更高。
3根据实施方式1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与CD137配体竞争对所述CD137蛋白的结合。
4根据实施方式1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其激活NF-κB信号通路。
5根据实施方式4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述激活NF-κB信号通路包括使NF-κB荧光素酶报告基因的表达水平的上调。
6根据实施方式1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其促进PBMC细胞增殖。
7根据实施方式6所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述PBMC细胞增殖包括增加所述PBMC细胞的增殖倍数。
8根据实施方式6或7所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述PBMC细胞增殖包括缩短所述PBMC细胞的细胞周期。
9根据实施方式1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其刺激免疫细胞分泌细胞因子。
10根据实施方式9所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述细胞因子包括干扰素和白细胞介素。
11根据实施方式9或10所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述细胞因子选自以下组：IFN-a、IFN-β和IFN-γ。
12根据实施方式9或11所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述细胞因子选自以下组：IL2、IL6和IL12。
13根据实施方式9-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述免疫细胞包括T细胞。
14根据实施方式1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，当与CD137蛋白结合时，其与所述CD137蛋白的胞外结构域中的一个或多个表位结合。
15根据实施方式1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，当与CD137蛋白结合时，其与位于相应于人CD137蛋白的第30位至第100位中的一个或多个表位结合。
16根据实施方式15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人CD137蛋白的第30位至第100位的氨基酸序列如SEQ ID NO：95所示。
17根据实施方式15-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，当与CD137蛋白结合时，其结合选自下组的一个或多个人CD137蛋白氨基酸残基或者与这些氨基酸残基相应的CD137蛋白氨基酸残基：L24、P27、N30、D38、N39、R41、N42、S46、A56、G57、R60、T61、K69、R75、E77、T89、P90和S100。
18根据实施方式1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，当与CD137蛋白结合时，其不与位于相应于人CD137蛋白的第115位至第156位中的表位结合。
19根据实施方式18所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人CD137蛋白的第115位至第156位的氨基酸序列如SEQ ID NO：93所示。
20根据实施方式1-19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其通过与所述CD137蛋白特异性结合而杀伤癌细胞和/或抑制癌细胞的增殖。
21根据实施方式20所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述癌细胞选自下组：胃癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、头颈癌细胞和膀胱癌细胞。
22根据实施方式1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与参比抗体竞争结合所述CD137蛋白，其中所述参比抗体包含抗体重链和轻链，该参比抗体包含轻链CDR1-3，且所述轻链CDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：11、SEQID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：71，所述轻链CDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：72；以及所述轻链CDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：73，且该参比抗体包含重链CDR1-3，所述重链CDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO：6、SEQIDNO：16、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66和SEQID NO：76，所述重链CDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：77；以及所述重链CDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：78。
23根据实施方式1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述参比抗体的重链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：87、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：91，且所述参比抗体的轻链可变区包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：85。
24根据实施方式1-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述参比抗体的重链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100，且所述参比抗体的轻链包含下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：97。
25根据实施方式1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
26根据实施方式1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD137蛋白为人CD137蛋白。
27根据实施方式1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述CD137蛋白包含SEQ ID NO.96所示的氨基酸序列。
28根据实施方式1-27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。
29根据实施方式1-28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体轻链。
30根据实施方式29所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含LCDR1，且所述LCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：11、SEQID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：71。
31根据实施方式29或30所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含LCDR2，且所述LCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQID NO：22、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：72。
32根据实施方式29-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含LCDR3，且所述LCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ IDNO：73。
33根据实施方式29-32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：85。
34根据实施方式29-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含人Igκ恒定区。
35根据实施方式29-34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包包含下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：97。
36根据实施方式1-35中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链。
37根据实施方式36所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链包含HCDR1，且所述HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQID NO：26、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：76。
38根据实施方式36-37中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链包含HCDR2，且所述HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67和SEQ IDNO：77。
39根据实施方式36-38中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链包含HCDR3，且所述HCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68和SEQ IDNO：78。
40根据实施方式36-39中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含下述任一项所示的氨基酸序列：：SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：91。
41根据实施方式36-40中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100。
42根据实施方式36-41中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链包括人IgG恒定区。
43根据实施方式42所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG恒定区包含人IgG2恒定区。
44根据实施方式43所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG恒定区包含人IgG2a恒定区。
45根据实施方式1-44中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自下组：c2H10、c3F3、c3F10、c20A11、c34F2、c9A7、c6F5和c8G6。
46分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
47载体，其包含根据实施方式46所述的一种或多种核酸分子。
48宿主细胞，其包含根据实施方式46所述的核酸分子或根据实施方式47所述的载体。
49制备实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在使得所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养根据实施方式48所述的宿主细胞。
50药物组合物，其包含根据实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和任选地药学上可接受的载体。
51根据实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗癌症或自身免疫病的药物中的用途。
52根据实施方式51所述的用途，其中所述癌症选自以下组：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
53根据实施方式51所述的用途，其中所述自身免疫病选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。
54根据实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于：
1)预防或治疗癌症或自身免疫病；
2)抑制CD137蛋白与CD137配体结合；
3)刺激免疫细胞分泌细胞因子；
4)激活NF-κB信号通路；和/或
5)促进PBMC细胞增殖。
55根据实施方式54所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述癌症选自以下组：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
56根据实施方式54-55中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述自身免疫病选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。
57根据实施方式54-56中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与所述CD137配体竞争对所述CD137蛋白的结合。
58根据实施方式54-57中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD137蛋白为人CD137蛋白。
59根据实施方式54-58中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞因子包括干扰素和白细胞介素。
60根据实施方式59所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述细胞因子选自以下组：
IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
61根据实施方式59或60所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述细胞因子选自以下组：IL2、IL6和IL12。
62根据实施方式54-61中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述激活NF-κB信号通路包括使NF-κB荧光素酶报告基因的表达水平的上调。
63根据实施方式54-62中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述PBMC细胞增殖包括增加所述PBMC细胞的增殖倍数。
64根据实施方式54-63中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述PBMC细胞增殖包括缩短所述PBMC细胞的细胞周期。
65治疗或预防癌症或自身免疫病的方法，其包括施用根据实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或如实施方式50所述的药物组合物。
66根据实施方式65所述的方法，其中所述癌症选自以下组：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
67根据实施方式64或65所述的方法，其中所述自身免疫病选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。
68抑制CD137与CD137配体结合的方法，所述方法包括施用根据实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或根据实施方式50所述的药物组合物。
69刺激免疫细胞分泌细胞因子的方法，其中，所述方法包括施用根据实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或根据实施方式50所述的药物组合物。
70根据实施方式69所述的方法，其中所述细胞因子选自以下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL2、IL6和IL12。
71根据实施方式69或70所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞。
72激活NF-κB信号通路的方法，其中，所述方法包括施用根据实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或如实施方式50所述的药物组合物。
73促进PBMC细胞增殖的方法，其中，所述方法包括施用根据实施方式1-45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或根据实施方式50所述的药物组合物。
74根据实施方式73所述的方法，其中所述PBMC细胞增殖包括增加所述PBMC细胞的增殖倍数和/或缩短所述PBMC细胞的细胞周期。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的装置、方法和系统的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1抗体的制备
小鼠免疫：balb/c小鼠经腹腔(i.p.)和皮下(s.c.)用福氏佐剂(sigma)混合50μg人CD137细胞外结构域蛋白(购自北京义翘神州科技有限公司)免疫5次。融合前，小鼠经腹腔内用相同量的抗原强化。来自经免疫小鼠的脾细胞的抗人CD137抗体的血清效价(滴度)达到105时，将免疫小鼠的脾细胞根据标准方法融合于小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。
杂交瘤融合：按现有常规杂交瘤融合方法融合小鼠脾脏，HAT筛选法筛选融合后的杂交瘤细胞。取上清用人CD137-his-tag抗原包被的酶标板进行ELISA检测。挑选出阳性杂交瘤克隆于24孔板中扩大培养并通过有限稀释法进行亚克隆。获得稳定表达目的抗体的杂交瘤株后进行保种建库。
杂交瘤筛选：通过ELISA检测与人CD137的结合。为鉴定分泌抗人CD137抗体的杂交瘤：用含有1μg/mL人CD137-his融合蛋白的PBS溶液在4℃包被ELISA板(购自NuncMaxiSorp)过夜。该板随后用含有0.01％吐温-20的PBS溶液(PBS-T)洗涤二次，然后向PBS-T加1％牛血清白蛋白(BSA)在室温封闭20min。将在PBS-T中稀释的50μL上清加入ELISA板，然后在环境温度保温1-2小时。如前述洗涤板，抗体的结合通过与辣根过氧化酶偶联的山羊抗鼠抗体(购自sigma公司)检测。用TMB显色并在450nm读数。
实施例2抗体序列的确定
使用TrizoI(购自上海生工生物)提取实施例1制备的杂交瘤细胞株的总RNA，用逆转录试剂盒(购自Takara公司)将mRNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板做PCR，使用Ig-PrimerSets试剂盒分别克隆抗体重链和轻链可变区序列；将克隆得到的抗体重链和轻链可变区序列测序。
分别将测序得的抗体命名为c2H10、c3F3、c3F10、c20A11、c34F2、c9A7、c6F5和c8G6。将这些单抗构建成嵌合抗体：将各抗体的重链可变区和轻链可变区分别克隆到重链表达载体和轻链表达载体，将各嵌合抗体重、轻链表达载体后共同瞬时转染293F细胞表达抗体蛋白。在37℃、5％CO2的摇床中培养7天后收集上清，用琼脂糖凝胶protein A层析填料(GE)纯化上清中的嵌合抗体。构建嵌合抗体分别命名为c2H10、c3F3、c3F10、c20A11、c34F2、c9A7、c6F5和c8G6，
测序结果显示，抗体c2H10的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；VL对应的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；抗体c2H10的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；VH对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。该嵌合抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；重链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。该嵌合抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；轻链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
抗体c3F3的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；VL对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；抗体c3F3的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；VH对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。该嵌合抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；重链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。该嵌合抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；轻链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
抗体c3F10的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ IDNO.23所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；VL对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；抗体c3F10的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ IDNO.28所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；VH对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。该嵌合抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；重链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。该嵌合抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；轻链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
抗体c20A11的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32和SEQID NO.33所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示；VL对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.35所示；抗体c20A11的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQID NO.38所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；VH对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.40所示。该嵌合抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；重链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。该嵌合抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；轻链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
抗体c34F2的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42和SEQ IDNO.43所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；VL对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；抗体c34F2的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.48所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示；VH对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示。该嵌合抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；重链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。该嵌合抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；轻链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
抗体c9A7的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52和SEQ IDNO.53所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示；VL对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示；抗体c9A7的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.59所示；VH对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示。该嵌合抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；重链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。该嵌合抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；轻链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
抗体c6F5的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62和SEQ IDNO.63所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.64所示；VL对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示；抗体c6F5的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示；VH对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示。该嵌合抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；重链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。该嵌合抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；轻链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
抗体c8G6的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72和SEQ IDNO.73所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示；VL对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示；抗体c8G6的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78所示；VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示；VH对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示。该嵌合抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示；重链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。该嵌合抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；轻链恒定区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
实施例3 CD137抗体的结合特征实验
3.1结合动力学实验
结合人CD137蛋白的单克隆抗体的结合动力学使用fortebio octet 384仪器(购自PALL)通过生物膜干涉(BLI)技术测量。包含第24-186位氨基酸的重组人CD137/his标签蛋白由北京义翘神州科技有限公司制备。将该标签蛋白溶解于含0.1％BSA及0.02％tween20的PBS(购自Hyclone)溶液中至终浓度基于预计分子量(33kDa)为100nM。
通过与AMQ传感器固定，将实CD137抗体c3F3、c3F10、c6F5、c9A7、c20A11和c8G6稀释至不同的浓度(3.125、6.25、12.5、25、50和100nM)后加入含有0.1％BSA及0.02％tween20的PBS溶液，再以100nM-1.56nM的浓度范围加入CD137蛋白，并以1500rpm/min离心10min，随后以相同转速在含0.1％BSA及0.02％tween20的PBS溶液中进行10分钟解离。结合的复合物通过甘氨酸脉冲再生。使用octet Data Analysis 9.0软件(购自fortebio)进行数据分析。结果如表1所示。
表1中，KD值越小说明CD137蛋白与CD137抗体解离越少，表明人CD137蛋白样品与CD137抗体之间的亲和力越强，则CD137抗体的活性越高。表1的结果显示含结合人CD137蛋白的单克隆抗体显示出与重组人CD137的可逆结合。
表1 CD137抗体与人CD137的结合动力学测试
Figure BDA0001936197070000361
3.2与CD137-L的竞争结合
人CD137蛋白与SA传感器固定，与CD137配体(CD137-L)结合10min，后再与混有鼠抗人137抗体和CD137-L的溶液结合10分钟后解离10分钟，结合的复合物通过甘氨酸脉冲再生。使用Octet Data Analysis9.0软件进行数据分析。先计算抗原抗体结合强度再计算抗原在结合CD137-L后与抗体的结合强度。竞争结果见图1和图2。图1的结果表明CD137抗体与CD137-L有竞争反应。其中，加入CD137配体竞争后的信号为竞争前信号的22.8％，22.8％＝(0.2547/1.11576)×100％。图2A-2H则依次反映了抗体c2H10、c3F3、c3F10、c20A11、c34F2、c9A7、c6F5和c8G6与CD137-L有竞争反应。
实施例4抗体的表位
4.1表位作图
为了确定CD137蛋白抗体的表位结合区，基于公开的犬CD137蛋白序列(Ref.Seq.XM845243)，对人CD137蛋白(4-1BB蛋白)的胞外结构域进行了一系列突变。具体的突变位点参见表2。
表2人CD137胞外结构域的氨基酸突变位点
Figure BDA0001936197070000371
其中，人至犬的突变通过使用金斯瑞公司的慢病毒的病毒表达载体phage-fEF1a-zGREEN而实现。病毒制备物通过在T-75培养瓶中瞬时转染大约40-50％铺满的293T细胞而建立。
4.2鼠抗人CD137抗体的表位
将突变后的CD137序列构建到pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen病毒包装载体上，并感染293FT细胞通过流式分选培养制成稳定表达细胞株，并且将无突变的CD137转基因细胞株做为阳性对照，通过流式检测法中阳性比例确定上述CD137抗体的表位。结果见表3。表3中，“+”代表流式阳性，“-”代表流式阴性，流式阴性表示该表位是抗原抗体结合表位。已知现有的CD137抗体结合的表位位于人CD137蛋白的第115位至第156位，而根据表3的结果，上述的CD137抗体完全不与位于相应于人CD137蛋白的第115位至第156位中的表位结合(在人CD137N&E5和人CD137N&E6显示流式阳性，而在人CD137N&E和人CD137N&E1-4分别显示部分的流式阴性)。
表3 CD137抗体的结合表位
Figure BDA0001936197070000381
实施例5 CD137抗体c6F5人源化及抗体表达
将抗体c6F5进行人源化改造：经同源性分析后，确定轻链以IGKV4-1*01为人源化模板，重链以IGHV1-2*02为人源化模板。完全保留CDR区的氨基酸序列，参考已有文献报道的关键性骨架区残基，对骨架区的关键鼠氨基酸进行选择性保留，产生三个人源化抗体Hu6F5、Hu6F5-1和Hu6F5-2。全基因合成人源化抗体重链可变区和轻链可变区，将该抗体的重链可变区和轻链可变区分别克隆到重链表达载体和轻链表达载体。将重、轻链表达载体后共同瞬时转染293F细胞表达抗体蛋白。在37℃、5％CO2的摇床中培养7天后收集上清，用琼脂糖凝胶proteinA层析填料(GE)纯化上清中的抗体蛋白。Hu6F5抗体轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86所示，重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.88所示。Hu6F5-1抗体轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86所示，重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90所示。Hu6F5-2抗体轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86所示，重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92所示。Hu6F5、Hu6F5-1和Hu6F5-2三个人源化抗体的重链恒定区氨基酸序列均如SEQ ID NO.81所示；对应的核苷酸序列均如SEQ IDNO.82所示。Hu6F5、Hu6F5-1和Hu6F5-2三个人源化抗体的轻链恒定区氨基酸序列均如SEQID NO.83所示；对应的核苷酸序列均如SEQ ID NO.84所示。
实施例6人源化CD137抗体的亲和力测定
将人CD137-his蛋白(购自义翘神州)稀释至不同的浓度(3.125、6.25、12.5、25、50和100nM)后加入含有0.1％BSA及0.02％tween20的PBS溶液，再以100nM-1.56nM的浓度范围加入人源化CD137抗体(UTOMILUMAB、c6F5、hu6F5-1、hu6F5和hu6F5-2)，并以1500rpm/min离心10min，随后以相同转速在含0.1％BSA及0.02％tween20的PBS溶液中进行10分钟解离。结合的复合物通过甘氨酸脉冲再生。使用octetDataAnalysis9.0软件(购自fortebio)进行数据分析。结果如表4所示。利用软件Data Analysis中Kinetics/Affinity分析，选择相互作用分子比为1∶1Langmuir的作用模式进行拟合。
表4人源化CD137抗体与CD137的结合动力学测试
Figure BDA0001936197070000391
实施例7 NF-κB信号通路检测
制备表达人CD137以及稳定整合的NF-κB萤光素酶报道基因的293T细胞。收获细胞，洗涤及重悬浮于无酚红完全培养基(含有10％(v/v)胎牛血清，HEPES缓冲液，非必需氨基酸及L-谷氨酰胺的DMEM培养基)，密度为6×105细胞/mL。将50μL细胞铺板于白色96孔平板(PerkinElmer)的每个测定孔中。在存在2.5∶1比率的交联抗体Fab′山羊抗人IgG Fc(购自Abcam)的条件下，分别加入human IgG2(同型对照)，以及各CD137抗体：小鼠CD137抗体m6F5、嵌合抗体c6F5、人源化抗体hu6F5，hu6F5-1，hu6F5-2、UTOMILUMAB(作为阳性对照)、cG33-IgG2(作为同型对照)。加入抗体后将平板在37℃温育5小时。加入75μL的Bright-GloLuciferase试剂(购自Promega)，使用酶标仪(购自Tecan)测量萤光素酶活性的量。将各CD137抗体处理细胞组的荧光值和未经CD137抗体处理的细胞组的荧光值的比值作图，图3的结果发现各CD137抗体与同型对照抗体相比均有显著差异(P＜0.01)。
实施例8 CD137抗体诱导细胞因子表达
人淋巴细胞的分离
将人全血收集在含有1mL0.5M EDTA的注射器中，然后移至Sigma Accuspin管中根据厂商的操作说明分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC用含有5mM EDTA的DPBS洗涤两次并以2×106细胞/mL重悬浮于由RPMI1640组成的TCM中，其中补加了10％胎牛血清和L-谷氨酰胺(2mM)、Hepes(10mM)、青霉素(100U/mL)、链霉素(50μg/mL)。
96孔平板在包被平板之前进行UV消毒。测试抗体在PBS中稀释至8μg/mL。将0.2mL的稀释抗体分到96孔平板的2个孔中，并1∶3系列稀释。将50μL稀释的抗体加入到无菌Maxisorp96孔测定平板并且立即加入50μl的20μg/mL抗CD3-e克隆UCHTI(购自Abnova)。所有平板4℃温育过夜。第二天，抗体包被的平板用PBS洗涤1次，并且将0.15mLRPMI完全培养基加入到NuncMaxisorp平板的孔中。如前所述分离PBMC细胞，以2×106细胞/mL(100，000细胞/孔)的浓度向每孔加入50μL PBMC细胞。细胞在37℃，5％CO2温育7天。
用10μM不同CD137抗体(抗体c3F3、c6F5、c9A7、c20A11、c8G6、c2H10)刺激PBMC细胞(其中以未刺激的PBMC细胞作为阴性对照)，使用CCK8的方法检测细胞的增殖倍数。结果如图4所示。图中的数据皆为通过三次独立实验得到数据的平均值。图4的结果说明，抗体能够显著提高PBMC细胞的增殖倍数。与正常PBMC培养相比差异有显著差异(P＜0.01)。
ELISA
在各个时间刺激下PBMC细胞后，离心并去除培养基。细胞因子的表达水平根据厂商的操作说明通过ELISA检测。简而言之，加入受试样品和标准品到抗细胞因子包被的96孔板中。在环境温度保温2小时后，在PBS-T中洗板3次，然后首先与工作检测抗体保温然后加入底物。450nm下读取吸光度，基于标准曲线计算浓度。检测各CD137抗体刺激后(包括小鼠CD137抗体m6F5、嵌合抗体c6F5、人源化抗体hu6F5，hu6F5-1，hu6F5-2、UTOMILUMAB(作为阳性对照)、cG33-IgG2(作为同型对照))，IL-2和IFN-γ表达量的结果分别如图5A-5B所示，图5A-5B的结果表明的结果表明，人源化CD137抗体能显著的提高细胞因子IL-2(图5A)和IFN-γ(图5B)的分泌，并且与正常PBMC培养上清中细胞因子含量相比差异有显著差异(P＜0.01)。
实施例9抗CD137抗体在结肠癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤作用研究
在第0天时，用1.5×106个MC38小鼠结直肠癌细胞(上海林渊生物科技有限公司)皮下接种6-8周龄的转入人CD137基因的C57BL/6雌性小鼠(B-hTNFRSF9(4-1BB)mice，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司)。在第3天时将小鼠平均分组，每组7只，给每组荷瘤小鼠分别腹腔注射人IgG-Fc蛋白(3mg/kg，每周二次，共两周)，CD137抗体hu6F5-2抗体(3mg/kg，每周二次，共两周)。定期观测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化。实验结果(图6)表明：与对照人IgG1-Fc相比，hu6F5-2可有效抑制肿瘤生长。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 原能细胞科技集团有限公司
<120> CD137抗体及其应用
<130> 0065-PA-009
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 LCDR1
<400> 1
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 LCDR2
<400> 2
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 LCDR3
<400> 3
His Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Pro Ala
1 5
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 VL
<400> 4
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr Arg Tyr Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 5
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 VL 核苷酸
<400> 5
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtatcagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcaccaata ttataggtat 300
cctccggcgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaa 339
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 HCDR1
<400> 6
Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 HCDR2
<400> 7
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 HCDR3
<400> 8
Gly Asp Glu Lys Asp Asn
1 5
<210> 9
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 VH
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Ile Ile Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c2H10 VH核苷酸
<400> 10
gaagtgcagc tggtggagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacttga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggcaacactg actgcagaca aatcctccag cactgcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtgc aagaggggac 300
gagaaagaca actggggcca aggcaccatt atcacagtct cctca 345
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F3 LCDR1
<400> 11
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F3 LCDR2
<400> 12
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3F3 LCDR3
<400> 13
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3F3 VL
<400> 14
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F3 VL 核苷酸
<400> 15
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aactatttaa gctggttcca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F3 HCDR1
<400> 16
Asp Tyr Asn Met Asn
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F3 HCDR2
<400> 17
Ile Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F3 HCDR3
<400> 18
Gly Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F3 VH
<400> 19
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F3 VH核苷酸
<400> 20
gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgaactgggt gaagcagagc 120
aatggaaaga gccttgagtg gattggaata attaatccta actatggtac tactggctac 180
aatcagaagt tcaggggcaa ggccacattg actgtagacc aatcttccag cacagcctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaggggac 300
tacggtagta cctacgaagc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 LCDR1
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 LCDR2
<400> 22
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 LCDR3
<400> 23
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 VL
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 VL 核苷酸
<400> 25
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtctcc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 HCDR1
<400> 26
Glu Tyr Ile Ile His
1 5
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 HCDR2
<400> 27
Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 HCDR3
<400> 28
His Asp Asn Gln Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 VH
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Ile Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Asn Gln Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c3F10 VH核苷酸
<400> 30
caggtgcagc tgcaggagtc tggagctggg ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gagtatatta tacactgggt aaagcagagg 120
tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttaccctg gaagtggtag tataaagtac 180
aatgagaaat tcaaggacaa ggccacattg actgcggaca aatcctccag gacagtctat 240
ttggagctta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgat 300
aaccaatact ttgactactg gggccagggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 LCDR1
<400> 31
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 LCDR2
<400> 32
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 LCDR3
<400> 33
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 34
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 VL
<400> 34
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 35
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 VL 核苷酸
<400> 35
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttct gtactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 HCDR1
<400> 36
Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 HCDR2
<400> 37
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 HCDR3
<400> 38
Gly Asp Glu Lys Asp Asn
1 5
<210> 39
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 VH
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Ile Ile Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c20A11 VH核苷酸
<400> 40
caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacttga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggcaacactg actgcagaca aatcctccag cactgcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtgc aagaggggac 300
gagaaagaca actggggcca aggcaccatt atcacagttt cctca 345
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 LCDR1
<400> 41
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 LCDR2
<400> 42
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 LCDR3
<400> 43
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Leu Thr
1 5
<210> 44
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 VL
<400> 44
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Phe Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 45
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 VL 核苷酸
<400> 45
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt agatctagct atagttatat gcactggtgc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacattt tactgtcagc acagttggga gattccgctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 HCDR1
<400> 46
Thr Tyr Val Met His
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 HCDR2
<400> 47
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 HCDR3
<400> 48
Gly Asp Tyr Glu Lys Gly Gly Asp Tyr
1 5
<210> 49
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 VH
<400> 49
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Lys Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Pro Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c34F2 VH核苷酸
<400> 50
gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact acctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aaggggggat 300
tacgagaagg ggggggacta ctggggccaa ggcacccctc tcacagtctc ctca 354
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 LCDR1
<400> 51
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 LCDR2
<400> 52
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 LCDR3
<400> 53
His Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Pro Ala
1 5
<210> 54
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 VL
<400> 54
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr Arg Tyr Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 55
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 VL 核苷酸
<400> 55
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtatcagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcaccaata ttataggtat 300
cctccggcgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaa 339
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 HCDR1
<400> 56
Ser Tyr Trp Ile Asn
1 5
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 HCDR2
<400> 57
Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 HCDR3
<400> 58
Phe Tyr Asp Tyr Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 VH
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Asp Tyr Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 60
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c9A7 VH核苷酸
<400> 60
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taaactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gatcggaaat atttatcctt ctgatagtta tactaactac 180
aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagattttat 300
gattacgact cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 LCDR1
<400> 61
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met Tyr
1 5 10 15
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 LCDR2
<400> 62
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 LCDR3
<400> 63
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 64
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 VL
<400> 64
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 VL 核苷酸
<400> 65
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gtactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 HCDR1
<400> 66
Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 HCDR2
<400> 67
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 HCDR3
<400> 68
Gly Asp Glu Lys Asp Tyr
1 5
<210> 69
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 VH
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 70
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c6F5 VH核苷酸
<400> 70
caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggta 60
tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacttga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggcaacactg actgcagaca aatcctccag cactgcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtgc aagaggggac 300
gagaaagact actggggcca aggcacctct ctcacagtct cctca 345
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 LCDR1
<400> 71
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His Val Ala
1 5 10
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 LCDR2
<400> 72
Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 LCDR3
<400> 73
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 74
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 VL
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Gln Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 75
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 VL 核苷酸
<400> 75
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat caataggaga cagggtcagc 60
gtctcctgca aggccagtca gaatgtgggt actcatgtcg cctggtttca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaagcaca gatttactcg gcatcctacc ggttcagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcaacaa tatgacagct atcctctaac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa gcgg 324
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 HCDR1
<400> 76
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 HCDR2
<400> 77
Thr Ile Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 HCDR3
<400> 78
Gln Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 79
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 VH
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Ser Ala Glu Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser
115 120
<210> 80
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c8G6 VH核苷酸
<400> 80
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatgcca tgtcttggat tcgccagatt 120
ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attattggtg gtggtactta tacctactat 180
ccagacactg tgaagggtcg attcattatc tccagagaca gtgccgagaa caccctgttt 240
ttgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acggccctgt attactgtgc aagacaggga 300
tactatggta actacggggg ttacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360
gcctca 366
<210> 81
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG2 抗体重链恒定区氨基酸
<400> 81
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 82
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG2 抗体重链恒定区核苷酸
<400> 82
gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccagt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300
aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540
gtggtcagcg tcctcaccgt cgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 960
tccctgtctc cgggtaaa 978
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Kappa 抗体轻链恒定区 氨基酸
<400> 83
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 84
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Kappa 抗体轻链恒定区 核苷酸
<400> 84
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctacc ccagagaagc caaagtgcag 120
tggaaggtgg acaacgccct gcagagcgga aacagccagg aaagcgtgac agagcaggat 180
tccaaggatt ccacatacag cctgagcagc acactgacac tgtccaaggc cgactacgag 240
aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgaca caccagggac tgtcctcccc tgtgacaaag 300
agcttcaaca gaggagaatg c 321
<210> 85
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5、hu6F5-1、hu6F5-2轻链可变区氨基酸
<400> 85
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 86
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5、hu6F5-1、hu6F5-2轻链可变区核苷酸
<400> 86
gacatcgtga tgacccagag cccagattcc ctggccgtga gcctgggaga gagggcaaca 60
atcaactgca gagcctctga gagcgtggac tcttacggca atagcttcat gtactggtat 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaagctg ctgatctata gggcctccaa cctggagtct 180
ggagtgccag accgcttctc cggatctgga agcggaaccg acttcaccct gacaatcagc 240
tccctgcagg cagaggacgt ggccgtgtac tattgccagc agagcaatga ggatccctac 300
acctttggcc agggcacaaa gctggagatc aag 333
<210> 87
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5重链可变区氨基酸
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 88
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5重链可变区核苷酸
<400> 88
caggtgcagc tggtgcagag cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60
agctgtaagg cctccggcta cgccttcacc aactatctga tcgagtgggt gaggcaggca 120
ccaggacagg gactggagtg gatgggcgtg atcaatccag gatccggagg aaccaactac 180
aatgagaagt ttaagggcag agtgaccatg acagccgaca agtcctctag caccgcctat 240
atggagctgt cctctctgcg gagcgacgat acagccgtgt actattgtgc cagaggcgac 300
gagaaggatt attggggcca gggcaccctg gtgacagtga gctcc 345
<210> 89
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5-1重链可变区氨基酸
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5-1重链可变区核苷酸
<400> 90
caggtgcagc tggtgcagag cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60
agctgtaagg cctccggcta caccttcacc aactatctga tcgagtgggt gaggcaggca 120
ccaggacagg gactggagtg gatgggcgtg atcaatccag gatccggagg aaccaactac 180
aatgagaagt ttaagggcag agtgaccatg acagccgaca agtcctctag caccgcctat 240
atggagctgt cctctctgcg gagcgacgat acagccgtgt actattgtgc cagaggcgac 300
gagaaggatt attggggcca gggcaccctg gtgacagtga gctcc 345
<210> 91
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5-2重链可变区氨基酸
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5-2重链可变区核苷酸
<400> 92
caggtgcagc tggtgcagag cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60
agctgtaagg cctccggcta caccttcacc aactatctga tcgagtgggt gaggcaggca 120
ccaggacagg gactggagtg gatgggcgtg atcaatccag gatccggagg aaccaactac 180
aatgagaagt ttaagggcag agtgaccatg acaagagaca cctccatcag caccgcctat 240
atggagctgt ccagactgcg gagcgacgat acagccgtgt actattgtgc cagaggcgac 300
gagaaggatt attggggcca gggcaccctg gtgacagtga gctcc 345
<210> 93
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD137蛋白的第115位至第156位
<400> 93
Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg
1 5 10 15
Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val
20 25 30
Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val
35 40
<210> 94
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD137蛋白的第110位至第170位
<400> 94
Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe
1 5 10 15
Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu
20 25 30
Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val
35 40 45
Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser
50 55 60
<210> 95
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人CD137抗体的表位第30位至第100位
<400> 95
Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser
1 5 10 15
Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys
20 25 30
Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys
35 40 45
Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys
50 55 60
Leu Gly Ala Gly Cys Ser
65 70
<210> 96
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人CD137的氨基酸序列
<400> 96
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 97
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5、hu6F5-1、hu6F5-2轻链
<400> 97
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 98
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5重链
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 99
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5-1重链
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 100
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体hu6F5-2重链
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Glu Lys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440

Claims (16)

1.抗体或其抗原结合片段，其结合CD137蛋白，所述抗体包含抗体轻链和抗体重链，所述抗体轻链包含：氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的LCDR3；
所述抗体重链包含：氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:67所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示的HCDR3；
其中所述抗原结合片段选自下组：Fab、Fab’、F(ab)2、scFv和Fv片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:85。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含人Igκ恒定区。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:97。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:91。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链包括人IgG恒定区。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG恒定区包含人IgG2恒定区。
10.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG恒定区包含人IgG2a恒定区。
11.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.载体，其包含根据权利要求11所述的一种或多种核酸分子。
13.宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的核酸分子或根据权利要求12所述的载体。
14.制备权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在使得所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养根据权利要求13所述的宿主细胞。
15.药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和任选地药学上可接受的载体。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗癌症或自身免疫病的药物中的用途，其中所述癌症选自以下组：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌，所述自身免疫病选自以下组：系统性红斑狼疮、系统性硬化症和类风湿性关节炎。
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