JP7061235B2 - 抗cld18a2ナノ抗体及びその応用 - Google Patents
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Description
及び治療においても大きく発展する可能性がある。
(2)アミノ酸配列SEQ ID NO.5で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.20で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.34で示されるCDR3。或いは、
(3)アミノ酸配列SEQ ID NO.6で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.21で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.35で示されるCDR3。或いは、
(4)アミノ酸配列SEQ ID NO.7で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.22で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.36で示されるCDR3。或いは、
(5)アミノ酸配列SEQ ID NO.8で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.23で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.37で示されるCDR3。或いは、
(6)アミノ酸配列SEQ ID NO.9で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.24で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.38で示されるCDR3。或いは、
(7)アミノ酸配列SEQ ID NO.10で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.25で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.36で示されるCDR3。或いは、
(8)アミノ酸配列SEQ ID NO.11で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.26で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.39で示される
CDR3。
(2)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.13で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.28で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(3)アミノ酸配列SEQ ID NO.3で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.14で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.29で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(4)アミノ酸配列SEQ ID NO.1で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.15で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.30で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(5)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.16で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.31で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(6)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.13で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.31で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(7)アミノ酸配列SEQ ID NO.1で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.17で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.30で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(8)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.18で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.32で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。
含み、好ましくは、ヒト免疫グロブリンのFc領域から選択される。
本発明は、その他の局面において、前記分離したポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
T(http://www.imgt.org/IMGT_vquest)にログインし、抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子を分析することで、可変領域のフレームワーク領域(framework regions,FR)及び相補性決定領域(complementarity determining regions,CDR)が特定される。免疫グロブリンの可変ドメイン構造内におけるCDRの「位置」は種間において保守的であり、且つ、環と称される構造内に存在している。そのため、構造的特徴に基づき可変ドメイン配列を揃えたナンバリングシステムを使用することで、CDRとフレームの残基が容易に鑑定される。この情報は、任意の種に由来する免疫グロブリンのCDR残基を通常のヒト由来抗体における受容体フレームに移植及び置換するために利用可能である。また、別途説明している場合を除き、本明細書、特許請求の範囲及び図面において、抗CLD18A2ナノ抗体は、CDR領域とFR領域の特定のために、IMGTのナンバリング方法に従ってナンバリングしている。
胞には、末梢血単核細胞(PBMC)やナチュラル・キラー(NK)細胞が含まれる。
ンパク質の3次元表面における特徴をなす。また、その他の実施方案において、CLD18A2エピトープはCLD18A2タンパク質の線形特徴をなす。通常、抗原はいくつかの又は多くの異なるエピトープを有しており、多くの異なる抗体と反応することが可能である。
本発明は、第1の局面において、抗CLD18A2ナノ抗体を提供する。前記抗CLD18A2ナノ抗体の相補性決定領域CDRは、アミノ酸配列で示されるCDR1~CDR3として、SEQ ID NO.4~11のアミノ酸配列のいずれかで示されるCDR1、SEQ ID NO.19~26のアミノ酸配列のいずれかで示されるCDR2、SEQ ID NO.33~39のアミノ酸配列のいずれかで示されるCDR3、を含んでいる。本発明のいくつかの具体的実施例において、前記抗CLD18A2ナノ抗体の相補性決定領域CDRは、アミノ酸配列で示される以下のCDR1~CDR3を含んでいる。
(2)アミノ酸配列SEQ ID NO.5で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.20で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.34で示されるCDR3。或いは、
(3)アミノ酸配列SEQ ID NO.6で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.21で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.35で示されるCDR3。或いは、
(4)アミノ酸配列SEQ ID NO.7で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.22で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.36で示されるCDR3。或いは、
(5)アミノ酸配列SEQ ID NO.8で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.23で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.37で示されるCDR3。或いは、
(6)アミノ酸配列SEQ ID NO.9で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.24で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.38で示されるCDR3。或いは、
(7)アミノ酸配列SEQ ID NO.10で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.25で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.36で示されるCDR3。或いは、
(8)アミノ酸配列SEQ ID NO.11で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.26で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.39で示されるCDR3。
(2)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.13で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.28で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(3)アミノ酸配列SEQ ID NO.3で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.14で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.29で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(4)アミノ酸配列SEQ ID NO.1で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.15で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.30で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(5)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.16で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.31で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(6)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.13で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.31で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(7)アミノ酸配列SEQ ID NO.1で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.17で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.30で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。或いは、
(8)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.18で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.32で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4。
本発明は、第2の局面において、抗CLD18A2ナノ抗体の融合タンパク質を提供する。当該融合タンパク質は、本発明の第1の局面で提供したナノ抗体の第1ドメインと、体内半減期を延長するために用いられ、及び/又はエフェクター細胞に対して結合作用を有
する第2ドメインを含む。前記融合タンパク質は、結合分子とすることができる。前記結合分子は、CLD18A2を発現する細胞と特異的に結合可能である。
殺傷効率を向上させることが可能となる。
本発明は、第3の局面において、本発明の第1の局面で提供したナノ抗体、又は本発明の第2の局面で提供した融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、RNA、DNA又はcDNA等とすることができる。前記分離したポリヌクレオチドを提供する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、DNAの自動合成及び/又は組換えDNA技術等で作製して取得してもよいし、適切な天然源から分離してもよい。本発明の具体的実施形態において、前記分離したポリヌクレオチドの核酸配列は、SEQ ID NO:119~130のいずれかで示される。
本発明は、第4の局面において、発現ベクターを提供する。前記発現ベクターは、本発明の第3の局面で提供した分離したポリヌクレオチドを含む。前記発現ベクターの作製方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、前記発現ベクターは、In vitro組換えDNA技術、DNA合成技術、生体内組換え技術等の方法で作製して取得することが可能であり、より具体的には、前記分離したポリヌクレオチドを発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することで作製可能である。本発明における発現ベクターは、通常、当該分野において熟知されている市販の各種発現ベクター等のことであり、例えば、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳類細胞ウイルス(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)、又はその他のベクターとすることができる。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチド配列に操作的に連結される1又は複数の調節配列を含んでもよい。また、前記調節配列は適切なプロモーター配列を含むことができる。通常、プロモーター配列は、発現されるアミノ酸配列のコード配列に操作的に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列としてもよく、突然変異したもの、切断されたもの、及び雑種プロモーターを含む。且つ、当該宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から取得可能である。また、調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり、宿主細胞により識別されることで転写を終結させる配列を含むことができる。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の3’末端に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に適用可能である。
本発明は、第5の局面において、抗体の発現システムを提供する。前記発現システムは、本発明の第4の局面で提供した発現ベクター、或いは、ゲノムに外来遺伝子が組み込まれている本発明の第3の局面で提供したポリヌクレオチドを含む。発現ベクターの発現に適用されるあらゆる細胞は、いずれも宿主細胞となり得る。例えば、前記宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞、或いは、酵母細胞のような下等真核細胞、或いは、哺乳類細胞のような高等真核細胞とすることができる。具体的には、大腸菌、ストレプトマイセス属、サルモネラ・ティフィムリウムの細菌細胞、真菌細胞(例えば、酵母、糸状真菌、植物細胞)、ショウジョウバエS2又はSf9の昆虫細胞、CHO、COS、HEK293細胞、或いはBowes悪性黒色腫細胞の動物細胞等のうちの1又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。前記発現システムを作製する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、電気穿孔法、ウイルス媒介性形質転換法、電子衝撃法、リン酸カルシウム共沈殿法等のうちの1又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。
本発明は、第6の局面において、免疫複合体を提供する。前記免疫複合体は、本発明の第1の局面で提供したナノ抗体、又は本発明の第2の局面で提供した融合タンパク質を含む。通常、前記免疫複合体は連結部を更に含む。前記連結部は、検出可能マーカー、細胞傷害性、放射性同位体、又は生物活性タンパク質等のうちの1又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。前記免疫複合体の作製方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、前記ナノ抗体及び/又は融合タンパク質を、直接的に、又は適切な長さのスペーサーを介して連結部と連結可能である。連結方式は、化学架橋又は遺伝子工学による融合発現とすればよく、これにより前記免疫複合体が得られる。治療目的のためには、例えば放射性グループのような治療エフェクターグループが適切な場合がある。これらの放射性グループは、放射性同位体又は放射性核種(例えば、3H、14C、15N、33P、35S、90Y、99Tc、111ln、123l、125l、131l、201TI、213Bi)、傷害性、或いは、細胞傷害性グループ(例えば、細胞増殖抑制剤)から構成されるか、そのグループを含む。このほか、本発明のポリペプチドは、マーカーグループ(マーカーのポリペプチド)と連結可能であり、その後、これを例えば診断目的に使用可能である。適切なマーカーグループは、放射性同位体(例えば、上記で提示したもの)、或いは、放射性同位体、放射性核種を含むグループ、蛍光グループ(例えば、GFP、RFP等の蛍光タンパク質、染料、ローダミン、フルオレセイン及びその誘導体(例えばFITC)、アントシアニジンなど)、酵素グループ(例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ)、化学発光グループ、ビオチングループ、金属粒子(例えば、金粒子)、磁性粒子(例えば、磁鉄鉱(Fe3O4)及び/又は磁気赤鉄鉱(Fe2O3)を含む核を有する)、所定のポリペプチドグループ等から選択可能である。
本発明は、第7の局面において、本発明の第1の局面で提供したナノ抗体、本発明の第2の局面で提供した融合タンパク質、又は本発明の第6の局面で提供した免疫複合体を含む検出用試薬キットを提供する。前記試薬キットは、必要に応じて、容器、対照物(陰性又は陽性対照)、緩衝剤、助剤等を更に含んでもよく、当業者は、具体的状況に応じてこれらを選択可能である。
本発明は、第8の局面において、本発明の第1の局面で提供した抗CLD18A2ナノ抗体、又は本発明の第2の局面で提供した抗CLD18A2ナノ抗体の融合タンパク質、又は本発明の第6の局面で提供した免疫複合体を含む薬物組成物を提供する。
前記融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物を免疫チェックポイント阻害剤と併用することが可能である。前記免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、又はCTLA-4阻害剤等のうちの1又は複数の組み合わせを含むが、これらに限らない。好ましくは、前記阻害剤はモノクローナル抗体とすることができる。
本発明は、第9の局面において、CLD18A2を標的とするキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor,CAR)を発現する細胞を提供する。前記CLD18A2を標的とする細胞は、通常、キメラ抗原受容体としてのポリペプチドを含む。また、前記ポリペプチドは、抗原識別領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含むことができる。前記キメラ抗原受容体を作製する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、膜貫通領域は、CD4、CD8、CD3又はCD28といったCDタンパク質、α、β、γ又はδといったT細胞受容体のサブユニット、IL-2受容体のサブユニット(α鎖)、低親和性神経成長因子受容体(LNGFR又はp75)のサブユニット(β鎖又はγ鎖)、又はFc受容体のサブユニット鎖の膜貫通領域とすることができる。本発明の具体的実施例において、膜貫通領域は、CD4、CD8又はCD28の膜貫通領域を含む。また、本発明の別の具体的実施例において、膜貫通領域は、CD4又はCD8の膜貫通領域(例えば、NCBI参照番号:NP_001139345.1に記載されているCD8α鎖又はそのフラグメント)を含む。本発明の別の具体的実施例において、CARは、更に、抗原識別領域と膜貫通領域の間のヒンジ領域を含む。本発明の別の具体的実施例において、ヒンジ領域は、CD8(例えばCD8α)又はIgG1又はIgG4のCH2及び/又はCH3ドメインから選択される。また、CARに用いられる細胞内シグナル領域の好ましい例としては、天然のT細胞受容体と、相互作用によって抗原結合後にシグナル伝達を開始する補助受容体の細胞質配列、これらの配列のあらゆる誘導体又は変異体、及び同一の機能を有するあらゆる合成配列が可能である。細胞内シグナル領域は、抗原依存性の一次活性化を惹起するものと、抗原に依存することなく作用して二次又は共刺激シグナルを提供するものの2種類に分けられる。一次活性化エフェクタードメインは、シグナル伝達モチーフを含み得る。当該モチーフとしては、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)が知られている。ITAMは明確に定義されたシグナル伝達モチーフであって、通常は複数の受容体の細胞質内尾部に存在して、syk/zap70系チロシンキナーゼの結合部位として用いられる。非限定的な実施例として、本発明で使用されるITAMの実施例には、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dから派生するものが含まれ得る。本発明の具体的実施例において、細胞内シグナル領域はCD3ζシグナル伝達ドメイン(CD247とも称する)を含む。天然TCRはCD3ζシグナル伝達分子を含むため、当該エフェクタードメインの使用は自然界で発生するTCR構造に最も類似している。本発明の別の具体的実施例において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、NCBI参照番号:NP_932170に記載されている配列、又は、当該配列における活性を有するか、活性を刺激するフラグメントを含む。本発明で記載したように、細胞内シグナル領域は、二次又は共刺激シグナルを提供することも可能である。T細胞は、共刺激分子を更に含む。共刺激分子は、抗原提示細胞上の同種の共刺激リガンドと結合することでT細胞応答を強化する。例えば、増殖の活性化、分化等が強化される。そのため、本発明の具体的実施例において、細胞内シグナル領域は共刺激ドメインを更に含む。本発明の別の具体的実施例において、共刺激ドメインは、CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、ICOS(CD278)、CD30、CD40、PD-1(CD279)、CD2、CD7、NKG2C(CD94)、B7-H3(CD276)、又はこれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。また、更なる実施方案において、共刺激ドメインは、CD28、CD27、4-1BB、OX40、ICOS又はこれらの任意の組み合わせから選
択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。また、本発明の別の具体的実施例において、共刺激ドメインは、例えば、NCBI参照番号:NP_006130に記載されているCD28、又は、CD28における活性を有するか、活性を刺激するフラグメントを含む。
本発明は、第10の局面において、CLD18A2を発現する細胞に関連する疾病を診断、治療又は予防するための薬物の製造における本発明の第1の局面で提供したナノ抗体、又は本発明の第2の局面で提供した融合タンパク質、又は本発明の第6の局面で提供した免疫複合体、又は本発明の第8の局面で提供した薬物組成物、第9の局面で提供したキメラ抗原受容体としてのポリペプチド、又は本発明の第9の局面で提供したCLD18A2を標的とするキメラ抗原受容体を発現する細胞の用途を提供する。
を発現する全ての癌及び固形腫瘍が含まれ得る。具体的には、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、結腸・直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌及び頭頸部癌等が含まれ得るがこれらに限らない。また、これらの癌は、初期、中期又は末期とすることができ、例えば転移癌とすることができる。
CLD18A1(アミノ酸配列SEQ ID NO.96)及びCLD18A2(アミノ酸配列SEQ ID NO.97)の全長遺伝子をそれぞれ含むpCDNA3.1ベクター(ライフテクノロジーズ社)から、プラスミドマキシキット(バイオミガ(Biomiga)社)を用いてプラスミドを抽出した。次に、発現プラスミドを滅菌ろ過したあと、CHO-S細胞に電気穿孔した。そして、G418(シグマ社)を添加して96ウェルにプレ
ーティングし、CHO-S-CLD18A1及びCHO-S-CLD18A2の安定トランスフェクション細胞株をそれぞれ作製した。選択した96ウェルマイクロプレート上の安定トランスフェクション細胞株は、G418を添加した培養条件において徐々に増大した。また、Anti-Claudin18抗体[34H14L15](アブカム社)を用い、ドットブロット(Dot blotting)により検出したところ、陽性発現細胞株CLD18A1及びCLD18A2がそれぞれ特定された。且つ、同様の方法を用いて、NUGC-4-CLD18A1及びNUGC-4-CLD18A2を作製した。胃腺癌細胞NUGC-4は武漢金開瑞有限公司から購入した。検査の結果、当該胃腺癌細胞NUGC-4はCLD18A2の発現について陽性を示さなかった。
実施例1のCHO-S-CLD18A2安定トランスフェクション細胞を細胞量1.0×107個/ml用い、健康なアルパカ(Vicugna pacos)を免疫するとともに、1mlの完全フロイントアジュバント(シグマ社)で免疫を補助した。更に、21日後に再び免疫し、合計で3回免疫することで、B細胞を刺激して抗原特異性のナノ抗体を発現させた。そして、3回の免疫から1週間後、真空採血管でアルパカの血液を30ml採取し、リンパ球分離溶液(天津市▲こう▼洋華科生物科技有限公司)を用いてリンパ球を分離してから、Trizol法でトータルRNAを抽出した。次に、逆転写試薬キット(インビトロジェン社)を用い、説明書に従って3μgのトータルRNAをcDNAに逆転写するとともに、ネステッドPCR及び次のプライマーを用いてVHHを増幅させた。即ち、1回目のPCRでは、フォワードプライマー5’-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3’(SEQ ID NO.110)と、リバースプライマー5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID NO.111)を用い、2回目のPCRでは、1回目のPCRを鋳型として、フォワードプライマー5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’(SEQ ID NO.112)と、リバースプライマーとして、5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3’(SEQ ID NO.113)、又は、5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3’(SEQ ID NO.114)を用い、それぞれ増幅させた。そして、ターゲットとするVHH核酸フラグメントを回収し、制限酵素SfiI(NEB社)で切断してから、同様に切断したファージディスプレイ用ベクターpcomb3xss(Addgene プラスミド#63890、RRID:Addgene_63890)に挿入するとともに、T4リガーゼ(タカラ社)を用いてライゲーションした。続いて、ライゲーション産物をエレクトロコンピテントセルER2738に形質転換することで、Anti-CLD18A2ナノ抗体ライブラリを調製した。また、段階希釈プレーティングによって、ライブラリ容量の大きさが1.23×108であることを測定した。且つ、24個のクローンをランダムに抜き取ってコロニーPCR検出を行ったところ、結果より、調製ライブラリの挿入率は100%であることが明らかとなった。
3.1 Anti-CLD18A2ナノ抗体のスクリーニング
調製したAnti-CLD18A2ナノ抗体ライブラリをヘルパーファージM13KO7(NEB社)でパッケージングして、ディスプレイライブラリである組換えファージの力価を測定したところ、5.7×1013PFU/mlであった。そこで、18ml、7×105個/mlのCHO-S-CLD18A2と、15ml、3×106個/mlのCHO-S細胞を取り、4℃下において300gで5分間遠心分離したあと、培地の上清を除去した。次に、細胞をPBSで再懸濁し、再び遠心分離したあとに、2%のスキムミルク
(PBSで希釈)を用いて室温で1時間ブロッキングした。続いて、ブロッキングしたCHO-S細胞(約4.5×107個)に組換えファージライブラリ約5.7×1011PFUを加え、室温で30分間インキュベートしてから、全細胞サブトラクティブスクリーニングを2回行った。そして、上清を約1.5×107個のブロッキングしたCHO-S-CLD18A2安定トランスフェクション細胞に加え、室温で1時間インキュベートして結合させてから、遠心分離したあとPBSで再懸濁し、細胞を洗浄した。洗浄は5回行った。次に、洗浄したファージを細胞に結合させ、1mlの0.1M gly-HCl 1mg/ml BSA(pH2.2)緩衝液を用いて10分間インキュベートし、溶出してから、遠心分離して上清を取り、1M pH 8.0 Tris-Clで中和した。続いて、ファージの力価を測定したところ、力価は3.6×105PFU/mlであった。そこで、前記ファージ溶出液を増幅させて測定したところ、力価は1×1013PFU/mlとなった。
2回目のエルトリエーションで溶出したファージの力価測定プレートから80個の単クローンを抜き取り、96ウェルマイクロプレートで培養するとともに、M13KO7ヘルパーファージを用いて感染させ、パッケージングすることで、上清における組換えファージの蓄積を取得した。次に、CHO-S、CHO-S-CLD18A1、CHO-S-CLD18A2を、1ウェルあたり細胞5×105個で96ウェルマイクロプレートにプレーティングするとともに、3%BSAを用いて室温で1時間ブロッキングした。そして、マイクロプレート遠心分離機を用い、ブロッキングした3種類の細胞に対応する96ウェルマイクロプレートを2000rpmで10分間遠心分離することで上清を慎重に除去した。続いて、単クローン組換えファージの上清を96ウェルマイクロプレートでそれぞれ3%BSAにより3倍に希釈してから、1ウェルあたり50μlの体積で、3種類の細胞がプレーティングされた96ウェルマイクロプレートに加えるとともに、室温で1時間インキュベートした。そして、PBSで3回洗浄したあと、希釈したHRP-anti-M13抗体(北京義翹神州科技有限公司)を1ウェルあたり100μl加え、室温で1時間インキュベートした。また、PBSで3回洗浄したあと、TMB基質を加えて37℃でインキュベートした。且つ、5分間インキュベートして発色したあと、1M硫酸を加えて反応を停止させ、OD450nmを読み取った。CHO-S、CHO-S-CLD18A1、CHO-S-CLD18A2の3つの96ウェルマイクロプレートに対するELISA測定の結果より、OD値が陰性ウェル(CHO-Sに対応するウェル)の1.5倍以上のものを陽性と認定し、CHO-S-CLD18A1プレートにおいて陰性を示し且つCHO
-S-CLD18A2プレートにおいて陽性を示したクローンを選別した。
3種類の細胞CHO-S、CHO-S-CLD18A1、CHO-S-CLD18A2の96ウェルマイクロプレートにおける発色結果に基づいて選別したクローンを培養し、単一のナノ抗体配列を含有するpcomb3xssプラスミドを抽出するとともに、プラスミドをそれぞれ大腸菌発現宿主Rosetta DE3に形質転換した。そして、それぞれの発現クローンを抜き取って培養したあと、0.2mMのIPTGを用いて30℃で一晩誘導し、ペリプラズムに発現したタンパク質を培養上清に浸透させた。続いて、その中から16個のクローンの培地上清を抜き取って再びELISA測定を行った。即ち、1:5000で希釈したmouse anti his tag抗体(R&D Systems,Inc)を100μl/ウェル加え、室温で1時間インキュベートした。また、これを洗浄したあと、1:10000で希釈したHRP-Goat anti mouse IgG抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を100μl/ウェル加え、室温で1時間インキュベートしてから、洗浄後にTMBを加えて発色させた。そして、これらの中から陰性クローンプラスミドを陰性対照として選択した。細胞のELISA結果は表1に示す通りとなり、更に、特異的に結合したクローンを選択した。続いて、これらのクローンをそれぞれシーケンシングし、アミノ酸配列を照合して反復配列を除去することで、配列の異なる8つの特異的結合クローンを取得した。表1に、取得した特異的結合クローンを例示する。
4.1 Anti-CLD18A2ナノ抗体の宿主大腸菌における発現及び精製
スクリーニングにより取得した特異的陽性配列プラスミドを鋳型とし、フォワードプライマーを5’-gtttaactttaagaaggagatatacatatgcaggtgcagctcgtggagtct-3’(SEQ ID NO.115)、リバースプ
ライマーを5’-ggccgcaagcttgtcgacggagctcgaattcttactaatggtgatggtgatggtgctg-3’(SEQ ID NO.116)として、ハイフィデリティー酵素GVP8(通用生物系統(安徽)有限公司)を用いPCR増幅を行った。また、配列5’末端にシグナルペプチド配列を保持し、3’末端にヒスチジンタグのコード配列を保持した。次に、PCR産物を電気泳動し、約500bpほどの断片をゲルから切断・回収した。続いて、回収したPCR産物を、組換え試薬キット(近岸蛋白質科技有限公司)を用いて、制限酵素NdeI及びEcoRIで切断したpET32a+ベクター(Novagen社)と組換え連結することで、大腸菌発現プラスミドを作製した。そして、これを大腸菌のコンピテント状態であるTop10F’に形質転換し、アンピシリン耐性プレートに塗布して、インキュベータにおいて37℃で一晩培養した。次に、アンピシリン耐性プレート上のクローンを抜き取り、プラスミドのシーケンシングを行うことで、pET32a+ベクターに対する配列の正確な挿入を特定した。
CHO-S、CHO-S-CLD18A1、CHO-S-CLD18A2を、1ウェルあたり細胞5×105個で96ウェルマイクロプレートにプレーティングするとともに、3%BSAを用いて室温で1時間ブロッキングした。次に、精製したヒスチジンタグ融合Anti-CLD18A2ナノ抗体タンパク質を濃度2μg/mlまで希釈したあと、ブロッキングした細胞に100μlずつ加え、室温で1時間インキュベートした。そして、洗浄したあと、1:5000で希釈したmouse anti his tag抗体(R&D Systems,Inc)を100μl/ウェル加え、室温で1時間インキュベートした。且つ、洗浄後に、1:10000で希釈したHRP-Goat anti mouse IgG抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を1ウェルあたり100μl加え、室温で1時間インキュベートした。そして、洗浄後にTMBを加えて発色させ、450nmでOD値を測定したところ、結果は表2のようになった。
CHO-S-CLD18A2を1ウェルあたり細胞5×105個で96ウェルマイクロプレートにプレーティングし、3%BSAを用いて室温で1時間ブロッキングした。次に、精製したヒスチジンタグ融合CLD18A2ナノ抗体を1%BSAで段階希釈したあと、ブロッキングした細胞にそれぞれ加えて、室温で1時間インキュベートした。そして、洗浄したあと、1:5000で希釈したmouse anti his tag抗体(R&D Systems,Inc)を100μl/ウェル加え、室温で1時間インキュベートした。且つ、洗浄後に、1:10000で希釈したHRP-Goat anti mouse IgG抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を1ウェルあたり100μl加え、室温で1時間インキュベートした。そして、洗浄後にTMBを加えて発色させ、450nmでOD値を測定した。また、グラフパッドプリズムv5.0アプリでデータ処理とグラフ作成及び分析を行い、細胞内のCLD18A2に対するAnti-CLD18A2ナノ抗体のEC50値を取得することで、CLD18A2に対する抗体の親和性を反映した。結果は表3の通りであった。
ヒト化の方法については、Vincke Cらが構築したVHHヒト化ユニバーサルフレームワーク移植法(Vincke C,Loris R,Saerens D,Martinez-Rodriguez S,Muyldermans S,Conrath K.J Biol Chem.2009;284(5):3273-3284)を用いて完成させた。配列相同性に基づき設計を完了したユニバーサルヒト化VHHフレームワークh-NbBcII10FGLA(PDB番号:3EAK)について、対応するCDR領域をCLD18A2ナノ抗体のCDR領域に置き換えるとともに、FR2領域の個々のアミノ酸をヒト化抗体DP-47の配列に基づき更にヒト化した。これにより、各anti-CLD18A2ナノ抗体について、少なくとも3種類のヒト化変異体をそれぞれ取得した。ヒト化前後の抗体配列については表4に示す通りであった。
6.1 Anti-CLD18A2ナノ抗体・Fc融合タンパク質(Anti-C18.2-Fc)の発現及び精製
スクリーニングにより取得した特異的陽性配列及びヒト化配列をそれぞれ鋳型とし、フォワードプライマーを5’-gtgctgctgctgtgggtgccaggatccaccgggcaggtgcagctcgtggagtc-3’(SEQ ID NO.117)、リバースプライマーを5’-gcaggacttgggctcagaagacacggtgaccagggtcccctggcc-3’(SEQ ID NO.118)として、ハイフィデリティー酵素GVP8(安徽通用生物技術有限公司)を用いPCR増幅を行った。次に、PCR産物を電気泳動し、約400bpほどの断片をゲルから切断・回収した。続いて、回収したPCR産物を、シグナルペプチド及びヒトIgG1のFc配列(アミノ酸配列SEQ ID NO.91)を含むpCDNA3.1ベクターと組換え連結することで、Anti-CLD18A2ナノ抗体とヒトIgG1のFcとを融合した細胞発現プラスミドを作製した。また、エンドトキシンフリープラスミドマキシキット(バイオミガ社)を用い、抗CLD18A2ナノ抗体とヒトIgG1のFcとを融合した細胞発現プラスミドを抽出し、プラスミドとトランスフェクション試薬PEI(Polysciences,Inc.)を1:3で均一に混合したあと30min間静置した。その後、これをHEK293F細胞に加え、37℃下において、5%CO2の振とう培養機内で7日間培養してから、遠心分離後に上清を取得した。続いて、上清をpH7.0に調節したあと、サンプルをProteinAアフィニティークロマトグラフィーカラム(博格隆生物技術有限公司)に加え、100%0.1M Gly-HCl(pH3.0)を用いて溶出した。溶出液は、10%1M Tris-HCl(pH8.5)に予め投入した。そして、100%の溶出液をコンダクタンス4ms/cmとなるまで希釈し、pH5.5に調整したあと、遠心分離にかけた(8000rpm、4℃、10min)。続いて、上清液をpH5.0まで調整してからサンプルをDSPクロマトグラフィーカラム(博格隆生物技術有限公司)に投入し、0~60%の溶出液(20mM NaAc、0.5M NaCl、pH5.0)を線形溶出した。流速は2ml/minとし、15min間行った。
米国特許第9751934B2号における配列番号118の重鎖及び配列番号125の軽鎖で構成されるキメラ抗体(米国特許第9751934B2号における名称はch-175D10)を対照抗体とし、そのアミノ酸配列における対応するポリヌクレオチド配列をpCDNA3.1ベクターと組換え連結した。そして、実施例6.1と同様の方法でHEK293F細胞の一過性トランスフェクションを行って、発現及び精製した。
の集合体含有量の比較分析
Anti-C18.2-Fcと対照抗体ch-175D10の純度チェックのために、SEC-HPLC-UVを用いて分析を行った。検出器はAgilent 1100 LC、検出波長は214nm、流動相は150mM pH7.0 PB+5%イソプロパノール、クロマトグラフィーカラムはSuperdex 200 Increase 5/150 GL、動作時間は15分、カラム温度は25℃とした。
7.1 CLD18A2に対するAnti-C18.2-Fc融合タンパク質の親和性鑑定
Anti-C18.2-Fc融合タンパク質を1%BSAでそれぞれ段階希釈した。また、HRP-Goat anti-Human IgG Fc(Novex)二次抗体を1:20000で希釈して使用した。残りの細胞ELISAの方法は、実施例3.2の記載と同様とした。また、グラフパッドプリズムv5.0アプリでデータ処理とグラフ作成及び分析を行い、細胞内のCLD18A2に対するAnti-C18.2-Fcの結合曲線とEC50値を取得することで、CLD18A2に対する抗体の親和性を反映した。
健康なヒト由来の血清を補体源とし、65℃で30分間インキュベートしたものを不活化血清対照とした。NUGC-4-CLD18A2を1ウェルあたり5×104個で96ウェルマイクロプレートにプレーティングした。そして、検出対象のAnti-C18.2
-Fc融合タンパク質、陰性対照(Fab領域を含まないIgG1のFcフラグメント、アミノ酸配列SEQ NO.91)及び陽性対照抗体ch-175D10を培地で段階希釈したあと、96ウェルマイクロプレートに加え、最終濃度を750nMから段階的に0.05nMまで低下させた。次に、37℃で30分間インキュベートしたあと、5%の健康なヒト由来の血清又は不活化血清対照をそれぞれ加え、37℃で4時間インキュベートした。そして、LDH検出用試薬キット(東仁化学科技(上海)有限公司)の説明書に従ってLDH放出測定を行った。結果は図2及び図3に示した通りであった。
健康なドナー由来のヒトの血液を分離して得た末梢血単核細胞(PBMC)を洗浄し、5%ウシ胎児血清(FBS)が添加された1640培地で再懸濁した。次に、5%FBS 1640培地を用い、検出対象のAnti-C18.2-Fc融合タンパク質と陽性対照ch-175D10を500nMまで希釈してから、50μlを96ウェルマイクロプレートにそれぞれ加えた。続いて、NUGC-4-CLD18A2をそれぞれ5%FBS 1640培地を用いて洗浄及び再懸濁し、約2×105/mlの細胞密度としてから、対応する96ウェルマイクロプレートに50μlずつ加えた。そして、再懸濁したPBMC細胞を100μl/ウェルで加え、PBMCの細胞量を1ウェルあたり1×105個、ET比を10:1とした。これを37℃のインキュベータで4時間インキュベートしたあと、LDH検出用試薬キット(東仁化学科技(上海)有限公司)に従ってLDH放出量を測定した。結果は図4に示す通りであった。
本実験では、患者由来の胃癌組織を用いて作製した異種移植片モデル(patientl
derived xenograft,PDX)の担癌マウスについて、融合タンパク質の抗腫瘍作用を測定した。各実験群が4~6匹のマウスとなるよう、大きさ100mm3程度の担癌マウスをランダムに群分けした。そして、腫瘍移植から15d後に異なるタンパク質及び異なる投与量で治療を行い、投与期間中に各群のマウスについて腫瘍体積及び体重の変化を監視測定した。投与頻度を2回/週とし、監視測定の頻度を2回/週として、5週間連続で監視測定した。また、投与量と投与方式については表6に示す通りとした。腫瘍体積の測定については、ノギスを用いて腫瘍の最大長軸(L)と最大幅軸(W)を測定し、下記の公式に従って腫瘍体積を計算した。
V=L×W2/2
8.1 Anti-CLDN18×CD3融合タンパク質の配列設計
Anti-CLDN18×CD3融合タンパク質は、CLD18A2とCD3を標的とする二重特異性ナノ抗体であり、Anti-CLD18A2及びAnti-CD3ナノ抗体から構成される。Anti-CLD18A2ナノ抗体の配列は本発明における配列とし、Anti-CD3ナノ抗体の配列は文献の報告を参照した(国際公開第2016/180982号)。また、Anti-CLD18A2及びAnti-CD3ナノ抗体は、GS配列(SEQ ID NO.132)により連結した。発現後の精製に有利となるよう、Anti-CLDN18×CD3融合タンパク質、Anti-CD3ナノ抗体のC末端には6つのHisアミノ酸を連結した。
9.1 Anti-CLDN18×CD3融合タンパク質の細胞結合特異性
Jurkat(中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞バンクから購入)をCD3陽性細胞とし、実施例1で作製したCHO-S-CLD18A2をCLD18A2の陽性細胞とした。そして、本発明で作製及び発現したAnti-CLDN18×CD3融合タンパク質の細胞結合活性を測定した。
との結合状況については、Anti-CLDN18×CD3-hu6V3のEC50値が9.39nM、Anti-CLDN18×CD3-hu19V3のEC50値が10.36nMであった。
Anti-CLDN18×CD3融合タンパク質の細胞殺傷効果を評価するために、本発明では、T細胞(妙通生物社)をエフェクター細胞として細胞傷害性試験を行った。
本発明では、患者由来の胃癌組織を用いて作製した異種移植片モデル(patientl
derived xenograft,PDX)の担癌NSGマウスについて、Anti-CLDN18×CD3融合タンパク質の腫瘍抑制作用を分析した。腫瘍が100mm3程度まで成長した時点で、担癌マウスをランダムに各群5匹となるよう群分けし、腹腔注射によって健康なヒト由来のPBMC細胞を2×107投与した。そして、1日後に、担癌マウスに対し5μg(25μg/ml、200μl PBS)のAnti-CLDN18×CD3融合タンパク質を腹腔注射した。これを1日1回、4週間続け、腫瘍の体積を週に2回記録した。
本発明におけるCLD18A2を特異的に標的とするVHHをキメラ抗原受容体の作製に適用した。表7には、作製したキメラ抗原受容体及びその構造を列挙している(抗原識別
領域-ヒンジ領域-膜貫通領域-細胞内シグナル領域。ただし、共発現したeGFP構造については記載していない)。
作製事例として、本発明では、第三世代自己不活化型レンチウイルスベクターシステムを使用した。当該システムは、VSV-Gタンパク質をコードするエンベローププラスミドPMD2.G(addgeneから購入)、タンパク質Gag/Pol及びRevタンパク質をコードするパッケージングプラスミドpsPAX2(addgeneから購入)、及び、空ベクターpWPT-eGFP(addgeneから購入)をベースに作製されるベクターであって、目的遺伝子CARをコードする組換え発現ベクター、という3つのプラスミドを有している。本発明では、多種類のVHH配列を挿入して完全なCAR構造を作製しやすいよう、pWPT-eGFPをベースに、特異的VHHを発現するためのレンチウイルスプラスミド汎用ベクターを作製した。また、目的遺伝子CARをコードする組換え発現ベクターにT2Aを用いることで、目的遺伝子CARとeGFPの共発現を実現した。T2Aは、Thosea asigna virus由来の2Aペプチドであり、「自己スプライシング」機能を有しているため、上流と下流の遺伝子の共発現を実現可能である。また、eGFPを検出することで、間接的にCARの発現を検出可能となる。
Anti-C18.2-hu19V3-Fcを発現するプラスミドを鋳型とし、採用したプライマー対であるフォワードプライマー(SEQ ID NO.143)とリバースプライマー(SEQ ID NO.144)をハイフィデリティー酵素GVP8(通用生物系統(安徽)有限公司)でPCR増幅させるとともに、PCR産物を電気泳動にかけてゲルから切断・回収した。また、CART汎用ベクターpWPT-x-CAR-28Zを制限酵素NdeI(タカラ社)及びPstI(タカラ社)でダブルダイジェストし、電気泳動にかけてゲルから切断・回収した。次に、回収したPCR産物とベクターを組換え試薬キット(近岸蛋白質科技有限公司)により組換え連結し、ライゲーション産物をTop10F’に形質転換するとともに、アンピシリン耐性プレートに塗布した。そして、クローンを抜き取って培養及びシーケンシングすることで、Anti-CLD18A2 CARレンチウイルスプラスミドpWPT-aC18.2-hu19V3-28Zを作製した。また、同様にして、回収したPCR産物と、NdeI(タカラ社)及びPstI(タカラ社)でダブルダイジェストしたベクターpWPT-x-CAR-28-137Zを組換え連結することで、Anti-CLD18A2 CARレンチウイルスプラスミドpWPT-aC18.2-hu19V3-28-137Zを作製した。以上の操作によって、pWPT-aC18.2-hu6V3-28ZとpWPT-aC18.2-hu6V3-28-137Zを作製した。
レンチウイルスのパッケージングについては、一般的な方法に従った。概略すると、細胞密度5×106でHEK-293T細胞(ATCC)を10cmのシャーレに移植し、37℃、5%CO2のインキュベータで一晩培養した。培地は、10%ウシ胎児血清(ジブコ社)を含有するDMEM(ジブコ社)とした。また、トランスフェクションの約2時間前に培養液を無血清DMEMに交換した。細胞のトランスフェクション時には、CARを発現するレンチウイルスプラスミドを使用するだけでなく、プラスミド(ウイルスの膜タンパク質及び構造タンパク質を提供する)psPAX2、pMD2.0Gを使用してコトランスフェクションさせる必要があった。このうち、目的配列CAR又は空ベクターを発現するレンチウイルスプラスミドについては5μg、psPAX2については3.75μg、pMD2.0Gについては1.25μg使用した。トランスフェクション時には、上記3種類のプラスミドの混合物を500μlのMEM培地に添加した。また、もう一つの小型遠沈管内で、25μLのLipofectamine 2000トランスフェクション試薬(サーモフィッシャー社)を500μLのMEM培地に加えた。その後、希釈したトランスフェクション試薬を希釈後のプラスミドの上方に加え、均一に混合し、室温で20分間静置したあと、プラスミドとトランスフェクション試薬の混合物を10cmのシャーレに移して振り、均一に混合した。そして、これを37℃のインキュベータに入れて、6時間後に10%ウシ胎児血清のDMEM培地に交換した。細胞のトランスフェクションから3日後に、ウイルスを取得可能となった。そこで、ウイルスを含む培養上清を遠沈管に移し、4℃下において1500rpmで5分間遠心分離することで細胞を除去した。その後、ウイルスを含む培地をフィルタリングして分包し、-80℃で凍結保存した。次に、10%ウシ胎児血清のDMEMにおいて、1×105/mLの細胞密度で、100μL/ウェルのHEK-293T細胞を96ウェル培養プレートに移植し、37℃且つ5%CO2で一晩培養した。そして、翌日、50μL/ウェルの培養上清を捨て、50μL/ウェルの新鮮な前記培養液を補充するとともに、最終濃度6μg/mLのポリブレンを含ませて、37℃且つ5%CO2で30min間インキュベートした。続いて、これに10μL/ウェルのウイルス原液を加え、37℃、5%CO2で培養した。そして、感染から48h後に、フローサイトメーターでeGFPを測定し、陽性率が5~20%の細胞数を好
ましいとして、力価を計算したところ約2×106U/mLとなった。
11.1 aC18.2-CAR-Tの作製
健康なヒト由来の末梢血から密度勾配遠心法によりヒト末梢血単核細胞(上海妙通社)を取得して、CD3マイクロビーズ(ミルテニーバイオテク(Miltenyi Biotec GmbH)社)により説明書に従って分離した。次に、約1×106/mLの密度でQuantum007リンパ球培養液(PAA Laboratories GmbH社から購入)を加えて培養するとともに、細胞:磁気ビーズの割合を1:1として、DynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28(サーモフィッシャー社)及び最終濃度100U/mLの組換えヒトIL-2(上海近岸社)を加えて24h培養を刺激した。その後、MOI≒5で前記組換えレンチウイルス(実施例10.3)を使用してT細胞を感染させた。感染させた細胞は、1日置きに5×105/mLの密度で継代しつつ、リンパ球培養液に最終濃度100U/mLの組換えヒトIL-2を加えた。そして、培養から8日目に、フローサイトメトリーで細胞を測定したところ、eGFPとCARが共発現していたことから、eGFPを検出した陽性細胞をキメラ抗原受容体発現陽性細胞とみなした。また、未感染のT細胞を陰性対照としたところ、異なるキメラ抗原受容体を発現したウイルス感染T細胞の陽性率は約66.4%であった。
我々は、異なるaC18.2-CAR-T細胞が、In vitroにおいて、NUGC-4-CLD18A2細胞及びCLD18A2陰性細胞株NUGC-4-CLD18A1に対して奏する殺傷作用を観察した。ET比はそれぞれ3:1、1:1及び1:3とし、標的細胞の数は10000/ウェルとした。各群には複数ウェルとして5つを設定し、5つのウェルの平均値を取得した。これらをいずれも16h培養したあと、LDH検出用試薬キット(上海東仁社)を用いて上清のLDH含有量を測定することで殺傷評価を行った。その結果、表8に示したように、ET比を3:1とした場合に、特異性aC18.2-CAR-T細胞は、CLD18A2発現陽性細胞を効果的に殺傷可能であったが、CLD18A2陰性細胞についてはほとんど殺傷しなかった。以上の結果より、aC18.2-CAR-TはCLD18A2陽性細胞を特異的に殺傷可能であるとともに、殺傷作用がET比と正の相関を示すことが明らかとなった。
CLD18A2発現陽性細胞NUGC-4-CLD18A2とaC18.2-CAR-T細胞を1:1の割合で合わせて培養し、24h間インキュベートしたあと、培養上清を収集してから、IL-2(R&D Systems,Inc.)、TNF-α(R&D Sy
stems,Inc.)及びIFN-γ(R&D Systems,Inc.)をそれぞれ用い、試薬キットの説明書に従ってサイトカインを測定した。図11の結果に示したように、NUGC-4-CLD18A2は、aC18.2-CAR-Tと合わせてインキュベートした場合に、陰性細胞NUGC-4-CLD18A1と比べて、IL-2、TNF-α及びIFN-γ等のサイトカインの分泌が著しく高かった。
NUGC-4-CLD18A2を用いて皮下移植腫瘍モデルを作製した。3×106個のNUGC-4-CLD18A2をNOD/SCIDマウスに皮下接種し、マウスの平均腫瘍体積が100~150mm3になった時点で、100mg/kgのシクロホスファミドを腹腔注射することでNOD/SCIDマウスの免疫細胞を除去した。これにより、養子移植した遺伝子組換えT細胞が抗腫瘍機能をより良好に発揮できるようにした。翌日、尾静脈から1.0×107個のaC18.2-CAR-T細胞aC18.2-hu19V3-28-137Zを注射した。且つ、28-137Zを発現するMock群を対照とし、皮下移植腫瘍の成長を観察及び測定した。その結果、図12に示すように、aC18.2-CAR-T細胞はNUGC-4-CLD18A2移植腫瘍の成長を明らかに抑制可能であった。
Claims (24)
- 抗CLD18A2ナノ抗体であって、前記抗CLD18A2ナノ抗体の相補性決定領域CDRは、アミノ酸配列で示されるCDR1~CDR3として、
(1)アミノ酸配列SEQ ID NO.4で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.19で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.33で示されるCDR3、或いは、
(2)アミノ酸配列SEQ ID NO.5で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.20で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.34で示されるCDR3、或いは、
(3)アミノ酸配列SEQ ID NO.6で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.21で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.35で示されるCDR3。或いは、
(4)アミノ酸配列SEQ ID NO.7で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.22で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.36で示されるCDR3、或いは、
(5)アミノ酸配列SEQ ID NO.8で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.23で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.37で示されるCDR3、或いは、
(6)アミノ酸配列SEQ ID NO.9で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.24で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.38で示されるCDR3、或いは、
(7)アミノ酸配列SEQ ID NO.10で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ
ID NO.25で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.36で示されるCDR3、或いは、
(8)アミノ酸配列SEQ ID NO.11で示されるCDR1、アミノ酸配列SEQ
ID NO.26で示されるCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.39で示されるCDR3、を含む抗CLD18A2ナノ抗体。 - 前記抗CLD18A2ナノ抗体はフレームワーク領域FRを含み、前記フレームワーク領域FRは、アミノ酸配列で示されるFR1~FR4として、
(1)アミノ酸配列SEQ ID NO.1で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.12で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.27で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.40で示されるFR4、或いは、
(2)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.13で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.28で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4、或いは、
(3)アミノ酸配列SEQ ID NO.3で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.14で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.29で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4、或いは、
(4)アミノ酸配列SEQ ID NO.1で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.15で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.30で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4、或いは、
(5)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.16で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.31で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4、或いは、
(6)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.13で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.31で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4、或いは、
(7)アミノ酸配列SEQ ID NO.1で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.17で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.30で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4、或いは、
(8)アミノ酸配列SEQ ID NO.2で示されるFR1、アミノ酸配列SEQ ID NO.18で示されるFR2、アミノ酸配列SEQ ID NO.32で示されるFR3、アミノ酸配列SEQ ID NO.41で示されるFR4、を含むことを特徴とする請求項1に記載のナノ抗体。 - 前記抗CLD18A2ナノ抗体のアミノ酸配列は、
a)SEQ ID NO.42~49のいずれかで示されるアミノ酸配列、或いは、
b)SEQ ID NO.42~49のいずれかと80%以上の配列同一性を有するものであって、a)で限定したアミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列、を含むことを特徴とする請求項1に記載のナノ抗体。 - 前記抗CLD18A2ナノ抗体はヒト化抗体であることを特徴とする請求項1に記載のナノ抗体。
- 前記抗CLD18A2ナノ抗体のアミノ酸配列はSEQ ID NO.67~90で示されることを特徴とする請求項4に記載のナノ抗体。
- 抗CLD18A2ナノ抗体の融合タンパク質であって、請求項1~5のいずれか1項に記載のナノ抗体における第1ドメインを含み、更に、体内半減期を延長するために用いられ、及び/又は、エフェクター細胞に対して結合作用を有する第2ドメインを含む融合タンパク質。
- 前記第2ドメインは、血清アルブミンフラグメント、ポリエチレングリコールフラグメント、HSAと結合するナノ抗体のうちの1又は複数の組み合わせを含み、
及び/又は、前記第2ドメインは免疫グロブリンのFc領域を含み、
及び/又は、前記第2ドメインは、T細胞上に存在するCD3に対し親和性を有し、及び/又は、T細胞上に存在するCD3と結合可能な分子を含むことを特徴とする請求項6に
記載の融合タンパク質。 - 前記Fc領域は、ヒト免疫グロブリンのFc領域から選択されることを特徴とする請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記ヒト免疫グロブリンのFc領域には、Fc媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異が含まれ、前記エフェクター機能には、CDC活性、ADCC活性、ADCP活性のうちの1又は複数の組み合わせが含まれ、
及び/又は、前記免疫グロブリンは、IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMのうちの1又は複数の組み合わせから選択され、前記IgGは、サブタイプIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のうちの1又は複数の組み合わせから選択され、
及び/又は、前記免疫グロブリンのFc領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.91~95のいずれかから選択され、
及び/又は、前記第1ドメインと第2ドメインの間には連結ペプチドが設置されていることを特徴とする請求項8に記載の融合タンパク質。 - 前記連結ペプチドは、アラニン及び/又はセリン及び/又はグリシンからなる柔軟なポリペプチド鎖から選択されることを特徴とする請求項9に記載の融合タンパク質。
- 前記連結ペプチドの長さは3~40個のアミノ酸であることを特徴とする請求項9に記載の融合タンパク質。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のナノ抗体をコードするか、請求項6~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする、分離したポリヌクレオチド。
- 請求項12に記載の分離したポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 抗体の発現システムであって、請求項13に記載の発現ベクター、又はゲノムに外来遺伝子が組み込まれている請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む発現システム。
- 前記抗体の発現に適した条件において、請求項14に記載の抗体の発現システムを培養することにより、前記抗体を発現し、前記抗体を精製・分離する、とのステップを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の抗CLD18A2ナノ抗体、又は請求項6~11のいずれか1項に記載の抗CLD18A2ナノ抗体の融合タンパク質の作製方法。
- 免疫複合体であって、請求項1~5のいずれか1項に記載のナノ抗体、又は請求項6~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む免疫複合体。
- 前記免疫複合体は連結部を更に含み、前記連結部は、検出可能マーカー、細胞傷害性、放射性同位体、又は生物活性タンパク質のうちの1又は複数の組み合わせを含むことを特徴とする請求項16に記載の免疫複合体。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のナノ抗体、又は請求項6~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質、又は請求項16又は17に記載の免疫複合体を含む検出用試薬キット。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のナノ抗体、又は請求項6~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質、又は請求項16又は17に記載の免疫複合体を含む薬物組成物。
- 更に、薬学的に許容可能なベクターを含むことを特徴とする請求項19に記載の薬物組成
物。 - 分離したポリペプチドであって、抗原識別領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、前記抗原識別領域は、請求項1~5のいずれか1項に記載のナノ抗体を含む、分離したポリペプチド。
- 膜結合型の請求項21に記載のポリペプチドを含み、T細胞、マクロファージ又はNK細胞である細胞。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のナノ抗体、又は請求項6~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質、又は請求項16に記載の免疫複合体、又は請求項19或いは20に記載の薬物組成物、又は請求項21に記載のポリペプチド、又は請求項22に記載の細胞の、CLD18A2を発現する細胞に関連する疾病を診断、治療又は予防するための薬物の製造における使用。
- 前記CLD18A2を発現する細胞に関連する疾病は腫瘍から選択され、前記腫瘍は、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頸部癌及び胆嚢癌のうちの1又は複数の組み合わせから選択されることを特徴とする請求項23に記載の使用。
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