CN115279406A - 蛋白质治疗剂的调配物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于静脉内施用的包含蛋白质治疗剂的组合物，所述蛋白质治疗剂包括多特异性多肽和融合蛋白。所述组合物可包含例如多特异性蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂。在一些实施方案中，所述组合物可包含多特异性蛋白、琥珀酸盐缓冲剂、蔗糖和聚山梨醇酯80。本文还提供了将所述组合物施用于有需要的受试者的临床方法，包括给药方案。

Description

蛋白质治疗剂的调配物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年12月4日提交的美国临时申请号63/121,633和2020年1月13日提交的美国临时申请号62/960,562的优先权，每个临时申请通过引用整体并入本文用于所有目的。
技术领域
本公开涉及蛋白质治疗剂的调配物。具体地，本公开涉及包含双特异性或多特异性蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物。更具体地，本公开涉及含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的双特异性或多特异性蛋白的调配物。本公开还涉及用于向有需要的受试者施用蛋白质治疗剂的临床方法，包括给药方案。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以电子方式提交并且特此通过引用整体并入。该序列表记录于2021年1月13日，命名为APVO_061_02SeqList_ST25.txt且大小为约103千字节。
背景技术
开发成功的蛋白质治疗剂的关键步骤之一是开发一种调配物，该调配物可在长期储存、医疗保健专业人员操纵和施用期间保持蛋白质的物理和化学完整性。待通过静脉内(i.v.)途径施用的蛋白质治疗剂常常以浓缩溶液冷冻储存，并且在使用前在临床进行稀释。而且，蛋白质治疗剂，诸如双特异性抗体和多特异性抗体，尤其是那些包含一个或多个scFv结构域的抗体，可能易于形成聚集体。
开发蛋白质调配物，特别是用于通过静脉内途径施用的蛋白质调配物，需要仔细考虑许多因素，该因素包括蛋白质的特性、调配物的组成、稀释剂的选择、储存温度、输注速度、光暴露等。本领域需要蛋白质治疗剂，特别是用于通过静脉内途径施用的蛋白质治疗剂的稳定调配物。
还需要给药策略来减轻用通过T细胞接合来起作用的双特异性和多特异性治疗剂(即T细胞接合剂)治疗的患者中与细胞因子释放的影响相关的风险。这类治疗剂包括靶向CD123和CD3的双特异性治疗剂。mAb14045(Xencor)(一种正在患有复发或难治性急性髓性白血病和其它表达CD123的血液系统恶性肿瘤的患者中进行评估的CD123xCD3双特异性抗体分子)由于I期试验中两名患者的死亡(包括由细胞因子释放综合征(CRS)引起的一例死亡)，于2019年被FDA置于部分临床暂停状态。
设计用于降低细胞因子释放的严重影响(包括细胞因子释放综合征)的可能性的给药策略可能无法达到治疗效果。因此，仍然需要以减轻毒性风险(包括细胞因子毒性)的方式向患者递送治疗有效剂量的T细胞接合剂(诸如CD123 x CD3治疗剂)的方法。
发明内容
本文描述了用于静脉内施用的包含蛋白质治疗剂的组合物，所述蛋白质治疗剂包括多特异性多肽和融合蛋白。所述组合物可包含例如多特异性蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂。在一些实施方案中，所述组合物可包含多特异性蛋白、琥珀酸盐缓冲剂、蔗糖和聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述组合物用于静脉内施用或皮下施用。
本公开提供了用琥珀酸盐缓冲剂和蔗糖调配的多特异性多肽。在一些实施方案中，多特异性多肽包含两个或更多个scFv结合结构域。在一些实施方案中，多特异性多肽形成同型二聚体。在其它实施方案中，多特异性多肽形成异二聚体。在一些实施方案中，多特异性多肽呈选自由以下组成的组的型式(format)：scFv-Fc-scFv(例如，
Figure BDA0003840537750000031
)、四价体瘤、Kλ抗体、dAb、双链抗体、TandAb、纳米抗体、
Figure BDA0003840537750000032
CrossMabFab、CrossMab VH-VL、链交换工程化结构域抗体(SEEDbodies)、亲和体(Affibodies)、Fynomers、Kunitz结构域、Albu-dabs、两个具有交换的VH的工程化Fv片段(例如，双重亲和重新靶向分子(D.A.R.T.))、scFv x scFv(例如，BiTE)、DVD-IG、Covx-body、肽体、scFv-Ig、SVD-Ig、dAb-Ig、旋钮入孔(Knobs-in-Holes)抗体、包含位于CH3结构域中的匹配突变的IgG1抗体(例如，DuoBody抗体)和三功能抗体(triomAb)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含多特异性蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中所述多特异性蛋白是两个同一(identical)的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序，或按照从羧基端到氨基端的顺序包含：(i)第一结合结构域，(ii)铰链区，(iii)免疫球蛋白恒定区，和(iv)第二结合结构域；并且所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。在一些实施方案中，每个多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述组合物包含约1mM至约10mM的琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸。在一些实施方案中，所述组合物包含约5mM的琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸。
在一些实施方案中，所述赋形剂包含糖(诸如蔗糖)或者由糖(诸如蔗糖)组成。在一些实施方案中，所述组合物可包含约1％重量/体积(w/v)至约12％w/v的糖。在一些实施方案中，所述组合物包含约6.5％(w/v)的糖。
在一些实施方案中，所述表面活性剂包含聚山梨醇酯80或由聚山梨醇酯80组成。在一些实施方案中，所述组合物包含约0.02％w/v的聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述组合物包含约0.1mg/ml至约10mg/ml的多特异性蛋白。例如，所述组合物可包含约1mg/ml至约5mg/ml的多特异性蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含约2mg/ml的多特异性蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述组合物具有约4.0至约5.5的pH。在一些实施方案中，所述组合物具有约4.8的pH。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定区是人Fc结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域是CD3结合结构域并且所述第二结合结构域是肿瘤抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述多肽从N端到C端包含CD3结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和肿瘤抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述第一结合结构域是肿瘤抗原结合结构域并且所述第二结合结构域是CD3结合结构域。在一些实施方案中，所述多肽从N端到C端包含肿瘤抗原结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和CD3结合结构域。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原结合结构域与CD123、PSMA、CD19、CD33、5T4或HER2结合。
在一些实施方案中，所述第一结合结构域是4-1-BB结合结构域并且所述第二结合结构域是肿瘤抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述多肽从N端到C端包含4-1-BB结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和肿瘤抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述第一结合结构域是肿瘤抗原结合结构域并且所述第二结合结构域是4-1-BB结合结构域。在一些实施方案中，所述多肽从N端到C端包含肿瘤抗原结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和4-1-BB结合结构域。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原结合结构域与CD123、PSMA、CD19、CD33、5T4或HER2结合。
在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域中的至少一者包含(i)免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3；和(ii)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域中的至少一者是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的羧基端。在一些实施方案中，所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的氨基端。在一些实施方案中，所述scFv包含接头多肽。接头多肽可以例如位于scFv的轻链可变区与重链可变区之间。在一些实施方案中，接头多肽包含Gly4Ser(SEQ IDNO:128)接头，诸如(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:129)。
在一些实施方案中，肿瘤抗原结合结构域是抗CD123 scFv，所述抗CD123 scFv包含：包含SEQ ID NO:10的HCDR1、包含SEQ ID NO:11的HCDR2和包含SEQ ID NO:12的HDCR3；以及包含SEQ ID NO:13的LCDR1、包含SEQ ID NO:14的LCDR2和包含SEQ ID NO:15的LCDR3。在一些实施方案中，肿瘤抗原结合结构域是包含VH和VL的抗CD123scFv，该VH包含与SEQ IDNO:136具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:134具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原结合结构域是抗CD123 scFv，并且其中所述scFv包含与SEQ ID NO:18具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，CD3结合结构域是抗CD3 scFv，其包含：包含SEQ ID NO:19的HCDR1、包含SEQ ID NO:20的HCDR2和包含SEQ ID NO:21的HDCR3；以及包含SEQ ID NO:22的LCDR1、包含SEQ ID NO:23的LCDR2和包含SEQ ID NO:24的LCDR3。在一些实施方案中，CD3结合结构域是包含VH和VL的抗CD3 scFv，该VH包含与SEQ ID NO:383或387具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:384具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，CD3结合结构域是包含与SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列的抗CD3 scFv。
在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区包含一个或多个突变以减少/防止FcγR结合、ADCC活性和/或CDC活性。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代L234A、L235A、G237A和K322A的人IgG1 CH2结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A的人IgG1 CH2结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白包含SEQ ID NO：131的序列，或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。
在一些实施方案中，铰链区源自免疫球蛋白铰链区。
在一些实施方案中，每个多肽包含位于所述免疫球蛋白恒定区与所述第二结合结构域之间的Fc结合结构域接头。在一些实施方案中，Fc结合结构域接头包含Gly4Ser(SEQID NO:128)序列。在一些实施方案中，Fc结合结构域接头包含式(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:129)。
在一些实施方案中，所述组合物实质上防止多特异性蛋白的降解。在一些实施方案中，所述组合物在4℃下实质上稳定至少1年。在一些实施方案中，所述组合物实质上抵抗多特异性蛋白聚集体的形成。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中所述融合蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序包含：(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，(ii)铰链区，(iii)免疫球蛋白恒定区，和(iv)与CD3特异性地结合的第二结合结构域；并且(b)所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中所述融合蛋白包含与CD123特异性地结合的第一结合结构域和与CD3特异性地结合的第二结合结构域；并且所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中所述融合蛋白包含(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，该免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ ID NO:14的LCDR2和SEQ ID NO:15的LCDR3；以及(ii)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，其中该结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，该免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3；并且所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80的组合物，其中所述融合蛋白包含(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，该免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ ID NO:14的LCDR2和SEQ ID NO:15的LCDR3；以及(i i)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，其中该结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，该免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中所述融合蛋白包含(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，其中所述结合结构域包含：包含SEQ ID NO:136的免疫球蛋白重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:134的免疫球蛋白轻链可变区(VL)；和(ii)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，其中该结合结构域包含：包含SEQ ID NO:383或387的免疫球蛋白重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:384的免疫球蛋白轻链可变区(VL)；并且所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中所述融合蛋白包含(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，其中所述第一结合结构域包含SEQ ID NO:18；和(ii)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，其中所述第二结合结构域包含SEQ ID NO:27；并且所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中所述融合蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端，或按照从羧基端到氨基端的顺序包含(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3，并且该免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ ID NO:14的LCDR2和SEQID NO:15的LCDR3；(ii)SEQ ID NO:47的铰链区；(iii)SEQ ID NO:33的免疫球蛋白恒定区；(iv)SEQ ID NO:132的Fc结合结构域接头；和(v)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，其中该第二结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，该免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3；并且所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80的组合物，其中所述融合蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序包含(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，其中该结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，该免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ IDNO:14的LCDR2和SEQ ID NO:15的LCDR3；(ii)SEQ ID NO:47的铰链区；(iii)SEQ ID NO:33的免疫球蛋白恒定区；(iv)SEQ ID NO:132的Fc结合结构域接头；和(v)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，其中该第二结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，该免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3。
本公开还提供了一种包含融合蛋白、约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80的组合物，其中该融合蛋白包含SEQ ID NO:31或由SEQ ID NO:31组成；其中该组合物包含约2mg/ml的融合蛋白；并且其中该组合物具有约4.8的pH。
本公开进一步提供了一种抑制有需要的受试者中的银屑病斑块生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的组合物。
本公开进一步提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的组合物。癌症可以是例如血液系统恶性肿瘤。例如，癌症可以是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、毛细胞白血病(HCL)、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)或慢性髓性白血病(CML)。
还提供了本公开的组合物用于治疗受试者的癌症的用途。还提供了本公开的组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。例如，本公开的组合物可用于治疗急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)。在一些实施方案中，本公开的组合物可用于治疗高危或高等级MDS。包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物可以通过IV输注以约0.3、约1、约3、约6、约9、约12、约18、约20、约24、约30、约36、约50、约48、约60、约75或约100μg的周剂量施用于受试者。为了降低不良事件的风险，可以在几个小时，例如约20-24小时内，通过IV向患者施用第一剂。在一些实施方案中，第一剂组合物在约20-24小时的时间段内施用，第二剂在约8小时的时间段内施用，第三剂在约6小时的时间段内施用，并且第四剂和后续剂量在约4小时的时间段内施用。也可以通过连续IV输注，例如持续时间长达约72小时的连续IV输注将组合物施用于受试者。
一种用于治疗有需要的患者的方法可以包括向患者静脉内施用含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白，使得对于至少前两剂或前三剂而言剂量每周增加。例如，可以根据以下周治疗计划表通过IV输注将组合物递送给患者：第1周剂量：6μg；第2周剂量：9μg；第3周剂量：12μg；以及第4周剂量和后续周剂量：12μg。在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：9μg；第3周剂量：12μg；以及第4周剂量和后续周剂量：18μg。在一些实施方案中，施用给患者的最高剂量为约24μg、约36μg、约48μg、约60μg或约100μg。在一些实施方案中，施用给患者的最高剂量在约100μg至约130μg的范围内。
在一些实施方案中，可以以持续约2周、约3周、约4周、约5周、约6周或更长时间的治疗周期向患者施用组合物。在一些实施方案中，可以以多于一个治疗周期，诸如2、3、4、5、6、7、8个或更多个治疗周期向患者施用组合物。在一些实施方案中，治疗周期持续4周，并且可以被重复多达6个周期。在一些实施方案中，治疗周期可以被重复多达36个周期。
在一些实施方案中，根据以下周治疗计划表将组合物静脉内施用于患者：第1周剂量：6μg；及第2周和后续周剂量：9μg，而在一些实施方案中，根据以下周治疗计划表将组合物静脉内施用于患者：第1周剂量：9μg；及第2周和后续周剂量：12μg。在一些实施方案中，根据以下周治疗计划表将组合物静脉内施用于患者：第1周剂量12μg，以及第2周和后续周剂量：18μg。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第1、8、15和22天向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。在一些实施方案中，在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用12μg。在一些实施方案中，在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用18μg。在一些实施方案中，在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用9μg，并且在第22天施用9μg。在一些实施方案中，在第1天施用9μg，在第8天施用12μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用12μg。在一些实施方案中，在第1天施用12μg，在第8天施用18μg，在第15天施用18μg，并且在第22天施用18μg。在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者表现出骨髓原始细胞百分比降低，而在一些实施方案中，患者表现出血液中的绝对原始细胞计数降低。在一些实施方案中，治疗引起患者血液中的原始细胞水平与紧接在治疗前患者的水平相比降低至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少45％、至少50％或更多。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在28天周期期间向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。在一些实施方案中，在28天周期期间向患者施用组合物每周一次、两次、三次或四次。在一些实施方案中，在28天周期的过程中增加剂量。在一些实施方案中，在28天周期的过程中减少剂量。在一些实施方案中，在28天周期期间每周增加剂量。在一些实施方案中，在28天周期期间每周减少剂量。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期的第1、8、15和22天，以及在至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。在一些实施方案中，在第一个28天周期的第22天施用的剂量与在至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天施用的剂量相同。在一些实施方案中，患者被治疗两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个另外的28天周期，其中组合物的施用发生在每个周期的第1、8、15和22天。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期的第1、2、3、4、8、11、15和22天向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期的第1、2、3、4、8、11、15和22天，以及在至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。在一些实施方案中，患者被治疗两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个另外的28天周期，其中组合物的施用发生在每个周期的第1、8、15和22天。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期的第1、2、3、4、8、11、15、18、22和25天向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期的第1、2、3、4、8、11、15、18、22和25天，以及在至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。在一些实施方案中，患者被治疗两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个另外的28天周期，其中组合物的施用发生在每个周期的第1、8、15和22天。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期期间向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物，其中在第一个28天周期的第1天施用6μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第2天施用9μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第3天施用12μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第4天施用18μg特异性蛋白，在第一个28天周期的第8天施用18μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第11天施用18μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第15天施用36μg多特异性蛋白，并且在第一个28天周期的第22天施用36μg多特异性蛋白。在一些实施方案中，该方法进一步包括在至少一个另外的28天周期期间向患者施用多特异性蛋白，其中在所述至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天中的每一天施用36μg多特异性蛋白。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期期间向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物，其中在第一个28天周期的第1天施用6μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第2天施用12μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第3天施用18μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第4天施用24μg特异性蛋白，在第一个28天周期的第8天施用24μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第11天施用24μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第15天施用48μg多特异性蛋白，并且在第一个28天周期的第22天施用48μg多特异性蛋白。在一些实施方案中，该方法进一步包括在至少一个另外的28天周期期间向患者施用多特异性蛋白，其中在所述至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天中的每一天施用48μg多特异性蛋白。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期期间向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物，其中在第一个28天周期的第1天施用6μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第2天施用12μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第3天施用24μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第4天施用36μg特异性蛋白，在第一个28天周期的第8天施用36μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第11天施用36μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第15天施用60μg多特异性蛋白，并且在第一个28天周期的第22天施用60μg多特异性蛋白。在一些实施方案中，该方法进一步包括在至少一个另外的28天周期期间向患者施用多特异性蛋白，其中在所述至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天中的每一天施用60μg多特异性蛋白。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第一个28天周期期间向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物，其中在第一个28天周期的第1天施用6μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第2天施用12μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第3天施用24μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第4天施用36μg特异性蛋白，在第一个28天周期的第8天施用48μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第11天施用48μg多特异性蛋白，在第一个28天周期的第15天施用100μg多特异性蛋白，并且在第一个28天周期的第22天施用100μg多特异性蛋白。在一些实施方案中，该方法进一步包括在至少一个另外的28天周期期间向患者施用多特异性蛋白，其中在所述至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天中的每一天施用100μg多特异性蛋白。
在一些实施方案中，在任一前述计划表中施用于患者的最高剂量增加了约5％至约40％，诸如约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％或约40％。在这些实施方案中，该增加的剂量可以首先在先前在前述计划表中施用最高剂量的第一天先向患者施用。
附图说明
图1A和图1B是示出与本公开的组合物和方法一起使用的示例性治疗性蛋白的结构的示意图。图1A示出了包含两个同一的多肽的同型二聚体蛋白，每个多肽包含CD3结合结构域和Fc结构域。图1B示出了包含两个同一的多肽的同型二聚体蛋白，每个多肽包含肿瘤结合结构域(例如，CD123结合结构域)、Fc结构域和CD3结合结构域。示例性的CD123 x CD3双特异性治疗性蛋白在本文中称为TRI130。
图2是示出1/1b期剂量递增临床研究设计的示意图，在该临床研究设计中，TRI130被施用于患有复发性或难治性急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)的患者。
图3A-3D示出了针对图2和实施例3中描述的1/1b期研究中的患者，随时间推移绘制的骨髓抽吸物中原始细胞的百分比。数据是针对接受≥12μg的最高剂量的队列中的患者用图表表示。N＝14名可经受与基线相比的变化评估的患者。队列6a和6b测试了不同的阶梯给药方案，如表10所示。
图4A-4D示出了在图2和实施例3中描述的1/1b期研究中来自预计划的血液集合(给药前、给药后约15-30分钟和给药后约20-26小时；N＝26)的患者样品中白细胞介素6(IL-6，图4A)、白细胞介素10(IL-10，图4B)、干扰素-γ(IFN-γ，图4C)和肿瘤坏死因子α(TNF-α，图4D)的血清浓度。预计划的血液集合是在每个患者的最高计划剂量被第一次施用时收集的。示出在IRR/CRS事件期间在未预计划的集合中观察到的峰值细胞因子水平以进行比较(4名患者中N＝6个事件)。
具体实施方式
本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为限制所描述的主题。本文引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，均特此明确地通过引用整体并入用于任何目的。如果并入的文件或文件的部分中的一者或多者定义的术语与该术语在本申请中的定义相矛盾，则以出现在本申请中的定义为准。然而，对本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公布和专利申请的提及并不且不应被视为对它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的常识的一部分的承认或任何形式暗示。
在本说明书中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围都应理解为包括在所列举的范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。应当理解，除非另有说明，否则如本文所用的术语“一”和“一个(种)”是指所列举组分中的“一种或多种”。替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一者、两者或其任何组合。如本文所用，术语“包括”和“包含”同义使用。另外，应当理解，包含本文所述的组分(例如，结构域或区域)和取代基的各种组合的多肽由本申请公开，达到如同每个多肽均被单独地阐述的相同程度。因此，单个多肽的特定组分的选择在本公开的范围内。
定义
术语“约”当紧接在数值之前时，意指±数值的至多10％。例如，“约40”意指±40的至多10％(即，36至44)，例如±至多10％、±至多9％、±至多8％、±至多7％、±至多6％、±至多5％、±至多4％、±至多3％、±至多2％、±至多1％、±至多小于1％，或其中任何其它值或值的范围。
如本文所用，“实质上”具有如其在本领域中被使用的普通含义。例如，“实质上”可意指“显著地”、“相当地”、“很大程度上”、“主要地”或“基本上”。在一个实施方案中，“实质上”可以指至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
术语“CD123”可以指CD123(也称为分化簇123、白细胞介素3受体α链和IL3RA)的任何同种型。CD123与白细胞介素3受体的β链缔合从而形成受体。CD123是一种I型跨膜糖蛋白，其胞外结构域包含一个预测的Ig样结构域和两个FnIII结构域。本公开的CD123结合结构域与CD123的胞外结构域结合。CD123也称为人白细胞介素3(IL-3)受体的α链。CD123是一种I型跨膜糖蛋白并且是细胞因子受体超家族的成员。白细胞介素3受体是由CD123和β链(CD131)形成的异二聚体。IL-3与CD123结合，并且信号转导由CD131提供。IL-3调节造血细胞和免疫细胞的功能和产生并刺激内皮细胞增殖(Testa等人，Biomark Res.2:4(2014))。
CD123在包括急性髓性白血病(AML)、B淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)和毛细胞白血病的子集在内的许多血液系统恶性肿瘤中过表达。虽然大部分AML患者对初始疗法反应良好，但大多数AML患者最终被诊断患有复发或难治性疾病(Ramos等人，J.Clin.Med.4:665-695(2015)).。需要这样的靶向CD123的分子，其具有增加的效率和效力以及减少的副作用并且可以用于治疗与CD123失调相关的病症。
“CD3”在本领域中称为六条链的多蛋白复合物(参见，例如，Abbas和Lichtman，2003；Janeway等人，第172和178页，1999年)，这六条链是T细胞受体复合物的亚基。在哺乳动物中，T细胞受体复合物的CD3亚基是CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链及CD3ζ链的同型二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白，其含有单个免疫球蛋白结构域。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾部各自含有单一保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM，而每条CD3ζ链具有三个保守基序。据信ITAM对于TCR复合物的信号传导能力很重要。如本公开中使用的CD3可以来自各种动物物种，包括人、猴、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
“细胞因子释放”或“细胞因子风暴”或“输注反应”是指细胞因子从T细胞中释放。当细胞因子释放到循环中时，可能会导致全身症状，诸如发烧、恶心、寒战、低血压、心动过速、虚弱、头痛、皮疹、喉咙沙哑和呼吸困难。一些患者可能经历因细胞因子大量释放而引起的严重、危及生命的反应。“减少的”细胞因子释放是指与OKT3抗体(其结合CD3)或其它CD3结合双特异性分子相比，施用如本文所公开的双特异性分子之后，至少一种细胞因子(例如，IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2、IL-8、IL-10、IL-17、GM-CSF、IL-4、IL-12、IL-13或IL-1β)的释放减少。减少的细胞因子释放可以使用体外测定法或体内测定法来测量。
如本文所用，术语“阶梯给药”或“阶梯式给药”或类似术语是指这样的给药方案，其中如本文所述的多特异性多肽在至少第一天和第二天施用于患者，其中向患者施用的剂量在第一天与第二天之间保持不变或增加。例如，在一些阶梯给药方案中，可以向患者施用第一剂、第二剂、第三剂和第四剂，其中每一剂在不同的日期施用，并且其中第二剂大于第一剂。第三剂可以大于第二剂，或者可以与第二剂相同。第四剂可以大于第三剂，或者可以与第三剂相同。在一些实施方案中，如果患者对特定剂量有不良反应，则可以减少后续剂量。
如本文所用，术语“结合结构域”或“结合区”是指蛋白质、多肽、寡肽、肽、抗体的具有特异性地识别和结合至靶分子(诸如抗原、配体、受体、底物或抑制剂)的能力的结构域、区域、部分或位点，或源自抗体、受体或配体的具有特异性地识别和结合至靶分子(诸如抗原、配体、受体、底物或抑制剂)的能力的结合结构域。示例性的结合结构域包括抗体和抗体样蛋白或结构域、抗体重链和轻链可变区以及单链抗体可变区(例如，结构域抗体、sFv、scFv、scFab)、受体胞外域和配体(例如，细胞因子、趋化因子)。在某些实施方案中，结合结构域包含以下或由以下组成：抗原结合位点(例如，包含可变重链序列和可变轻链序列)或置于替代性框架区(FR)(例如，任选地包含一个或多个氨基酸取代的人FR)中的来自抗体的三个轻链互补决定区(CDR)和三个重链CDR。已知多种用于鉴定特异性地结合特定靶标的本公开的结合结构域的测定法，该测定法包括蛋白质印迹、ELISA、噬菌体展示文库筛查和
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相互作用分析。
如果结合结构域或包含结合结构域的蛋白质以等于或大于105M-1的亲和力或Ka(即，与1/M单元的特定结合相互作用的平衡缔合常数)结合靶标，而不会显著结合试验样品中存在的其它组分，则该结合结构域或包含结合结构域的蛋白质“特异性地结合”靶标。结合结构域可分为“高亲和力”结合结构域和“低亲和力”结合结构域。“高亲和力”结合结构域是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的那些结合结构域。“低亲和力”结合结构域是指Ka高达107M-1、高达106M-1、高达105M-1的那些结合结构域。可替代地，亲和力可以定义为与M单元的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)(例如，10-5M至10-13，或约500nM、约300nM、约250nM、约200nM、约150nM、约100nM、约50nM、约25nM、约10nM或约5nM)。根据本公开的结合结构域多肽和单链多肽的亲和力可以容易地使用常规技术(参见，例如，Scatchard等人(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美国专利号5,283,173、5,468,614或等效案)来确定。
如本文所用，“保守性取代”在本领域中被认为是一种氨基酸取代另一种具有相似特性的氨基酸。示例性的保守性取代在本领域中是众所周知的(参见，例如，PCT申请公布号WO 97/09433，第10页，1997年3月13日公开；Lehninger，Biochemistry，第二版；WorthPublishers,Inc.NY:NY(1975)，第71-77页；Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY和Cell Press,Cambridge,MA(1990)，第8页)。在某些实施方案中，保守性取代包括亮氨酸到丝氨酸的取代。
如本文所用，术语“衍生物”是指通过化学或生物学手段，用或不用酶，例如通过糖基化、烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成对肽的一个或多个氨基酸残基的修饰。
如本文所用，“源自”指定的多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽源。在某些实施方案中，源自特定序列(有时称为“起始”或“亲本”或“亲代”序列)的多肽或氨基酸序列具有与亲本序列或其部分基本上同一的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸，至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸或至少50-150个氨基酸组成，或者该多肽或氨基酸序列可被本领域普通技术人员以其它方式鉴定为在亲本序列中具有其来源。例如，结合结构域可以源自抗体，例如Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、单结构域抗体(sdAb)等。
源自另一多肽的多肽可具有相对于亲本多肽的一个或多个突变或改变，例如，一个或多个氨基酸残基被另外的氨基酸残基取代或者具有一个或多个氨基酸插入或缺失。在此类实施方案中，源自亲本多肽并包含一个或多个突变或改变的多肽称为“变体”。如本文所用，术语“一种变体”或“多种变体”是指具有与参考多核苷酸或多肽的序列不同的序列但保留该参考多核苷酸或多肽的基本特性的多核苷酸或多肽。一般来说，变体多核苷酸或多肽序列总体上非常相似，并且在许多区域与参考多核苷酸或多肽是同一的。例如，变体多核苷酸或多肽与活性部分或全长参考多核苷酸或多肽相比可以表现出至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。该多肽可包含非天然存在的氨基酸序列。此类变体必然地与亲本多肽具有小于100％的序列同一性或相似性。在一个实施方案中，变体将具有与亲本多肽的氨基酸序列具有约60％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。在另一实施方案中，变体将具有与亲本多肽的氨基酸序列具有约75％至小于100％、约80％至小于100％、约85％至小于100％、约90％至小于100％、约95％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个或更多个多核苷酸序列之间或两个或更多个多肽序列之间的关系。当一个序列中的一个位置被比较器序列相应位置中的相同的核酸碱基或氨基酸残基占据时，则称该序列在该位置是“同一的”。通过确定在这两个序列中出现同一的核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以得到同一的位置的数目来计算序列同一性百分比。然后将同一的位置的数目除以比较窗口中的位置总数并乘以100以得到序列同一性的百分比。序列同一性的百分比是通过比较在比较窗口上的两个最佳比对序列来确定的。多核苷酸序列的比较窗口可以长度是，例如，至少约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个或更多个核酸。多肽序列的比较窗口可以长度是，例如，至少约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约300个或更多个氨基酸。为了最佳比对序列以进行比较，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分可以包含添加或缺失(称为空位)，而参考序列保持恒定。最佳比对是这样的比对，该比对即使在存在空位的情况下，也能在参考序列与比较器序列之间产生最大可能数目的“同一的”位置。可以使用截至2004年9月1日可从国家生物技术信息中心获得的程序“BLAST 2Sequences”版本确定两个序列之间的百分比“序列同一性”，该程序并入了程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多肽序列比较)，这些程序基于Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12):5873-5877,1993)。当利用“BLAST 2Sequences”时，截至2004年9月1日为默认参数的参数可用于字长(3)、开放空位罚分(11)、扩展空位罚分(1)、空位下降值(50)、期望值(10)和任何其它必需参数(包括但不限于矩阵选项)。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对于彼此具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性，则认为该两个序列具有“实质上相似的序列同一性”或“实质性序列同一性”。
如本文所用，除非另外提供，否则免疫球蛋白分子可变区中氨基酸残基的位置是根据IMGT编号公约(Brochet,X等人,Nucl.Acids Res.(2008)36,W503-508)进行编号，并且免疫球蛋白分子恒定区中氨基酸残基的位置是根据EU命名法(Ward等人,1995Therap.Immunol.2:77-94)进行编号。其它编号公约是本领域中已知的(例如，Kabat编号公约(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda,MD:Public Health Service,National Institutes of Health(1991))。
如本文所用，术语“二聚体”是指这样的生物实体，其由两个经由一种或多种形式的分子内力(包括共价键(例如，二硫键)和其它相互作用(例如，静电相互作用、盐桥、氢键和疏水相互作用))彼此缔合的亚基组成，并且在适当的条件下(例如，在生理条件下，在适合于表达、纯化和/或储存重组蛋白的水溶液中，或在非变性和/或非还原电泳的条件下)是稳定的。如本文所用，“异二聚体”或“异二聚体蛋白”是指由两个不同多肽形成的二聚体。异二聚体不包括由四个多肽(即，两条轻链和两条重链)形成的抗体。如本文所用的“同型二聚体”或“同型二聚体蛋白”是指由两个同一的多肽形成的二聚体。多肽的包括特征和活性(诸如结合和RTCC)在内的所有公开内容都应被理解为包括多肽呈其二聚体形式以及其它多聚体形式。
当本公开的多肽为二聚体形式(即，二聚体蛋白)时，它在氨基端含有两个结合位点且在羧基端含有两个结合位点。因此，当单链多肽二聚化时，结合结构域被认为是二价的(即，每端有两个结合部分)。
“免疫球蛋白恒定区”或“恒定区”是本文定义的术语，是指对应于或源自免疫球蛋白的一个或多个恒定结构域的一部分或全部的肽或多肽序列。在某些实施方案中，恒定区包含IgG CH2和CH3结构域，例如IgG1 CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，恒定区不包含CH1结构域。在某些实施方案中，构成恒定区的恒定结构域是人的。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白的恒定区缺乏效应子功能或者具有最低的效应子功能，同时保持结合一些Fc受体诸如新生儿Fc受体(FcRn)的能力并保持相对长的体内半衰期。例如，本公开的融合蛋白的恒定区不会引起，或者实质上降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、补体激活和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的诱导。在其它变型中，本公开的融合蛋白包含保持一种或多种效应子功能，诸如ADCC和CDC中的一者或两者的效应子功能的恒定结构域。在某些实施方案中，本公开的结合结构域与人IgG1恒定区融合，其中IgG1恒定区具有以下氨基酸中的一者或多者的突变：位置234处的亮氨酸(L234)、位置235处的亮氨酸(L235)、位置237处的甘氨酸(G237)、位置318处的谷氨酸(E318)、位置320处的赖氨酸(K320)、位置322处的赖氨酸(K322)或它们的任何组合(根据EU编号)。例如，这些氨基酸中的任何一者或多者都可以改变为丙氨酸。在进一步实施方案中，IgG1 Fc结构域具有从L234、L235、G237、E318、K320和K322(根据EU编号)中的每一者向丙氨酸的突变(即，分别为L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A)，并且任选地还具有N297A突变(即，基本上消除CH2结构域的糖基化)。
术语“轻链可变区”(也称为“轻链可变结构域”或“VL”)和“重链可变区”(也称为“重链可变结构域”或“VH ”)分别是指来自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)的离散的、明确定义的亚区组成。在一个实施方案中，FR是人源化的。术语“CL”是指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即来自抗体轻链的恒定区。术语“CH”是指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，其可根据抗体同种型进一步细分为CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)，或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。“Fab”(抗原结合片段)是抗体中这样的部分，其与抗原结合并且包含经由链间二硫键与轻链联接的重链的可变区和CH1结构域。
如本文所用，术语“接头”一般是指连接多肽的两个亚结构域的短多肽序列。接头的非限制性实例包括包含甘氨酸-丝氨酸重复序列的柔性接头，和源自以下的接头：(a)跨膜蛋白(例如，I型跨膜蛋白)的结构域间区域；或(b)免疫球蛋白铰链。在一些实施方案中，接头提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得多肽保留了对与包含相同轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。在某些实施方案中，接头由5至约35个氨基酸，例如约15至约25个氨基酸组成。如本文所用，短语“介于CH3与CH1或CL之间的接头”是指介于CH3结构域(例如，野生型CH3或突变CH3)的C端与CH1结构域或CL结构域(例如，Cκ)的N端之间的一个或多个(例如，约2-12个、约2-10个、约4-10个、约5-10个、约6-10个、约7-10个、约8-10个、约9-10个、约8-12个、约9-12个或约10-12个)氨基酸残基。
在一些实施方案中，根据上下文，接头可以指(1)单链Fv(scFv)中介于VH区与VL区之间的多肽区或(2)包含两个结合结构域的多特异性多肽中介于第一结合结构域与第二结合结构域之间的多肽区。在后一个实例中，其中接头连接两个或更多个结合结构域，此类接头在本文中称为“Fc结合结构域接头”。在一些实施方案中，Fc结合结构域接头可以直接联接或连接两个或更多个结合结构域，产生包含以下结构的构建体：结合结构域-Fc结合结构域接头-结合结构域。在一些实施方案中，本文所述的多特异性多肽按照从氨基端到羧基端的顺序包含(i)第一结合结构域，(ii)Fc结合结构域接头，和(iii)第二结合结构域。在一些实施方案中，多特异性多肽按照从氨基端到羧基端的顺序包含(i)第二结合结构域，(ii)Fc结合结构域接头，和(iii)第一结合结构域。在一些实施方案中，Fc结合结构域接头可以通过将至少一个结合结构域联接至非结合结构域多肽，诸如免疫球蛋白Fc结构域(即，包含以下结构的多肽：Ig铰链-Ig恒定区)来联接或连接两个或更多个结合结构域。在此类实施方案中，所得构建体可以包含以下结构：结合结构域-Fc结构域-Fc结合结构域接头-结合结构域。在一些实施方案中，本文所述的多特异性多肽按照从氨基端到羧基端的顺序包含(i)第一结合结构域，(ii)铰链区，(iii)免疫球蛋白恒定区，(iv)Fc结合结构域接头，和(v)第二结合结构域。在一些实施方案中，多特异性多肽按照从氨基端到羧基端的顺序包含(i)第二结合结构域，(ii)Fc结合结构域接头，(iii)免疫球蛋白恒定区，(iv)铰链区，和(v)第一结合结构域。在包含两个结合结构域的多特异性多肽中介于免疫球蛋白恒定区与第二结合结构域之间的多肽区(例如，Fc结合结构域接头)也可以根据多特异性多肽内结构域的取向，称为“羧基端接头”或“氨基端”接头”。表1中提供了接头的非限制性实例。
在一些实施方案中，“铰链”或“铰链区”是指源自免疫球蛋白铰链区并且位于本文所述的多肽中的结合结构域与免疫球蛋白恒定区之间的多肽。“野生型免疫球蛋白铰链区”是指在抗体的重链中发现的插入在CH1与CH2结构域(对于IgG、IgA和IgD而言)之间并连接二者，或者插入在CH1与CH3结构域(对于IgE和IgM而言)之间并连接二者的天然存在的上部和中间铰链氨基酸序列。在某些实施方案中，野生型免疫球蛋白铰链区序列是人的，并且可以包含人IgG铰链区(例如，和IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区)。
“改变的免疫球蛋白铰链区”或“变异免疫球蛋白铰链区”是指与相应的亲代野生型免疫球蛋白铰链区相比具有一个或多个突变、取代、插入或缺失的铰链区多肽。在某些实施方案中，改变的免疫球蛋白铰链区与野生型免疫球蛋白铰链区具有至少约70％同一性(例如，至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性)。在某些实施方案中，改变的免疫球蛋白铰链区是野生型免疫球蛋白铰链区的片段，该片段长度为约5个氨基酸(例如，约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20个或更多个氨基酸)至至多约120个氨基酸(例如，长度为约10至约40个氨基酸或约15至约30个氨基酸或约15至约20个氨基酸或约20至约25个氨基酸)。通常，作为野生型免疫球蛋白铰链区的片段的改变的免疫球蛋白铰链区包含如美国专利申请公布号2013/0129723和2013/0095097中所公开的IgG核心铰链区(例如，包含序列C-X-X-C的多肽，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:390))。表2中提供了铰链的非限制性实例。
如本文所用，术语“人源化”是指使用基因工程技术使源自非人类物种(例如，小鼠或大鼠)的抗体或免疫球蛋白结合蛋白和多肽对人类的免疫原性较低，同时仍保留原始抗体的抗原结合特性的过程。在一些实施方案中，抗体或免疫球蛋白结合蛋白和多肽(例如，轻链和重链可变区、Fab、scFv)的一个或多个结合结构域是人源化的。非人结合结构域可以使用称为CDR移植的技术(Jones等人，Nature321:522(1986))以及该技术的变型人源化，该技术的变型包括“改形(reshaping)”(Verhoeyen等人,1988Science 239:1534-1536；Riechmann等人,1988Nature 332:323-337；Tempest等人,Bio/Technol 1991 9:266-271)、“超嵌合(hyperchimerization)”(Queen等人,1989Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033；Co等人,1991Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co等人,1992J Immunol148:1149-1154)和“镶饰(veneering)”(Mark等人,"Derivation of therapeuticallyactive humanized and veneered anti-CD18 antibodies.”见:Metcalf BW,Dalton BJ编辑的Cellular adhesion中：molecular definition to therapeutic potential.NewYork:Plenum Press,1994:291-312)。如果源自非人来源，则抗体或免疫球蛋白结合蛋白和多肽的其它区域，诸如铰链区和恒定区结构域，也可以被人源化。
如本文所用，“免疫球蛋白二聚化结构域”或“免疫球蛋白异二聚化结构域”是指多肽链中优先与第二多肽链的不同免疫球蛋白结构域相互作用或缔合的免疫球蛋白结构域，其中不同免疫球蛋白异二聚化结构域的相互作用实质上促使或有效促进第一和第二多肽链的异二聚化(即，在两条不同的多肽链之间形成二聚体，其也称为“异二聚体”)。如果在不存在第一多肽链的免疫球蛋白异二聚化结构域和/或第二多肽链的免疫球蛋白异二聚化结构域的情况下，第一多肽链与第二多肽链之间的二聚化在统计学上显著减少，则免疫球蛋白异二聚化结构域之间的相互作用“实质上促使或有效促进”第一多肽链和第二多肽链的异二聚化。在某些实施方案中，当第一多肽链和第二多肽链共表达时，至少60％、至少约60％至约70％、至少约70％至约80％、至少80％至约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的第一多肽链和第二多肽链彼此形成异二聚体。代表性的免疫球蛋白异二聚化结构域包括免疫球蛋白CH1结构域、免疫球蛋白CL结构域(例如，Cκ或Cλ同种型)或它们的衍生物，包括如其中提供的野生型免疫球蛋白CH1和CL结构域以及改变(或突变)的免疫球蛋白CH1和CL结构域。
术语患者和受试者在本文可互换使用。如本文所用，术语“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指处于适合用本文提供的结合蛋白或多特异性多肽或其组合物治疗或改善的疾病、病症或病状的风险中，或患有该疾病、病症或病状的患者或受试者。“患者”和“受试者”在本文可互换使用。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当使用本领域众所周知的途径施用时一般不产生过敏或其它严重不良反应的分子实体和组合物。被联邦或州政府的监管机构批准或列入《美国药典(U.S.Pharmacopeia)》或其它公认的药典中用于动物且更特别是用于人类的分子实体和组合物被认为是“药学上可接受的”。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非明确限定，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸类似物的核酸，该核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守性修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个选定的(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；Cassol等人(1992)；Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物，以及它们的衍生物、片段和同源物。
术语“表达”是指由核酸编码的产物的生物合成。例如，在编码目标多肽的核酸片段的情况下，表达涉及将核酸区段转录成mRNA和将mRNA翻译成一个或多个多肽。
术语“表达单元”和“表达盒”在本文中可互换使用并且表示这样的核酸区段，该核酸区段编码目标多肽并且能够在宿主细胞中提供该核酸区段的表达。表达单元通常包含转录启动子、编码目标多肽的开放阅读框，和转录终止子，所有这些都处于可操作构型(configuration)。除了转录启动子和终止子之外，表达单元可以进一步包括其它核酸区段，诸如，例如增强子或多聚腺苷酸化信号。
如本文所用的术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元的线性或环状核酸分子。除了一个或多个表达单元之外，表达载体还可以包括另外的核酸区段，诸如，例如，一个或多个复制起点或一个或多个可选择标记。表达载体一般源自质粒或病毒DNA，或者可以含有两者的元件。
如本文所用，“多肽”、“多肽链”或“蛋白质”是指共价联接的氨基酸的连续排列。多肽可以形成一个或多个链内二硫键。关于如本文所述的多肽，对与由SEQ ID NO指定的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的修饰或改变的提及包括此类残基的翻译后修饰。术语多肽和蛋白质还涵盖其中两条多肽链以非线性方式联接在一起(诸如经由链间二硫键联接在一起)的实施方案。例如，天然免疫球蛋白分子由两条重链多肽和两条轻链多肽组成。
如本文所用，“多特异性多肽”是指包含两个或更多个结合结构域的多肽，每个结合结构域均能够与靶抗原特异性地结合。例如，本文所述的多肽可包含2、3、4个或更多个结合结构域并且可能能够结合2、3、4个或更多个靶抗原。在一些实施方案中，多特异性多肽是双特异性多肽。本文中，“双特异性多肽”包含两个结合结构域并且能够结合至两个不同的靶抗原。在一些实施方案中，本文所述的双特异性多肽包含与靶细胞上表达的细胞表面抗原特异性地结合的第一结合结构域。在一些实施方案中，本文所述的双特异性多肽包含与效应细胞上表达的细胞表面抗原特异性地结合的结合结构域。结合结构域可以源自抗体(例如，可变重链和/或可变轻链变化，scFv)、配体或受体。
多特异性多肽公开于例如PCT公布号WO 2007/146968；WO 2010/040105；WO 2010/003108；WO 2016/094873；WO 2017/053469；美国专利申请公布号2006/0051844；和美国专利号7,166,707和8,409,577中，其各自通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，本文所述的多特异性多肽是双特异性多肽并且可以包含scFv-Fc-scFv结构，其在本文也称为ADAPTIRTM多肽。包含此类结构的多肽的结构从N端到C端包含：第一scFv结合结构域-免疫球蛋白(Ig)铰链区-Ig恒定区-第二scFv结合结构域。
蛋白质或多肽可以是抗体或抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，蛋白质可以是重组多特异性蛋白。在其它实施方案中，可以通过化学联接两种不同的单克隆抗体或通过融合两种杂交瘤细胞系以产生杂合体杂交瘤来产生多特异性蛋白。可以使用的其它多价型式包括，例如四价体瘤、Kλ抗体、dAb、双链抗体、TandAb、纳米抗体、小型模块化免疫药物(SMIPTM)、
Figure BDA0003840537750000301
CrossMab Fab、CrossMab VH-VL、链交换工程化结构域抗体(SEEDbody)、亲和体、Fynomers、Kunitz结构域、Albu-dab、两个具有交换的VH的工程化Fv片段(例如，双重亲和重新靶向分子(D.A.R.T.))、scFv x scFv(例如，BiTE)、DVD-IG、Covx-body、肽体、scFv-Ig、SVD-Ig、dAb-Ig、旋钮入孔(Knobs-in-Hole)抗体、在CH3结构域中包含匹配突变的IgG1抗体(例如，DuoBody抗体)和三功能抗体。示例性的双特异性型式在Garber等人，Nature Reviews Drug Discovery 13:799-801(2014)中有讨论，该文献通过引用整体并入本文。Liu等人Front.Immunol.8:38doi:10.2289/fimmu.2017.00038，及Brinkmann和Kontermann,MABS 9:2,182–212(2017)讨论了另外的示例性双特异性型式，该文献各自通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，双特异性抗体可以是F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有四聚体抗体分子的通过铰链区中的二硫键联接的两条抗原结合臂。
如本领域技术人员将理解的，蛋白质和多肽在本文中根据单个多肽链的氨基酸序列来定义，该氨基酸序列由贯穿本公开提及的SEQ ID NO指示。例如，在一些实施方案中，本文所述的scFv-Fc-scFv蛋白或多肽由两条scFv-Fc-scFv多肽链组成，该两条scFv-Fc-scFv多肽链通过链间键(例如，链间二硫键)缔合从而形成二聚体scFv-Fc-scFv蛋白(例如，同型二聚体或异二聚体scFv-Fc-scFv蛋白)。在此类实施方案中，scFv-Fc-scFv蛋白由单个scFv-Fc-scFv多肽链的氨基酸序列限定。多肽和蛋白质也可以包含非肽组分，诸如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可以由产生蛋白质的细胞添加到该蛋白质或多肽中，并且将会随细胞类型而变化。蛋白质和多肽在本文根据其氨基酸骨架结构进行定义；诸如碳水化合物基团的取代基一般没有被指定，但仍然可以存在。
术语“轻链可变区”(也称为“轻链可变结构域”或“VL”或“VL”)和“重链可变区”(也称为“重链可变结构域”或“VH”或“VH”)分别是指来自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)的离散的、明确定义的亚区构成，该亚区一般从氨基端到羧基端按顺序包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在一个实施方案中，FR是人源化的。术语“CL”是指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即来自抗体轻链的恒定区。术语“CH”是指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，其可根据抗体同种型进一步细分为CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)，或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。“Fab”(抗原结合片段)是抗体中这样的部分，其与抗原结合并且包含经由链间二硫键与轻链联接的重链的可变区和CH1结构域。
术语“氨基端”和“羧基端”在本文中用于表示在多肽内的位置。在上下文允许的情况下，这些术语是针对多肽的特定序列或部分使用，用于表示接近性或相对位置。例如，定位于多肽内参考序列羧基端的某个序列位于参考序列的羧基端的近侧，但不一定位于完整多肽的羧基端。
如本文所用，术语“转化”、“转染”和“转导”是指将核酸(即，核苷酸聚合物)转移到细胞中。如本文所用，术语“遗传转化”是指将DNA，特别是重组DNA转移和掺入到细胞中。转移的核酸可以经由表达载体被引入到细胞中。
如本文所用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的过程，在这个过程中，表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞(例如，单核细胞诸如自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体(或其它能够结合FcγR的蛋白质)并随后引起靶细胞的裂解。原则上，任何具有激活性FcγR的效应细胞都可以被触发以介导ADCC。介导ADCC的原代细胞是仅表达FcγRIII的NK细胞，而单核细胞根据其激活、定位或分化状态，可以表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。关于造血细胞上FcγR表达的综述，参见，例如，Ravetch等人，1991,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92。
如本文关于多肽或蛋白质所用的术语“具有ADCC活性”意指多肽或蛋白质，例如，包含诸如源自IgG(例如IgG1)的Fc结构域(例如，免疫球蛋白铰链区和具有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白恒定区)的多肽或蛋白质能够通过表达Fc受体的溶细胞免疫效应细胞(例如，NK细胞)上的溶细胞Fc受体(例如FcγRIII)的结合介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，包含Fc结构域的多特异性多肽或蛋白质可能由于CH2和/或CH3结构域中的突变而缺乏效应子功能(例如，无效的ADCC活性)。
如本文所用的“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指这样的过程，在该过程中，正常血清中的组分(“补体”)与抗体或其它与靶抗原结合的C1q补体结合蛋白一起表现出对表达靶抗原的靶细胞的裂解。补体由一组血清蛋白组成，所述血清蛋白共同作用并按有序的顺序发挥其作用。
如本文所用的术语“经典补体途径”和“经典补体系统”是同义的并且是指用于激活补体的特定途径。经典途径需要抗原-抗体复合物才能启动，并且涉及以有序的方式激活命名为C1至C9的九种主要蛋白质组分。对于激活过程中的几个步骤，产物是催化后续步骤的酶。该级联通过相对小的初始信号提供大量补体的扩增和激活。
如本文关于多肽或蛋白质所用的术语“具有CDC活性”意指多肽或蛋白质，例如，包含诸如源自IgG(例如IgG1)的Fc结构域(例如，免疫球蛋白铰链区和具有CH2和CH3结构域的免疫球蛋白恒定区)的多肽或蛋白质能够通过C1q补体蛋白的结合和经典补体系统的激活来介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，多特异性多肽或蛋白质可能由于CH2和/或CH3结构域中的一个或多个突变而缺乏效应子功能(例如，无效的CDC活性)。
如本文所用，“增强的效应细胞激活”是指本文所述的多肽或蛋白质对效应细胞反应的增加、延长和/或强化。在一些实施方案中，增强的效应细胞激活是指效应细胞的细胞毒活性的增加。在一些实施方案中，增强的效应细胞激活是指细胞因子产生、细胞增殖的增加，或细胞表面分子表达的变化，使得效应细胞裂解靶细胞的能力增强。
如本文所用，术语“效应细胞”是指能够裂解或杀伤靶细胞(诸如肿瘤细胞)的免疫系统细胞。在本文中，效应细胞可以指淋巴细胞，诸如T细胞、自然杀伤(NK)细胞或NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。在特定实施方案中，术语效应细胞是指T细胞、NK细胞或NKT细胞。
如本文所用，术语“治疗”或“改善”是指治疗性治疗或预防性/防治性治疗。如果接受治疗的个体的至少一种疾病症状改善，或者治疗可以延迟个体进行性疾病的恶化，或防止另外的相关疾病的发作，则治疗是治疗性的。
如本文所用，本文所述的多肽或蛋白质或其组合物的术语“治疗有效量(或剂量)”或“有效量(或剂量)”是指足以引起正在治疗的疾病的一种或多种症状以统计学上显著的方式改善或引起统计学上显著的器官功能改进的化合物的量。当提及单独施用的单个活性成分时，治疗有效剂量是指单独的该成分。当提及组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是连续施用还是同时施用(以同一调配物施用或以单独调配物并行施用)。
药物组合物
本文描述了蛋白质治疗剂(诸如多特异性多肽)的稳定药物调配物，其防止变性并且/或者防止或实质上减少聚集体的形成，尤其是在冷冻时。除了治疗性蛋白之外，本文所述的药物组合物可进一步包含缓冲剂、赋形剂和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，所述组合物包含缓冲剂、赋形剂和表面活性剂，由或基本上由缓冲剂、赋形剂和表面活性剂组成，其中所述多特异性蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序，或按照从羧基端到氨基端的顺序包含：(i)第一结合结构域，(ii)铰链区，(iii)免疫球蛋白恒定区，和(iv)第二结合结构域；并且所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
在一些实施方案中，所述组合物包含约0.1mg/ml至约10mg/ml的多特异性蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含约1mg/ml至约5mg/ml的多特异性蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含约2mg/ml的多特异性蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含约2mg/ml的多特异性蛋白、约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，其中所述组合物实质上防止多特异性蛋白的降解。在一些实施方案中，所述组合物使所述多特异性多肽的降解与在同一的储存条件下储存在组氨酸缓冲液中的同一的多特异性多肽相比得以减缓或减少。在一些实施方案中，所述组合物在4℃下实质上稳定至少1年。在一些实施方案中，所述组合物实质上抵抗多特异性蛋白聚集体的形成。
在一些实施方案中，所述组合物能够经受冻融条件。在一些实施方案中，与在同一的冻融条件下储存在组氨酸缓冲液中的同一的多特异性多肽相比，所述组合物减缓或减少所述多特异性多肽在冻融条件下的降解。
在其它实施方案中，当如本文公开的那样调配时，CD123 x CD3靶向多特异性多肽在冻干后几乎不发生降解。例如，CD123 x CD3靶向多特异性多肽可以被调配成琥珀酸盐和蔗糖调配物，该调配物与用组氨酸缓冲剂调配的同一的多肽相比在冻干后表现出降解减少。本文还提供了一种冻干的抗CD123 x抗CD3多特异性多肽，包括但不限于调配在约5mM琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)蔗糖和约0.02％w/v聚山梨醇酯80中的TRI130和TRI129。在一些实施方案中，所述组合物是经冻干的。
缓冲剂
如本文所用，术语“缓冲剂(buffer)”或“缓冲剂(buffering agent)”是指一种或多种这样的组分，该组分在被添加到水溶液中时，能够在添加酸或碱或用溶剂稀释时保护溶液免受pH值变化的影响。
在一些实施方案中，缓冲剂包含任何药学上可接受的缓冲剂，由或基本上由任何药学上可接受的缓冲剂组成。例如，缓冲剂可以是磷酸钾、乙酸/乙酸钠、柠檬酸/柠檬酸钠、琥珀酸/琥珀酸钠、酒石酸/酒石酸钠、组氨酸/组氨酸HCl、甘氨酸、Tris、谷氨酸盐、乙酸盐、它们的混合物，或它们的药学上可接受的盐或酸。在特定实施方案中，缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，由或基本上由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
在一些实施方案中，所述组合物中缓冲剂的浓度为约1mM至约500mM、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1至约10mM、约5mM约50mM或约5mM至约20mM、约5mM至约10mM。在一些实施方案中，所述组合物包含约1mM至约10mM的琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸。在一些实施方案中，所述组合物包含约5mM的琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸。
在一些实施方案中，所述组合物的pH为3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75、10.0、10.25、10.5、10.75、11.0、11.25或11.5。在一些实施方案中，所述组合物的pH为约3.0至约6.0。在一些实施方案中，所述组合物具有约4.0至约5.5的pH。在一些实施方案中，所述组合物的pH为约4.8。
赋形剂
如本文所指，赋形剂是与组合物的活性药物成分一起调配的药理学非活性物质。赋形剂可能有助于润滑性、流动性、崩解性或味道，并且可赋予某种形式的抗菌功能。
可用于本文公开的组合物中的示例性赋形剂包括药物粘合剂、稀释剂、延迟缓释赋形剂、润滑剂、助流剂、气体发生剂、包衣体系、溶剂和着色剂。合适的赋形剂包括在Handbook of Pharmaceutical Excipients，第三版，由A.H.Kibbe编辑，AmericanPharmaceutical Association and Pharmaceutical Press(2000)，以及E.T.Cole等人,Advanced Drug Delivery Reviews 60(2008),747-756中的表3-5中提及的作为赋形剂的物质。例如，赋形剂可以选自由聚丙二醇；聚乙二醇、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯甘油氧硬脂酸酯、饱和聚乙二醇化甘油酯、聚乙烯聚丙二醇、维生素E和维生素ETPGS(d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)组成的组。
在一些实施方案中，所述组合物包含约1％重量/体积(w/v)至约20％w/v、约1％w/v至约10％w/v、约5％w/v至约15％w/v或约10％w/v的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包含约1％w/v至约12％w/v的赋形剂，诸如约6.5％w/v的赋形剂。
在一些实施方案中，所述赋形剂包含糖、由糖组成或基本上由糖组成。在一些实施方案中，所述组合物包含约1％w/v至约12％w/v的糖。在一些实施方案中，所述组合物包含约4％至约8％w/v的糖。在一些实施方案中，所述组合物包含约6.5％w/v的糖。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖。
表面活性剂
如本文所述，“表面活性剂”是含有疏水部分(例如，烷基链)和亲水部分(例如，羧基和羧酸根基团)的表面活性分子。
适合用于本文所述的组合物中的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；脱水山梨糖醇酯和衍生物；Triton；月桂硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基磺基甜菜、肉豆蔻基磺基甜菜、亚油基磺基甜菜或硬脂基磺基甜菜碱；月桂基肌氨酸、肉豆蔻基肌氨酸、亚油基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亚油基甜菜、肉豆蔻基甜菜或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、亚油酰胺丙基甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基甜菜碱、棕榈酰胺丙基甜菜碱或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如，月桂酰胺丙基甜菜碱)；肉豆蔻酰胺丙基二甲胺、棕榈酰胺丙基二甲胺或异硬脂酰胺丙基二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics、PF68等)。在特定实施方案中，所述表面活性剂包含聚山梨醇酯80或由聚山梨醇酯80组成。
在一些实施方案中，所述组合物包含约0.001％w/v至约1％w/v、约0.01％w/v至约0.5％w/v、或约0.01％w/v至约0.1％w/v的表面活性剂。在一些实施方案中，所述组合物包含约0.02％w/v的表面活性剂。
在一些实施方案中，所述组合物包含约0.001％w/v至约1％w/v、约0.01％w/v至约0.5％w/v、或约0.01％w/v至约0.1％w/v的聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述组合物包含约0.02％w/v的聚山梨醇酯80。
治疗性蛋白质
本文所述的组合物可与如本文所述的许多不同的蛋白质治疗剂结合使用。
结合结构域
在一些实施方案中，所述治疗性蛋白包含结合结构域。该结合结构域可以提供与至少一种细胞表面分子(例如，细胞表面受体)的特异性结合。该结合结构域可以是抗体或其片段，或多种不同型式中的任何一种型式的融合蛋白的形式(例如，该融合蛋白可以是双特异性或多特异性分子的形式)。在其它实施方案中，该结合结构域可以包含例如特定细胞因子或将结合结构域多肽靶向例如特定细胞类型、毒素、另外的细胞受体或抗体的分子。
在一些实施方案中，本文所述的结合结构域源自抗体并且包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。例如，包含VH和VL链的scFv。这些结合结构域和可变链可以任何顺序排列，但仍保留与一个或多个靶标的一些结合。在一些实施方案中，结合结构域包含(i)免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3；和(ii)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本文所述的多肽和蛋白质包含作为scFv的结合结构域。在此类实施方案中，所述结合结构域可以称为scFv结构域。在一些实施方案中，结合结构域是单链Fv片段(scFv)，该单链Fv片段包含对目标靶标有特异性的VH和VL区。在某些实施方案中，VH和VL区是人的或人源化的。在一些变型中，结合结构域是单链Fv(scFv)，该单链Fv包含通过肽接头联结的VL和VH区。
在某些实施方案中，本文所述的多肽的结合结构域包含(i)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含CDR即LCDR1、LCDR2和LCDR3，和(ii)免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含CDR即HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，为多肽构建体提供的氨基酸序列不包括人免疫球蛋白前导序列。所示的CDR序列和氨基酸取代位置是使用IMGT标准(Brochet等人，Nucl.Acids Res.(2008)36,W503-508)定义的那些。
在某些实施方案中，当与已知单克隆抗体的VL和/或VH序列相比较时，本公开的结合结构域VL和/或VH区源自亲本VL和/或VH区(例如，如在PCT申请公开号WO 2016/185016所述的1618/1619)的VL和/或VH并且任选地含有约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代)，或上述变化的组合。一个或多个插入、一个或多个缺失或者一个或多个取代可以在VL和/或VH区的任何位置，包括在该区域的氨基端或羧基端或这两个末端，条件是每个CDR均包含零个变化或最多一个、两个或三个变化。在一些实施方案中，含有经修饰的VL和/或VH区的结合结构域仍可以以与亲本结合结构域相似或更高的亲和力特异性地结合其靶标。
用于联结VL和VH区的肽接头的使用在本领域中是众所周知的，并且在该特定领域中存在大量出版物。在一些实施方案中，肽接头是由Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:128)氨基酸序列((Gly4Ser)3)(SEQ ID NO:59)的三个重复组成的15聚体。已经使用其它接头，并且已经使用噬菌体展示技术以及选择性感染性噬菌体技术来多样化和选择适当的接头序列(Tang等人,J.Biol.Chem.271,15682-15686,1996；Hennecke等人,Protein Eng.11,405-410,1998)。在某些实施方案中，VL和VH区被具有包含式(Gly4Ser)n的氨基酸序列的肽接头联结，其中n＝1-5(SEQ ID NO:129)。例如，在一些实施方案中，接头包含(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:61)。其它合适的接头可以通过经随机诱变优化简单的接头来获得。在一些实施方案中，本文所述的scFv的VH区可以被定位于接头序列的N端。在一些实施方案中，本文所述的scFv的VL区可以被定位于接头序列的C端。
在一些实施方案中，该结合结构域可与肿瘤抗原，诸如CD123、PSMA、CD19、CD33、5T4或HER2结合。在一些实施方案中，该结合结构域可以是CD3结合结构域。在一些实施方案中，该结合结构域可以与4-1-BB结合。在一些实施方案中，该结合结构域可以与OX40结合。在一些实施方案中，调配的多特异性蛋白与4-1BB和OX40两者结合。
铰链
除了结合结构域之外，治疗性多肽可进一步包含铰链区。在一些实施方案中，铰链是改变的免疫球蛋白铰链，其中在野生型免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基被一个或多个其它氨基酸残基(例如，丝氨酸或丙氨酸)取代。示例性改变的免疫球蛋白铰链、羧基端接头和氨基端接头包括免疫球蛋白人IgG1铰链区，该铰链区具有在野生型人IgG1铰链中发现的一个、两个或三个半胱氨酸残基被一个、两个或三个不同的氨基酸残基(例如，丝氨酸或丙氨酸)的取代。改变的免疫球蛋白铰链可以另外具有脯氨酸被另一种氨基酸(例如，丝氨酸或丙氨酸)的取代。例如，上述改变的人IgG1铰链可以另外具有位于野生型人IgG1铰链区的三个半胱氨酸羧基端的脯氨酸被另一种氨基酸残基(例如，丝氨酸、丙氨酸)的取代。在一个实施方案中，核心铰链区的脯氨酸未被取代。在某些实施方案中，铰链、羧基端接头或氨基端接头多肽包含或者是与野生型免疫球蛋白铰链区，诸如野生型人IgG1铰链、野生型人IgG2铰链或野生型人IgG4铰链有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
免疫球蛋白恒定结构域
治疗性蛋白还可包含免疫球蛋白恒定(Fc)结构域(在本文中也称为恒定区、Fc结构域、Fc区等)。在一些实施方案中，该恒定区包含IgG CH2和CH3结构域，例如IgG1 CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，该恒定区不包含CH1结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定区是人Fc结构域。在一些实施方案中，该免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区相比包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，以减少或防止与FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRIIIb的结合。在一些实施方案中，构成恒定区的恒定结构域是人的或源自人序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含Fc区的一个或多个突变以减少或防止补体固定和与Fcγ受体的相互作用。在一些实施方案中，该免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区相比包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以防止或减少Fc介导的T细胞激活。在一些实施方案中，该免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区相比包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以防止或减少CDC活性。在一些实施方案中，该免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区相比包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以防止或减少ADCC活性。
在一些实施方案中，Fc区包含位于CH2结构域的根据EU编号系统的位置234、235、237和322处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc结构域包含位于CH2结构域的根据EU编号系统的位置234、235、237、318、320和322处的突变。在一些实施方案中，该Fc结构域包含CH2结构域的根据EU编号系统的突变L234A、L235A、G237A和K322A。在一些实施方案中，该Fc结构域包含CH2结构域的根据EU编号系统的突变L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A。在一些实施方案中，该免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代E233P、L234A、L235A、G237A和K322A及G236缺失的人IgG1CH2结构域。在一些实施方案中，Fc结构域源自人IgG1。在一些实施方案中，IgG1 Fc结构域中的两个或更多个突变防止或实质上减少通过Fc介导的交联的信号传导。
在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区包含SEQ ID NO:32-35中任一个的氨基酸序列或其变体。免疫球蛋白恒定区的纳入减缓了本公开的多肽和蛋白质在被施用于受试者后从循环中的清除。通过突变或其它改变，免疫球蛋白恒定区进一步使得能够相对容易地调节多肽效应子功能(例如，ADCC、ADCP、CDC、补体固定和与Fc受体的结合)，该多肽效应子功能可以根据所治疗的疾病来增加或减少，如本领域已知和本文描述的。在某些实施方案中，本文所述的多肽和蛋白质包含能够介导这些效应子功能中的一种或多种效应子功能的免疫球蛋白恒定区。在其它实施方案中，与相应的野生型免疫球蛋白恒定区相比，这些效应子功能中的一种或多种效应子功能在本公开中描述的多肽或蛋白质的免疫球蛋白恒定区中降低或不存在。
存在于本公开的多肽和蛋白质中的免疫球蛋白恒定区可包含或可源自以下的一部分或全部：CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其任何组合。例如，免疫球蛋白恒定区可以包含CH2结构域、CH3结构域、CH2和CH3结构域两者、CH3和CH4结构域两者、两个CH3结构域、CH4结构域、两个CH4结构域，以及CH3结构域的一部分和CH2结构域。在某些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质不包含CH1结构域。
本文所述的多肽或蛋白质可包含来自某些免疫球蛋白类别或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD)和来自各种物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的野生型免疫球蛋白CH2结构域或改变的免疫球蛋白CH2结构域。在某些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质的CH2结构域是野生型人免疫球蛋白CH2结构域，诸如分别如美国专利申请公开号2013/0129723的SEQ ID NO:115、199-201和195-197(所述序列通过引用并入本文)中所示的人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的野生型CH2结构域。在某些实施方案中，CH2结构域是如美国专利申请公布号US 2013/0129723的SEQ ID NO:115所示的野生型人IgG1 CH2结构域(所述序列通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，本公开的多肽或蛋白质中改变的CH2区包含或者是与野生型免疫球蛋白CH2区，诸如野生型人IgG1、IgG2或IgG4或小鼠IgG2a(例如，IGHG2c)的CH2区有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列。
本公开的多肽或蛋白质中改变的免疫球蛋白CH2区可以源自来自各种物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的各种免疫球蛋白同种型(诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2和IgD)的CH2区。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白中改变的免疫球蛋白CH2区可以源自人IgG1、IgG2或IgG4或小鼠IgG2a(例如，IGHG2c)的CH2区，其序列在美国专利申请公开号2013/0129723的SEQ ID NO:115、199、201和320中示出(所述序列通过引用并入本文)。在某些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质的改变的CH2结构域是具有本领域已知的突变的改变的人IgG1 CH2结构域，所述突变增强或降低免疫活性(即，效应子功能)，诸如ADCC、ADCP、CDC、补体固定、Fc受体结合或它们的任何组合。
在某些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质的CH2结构域是改变的免疫球蛋白CH2区(例如，改变的人IgG1 CH2结构域)，其包含一个或多个氨基酸缺失或取代。在一些实施方案中，CH2结构域包含位于位置297的天冬酰胺处的氨基酸取代(例如，天冬酰胺被取代为丙氨酸)。此类氨基酸取代减少或消除了该位点处的糖基化，并除去了Fc与FcγR和C1q的有效结合。具有位于位置297处的Asn至Ala取代的改变的人IgG1 CH2结构域的序列如美国专利申请公开号2013/0129723的SEQ ID NO:324(所述序列通过引用并入本文)中所示。在一些实施方案中，改变的CH2结构域包含位于位置234至238处的至少一个取代或缺失。例如，免疫球蛋白CH2区可以包含位于以下处的取代：位置234、235、236、237或238；位置234和235；位置234和236；位置234和237；位置234和238；位置234-236；位置234、235和237；位置234、236和238；位置234、235、237和238；位置236-238；或位置234-238处的两个、三个、四个或五个氨基酸的任何其它组合。在一些实施方案中，改变的CH2区包含位于位置234-238处的一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)氨基酸缺失，例如包含位于位置236或位置237中的一个位置处的一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)氨基酸缺失，而另一个位置被取代。在某些实施方案中，位于位置234-238中的一个或多个位置处的氨基酸残基已被一个或多个丙氨酸残基置换。在进一步的实施方案中，位于位置234-238处的氨基酸残基中的仅一个氨基酸残基已经缺失，而位于位置234-238处的剩余氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被另一种氨基酸(例如，丙氨酸或丝氨酸)取代。
在一些实施方案中，一个或多个上述突变降低或消除包含改变的CH2结构域的多肽的ADCC活性或Fc受体结合能力。
在某些其它实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质的CH2结构域是改变的免疫球蛋白CH2区(例如，改变的人IgG1 CH2结构域)，其包含位于位置253、310、318、320、322和331处的一个或多个氨基酸取代。例如，免疫球蛋白CH2区可以包含位于以下处的取代：位置253、310、318、320、322或331，位置318和320，位置318和322，位置318、320和322，或者位置253、310、318、320、322和331处的两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的任何其它组合。在此类实施方案中，一个或多个上述突变降低或消除包含改变的CH2结构域的多肽的CDC活性。
在某些其它实施方案中，除了位置297处的氨基酸取代之外，本文所述的多肽或蛋白质的改变的CH2区(例如，改变的人IgG1 CH2结构域)可以进一步包含位于位置234-238处的一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)附加替代。例如，免疫球蛋白CH2区可以包含位于以下处的取代：位置234和297，位置234，235和297，位置234、236和297，位置234-236和297，位置234、235、237和297，位置234、236、238和297，位置234、235、237、238和297，位置236-238和297，或位置234-238外加位置297处的两个、三个、四个或五个氨基酸的任何组合。另外或可替代地，改变的CH2区可以包含位于位置234-238处，诸如位于位置236或位置237处的一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)氨基酸缺失。一个或多个附加突变降低或消除了包含改变的CH2结构域的多肽的ADCC活性或Fc受体结合能力。在某些实施方案中，位于位置234-238中的一个或多个位置处的氨基酸残基已被一个或多个丙氨酸残基置换。在进一步的实施方案中，位于位置234-238处的氨基酸残基中的仅一个氨基酸残基已经缺失，而位于位置234-238处的剩余氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被另一个氨基酸(例如，丙氨酸或丝氨酸)取代。
在某些实施方案中，除了位置234-238处的一个或多个(例如，2、3、4或5个)氨基酸取代以外，本公开的融合蛋白中本文所述的多肽或蛋白质的突变的CH2区(例如，改变的人IgG1 CH2结构域)可以含有位于参与补体固定的一个或多个位置处(例如，位于位置I253、H310、E318、K320、K322或P331处)的一个或多个(例如，2、3、4、5或6个)附加氨基酸取代(例如，经丙氨酸取代)。突变的免疫球蛋白CH2区的实例包括人IgG1、IgG2、IgG4和小鼠IgG2aCH2区，其具有位于位置234、235、237(如果存在)、318、320和322处的丙氨酸取代。示例性突变免疫球蛋白CH2区是具有位于L234、L235、G237、E318、K320和K322处的丙氨酸取代的小鼠IGHG2c CH2区。
在还进一步的实施方案中，除了位于位置297处的氨基酸取代和位于位置234-238处的一个或多个附加缺失或取代以外，本文所述的多肽或蛋白质的改变的CH2区(例如，改变的人IgG1 CH2结构域)可进一步包含位于位置253、310、318、320、322和331处的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)附加取代。例如，免疫球蛋白CH2区可包含：(1)位于位置297处的取代，(2)位于位置234-238处的一个或多个取代或缺失或其组合，和位于位置I253、H310、E318、K320、K322和P331处的一个或多个(例如，2、3、4、5或6个)氨基酸取代，诸如位于位置E318、K320和K322处的一个、两个、三个取代。位于上述位置处的氨基酸可以被丙氨酸或丝氨酸取代。
在某些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质的免疫球蛋白CH2区包含：(i)位于位置297的天冬酰胺处的氨基酸取代和位于位置234、235、236或237处的一个氨基酸取代；(ii)位于位置297的天冬酰胺处的氨基酸取代和位于位置234-237中的两个位置处的氨基酸取代；(iii)位于位置297的天冬酰胺处的氨基酸取代和位于位置234-237中的三个位置处的氨基酸取代；(iv)位于位置297的天冬酰胺处的氨基酸取代，位于位置234、235和237处的氨基酸取代，以及位于位置236处的氨基酸缺失；(v)位于位置234-237中的三个位置处的氨基酸取代和位于位置318、320和322处的氨基酸取代；或(vi)位于位置234-237中的三个位置处的氨基酸取代，位于位置236处的氨基酸缺失，以及位于位置318、320和322处的氨基酸取代。
具有位于位置297的天冬酰胺处的氨基酸取代的示例性改变的免疫球蛋白CH2区包括：具有位于L234、L235、G237和N297处的丙氨酸取代和位于G236处的缺失的人IgG1 CH2区(美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:325，所述序列通过引用并入本文)；具有位于V234、G236和N297处的丙氨酸取代的人IgG2 CH2区(美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:326，所述序列通过引用并入本文)；具有位于F234、L235、G237和N297处的丙氨酸取代和G236缺失的人IgG4 CH2区(美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ IDNO:322，所述序列通过引用并入本文)；具有位于F234和N297处的丙氨酸取代的人IgG4 CH2区(美国专利申请公布号US2013/0129723的SEQ ID NO:343，所述序列通过引用并入本文)；具有位于L235和N297处的丙氨酸取代的人IgG4 CH2区(美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:344，所述序列通过引用并入本文)；具有位于G236和N297处的丙氨酸取代的人IgG4 CH2区(美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:345，所述序列通过引用并入本文)；以及具有位于G237和N297处的丙氨酸取代的人IgG4CH2区(美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:346，所述序列通过引用并入本文)。这些CH2区可以用于本公开的多肽中。
在某些实施方案中，除了上述氨基酸取代以外，本文所述的多肽或蛋白质的改变的CH2区(例如，改变的人IgG1 CH2结构域)可以含有位于除上述位置以外的一个或多个位置处的一个或多个附加氨基酸取代。此类氨基酸取代可以是保守性的或非保守性的氨基酸取代。例如，在某些实施方案中，在改变的IgG2 CH2区中P233可以改变为E233(参见，例如美国专利申请公开号2013/0129723的SEQ ID NO:326，所述序列通过引用并入本文)。另外或可替代地，在某些实施方案中，改变的CH2区可以含有一个或多个氨基酸插入、缺失或两者。一个或多个插入、一个或多个缺失或一个或多个取代可以在免疫球蛋白CH2区中的任何位置，诸如在野生型免疫球蛋白CH2区的N端或C端，这是通过经由铰链将CH2区与另一个区(例如，结合结构域或免疫球蛋白异二聚化结构域)联接而产生的。
在某些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质的改变的CH2结构域是这样的人IgG1 CH2结构域，该人IgG1 CH2结构域具有位于位置235、318、320和322处的丙氨酸取代(即，具有L235A、E318A、K320A和K322A取代的人IgG1 CH2结构域)(美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:595，所述序列通过引用并入本文)，和任选的N297突变(例如，突变为丙氨酸)。在某些其它实施方案中，改变的CH2结构域是这样的人IgG1 CH2结构域，该IgG1 CH2结构域具有位于位置234、235、237、318、320和322处的丙氨酸取代(即，具有L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A取代的人IgG1 CH2结构域)(美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:596，所述序列通过引用并入本文)，和任选的N297突变(例如，突变为丙氨酸)。
在一些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质的免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代L234A、L235A、G237A和K322A的人IgG1 CH2结构域。
可形成本文所述的多肽或蛋白质的免疫球蛋白恒定区的CH3结构域可以是来自各种物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的某些免疫球蛋白类别或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM)的野生型免疫球蛋白CH3结构域或其改变的免疫球蛋白CH3结构域。在某些实施方案中，本文所述的多肽的CH3结构域是野生型人免疫球蛋白CH3结构域，诸如分别如美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:116、208-210、204-207和212(所述序列通过引用并入本文)中所示的人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的野生型CH3结构域。在某些实施方案中，所述CH3结构域是如美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:116(所述序列通过引用并入本文)中所示的野生型人IgG1 CH3结构域。
在某些实施方案中，本文所述的多肽的CH3结构域是改变的人免疫球蛋白CH3结构域，诸如基于或源自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体的野生型CH3结构域的改变的CH3结构域。例如，改变的CH3结构域可以是具有位于位置H433和N434处的一个或两个突变的人IgG1 CH3结构域(位置根据EU编号进行编号)。位于此类位置中的突变可参与补体固定。在某些其它实施方案中，本文所述的多肽的改变的CH3结构域可以是人IgG1 CH3结构域，但该结构域具有位于位置F405或Y407处的一个或两个氨基酸取代。位于此类位置处的氨基酸参与与另一个CH3结构域的相互作用。在某些实施方案中，本文所述的多肽的改变的CH3结构域可以是其中的最后一个赖氨酸缺失的改变的人IgG1 CH3结构域。这种改变的CH3结构域的序列如美国专利申请公开号2013/0129723的SEQ ID NO:761(所述序列通过引用并入本文)中所示。
在某些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质包含CH3结构域，该结构域包含所谓的“旋钮入孔(knobs-into-hole)”突变(参见，Marvin和Zhu,Acta Pharmacologica Sinica26:649-58,2005；Ridgway等人,Protein Engineering 9:617-21,1966)。更具体地，可以将突变引入到每条多肽链的CH3结构域中的每个CH3结构域中，以使得CH3/CH3缔合所需的空间互补性使这两个CH3结构域相互配对。例如，多肽异二聚体的一个单链多肽中的CH3结构域可以含有T366W突变(“旋钮”突变，该突变用较大的氨基酸取代小的氨基酸)，而该多肽异二聚体的另一个单链多肽中的CH3结构域可以含有Y407A突变(“孔”突变，该突变用较小的氨基酸取代大的氨基酸)。其它示例性的旋钮入孔突变包括：(1)位于一个CH3结构域中的T366Y突变和位于另一个CH3结构域中的Y407T，和(2)位于一个CH3结构域中的T366W突变和位于另一个CH3结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。
可形成本文所述的多肽或蛋白质的免疫球蛋白恒定区的CH4结构域可以是来自IgE或IgM分子的野生型免疫球蛋白CH4结构域或其改变的免疫球蛋白CH4结构域。在某些实施方案中，本文所述的多肽的CH4结构域是野生型人免疫球蛋白CH4结构域，诸如分别如美国专利申请公开号2013/0129723的SEQ ID NO:213和214(所述序列通过引用并入本文)中所示的人IgE或IgM分子的野生型CH4结构域。在某些实施方案中，本文所述的多肽的CH4结构域是改变的人免疫球蛋白CH4结构域，诸如基于或源自人IgE或IgM分子的CH4结构域的改变的CH4结构域，该结构域具有增加或减少已知与IgE或IgM Fc区相关的免疫学活性的突变。
在某些实施方案中，本文所述的多肽或蛋白质的免疫球蛋白恒定区包含CH2、CH3或CH4结构域的组合(即，多于一个选自CH2、CH3和CH4的恒定区结构域)。例如，该免疫球蛋白恒定区可以包含CH2和CH3结构域或CH3和CH4结构域。在某些其它实施方案中，该免疫球蛋白恒定区可以包含两个CH3结构域并且不包含CH2或CH4结构域(即，只有两个或更多个CH3)。形成本文所述的多肽的免疫球蛋白恒定区的多个恒定区结构域可以基于或源自相同的免疫球蛋白分子，或相同类别或亚类的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定区是IgG CH2-CH3(例如，IgG1 CH2-CH3、IgG2 CH2-CH3和IgG4 CH2-CH3)并且可以是人(例如，人IgG1、IgG2和IgG4)CH2CH3。例如，在某些实施方案中，本文所述的多肽的免疫球蛋白恒定区包含(1)野生型人IgG1 CH2和CH3结构域，(2)具有N297A取代的人IgG1CH2(即，CH2(N297A))和野生型人IgG1 CH3，或(3)IgG1 CH2(N297A)和其中最后一个赖氨酸缺失的改变的人IgG1 CH3。可替代地，本文所述的多肽或蛋白质的多个恒定区结构域可以基于或源自不同的免疫球蛋白分子，或不同类别或亚类的免疫球蛋白分子。例如，在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定区包含人IgM CH3结构域和人IgG1 CH3结构域。形成本文所述的多肽的免疫球蛋白恒定区的多个恒定区结构域可以直接联接在一起或者可以经由一个或多个(例如，约2-10个)氨基酸彼此联接。
可用于本文所述的多肽或蛋白质中的示例性免疫球蛋白恒定区在美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:305-309、321、323、341、342和762中示出(所述序列通过引用并入本文)。下表中提供了可用于本文所述的多肽或蛋白质中的进一步的示例性免疫球蛋白恒定区。
表1：示例性免疫球蛋白恒定区
Figure BDA0003840537750000511
Figure BDA0003840537750000521
在某些实施方案中，本文所述的同型二聚体或异二聚体蛋白质的每条多肽链的免疫球蛋白恒定区彼此是同一的。在某些其它实施方案中，异二聚体蛋白质的一条多肽链的免疫球蛋白恒定区不同于该异二聚体的另一条多肽链的免疫球蛋白恒定区。例如，异二聚体蛋白质的一个免疫球蛋白恒定区可以含有具有“旋钮”突变的CH3结构域，而异二聚体蛋白质的另一个免疫球蛋白恒定区可以含有具有“孔”突变的CH3结构域。
Fc结合结构域接头
在一些实施方案中，该多肽可以进一步包含Fc结合结构域接头。在一些实施方案中，该Fc结合结构域接头可用于将免疫球蛋白恒定区联接至C端结合结构域(例如，CD3结合结构域)。在一些实施方案中，该Fc结合结构域接头可被用作铰链结构域并且/或者可被并入scFv中。在一些实施方案中，该Fc结合结构域接头是Gly4Ser接头(SEQ ID NO:128)。在一些实施方案中，该Fc结合结构域接头是由Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:128)氨基酸序列((Gly4Ser)4)(SEQ ID NO:61)的四个重复组成的20聚体。在一些实施方案中，该Fc结合结构域接头包含选自SEQ ID NO 50-70中任一个的氨基酸序列。已经使用其它接头，并且已经使用噬菌体展示技术以及选择性感染性噬菌体技术来多样化和选择适当的接头序列(Tang等人,J.Biol.Chem.271,15682-15686,1996；Hennecke等人,Protein Eng.11,405-410,1998)。在某些实施方案中，VL和VH区被具有包含式(Gly4Ser)n的氨基酸序列的肽接头联结，其中n＝1-5(SEQ ID NO:129)。其它合适的接头可以通过经随机诱变优化简单的接头来获得。在一些实施方案中，双特异性分子不包含铰链区或恒定区。
在某些实施方案中，Fc结合结构域接头是包含甘氨酸-丝氨酸(例如，Gly4Ser，SEQID NO:128)重复序列的柔性接头序列。在某些实施方案中，接头包含三个Gly4Ser重复序列(SEQ ID NO:59)，该重复序列之后是脯氨酸残基。在某些实施方案中，脯氨酸残基之后是选自由甘氨酸、精氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，Fc结合结构域接头包含选自SEQ ID NO:50-70的序列或由该序列组成。
适合于根据本公开使用的一些示例性铰链、Fc结合结构域接头序列示于表2中。另外的示例性铰链和接头区域在U.S.2013/0129723的SEQ ID NO:241-244、601、78、763-791、228、379-434、618-749中示出(所述序列通过引用并入本文)。
表2：示例性铰链和接头
Figure BDA0003840537750000531
Figure BDA0003840537750000541
除了前述结构域以外，治疗性多肽还可进一步包含免疫球蛋白二聚化/异二聚化结构域、接合氨基酸(junctional amino acid)、标签、附加结合结构域等。在一些实施方案中，本文所述的多肽和蛋白质与药物或毒性部分缀合。
双特异性/多特异性蛋白
在一些实施方案中，治疗性蛋白可以是双特异性或多特异性蛋白。双特异性分子的非限制性实例包括scFv-Fc-scFv分子、scFv-Ig分子和scFv-scFv分子。在一些实施方案中，本文所述的双特异性分子包含与第二结合结构域scFv联接的第一结合结构域scFv或由与第二结合结构域scFv联接的第一结合结构域scFv组成，并且不包括其它序列，诸如免疫球蛋白恒定区。在一些实施方案中，治疗性蛋白可以是双特异性或多特异性蛋白，其从氨基端到羧基端，或按照从羧基端到氨基端的顺序包含(i)第一结合结构域，(ii)铰链区，(iii)免疫球蛋白恒定区，(iv)(任选地)Fc结合结构域接头，和(v)第二结合结构域。
在一些实施方案中，多特异性蛋白可以从N端到C端包含CD3结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和肿瘤抗原结合结构域。该肿瘤抗原结合结构域可以与例如CD123、PSMA、CD19、CD33、5T4或HER2结合。
在一些实施方案中，多特异性蛋白可以从N端到C端包含肿瘤抗原结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和CD3结合结构域。该肿瘤抗原结合结构域可以与例如CD123、PSMA、CD19、CD33、5T4或HER2结合。
在一些实施方案中，多特异性蛋白可以从N端到C端包含4-1-BB结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和肿瘤抗原结合结构域。该肿瘤抗原结合结构域可以与例如CD123、PSMA、CD19、CD33、5T4或HER2结合。
在一些实施方案中，多特异性蛋白可以从N端到C端包含肿瘤抗原结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和4-1-BB结合结构域。该肿瘤抗原结合结构域可以与例如CD123、PSMA、CD19、CD33、5T4或HER2结合。
同型二聚体/异二聚体
在一些实施方案中，治疗性蛋白可以是同型二聚体或异二聚体。在一些实施方案中，治疗性蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序，或按照从羧基端到氨基端的顺序包含(i)第一结合结构域，(ii)铰链区，和(iii)免疫球蛋白恒定区，(iv)(任选地)Fc结合结构域接头，和(v)第二结合结构域。在一些实施方案中，双特异性或多特异性蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序，或按照从羧基端到氨基端的顺序包含：(i)第一结合结构域，(ii)铰链区，(iii)免疫球蛋白恒定区，(iv)(任选地)Fc结合结构域接头，和(v)第二结合结构域。在其它实施方案中，本文所述的双特异性蛋白是双抗体。
在某些实施方案中，存在于与另一多肽链形成异二聚体的多肽中的铰链可以是免疫球蛋白铰链，诸如野生型免疫球蛋白铰链区或其改变的免疫球蛋白铰链区。在某些实施方案中，异二聚体蛋白的一条多肽链的铰链与该异二聚体的另一条多肽链的相应铰链是同一的。在某些其它实施方案中，一条链的铰链不同于另一条链的铰链(不同之处在于它们的长度或序列上)。不同链中的不同铰链允许对铰链所连接的结合结构域的结合亲和力进行不同的操纵，使得异二聚体与一个结合结构域的靶标的结合能够相较于与另一结合结构域的靶标的结合优先地发生。
在其它实施方案中，本文所述的多肽和蛋白质包括能够与第二不同一的多肽链中的不同异二聚化结构域进行异二聚化的异二聚化结构域。在某些变型中，用于异二聚化的第二多肽链包括第二结合结构域。因此，在本公开的某些实施方案中，两条不同一的多肽链(一条包含含有第一结合结构域的多肽，而第二条任选地包含第二结合结构域)二聚化从而形成异二聚体结合蛋白。二聚化/异二聚化结构域可以在期望由两条不同一的多肽链(其中一条或两条多肽链包含结合结构域)形成异二聚体的情况下使用。在某些实施方案中，本文所述的某些异二聚体的一个多肽链成员不含结合结构域。异二聚体的类型的实例包括美国专利申请公布号2013/0095097和2013/0129723以及国际PCT公布号WO 2016/094873中描述的那些。
在某些实施方案中，第一和第二多肽链经由“免疫球蛋白二聚化结构域”或“免疫球蛋白异二聚化结构域”的纳入而二聚化。“免疫球蛋白二聚化结构域”或“免疫球蛋白异二聚化结构域”是指第一多肽链中优先与第二多肽链的不同免疫球蛋白结构域相互作用或缔合的免疫球蛋白结构域，其中不同免疫球蛋白结构域的相互作用实质上促使或有效促进第一和第二多肽链的异二聚化(即，在两条不同的多肽链之间形成二聚体，其也称为“异二聚体”)。异二聚体的多肽链中的免疫球蛋白异二聚化结构域彼此不同，并且因此可以被差异性地修饰以促进这两条链的异二聚化并最小化任一条链的同型二聚化。本文提供的免疫球蛋白异二聚化结构域允许不同多肽之间的有效异二聚化并且促进所得异二聚体蛋白的纯化。
如本文所提供，根据本公开可用于促进两条不同多肽链的异二聚化的免疫球蛋白异二聚化结构域包括野生型和改变的免疫球蛋白CH1和CL结构域，例如人CH1和CL结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白异二聚化结构域是野生型CH1结构域，诸如，例如分别如美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:114、186-192和194或美国专利申请公布号2013/0129723的SEQ ID NO:114(所述序列通过引用并入本文)中所示的野生型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM CH1结构域。在进一步的实施方案中，参与与野生型免疫球蛋白CL结构域(例如，人CL)形成二硫键的野生型CH1结构域(例如，人CH1)的半胱氨酸残基在改变的免疫球蛋白CH1结构域中缺失或被取代，使得在改变的CH1结构域与野生型CL结构域之间不形成二硫键。
本文所述的多肽和蛋白质可以使用如美国专利申请公开号2013/0129723和2013/0095097中一般地公开的支架来制备，该专利申请各自通过引用整体并入本文。本文所述的多肽可包含两条不同一的多肽链，每条多肽链均包含免疫球蛋白异二聚化结构域。界面免疫球蛋白异二聚化结构域是不同的。在一个实施方案中，免疫球蛋白异二聚化结构域包含CH1结构域或其衍生物。在另一个实施方案中，免疫球蛋白异二聚化结构域包含CL结构域或其衍生物。在一个实施方案中，CL结构域是Cκ或Cλ同种型或其衍生物。
示例性的蛋白质治疗剂：抗CD123x抗CD3多肽及其二聚体
示例性的蛋白质治疗剂可以结合表达CD123的细胞和T细胞上的T细胞受体复合物，从而诱导靶标依赖性T细胞细胞毒性、激活和增殖。
因此，在某些实施方案中，与本文所述的方法和组合物结合使用的治疗性蛋白是包含CD123结合结构域和CD3结合结构域的双特异性单链分子。在一些实施方案中，CD123和/或CD3结合结构域源自抗体并且包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)。例如，CD123和/或CD3结合结构域可以是包含VH和VL的scFv。这些结合结构域和可变链可以任何顺序排列，但仍保留与一个或多个靶标的一些结合。例如，可变结构域可以按诸如以下的顺序排列(VHCD123)-(VL CD123)-(VH CD3)-(VL CD3)；(VL CD123)-(VH CD123)-(VH CD3)-(VL CD3)；(VH CD123)-(VL CD123)-(VL CD3)-(VH CD3)；(VL CD123)-(VH CD123)-(VL CD3)-(VHCD3)；(VH CD3)-(VL CD3)-(VH CD123)-(VL CD123)；(VL CD3)-(VH CD3)-(VL CD123)-(VHCD123)；(VH CD3)-(VL CD3)-(VL CD123)-(VH CD123)；或(VL CD3)-(VH CD3)-(VHCD123)-(VL CD123)。结合至CD3的结合结构域中的VH区和VL区对可以是单链抗体(scFv)的型式。VH和VL区可以按照VH-VL或VL-VH的顺序排列。在一些实施方案中，scFv可以比包含处于相同取向的相同VH和VL区序列的抗体更有效地结合至CD123。在某些实施方案中，scFv可以在VL-VH取向上比在VH-VL方向上更有效地与CD123结合，反之亦然。VH-区可以被定位于接头序列的N端。VL区可以被定位于接头序列的C端。双特异性单链分子的CD3结合结构域中的结构域排列可以是VH-VL，其中CD3结合结构域位于CD123结合结构域的C端。双特异性分子可以包含与结合至CD3的scFv联接的结合至CD123的scFv。这些scFv可以与短肽联接。在一些实施方案中，双特异性单链分子不包含铰链区或恒定区(参见，例如，US 2013/0295121、WO 2010/037836、WO 2004/106381和WO 2011/121110；该文献各自通过引用整体并入本文)。
CD123双特异性结合构建体可以包含表3、表4和/或表5中所示的一个或多个序列。
表3：结合多肽序列和组分
Figure BDA0003840537750000591
Figure BDA0003840537750000601
Figure BDA0003840537750000611
Figure BDA0003840537750000621
Figure BDA0003840537750000631
Figure BDA0003840537750000641
Figure BDA0003840537750000651
Figure BDA0003840537750000661
Figure BDA0003840537750000671
Figure BDA0003840537750000681
表4：人源化构建体的组成
构建体ID scFv取向 核苷酸SEQ ID NO 氨基酸SEQ ID NO
TRI129 VHVL 309 310
TRI130 VLVH 311 312
表5：示例性结合蛋白构建体的氨基酸序列
Figure BDA0003840537750000682
Figure BDA0003840537750000691
在某些实施方案中，CD123结合结构域包含：(i)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含CDR即LCDR1、LCDR2和LCDR3；和(ii)免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含CDR即HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含如SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ IDNO:146所示的氨基酸序列，且HCDR3包含如SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，CD123结合结构域包含(i)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含CDR即LCDR1、LCDR2和LCDR3；和(ii)免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含CDR即HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些此类实施方案中，(i)LCDR1具有SEQ ID NO:138中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:138的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；(ii)LCDR2具有SEQ ID NO:140中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:140的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；(iii)LCDR3具有SEQID NO:142中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:142的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；(iv)HCDR1具有SEQ ID NO:144中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:144的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；(v)HCDR2具有SEQ ID NO:146中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:146的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；以及(vi)HCDR3具有SEQ IDNO:148中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:148的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列。上述氨基酸取代可以是保守性的或非保守性的氨基酸取代。在一些实施方案中，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3与列举的序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸不同。在某些实施方案中，当与已知单克隆抗体的CDR序列相比较时，本公开的CDR含有约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代)，或上述变化的组合。例如，本公开包括一种重组多肽，该重组多肽包含：(i)LCDR1，其具有SEQ ID NO:138中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:138的不同之处在于一个或两个氨基酸取代的序列；(ii)LCDR2，其具有SEQ ID NO:140中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:140的不同之处在于一个或两个氨基酸取代的序列；(iii)LCDR3，其具有SEQ ID NO:142中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:142的不同之处在于一个或两个氨基酸取代的序列；(iv)HCDR1，其具有SEQ ID NO:144中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:144的不同之处在于一个或两个氨基酸取代的序列；(v)HCDR2，其具有SEQ IDNO:146中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:146的不同之处在于一个或两个氨基酸取代的序列；和(vi)HCDR3，其具有SEQ ID NO:148中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:148的不同之处在于一个或两个氨基酸取代的序列。上述氨基酸取代可以是保守性的或非保守性的氨基酸取代。
在相关实施方案中，本公开的重组多肽包含或者是与轻链可变区(VL)的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:134)或与重链可变区(VH)(例如，SEQ ID NO:136)或两者有至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，该重组多肽的CD123结合结构域是scFv，其包含处于VHVL取向的包含SEQ ID NO:136的可变重链和包含SEQ ID NO:134的可变轻链。在一个实施方案中，该重组多肽的CD123结合结构域是scFv，其包含处于VLVH取向的包含SEQ ID NO:134的可变轻链和包含SEQ ID NO:136的可变重链。例如，在某些实施方案中，本公开的多肽包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列。本公开包括与SEQ ID NO:337的氨基酸序列有至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％同一性的重组多肽。
在某些实施方案中，CD123结合结构域包含(i)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含CDR即LCDR1、LCDR2和LCDR3；和(ii)免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含CDR即HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些此类实施方案中，(i)LCDR1具有SEQ ID NO:154中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:154的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；(ii)LCDR2具有SEQ IDNO:156中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:156的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；(iii)LCDR3具有SEQ ID NO:158中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:158的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；(iv)HCDR1具有SEQ ID NO:160中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:160的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；(v)HCDR2具有SEQ ID NO:162中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:162的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列；和(vi)HCDR3具有SEQ ID NO:164中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:164的不同之处在于至少一个氨基酸取代的序列。上述氨基酸取代可以是保守性的或非保守性的氨基酸取代。在一些实施方案中，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3与列举的序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸不同。在某些实施方案中，当与已知单克隆抗体的CDR序列相比较时，本公开的CDR含有约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、约一个或多个(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代)，或上述变化的组合。
在相关实施方案中，CD123结合结构域包含或者是与轻链可变区(VL)的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:17)或与重链可变区(VH)(例如，SEQ ID NO:16)或两者有至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％同一性的序列。
在某些实施方案中，CD123结合结构域包含人源化免疫球蛋白VL和/或VH区。用于对免疫球蛋白VL和VH区进行人源化的技术是本领域已知的并且例如在美国专利申请公开号2006/0153837中有讨论。在某些实施方案中，CD123结合结构域包含人免疫球蛋白VL和/或VH区。
本质上，通过CDR移植进行的人源化涉及仅将非人抗体的CDR重组到人可变区框架和人恒定区上。从理论上讲，这应该会实质上降低或消除免疫原性(除非存在同种异型或独特型差异)。然而，已经报道，原始抗体的一些框架残基也可能需要保留(Reichmann等人,Nature,332:323(1988)；Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10,029(1989))。
需要保留的框架残基可以通过计算机建模进行鉴定。可替代地，可以通过比较已知的抗原结合位点结构潜在地鉴定关键框架残基(Padlan,Molec.Immunol.,31(3):169-217(1994)，该文献通过引用并入本文)。
潜在地影响抗原结合的残基分为几组。第一组包含与抗原位点表面邻近的残基，因此可以与抗原直接接触。这些残基包括氨基端残基和与CDR相邻的残基。第二组包括可以通过接触CDR或抗体中的另一肽链来改变CDR的结构或相对比对的残基。第三组包含具有可影响可变结构域的结构完整性的隐藏侧链的氨基酸。这些组中的残基通常被发现在相同的位置(Padlan,1994,同上)，但是所鉴定出的它们的位置可因编号系统而异(参见Kabat等人,"Sequences of proteins of immunological interest，第5版，出版期号91-3242,U.S.Dept.Health&Human Services,NIH,Bethesda,Md.,1991)。
本领域关于人源化抗体的知识适用于根据本公开的多肽，即使这些多肽不是抗体。
在一些实施方案中，抗CD123 scFv包含：包含SEQ ID NO:10的HCDR1、包含SEQ IDNO:11的HCDR2和包含SEQ ID NO:12的HDCR3；以及包含SEQ ID NO:13的LCDR1、包含SEQ IDNO:14的LCDR2和包含SEQ ID NO:15的LCDR3。在一些实施方案中，抗CD123 scFv包含VH和VL，该VH包含与SEQ ID NO:136具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:134具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，抗CD123 scFv包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:16有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，抗CD123 scFv包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:17有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原结合结构域是抗CD123scFv，并且其中所述scFv包含与SEQ ID NO:18具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开涉及CD123结合结构域，其中(i)免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列有至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且免疫球蛋白重链可变区包含与SEQID NO:136所示的氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，每个CDR与来自与目标靶标(例如，CD123)特异性地结合的单克隆抗体或其片段或衍生物的CDR相比包含不超过一个、两个或三个取代、插入或缺失。
在某些实施方案中，CD123结合结构域不抑制IL-3与CD123的结合。
在某些实施方案中，CD123结合分子或蛋白可以包含用于将T细胞募集到表达CD123的靶细胞的T细胞结合结构域。在某些实施方案中，如本文所述的CD123结合蛋白可包含(i)特异性地结合TCR复合物或其组分(例如，TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和CD3ε)的结合结构域和(ii)与CD123特异性地结合的另一结合结构域。CD123结合蛋白可以利用基本上任何结合T细胞的结合结构域，例如抗体来源的结合结构域。CD3结合结构域可以源自的示例性抗CD3抗体包括CRI S-7单克隆抗体(Reinherz,E.L.等人(编辑),Leukocyte typingII.,Springer Verlag,New York,(1986)；VL和VH氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:341(QVVLTQSPAIMSAFPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSRNPPTFGGGTKLQITR)和SEQ ID NO:342(QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRSTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSA))；HuM291(Chau等人(2001)Transplantation 71:941-950；VL和VH氨基酸序列分别示于SEQ IDNO:343(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIK)和SEQ ID NO:344(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGQGTLVTVSS))；BC3单克隆抗体(Anasetti等人(1990)J.Exp.Med.172:1691)；OKT3单克隆抗体(Ortho multicenter Tran splant Study Group(1985)N.Engl.J.Med.313:337)及其衍生物诸如OKT3 ala-ala(也称为OKT3 AA-FL或OKT3FL)，即一种具有位于位置234和235处的丙氨酸取代的人源化Fc变体(Herold等人(2003)J.Clin.Invest.11:409)；维西珠单抗(visilizumab)(Carpenter等人(2002)Blood 99:2712)、G19-4单克隆抗体(Ledbetter等人,1986,J.Immunol.136:3945)、145-2C11单克隆抗体(Hirsch等人(1988)J.Immunol.140:3766)和I2C单克隆抗体(参见，例如，US 2011/0293619和US20120244162)。例如，CD3结合结构域可包含美国专利申请公布号2012/0244162中公开的CD3结合结构域，包括包含选自US 2012/0244162的SEQ ID NO:17、21、35、39、53、57、71、75、89、83、107、111、125、129、143、147、161、165、179和183的VL区和/或选自US 2012/0244162的SEQ ID NO:15、19、33、37、51、55、69、73、87、91.105、109、123、127、141、145、159、163、177和181的VH区的CD3结合结构域。在一些实施方案中，CD3结合结构域包含选自US 2012/0244162的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185和187的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD3结合结构域是WO2004/106380、WO2005/040220A1、US 2014/0099318中描述的或源自它们的CD3结合结构域的CD3结合结构域。示例性的抗TCR抗体是BMA031单克隆抗体(Borst等人(1990)HumanImmunology 29:175-188)。CD3结合结构域可源自WO 2013/158856(通过引用整体并入本文)中描述的任何抗体或序列。
在一些实施方案中，本文所述的CD123结合多肽的第二结合结构域包含：(i)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白轻链可变区，和(ii)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白重链可变区，其中(a)LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:348、349和350所示的氨基酸序列，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:345、346和347所示的氨基酸序列；或(b)LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355和SEQ ID NO:356所示的氨基酸序列，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352和SEQ ID NO:353所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的CD123结合多肽的第二结合结构域包含：(i)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白轻链可变区，和(ii)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白重链可变区，其中(a)LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQID NO:182、183和184所示的氨基酸序列，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:351、352和353所示的氨基酸序列，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:357、359和359所示的氨基酸序列；或(b)LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:359、367和368所示的氨基酸序列，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:363、364和365所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的CD123结合多肽的第二结合结构域包含：(i)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白轻链可变区，和(ii)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白重链可变区，其中(a)LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:372、373和374所示的氨基酸序列；或(b)LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:378、379和380所示的氨基酸序列，并且HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:375、376和377所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含本段所叙述的CDR序列的第二结合结构域是人源化的。
在包含特异性地结合CD3ε的第二结合结构域的CD123结合蛋白的一些实施方案中，该第二结合结构域与CRIS-7、HuM291或I2C单克隆抗体竞争与CD3ε结合。在一些实施方案中，该CD3结合结构域包含源自CRIS-7、HuM291或I2C单克隆抗体的免疫球蛋白轻链可变区(VL)和免疫球蛋白重链可变区(VH)(例如，第二结合结构域的VL和VH可以是分别包含单克隆抗体的轻链CDR和重链CDR的人源化可变区)。第二结合结构域可包含DRA222、TSC455或TSC456 CD3结合结构域的轻链可变区、重链可变区或两者。DRA222、TSC455和TSC456的氨基酸序列提供在表4中。DRA222结合结构域也在WO 2013/158856中有描述。TSC455也可以称为TSC394 F87Y。TSC455也可以称为TSC394 E86D F87Y或TSC394 DY。
在一些实施方案中，第二结合结构域特异性地结合CD3并且包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区；其中该免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:384中的氨基酸序列有至少约93％同一性、至少约95％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性；或与SEQ ID NO:385中的氨基酸序列有至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的氨基酸序列；并且其中该免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:383中的氨基酸序列有至少约82％同一性、至少约85％同一性、至少约87％同一性、至少约90％同一性、至少约92％同一性、至少约95％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二结合结构域是CD3结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO:19的HCDR1、包含SEQ ID NO:20的HCDR2和包含SEQ ID NO:21的HDCR3；以及包含SEQ ID NO:22的LCDR1、包含SEQ ID NO:23的LCDR2和包含SEQ ID NO:24的LCDR3。在一些实施方案中，CD3结合结构域是包含VH和VL的抗CD3 scFv，该VH包含与SEQ ID NO:383或387具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:384具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，CD3结合结构域包含VH，该VH包含与SEQ IDNO:25具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，CD3结合结构域包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:26具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，CD3结合结构域是包含与SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列的抗CD3 scFv。
在一些实施方案中，进一步包含CD3结合结构域的CD123结合多肽或蛋白质可具有在多肽或蛋白质重组表达期间产生的低水平的高分子量聚集体。进一步包含CD3结合结构域的CD123结合多肽或蛋白质可在人血清中表现出相对长的稳定性，这取决于多肽或蛋白质中存在的CD3结合结构域。
在某些变型中，CD3结合结构域包含US 2013/0129730、US 2011/0293619、US 7,635,472、WO 2010/037836、WO 2004/106381或WO 2011/121110中公开的CD3结合序列(例如，CDR或可变区)中的一种或多种；该文献各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，CD3结合结构域包含表6所示的序列中的一个或多个序列。
表6：示例性的CD3结合结构域轻链CDR
Figure BDA0003840537750000771
在各种实施方案中，CD3结合结构域包含表7所示的序列中的一个或多个序列。
表7：示例性的CD3结合结构域重链CDR
Figure BDA0003840537750000781
在一些实施方案中，治疗性蛋白按照从氨基端到羧基端的顺序包含第一结合结构域、铰链区、免疫球蛋白恒定区和第二结合结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，第一结合结构域包含：免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:10，HCDR2包含SEQ ID NO:11，并且HDCR3包含SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:13，LCDR2包含SEQ ID NO:14，并且LCDR3包含SEQ IDNO:15。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:10，HCDR2包含SEQ ID NO:11，并且HDCR3包含SEQ ID NO:12；并且LCDR1包含SEQ ID NO:13，LCDR2包含SEQ ID NO:14，并且LCDR3包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，第一结合结构域包含与SEQ ID NO:18具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，第二结合结构域包含：免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3；和(ii)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:19，HCDR2包含SEQ ID NO:20，并且HDCR3包含SEQ ID NO:21。在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:22，LCDR2包含SEQ ID NO:23，并且LCDR3包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:19，HCDR2包含SEQ ID NO:20，并且HDCR3包含SEQ ID NO:21；并且LCDR1包含SEQ ID NO:22，LCDR2包含SEQID NO:23，并且LCDR3包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，第二结合结构域包含与SEQID NO:27具有至少95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，治疗性蛋白包含SEQ IDNO:31的序列。
与替代结构型式的多特异性抗CD123和抗CD3分子相比，本文公开的多特异性抗CD123和抗CD3分子的结构型式诱导了强效的肿瘤细胞溶解，但减少了细胞因子释放。不受任何理论束缚，与其它T细胞接合剂相比，本文公开的多肽结构型式(例如，按照从氨基端到羧基端的顺序)：(a)第一结合结构域(该结构域是CD123结合结构域)；(b)铰链区；(c)免疫球蛋白恒定区；(d)第二结合结构域(该结构域是特异性地结合T细胞、CD3、CD3ε或T细胞受体(TCR)复合物的人或人源化结合结构域)诱导中等水平的T细胞受体(TCR)刺激。已广泛证明TCR信号的强度或幅度调节T细胞激活的结果。TCR刺激触发了许多细胞事件，该细胞事件包括效应子功能的启动(例如，溶细胞颗粒酶)，以及细胞因子分泌和细胞分裂(Corse,Gottschalk和Allison.J Immunol 2011,186:5039-5045)。这些不同的细胞事件可以以不同的动力学进行并达到可变的最大水平，这取决于TCR刺激的强度和另外的因素。本文公开的多特异性结构型式足够强效从而能够在多日内引起肿瘤细胞裂解并诱导多轮T细胞分裂，但足够温和从而能够限制细胞因子分泌的量。
在一些实施方案中，与OKT3抗体对照相比，当与T细胞上的CD3蛋白结合时，包含CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性多肽诱导来自所述T细胞的细胞因子释放减少。在一些实施方案中，与包含源自OKT3或I2C的CD3结合结构域的多特异性多肽相比，包含CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性多肽诱导来自所述T细胞的细胞因子释放减少。在一些实施方案中，与呈双特异性T细胞接合剂(scFv-scFv)型式或双重亲和力重新靶向型式的包含CD123结合结构域和I2C来源的CD3结合结构域的双特异性多肽相比，包含CD123结合结构域(例如，包含与SEQ ID NO:312和/或SEQ ID NO:337具有至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CD123结合结构域)和CD3结合结构域并且呈scFv-Fc-scFv型式的多特异性多肽诱导非人灵长类或人中的细胞因子释放减少。
本文还提供了包含本文所述的治疗性蛋白的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含1-20mg/m、2.5-12mg/ml或5-10mg/ml的治疗性蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含约2.5mg/ml至约12mg/ml，或约5mg/ml至约10mg/ml的治疗性蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12mg/ml的治疗性蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含约5mg/ml的治疗性蛋白。
使用方法
本公开提供了用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向该受试者施用治疗有效量的本公开的至少一种组合物。
在一些实施方案中，该疾病或病症可以是癌症。癌症可以例如选自急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、毛细胞白血病(HCL)、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和慢性髓性白血病(CML)。
在一些实施方案中，该疾病或病症可以是炎性疾病或病症。在实施方案中，该炎性疾病或病症可以是自身免疫疾病或病症。在一些实施方案中，该自身免疫疾病或病症选自肠易激综合征、炎症性肠病(例如，克罗恩病(Crohn’s disease)或溃疡性结肠炎)、银屑病、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身性红斑狼疮、哮喘、多发性硬化、皮肌炎、多发性肌炎、恶性贫血、原发性胆汁性肝硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、爱迪生氏病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(aPL)、自身免疫性肝炎、1型糖尿病、Goodpasture综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本病(Hashimoto'sdisease)、特发性血小板减少性紫癜、寻常型天疱疮、肖格伦综合征、颞动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、脉管炎、乳糜泻、子宫内膜异位、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、硬斑病、硬皮病、嗜睡症、神经性肌强直、白癜风、自身免疫性内耳病和重症肌无力。在一些实施方案中，炎性疾病或病症是银屑病。
在一些实施方案中，炎性疾病或病症可以是“神经免疫疾病”，诸如神经性疼痛、骨关节炎、帕金森病(Parkinson’s disease)、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病(Huntington’sdisease)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)。
在一些实施方案中，炎性疾病或病症可以是移植相关的不良事件，即移植排斥、同种异体移植疾病或移植物抗宿主疾病。
在一些实施方案中，对于本文所述的治疗方法和用途，本文所述的蛋白质或多肽以与和寻求治疗的疾病或病症的管理相关的常规方法一致的方式递送。根据本文的公开内容，在足以防止或治疗疾病或病症的条件下，将治疗有效量的蛋白质或多肽施用给需要此类治疗的受试者一段时间。
用于施用本公开的蛋白质的受试者包括处于罹患特定病症的高风险的患者以及呈现出现有的此种病症的患者。通常，受试者已被诊断为患有寻求治疗的病症。进一步地，可以在治疗过程中监测受试者的病症的任何变化(例如，病症的临床症状的增加或减少)。同样，在一些变型中，受试者未患需要治疗的另一种病症。
在预防性应用中，将包含本公开的蛋白质的药物组合物或药物以足以消除或降低特定病症风险或延迟特定病症发作的量施用于易患该病症或以其他方式处于该病症的风险中的患者。在治疗性应用中，将包含本公开的蛋白质的组合物或药物以足以治愈或至少部分遏制病症及其并发症的症状的量施用于疑似或已经患有此类病症的患者。将足够实现这一目标的量称为治疗有效剂量或治疗有效量。在预防和治疗方案中，剂通常以几个剂量施用，直至已获得足够的反应(例如，对不适当的血管生成活性的抑制)。通常，监测反应并且如果所需的反应开始变弱，则给予重复剂量。
为了鉴定根据本公开的方法治疗的主题患者，可采用接受的筛查方法来确定与特定病症相关的风险因素，或确定在受试者中鉴定的现有病症的状态。此类方法可以包括，例如，确定个体是否有被已经诊断患有特定病症的亲属。筛查方法还可以包括例如常规诊断检查(work-ups)以确定已知具有可遗传成分的特定病症的家族状态。例如，还已知各种癌症具有某些可遗传成分。癌症的可遗传成分包括，例如，正在转化的多个基因(例如，Ras、Raf、EGFR、cMet等)中的突变，某些HLA和杀伤抑制受体(KIR)分子的存在或不存在，或癌细胞能够直接或间接地调节细胞如NK细胞和T细胞的免疫阻抑的机制(参见，例如，Ljunggren和Malmberg,Nature Rev.Immunol.7:329-339,2007；Boyton和Altmann,Clin.Exp.Immunol.149:1-8,2007)。为此，可以常规采用核苷酸探针来鉴定携带与特定目标病症相关的遗传标志物的个体。另外，本领域已知有多种免疫学方法可用于鉴定特定病症的标志物。例如，各种ELISA免疫测定方法是可用的并且在本领域中是众所周知的，它们采用单克隆抗体探针来检测与特定肿瘤相关的抗原。可以根据已知的患者症状、年龄因素、相关风险因素等的指示进行筛查。这些方法允许临床医生常规选择需要本文所述的方法进行治疗的患者。
对于施用，本公开的药物组合物可以包含：(i)治疗性蛋白/多肽；和(ii)药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，该药物组合物可以包含(i)治疗性蛋白/肽，(ii)缓冲剂，(iii)赋形剂，和(iv)表面活性剂。
包含本文所述的多肽或蛋白质的药物组合物可以被调配成选自由以下组成的组的剂型：口服单位剂型、静脉内单位剂型、鼻内单位剂型、栓剂单位剂型、皮内单位剂型、肌内单位剂型、腹腔内单位剂型、皮下单位剂型、硬膜外单位剂型、舌下单位剂型和脑内单位剂型。口服单位剂型可以选自由以下组成的组：片剂、丸剂、球粒剂、胶囊、粉剂、锭剂、颗粒剂、溶液、混悬剂、乳剂、糖浆、酏剂、缓释调配物、气雾剂和喷雾剂。
可以将包含本文所述的多肽或蛋白质的药物组合物以治疗有效量施用于受试者。根据本公开的方法，本文所述的多肽或蛋白质可以通过多种施用模式向受试者施用，所述施用模式包括例如通过肌内、皮下、静脉内、心房内、关节内、肠胃外、鼻内、肺内、透皮、胸膜内、鞘内和口服施用途径。出于防止和治疗目的，拮抗剂可以以单次推注递送、经由延长的时间段的连续递送(例如，连续透皮递送)或以重复施用方案(例如，每小时、每天、每周或每月)向受试者施用。
在这种背景下，有效剂量的确定通常基于动物模型研究，随后是人临床试验，并以确定显著降低模型受试者中受试者病症的发生或严重程度的有效剂量和施用方案为指导。本公开的组合物的有效剂量根据许多不同的因素而异，这些因素包括施用方式、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物、治疗是预防性的还是治疗性的，以及组合物本身的特定活性及其在个体中引发所需反应的能力。通常，患者是人，但在一些疾病中，患者可以是非人哺乳动物。通常，调整剂量方案以提供最佳治疗反应，即优化安全性和功效。
本文还提供了本公开的组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。例如，本公开的组合物可用于治疗急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)。还提供了方法，该方法包括通过IV输注以约0.3、约1、约3、约6、约9、约12、约18、约20、约24、约30、约36、约50、约48、约60、约75或约100μg的周剂量向患者施用包含多特异性多肽的组合物，所述多特异性多肽包含CD123结合结构域和CD3结合结构域。通常，患者每周接受一次或两次治疗，持续4至6周。患者可以每周接受相同的剂量，或者可以例如每周增加剂量。
在一些实施方案中，每周增加剂量，第一剂量低于患者预期耐受的剂量。这种类型的递升治疗方案降低了患者发生输注相关反应或细胞因子释放综合征的风险。在一些实施方案中，可以将含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的(例如，TRI130或TRI129)的多特异性蛋白静脉内施用给患者，使得对于至少前两剂或前三剂每周增加剂量。例如，可以通过IV输注根据以下周治疗计划表来施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：9μg；第3周剂量：12μg；以及第4周剂量和后续周剂量：12μg。在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：9μg；第3周剂量：12μg；以及第4周剂量和后续周剂量：18μg。在一些实施方案中，根据以下周治疗计划表将组合物静脉内施用于患者：第1周剂量：6μg；及第2周和后续周剂量：9μg，而在一些实施方案中，根据以下周治疗计划表将组合物静脉内施用于患者：第1周剂量：9μg；及第2周和后续周剂量：12μg。在其它实施方案中，根据以下周治疗计划表将组合物静脉内施用于患者：第1周剂量12μg，以及第2周和后续周剂量：18μg。
在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：9μg；第3周剂量：12μg；第4周剂量和后续周剂量：12μg。在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：9μg；第3周剂量：12μg；第4周剂量和后续周剂量：18μg。在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：12μg；第3周剂量：12μg；第4周剂量和后续周剂量：12μg。在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：12μg；第3周剂量：18μg；第4周剂量和后续周剂量：24μg。在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：12μg；第3周剂量：18μg；第4周剂量和后续周剂量：36μg。在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：12μg；第3周剂量：18μg；第4周剂量和后续周剂量：48μg。在一些实施方案中，可以根据以下周治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1周剂量：6μg；第2周剂量：12μg；第3周剂量：18μg；第4周剂量和后续周剂量：60μg。
在一些实施方案中，可以根据以下治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1天：6μg；第2天：9μg；第3天：12μg；第4天：18μg；第8天：18μg；第11天：18μg；第15天：36μg；第22天：36μg；随后是36μg的每周剂量。
在一些实施方案中，可以根据以下治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1天：6μg；第2天：12μg；第3天：18μg；第4天：24μg；第8天：24μg；第11天：24μg；第15天：48μg；第22天：48μg；随后是48μg的每周剂量。
在一些实施方案中，可以根据以下治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1天：6μg；第2天：12μg；第3天：24μg；第4天：36μg；第8天：36μg；第11天：36μg；第15天：60μg；第22天：60μg；随后是60μg的每周剂量。
在一些实施方案中，可以根据以下治疗计划表向患者静脉内施用本公开的组合物：第1天：6μg；第2天：12μg；第3天：24μg；第4天：36μg；第8天：48μg；第11天：48μg；第15天：100μg；第22天：100μg；随后是100μg的每周剂量。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者的方法包括在第1、8、15和22天向患者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。在一些实施方案中，在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用12μg。在一些实施方案中，在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用18μg。在一些实施方案中，在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用9μg，并且在第22天施用9μg。在一些实施方案中，在第1天施用9μg，在第8天施用12μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用12μg。在一些实施方案中，在第1天施用12μg，在第8天施用18μg，在第15天施用18μg，并且在第22天施用18μg。
在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者表现出骨髓原始细胞百分比降低，而在一些实施方案中，患者表现出血液中的绝对原始细胞计数降低。在一些实施方案中，治疗引起患者的原始细胞水平与紧接在治疗前患者的水平相比降低至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或更多。
在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者表现出完全缓解(CR)。如本文所用，完全缓解是指骨髓原始细胞减少到小于约5％，不存在循环原始细胞和带有奥尔棒(Auer rod)的原始细胞，不存在髓外疾病，以及绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.0×109/L(1,000/μL)和PLT≥100×109/L(100,000/μL)。在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者表现出没有微小残留病的CR(CRMRD)。如本文所用，CRMRD是指通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)确定对遗传标志物呈阴性的CR或通过多参数流式细胞术确定呈阴性的CR。在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者表现出具有不完全血液恢复的CR(CRi)。CRi包括上述所有CR标准，但残留中性粒细胞减少症(ANC<1.0×109/L[1,000/μL])或血小板减少症(PLT<100×109/L[100,000/μL])除外。
在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者表现出形态学无白血病状态(MLFS)。如本文所用，MLFS是指骨髓原始细胞<5％(即，骨髓不应仅仅是“再生障碍性的”；应列举至少200个细胞或者细胞密度(cellularity)应为至少10％)；不存在带有奥尔棒(Auerrod)的原始细胞；并且不存在髓外疾病。不需要血液学恢复。
在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者表现出部分缓解(PR)。如本文所用，PR包括上述CR的所有血液学标准，加上骨髓原始细胞百分比降低到5％至25％，以及治疗前骨髓原始细胞百分比降低至少50％。
在一些实施方案中，根据本公开的方法治疗的患者表现出疾病稳定(SD)，其特征在于不存在CRMRD、CR、CRi、PR和MLFS，但没有进行性疾病(即，骨髓原始细胞百分比增加和/或血液中绝对原始细胞计数增加)。
对用CD123 x CD3靶向多特异性多肽(例如，TRI130或TRI129)以每周相同剂量或以递升治疗方案治疗的患者输注的时间(即，输注长度)也可以被修改成进一步降低输注反应或细胞因子释放综合征的可能性。为了降低不良事件的风险，在几个小时，例如20-24小时内，通过IV向患者施用第一剂。在一些实施方案中，第一剂组合物在约20-24小时的时间段内施用，第二剂在约8小时的时间段内施用，第三剂在约6小时的时间段内施用，并且第四剂和后续剂量在约4小时的时间段内施用。在一些实施方案中，第一剂组合物在约20-24小时的时间段内施用，第二剂在约8小时的时间段内施用，第三剂在约6小时的时间段内施用，并且第四剂和后续剂量在约4小时的时间段内施用，其中第一剂、第二剂、第三剂和第四剂中的每一剂都是相同的。也可以通过连续IV输注，例如持续时间长达约72小时的连续IV输注将组合物施用于受试者。
用CD123 x CD3靶向多特异性多肽(例如，TRI130或TRI129)治疗的患者也可以用一种或多种附加治疗剂进行治疗。所述一种或多种附加治疗剂可以与CD123 x CD3靶向多特异性多肽同时或大约同时施用。在一些实施方案中，所述一种或多种附加治疗剂在施用多特异性多肽之前(即，作为“前驱药”)施用，诸如在多特异性多肽施用前约1-3小时施用。在一些实施方案中，所述一种或多种附加治疗剂在施用一剂或多剂多特异性多肽之后施用。
在一些实施方案中，所述一种或多种附加治疗剂是苯海拉明(diphenhydramine)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)和/或地塞米松(dexamethasone)。在一些实施方案中，所述一种或多种附加治疗剂可以静脉内或口服施用。在一些实施方案中，地塞米松可以以约10mg至约20mg的剂量施用。在一些实施方案中，甲基强的松龙可以以约1mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，对乙酰氨基酚可以以约650mg或约1,000mg的剂量施用。在一些实施方案中，对乙酰氨基酚可以一天施用三次，持续1天，其中第一剂在施用CD123 x CD3靶向多特异性多肽之前1至3小时施用。在一些实施方案中，所述一种或多种附加治疗剂可以包括抗组胺药诸如苯海拉明。苯海拉明可以以约50mg的剂量施用。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂可以包括别嘌呤醇。在一些实施方案中，别嘌呤醇在施用CD123 x CD3靶向多特异性多肽之前至少2天施用。在一些实施方案中，所述一种或多种附加治疗剂可以包括托珠单抗(tocilizumab)。
在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者中以CD123过表达为特征的病症的方法包括以本文所述的任何剂量或方案向患者施用有效量的包含包含重组多肽的药物组合物，该重组多肽包含CD123结合结构域和CD3结合结构域(例如，TRI130或TRI129)。在一些实施方案中，用于治疗有需要的患者中以CD123过表达为特征的病症的方法包括向患者施用有效量的包含重组多肽的药物组合物，该重组多肽包含CD123结合结构域和CD3结合结构域(例如，TRI130或TRI129)；其中该药物组合物的施用与以下物质的施用相比诱导受试者中的细胞因子水平降低：(a)包含重组多肽的CD123结合结构域和CD3结合结构域的双重亲和力重新靶向抗体；或(b)包含重组多肽的CD123结合结构域和CD3结合结构域的双特异性T细胞接合剂分子。在一些实施方案中，该病症是癌症，诸如AML或MDS。在一些实施方案中，该受试者先前用不同的CD123结合分子治疗，并且其中该受试者在先前治疗后经历不良事件。在一些实施方案中，该不良事件是过度的细胞因子释放。在一些实施方案中，该细胞因子水平是IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2、IL-8、IL-10、IL-17、GM-CSF、IL-4、IL-12、IL-13或IL-1β或其任何组合的水平。在一些实施方案中，该细胞因子水平是IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-10的水平。在一些实施方案中，该细胞因子水平是在体外激活T细胞测定中测量的。
包含本文所述的蛋白质和多肽的药物组合物可以作为包括容器的试剂盒提供，该容器包含如本文所述的药物组合物。药物组合物可以例如以用于单剂量或多剂量的可注射溶液的形式提供，或作为将在注射前重构的无菌粉剂提供。此类试剂盒可以进一步包括关于药物组合物的适应症和用法的书面信息。在一些实施方案中，该试剂盒包含药物组合物和IV稳定溶液(0.1M琥珀酸盐缓冲剂和0.08％重量/体积聚山梨醇酯80(pH 6.0)或设计用于防止或降低多特异性多肽将附着于塑料管和塑料袋上的可能性的类似溶液)。
本公开将通过以下实施例进一步阐明，这些实施例旨在纯粹为本公开的示例而决非限制。
实施例
进一步参考以下实施例详细描述本发明。除非另有说明，否则这些实施例仅出于说明的目的提供而非旨在进行限制。因此，本发明决不应被解读为限于以下实施例，而是应被解读为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
无需进一步描述，据信本领域普通技术人员可以使用前述的描述和以下说明性实施例，制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例特别指出本发明的优选实施方案，并且不应当被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：抗CD123x抗CD3双特异性蛋白的调配
对于治疗性蛋白药物而言，至关重要的是在配送中心长期储存、运输以及在剂量施用场所储存和使用期间维持它们的产品质量。蛋白质在生产和调配后可能会暴露于包括冷冻(-80℃、-20℃)、冷藏(4℃)和室温(25℃)在内的各种温度下。影响蛋白质药物稳定性的条件包括pH、蛋白质浓度以及调配物中可能包含的盐和赋形剂的浓度。
为了评价5mM琥珀酸盐、6.5％蔗糖、0.02％重量/体积的聚山梨醇酯80(缩写为SSuT)(pH 4.8)的抗CD123x抗CD3双特异性调配物(抗CD123-铰链区-CH2-CH3-抗CD3)，将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用编码TRI-129或TRI-130的DNA质粒连同选择标志物进行稳定转染。转染后，这些细胞在选择性压力下生长，以确保编码双特异性蛋白的基因稳定整合到CHO细胞基因组中并杀伤不含选择标志物的细胞。
TRI-129和TRI-130 CHO库最初在摇瓶中生长，然后转移到10L生物反应器中并在限定的、无动物组分的培养基中培养。在大约两周的培养后，使用深度过滤和无菌过滤的组合将细胞培养上清液进行澄清，然后使用亲和和混合模式柱色谱法的组合进行纯化。使用切向流过滤(TFF)装置将经过两步纯化的蛋白质渗滤到琥珀酸盐缓冲液中，然后掺入适当体积的蔗糖和聚山梨醇酯80浓缩储备溶液以达到限定组成。TRI-129和TRI-130ADAPTIR蛋白是在优选的调配缓冲液中在2mg/mL和10mg/mL下进行评价的。将在SSuT中的稳定性与在杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(dPBS)中的蛋白质进行比较。
在一项实验中，将TRI-129和TRI-130调配在SSut或PBS中并将样品储存在4℃和25℃下。在研究开始时和储存9天后，使用分析型尺寸排阻色谱(SEC)测定法确定样品的纯度。9天后药物产品的％纯度变化报告在下表8中。在dPBS中的样品的负值表明该样品的纯度正在下降并且指示产物峰面积从主峰重新分布到聚集体/较高分子量物质(HMW)。9天后，与在dPBS中的样品相比，在SSuT中的TRI-129和TRI-130显示出小得多的纯度变化，表明该调配物具有显著的稳定特性。
表8. 9天后在2mg/mL下TRI-129和TRI-130的PBS与SSut稳定性的比较
Figure BDA0003840537750000911
在生产和/或储存期间，蛋白质治疗剂通常会经历从-80℃或-20℃到4℃或室温的一个或多个冻融循环。重要的是所选原料药(bulk drug substance)和药物产品调配物可以稳定蛋白质并防止药物质量发生剧烈变化。检查了调配在SSuT中的TRI-129和TRI-130抗低温聚集的能力，低温聚集是由冷冻和融化蛋白质溶液引起的聚集形成。研究TRI-129和TRI-130在2和10mg/mL下的稳定性。通过分析SEC评估样品的纯度，然后将200μL在-80℃或-20℃下放置几小时，以使样品有足够的时间完全冷冻。将样品从冷冻箱中取出并让其在室温下完全融化。使样品经历在-80℃或-20℃下的总共三个冻融循环，然后通过SEC重新测试样品以确定％MP的变化。如下表9所示，TRI-129和TRI-130在-80℃或-20℃下都表现出％MP的最小变化。与2mg/mL的样品相比，10mg/mL的较高蛋白质浓度的样品显示出略大的％MP变化。
表9.在2mg/mL和10mg/mL下的在SSuT调配缓冲液中的TRI-129和TRI-130的冻融稳定性分析。
Figure BDA0003840537750000912
Figure BDA0003840537750000921
实施例2：对于TRI130的无可见有害效应水平(NOAEL)和最低预期生物效应水平(MABEL)的确定
无可见有害效应水平(NOAEL)
在非人灵长类动物(NHP)中进行了28天的重复剂量毒理学研究，恢复期为5周。四个研究组中的动物接受每周剂量的媒介物或0.5、2.5或10mg/kg的TRI130。测量的参数包括药物安全、实验室评价和具有完整组织病理学的尸检。没有临床不良发现，动物重量或器官重量没有变化，且组织病理学方面没有与TRI130相关的异常宏观或微观发现。给药后检测到最少的细胞因子，该最少的细胞因子与第一剂相比，在第二剂后减弱。随着T细胞的瞬时重新分布，观察到该分子的抗CD3结合结构域的预计药效学效应。在高剂量下消除半衰期为大约73小时。NHP中无可见有害效应水平(NOAEL)为10mg/kg，其转化为大约3.2mg/kg的人等效剂量(HED)。
最低预期生物效应水平(MABEL)
TRI130动员T细胞裂解表达靶抗原CD123的肿瘤细胞，并且最大活性发生在非常低的TCR占用水平(数据未示出)。为了计算最低预期生物效应水平(MABEL)，使用体外活性测定法代替体外受体占用。
MABEL是在人T细胞激活体外测定法中使用引发10％活性所需的有效浓度(EC10)(Muller等人，2009)来确定的。虽然TRI130在这些T细胞激活测定法中的效力可因T细胞的激活程度和效应与靶(E:T)细胞的比率而变化，但激活测定法代表了与重定向的T细胞细胞毒性(RTCC)测定法相比更灵敏的计算MABEL的测定法。RTCC和T细胞激活都被评价为预测起始临床剂量的MABEL的可能测定法。RTCC测定法，使用10:1E:T比率的纯化T细胞与CD123+KG1a肿瘤细胞系，从5个供体评估的平均EC10为5.8pM(在评价的供体中范围为4.4至6.7pM)。相比之下，T细胞激活测定法是一种更敏感的估计MABEL的测定法。为了测量体外诱导的T细胞激活，从外周血单核细胞中分离出T细胞，并且将该T细胞在CD123+肿瘤细胞(MOLM-13)的存在下与TRI130一起孵育。在对活CD4+和CD8+T细胞进行门控后，在20小时使用多色流式细胞术监测T细胞上CD69和CD25的上调。这些测定法评估了三个供体中CD4和CD8 T细胞两者的激活。这些测定法的平均EC10计算值对于CD4 T细胞为1.2pM(范围为0.7至1.6pM)并且对于CD8 T细胞为1.3pM(范围为0.9至2.0pM)。该测定法代表了对MABEL的更保守估计并且被用于估计用于患者的起始剂量。对于TRI130，0.7pM(0.113ng/ml)是基于来自供体的CD4+T细胞反应的MABEL的最保守的方法。
使用WinNonlin(v6.4)预编译的静脉(IV)给药2隔室模型确定单剂量NHP研究中第4组的清除率和体积估计值。使用异速生长缩放预测人体清除率和体积参数估计值，人体清除率和体积参数估计值可用于模拟将会产生低于0.7pM的EC10(MABEL)值的Cmax的给药策略，该低于0.7pM的EC10(MABEL)值是从激活测定中使用的个体供体测定的最低EC10。使用该模型，约0.005μg/kg的剂量将具有低于0.113ng/mL(0.7pM)的MABEL浓度的Cmax。
本研究中利用的是平坦剂量或固定剂量，而不是基于体重的剂量。几项研究已经证明，在许多单克隆抗体中平坦给药(flat dosing)与基于体重的给药相比表现相似，并且任一给药方案引入的PK变异性相对于在药效学、功效和安全性方面普遍观察到的变异性而言是中等的(Wang等人,2009)。假设患者60-kg且MABEL剂量为0.005μg/kg，则研究的起始剂量为0.3μg。
实施例3：向患者施用TRI130，一种调配的抗CD123x抗CD3治疗候选物
正将调配的TRI130(5mM琥珀酸盐、6.5％蔗糖、0.02％重量/体积的聚山梨醇酯80，pH 4.8)施用给处于正在进行的对复发或难治性急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)患者的1/1b期开放标签、剂量递增研究中的患者。该研究分两部分进行。第一部分是1期开放标签、剂量递增研究，以确定1b期的推荐剂量。1b期是一项开放标签的扩展研究，以评估药物在推荐剂量下的临床活性和安全性。研究设计概述在图2中。终点包括安全性、免疫原性、药代动力学、药效学和临床活性。
表10是列出队列1-10(剂量递增队列)每周被给予(通过IV施用)的量的给药计划表。在研究的两个部分中，除非早期发生疾病进展、毒性不可耐受或撤回同意书，否则患者每周静脉内接受药物，持续共六个28天的周期。如果患者有反应，则可以选择更长时间的治疗。
表10：剂量递增队列1至10
Figure BDA0003840537750000941
药物以一次性小瓶提供，该一次性小瓶装有含有2mg药物产品的1mL浓度为2mg/mL的液体。将该药物产品与IV稳定化溶液混合以防止药物产品附着于IV袋和IV管组上。该稳定化溶液在10mL小瓶中无菌提供并冷藏(2℃至8℃)，该稳定溶液由0.1M琥珀酸盐缓冲剂和0.08％重量/体积的聚山梨醇酯80(pH 6.0)组成。
对于队列1至4，第一剂(周期1，第1天)在大约20至24小时内，第二剂(周期1，第8天)在8小时(±1小时)内，第三剂(周期1，第15天)在6小时(±1小时)内以及所有后续剂量(周期1，第22天及以后)在4小时(±1小时)内通过IV输注进行施用。对于队列5及以上，第一剂在20至24小时内通过IV输注进行施用并且每次增加剂量。第二次施用相同剂量，在8小时(±30分钟)内输注，第三次在6小时(±30分钟)内输注，并且第四次和所有进一步次数在4小时(±30分钟)内输注。
如有必要，为了管理或防止任何不良事件且尤其是输注相关反应(IRR)或细胞因子释放综合征(CRS)，可以减缓和/或中断任何剂量的输注，将施用时间延长到至多72小时。如果输注延长超过60小时，则必须在输注完成后观察患者12小时。表10公开了有可能降低IRR和/或CRS的可能性的阶梯式给药方案(从队列5开始)。
患者给药频率为每周一次，持续长达6个月。基于递增TRI130剂量的食蟹猴毒理学研究(数据未示出)选择按周计划表的给药。对于以0.25至1mg/kg被给药的各个动物，单次剂量后TRI130的半衰期范围为大约25至113小时；较长的半衰期估计值与高剂量组(1mg/kg)的动物相关。
为减轻输注相关反应(IRR)和细胞因子释放综合征(CRS)，对患者施用以下前驱药：苯海拉明、对乙酰氨基酚和地塞米松。所有前驱药均在开始输注前1至3小时施用。如果研究者认为合并症需要所述前驱药中的任一种，则可以减少它的剂量。在周期2第15天之后地塞米松是任选的，只要患者在早期剂量下没有经历任何IRR或CRS即可。3种前驱药的剂量为：
1.地塞米松10mg至20mg IV，或甲基强的松龙1mg/kg IV，或等效物；该剂量由研究者基于患者的合并症决定；
2.对乙酰氨基酚650mg或1,000mg，或等效物，口服(PO)，每天三次，持续1天(由研究人员决定为650mg或1,000-mg剂量)，第一剂在研究药物输注前1至3小时施用；和
3.抗组胺药：苯海拉明50mg PO或IV；或等效物。
如果研究者选择施用别嘌呤醇来进行肿瘤溶解预防，则必须在研究药物开始前至少2天开始。
1期-剂量递增研究
在患者队列中以最低预期生物效应水平(MABEL)开始给药。被录入的患者：1)患有复发或难治性AML，拒绝强化化疗或同种异体干细胞移植或者不符合强化化疗或同种异体干细胞移植的条件，或2)患有复发或难治性MDS，具有>5％的位于骨髓中的原始细胞或者任何位于外周血中的循环原始细胞，并且先前用低甲基化剂(HMA)治疗失败；失败被定义为在用HMA治疗期间或之后对HMA不耐受、缺乏反应(至少6个周期没有CR)或IWG限定的进行性疾病。被录入正在进行的1期剂量递增研究(被录入至队列7)的32名患者的人口统计数据在表11中给出。对于被录入队列7的患者，中位年龄为67岁，且79％的患者患有AML。每名患者被施用的平均剂数为8.5，平均治疗持续时间为54天。
表11：人口统计数据和暴露，被录入队列7的患者
Figure BDA0003840537750000961
Figure BDA0003840537750000971
<u>治疗暴露汇总</u> <u>32名患者的平均值(SD)</u>
施用剂量 8.5(8.3)
治疗持续时间(天) 54(59)
被录入正在进行的1期剂量递增研究的32名患者的治疗相关不良事件如下表12所示。34％的患者经历了一个或多个IRR/CRS事件(据报告，等级≥3占16％)。最常见的症状是呼吸困难、发烧、低血压、缺氧、心动过速和僵直/寒战。值得注意的是，IRR/CRS是在两名或更多名患者中发生的唯一的治疗相关的严重不良事件。11名经历IRR/CRS事件的患者中有3名接受了托珠单抗治疗。
表12：治疗相关的不良事件
Figure BDA0003840537750000972
Figure BDA0003840537750000981
随着时间的推移监测患者骨髓抽吸物中原始细胞的百分比。如图3A-3D所示，在接受≥12μg的最高剂量的几名患者中观察到骨髓原始细胞减少。两名患者各自的骨髓原始细胞分别从29％减少到0％(队列6b，图3C)和从33％减少到4％(队列6a，图3B)。绝对中性粒细胞和血小板计数符合完全缓解标准。这两名患者以及队列7中一名原始细胞减少的患者仍在研究中。
在每位患者中施用最高剂量之前和之后的预计划的时间点评估血清细胞因子，并在输注相关反应或细胞因子释放综合征事件期间每隔一段时间对血清细胞因子进行评价。如图4A-4D所示，在预计划的收集期间细胞因子没有升高。在IRR/CRS不良事件期间观察到升高的细胞因子，特别是IL-6。值得注意的是，在这个小数据集中，在最高细胞因子浓度与剂量水平或事件等级之间没有观察到相关性。
因此，在这项初步研究中，以直到24μg的剂量施用TRI130可被耐受并且具有可管理的安全性。如上所述，两名患者具有完全缓解(CR)。除非并行地发生IRR/CRS不良事件，否则细胞因子不会显著升高。初步数据表明没有治疗诱导的抗药物抗体(ADA)的证据。
1期-附加剂量递增队列
在队列7的剂量限制性毒性(DLT)观察期完成后，四个附加顺序队列(队列A、B、C和D)将录入患者，同时对≥8的队列进行治疗。这些队列将按顺序运行并且独立于队列8至10，并将实现更快速的剂量递增。
队列A、B、C和D中的患者将在周期1的前4天接受连续静脉给药(20-24小时/天)，然后在第2周期间接受每周两次的给药，接着在周期1和所有后续周期中接受每周一次的给药。表14示出了队列A、B、C和D的给药方案。队列A中的第一周给药利用在队列6a中测试的剂量(第1天6μg、第2天9μg、第3天12μg和第4天18μg)。在第二周期间，在第8天和第11天施用18μg的剂量。在第3周，剂量递增到36μg并被维持在该水平。在第一周期间递增每日剂量的优点是Cmax逐渐增加，这可能会降低IRR/CRS发展的倾向。对于在对症治疗和剂量中断2小时内没有反应的等级≥2的IRR或CRS，将施用托珠单抗侵袭性治疗。
表14：队列A、B、C和D的给药
Figure BDA0003840537750000991
对于队列A-D，第一剂在20至24小时内通过IV输注进行施用并且每次增加剂量。第二次施用相同剂量，在8小时(±30分钟)内输注，第三次在6小时(±30分钟)内输注，并且第四次和所有进一步次数在4小时(±30分钟)内输注。
在周期1，第1天；周期1，第8天；周期1，第11天；周期1，第15天；和周期1，第22天之前施用前驱药。对于所有后续剂量，地塞米松是任选的，但对乙酰氨基酚和苯海拉明是需要的。
1b期-扩展
推荐剂量方案将在由相同类型的患者组成的两个扩展队列中进一步检查：1)队列1将由24名不符合强化化疗或同种异体移植的条件的复发或难治性AML患者组成；以及2)队列2将由24名复发或难治性MDS患者组成，该患者具有>5％的位于骨髓中的原始细胞或者任何位于外周血中的循环原始细胞并且先前用HMA治疗失败；失败被定义为在用HMA治疗期间或之后对HMA不耐受、缺乏反应(至少6个周期没有CR)或IWG限定的进行性疾病。
将收集血清样品用于药物水平的连续PK评估。
序列表
<110> 阿帕特夫研究和发展有限公司(Aptevo Research and Development LLC)
J·克拉珀(Clapper, Jonathan)
D·比恩维依(Bienvenue, David)
S·斯特里米特(Stromatt, Scott)
C·J·麦克马汉(McMahan, Catherine J.)
<120> 蛋白质治疗剂的调配物
<130> APVO-061/02WO 327714-2782
<150> US 63/121,633
<151> 2020-12-04
<150> US 62/960,562
<151> 2020-01-13
<160> 390
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<400> 1
000
<210> 2
<400> 2
000
<210> 3
<400> 3
000
<210> 4
<400> 4
000
<210> 5
<400> 5
000
<210> 6
<400> 6
000
<210> 7
<400> 7
000
<210> 8
<400> 8
000
<210> 9
<400> 9
000
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 HCDR1
<400> 10
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 HCDR2
<400> 11
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 HCDR3
<400> 12
Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ser Asp Ala Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 LCDR1
<400> 13
His Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 LCDR2
<400> 14
Trp Ala Ser
1
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 LCDR3
<400> 15
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr
1 5 10
<210> 16
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VH
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 17
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 VL
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ser Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 scFv
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
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145 150 155 160
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Gly Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
180 185 190
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
195 200 205
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp
225 230 235 240
Leu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
245 250 255
Ser Ser
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε HCDR1
<400> 19
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser Thr
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε HCDR2
<400> 20
Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε HCDR3
<400> 21
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε LCDR1
<400> 22
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε LCDR2
<400> 23
Asp Ser Ser
1
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε LCDR3
<400> 24
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε VH
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε VL
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
100 105
<210> 27
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3ε scFv
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser
180 185 190
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
245
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<400> 30
000
<210> 31
<211> 777
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD123 x 抗CD3ε双特异性构建体氨基酸序列
<400> 31
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
210 215 220
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Lys Leu Arg
245 250 255
Tyr Phe Asp Trp Leu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Met Val Thr Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
275 280 285
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val
290 295 300
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
305 310 315 320
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
325 330 335
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
340 345 350
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
355 360 365
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
370 375 380
Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
385 390 395 400
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
405 410 415
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
420 425 430
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
435 440 445
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
450 455 460
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
465 470 475 480
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
485 490 495
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser
515 520 525
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
530 535 540
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser
545 550 555 560
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
565 570 575
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
580 585 590
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
595 600 605
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
610 615 620
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
625 630 635 640
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
645 650 655
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
660 665 670
Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
675 680 685
Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
690 695 700
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser
705 710 715 720
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
725 730 735
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala
740 745 750
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly
755 760 765
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
770 775
<210> 32
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 经修饰的免疫球蛋白恒定区
<400> 32
tcgagtgagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 60
gccgcgggtg caccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 120
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 180
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 240
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 300
ctgaatggca aggaatacaa gtgcgcggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 360
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 420
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 480
ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 540
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 660
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggt 699
<210> 33
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 经修饰的免疫球蛋白恒定区
<400> 33
Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
35 40 45
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
50 55 60
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
65 70 75 80
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
85 90 95
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn
100 105 110
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
115 120 125
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
130 135 140
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
165 170 175
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
195 200 205
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 34
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 经修饰的免疫球蛋白恒定区
<400> 34
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg 60
ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggaat acaagtgcgc ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt 693
<210> 35
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 经修饰的免疫球蛋白恒定区
<400> 35
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 36
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 37
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 38
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 39
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 40
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 41
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 42
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 43
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 44
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 45
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 46
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 47
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 48
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白铰链区
<400> 49
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 50
Ser Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 51
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 51
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asn Ser
20
<210> 52
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 52
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Asn Ser
35
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 54
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 55
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 56
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser
1 5 10 15
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 57
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Asn Ser
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 58
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser
1 5
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 61
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 62
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 63
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 63
Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Gly Thr Gln Met Ala Gly
1 5 10 15
His Ser Pro Asn Ser
20
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 64
Ser Ser Leu Asn Thr Gly Thr Gln Met Ala Gly His Ser Pro Asn Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 65
Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Gly Thr Gln Met Ala Gly
1 5 10 15
His Ser
<210> 66
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 66
Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Ser Pro Asn Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 67
Asn Ser Leu Ala Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Pro Asn Ser
20
<210> 68
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 68
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Asn Ser
<210> 69
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 69
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Pro Gly Ser
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro
1 5 10 15
Ser
<210> 71
<400> 71
000
<210> 72
<400> 72
000
<210> 73
<400> 73
000
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<400> 74
000
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<400> 75
000
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<400> 76
000
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<400> 77
000
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<400> 78
000
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<400> 79
000
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<400> 80
000
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<400> 81
000
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<400> 82
000
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<400> 83
000
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<400> 84
000
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<400> 85
000
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<400> 86
000
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<400> 87
000
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<400> 88
000
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<400> 89
000
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<400> 90
000
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<400> 91
000
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<400> 92
000
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<400> 93
000
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<400> 94
000
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<400> 95
000
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<400> 96
000
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<400> 97
000
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<400> 98
000
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<400> 99
000
<210> 100
<400> 100
000
<210> 101
<400> 101
000
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<400> 102
000
<210> 103
<400> 103
000
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<400> 104
000
<210> 105
<400> 105
000
<210> 106
<400> 106
000
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<400> 107
000
<210> 108
<400> 108
000
<210> 109
<400> 109
000
<210> 110
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR1
<400> 110
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 111
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR1
<400> 111
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 112
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR1
<400> 112
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR2
<400> 113
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR2
<400> 114
Ala Thr Asp Met Arg Pro Ser
1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR2
<400> 115
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR3
<400> 116
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR3
<400> 117
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 LCDR3
<400> 118
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR1
<400> 119
Ile Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 120
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR1
<400> 120
Lys Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR1
<400> 121
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 122
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR2
<400> 122
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Ser
<210> 123
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR2
<400> 123
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 124
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR2
<400> 124
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 125
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR3
<400> 125
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Phe Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 126
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR3
<400> 126
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 127
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD3 HCDR3
<400> 127
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Phe Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 128
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 肽接头
<400> 128
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 129
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 肽接头
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(10)
<223> 可存在或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(15)
<223> 可存在或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 可存在或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(25)
<223> 可存在或不存在
<400> 129
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 130
<400> 130
000
<210> 131
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 经修饰的免疫球蛋白恒定区
<400> 131
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Ala Tyr Ala Cys Ala Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结合结构域接头
<400> 132
Ser Ser Leu Asn Thr Gly Thr Gln Pro Asn Ser
1 5 10
<210> 133
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1可变轻链结构域
<400> 133
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca cagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
cctccgacca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aa 342
<210> 134
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1可变轻链结构域
<400> 134
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 135
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1可变重链结构域
<400> 135
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatggca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaggg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagaaaag 300
ttacgatatt ttgactggtt atccgatgct tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc 360
accgtctctt ca 372
<210> 136
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1可变重链结构域
<400> 136
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ser Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 137
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRL1
<400> 137
cacagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRL1
<400> 138
His Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 139
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRL2
<400> 139
tgggcatct 9
<210> 140
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRL2
<400> 140
Trp Ala Ser
1
<210> 141
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRL3
<400> 141
cagcaatatt atagtactcc tccgaccact 30
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRL3
<400> 142
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr
1 5 10
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRH1
<400> 143
ggattcacct ttagcagcta tggc 24
<210> 144
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRH1
<400> 144
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 145
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRH2
<400> 145
attagtggta gtggtggtag caca 24
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRH2
<400> 146
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 147
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRH3
<400> 147
gcgaaagaaa agttacgata ttttgactgg ttatccgatg cttttgatat c 51
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OMT1 CDRH3
<400> 148
Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ser Asp Ala Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 149
<400> 149
000
<210> 150
<400> 150
000
<210> 151
<400> 151
000
<210> 152
<400> 152
000
<210> 153
<400> 153
000
<210> 154
<400> 154
000
<210> 155
<400> 155
000
<210> 156
<400> 156
000
<210> 157
<400> 157
000
<210> 158
<400> 158
000
<210> 159
<400> 159
000
<210> 160
<400> 160
000
<210> 161
<400> 161
000
<210> 162
<400> 162
000
<210> 163
<400> 163
000
<210> 164
<400> 164
000
<210> 165
<400> 165
000
<210> 166
<400> 166
000
<210> 167
<400> 167
000
<210> 168
<400> 168
000
<210> 169
<400> 169
000
<210> 170
<400> 170
000
<210> 171
<400> 171
000
<210> 172
<400> 172
000
<210> 173
<400> 173
000
<210> 174
<400> 174
000
<210> 175
<400> 175
000
<210> 176
<400> 176
000
<210> 177
<400> 177
000
<210> 178
<400> 178
000
<210> 179
<400> 179
000
<210> 180
<400> 180
000
<210> 181
<400> 181
000
<210> 182
<400> 182
000
<210> 183
<400> 183
000
<210> 184
<400> 184
000
<210> 185
<400> 185
000
<210> 186
<400> 186
000
<210> 187
<400> 187
000
<210> 188
<400> 188
000
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化双特异性构建体TRI129
<400> 309
atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 120
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatggca tgagctgggt ccgccaggct 180
ccagggaagg ggctggaggg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 240
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 300
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagaaaag 360
ttacgatatt ttgactggtt atccgatgct tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc 420
accgtctctt caggtggagg cggttcaggc ggaggtggat ccggcggtgg cggctccggt 480
ggcggcggat ctgacatcgt gatgacccag tctccagact ccctggctgt gtctctgggc 540
gagagggcca ccatcaactg caagtccagc cacagtgttt tatacagctc caacaataag 600
aactacttag cttggtacca gcagaaacca ggacagcctc ctaagctgct catttactgg 660
gcatctaccc gggaatccgg ggtccctgac cgattcagtg gcagcgggtc tgggacagat 720
ttcactctca ccatcagcag cctgcaggct gaagatgtgg cagtttatta ctgtcagcaa 780
tattatagta ctcctccgac cactttcggc ggagggacca aggtggagat caaatcctcg 840
agtgagccca aatcttctga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc 900
gcgggtgcac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 960
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1020
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1080
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1140
aatggcaagg aatacaagtg cgcggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1200
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1260
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 1320
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1380
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1440
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1500
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggttccg gaggaggggg ttcaggtggg 1560
ggaggttctg gcggcggggg aagcccttca caggtgcaac tggtgcagag tggacccgag 1620
gttaaaaaac cagggtcctc cgttaaggtt agctgcaaag cctctggcta cacattttcc 1680
aggagtacaa tgcactgggt gaggcaggct cctggacagg gactcgagtg gatcgggtat 1740
atcaacccat ctagcgccta taccaattac aaccaaaagt ttaaggaccg agttaccatt 1800
accgctgaca aatccaccag tacagcttat atggagctgt catctcttag gtccgaggac 1860
actgctgttt attactgcgc tcgtcctcag gttcactatg actataatgg ttttccctac 1920
tggggtcagg gaaccctggt gactgtctct tctggcggtg gaggcagcgg tgggggtggg 1980
tctggaggcg gtggcagtgg cggcggaggc tctgatattc agatgactca gtctcctagc 2040
actctcagcg ccagcgtggg ggatcgtgtg acaatgactt gctccgctag cagtagtgtg 2100
tcttacatga attggtatca gcagaagccc gggaaagcac ctaagcgctg gatctatgac 2160
tcttccaagc tggcaagtgg tgtcccctca cggttctctg gctcaggttc tggtactgac 2220
tatactttga ctatctcctc cctccagccc gatgatttcg ctacctatta ttgtcagcag 2280
tggagccgta acccacccac tttcggaggc ggtaccaaag tggagatcaa gaggtcataa 2340
<210> 310
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化双特异性构建体TRI129
<400> 310
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ser Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
145 150 155 160
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser
165 170 175
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
180 185 190
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
195 200 205
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
225 230 235 240
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
245 250 255
Ile Lys Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala
355 360 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
385 390 395 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
450 455 460
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Gln Val
500 505 510
Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val
515 520 525
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser Thr Met
530 535 540
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
545 550 555 560
Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp
565 570 575
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
580 585 590
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
595 600 605
Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
610 615 620
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
625 630 635 640
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
645 650 655
Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met
660 665 670
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
675 680 685
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu
690 695 700
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
705 710 715 720
Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr
725 730 735
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr
740 745 750
Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
755
<210> 311
<211> 2334
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化双特异性构建体TRI130
<400> 311
atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 120
atcaactgca agtccagcca cagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 180
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 240
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 300
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 360
cctccgacca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aaggtggagg cggttcaggc 420
ggaggtggat ccggcggtgg cggctccggt ggcggcggat ctgaggtgca gctgttggag 480
tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 540
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ggggtctcag ctattagtgg tagtggtggt agcacatact acgcagactc cgtgaagggc 660
cggttcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 720
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cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 1020
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1080
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tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1260
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tccaagcgac 1320
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acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt tccggaggag ggggttcagg tgggggaggt 1560
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cgtaacccac ccactttcgg aggcggtacc aaagtggaga tcaagaggtc ataa 2334
<210> 312
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化双特异性构建体TRI130
<400> 312
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Gly Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
180 185 190
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
195 200 205
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Lys Leu Arg Tyr Phe Asp Trp
225 230 235 240
Leu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
245 250 255
Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
260 265 270
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
275 280 285
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
290 295 300
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
305 310 315 320
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
325 330 335
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
340 345 350
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser
355 360 365
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
370 375 380
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
385 390 395 400
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
405 410 415
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
420 425 430
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
435 440 445
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
450 455 460
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
485 490 495
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Gln Val Gln Leu
500 505 510
Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val
515 520 525
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser Thr Met His Trp
530 535 540
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn
545 550 555 560
Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val
565 570 575
Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
580 585 590
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gln
595 600 605
Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
610 615 620
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
625 630 635 640
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
645 650 655
Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys
660 665 670
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
675 680 685
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser
690 695 700
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
705 710 715 720
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
725 730 735
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
740 745 750
Glu Ile Lys Arg Ser
755
<210> 313
<400> 313
000
<210> 314
<400> 314
000
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<400> 315
000
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<400> 316
000
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<400> 317
000
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<400> 318
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<400> 319
000
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<400> 320
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<400> 321
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<400> 322
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<400> 323
000
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<400> 324
000
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<400> 325
000
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<400> 326
000
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<400> 327
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<400> 328
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<400> 329
000
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<400> 330
000
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<400> 331
000
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<400> 332
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<400> 333
000
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<400> 334
000
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<400> 335
000
<210> 336
<400> 336
000
<210> 337
<211> 777
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化双特异性构建体TRI130
<400> 337
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
210 215 220
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Lys Leu Arg
245 250 255
Tyr Phe Asp Trp Leu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Met Val Thr Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
275 280 285
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val
290 295 300
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
305 310 315 320
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
325 330 335
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
340 345 350
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
355 360 365
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
370 375 380
Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
385 390 395 400
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
405 410 415
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
420 425 430
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
435 440 445
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
450 455 460
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
465 470 475 480
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
485 490 495
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser
515 520 525
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
530 535 540
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser
545 550 555 560
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
565 570 575
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
580 585 590
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
595 600 605
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
610 615 620
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
625 630 635 640
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
645 650 655
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
660 665 670
Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
675 680 685
Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
690 695 700
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser
705 710 715 720
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
725 730 735
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala
740 745 750
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly
755 760 765
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
770 775
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<400> 338
000
<210> 339
<400> 339
000
<210> 340
<400> 340
000
<210> 341
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris-7可变轻链序列
<400> 341
Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Phe Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
100 105
<210> 342
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris-7可变重链序列
<400> 342
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 343
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291可变轻链序列
<400> 343
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 344
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291可变重链序列
<400> 344
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 345
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VH CDR2 (Kabat)
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Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VH CDR3 (Kabat)
<400> 347
Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr
1 5 10
<210> 348
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VL CDR1 (Kabat)
<400> 348
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VL CDR2 (Kabat)
<400> 349
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 350
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VL CDR3 (Kabat)
<400> 350
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VH CDR1 (IMGT)
<400> 351
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VH CDR2 (IMGT)
<400> 352
Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VH CDR3 (IMGT)
<400> 353
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VL CDR1 (IMGT)
<400> 354
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 355
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VL CDR2 (IMGT)
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Asp Ser Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cris7和DRA222 VL CDR3 (IMGT)
<400> 356
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VH CDR1 (Kabat)
<400> 357
Lys Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 358
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VH CDR2 (Kabat)
<400> 358
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 359
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VH CDR3 (Kabat)
<400> 359
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 360
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VL CDR1 (Kabat)
<400> 360
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 361
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VL CDR2 (Kabat)
<400> 361
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 362
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VL CDR3 (Kabat)
<400> 362
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 363
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VH CDR1 (IMGT)
<400> 363
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala
1 5
<210> 364
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VH CDR2 (IMGT)
<400> 364
Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 365
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VH CDR3 (IMGT)
<400> 365
Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 366
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VL CDR1 (IMGT)
<400> 366
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr
1 5
<210> 367
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VL CDR2 (IMGT)
<400> 367
Gly Thr Lys
1
<210> 368
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> I2C VL CDR3 (IMGT)
<400> 368
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 369
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VH CDR1 (Kabat)
<400> 369
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 370
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VH CDR2 (Kabat)
<400> 370
Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 371
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VH CDR3 (Kabat)
<400> 371
Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 372
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VL CDR1 (Kabat)
<400> 372
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 373
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VL CDR2 (Kabat)
<400> 373
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 374
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VL CDR3 (Kabat)
<400> 374
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 375
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VH CDR1 (IMGT)
<400> 375
Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Thr
1 5
<210> 376
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VH CDR2 (IMGT)
<400> 376
Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VH CDR3 (IMGT)
<400> 377
Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 378
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VL CDR1 (IMGT)
<400> 378
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 379
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VL CDR2 (IMGT)
<400> 379
Asp Thr Ser
1
<210> 380
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HuM291 VL CDR3 (IMGT)
<400> 380
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 381
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC455 (抗CD3) TSC394 F87Y scFv
<400> 381
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser
180 185 190
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Ser Ser
245 250
<210> 382
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC456 (抗CD3) TSC394 E86D F87Y scFv
<400> 382
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser
180 185 190
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Ser Ser
245 250
<210> 383
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC455和TSC456可变重结构域
<400> 383
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 384
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC455可变轻结构域
<400> 384
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
100 105
<210> 385
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TSC456可变轻结构域
<400> 385
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser
100 105
<210> 386
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DRA222 (抗CD3) scFv
<400> 386
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr
145 150 155 160
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Gln Ile Thr Ser Ser Ser
245
<210> 387
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DRA222可变重结构域
<400> 387
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 388
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DRA222可变轻结构域
<400> 388
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Ser
100 105
<210> 389
<400> 389
000
<210> 390
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 铰链区
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 390
Cys Xaa Xaa Cys
1

Claims (157)

1.一种包含多特异性蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中
(a)所述多特异性蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序，或按照从羧基端到氨基端的顺序包含：
(i)第一结合结构域，
(ii)铰链区，
(iii)免疫球蛋白恒定区，和
(iv)第二结合结构域；并且
(b)所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含约1mM至约10mM的琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含约5mM的琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述赋形剂包含糖或由糖组成。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述糖是蔗糖。
6.如权利要求4或5所述的组合物，其中所述组合物包含约1％重量/体积(w/v)至约12％w/v的所述糖。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述组合物包含约6.5％(w/v)的所述糖。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂包含聚山梨醇酯80或由聚山梨醇酯80组成。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物包含约0.02％w/v的聚山梨醇酯80。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约0.1mg/ml至约10mg/ml的所述多特异性蛋白。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合物包含约1mg/ml至约5mg/ml的所述多特异性蛋白。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述组合物包含约2mg/ml的所述多特异性蛋白。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有约4.0至约5.5的pH。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物具有约4.8的pH。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区是人Fc结构域。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是CD3结合结构域并且所述第二结合结构域是肿瘤抗原结合结构域。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述多肽从N端到C端包含所述CD3结合结构域、所述铰链区、所述免疫球蛋白恒定区和所述肿瘤抗原结合结构域。
20.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是肿瘤抗原结合结构域，并且所述第二结合结构域是CD3结合结构域。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述多肽从N端到C端包含所述肿瘤抗原结合结构域、所述铰链区、所述免疫球蛋白恒定区和所述CD3结合结构域。
22.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是4-1-BB结合结构域并且所述第二结合结构域是肿瘤抗原结合结构域。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述多肽从N端到C端包含所述4-1-BB结合结构域、所述铰链区、所述免疫球蛋白恒定区和所述肿瘤抗原结合结构域。
24.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是肿瘤抗原结合结构域，并且所述第二结合结构域是4-1-BB结合结构域。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述多肽从N端到C端包含肿瘤抗原结合结构域、所述铰链区、所述免疫球蛋白恒定区和所述4-1-BB结合结构域。
26.如权利要求18-25中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤抗原结合结构域与CD123、PSMA、CD19、CD33或HER2结合。
27.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域或所述第二结合结构域是4-1BB结合结构域。
28.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域或所述第二结合结构域是OX40结合结构域。
29.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是4-1BB结合结构域并且其中所述第二结合结构域是OX40结合结构域。
30.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是OX40结合结构域并且其中所述第二结合结构域是4-1BB结合结构域。
31.如权利要求29或30所述的组合物，其中所述4-1BB结合结构域是scFv并且所述OX40结合结构域是scFv。
32.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是OX40结合结构域并且所述第二结合结构域是肿瘤抗原结合结构域。
33.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是肿瘤抗原结合结构域并且所述第二结合结构域是OX40结合结构域。
34.如权利要求1-33中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域中的至少一者包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)；和
(ii)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白轻链可变区(VL)。
35.如权利要求1-34中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域中的至少一者是单链可变片段(scFv)。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的羧基端。
37.如权利要求35所述的组合物，其中所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的氨基端。
38.如权利要求35-37中任一项所述的组合物，其中所述scFv包含接头多肽。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述接头多肽位于所述scFv的所述轻链可变区与所述重链可变区之间。
40.如权利要求38-39中任一项所述的组合物，其中所述接头多肽包含Gly4Ser(SEQ IDNO:128)接头。
41.如权利要求40所述的组合物，其中所述接头多肽包含式(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:129)。
42.如权利要求18-26中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤抗原结合结构域是抗CD123 scFv，所述抗CD123 scFv包含：
包含SEQ ID NO:10的HCDR1、包含SEQ ID NO:11的HCDR2和包含SEQ ID NO:12的HDCR3；和
包含SEQ ID NO:13的LCDR1、包含SEQ ID NO:14的LCDR2和包含SEQ ID NO:15的LCDR3。
43.如权利要求18-26中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤抗原结合结构域是包含VH和VL的抗CD123 scFv，所述VH包含与SEQ ID NO:136具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:134具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
44.如权利要求18-26中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤抗原结合结构域是抗CD123 scFv，并且其中所述scFv包含与SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
45.如权利要求18至21中任一项所述的组合物，其中所述CD3结合结构域是抗CD3scFv，所述抗CD3 scFv包含：
包含SEQ ID NO:19的HCDR1、包含SEQ ID NO:20的HCDR2和包含SEQ ID NO:21的HDCR3；和
包含SEQ ID NO:22的LCDR1、包含SEQ ID NO:23的LCDR2和包含SEQ ID NO:24的LCDR3。
46.如权利要求18-21中任一项所述的组合物，其中所述CD3结合结构域是包含VH和VL的抗CD3 scFv，所述VH包含与SEQ ID NO:383或387具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:384具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
47.如权利要求18-21中任一项所述的组合物，其中所述CD3结合结构域是抗CD3 scFv，所述抗CD3 scFv包含与SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
48.如权利要求18-21或45-47中任一项所述的组合物，其中每个多肽包含与SEQ IDNO:31具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
49.如权利要求1-48中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区相比包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以减少或防止与FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIa和FcγRIIIb的结合。
50.如权利要求1-48中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区相比包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以防止或减少Fc介导的T细胞激活。
51.如权利要求1-48中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区相比包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以防止或减少CDC活性。
52.如权利要求1-48中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区相比包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代以防止或减少ADCC活性。
53.如权利要求1-52中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含与野生型人IgG1 CH2结构域相比具有一个、两个、三个或更多个氨基酸取代的人IgG1 CH2结构域。
54.如权利要求1-53中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代L234A、L235A、G237A和K322A的人IgG1 CH2结构域。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A的人IgG1 CH2结构域。
56.如权利要求1-53中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代E233P、L234A、L235A、G237A和K322A及G236缺失的人IgG1 CH2结构域。
57.如权利要求1-56中任一项所述的组合物，其中所述铰链区源自免疫球蛋白铰链区。
58.如权利要求1-57中任一项所述的组合物，其中每个多肽包含位于所述免疫球蛋白恒定区与所述第二结合结构域之间的Fc结合结构域接头。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述Fc结合结构域接头包含Gly4Ser(SEQ ID NO:128)序列。
60.如权利要求59所述的组合物，其中所述Fc结合结构域接头包含式(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:129)。
61.如权利要求1-60中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于静脉内施用或皮下施用。
62.如权利要求1至61中任一项所述的组合物，其中所述组合物实质上防止所述多特异性蛋白的降解。
63.如权利要求1-62中任一项所述的组合物，其中所述组合物使所述多特异性蛋白的降解与在同一的储存条件下储存在组氨酸缓冲液中的同一的多特异性蛋白相比得以减缓或减少。
64.如权利要求1至63中任一项所述的组合物，其中所述组合物在4℃下实质上稳定至少1年。
65.如权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物实质上抵抗多特异性蛋白聚集体的形成。
66.如权利要求1-65中任一项所述的组合物，其中所述组合物与在同一的储存条件下储存在组氨酸缓冲液中的同一的多特异性蛋白相比形成更少的聚集体。
67.一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中：
(a)所述融合蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序包含：
(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，
(ii)铰链区，
(iii)免疫球蛋白恒定区，和
(iv)与CD3特异性地结合的第二结合结构域；并且
(b)所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
68.如权利要求67所述的组合物，其中所述组合物包含约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80。
69.如权利要求67或68所述的组合物，其中所述组合物包含约0.1mg/ml至约10mg/ml的所述多特异性蛋白。
70.如权利要求69所述的组合物，其中所述组合物包含约1mg/ml至约5mg/ml的所述多特异性蛋白。
71.如权利要求70所述的组合物，其中所述组合物包含约2mg/ml的所述多特异性蛋白。
72.如权利要求67-71中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有约4.0至约5.5的pH。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述组合物具有约4.8的pH。
74.如权利要求67-73中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区是人Fc结构域。
75.如权利要求67-74中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的免疫球蛋白CH2和CH3结构域。
76.如权利要求1-75中任一项所述的组合物，其中所述CH2结构域是与野生型人IgG1CH2结构域相比具有一个、两个、三个或更多个氨基酸取代的人IgG1 CH2结构域。
77.如权利要求67-76中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代L234A、L235A、G237A和K322A的人IgG1 CH2结构域。
78.如权利要求67-77中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A的人IgG1 CH2结构域。
79.如权利要求67-76中任一项所述的组合物，其中所述免疫球蛋白恒定区包含含有根据EU编号系统的取代E233P、L234A、L235A、G237A和K322A及G236缺失的人IgG1 CH2结构域。
80.如权利要求67-79中任一项所述的组合物，其中所述铰链区源自免疫球蛋白铰链区。
81.如权利要求67-80中任一项所述的组合物，其中每个多肽包含位于所述免疫球蛋白恒定区与所述第二结合结构域之间的Fc结合结构域接头。
82.如权利要求81所述的组合物，其中所述Fc结合结构域接头包含Gly4Ser(SEQ ID NO:128)序列。
83.如权利要求82所述的组合物，其中所述Fc结合结构域接头包含式(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:129)。
84.如权利要求67-83中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于静脉内施用或皮下施用。
85.如权利要求67-84中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域中的至少一者包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)；和
(ii)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白轻链可变区(VL)。
86.如权利要求67-85中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域中的至少一者是单链可变片段(scFv)。
87.如权利要求86所述的组合物，其中所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的羧基端。
88.如权利要求86所述的组合物，其中所述scFv的轻链可变区在所述scFv的重链可变区的氨基端。
89.如权利要求86-88中任一项所述的组合物，其中所述scFv包含接头多肽。
90.如权利要求89所述的组合物，其中所述接头多肽位于所述scFv的轻链可变区与重链可变区之间。
91.如权利要求89或90所述的组合物，其中所述接头多肽包含Gly4Ser(SEQ ID NO:128)接头。
92.如权利要求91所述的组合物，其中所述接头多肽包含式(Gly4Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:129)。
93.如权利要求67-92中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是抗CD123scFv，所述抗CD123 scFv包含：
包含SEQ ID NO:10的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR2和包含SEQ IDNO:12的序列的HCDR3；和
包含SEQ ID NO:13的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR2和包含SEQ IDNO:15的序列的LCDR3。
94.如权利要求67-92中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是包含VH和VL的抗CD123 scFv，所述VH包含与SEQ ID NO:136具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:134具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
95.如权利要求67-92中任一项所述的组合物，其中所述第一结合结构域是抗CD123scFv，所述抗CD123 scFv包含与SEQ ID NO:18具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
96.如权利要求67-95中任一项所述的组合物，其中所述第二结合结构域是抗CD3scFv，所述抗CD3 scFv包含：
包含SEQ ID NO:19的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:20的序列的HCDR2和包含SEQ IDNO:21的序列的HCDR3；和
包含SEQ ID NO:22的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:23的序列的LCDR2和包含SEQ IDNO:24的序列的LCDR3。
97.如权利要求67-95中任一项所述的组合物，其中所述第二结合结构域是包含VH和VL的抗CD3 scFv，所述VH包含与SEQ ID NO:383或387具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:384具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
98.如权利要求67-95中任一项所述的组合物，其中所述第二结合结构域是抗CD3scFv，所述抗CD3 scFv包含与SEQ ID NO:27具有至少90％、至少95％或100％同一性的序列。
99.如权利要求67-95中任一项所述的组合物，其中每个多肽包含SEQ ID NO:31的序列，或包含与SEQ ID NO:31具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
100.如权利要求67-95中任一项所述的组合物，其中：
所述第一结合结构域是包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)的抗CD123 scFv，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ IDNO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ ID NO:14的LCDR2和SEQ ID NO:15的LCDR3，并且
所述第二结合结构域是包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)的抗CD3 scFv，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ IDNO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3。
101.如权利要求67至100中任一项所述的组合物，其中所述组合物实质上防止所述多特异性蛋白的降解。
102.如权利要求67至101中任一项所述的组合物，其中所述组合物使所述多特异性蛋白的降解与在同一的储存条件下储存在组氨酸缓冲液中的同一的多特异性蛋白相比得以减缓或减少。
103.如权利要求67至102中任一项所述的组合物，其中所述组合物在4℃下实质上稳定至少1年。
104.如权利要求67至103中任一项所述的组合物，其中所述组合物实质上抵抗多特异性蛋白聚集体的形成。
105.如权利要求67至104项所述的组合物，其中所述组合物与在同一的储存条件下储存在组氨酸缓冲液中的同一的多特异性蛋白相比形成更少的聚集体。
106.一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中
(a)所述融合蛋白包含：
(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，
其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ IDNO:14的LCDR2和SEQ ID NO:15的LCDR3；和
(ii)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3；并且
(b)所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
107.一种组合物，其包含融合蛋白、约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80，其中所述融合蛋白包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二硫键联接的Fv、scFv x scFv(BiTE)、scFv-Fc(SMIP)、scFv-Fc-scFv、四价体瘤、Kλ抗体、dAb、双链抗体、纳米抗体、DOCK-AND-
Figure FDA0003840537740000151
CrossMab Fab、CrossMab VH-VL、链交换工程化结构域抗体(SEEDbody)、亲和体、Fynomer、Kunitz结构域、Albu-dab、两个具有交换的VH的工程化Fv片段(例如，双重亲和重新靶向分子(D.A.R.T.))、DVD-IG、Covx-body、肽体、SVD-Ig、dAb-Ig、旋钮入孔抗体、包含位于CH3结构域中的匹配突变的IgG1抗体(例如，DuoBody抗体)和三功能抗体。
108.一种包含融合蛋白、约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80的组合物，其中
(a)所述融合蛋白包含：
(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，
其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ IDNO:14的LCDR2和SEQ ID NO:15的LCDR3；和
(ii)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，
其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ IDNO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3。
109.一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中
(a)所述融合蛋白包含：
(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，
其中所述结合结构域包含：免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:136；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:134；和
(ii)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，
其中所述结合结构域包含：免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:383或387；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:384；并且
并且
(b)所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
110.一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中
(a)所述融合蛋白包含：
(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，其中所述第一结合结构域包含SEQ IDNO:18；和
(ii)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，其中所述第二结合结构域包含SEQ IDNO:27；并且
(b)所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
111.一种包含融合蛋白、缓冲剂、赋形剂和表面活性剂的组合物，其中
(a)所述融合蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序，或按照从羧基端到氨基端的顺序包含：
(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，
其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ IDNO:14的LCDR2和SEQ ID NO:15的LCDR3；
(ii)SEQ ID NO:47的铰链区，
(iii)SEQ ID NO:131的免疫球蛋白恒定区，
(iv)SEQ ID NO:132的Fc结合结构域接头，和
(v)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，
其中所述第二结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3；并且
(b)所述缓冲剂包含琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸，或者由琥珀酸盐或其药学上可接受的盐或酸组成。
112.一种包含融合蛋白、约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80的组合物，其中：
所述融合蛋白是两个同一的多肽的二聚体，其中每个多肽按照从氨基端到羧基端的顺序包含：
(i)与CD123特异性地结合的第一结合结构域，
其中所述结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2和SEQ ID NO:12的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:13的LCDR1、SEQ IDNO:14的LCDR2和SEQ ID NO:15的LCDR3；
(ii)SEQ ID NO:47的铰链区，
(iii)SEQ ID NO:131的免疫球蛋白恒定区，
(iv)SEQ ID NO:132的Fc结合结构域接头，和
(v)与CD3特异性地结合的第二结合结构域，
其中所述第二结合结构域包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述免疫球蛋白重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2和SEQ ID NO:21的HCDR3；和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3。
113.一种包含融合蛋白、约5mM的琥珀酸盐、约6.5％重量/体积(w/v)的蔗糖和约0.02％w/v的聚山梨醇酯80的组合物，
其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:31或由SEQ ID NO:31组成；
其中所述组合物包含约2mg/ml的所述融合蛋白；并且
其中所述组合物具有约4.8的pH。
114.一种治疗有需要的受试者的自身免疫病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-113中任一项所述的组合物。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述自身免疫病症是肠易激综合征、炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身性红斑狼疮、哮喘、多发性硬化、皮肌炎、多发性肌炎、恶性贫血、原发性胆汁性肝硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、爱迪生氏病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(aPL)、自身免疫性肝炎、1型糖尿病、Goodpasture综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本病、特发性血小板减少性紫癜、寻常型天疱疮、肖格伦综合征、颞动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、脉管炎、乳糜泻、子宫内膜异位、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、硬斑病、硬皮病、嗜睡症、神经性肌强直、白癜风、自身免疫性内耳病或重症肌无力。
116.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-113中任一项所述的组合物。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述癌症选自癌或肉瘤。
118.如权利要求116所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肾癌、胰腺癌、肺癌、肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、脑癌、结肠癌、卵巢癌或血液癌症。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述血液癌症是急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、毛细胞白血病(HCL)、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和慢性髓性白血病(CML)。
120.如权利要求1-113中任一项所述的组合物用于治疗受试者的自身免疫病症的用途。
121.如权利要求1-113中任一项所述的组合物在制造用于治疗自身免疫病症的药物中的用途。
122.如权利要求1-113中任一项所述的组合物用于治疗受试者的癌症的用途。
123.如权利要求1-113中任一项所述的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
124.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括通过IV输注以0.3、1、3、6、9、12、18、20、24、30、36、48、50、60、75或100μg的剂量向所述受试者施用包含含有CD123结合结构域和CD3结合结构域的多特异性蛋白的组合物。
125.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括通过IV输注以0.3、1、3、6、9、12、18、20、24、30、36、48、60、50、75或100μg的剂量向患者施用如权利要求42-48、93-100和108-111中任一项所述的组合物。
126.如权利要求124或125所述的方法，其中第一剂的所述组合物通过IV输注在20-24小时的时间段内施用于所述患者。
127.如权利要求126所述的方法，其中第二剂的所述组合物通过IV输注在8小时的时间段内施用于所述患者，其中所述第二剂与所述第一剂相同。
128.如权利要求127所述的方法，其中第三剂的所述组合物通过IV输注在6小时的时间段内施用于所述患者，其中所述第三剂与所述第一剂和所述第二剂相同。
129.如权利要求124-128中任一项所述的方法，其中第四剂和后续剂的所述组合物通过IV输注在约2至约4小时的时间段内施用于所述患者。
130.如权利要求124-125中任一项所述的方法，其中所述组合物通过长达72小时的连续IV输注施用于所述患者。
131.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物在第1、8、15和22天施用。
132.如权利要求131所述的方法，其中在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用12μg。
133.如权利要求131所述的方法，其中在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用18μg。
134.如权利要求131所述的方法，其中在第1天施用6μg，在第8天施用9μg，在第15天施用9μg，并且在第22天施用9μg。
135.如权利要求131所述的方法，其中在第1天施用9μg，在第8天施用12μg，在第15天施用12μg，并且在第22天施用12μg。
136.如权利要求131所述的方法，其中在第1天施用12μg，在第8天施用18μg，在第15天施用18μg，并且在第22天施用18μg。
137.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：6μg；
第2周剂量：9μg；
第3周剂量：12μg；和
第4周剂量和后续周剂量：12μg。
138.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：6μg；
第2周剂量：9μg；
第3周剂量：12μg；和
第4周剂量和后续周剂量：18μg。
139.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：6μg；
第2周剂量：12μg；
第3周剂量：12μg；和
第4周剂量和后续周剂量：12μg。
140.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：6μg；
第2周剂量：12μg；
第3周剂量：18μg；和
第4周剂量和后续周剂量：24μg。
141.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：6μg；
第2周剂量：12μg；
第3周剂量：18μg；和
第4周剂量和后续周剂量：36μg。
142.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：6μg；
第2周剂量：12μg；
第3周剂量：18μg；和
第4周剂量和后续周剂量：48μg。
143.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：6μg；
第2周剂量：12μg；
第3周剂量：18μg；和
第4周剂量和后续周剂量：60μg。
144.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：6μg；和
第2周和后续周剂量：9μg。
145.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：9μg；和
第2周和后续周剂量：12μg。
146.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物根据以下周治疗计划表通过IV施用于患者：
第1周剂量：12μg；和
第2周和后续周剂量：18μg。
147.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物在第一个28天周期期间施用于患者，其中在所述第一个28天周期的第1天施用6μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第2天施用9μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第3天施用12μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第4天施用18μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第8天施用18μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第11天施用18μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第15天施用36μg所述多特异性蛋白，并且在所述第一个28天周期的第22天施用36μg所述多特异性蛋白。
148.如权利要求147所述的方法，其中所述方法进一步包括在至少一个另外的28天周期期间向所述患者施用所述多特异性蛋白，其中在所述至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天中的每一天施用36μg所述多特异性蛋白。
149.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物在第一个28天周期期间施用于患者，其中在所述第一个28天周期的第1天施用6μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第2天施用12μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第3天施用18μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第4天施用24μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第8天施用24μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第11天施用24μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第15天施用48μg所述多特异性蛋白，并且在所述第一个28天周期的第22天施用48μg所述多特异性蛋白。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述方法进一步包括在至少一个另外的28天周期期间向所述患者施用所述多特异性蛋白，其中在所述至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天中的每一天施用48μg所述多特异性蛋白。
151.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物在第一个28天周期期间施用于患者，其中在所述第一个28天周期的第1天施用6μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第2天施用12μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第3天施用24μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第4天施用36μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第8天施用36μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第11天施用36μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第15天施用60μg所述多特异性蛋白，并且在所述第一个28天周期的第22天施用60μg所述多特异性蛋白。
152.如权利要求151所述的方法，其中所述方法进一步包括在至少一个另外的28天周期期间向所述患者施用所述多特异性蛋白，其中在所述至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天中的每一天施用60μg所述多特异性蛋白。
153.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物在第一个28天周期期间施用于患者，其中在所述第一个28天周期的第1天施用6μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第2天施用12μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第3天施用24μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第4天施用36μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第8天施用48μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第11天施用48μg所述多特异性蛋白，在所述第一个28天周期的第15天施用100μg所述多特异性蛋白，并且在所述第一个28天周期的第22天施用100μg所述多特异性蛋白。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述方法进一步包括在至少一个另外的28天周期期间向所述患者施用所述多特异性蛋白，其中在所述至少一个另外的28天周期的第1、8、15和22天中的每一天施用100μg所述多特异性蛋白。
155.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中所述组合物通过IV施用于患者并且剂量在前几周每周增加。
156.如权利要求124-130中任一项所述的方法，其中每周一次、两次、三次或四次地给所述患者施用所述组合物。
157.如权利要求124-156中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于患有急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)的患者。
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