KR102649757B1 - 5t4 및 4-1bb에 결합하는 항원 결합 단백질 및 관련 조성물 및 방법 - Google Patents

5t4 및 4-1bb에 결합하는 항원 결합 단백질 및 관련 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은 5T4 및/또는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 단백질 분자에 관한 것이다. 분자는 하나 이상의 인간화된 5T4-결합 또는 4-1BB-결합 도메인을 가질 수 있다. 이러한 분자는 암 치료에 유용하다. 5T4 또는 4-1BB에 결합하는 단백질 분자는 다른 표적에 결합하는 제2 결합 도메인을 가질 수 있다. 분자는 이펙터 세포에 의해 발현되는 5T4-발현 세포 및 세포-표면 분자 둘 다에 결합하여 이펙터 세포 활성화, 증식, 생존 및/또는 이펙터-세포 매개 세포독성을 향상시킬 수 있다. 본 개시 내용은 또한 5T4-결합 또는 4-1BB-결합 폴리펩티드 또는 단백질 분자를 포함하는 제약 조성물, 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 및 이들 분자의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

Description

5T4 및 4-1BB에 결합하는 항원 결합 단백질 및 관련 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 7월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/535,107호; 2017년 10월 23월에 출원된 제62/575,820호; 및 2018년 3월 26월에 출원된 제62/648,072호를 우선권으로 주장하며, 그 내용은 각각 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
본원과 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식 사본 (파일명: APVO_057_03WO_SeqList_ST25.txt; 저장일: 2018년 7월 20월, 파일 크기: 260 킬로바이트)
개시 분야
본 개시 내용은 영양막 당 단백질 (5T4)에 특이적으로 결합하는 분자에 관한 것이다. 이들 분자는 하나 이상의 인간화된 5T4-결합 도메인을 가질 수 있다. 이들 분자는 암과 같은 5T4의 발현을 특징으로 하는 장애의 특성화 또는 치료에 유용하다. 5T4에 대한 결합하는 단백질 치료제는 단일 특이적 단백질 치료제 또는 다중특이적 단백질 치료제일 수 있다. 본원 개시는 또한 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 9 (4-1BB 또는 CD137)에 특이적으로 결합하는 단백질 치료제에 관한 것이다. 다중특이적 단백질 치료제는 이펙터 세포상에서 발현되는 5T4-발현 세포 및 4-1BB 둘 다에 결합하여 이펙터 세포 활성화, 증식 및/또는 이펙터-세포 매개 세포독성을 향상시킬 수 있다.
5T4 (영양막 당 단백질, TPBG, M6P1 및 Waif1이라고도 함)는 맨체스터 대학교 (University of Manchester)의 피터 스턴 교수에 의해 처음 확인된 잘 정의된 종양 관련 항원 (TAA)이다 (Hole and Stern, 1988). 비-소세포 폐암, 신장암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 결장 직장암, 위암, 난소암 및 자궁 경부암 및 급성 림프구성 백혈병을 포함한 다양한 악성 종양에서 많은 비율의 환자에서 발현되는 종양태아성 항원이며, 또한 종양 개시 세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 (Castro et al., 2012; Damelin et al., 2011; Elkord et al., 2009; Southall et al., 1990).
태반 및 특수 상피와 같은 일부 건강한 조직에서 낮은 수준의 5T4 발현이 검출되었으나 종양에서의 발현 수준은 상당히 높다.
데이터는 5T4가 CXCR4의 기능적 활성을 조절함을 시사한다 (Castro et al., 2012; Southgate et al., 2010). 5T4 결합 항체 또는 5T4 녹다운 (knock-down)은 종양 성장 및 전이에 관여하는 경로인 CXCR4-매개 세포 이동의 억제를 초래하였다. 따라서, 5T4를 표적화하는 것은 다양한 암의 치료에서 치료적 이점을 제공할 수 있다. 현재 5T4를 특이적으로 표적으로 하거나 결합하는 FDA 승인 치료제는 없다. 5T4가 발현되는 악성 종양을 치료하기 위한 새로운 치료제가 필요하다.
4-1BB (CD137 또는 TNFRSF9라고도 함)는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 멤버다. 4-1BB는 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 조절 T 세포 (Treg), 수지상 세포 (DC), 단핵구, 비만 세포, 호산구 및 종양 내피 세포를 포함하는 다양한 세포 집단에서 발현된다. 4-1BB의 활성화는 4-1BBL (CD137L이라고도 함)에 결합하여 유도되는 수용체 올리고머화 (Rabu et al., 2005; Wyzgol et al., 2009)에 의존하며, 이는 항원 제시 세포 (APC) 및 다른 세포 유형의 세포 표면에 삼량체로서 발현된다. CD8+ T 세포에서의 4-1BB 활성화는 CD8+ T 세포 이펙터 기능을 유지 및 증강시키고 우선적으로 Th1 사이토카인 생성을 지원한다 (Shuford et al., 1997; Lee et al., 2002; Pulle et al., 2006). CD4+ T 세포에서 4-1BB 활성화, 4-1BB 자극은 초기에 활성화를 초래하고, 또 나중에 활성화-유도된 세포 사멸을 초래하는데, 이는 왜 4-1BB 작용성 항체가 자가 면역뿐만 아니라 종양 면역에도 치료 효과를 나타냈는지 설명하는 것으로 생각된다 (Jhang, JCI, 2007; Sun, Trends Mol Med, 2003). 4-1BB 활성화는 Treg 기능을 억제하거나 Treg를 세포독성 CD4+ T-세포로 전환시키는 것으로 보고되었다 (Akhmetzyanova et al., 2016; So et al., 2008).
T 세포 이펙터 기능의 발현 및 조절에 추가하여, 4-1BB는 CD16- 및 사이토카인-활성화 천연 킬러 (NK) 세포에서 상향 조절된다. 4-1BB의 활성화는 뮤린 및 인간 세포 둘 다에서 NK 세포의 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 활성을 증가시키는 것으로 나타났다 (Kohrt 2012 및 2014 J Clin Invest, Hout 2012, Oncoimm에 의해 검토됨). 또한, DC 및 대식세포와 같은 APC 상에 발현된 4-1BB의 활성화는 또한 면역 활성화를 유도 및/또는 조절할 수 있다.
면역 세포 활성화의 조절에서 4-1BB의 역할은 다양한 암 유형의 치료에서 바람직한 면역 요법 표적일 수 있음을 시사한다. 실제로, 2개의 4-1BB 항체가 임상 개발 중에 있다: 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)에 의해 개발된 우렐루맙(Urelumab (BMS-66513)) 및 화이자(Pfizer)에 의해 개발된 PF-05082566. 다양한 적응증에 대한 1상 및 2상 연구가 각 항체에 대해 진행 중이다. 그러나, 4-1BB 활성화시 환자 및 뮤린 모델에서 간 및 피부 독성이 관찰되었다 (Ascierto et al., 2010; Dubrot et al., 2010; Niu et al., 2007). 또한, 전이성 흑색 종에서 2차 요법으로서 우렐루맙을 사용한 2상 연구는 간 독성으로 인해 2009년 종료되었다 (Garber et al., 2011; Li and Liu, 2013).
따라서, 종양학적 적응증의 치료에 사용하기 위해 4-1BB를 안전하고 효과적으로 활성화시키는 치료제가 당 업계에 여전히 필요하다.
몇몇 실시양태에서, 본 개시내용은 특히 5T4 및/또는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 다중특이적 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 5T4-결합 도메인은 인간 5T4의 세포 외 도메인에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 4-1BB-결합 도메인은 인간 4-1BB의 세포 외 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 5T4에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 도메인 및 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 5T4-결합 도메인은 (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역, 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하되 (a) HCDR1은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; (e) LCDR2는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고; (f) LCDR3은 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 38 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 38 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 44, 48 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 44, 48 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 i) 서열 번호 38과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: 및 서열 번호 44와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 ii) 서열 번호 46에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48에 대해서 90%, 95% 이상, 또는 97% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 iii) 서열 번호 46에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 5와 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 ii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 iii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 인간 5T4에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 도메인 및 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 4-1BB-결합 도메인 및 5T4 결합 도메인 각각은 (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고; 여기서 5T4-결합 도메인의 VH 및/또는 VL 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하되 상기 5T4-결합 도메인은 (a) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (b) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; (c) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (d) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (e) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 (f) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 38에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 40과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 38에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 40에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 개시내용은 인간 5T4에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 도메인 및 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 4-1BB-결합 도메인 및 5T4 결합 도메인 각각은 (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고; 여기서 4-1BB-결합 도메인의 VH 및/또는 VL 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하되 5T4-결합 도메인은 (a) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (b) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; c) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (d) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (e) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 (f) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 38 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 38 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 44, 48 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 44, 48 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 i) 서열 번호 38에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: 및 서열 번호 44와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 ii) 서열 번호 46에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48에 대해서 90%, 95% 이상, 또는 97% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 iii) 서열 번호 46에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 50에 대해서 90%, 95% 이상, 또는 97% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 ii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 iii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 5T4에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 도메인 및 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 4-1BB-결합 도메인 및 5T4 결합 도메인 각각은 (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고; 여기서 4-1BB-결합 도메인의 VH 및/또는 VL 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하되 5T4-결합 도메인은 (a) 서열 번호 52 의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (b) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; (c) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (d) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (e) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 (f) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 56에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 58에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 56에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 58에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 개시내용은 또한 인간 5T4에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 도메인 및 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 4-1BB-결합 도메인 및 5T4 결합 도메인 각각은 (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하되 4-1BB-결합 도메인의 VH 및/또는 VL 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하되 5T4-결합 도메인은 (a) 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (b) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; (c) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (d) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (e) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 (f) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 64와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 측면에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 58에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 5T4-결합 도메인은 서열 번호 64와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 58에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공한다. 본 개시내용은 또한 4-1BB-결합 도메인 및 5T4-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 4-1BB-결합 도메인은 결합 도메인 링커를 통해 5T4-결합 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지, (i) 5T4-결합 도메인, (ii) 결합 도메인 링커 및 (iii) 4-1BB-결합 도메인을 포함한다. 특정 측면에서, 5T4-결합 도메인은 단일쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시양태에서, 상기 scFv의 경쇄 가변 영역은 상기 scFv의 중쇄 가변 영역으로의 카르복실-말단이다. 다른 실시양태에서, 상기 scFv의 경쇄 가변 영역은 상기 scFv의 중쇄 가변 영역으로의 아미노-말단이다. 특정 측면에서, scFv는 링커 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 링커 폴리펩티드는 상기 scFv의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 사이에 있다. 특정 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 Gly4Ser 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 화학식 (Gly4Ser)n을 포함하되 n = 1 내지 5이다. 일부 측면에서, 링커 폴리펩티드는 서열 번호 85 내지 108로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 서열 번호 98에 제시된 아미노산 서열 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 scFv는 서열 번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 및 170으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv는 서열 번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 및 170으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 4-1BB-결합 도메인 및 5T4-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 4-1BB-결합 도메인은 (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH), 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하되 (a) HCDR1은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; (e) LCDR2는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (f) LCDR3은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 14와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 16에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 14와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 개시내용은 인간 5T4에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 도메인 및 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 추가로 제공하며, 여기서 4-1BB-결합 도메인은 (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하되 4-1BB-결합 도메인의 VH 및/또는 VL 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하되 4-1BB-결합 도메인은 (a) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (b) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; (c) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (d) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (e) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 (f) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 20에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 22와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 20에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 22와 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 개시내용은 또한 인간 5T4에 특이적으로 결합하는 5T4 결합 도메인 및 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중 특이성 폴리펩티드를 제공하되 4-1BB-결합 도메인은 (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하되 4-1BB-결합 도메인의 VH 및/또는 VL 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하되 4-1BB-결합 도메인은 (a) 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (b) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; (c) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (d) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (e) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 (f) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 26에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 16에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 26에 대해서 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 4-1BB-결합 도메인은 단일쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 측면에서, 상기 scFv의 경쇄 가변 영역은 상기 scFv의 중쇄 가변 영역으로의 카르복실-말단이다. 다른 측면에서, 상기 scFv의 경쇄 가변 영역은 상기 scFv의 중쇄 가변 영역으로의 아미노-말단이다. 특정 측면에서, scFv는 링커 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 링커 폴리펩티드는 상기 scFv의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 사이에 있다. 특정 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 Gly4Ser 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 화학식 (Gly4Ser)n을 포함하되 n = 1 내지 5이다. 일부 측면에서, 링커 폴리펩티드는 서열 번호 85 내지 108로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 서열 번호 98에 제시된 아미노산 서열 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)을 포함한다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 다중특이적 폴리펩티드는 결합 도메인 링커를 통해 5T4-결합 도메인에 연결된 4-1BB-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 (i) 5T4-결합 도메인, (ii) 결합 도메인 링커 및 (iii) 4-1BB-결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 포함하는 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 다중특이적 폴리펩티드는 약물 또는 독소에 접합되는 4-1BB-결합 도메인을 포함한다.
본 개시내용은 면역 글로불린 불변 영역에 융합되거나 접합되는 5T4-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 면역 글로불린 불변 영역은 인간 Fc 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 Fc 도메인은 서열 번호 158 또는 서열 번호 160에 제시된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 아미노-말단에서 카르복실-말단까지, (i) 5T4-결합 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 결합 도메인 링커, 및 (v) 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 Gly4Ser 서열을 포함한다. 일부 예에서, 결합 도메인 링커는 화학식 (Gly4Ser)n을 포함하되 n = 1 내지 5이다. 일부 측면에서, 결합 도메인 링커는 서열 번호 85 내지 108로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 서열 번호 107에 제시된 아미노산 서열 (SGGGGSGGGGSGGGGSPS)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 제1 scFv 도메인 및 제2 scFv 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 scFv 도메인은 결합 도메인 링커, 또는 결합 도메인 링커와 면역 글로불린 Fc 도메인에 의해 서로 연결되며, 여기서 면역 글로불린 Fc 도메인은 힌지 영역 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함하고; 제2 scFv 도메인은 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호 2, 18, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 4의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 6의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호 8의 LCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 10의 LCDR2 아미노산 서열 및 서열 번호 12의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하되 제1 및 제2 scFv 도메인은 결합 도메인 링커, 또는 결합 도메인 링커와 면역 글로불린 Fc 도메인에 의해 서로 연결되며, 여기서 면역 글로불린 Fc 도메인은 힌지 영역 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 및 156으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 및 156으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138 및 146으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지, (i) 제1 scFv 도메인, (ii) 결합 도메인 링커, 및 (iii) 제2 결합 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지, (i) 제2 scFv 도메인, (ii) 결합 도메인 링커, 및 (iii) 제1 scFv 도메인을 포함한다. 특정 측면에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지, (i) 제1 scFv 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 결합 도메인 링커, 및 (v) 제2 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 Gly4Ser 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 화학식 (Gly4Ser)n을 포함하되 n = 1 내지 5이다. 특정 측면에서, 결합 도메인 링커는 서열 번호 85 내지 108로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 서열 번호 107에 제시된 아미노산 서열 (SGGGGSGGGGSGGGGSPS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제2 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 2에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 4에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 6에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 8에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 12에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제2 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 24에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 4에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 6에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 8에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 12에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제2 scFv 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제2 scFv 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제2 scFv 도메인은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제2 scFv 도메인은 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 개시내용은 또한 제1 scFv 도메인 및 제2 scFv 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 scFv 도메인은 결합 도메인 링커, 또는 결합 도메인 링커와 면역 글로불린 Fc 도메인에 의해 서로 연결되며, 여기서 면역 글로불린 Fc 도메인은 힌지 영역 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함하고; 여기서 제2 scFv 도메인은 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고; 여기서 제1 scFv 도메인은 (i) 서열 번호 30, 52 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는HCDR1 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 32 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 34의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호 8, 42 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 10의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 36의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고; 제2 scFv 도메인은 (i) 서열 번호 2, 18, 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 4에서 선택되는 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 6의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호 8의 LCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 10의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 12의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하되 제1 및 제2 scFv 도메인은 결합 도메인 링커, 또는 결합 도메인 링커와 면역 글로불린 Fc 도메인에 의해 서로 연결되며, 여기서 면역 글로불린 Fc 도메인은 힌지 영역 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 2에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 4에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 6에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 8에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 12에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 30에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 32에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 8에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 30에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 32에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 42에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 30에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 32에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 42에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 30에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 32에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 42에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 52에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 32에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 54에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 60에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 62에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 54에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 18에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 4에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 6에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 8에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 12에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 30에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 32에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 42에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 24에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 4에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 6에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 8에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 12에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 52에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 32에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 54에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 24에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 4에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 6에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 8에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 12에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함하고, 임의로, 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 30에 제시된 HCDR1 아미노산 서열; (b) 서열 번호 32에 제시된 HCDR2 아미노산 서열; (c) 서열 번호 34에 제시된 HCDR3 아미노산 서열; (d) 서열 번호 8에 제시된 LCDR1 아미노산 서열; (e) 서열 번호 10에 제시된 LCDR2 아미노산 서열; 및 (f) 서열 번호 36에 제시된 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 또한 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 40의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 14의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 44의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 14의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 14의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 58의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 14의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 58의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 14의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 50의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 20의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 58의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 26의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 68의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 28의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 70의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 ii) 서열 번호 28의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 scFv 도메인 및 제2 scFv 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 scFv 도메인은 결합 도메인 링커 또는 결합 도메인 링커와 면역 글로불린 Fc 도메인에 의해 서로 연결되며, 여기서 면역 글로불린 Fc 도메인은 힌지 영역 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함하고; 제1 scFv 도메인은 인간 5T4에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호 30의 HCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 32의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 34의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호 42의 LCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 10의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 36의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 ii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 iii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 scFv 도메인 및 제2 scFv 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 scFv 도메인은 결합 도메인 링커, 또는 결합 도메인 링커와 면역 글로불린 Fc 도메인에 의해 서로 연결되고, 여기서 면역 글로불린 Fc 도메인은 힌지 영역 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함하고; 여기서 제1 scFv 도메인은 인간 5T4에 특이적으로 결합하되 제2 scFv 도메인의 VH 및/또는 VL 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고; 여기서 제1 scFv 도메인은 (a) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (b) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; (c) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (d) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (e) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 (f) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 ii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 iii) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지, (i) 제1 scFv 도메인, (ii) 결합 도메인 링커, 및 (iii) 제2 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지, (i) 제2 scFv 도메인, (ii) 결합 도메인 링커, 및 (iii) 제1 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지, (i) 제1 scFv 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 결합 도메인 링커, 및 (v) 제2 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 Gly4Ser 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 화학식 (Gly4Ser)n을 포함하되 n = 1 내지 5이다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 서열 번호 85 내지 108로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 서열 번호 107에 제시된 아미노산 서열 (SGGGGSGGGGSGGGGSPS)을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 다중특이적 폴리펩티드의 제1 scFv 도메인은 인간 5T4에 특이적으로 결합하고 서열 번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 및 170으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 제2 scFv 도메인은 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고 서열 번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 112에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 128에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 170에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 134에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 5T4 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하되 폴리펩티드는 각각의 서열 번호와 동일한 CDR 아미노산 서열을 포함하거나, 폴리펩티드는 각각의 서열 번호와 비교하여 벗어나는 아미노산이 하나 이상을 넘지 않는 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 제1 scFv 도메인이 5T4의 세포 외 도메인에 결합하고 제2 scFv 도메인이 4-1BB의 세포 외 도메인에 결합하는 다중특이적 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 이펙터 세포 활성화를 향상시킨다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 다중특이적 폴리펩티드는 이펙터 세포 활성화 및/또는 이펙터 세포 증식을 증가시킨다. 다른 측면에서, 다중특이적 폴리펩티드는 5T4-발현 세포의 이펙터 세포-의존적 용해를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 5T4 결합 도메인은 50 nM 미만의 kD 값으로 5T4에 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 5T4-결합 도메인 및/또는 4-1BB-결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역은 인간화된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 결합 도메인 링커 및 면역 글로불린 Fc 도메인에 의해 서로 연결된 제1 단일쇄 가변 단편(scFv) 도메인 및 제2 scFv 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 면역 글로불린 Fc 도메인은 힌지 영역 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함하고; 여기서 다중특이적 폴리펩티드는 제2의 동일한 다중특이적 폴리펩티드와 회합함으로써 동종이량체를 형성할 수 있고; 제1 scFv 도메인은 인간 5T4에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호 30의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)-1 아미노산 서열, 서열 번호 32의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 34의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호 42의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)-1 아미노산 서열, 서열 번호 10의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 36의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고; 제2 scFv 도메인은 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호 2의 HCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 4의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 6의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호 8의 LCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 10의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 12의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 2. 제1 항에 있어서, 다중특이적 폴리펩티드는 상기 아미노-말단부터 카르복실-말단까지, (i) 제1 scFv 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 결합 도메인 링커, 및 (v) 제2 scFv 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인은 서열 번호 130 또는 170의 프레임워크 영역과 비교할 때, 프레임워크 영역에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 안정화 이황화 결합을 도입한다.
일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제1 scFv 도메인은 서열 번호 38의 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 44의 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제1 scFv 도메인은 서열 번호 46의 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48의 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제2 scFv 도메인은 서열 번호 14의 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제1 scFv 도메인은 서열 번호 46의 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48의 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 scFv 도메인은 서열 번호 14의 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 120과 97% 이상 동일하고, 제2 scFv 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 110과 97% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 172와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호 172와 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 scFv 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 122와 97% 이상 동일하고, 제2 scFv 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 110과 97% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 174와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이펙터 세포에 대한 다중특이적 폴리펩티드의 결합은 이펙터 세포 활성화 증가, 이펙터 세포 증식 증가를 가져오거나, 이펙터 세포, 5T4-발현 세포에 대한 다중특이적 폴리펩티드의 결합이 5T4-발현 세포의 증강된 이펙터 세포-의존적 용해를 가져온다.
본 기재 내용은 또한 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하는 이량체를 포함하며, 여기서 2개의 폴리펩티드는 각각 본 명세서에 기재된 다중특이적 폴리펩티드이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 경구 단위 투여 형태, 정맥 내 단위 투여 형태, 비강 내 단위 투여 형태, 좌제 단위 투여 형태, 피내 단위 투여 형태, 근육 내 단위 투여 형태, 복강 내 단위 투여 형태, 피하 단위 투여 형태, 경막 외 단위 투여 형태, 설하 단위 투여 형태 및 뇌내 단위 투여 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 단위 투여 형태의 비제한적인 예는 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 분말, 로젠지, 과립제, 용액제, 현탁액제, 유제, 시럽제, 엘릭시르제, 서방성 제제, 에어로졸 및 스프레이를 포함한다.
본 개시내용은 5T4를 발현하는 세포에 대한 이펙터 세포 활성화를 향상시키는 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 상기 5T4-발현 세포를 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 접촉 단계는 5T4-발현 세포에 대한 향상된 이펙터 세포 활성화가 유도되는 조건에서 이루어진다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 장애는 5T4의 발현을 특징으로 하며, 상기 방법은 대상체에게 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 단백질 또는 그의 제약 조성물을 치료적 유효량 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용은 또한 대상체에서 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 단백질의 용도를 포함하며, 상기 장애는 5T4의 발현을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 단백질에 관한 것이며, 상기 장애는 5T4의 발현을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 장애는 암이다. 특정 측면에서, 암은 유방암, 췌장암, 난소암, 비-소세포 폐암, 중피종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀 세포 백혈병(MCL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 편평 세포 암종, 흑색종, 부신암, 방광암, 자궁 경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 갑상선암, 간암, 자궁암, 신경 섬유종, 육종 또는 두부 및 경부암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이러한 방법에 사용하기 위한 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지: (i) 제1 scFv 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 결합 도메인 링커, 및 (v) 제2 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법에 사용하기 위한 다중특이적 폴리펩티드는 서열 번호 14의 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 scFv 도메인: 및 (i) 서열 번호 38의 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 44의 면역 글로불린 경쇄 가변 영역; 또는 (ii) 서열 번호 46의 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 48의 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드의 제2 scFv 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 110과 97% 이상 동일하고, 다중특이적 폴리펩티드의 제1 scFv 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 120 (209의 경우, 항-5T4 scFv) 또는 서열 번호 122와 97% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 제2 다중특이적 폴리펩티드와 비교하여 통계적으로 유의한 향상된 이펙터 세포 활성화를 나타내며, 여기서 제2 다중특이적 폴리펩티드는 서열 번호 28을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 16을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항-4-1BB 항체, 및 서열 번호 46을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 66을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항-5T4 scFv를 포함하는 IgG-scFv 구조이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 제2 다중특이적 폴리펩티드와 비교하여 통계적으로 유의한 증강된 이펙터 세포 증식을 유도하며, 여기서 제2 다중특이적 폴리펩티드는 서열 번호 28을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 16을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항-4-1BB 항체, 및 서열 번호 46을 포함하는 가변 중쇄 및 서열 번호 66을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항-5T4 scFv를 포함하는 IgG-scFv 구조이다.
본 개시내용의 일부 측면은 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 171, 173 및 175로 이루어진 군으로부터 선택되는뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터의 핵산 분자는 숙주 세포에서 핵산 세그먼트의 발현에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 본 개시내용은 본원에 기재된 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 5T4-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공하고, 본 방법은 핵산 세그먼트가 발현되는 조건하에 본원에 기재된 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 5T4-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 것을 포함한다.
도 1은 5T4(+) 세포의 존재하에 7개의 작제물(construct) (ALG.APV-004, ALG.APV-006, ALG.APV-099, ALG.APV-127, ALG.APV-148 및 ALG.APV-150)의 작용제 기능을 도시한 것이다.
도 2는 7개의 scFv-Fc-scFv 분자 (ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196 및 ALG.APV-198)의 인간 4-1BB를 발현하는 CHO-K1 세포주에 대한 결합 곡선을 도시한 것이다.
도 3은 7개의 scFv-Fc-scFv 분자 (ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196 및 ALG.APV-198)의 시노몰구스 4-1BB를 발현하는 CHO-K1 세포주에 대한 결합 곡선을 도시한 것이다.
도 4는 7개의 scFv-Fc-scFv 분자 (ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196, 및 ALG.APV-198)의 인간 5T4를 발현하는 CHO-K1 세포주에 대한 결합 곡선을 도시한 것이다.
도 5는 CHO-K1 및 SKOV-3 세포주에서 인간 5T4의 발현 수준을 도시한 것이다.
도 6은 SKOV-3 세포에 대한 ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-196, 및 ALG.APV-198 작제물의 결합 곡선을 도시한 것이다.
도 7은 ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196, 및 ALG.APV-198의 시노몰구스 5T4를 발현하는 CHO-K1 세포주에 대한 결합 곡선을 도시한 것이다.
도 8은 4-1BB 리포터 분석에서 항-5T4 x 항-4-1BB 작제물의 활성을 도시한 것이다.
도 9는 PBMC 및 CHO-K1 공배양물로부터의 IFNγ 방출에 대한 항-5T4 x 항-4-1BB 작제물의 효과를 예시한다.
도 10은 scFv-Fc-scFv 형식 (ADAPTIRTM 형식)을 갖는 단백질의 예시적인 실시양태를 도시한 것이다.
도 11a 내지 도 11b는 이중특이적 scFv-Fc-scFv 작제물과 함께 배양된 인간 CD8+ T 세포에서의 인터페론 감마 (IFNγ) 반응을 나타낸다. 도 11a는 5T4-Fc 항원으로 코팅된 플레이트에서 배양될 때의 T 세포 반응을 나타낸다. 도 11b는 5T4-Fc 항원없이 배양될 때의 T 세포 반응을 나타낸다. 도면은 두 공여자의 평균값을 표시한다.
도 12는 ALG.APV-004, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209, 및 ALG.APV-210의 CHO-K1/인간 CD137 세포주에 대한 결합 곡선을 보여준다.
도 13은 ALG.APV-004, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209, 및 ALG.APV-210의 인간 5T4를 발현하는 뮤린 CT26 세포 (ATCC)에 대한 결합 곡선을 보여준다.
도 14는 ALG.APV-004, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 CHO-K1/시노몰구스 5T4 형질 감염체에서의 결합 곡선을 보여준다.
도 15는 ALG.APV-004, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 CD137이나 5T4를 발현하지 않는 인간 세포주 (MOLM13 세포, ATCC)에서의 결합 곡선을 보여준다.
도 16은 5T4(+) 세포 (HCC1143) 또는 5T4(-) 세포 (MOLM13)의 존재하에 5시간 인큐베이션한 후 Jurkat/NF-κB 리포터 세포에서 이중특이적 작제물의 활성을 보여준다. 곡선의 모든 점은 복제 웰(duplicate well)의 평균을 나타낸다. y축은 상대 형광 단위 (RLU)로 값을 표시한다.
도 17은 ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209, ALG.APV-210, 및 모리슨 형식 대조군 작제물, ALG.APV-004에 의해 72에서 1차 PBMC 배양에서 유도된 IFN-γ의 수준을 보여준다. 곡선의 모든 점은 복제 웰의 평균을 나타낸다.
도 18a 내지 도 18b는 항원-발현 종양에 대한 이중특이적 작제물 ALG.APV-209, ALG.APV-210 및 ALG.APV-004의 5T4-의존적 국소화의 FACS 분석을 도시한 것이다. 국소화는 항-인간 Fc 항체 (도 18a) 또는 비오티닐화된 4-1BB (도 18b)로 염색함으로써 검출되었다.
도 19a 내지 도 19b는 이중특이적 작제물 ALG.APV-209, ALG.APV-210, 및 ALG.APV-004의 5T4+ (도 19a) 및 5T4- (도 19b) 종양에 대한 5T4-의존적 국소화의 면역 조직 화학 분석을 도시한 것이다.
도 20은 상이한 수준의 5T4를 발현하는 CT26 세포의 존재하에서 이중특이적 항체 ALG.APV-210과 함께 배양된 인간 CD8 T 세포의 IFNγ 반응을 보여준다.
도 21a 내지 도 21b는 상이한 수준의 5T4를 발현하는 CT26 세포의 존재하에 이중특이적 항체 ALG.APV-210과 함께 배양된 인간 CD8 T 세포의 최대 IFNγ 방출을 나타낸다.
도 22a 내지 도 22c는 CD3-자극 또는 자극되지 않은 인간 및 시노몰구스 PBMC로부터 게이팅된 1차 CD8 T 세포에 대한 ALG.APV-210 또는 ANC107 (이소형 대조군) 결합을 나타낸다. 2개의 독립적인 실험으로부터의 MFI (및 SEM)가 도 22a 및 도22b에 도시되어 있다. 도 22c는 2개의 독립적인 실험으로부터 ALG.APV-210에 대한 정규화된 풀링된 데이터를 나타낸다. n = 3 공여자/그룹/실험.
도 23a 내지 도 23c는 CD3-자극 또는 자극되지 않은 인간 및 시노몰구스 PBMC로부터 게이팅된 1차 CD8 T 세포에 대한 ALG.APV-210 또는 ANC107 (이소형 대조군) 결합을 나타낸다. 2개의 독립적인 실험으로부터 CD8 T 세포에 대한 ALG.APV-210 결합의 백분율 및 SEM이 도 23a 및 도 23b에 도시되어 있다. 도 23c는 실험 1 및 2로부터의 정규화된 풀링된 데이터를 나타낸다. n = 3 공여자/그룹/실험.
도 24는 인간 CD8 T 세포에서 ALG.APV-210의 작용제 기능을 나타낸다.
도 25a 내지 도 25b는 개별 대표 공여자로부터의 인간 CD8 T 세포에서 ALG.APV-210의 작용제 기능을 나타낸다.
도 26은 시노몰구스 CD8 T 세포에서 ALG.APV-210의 작용제 기능을 나타낸다.
도 27a 내지 도 27c는 개별 대표 공여자로부터의 시노몰구스 CD8 T 세포에서 ALG.APV-210의 작용제 기능을 나타낸다. 도면은 5T4-Fc의 존재하에 ALG.APV-210으로 활성화된 시노몰구스 CD8 T에 의한 용량 반응 의존적 IFNγ 생성을 보여준다.
도 28은 SCID 베이지 색 마우스에서 5T4 양성 인간 결장 암종 이종 이식편 종양 모델인 HCT-116에서 이중특이적 항체 ALG.APV-210의 항종양 효능을 나타낸다.
도 29는 ALG.APV-210 또는 ALG.APV-209의 PK 분석을 나타낸다.
도 30a 내지 도 30b는 ALG.APV-210의 Fc 부분의 FcγR에 대한 결합을 나타낸다. 적정된 ALG.APV-210을 FcγR-발현 세포와 함께 인큐베이션하고 형광 표지된 항-인간 IgG 2차 항체로 프로브했다 (도 30a). 인간 IgG1 분자를 양성 대조군으로 사용했다 (도 30b).
도 31a 내지 도 31b는 인간 5T4를 발현하는 CHO-K1 세포 및 항-CD3 항체의 존재하에 이중특이적 분자 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210에 의해 유도된 CD8+ 및 CD4+ T-세포 증식을 보여준다.
도 32a 내지 도 32b는 2명의 상이한 인간 PBMC 공여자 (A 및 B)로부터의 전체 PBMC 배양물에서 이중 특이성 분자 ALG.APV-210에 의한 IFN-γ 분비의 유도를 보여준다.
도 33a 내지 도 33b는 2명의 상이한 인간 PBMC 공여자로부터의 전체 PBMC 배양물에서 이중 특이성 분자 ALG.APV-210에 의해 유도된 CD8+ T-세포 증식을 보여준다.
도 34는 ALG.APV-210의 5T4-발현 세포주에 대한 결합을 나타낸 것이다.
도 35는 다양한 표면 5T4 단백질 밀도를 발현하는 세포의 존재하에서 인큐베이션한 후 Jurkat/NF-κB 리포터 세포에서 이중특이적 작제물 ALG.APV-210의 작용제 기능을 나타낸다.
도 36는 5T4를 발현하는 인간 HCT116 세포의 존재하에서 이중특이적 항체 ALG.APV-210과 함께 배양된 인간 CD8+ T 세포의 IFNγ 반응을 보여준다.
도 37은 5T4를 발현하는 인간 HCT116 세포의 존재하에서 이중특이적 항체 ALG.APV-210과 함께 배양된 인간 CD8+ T 세포의 IFNγ 반응을 나타낸다.
도 38은 인간 5T4를 발현하는 HCT116 세포의 존재하에서 이중특이적 항체 ALG.APV-210과 함께 배양된 인간 CD8 T 세포의 최대 IFNγ 방출을 나타낸다.
도 39a 내지 도 39d는 5T4 발현 인간 종양 세포 또는 형질 감염된 세포주에 대한 ALG.APV-210 결합을 나타낸다.
도 40a 내지 도 40d는 5T4 발현 인간 종양 세포 또는 형질 감염된 세포주에 대한 ALG.APV-210 결합을 나타내는 실험에 대한 정규화된 MFI를 보여준다.
본 개시내용은 당 단백질 영양막 세포 (5T4)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 및 5T4에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 5T4 및 다른 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 다중특이적 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 5T4에 특이적으로 결합하고 또한 이펙터 세포상의 표적에 특이적으로 결합하는 다중특이적 폴리펩티드이다. 본 개시내용은 또한 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 9 (41BB 또는 CD137)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 4-1BB 및 다른 표적 (예를 들어, 종양 관련 항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 다중특이적 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 4-1BB에 특이적으로 결합하고 또한 표적 세포상의 표적에 특이적으로 결합하는 다중특이적 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 5T4에 특이적으로 결합하고 4-1BB에 특이적으로 결합하는 이중특이적 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 폴리펩티드는 표적 세포상에서 발현된 5T4 및 이펙터 세포상에서 발현된 4-1BB에 결합하여, 이펙터 세포 활성화의 증폭 및 표적 세포의 이펙터 세포-매개 세포독성을 초래한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이전에 공지된 5T4-결합 도메인 및/또는 4-1BB-결합 도메인와 비교하여 덜 표적 외 결합을 나타내는 5T4-결합 도메인 및/또는 4-1BB-결합 도메인 (및 이러한 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질)을 제공한다. 특정 측면에서, 본원에 기재된 결합 도메인을 포함하는 결합 도메인 및/또는 폴리펩티드는 특정 형식 및/또는 특정 배향 (예를 들어, VL-VH에 비해 VH-VL)으로 5T4 및/또는 4-1BB에 보다 효과적으로 결합하여, 5T4의 발현과 관련된 장애의 치료에 보다 높은 효능 및/또는 개선된 유용성을 가져온다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료적 유효량의 폴리펩티드 또는 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것은 특정 암을 포함하여 5T4의 발현과 관련된 특정 장애의 치료에 유용하다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 단백질은 5T4를 발현하는 표적 세포 및 이펙터-세포 둘 다에 결합하여, 5T4를 발현하는 표적 세포 및 이펙터 세포를 "가교 결합"시킨다. 두 도메인의 표적에 대한 결합은 이펙터 세포의 활성화를 향상시켜, 연장되고/거나 더 강력한 이펙터 세포 반응 (예를 들어, 이펙터 세포-매개 세포독성)을 가져온다. 본 개시내용의 폴리펩티드 및 단백질은 환자 치료에 있어서의 다양한 이점, 예를 들어 5T4에 대한 효과적인 결합, 이펙터 세포 활성의 효과적인 향상, 감소된 사이토카인 방출 수준 및/또는 부작용 (예를 들어, 독성)의 위험을 낮추는 것과 같은 이점을 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 비표적 세포 (예를 들어, 동일한 대상체, 기관 또는 조직의 정상 세포 또는 비-암성 세포)보다 더 높은 수준에서 5T4를 발현한다. 다른 실시양태에서, 표적 세포는 5T4를 발현하지만, 비표적 세포 (예를 들어, 동일한 대상체, 기관 또는 조직에서 정상 세포 또는 비-암성 세포)는 5T4를 발현하지 않는다.
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본 기재 내용에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우 그 분수 (예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어 "a" 및 "an"은 달리 지시되지 않는 한 열거된 구성 요소의 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어 "포함하다(include)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용된다. 또한, 본원에 기재된 성분 (예를 들어, 도메인 또는 영역) 및 치환기의 다양한 조합을 포함하는 폴리펩티드는 각각의 폴리펩티드가 개별적으로 제시된 것과 동일한 정도로 본 출원에 개시되어 있는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 개별 폴리펩티드의 특정 성분의 선택은 본 발명의 범위 내에 있다.
정의
본원에 사용된 용어 "결합 도메인" 또는 "결합 영역"은 표적 분자, 예컨대 항원, 리간드, 수용체, 기질 또는 억제제 (예를 들어, 5T4 또는 4-1BB)를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력을 가진 항체로부터 유래한 단백질, 폴리펩티드, 올리고 펩티드, 펩티드, 항체, 또는 결합 도메인의 도메인, 영역, 부분, 부위를 지칭한다. 예시적인 결합 도메인은 항체 및 항체-유사 단백질 또는 도메인, 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및 단일쇄 항체 가변 영역 (예를 들어, 도메인 항체, sFv, scFv, scFab)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 도메인은 항원 결합 부위 (예를 들어, 대안적인 프레임워크 영역 (FR) (예를 들어, 임의로 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 FR) 배치된 항체로부터의 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열, 또는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 3개의 중쇄 CDR을 포함함)를 포함하거나 이로 구성된다. 웨스턴 블롯 (Western blot), ELISA, 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝 및 BIACORE® 상호 작용 분석을 포함하여 특정 표적에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 결합 도메인을 확인하기 위한 다양한 분석법이 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 표적 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 5T4와 같은 종양 관련 항원)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 이펙터 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 4-1BB)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 다중특이적 폴리펩티드이고 2개 이상의 결합 도메인을 포함한다.
결합 도메인 또는 결합 도메인을 포함하는 단백질은 시험 샘플에 존재하는 다른 성분을 유의하게 결합시키지 않으면서 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka (즉, 1/M 단위를 갖는 특정 결합 상호 작용의 평형 결합 상수)로 표적에 결합하는 경우 표적을 "특이적으로 결합"한다. 결합 도메인은 "높은 친화성" 결합 도메인 및 "낮은 친화성" 결합 도메인으로 분류될 수 있다. "높은 친화성" 결합 도메인은 107 M-1 이상, 108 M-1 이상, 109 M-1 이상, 1010 M-1 이상, 1011 M-1 이상, 1012 M-1 이상, 또는 1013 M-1 이상의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. "낮은 친화성" 결합 도메인은 최대 107 M-1까지, 106 M-1까지, 최대 105 M-1까지의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. 선택적으로, 친화도는 M의 단위를 갖는 특정 결합 상호 작용의 평형 해리 상수 (Kd) (예를 들어, 10-5 M 내지 10-13, 또는 약 500 nM, 약 300 nM, 약 250 nM, 약 200 nM, 약 150 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 25 nM, 약 10 nM 또는 약 5 nM)로 정의될 수 있다. 본 개시내용에 따른 결합 도메인 폴리펩티드 및 단일쇄 폴리펩티드의 친화도는 통상적인 기술을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다 (예를 들어, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; 및 미국 특허 5,283,173, 5,468,614 또는 이의 등가물 참조).
본원에 사용된 "보존적 치환"은 당 업계에서 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환으로 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 당 업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 1997년 3월 13일 공개된 PCT 출원 공개 번호 WO 97/09433, 10 페이지; Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8 참조).
본원에 사용된 용어 "유도체"는 효소의 존재 또는 부재하에 화학적 또는 생물학적 수단, 예를 들어 글리코실화, 알킬화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성에 의해 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 지정된 폴리펩티드 또는 단백질로부터 "유래된" 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드의 기원을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상기 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 특정 서열 (때때로 "부모" 또는 "모" 서열로 지칭됨)에서 유래되고 모 서열 또는 그의 일부와 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 상기 일부는 적어도 10 내지 20개의 아미노산, 적어도 20 내지 30개의 아미노산, 또는 적어도 30 내지 50개의 아미노산, 또는 적어도 50 내지 150개의 아미노산으로 구성되거나, 그렇지 않으면 모 서열에서 기원을 갖는 것으로 통상의 당 업자에게 확인 가능한 것이다. 예를 들어, 결합 도메인 (예를 들어, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, 단일 도메인 항체 (sdAb) 등)은 항체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 서열 (예를 들어, 5T4- 또는 4-1BB-결합 도메인)은 컴퓨터 알고리즘 또는 실리코에 의해 항체 또는 단백질로부터 유래된다.
다른 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 돌연변이 또는 변형, 예를 들어 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 하나 이상의 아미노산 삽입 또는 결실을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 실시양태에서, 모 폴리펩티드로부터 유래되고 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함하는 폴리펩티드는 "변이체"로 지칭된다. 본원에 사용된 용어 "변이체" 또는 "변이체들"은 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 필수 특성을 유지하지만, 그와는 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로, 변이 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 전체적으로 매우 유사하며, 많은 영역에서 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 동일하다. 예를 들어, 변이 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 활성 부분 또는 전장의 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 비교하여, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변이는 반드시 모 폴리펩티드와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체는 모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 60% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 변이체는 모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만, 약 80% 내지 100% 미만, 약 85% 내지 100% 미만, 약 90% 내지 100 미만, 또는 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가질 것이다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 둘 이상의 폴리펩티드 서열 사이의 관계를 지칭한다. 하나의 서열에서의 위치가 비교기 서열의 상응하는 위치에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기에 의해 점유될 때, 그 서열은 그 위치에서 "동일한" 것으로 일컬어진다. 서열 동일성 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 동일한 위치의 수를 산출함으로써 계산된다. 그런 다음 동일한 위치의 수를 비교 창의 총 위치 수로 나눈 후 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출한다. 서열 동일성 백분율은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된다. 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 비교 창은 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이상의 핵산 길이일 수 있다. 폴리펩티드 서열에 대한 비교 창은 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 비교를 위해 서열을 최적으로 정렬시키기 위해, 비교 창에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 기준 서열이 일정하게 유지되는 동안 간격으로 지칭되는 첨가 또는 결실을 포함할 수 있다. 최적의 정렬은 간격이 있어도 기준 및 비교기 서열 사이에서 가능한 한 많은 "동일한" 위치를 생성하는 정렬이다. 두 서열 사이의 "서열 동일성" 백분율은 2004년 9월 1일 현재 국립 생명 공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information)에서 이용 가능한 프로그램 "BLAST 2 서열"의 버전을 사용하여 결정될 수 있으며, 이 프로그램은 BLASTN (뉴클레오티드 서열 비교용) 및 BLASTP (폴리펩티드 서열 비교용) 프로그램을 포함하고, 이들 프로그램은 Karlin 및 Altschul의 알고리즘을 기반으로 한다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (12): 5873-5877, 1993). "BLAST 2 서열"을 사용할 때, 2004년 9월 1일 현재 기본 파라미터인 파라미터를 단어 크기 (3), 개방 간격 벌점 (11), 확장 간격 벌점 (1), 간격 드롭 오프 (50), 기대 값 (10), 및 매트릭스 옵션을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 필수 파라미터로 사용될 수 있다. 두 서열이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 경우, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 "실질적으로 유사한 서열 동일성" 또는 "실질적 서열 동일성"을 갖는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 제공되지 않는 한, 면역 글로불린 분자의 가변 영역에서 아미노산 잔기의 위치는 IMGT 기준 (Brochet et al., Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508) 또는 EU 명명법 (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94)에 따라 넘버링되며, 면역 글로불린 분자의 불변 영역에서 아미노산 잔기의 위치는 EU 명명법 (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94) 에 따라 넘버링된다. 카밧 (Kabat) 넘버링 컨벤션 (Kabat, 면역학적 관심 단백질의 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest), 5th ed. Bethesda, MD: National Institutes of Health (1991))은 면역 글로불린 분자의 가변 영역에서 아미노산 잔기의 위치를 지칭하는 데 사용되는 대체 시스템이며, 때때로 면역 글로불린 분자의 가변 영역에서 아미노산 잔기의 위치를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "이량체"는 공유 결합 (예를 들어, 이황화 결합) 및 다른 상호 작용 (예를 들어, 정전기 상호 작용, 염 가교, 수소 결합 및 소수성 상호 작용)을 포함하는 분자간 힘의 하나 이상의 형태를 통해 서로 연관된 두 개의 하위 단위로 구성된 생물학적 실체를 지칭하며, 적절한 조건 (예를 들어, 생리학적 조건, 재조합 단백질의 발현, 정제 및/또는 저장에 적합한 수용액, 또는 비변성 및/또는 비환원 전기 영동을 위한 조건)에서 안정하다. 본원에 사용된 용어 "이종이량체" 또는 "이종이량체 단백질"은 2개의 상이한 폴리펩티드로부터 형성된 이량체를 지칭한다. 이종이량체는 본원에 기재된 바와 같은 항-5T4 x 항-4-1BB 분자를 포함할 수 있다. 이종이량체는 4 개의 폴리펩티드 (즉, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄)로부터 형성된 항체를 포함하지 않는다. 본원에 사용된 용어 "동종이량체" 또는 "동종이량체 단백질"은 2개의 동일한 폴리펩티드로부터 형성된 이량체를 지칭한다.
"Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 세포상의 Fc 수용체 및/또는 보체의 C1q 성분에 결합하여 항체의 작용기 기능을 매개할 수 있는 공급원 항체의 부분에 상응하거나 이로부터 유래된 폴리펩티드 서열을 지칭한다. Fc는 단백질 결정을 쉽게 형성할 항체의 단편인 "단편 결정"을 의미한다. 단백질 분해로 원래 설명된 뚜렷한 단백질 단편은 면역 글로불린 단백질의 전반적인 일반 구조를 정의할 수 있다. 문헌에 원래 정의된 바와 같이, Fc 영역은 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드를 포함하고 각각 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 동종이량체 단백질이다. 그러나, 보다 최근에는 이 용어가 CH3, CH2, 및 제2의 이러한 쇄와 이황화 연결된 이량체를 형성하기에 충분한 힌지의 적어도 일부로 구성된 단일쇄 단량체 성분에 적용되었다. 이와 같이, 문맥에 따라, 용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 본원에서 이량체 형태, 또는 이량체 단백질을 형성하기 위해 회합되는 개별 단량체를 지칭할 것이다. 면역 글로불린 구조 및 기능에 대한 검토는 Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp. 49-140; 및 Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994를 참조한다. 본원에 사용된 용어 Fc는 자연 발생 서열의 변이체를 포함한다.
"면역 글로불린 불변 영역" 또는 "불변 영역"은 면역 글로불린의 하나 이상의 불변 도메인의 일부 또는 전부에 상응하거나 이로부터 유래된 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭하는 것으로 본원에 정의된 용어이다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 IgG CH2 및 CH3 도메인, 예를 들어 IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 CH1 도메인을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 불변 영역을 구성하는 불변 도메인은 인간이다. 일부 실시양태에서 (예를 들어, 41BB-결합 폴리펩티드, 5T4-결합 폴리펩티드 또는 이의 다중특이적 폴리펩티드의 특정 변형에서), 본 개시내용의 융합 단백질의 불변 영역은 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와 같은 일부 Fc 수용체에 결합하는 능력을 유지하고 생체 내에서 비교적 긴 반감기를 유지하면서 이펙터 기능을 갖지 않거나 이펙터 기능을 최소로 갖는다. 예를 들어, 본 개시내용의 융합 단백질의 불변 영역은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포-매개 식균작용 (ADCP), 보체 활성화, 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)의 유도를 일으키지 않거나 실질적으로 감소시킨다. 다른 변이에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 ADCC 및 CDC 중 하나 또는 둘 다와 같은 하나 이상의 이펙터 기능을 보유하는 불변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 결합 도메인은 인간 IgG1 불변 영역에 융합되며, 여기서 IgG1 불변 영역은 돌연변이된 하기 아미노산 중 하나 이상을 갖는다: 위치 234의 류신 (L234), 위치 235의 류신 (L235), 위치 237의 글리신 (G237), 위치 318의 글루타메이트 (E318), 위치 320의 라이신 (K320), 위치 322의 라이신 (K322), 또는 이들의 조합 (EU에 따른 넘버링). 예를 들어, 이들 아미노산 중 임의의 하나 이상이 알라닌으로 변경될 수 있다. 추가의 실시양태에서, IgG1 Fc 도메인은 알라닌 (즉, 각각 L234A, L235A, G237A, E318A, K320A 및 K322A)으로 돌연변이된 L234, L235, G237, E318, K320, 및 K322 (EU 넘버링에 따름) 각각, 및 임의로 N297A 돌연변이 (즉, 본질적으로 CH2 도메인의 글리코실화를 제거)를 가진다.
용어 "경쇄 가변 영역"("경쇄 가변 도메인" 또는 "VL"이라고도 함) 및 "중쇄 가변 영역"("중쇄 가변 도메인" 또는 "VH"라고도 함)은 각각 항체 경쇄 및 중쇄로부터의 가변 결합 영역을 지칭한다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역"(CDR) 및 "프레임워크 영역"(FR)으로 알려진 불연속의 잘 정의된 하위 영역으로 구성된다. 한 실시양태에서, FR은 인간화된다. 용어 "CL"은 "면역 글로불린 경쇄 불변 영역" 또는 "경쇄 불변 영역", 즉 항체 경쇄로부터의 불변 영역을 지칭한다. 용어 "CH"는 "면역 글로불린 중쇄 불변 영역" 또는 "중쇄 불변 영역"을 지칭하며, 이는 항체 이소형에 따라 CH1, CH2 및 CH3 (IgA, IgD, IgG), 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 (IgE, IgM)으로 추가로 나누어질 수 있다. "Fab" (단편 항원 결합)은 항원에 결합하고 쇄간 이황화 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역 및 CH1 도메인을 포함하는 항체의 일부이다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 일반적으로 폴리펩티드의 2개의 서브 도메인을 연결하는 짧은 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 링커의 비제한적 예는 글리신-세린 반복체를 포함하는 가요성 링커, 및 (a) 막 통과 단백질의 도메인 간 영역 (예를 들어, I형 막 통과 단백질); (b) II형 C-렉틴의 줄기 영역; 또는 (c) 면역 글로불린 힌지로부터 유래된 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 생성된 폴리펩티드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화성을 유지하도록 2개의 서브-결합 도메인의 상호 작용에 적합한 스페이서 기능을 제공한다. 특정 실시양태에서, 링커는 5 내지 약 35개의 아미노산, 예를 들어 약 15 내지 약 25개의 아미노산으로 구성된다. 본원에 사용된 어구 "CH3과 CH1 또는 CL 사이의 링커"는 CH3 도메인 (예를 들어, 야생형 CH3 또는 돌연변이된 CH3)의 C-말단 및 CH1 도메인 또는 CL 도메인 (예를 들어, Cκ)의 N-말단 사이의 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, 약 2 내지 12, 약 2 내지 10, 약 4 내지 10, 약 5 내지 10, 약 6 내지 10, 약 7 내지 10, 약 8 내지 10, 약 9 내지 10, 약 8 내지 12, 약 9 내지 12, 또는 약 10 내지 12)를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 문맥에 따라, 링커는 (1) 단일쇄 Fv (scFv) 중 VH 및 VL 영역 사이의 폴리펩트드 영역, 또는 (2) 두 개의 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드에서 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 사이의 폴리펩티드 영역을 지칭할 수 있다. 링커가 둘 이상의 결합 도메인을 연결하는 후자의 예에서, 이러한 링커는 본원에서 "결합 도메인 링커"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 둘 이상의 결합 도메인을 직접 링크 또는 연결하여, 다음 구조를 포함하는 작제물을 생성할 수 있다: 결합 도메인 - 결합 도메인 링커 - 결합 도메인. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (i) 제1 결합 도메인, (ii) 결합 도메인 링커, 및 (iii) 제2 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (i) 제2 결합 도메인, (ii) 결합 도메인 링커, 및 (iii) 제1 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 하나 이상의 결합 도메인을 비결합 도메인 폴리펩티드, 예컨대 면역 글로불린 Fc 도메인 (즉, Ig 힌지 - 불변 영역의 구조를 포함하는 폴리펩티드)에 연결시킴으로써 둘 이상의 결합 도메인을 링크 또는 연결할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 생성된 작제물은 다음 구조를 포함할 수 있다: 결합 도메인 - Fc 도메인 - 결합 도메인 링커 - 결합 도메인. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 (i) 제1 결합 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 결합 도메인 링커, 및 (v) 제2 결합 도메인을 차례로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 (i) 제2 결합 도메인, (ii) 결합 도메인 링커, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 힌지 영역, 및 (v) 제1 결합 도메인을 차례로 포함한다. 2개의 결합 도메인 (예를 들어, 결합 도메인 링커)을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드에서 면역 글로불린 불변 영역과 제2 결합 도메인 사이의 폴리펩티드 영역은 또한 다중특이적 폴리펩티드 내의 도메인의 배향에 따라 "카르복실-말단 링커" 또는 "아미노-말단 링커"로 지칭될 수 있다. 링커의 비제한적인 예는 표 1에 제공된다.
일부 실시양태에서, "힌지" 또는 "힌지 영역"은 면역 글로불린 힌지 영역으로부터 유래되고, 본원에 기재된 폴리펩티드에서 결합 도메인 (예를 들어, 5T4-결합 도메인 또는 4-1BB-결합 도메인)과 면역 글로불린 불변 영역 사이에 위치한 폴리펩티드를 지칭한다. "야생형 면역 글로불린 힌지 영역"은 (IgG, IgA 및 IgD의 경우) CH1 및 CH2 도메인 사이에 존재하고 CH1 및 CH2 도메인을 연결하거나, (IgE 및 IgM의 경우) 항체의 중쇄에서 발견되는 CH1 및 CH3 도메인 사이에 존재하고 CH1 및 CH3 도메인을 연결하는 자연적으로 발생하는 상부 및 중간 힌지 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 야생형 면역 글로불린 힌지 영역 서열은 인간이고, 인간 IgG 힌지 영역 (예를 들어, 및 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 영역)을 포함할 수 있다.
"변경된 면역 글로불린 힌지 영역" 또는 "변이 면역 글로불린 힌지 영역"은 상응하는 모 야생형 면역 글로불린 힌지 영역과 비교하여 하나 이상의 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 힌지 영역 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변경된 면역 글로불린 힌지 영역은 야생형 면역 글로불린 힌지 영역과 70% 이상 상동성이다 (예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성). 특정 실시양태에서, 변경된 면역 글로불린 힌지 영역은 약 5개의 아미노산 (예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산)에서 최대 약 120개의 아미노산 (예를 들어, 약 10 내지 약 40개의 아미노산, 또는 약 15 내지 약 30개의 아미노산, 또는 약 15 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 20 내지 약 25개 아미노산의 길이를 가짐) 길이를 갖는 야생형 면역 글로불린 힌지 영역의 단편이다. 일반적으로, 야생형 면역 글로불린 힌지 영역의 단편인 변경된 면역 글로불린 힌지 영역은 미국 특허 출원 공개 공보 2013/0129723 및 2013/0095097에 개시된 바와 같이 IgG의 코어 힌지 영역 (예를 들어, 서열 C-X-X-C을 포함하는 폴리펩티드, 여기서 X는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 힌지의 비제한적인 예는 표 1에 제공된다.
본원에 사용된 용어 "인간화된"은 비-인간 종 (예를 들어, 마우스 또는 쥐)으로부터 유래된 항체 또는 면역 글로불린 결합 단백질 및 폴리펩티드를 유전자 공학 기술을 이용하여 원래의 항체의 항원-결합 성질을 유지하면서도 인간에게 덜 면역원성으로 만드는 과정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역 글로불린 결합 단백질 및 폴리펩티드의 결합 도메인(들) (예를 들어, 경쇄 및 중쇄 가변 영역, Fab, scFv)은 인간화된다. 비-인간 결합 도메인은 CDR 이식 (Jones et al., Nature 321:522 (1986)) 및 "재형성" (Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), "과도체화" (Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86 : 10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154) 및 "베니어링" (Mark, et al., "치료적 활성 인간화 및 베니어링된 항-CD18 항체의 유도 (Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies.)" In: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. 세포 접착:치료 잠재력에 대한 분자 정의 (Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential). 뉴욕: Plenum Press, 1994:291-312)을 포함한 이들의 변형으로 알려진 기술을 이용하여 인간화될 수 있다. 비인간 공급원으로부터 유래된 경우, 힌지 영역 및 불변 영역 도메인과 같은 항체 또는 면역 글로불린 결합 단백질 및 폴리펩티드의 다른 영역도 인간화될 수 있다. 이들 폴리펩티드가 항체가 아니더라도, 당해 분야의 인간화 항체에 대한 지식은 본 개시내용에 따른 폴리펩티드에 적용 가능하다.
본원에 사용된 용어 "필요로 하는 환자"는 여기에 제공된 5T4-결합 단백질 또는 다중특이적 폴리펩티드 또는 그의 조성물로 치료 또는 개선될 수 있는 질환, 장애 또는 상태의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "제약학적으로 허용되는"은 당 업계에 공지된 경로를 사용하여 투여될 때 일반적으로 알레르기 또는 다른 심각한 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 특히 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 다른 약전에 등재된 분자 실체 및 조성물은 "제약학적으로 허용되는" 것으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제를 결합시키는 데 관여하는 DNA 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "핵산", "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 자연 뉴클레오티드의 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 변성 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택되는 (또는 모든) 코돈의 제 3 위치가 혼합-기재 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 변성 코돈 치환이 달성될 수 있다 (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). 핵산이라는 용어는 유전자에 의해 코딩된 유전자, cDNA 및 mRNA와 상호 교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 용어 "핵산", "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자 (예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 이의 유도체, 단편 및 상동체를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "발현"은 핵산에 의해 코딩된 생성물의 생합성을 지칭한다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 세그먼트의 경우, 발현은 핵산 세그먼트의 mRNA로의 전사 및 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다.
용어 "발현 단위" 및 "발현 카세트"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 관심 폴리펩티드를 코딩하고 숙주 세포에서 핵산 세그먼트의 발현을 제공할 수 있는 핵산 세그먼트를 나타낸다. 발현 단위는 전형적으로 전사 프로모터, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 및 전사 터미네이터를 모두 작동 가능한 구성으로 포함한다. 전사 프로모터 및 터미네이터 이외에, 발현 단위는 예를 들어 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호와 같은 다른 핵산 세그먼트를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 단위를 포함하는 선형 또는 원형의 핵산 분자를 지칭한다. 하나 이상의 발현 단위 이외에, 발현 벡터는 또한 예를 들어 하나 이상의 복제 기점 또는 하나 이상의 선별 마커와 같은 추가적인 핵산 세그먼트를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "폴리펩티드", "폴리펩티드 쇄" 또는 "단백질"은 공유 연결된 아미노산의 단일의 선형 및 연속 배열을 지칭한다. 폴리펩티드는 하나 이상의 쇄내 이황화 결합을 형성할 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드와 관련하여, 서열 번호로 특정된 것에 상응하는 아미노산 잔기의 변형(modification) 또는 변경(alternation)에 대한 언급은 이러한 잔기의 번역 후 변형을 포함한다. 용어 폴리펩티드 및 단백질은 또한 2개의 폴리펩티드 쇄가 쇄간 이황화 결합을 통해서와 같이 비선형 방식으로 서로 연결되는 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 천연 면역 글로불린 분자는 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 폴리펩티드로 구성된다. 각각의 중쇄 폴리펩티드는 중쇄와 경쇄 폴리펩티드 사이의 쇄간 이황화 결합에 의해 경쇄 폴리펩티드와 회합하여 2개의 이종이량체 단백질 또는 폴리펩티드 (즉, 2개의 이종 폴리펩티드 쇄를 포함하는 단백질)를 형성한다. 이어서, 2개의 이종이량체 단백질은 중쇄 폴리펩티드들 사이의 추가적인 쇄간 이황화 결합에 의해 회합하여 면역 글로불린 단백질 또는 폴리펩티드를 형성한다. 여기서, 단백질 또는 폴리펩티드는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 scFv-Fc-scFv 단백질, scFv-scFv 이량체 또는 디아바디일 수 있다.
당업자에게 이해될 바와 같이, 단백질 및 폴리펩티드는 개별 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열과 관련하여 본원에 정의되어 있으며, 이는 본 명세서 전체에 걸쳐 서열 번호 참조로 표시되어 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 scFv-Fc-scFv 단백질 또는 폴리펩티드는 이량체 scFv-Fc-scFv 단백질 (예를 들어, 동종이량체 또는 이종이량체 scFv-Fc-scFv 단백질)을 형성하기 위해 쇄간 결합 (예를 들어, 쇄간 이황화 결합)에 의해 회합된 2개의 scFv-Fc-scFv 폴리펩티드 쇄로 구성된다 (예를 들어, 도 10 참조). 이러한 실시양태에서, scFv-Fc-scFv 단백질은 개별 scFv-Fc-scFv 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열에 의해 정의된다. 폴리펩티드 및 단백질은 또한 비-펩티드 성분, 예컨대 탄수화물기를 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드성 치환체는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질 또는 폴리펩티드에 첨가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 단백질 및 폴리펩티드는 본원에서 아미노산 골격 구조로 정의되고; 탄수화물기와 같은 치환기는 일반적으로 특정되지 않지만 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
용어 "아미노-말단" 및 "카르복실-말단"은 폴리펩티드 내의 위치를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 문맥상 허용되는 경우, 이들 용어는 근접성 또는 상대 위치를 나타내기 위해 폴리펩티드의 특정 서열 또는 부분을 참조하여 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드 내의 기준 서열로의 카르복실-말단에 위치한 특정 서열은 기준 서열의 카르복실-말단에 근접하여 위치하지만, 반드시 완전한 폴리펩티드의 카르복실-말단에 있는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "형질 전환", "형질 감염" 및 "형질 도입"은 핵산 (즉, 뉴클레오티드 중합체)의 세포로의 전이를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "유전자 형질 전환"은 DNA, 특히 재조합 DNA를 세포 내로 전이시키고 혼입시키는 것을 의미한다. 전이된 핵산은 발현 벡터를 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 사용된 "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 FcγRs를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포 및 대식세포와 같은 단핵구 세포)가 표적 세포상의 결합된 항체 (또는 FcγRs에 결합할 수 있는 다른 단백질)를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 과정을 지칭한다. 원칙적으로, 활성화 FcγR을 갖는 이펙터 세포는 ADCC를 매개하기 위해 트리거될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포는 FcγRIII만을 발현하는 NK 세포인 반면, 단핵구는 활성화, 국소화 또는 분화 상태에 따라 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현할 수 있다. 조혈 세포에서의 FcγR 발현의 검토에 대해서는, 예를 들어, Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92를 참조한다.
폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본원에 사용된 용어 "ADCC 활성을 갖는"은 예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1)로부터 유래된 것과 같이 Fc 도메인 (예를 들어, 면역 글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 면역 글로불린 불변 영역)을 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 단백질이 세포 용해 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRIII)의 결합을 통해 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 Fc 수용체 (예를 들어, NK 세포)를 발현하는 세포 용해 면역 이펙터 세포 상에 매개할 수 있음을 의미한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)은 CH2 및/또는 CH3 도메인에서의 돌연변이의 결과로서 이펙터 기능 (예를 들어, 널 ADCC 활성)이 결여될 수 있다.
본원에 사용된 "보체-의존적 세포독성" 및 "CDC"는 정상 혈청의 성분 ("보체")이 표적 항원에 결합된 항체 또는 다른 C1q-보체-결합 단백질과 함께 표적 항원을 발현하는 표적 세포의 용해를 나타내는 과정을 지칭한다. 보체는 효과를 발휘하기 위해 일제히 그리고 순서대로 작동하는 혈청 단백질 그룹으로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "고전적 보체 경로" 및 "고전적인 보체 시스템"은 동의어이며 보체의 활성화를 위한 특정 경로를 지칭한다. 고전적인 경로는 개시를 위한 항원-항체 복합체를 필요로 하며, 순서대로 C1 내지 C9로 지정된 9개의 주요 단백질 성분의 활성화를 포함한다. 활성화 과정의 여러 단계에서, 생성물은 후속 단계를 촉매하는 효소이다. 이 캐스케이드는 비교적 작은 초기 신호에 의해 많은 양의 보체의 증폭 및 활성화를 제공한다.
폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본원에 사용된 용어 "CDC 활성을 갖는"은 예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1)로부터 유래된 것과 같이 Fc 도메인 (예를 들어, 면역 글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 면역 글로불린 불변 영역)을 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 단백질이 C1q 보체 단백질의 결합 및 고전적인 보체 시스템의 활성화를 통해 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 매개할 수 있음을 의미한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)은 CH2 및/또는 CH3 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이의 결과로서 이펙터 기능 (예를 들어, 널 CDC 활성)이 결여될 수 있다.
본원에 사용된 "향상된 이펙터 세포 활성화"는 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질에 의한 이펙터 세포 반응의 증가, 연장 및/또는 강화를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 향상된 이펙터 세포 활성화는 이펙터 세포의 세포독성 활성의 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 향상된 이펙터 세포 활성화는 표적 세포를 용해시키는 이펙터 세포의 능력이 향상되도록 하는 사이토카인 생성, 세포 증식, 또는 세포-표면 분자 발현의 변화를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 단백질은 Wnt/β-카테닌 신호 전달을 조절함으로써 이펙터 세포 활성화를 향상시킨다.
본원에 사용된 용어 "이펙터 세포"는 종양 세포와 같은 표적 세포를 용해 또는 사멸시킬 수 있는 면역계의 세포를 지칭한다. 여기서, 이펙터 세포는 림프구, 예컨대 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포 또는 NKT 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 과립구를 의미할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이펙터 세포라는 용어는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료", "치료하는" 또는 "경감"은 치료적 치료 또는 예방적(prophylactic)/예방적(preventative) 치료를 지칭한다. 치료는 치료를 받는 개체에서 적어도 하나의 질병의 증상이 개선되거나 치료가 개체에서 진행성 질병의 악화를 지연시키거나 추가적인 관련 질병의 발병을 예방할 수 있는 경우 치료법이다.
본원에 사용된 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 이의 조성물의 "치료 유효량 (또는 용량)" 또는 "유효량 (또는 용량)"의 용어는 통계적으로 유의미한 방식으로 또는 통계적으로 유의미한 장기(organ) 기능의 개선으로 치료되는 질환의 하나 이상의 증상의 경감을 초래하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. 단독으로 투여되는 개별 활성 성분을 언급할 때, 치료적 유효 용량은 그 성분 단독을 지칭한다. 조합물을 언급할 때, 치료적 유효 용량은 연속적으로 또는 동시에 (동일한 제제로 또는 동시에 개별 제제로) 투여되는 지에 상관없이 치료 효과를 가져오는 활성 성분의 조합된 양을 지칭한다.
여기서, "통계적 유의미성"이라는 용어는 우연히 발생하는 테스트 결과를 얻을 확률을 의미한다. 예를 들어, 순전히 우연히 발생할 확률 (p)이 사전 결정된 통계 임계값 (a)보다 작거나 p < a 인 경우, 관찰 또는 테스트 결과는 통계적으로 유의하다고 한다. 특정 테스트에 대한 통계적 역치는 당 업계에 공지된 데이터 및 규약의 특성에 따라 설정될 수 있다. 예를 들어, a 는 통상적으로 5% (0.05)로 설정되어, 주어진 결과에 대해 상기 결과가 통계적으로 유의한 것으로 간주되도록 하기 위해서 p < 0.05이다.
본원에 사용된 "5T4-결합 도메인"은 TPBG 및 Wnt-활성화 억제 인자 1 (WAIF1)로도 알려진 종양성 영양막 당 단백질 (5T4) (예를 들어, 인간 5T4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 폴리펩티드의 도메인을 지칭한다. 5T4는 단백질-단백질 상호 작용과 관련된 몇 가지 류신-풍부 반복체를 갖는 크게 N-당화된 단백질인 72kD 종양성 당 단백질이다. 용어 "5T4"는 5T4의 임의의 이소형을 지칭할 수 있다. 예시적인 인간 5T4 뉴클레오티드 서열이 하기 표 1에 도시되어 있고 서열 번호 163 및 167에 제공되어 있고, 예시적인 인간 5T4 아미노산 서열이 서열 번호 164 및 168에 제공되어 있다.
본원에 사용된 "4-1BB-결합 도메인"은 인간 4-1BB (CD137로도 공지됨)에 특이적으로 결합할 수 있는 본원에 기재된 단백질 또는 폴리펩티드의 결합 도메인을 지칭한다. 용어 "4-1BB"는 4-1BB의 임의의 이소형을 지칭할 수 있다. 예시적인 인간 4-1BB 뉴클레오티드 서열은 하기 표 1에 도시되어 있고 서열 번호 161 및 165에 제공되며, 예시적인 인간 4-1BB 아미노산 서열은 서열 번호 162 및 166에 제공된다.
본원에 사용된 "다중특이적 폴리펩티드"는 각각 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 폴리펩티드는 2, 3, 4개 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있고, 2, 3, 4개 이상의 표적 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 이중특이적 폴리펩티드이다. 본원에서, "이중특이적 폴리펩티드"는 2개의 결합 도메인을 포함하고 2개의 별개의 표적 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 폴리펩티드는 표적 세포, 예컨대 5T4 상에서 발현되는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 폴리펩티드는 이펙터 세포, 예컨대 4-1BB 상에서 발현되는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중특이적 폴리펩티드는 scFv-Fc-scFv 형식의 ADAPTIRTM 동종이량체 이중특이적 폴리펩티드이다.
스캐폴드를 사용하는 다중특이적 폴리펩티드는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2007/146968; WO 2010/040105; WO 2010/003108; WO 2016/094873; WO 2017/053469; 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0051844; 및 미국 특허 번호 7,166,707; 및 8,409,577에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 다중특이적 폴리펩티드는 이중특이적 폴리펩티드이고, 본원에서 ADAPTIRTM 폴리펩티드 또는 형식 1로도 지칭되는 scFv-Fc-scFv 구조를 포함할 수 있으며, 이의 예시적인 실시양태는 도 10에 도시되어 있다. 형식 1 구조를 포함하는 폴리펩티드의 구조는 N-말단에서 C-말단까지: 제1 scFv 결합 도메인 - 면역 글로불린 (Ig) 힌지 영역 - Ig 불변 영역 - 제2 scFv 결합 도메인을 포함한다 (도 10). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 다중특이적 폴리펩티드는 IgG-scFv 구조 (본원에서 모리슨 형식 또는 형식 2로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 형식 2 구조를 포함하는 폴리펩티드의 구조는 N-말단에서 C-말단까지: scFv 결합 도메인 - Ig 불변 영역 - Ig 힌지 영역 - Ig 가변 영역을 포함한다. 형식 2는 본질적으로 C-말단 scFv 도메인을 포함하는 온전한 Ig 분자이다.
결합 폴리펩티드 및 단백질
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 5T4에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드) 뿐만 아니라 이들 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 및 단백질을 기술한다. 이러한 실시양태는 5T4-결합 폴리펩티드로 지칭될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 이펙터 세포상의 세포-표면 분자에 결합할 수 있는 5T4-결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 5T4-결합 도메인 및 4-1BB에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 (예를 들어, 4-1BB-결합 도메인)을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지: 5T4-결합 도메인 - Fc 도메인의 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드, 및 이들 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 및 단백질을 기술한다. 이러한 실시양태는 4-1BB-결합 폴리펩티드로 지칭될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 4-1BB-결합 도메인 및 표적 세포상의 세포-표면 분자에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 4-1BB-결합 도메인 및 5T4에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 (예를 들어, 5T4-결합 도메인)을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지: 4-1BB-결합 도메인 - Fc 도메인의 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 면역 글로불린 불변 영역, 링커 펩티드, 힌지 영역, 면역 글로불린 이량체화/이종이량체화 도메인, 접합 아미노산, 태그 등을 추가로 포함할 수 있다. 개시된 폴리펩티드 및 단백질의 이들 성분은 하기에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 결합 도메인은 임의의 다양한 상이한 형태의 항체 또는 융합 단백질의 형태일 수 있다 (예를 들어, 융합 단백질은 이중특이적 또는 다중특이적 분자의 형태일 수 있다). 이중특이적 분자의 비제한적 예는 scFv-Fc-scFv 분자 (예를 들어, 형식 1의 구조를 포함하는 이중특이적 단백질), scFv-Ig 분자 (예를 들어, 형식 2의 구조를 포함하는 이중특이적 단백질) 및 scFv-scFv 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 분자는 제2 결합 도메인 scFv에 연결된 제1 결합 도메인 scFv를 포함하거나 이로 구성되며 면역 글로불린 불변 영역과 같은 다른 서열을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 이중특이적 단백질은 디아바디이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 단백질은 약물 또는 독성 모이어티에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 표 2 내지 10에 나타낸 서열 아미노산 및/또는 핵산을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 결합 도메인은 (i) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 의 CDR들을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 및 (ii) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 CDR들을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 작제물에 제공된 아미노산 서열은 인간 면역 글로불린 리더 서열을 포함하지 않는다. 도시된 CDR 서열 및 아미노산 치환 위치는 IMGT 기준 (Brochet et al, Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508)을 사용하여 정의된 것들이다. 일부 경우에, 표 2 내지 10을 포함하여 본 명세서에 도시된 서열은 모 서열 (예를 들어, 항-4-1BB 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 PCT 출원 공개 번호 WO 2016/185016에 개시된 클론 1618/1619, 또는 항-5T4 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 PCT 출원 공개 번호 WO 2016/185016에 개시된 것들)에 대한 아미노산 치환을 함유한다. 일부 실시양태에서, 항-5T4 결합 도메인의 모 서열은 서열 번호 38 및 68에 제공된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-4-1BB-결합 도메인의 모 서열은 서열 번호 28 및 16에 제공된 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 항-4-1BB 및 항-5T4 결합 도메인에 대한 예시적인 모 서열은 하기 표 2에 제시되어 있다. 밑줄 친 텍스트는 CDR 서열을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 결합 도메인 VL 및/또는 VH 영역은 모 VL 및/또는 VH 영역의 VL 및/또는 VH로부터 유래되고 (예, PCT 출원 공개 번호 WO 2016/185016에 기재된 1618/1619), 공지된 단일 클론 항체의 VL 및/또는 VH 서열과 비교할 때, 선택적으로 약 하나 이상의 (예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 삽입, 약 하나 이상의 (예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 결실, 약 하나 이상 (예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 아미노산 치환 (예, 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환), 또는 상기 인용된 변화의 조합을 포함한다. 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 아미노 - 또는 카르복실-말단 또는 이 영역의 양단을 포함하여 VL 및/또는 VH 영역 어딘가에 있을 수 있되, 단, 각각의 CDR이 0개의 변화 또는 최대 1, 2 또는 3개의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수정된 VL 및/또는 VH 영역을 포함하는 결합 도메인은 모 결합 도메인보다 유사하거나 큰 친화성으로 표적에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합 도메인은 항체로부터 유도되고, 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 예를 들어, scFv는 VH 및 VL 쇄를 포함한다. 이들 결합 도메인 및 가변 쇄는 표적(들)에 대한 일부 결합을 여전히 유지하는 임의의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 가변 VH 5T4 - VL 5T4 - VH 4-1BB - VL 4-1BB; VL 5T4 - VH 5T4 - VH 4-1BB - VL 4-1BB; VH 5T4 - VL 5T4 - VL 4-1BB - VH 4-1BB; VL 5T4 - VH 5T4 - VL 4-1BB - VH 4-1BB; VH 4-1BB - VL 4-1BB - VH 5T4 - VL 5T4; VL 4-1BB - VH 4-1BB - VL 5T4 - VH 5T4; VH 4-1BB - VL 4-1BB - VL 5T4 - VH 5T4; 또는 VL 4-1BB - VH 4-1BB - VH 5T4 - VL 5T4의 순서로 배열될 수 있다. 4-1BB에 결합하는 결합 도메인 및/또는 5T4에 결합하는 결합 도메인에서 VH 영역 및 VL 영역의 쌍은 단일쇄 항체 (scFv)의 형식일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 scFv인 결합 도메인을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 결합 도메인은 scFv 도메인으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 관심 표적에 특이적인 VH 및 VL 영역을 포함하는 단일쇄 Fv 단편(scFv)이다. 특정 실시양태에서, VH 및 VL 영역은 인간 또는 인간화된다. 일부 변형에서, 결합 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결되는 VL 및 VH 영역을 포함하는 단일쇄 Fv (scFv)이다.
VL 및 VH 영역의 연결에 펩티드 링커의 사용은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 다수의 출판물이 이 특정 분야 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 아미노산 서열의 3개의 반복체 ((Gly4Ser)3) (서열 번호 96)로 구성된 15mer이다. 적절한 링커 서열을 다양화하고 선택하기 위해, 다른 링커가 사용되었으며, 선택적 감염성 파지 기술뿐만 아니라 파지 디스플레이 기술이 이용되었다 (Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998). 특정 실시양태에서, VL 및 VH 영역은 화학식 (Gly4Ser)n을 포함하는 아미노산 서열 (여기서 n = 1 내지 5)을 갖는 펩티드 링커에 의해 연결된다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시양태에서, 링커는 (Gly4Ser)4를 포함한다. 임의의 돌연변이 유발을 통해 간단한 링커 (예를 들어, (Gly4Ser)n)를 최적화함으로써 다른 적합한 링커를 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 scFv의 VH 영역은 링커 서열에 N-말단으로 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 scFvs의 VL 영역은 링커 서열에 C-말단으로 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 scFv를 동일한 배향으로 동일한 VH 및 VL 영역 서열을 포함하는 항체보다 효과적으로 5T4 및/또는 4-1BB와 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, scFv는 VH-VL 배향보다 VL-VH 배향에서 5T4 및/또는 4-1BB에 보다 효과적으로 결합할 수 있거나 그 반대일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 결합 도메인을 연결하는 (예를 들어, scFv 도메인을 연결하는) 결합 도메인 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 Gly4Ser 링커이다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 아미노산 서열의 4개의 반복체 ((Gly4Ser)3) (서열 번호 98)로 구성된 20mer이다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 링커는 서열 번호 86 내지 108로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 적절한 링커 서열을 다양화하고 선택하기 위해, 다른 링커가 사용되었으며, 선택적 감염성 파지 기술뿐만 아니라 파지 디스플레이 기술이 이용되었다 (Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998). 특정 실시양태에서, VL 및 VH 영역은 화학식 (Gly4Ser)n을 포함하는 아미노산 서열 (여기서 n = 1 내지 5)을 갖는 펩티드 링커에 의해 연결된다. 임의의 돌연변이 유발을 통해 간단한 링커 (예를 들어, (Gly4Ser)n)를 최적화함으로써 다른 적합한 링커를 얻을 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 분자는 4-1BB에 대한 scFv 결합에 연결된 5T4에 대한 scFv 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 분자는 힌지 영역 또는 불변 영역을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 추가로 힌지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지는 야생형 면역 글로불린 힌지 영역에서 하나 이상의 시스테인 잔기가 하나 이상의 다른 아미노산 잔기 (예를 들어, 세린 또는 알라닌)로 치환된 변경된 면역 글로불린 힌지이다. 예시적인 변경된 면역 글로불린 힌지, 카르복실-말단 링커 및 아미노-말단 링커는 1, 2 또는 3개의 상이한 아미노산 잔기 (예를 들어, 세린 또는 알라닌)에 의해 치환된 야생형 인간 IgG1 힌지에서 발견되는 1, 2 또는 3개의 시스테인 잔기를 갖는 면역 글로불린 인간 IgG1 힌지 영역을 포함한다. 변경된 면역 글로불린 힌지는 추가로 다른 아미노산 (예를 들어, 세린 또는 알라닌)으로 치환된 프롤린을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 변경된 인간 IgG1 힌지는 다른 아미노산 잔기 (예를 들어, 세린, 알라닌)에 의해 치환된 야생형 인간 IgG1 힌지 영역의 3개의 시스테인에 카르복실 말단에 위치된 프롤린을 추가로 가질 수 있다. 일 실시양태에서, 코어 힌지 영역의 프롤린은 치환되지 않는다. 특정 실시양태에서, 힌지, 카르복실-말단 링커 또는 아미노-말단 링커 폴리펩티드는 예컨대, 야생형 인간 IgG1 힌지, 야생형 인간 IgG2힌지, 또는 야생형 인간 IgG4 힌지인 서열와 같은 야생형 면역 글로불린 힌지 영역과 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하거나 그 서열이다.
특정 실시양태에서, 다른 폴리펩티드 쇄와 함께 이종이량체를 형성하는 폴리펩티드에 존재하는 힌지는 면역 글로불린 힌지, 예컨대 야생형 면역 글로불린 힌지 영역 또는 이의 변경된 면역 글로불린 힌지 영역일 수 있다. 특정 실시양태에서, 이종이량체 단백질의 하나의 폴리펩티드 쇄의 힌지는 이종이량체의 다른 폴리펩티드 쇄의 상응하는 힌지와 동일하다. 다른 특정 실시양태에서, 하나의 쇄의 힌지는 다른 쇄의 힌지와 (길이 또는 서열에서) 상이하다. 상이한 쇄에서 상이한 힌지는 힌지가 연결된 결합 도메인의 결합 친화도의 상이한 조작을 허용하여, 이종이량체는 다른 결합 도메인의 표적보다 하나의 결합 도메인의 표적에 우선적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 이종이량체 단백질은 하나의 쇄에 4-1BB-결합 도메인 및 다른 쇄에 5T4-결합 도메인을 갖는다. 2개의 쇄에 2개의 상이한 힌지를 갖는 것은 이종이량체가 5T4에 먼저 결합한 다음 4-1BB에 2번째로 결합하게 할 수 있다. 따라서, 이종이량체는 4-1BB-발현 이펙터 세포를 5T4-발현 표적 세포 (예를 들어, 5T4-발현 종양 또는 암 세포)로 동원할 수 있으며, 이는 5T4-발현 세포를 손상시키거나 파괴할 수 있다.
특정 실시양태에서, 카르복실-말단 링커 또는 아미노-말단 링커는 글리신-세린 (예를 들어, Gly4Ser) 반복체를 포함하는 가요성 링커 서열이다. 특정 실시양태에서, 링커는 3개의 Gly4Ser 반복체 (서열 번호 96)에 이어서 프롤린 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프롤린 잔기에는 글리신, 아르기닌 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이 뒤따른다. 일부 실시양태에서, 카르복실-말단 링커 또는 아미노-말단 링커는 서열 번호 86 내지 108로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 개시내용에 따라 사용하기에 적합한 일부 예시적인 힌지, 카르복실-말단 링커 및 아미노-말단 링커 서열은 하기 표 3이다. 추가적인 예시적인 힌지 및 링커 영역은 미국 특허 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 241 내지 244, 601, 78, 763 내지 791, 228, 379 내지 434, 618 내지 749 (상기 서열은 참조에 의해 본원에 포함됨)에 기재되어 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 단백질은 제2의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄에서 다른 이종이량체화 도메인으로 이종이량체화할 수 있는 이종이량체화 도메인을 포함한다. 특정 변형에서, 이종이량체화를 위한 제2 폴리펩티드 쇄는 제2 결합 도메인을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 하나는 제1 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고 다른 하나는 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄가 이량체화되어 이종이량체 결합 단백질을 형성한다. 이량체화/이종이량체화 도메인은 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄로부터 이종이량체를 형성하는 것이 바람직한 경우에 사용될 수 있으며, 여기서 하나 또는 둘 다의 폴리펩티드 쇄는 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 특정 이종이량체의 하나의 폴리펩티드 쇄 구성원은 결합 도메인을 함유하지 않는다. 이종이량체의 유형의 예는 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0095097 및 2013/0129723 및 국제 PCT 공개 번호 WO 2016/094873에 기재된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄는 "면역 글로불린 이량체화 도메인" 또는 "면역 글로불린 이종이량체화 도메인"의 포함을 통해 이량체화된다. "면역 글로불린 이량체화 도메인" 또는 "면역 글로불린 이종이량체화 도메인"은 본원에서 제2 폴리펩티드 쇄의 상이한 면역 글로불린 도메인과 우선적으로 상호 작용하거나 회합하는 제1 폴리펩티드 쇄의 면역 글로불린 도메인을 지칭하되 상이한 면역 글로불린 도메인의 상호 작용은 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 이종이량체화에 실질적으로 기여하거나 이를 효과적으로 촉진한다 (즉, 2개 상이한 폴리펩티드 쇄 사이에서 "이종이량체"로도 지칭되는 이량체의 형성). 이종이량체의 폴리펩티드 쇄의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인이 서로 다르기 때문에 두 쇄의 이종이량체화를 용이하게 하고 하나의 쇄의 동종이량체화를 최소화하도록 차등적으로 변형될 수 있다. 본원에 제공된 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 상이한 폴리펩티드 사이의 효율적인 이종이량체화를 가능하게 하고 생성된 이종이량체 단백질의 정제를 용이하게 한다.
본원에 제공된 바와 같이, 본 개시내용에 따른 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄의 이종이량체화를 촉진하는데 유용한 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 야생형 및 변경된 면역 글로불린 CH1 및 CL 도메인, 예를 들어 인간 CH1 및 CL 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호: 114, 186 내지 192 및 194 각각, 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 114 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 야생형 CH1 도메인, 예컨대 야생형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM CH1 도메인이다. 추가의 실시양태에서, 야생형 면역 글로불린 CL 도메인 (예를 들어, 인간 CL)과 이황화 결합을 형성하는 데 관여하는 야생형 CH1 도메인 (예를 들어, 인간 CH1)의 시스테인 잔기는, 변경된 CH1 도메인과 야생형 CL 도메인 사이에 이황화 결합이 형성되지 않도록, 변경된 면역 글로불린 CH1 도메인에서 결실되거나 치환된다.
특정 실시양태에서, 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 112 및 113 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 각각 제시된 바와 같은 야생형 Cκ 도메인 또는 야생형 Cλ 도메인과 같은 야생형 CL 도메인이다. 추가의 실시양태에서, 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 변경된 면역 글로불린 CL 도메인, 예컨대 변경된 Cκ 또는 Cλ 도메인, 예를 들어 변경된 인간 Cκ 또는 인간 Cλ 도메인이다. 특정 실시양태에서, 야생형 면역 글로불린 CH1 도메인과 이황화 결합을 형성하는 데 관여하는 야생형 CL 도메인의 시스테인 잔기는 변경된 면역 글로불린 CL 도메인, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 141에 제시된 바와 같은 Cκ 도메인, 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 140에 제시된 바와 같은 Cλ 도메인에서 결실되거나 치환된다 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨). 특정 실시양태에서, 야생형 인간 Cκ 도메인의 마지막 시스테인만이 변경된 Cκ 도메인에서 결실되는데, 이는 야생형 인간 Cκ 도메인에서 결실된 첫번째 아르기닌은 그의 카르복실-말단에 아르기닌을 갖고 변경된 Cκ 도메인의 아미노-말단을 다른 도메인 (예를 들어, 면역 글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 하위-영역과 같은 면역 글로불린 하위-영역)과 연결시키는 링커에 의해 제공될 수 있기 때문이다.
추가의 실시양태에서, 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 야생형 Cκ 도메인과 비교하여 Cκ-Cκ 계면에서 쇄간-수소 결합 네트워크 형성에 관여할 수 있는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변경된 Cκ 도메인이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 상이한 아미노산으로 치환된 위치 N29, N30, Q52, V55, T56, S68 또는 T70에 하나 이상의 아미노산을 갖는 변경된 인간 Cκ 도메인이다. 아미노산의 넘버링은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 141 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 제시된 바와 같이 변경된 인간 Cκ 서열에서의 위치를 기초로 한다. 특정 실시양태에서, 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 위치 N29, N30, V55 또는 T70에서 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 변경된 인간 Cκ 도메인이다. 상기 인용된 위치에서 치환체로서 사용된 아미노산은 알라닌, 또는 알기닌, 트립토판, 티로신, 글루타메이트, 글루타민, 리신 아스파르테이트, 메티오닌, 세린 또는 페닐알라닌과 같은 벌크 측쇄 모이어티를 갖는 아미노산 잔기일 수 있다. 변경된 인간 Cκ 도메인은 CH1 도메인과의 이종이량체화를 용이하게 하지만 다른 Cκ 도메인과의 동종이량체화를 최소화하는 것들이다. 대표적인 변경된 인간 Cκ 도메인은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 142 내지 178; 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 160 (N29W V55A T70A), 161 (N29Y V55A T70A), 202 (T70E N29A N30A V55A), 167 (N30R V55A T70A), 168 (N30K V55A T70A), 170 (N30E V55A T70A), 172 (V55R N29A N30A), 175 (N29W N30Y V55A T70E), 176 (N29Y N30Y V55A T70E), 177 (N30E V55A T70E), 178 (N30Y V55A T70E), 838 (N30D V55A T70E), 839 (N30M V55A T70E), 840 (N30S V55A T70E), 및 841 (N30F V55A T70E) (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 제시되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 Cκ 도메인에서의 돌연변이에 추가하여 또는 대안적으로, 폴리펩티드 이종이량체의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인 (즉, 면역 글로불린 CH1 및 CL 도메인) 둘 다는 돌연변이를 가져서 생성된 면역 글로불린 이종이량체화 도메인이 돌연변이된 부위의 아미노산 잔기들 사이에 염 가교 (즉, 이온 상호 작용)를 형성한다. 예를 들어, 폴리펩티드 이종이량체의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 돌연변이된 Cκ 도메인과 조합된 돌연변이된 CH1 도메인일 수 있다. 돌연변이된 CH1 도메인에서, 야생형 인간 CH1 도메인의 위치 68에서의 발린 (V68)은 음전하를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 아스파르테이트 또는 글루타메이트)로 치환되는 반면, 첫번째 아르기닌 및 마지막 시스테인이 결실된 돌연변이된 인간 Cκ 도메인의 위치 29에서의 류신(L29)은 양전하를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘)로 치환된다. 생성된 돌연변이 CH1 도메인의 음전하를 갖는 아미노산 잔기와 생성된 돌연변이 Cκ 도메인의 양전하를 갖는 아미노산 잔기 사이의 전하-전하 상호 작용으로 염 가교를 형성하고, 이는 돌연변이된 CH1과 Cκ 도메인 사이에서 이종이량체화된 계면을 안정화시킨다. 대안적으로, 야생형 CH1의 V68은 양전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환될 수 있는 반면, 첫번째 아르기닌 및 마지막 시스테인이 결실된 돌연변이된 인간 Cκ 도메인의 L29 는 음전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. V68이 음전하 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환된 예시적인 돌연변이 CH1 서열은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 844 및 845 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 제시되어 있다. L29가 음전하 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환된 예시적인 돌연변이된 Cκ 서열은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 842 및 843 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 제시되어 있다.
인간 CH1 도메인의 V68 및 인간 Cκ 도메인의 L29 이외의 위치는 CH1 도메인의 V68에서의 돌연변이 및 Cκ 도메인의 L29에서의 돌연변이에 추가로 또는 대안적으로 아미노산 사이의 이온 상호 작용을 생성하기 위해 반대 전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 위치는 임의의 돌연변이 유발, CH1-Cκ 계면에서 아미노산 잔기를 식별하기 위한 CH1-Cκ 쌍의 결정 구조 분석, 및 일련의 기준 (예: 이온 상호 작용에 관여하는 경향, 잠재적 파트너 잔기에 대한 근접성 등)을 사용하여 CH1-Cκ 계면의 아미노산 잔기 중 적합한 위치를 추가로 식별하는 것을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 식별될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 이종이량체는 단지 한 쌍의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인을 함유한다. 예를 들어, 폴리펩티드 이종이량체의 제1 쇄는 면역 글로불린 이종이량체화 도메인으로서 CH1 도메인을 포함할 수 있는 반면, 제2 쇄는 면역 글로불린 이종이량체화 도메인으로서 CL 도메인 (예를 들어, Cκ 또는 Cλ)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 쇄는 면역 글로불린 이종이량체화 도메인으로서 CL 도메인 (예를 들어, Cκ 또는 Cλ)을 포함할 수 있는 반면, 제2 쇄는 면역 글로불린 이종이량체화 도메인으로서 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 제1 및 제2 쇄의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 본 개시내용의 이종이량체 단백질을 형성하기 위해 회합될 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이종이량체 단백질은 2 쌍의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인을 가질 수 있다. 예를 들어, 이종이량체의 제1 쇄는 2개의 CH1 도메인을 포함할 수 있는 반면, 제2 쇄는 제1 쇄의 2개의 CH1 도메인과 회합되는 2개의 CL 도메인을 가질 수 있다. 대안적으로, 제1 쇄는 2개의 CL 도메인을 포함할 수 있는 반면, 제2 쇄는 제1 쇄의 2개의 CL 도메인과 회합되는 2개의 CH1 도메인을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 CH1 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 각각 제1 폴리펩티드 쇄의 CH1 도메인 및 CL 도메인과 회합되는 CL 도메인 및 CH1 도메인을 포함한다.
이종이량체 단백질이 단지 하나의 이종이량체화 쌍 (즉, 각 쇄에서 하나의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인)을 포함하는 실시양태에서, 각 쇄의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 그 쇄의 면역 글로불린 불변 영역에 대해 아미노-말단에 위치할 수 있다. 대안적으로, 각 쇄에서 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 그 쇄의 면역 글로불린 불변 영역에 대한 카르복실 말단에 위치할 수 있다.
이종이량체 단백질이 2개의 이종이량체화 쌍 (즉, 각각의 쇄에서 2개의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인)을 포함하는 실시양태에서, 각 쇄의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인 둘다는 그 쇄의 면역 글로불린 불변 영역에 대해 아미노-말단에 위치할 수 있다. 대안적으로, 각 쇄의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인 둘다는 그 쇄의 면역 글로불린 불변 영역에 대한 카르복실 말단에 위치할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 각 쇄에서 하나의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 그 쇄의 면역 글로불린 불변 영역에 대해 아미노-말단에 위치할 수 있는 반면, 각 쇄의 다른 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 그 쇄의 면역 글로불린 불변 영역에 대한 카르복실-말단에 위치할 수 있다. 다시 말해서, 이러한 실시양태에서, 면역 글로불린 불변 영역은 각 쇄의 2개의 면역 글로불린 이종이량체화 도메인 사이에 개재된다.
본원에 지시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 폴리펩티드 쇄에 면역 글로불린 불변 영역 (본원에서 불변 영역, Fc 도메인, Fc 영역 등으로도 지칭됨)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 글로불린 불변 영역은 서열 번호 158, 160에 따른 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 면역 글로불린 불변 영역의 포함은 대상체에게 투여한 후 순환으로부터 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질의 제거를 느리게 한다. 돌연변이 또는 다른 변형에 의해, 면역 글로불린 불변 영역은 폴리펩티드 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC, ADCP, CDC, 보체 고정 및 Fc 수용체에 대한 결합)의 비교적 용이한 조절을 가능하게 하며, 이는 당 업계에 공지되고 본원에 기술된 바와 같이 치료하는 질환에 따라 증가 또는 감소될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 단백질은 하나 이상의 이들 이펙터 기능을 매개할 수 있는 면역 글로불린 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 이들 이펙터 기능 중 하나 이상은 상응하는 야생형 면역 글로불린 불변 영역과 비교하여 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 단백질의 면역 글로불린 불변 영역에서 감소되거나 부재한다. 예를 들면, 4-1BB-결합 도메인의 포함과 같은 것을 통해 이펙터 세포의 활성화를 향상시키기 위해 설계된 이량체 5T4 결합 또는 4-1BB 결합 폴리펩티드에 대해, 면역 글로불린 불변 영역은 상응하는 야생형 면역 글로불린 불변 영역에 대해 이펙터 기능이 바람직하게는 감소되거나 부재한다.
본 개시내용의 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)에 존재하는 면역 글로불린 불변 영역은 CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 이의 일부 또는 전체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린 불변 영역은 CH2 도메인, CH3 도메인, CH2 및 CH3 도메인 둘다, CH3 및 CH4 도메인 둘다, 2개의 CH3 도메인, CH4 도메인, 2개의 CH4 도메인, 및 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 일부를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질은 CH1 도메인을 포함하지 않는다.
본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질은 다양한 종 (인간, 마우스, 쥐 및 기타 포유류 포함)으로부터의 특정 면역 글로불린 클래스 또는 서브 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 또는 IgD)로부터의 야생형 면역 글로불린 CH2 도메인, 또는 이의 변경된 면역 글로불린 CH2 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 CH2 도메인은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 115, 199 내지 201, 및 195 내지 197 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨) 각각에 제시된 바와 같은 야생형 인간 면역 글로불린 CH2 도메인, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 또는 IgD의 야생형 CH2 도메인이다. 특정 실시양태에서, CH2 도메인은 미국 특허 출원 공개 US 2013/0129723의 서열 번호 115에 제시된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 도메인이다 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨).
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 단백질의 변경된 CH2 영역은 야생형 면역 글로불린 CH2 영역, 예컨대 야생형 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4, 또는 마우스 IgG2a (예를 들어, IGHG2c)의 CH2 영역에 대해서 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 동일한 서열을 포함하거나, 그 서열이다.
본 개시내용의 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)에서 변경된 면역 글로불린 CH2 영역은 다양한 면역 글로불린 이소형, 예컨대 다양한 종 (인간, 마우스, 쥐 및 기타 포유 동물 포함)으로부터의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 및 IgD의 CH2 영역으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질에서 변경된 면역 글로불린 CH2 영역은 그 서열이 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 115, 199, 201 및 320 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 제시된 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 마우스 IgG2a (예를 들어, IGHG2c) 의 CH2 영역으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 변경된 CH2 도메인 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 ADCC, ADCP, CDC, 보체 고정, Fc 수용체 결합 또는 이들의 임의의 조합과 같은 면역학적 활성 (즉, 이펙터 기능)을 향상시키거나 감소시키는 당 업계에 공지된 돌연변이를 갖는 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 CH2 도메인은 하나 이상의 아미노산 결실 또는 치환을 포함하는 변경된 면역 글로불린 CH2 영역 (예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)이다. 일부 실시양태에서, CH2 도메인은 위치 297의 아스파라긴의 아미노산 치환 (예를 들어, 아스파라긴에서 알라닌으로)을 포함한다. 이러한 아미노산 치환은 이 부위에서 글리코실화를 감소시키거나 제거하고 FcγR 및 C1q에 대한 효율적인 Fc 결합을 제거한다. 위치 297에서 Asn에서 Ala로 치환된 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인의 서열은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 324 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 변경된 CH2 도메인은 위치 234 내지 238에서 하나 이상의 치환 또는 결실을 포함한다. 예를 들어, 면역 글로불린 CH2 영역은 위치 234, 235, 236, 237 또는 238; 위치 234 및 235; 위치 234 및 236; 위치 234 및 237; 위치 234 및 238; 위치 234 내지 236; 위치 234, 235 및 237; 위치 234, 236 및 238; 위치 234, 235, 237 및 238; 위치 236 내지 238; 또는 위치 234 내지 238에서 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 임의의 다른 조합의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 CH2 영역은 위치 234 내지 238, 예를 들어 위치 236 또는 위치 237 중 하나에서 하나 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개) 아미노산 결실을 포함하고 다른 위치는 치환된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 위치 234 내지 238의 아미노산 잔기가 하나 이상의 알라닌 잔기로 대체되었다. 추가의 실시양태에서, 위치 234 내지 238의 아미노산 잔기 중 하나만이 결실된 반면, 위치 234 내지 238의 하나 이상의 나머지 아미노산은 다른 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 세린)으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 인용된 돌연변이(들)는 변경된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 ADCC 활성 또는 Fc 수용체-결합 능력을 감소시키거나 제거한다.
다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 CH2 도메인은 위치 253, 310, 318, 320, 322 및 331에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변경된 면역 글로불린 CH2 영역 (예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)이다. 예를 들어, 면역 글로불린 CH2 영역은 위치 253, 310, 318, 320, 322 또는 331, 위치 318 및 320, 위치 318 및 322, 위치 318, 320 및 322, 또는 위치 253, 310, 318, 320, 322 및 331에서 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산의 임의의 조합의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기 인용된 돌연변이(들)는 변경된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 CDC 활성을 감소시키거나 제거한다.
특정 다른 실시양태에서, 위치 297에서의 아미노산 치환에 추가하여, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 변경된 CH2 영역 (예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)은 위치 234 내지 238에서 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개)의 추가 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린 CH2 영역은 위치 234 및 297, 위치 234, 235 및 297, 위치 234, 236 및 297, 위치 234 내지 236 및 297, 위치 234, 235, 237 및 297, 위치 234, 236, 238 및 297, 위치 234, 235, 237, 238 및 297, 위치 236 내지 238 및 297, 또는 위치 297 외에 234 내지 238에서 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 임의의 조합의 치환을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 변경된 CH2 영역은 위치 236 또는 위치 237과 같은 위치 234 내지 238에서 하나 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개) 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 추가적인 돌연변이(들)는 변경된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 ADCC 활성 또는 Fc 수용체-결합 능력을 감소시키거나 제거한다. 특정 실시양태에서, 위치 234 내지 238 중 하나 이상에서 아미노산 잔기가 하나 이상의 알라닌 잔기로 대체되었다. 추가의 실시양태에서, 위치 234 내지 238의 아미노산 잔기 중 하나만이 결실된 반면, 위치 234 내지 238의 하나 이상의 나머지 아미노산은 다른 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 세린)으로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, 위치 234 내지 238에서의 하나 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개) 아미노산 치환 이외에, 본 개시내용의 융합 단백질에서 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 돌연변이된 CH2 영역 (예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)은 보체 고정 (예를 들어, 위치 I253, H310, E318, K320, K322 또는 P331에서)과 관련된 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개) 추가 아미노산 치환 (예를 들어, 알라닌으로 치환)을 함유할 수 있다. 돌연변이된 면역 글로불린 CH2 영역의 예는 위치 234, 235, 237 (존재하는 경우), 318, 320 및 322에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 마우스 IgG2a CH2 영역을 포함한다. 예시적인 돌연변이된 면역 글로불린 CH2 영역은 L234, L235, G237, E318, K320 및 K322에서 알라닌 치환을 갖는 마우스 IGHG2c CH2 영역이다.
또 다른 실시양태에서, 위치 297에서의 아미노산 치환 및 위치 234 내지 238에서의 추가적인 결실 또는 치환에 추가하여, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 변경된 CH2 영역 (예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)은 위치 253, 310, 318, 320, 322 및 331에서 하나 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개) 추가 치환을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린 CH2 영역은 (1) 위치 297에서 치환, (2) 위치 234 내지 238에서 하나 이상의 치환 또는 결실, 또는 이들의 조합, 및 위치 I253, H310, E318, K320, K322 및 P331에서의 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 아미노산 치환, 예컨대 위치 E318, K320 및 K322에서의 1, 2, 3개의 치환을 포함할 수 있다. 상기 인용된 위치의 아미노산은 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 면역 글로불린 CH2 영역은 (i) 위치 297의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 위치 234, 235, 236 또는 237에서 하나의 아미노산 치환; (ii) 위치 297의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 위치 234 내지 237에서 2개의 아미노산 치환; (iii) 위치 297의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 위치 234 내지 237에서 3개의 아미노산 치환; (iv) 위치 297의 아스파라긴에서 아미노산 치환, 위치 234, 235 및 237에서 아미노산 치환, 및 위치 236에서 아미노산 결실; (v) 위치 234 내지 237에서 3개의 아미노산 치환 및 위치 318, 320 및 322에서 아미노산 치환; 또는 (vi) 위치 234 내지 237 에서 3개의 아미노산 치환, 위치 236에서 아미노산 결실 및 위치 318, 320 및 322에서 아미노산 치환을 포함한다.
위치 297의 아스파라긴에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 변경된 면역 글로불린 CH2 영역은 L234, L235, G237 및 N297에서 알라닌 치환 및 G236에서 결실을 갖는 인간 IgG1 CH2 영역 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 325, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨), V234, G236 및 N297에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG2 CH2 영역 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 326, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨), F234, L235, G237 및 N297에서 알라닌 치환 및 G236의 결실을 갖는 인간 IgG4 CH2 영역 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 322, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨), F234 및 N297에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG4 CH2 영역 (미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/0129723의 서열 번호 343, 상기 서열은 본원에 참고로 포함됨), L235 및 N297에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG4 CH2 영역 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 344, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨), G236 및 N297에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG4 CH2 영역 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723345의 서열 번호 345, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨), 및 G237 및 N297에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG4 CH2 영역 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 346, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)을 포함한다. 이들 CH2 영역은 본 개시의 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드 및/또는 이중특이적 4-1BB 폴리펩티드)에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 기재된 아미노산 치환 이외에, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 변경된 CH2 영역 (예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)은 상기 인용된 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, P233은 변경된 IgG2 CH2 영역에서 E233으로 변경될 수 있다 (예: 미국 특허 출원 공보 2013/0129723의 서열 번호 326 참조, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨). 추가로 또는 대안적으로, 특정 실시양태에서, 변경된 CH2 영역은 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 삽입, 결실 또는 치환은, 힌지를 통해 CH2 영역을 다른 영역 (예를 들어, 결합 도메인 또는 면역 글로불린 이종이량체화 도메인)과 연결함으로써 생성된 야생형 면역 글로불린 CH2 영역의 N- 또는 C-말단에서와 같이 면역 글로불린 CH2 영역의 어느 곳에나 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 변경된 CH2 도메인은 위치 235, 318, 320 및 322에서 알라닌 치환 (즉, L235A, E318A, K320A 및 K322A 치환을 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인) (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 595, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨), 및 선택적으로 N297 돌연변이 (예를 들어, 알라닌으로)를 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인이다. 다른 특정 실시양태에서, 변경된 CH2 도메인은 위치 234, 235, 237, 318, 320 및 322에서 알라닌 치환 (즉, L234A, L235A, G237A, E318A, K320A 및 K322A 치환을 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인) (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 596, 상기 서열은 본원에 참조로 포함됨), 및 선택적으로 N297 돌연변이 (예를 들어, 알라닌으로)를 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 면역 글로불린 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 치환 L234A, L235A, G237A 및 K322A를 포함하는 인간 IgG1 CH2 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 면역 글로불린 불변 영역을 형성할 수 있는 CH3 도메인은 다양한 종 (인간, 마우스, 쥐 및 기타 포유 동물 포함)의 특정 면역 글로불린 클래스 또는 서브 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM)로부터의 야생형 인간 면역 글로불린 CH3 도메인 또는 이의 변경된 면역 글로불린 CH3 도메인일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 CH3 도메인은 야생형 인간 면역 글로불린 CH3 도메인, 예컨대, 미국 특허 출원 공개 2013/0129723의 서열 번호 116, 208 내지 210, 204 내지 207 및 212 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨) 각각에 제시된 바와 같은, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM의 야생형 CH3 도메인이다. 특정 실시양태에서, CH3 도메인은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 116 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 제시된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH3 도메인이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 CH3 도메인은 변경된 인간 면역 글로불린 CH3 도메인, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 야생형 CH3 도메인에 기반하거나 또는 유래된 변경된 CH3 도메인이다. 예를 들어, 변경된 CH3 도메인은 위치 H433 및 N434에서 하나 또는 두 개의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인일 수 있다 (위치는 EU 넘버링에 따라 번호가 매겨짐). 이러한 위치에서의 돌연변이는 보체 고정에 관여할 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 변경된 CH3 도메인은 인간 IgG1 CH3 도메인일 수 있지만 위치 F405 또는 Y407에서 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 이러한 위치의 아미노산은 다른 CH3 도메인과의 상호 작용에 관여한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 변경된 CH3 도메인은 그의 마지막 리신이 결실된 변경된 인간 IgG1 CH3 도메인일 수 있다. 이 변경된 CH3 도메인의 서열은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 761 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 소위 "노브-인투-홀 (knobs-into-holes)" 돌연변이 (Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1966 참조)를 포함하는 CH3 도메인을 포함한다. 보다 구체적으로, CH3/CH3 회합에 필요한 입체 상보성이 이들 두 CH3 도메인이 서로 쌍을 이루어야 하도록 돌연변이가 각각의 폴리펩티드 쇄의 각각의 CH3 도메인으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 이종이량체의 하나의 단일쇄 폴리펩티드의 CH3 도메인은 T366W 돌연변이 (작은 아미노산을 큰 아미노산으로 치환하는 "노브" 돌연변이)를 함유할 수 있고, 폴리펩티드 이종이량체의 다른 단일쇄 폴리펩티드의 CH3 도메인은 Y407A 돌연변이 (큰 아미노산을 더 작은 것으로 치환하는 "홀" 돌연변이)를 함유할 수 있다. 다른 예시적인 노브-인투-홀 돌연변이는 (1) 하나의 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이 및 다른 CH3 도메인에서의 Y407T 및 (2) 하나의 CH3 도메인에서의 T366W 돌연변이 및 다른 CH3 도메인에서의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 면역 글로불린 불변 영역을 형성할 수 있는 CH4 도메인은 IgE 또는 IgM 분자로부터의 야생형 면역 글로불린 CH4 도메인 또는 이의 변경된 면역 글로불린 CH4 도메인일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 CH4 도메인은 야생형 인간 면역 글로불린 CH4 도메인, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 213 및 214 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨)에 각각 제시된 바와 같은 인간 IgE 및 IgM 분자의 야생형 CH4 도메인이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 CH4 도메인은 IgE 또는 IgM Fc 영역과 관련이 있는 것으로 알려진 면역학적 활성을 증가 또는 감소시키는 돌연변이를 갖는 인간 IgE 또는 IgM 분자의 CH4 도메인에 기초하거나 그로부터 유래된 변경된 CH4 도메인과 같은 변경된 인간 면역 글로불린 CH4 도메인이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 면역 글로불린 불변 영역은 CH2, CH3 또는 CH4 도메인의 조합 (즉, CH2, CH3 및 CH4로부터 선택되는 하나 이상의 불변 영역 도메인)을 포함한다. 예를 들어, 면역 글로불린 불변 영역은 CH2 및 CH3 도메인, 또는 CH3 및 CH4 도메인을 포함할 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 면역 글로불린 불변 영역은 2개의 CH3 도메인을 포함하고, CH2 또는 CH4 도메인을 포함하지 않을 수 있다 (즉, 단지 2개 이상의 CH3). 본원에 기재된 폴리펩티드의 면역 글로불린 불변 영역을 형성하는 다중 불변 영역 도메인은 동일한 면역 글로불린 분자, 또는 동일한 클래스 또는 서브 클래스 면역 글로불린 분자에 기초하거나 그로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역 글로불린 불변 영역은 IgG CH2-CH3 (예를 들어, IgG1 CH2-CH3, IgG2 CH2-CH3 및 IgG4 CH2-CH3)이고 인간 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4) CH2CH3일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드의 면역 글로불린 불변 영역은 (1) 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 도메인, (2) N297A 치환을 갖는 인간 IgG1 CH2 (즉, CH2(N297A)) 및 야생형 인간 IgG1 CH3, 또는 (3) 인간 IgG1 CH2 (N297A) 및 마지막 라이신이 결실된 변경된 인간 IgG1 CH3을 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 다중 불변 영역 도메인은 상이한 면역 글로불린 분자, 또는 상이한 클래스 또는 서브 클래스 면역 글로불린 분자를 기반으로 하거나 그로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 면역 글로불린 불변 영역은 인간 IgM CH3 도메인 및 인간 IgG1 CH3 도메인 둘 다를 포함한다. 본원에 기재된 폴리펩티드의 면역 글로불린 불변 영역을 형성하는 다중 불변 영역 도메인은 서로 직접 연결되거나 하나 이상의 (예를 들어, 약 2 내지 약 10개) 아미노산을 통해 서로 연결될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)에 사용될 수 있는 예시적인 면역 글로불린 불변 영역은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723의 서열 번호 305 내지 309, 321, 323, 341, 342 및 762에 제시되어 있다 (상기 서열은 본원에 참조로 포함됨). 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질에 사용될 수 있는 추가의 예시적인 면역 글로불린 불변 영역이 하기 표 4에 제공된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 동종이량체 또는 이종이량체 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 각 폴리펩티드 쇄의 면역 글로불린 불변 영역은 서로 동일하다. 다른 특정 실시양태에서, 이종이량체 단백질의 하나의 폴리펩티드 쇄의 면역 글로불린 불변 영역은 이종이량체의 다른 폴리펩티드 쇄의 면역 글로불린 불변 영역과 상이하다. 예를 들어, 이종이량체 단백질의 하나의 면역 글로불린 불변 영역은 "노브" 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 함유할 수 있는 반면, 이종이량체 단백질의 다른 면역 글로불린 불변 영역은 "홀" 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 임의의 상기 기재된 돌연변이를 포함하는 면역 글로불린 불변 영역 및 모 결합 도메인 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원 개시의 폴리펩티드는 인간 IgG1 CH2 도메인에서 L234A, L235A, G237A, 및 K322A 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 면역 글로불린 불변 영역, 및 서열 번호 38 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 도메인 및 서열 번호 44, 48 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL 도메인을 포함하는 5T4-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원 개시의 폴리펩티드는 인간 IgG1 CH2 도메인에서 L234A, L235A, G237A, 및 K322A 돌연번이 중 하나 이상을 포함하는 면역 글로불린 불변 영역, 및 서열번호 14의 VH 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호 16의 VL 도메인 아미노산 서열을 포함하는 41BB-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원 개시의 폴리펩티드는 인간 IgG1 CH2 도메인에서 L234A, L235A, G237A, 및 K322A 돌연번이 중 하나 이상을 포함하는 면역 글로불린 불변 영역, 및 서열 번호 38 및 46으로 이루어진 그룹에서 선택되는 VH 도메인 및 서열 번호 44, 48 및 50으로 이루어진 그룹에서 선택되는 VL 도메인을 포함하는 5T4-결합 도메인; 및 서열 번호 14의 VH 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호 16의 VL 도메인 아미노산 서열을 포함하는 41BB-결합 도메인을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0129723 및 2013/0095097에 일반적으로 개시된 바와 같은 스캐폴딩을 사용하여 제조될 수 있으며, 이들 문헌은 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본원에 기재된 폴리펩티드는 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있으며, 각각의 폴리펩티드 쇄는 면역 글로불린 이종이량체화 도메인을 포함한다. 계면 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 상이하다. 일 실시양태에서, 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 CH1 도메인 또는 이의 유도체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역 글로불린 이종이량체화 도메인은 CL 도메인 또는 이의 유도체를 포함한다. 한 실시양태에서, CL 도메인은 Cκ 또는 Cλ 이소형 또는 이의 유도체이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 다른 5T4-결합 폴리펩티드 또는 4-1BB-결합 폴리펩티드와 비교하여 개선된 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 또는 이의 다중특이적 단백질은 상이한 5T4-결합 폴리펩티드 및/또는 4-1BB-결합 폴리펩티드의 등전점과 비교하여 감소된 등전점을 나타낼 수 있다. "등전점" 또는 "pI"는 순 전하가 0인 pH이다. 단백질의 등전점은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 분석 모세관 등전 포커싱 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 이전에 알려진 5T4- 및/또는 4-1BB-결합 도메인 및/또는 모 5T4- 및/또는 4-1BB-결합 도메인 또는 단백질보다 높은 친화도로 5T4 (예를 들어, 인간 5T4) 및/또는 4-1BB에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 5T4- 및/또는 4-1BB-결합 도메인 또는 폴리펩티드의 해리 상수는 약 2 내지 5 nM일 수 있다. 특정 실시양태에서, 5T4- 및/또는 4-1BB-결합 도메인 또는 폴리펩티드의 오프 속도는 이전에 알려진 항체 또는 scFv 작제물 또는 모 5T4- 및/또는 4-1BB-결합 도메인 또는 단백질의 오프 속도와 비교하여 4 내지 10배 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 폴리펩티드 또는 단백질의 재조합 발현 동안 생성된 고분자량 응집체를 저수준으로 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 폴리펩티드 또는 단백질에 존재하는 도메인의 조합에 따라 인간 혈청에서 더 긴 안정성을 나타낼 수 있다.
5T4-결합 도메인 및 이를 포함하는 단백질
일부 실시양태에서, 본 발명은 5T4 (예를 들어, 인간 5T4)에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 도메인을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 5T4-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드)를 추가로 제공한다. 특정 변형에서, 5T4-결합 폴리펩티드는 5T4-결합 도메인에 대한 힌지 영역 카르복실-말단 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함한다. 추가 변형에서, 5T4-결합 폴리펩티드는 면역 글로불린 불변 영역으로의 카르복실-말단 결합 도메인 링커 카르복실-말단, 및 카르복실-말단 링커로의 제2 결합 도메인 카르복실-말단을 포함한다. 또 다른 변형에서, 5T4-결합 폴리펩티드는 5T4-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 대한 힌지 영역 아미노-말단, 및 힌지 영역에 대한 면역 글로불린 불변 아미노-말단을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 5T4-결합 도메인은 5T4의 세포 외 도메인 상에 위치된 에피토프 (예를 들어, 서열 번호 168에 포함된 에피토프)에 결합한다. 특정 측면에서, 이 에피토프는 불연속적 및/또는 형태적 에피토프이다.
5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 5T4에 특이적으로 결합할 수 있고 중쇄 CDR1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 CDR1 (LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호 30, 52 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 32 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 8, 42 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 5T4에 특이적으로 결합하고 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있으며, 여기서 (a) HCDR1은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (f) LCDR3은 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 5T4에 특이적으로 결합하고 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하되 (a) HCDR1은 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (e) LCDR2는 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (f) LCDR3은 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 5T4에 특이적으로 결합하고 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하되 (a) HCDR1은 서열 번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (e) LCDR2는 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (f) LCDR3은 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 5T4에 특이적으로 결합하고 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하되 (a) HCDR1은 서열 번호 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (e) LCDR2는 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (f) LCDR3은 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 40, 44, 48, 50, 58, 68 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열과 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이의 서열이고, 여기서, 폴리펩티드는 scFv-Fc-scFv 형식의 다중특이적 폴리펩티드이고, VL의 위치 99의 LCDR1에서 Y의 F로의 치환 및/또는 VL의 위치 148의 FR3에서 F의 S로의 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열 번호 40, 44, 48, 50, 58, 68 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 38, 46, 56 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
예시적인 항-5T4 결합 도메인 서열이 표 5에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 5T4-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 (예를 들어, 이중특이적 폴리펩티드)를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 5T4-결합 단백질 또는 폴리펩티드는 5T4 이외의 표적에 결합하는 하나 이상의 추가의 결합 도메인 (예를 들어, 제2 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 이들 다른 결합 도메인은 예를 들어, 특정 사이토카인 또는 결합 도메인 폴리펩티드를 표적화하는 분자, 예를 들어 특정 세포 유형, 독소, 추가 세포 수용체 또는 항체를 포함할 수 있다. 다중특이적 5T4-결합 폴리펩티드 또는 단백질은 2개의 결합 도메인 (동일하거나 상이한 표적에 도메인이 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있음), 힌지 영역, 링커 (예를 들어, 카르복실-말단 또는 아미노-말단 링커), 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 다중특이적 5T4-결합 단백질은 2개의 동일한 이황화 결합 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 도메인은 5T4에 결합하는 단일 클론 항체로부터 유래될 수 있다.
본원 개시의 일부 실시양태에서, 5T4-결합 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드 쇄와 함께 이종이량체를 형성할 수 있고, (a) 즉시 아미노-말단을 면역 글로불린 불변 영역에 (예를 들어, 아미노-말단을 CH2 도메인에 (여기서, 면역 글로불린 불변 영역이 CH2 및 CH3 도메인을 포함함), 또는 아미노-말단을 CH3 도메인에 (여기서, 면역 글로불린 하위 영역은 CH3 및 CH4 도메인을 포함함)), (b) 결합 도메인 (예를 들어, scFv) 및 면역 글로불린 이종이량체화 도메인 사이에 개재되어 연결하고, (c) 면역 글로불린 이종이량체화 도메인과 면역 글로불린 불변 영역 (예를 들어, 면역 글로불린 불변 영역은 CH2 및 CH3 도메인, 또는 CH3 및 CH4 도메인을 포함함) 사이에 개재되어 연결하고, (d) 면역 글로불린 불변 영역 및 결합 도메인 사이에 개재되어 연결하는, (e) 폴리펩티드 쇄의 아미노-말단에서, 또는 (f) 폴리펩티드 쇄의 카르복실-말단에서의 힌지 영역을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 힌지 영역을 포함하는 폴리펩티드 쇄는 상이한 폴리펩티드 쇄와 회합하여 본원에 제공된 이종이량체 단백질을 형성할 수 있고, 형성된 이종이량체는 그의 표적 특이성 또는 그의 특이적 표적 결합 친화성을 보유하는 결합 도메인을 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 5T4-결합 폴리펩티드는 2개의 scFv를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 2개의 scFv는 5T4-결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2개의 scFv는 동일한 5T4-결합 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 2개의 scFv는 상이한 5T4-결합 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 제1 scFv로서 5T4-결합 도메인 및 제2 scFv로서 이펙터 세포 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 이펙터 세포 결합 도메인은 4-1BB에 특이적인 scFv일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 5T4-결합 폴리펩티드는 서열 번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 및 170으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 약 82% 이상, 약 85% 이상, 약 87% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 100% 동일한 항-5T4 scFv를 포함하되 폴리펩티드는 scFv-Fc-scFv 형식의 다중특이적 폴리펩티드이고, 항-5T4 VL의 위치 99의 LCDR1에서 Y의 F로의 치환, 및/또는 항-5T4 VL의 위치 148의 FR3에서 F의 S로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 5T4-결합 폴리펩티드는 서열 번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 및 170으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항-5T4 scFv를 포함한다. 예시적인 항-5T4 scFv에 대한 아미노산 및 핵산 서열은 하기 표 6에 제공된다.
일부 실시양태에서, 5T4-결합 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (또는 카르복실-말단에서 아미노-말단까지 순서대로), (i) 5T4-결합 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 카르복실-말단 링커 (또는 아미노-말단 링커), 및 (v) 제2 결합 도메인을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 4-1BB에 특이적인 scFv이다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (또는 카르복실-말단에서 아미노-말단까지 순서대로), (i) 제2 결합 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 카르복실-말단 링커 (또는 아미노-말단 링커), 및 (v) 5T4-결합 도메인을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 4-1BB-결합 도메인을 포함하거나 4-1BB-결합 도메인이다. 특정 실시양태에서, 5T4-결합 단백질은 5T4를 발현하는 표적 세포에 대한 이펙터의 동원을 위한 이펙터-세포 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이펙터-세포 결합 도메인은 4-1BB에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 5T4-결합 폴리펩티드의 제2 결합 도메인은 4-1BB-결합 도메인이고 PCT 출원 공개 번호 WO 2016/185016; PCT 출원 번호PCT/EP2017/059656; Dubrot et al., 2010; Gauttier et al., 2014; Kim et al., 2001; McMillin et al., 2006; Melero et al., 1997; Miller et al., 2002; Sallin et al., 2014; Taraban et al., 2002; Uno et al., 2006; Vinay and Kwon, 2012; Wilcox et al., 2002에 개시된 4-1BB-결합 서열 중 하나 이상 (예를 들어, CDR 또는 가변 영역)을 포함하고, 상기 문헌 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 4-1BB와 특이적으로 결합하고, 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)과 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고; 여기서 VL은 서열 번호 16 및 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 약 93% 이상 동일, 약 95% 이상 동일, 약 97% 이상 동일, 약 98% 이상 동일, 약 99% 이상 동일 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VH는 서열 번호 14, 20, 26, 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 약 93% 이상 동일, 약 95% 동일 이상, 약 97% 이상 동일, 약 98% 이상 동일, 적어도 99% 이상 동일 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하되 폴리펩티드는 scFv-Fc-scFv 형식의 다중특이적 폴리 펩티드이고, VH의 위치 150의 HCDR1에서 Y의 H로의 치환, 및/또는 VH의 위치 127의 FR3에서 R의 H로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 4-1BB에 특이적으로 결합하고 VL 및 VH를 포함하고; VL은 서열 번호 16 및 22로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 14, 20, 26, 및 28로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드이고, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 약 82% 이상, 약 85% 이상, 약 87% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 scFv이다. 예시적인 항-4-1BB-결합 도메인 서열은 표 6 및 7에 도시되어 있고, 하기에 추가로 논의된다.
4-1BB-결합 도메인 및 이를 포함하는 단백질
일부 실시양태에서, 본 발명은 4-1BB (예를 들어, 인간 4-1BB)에 특이적으로 결합하는 4-1BB-결합 도메인을 제공한다. 4-1BB는 CD137 또는 TNFRSF9라고도 하며 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 계열의 구성원이다. 4-1BB는 T 세포의 활성화된 서브 세트 (예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 T 조절 세포 (Treg)), 자연 살해 (NK) 세포, 수지상 세포, 단핵구, 비만 세포 및 호산구를 비롯한 다수의 세포 유형에서 발현된다. CD8+ T 세포상의 4-1BB 활성화는 세포 활성화를 유지 및/또는 증강시키는 반면, CD4+ T 세포상의 4-1BB 활성화는 세포 활성화를 개시할 수 있고, 일부 경우에는 활성화-유도된 세포 사멸을 초래할 수 있다. Treg에서 4-1BB 활성화는 일반적으로 Treg 기능을 억제한다. 여러 연구에서 길항제 4-1BB 항체의 사용을 통한 종양 면역 유도가 입증되었다. 예시적인 인간 4-1BB 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 번호 163 및 167 및 서열 번호 164 및 166에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 4-1BB-결합 폴리펩티드)를 추가로 제공한다. 특정 변형에서, 4-1BB-결합 폴리펩티드는 4-1BB-결합 도메인으로의 힌지 영역 카르복실-말단, 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함한다. 추가 변형에서, 4-1BB-결합 폴리펩티드는 면역 글로불린 불변 영역으로의 카르복실-말단 결합 도메인 링커 카르복실-말단, 및 카르복실-말단 링커로의 제2 결합 도메인 카르복실-말단을 포함한다.
또 다른 변형에서, 4-1BB-결합 폴리펩티드는 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 대한 힌지 영역 아미노-말단 및 힌지 영역에 대한 면역 글로불린 불변 아미노-말단을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 4-1BB-결합 도메인은 4-1BB의 세포 외 도메인 상에 위치된 에피토프 (예를 들어, 서열 번호 166에 포함된 에피토프)에 결합한다. 특정 측면에서, 이 에피토프는 불연속적 및/또는 형태적 에피토프이다.
4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있고 중쇄 CDR1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 CDR1 (LCDR1), LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 여기서 HCDR1은 서열 번호 2, 18, 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하되 폴리펩티드는 scFv-Fc-scFv 형식의 다중특이적 폴리펩티드이고 항-4-1BB VH의 위치 150의 HCDR1에서의 Y에서 H로의 치환 및/또는 항-4-1BB VH의 위치 127의 FR3에서의 R에서 H로의 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있고, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있으며, 여기서 (a) HCDR1은 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (f) LCDR3은 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 5T4에 특이적으로 결합하고 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하되 (a) HCDR1은 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (e) LCDR2는 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, (f) LCDR3은 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 5T4-결합 도메인 폴리펩티드는 인간 5T4에 특이적으로 결합하고 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하되 (a) HCDR1은 서열 번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (b) HCDR2는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (c) HCDR3은 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (d) LCDR1은 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (e) LCDR2는 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; (f) LCDR3은 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 16 및 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 14, 20, 26, 및 28로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산과 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하되 폴리펩티드는 scFv-FC-scFv 형식의 다중특이적 폴리펩티드이고, 항-4-1BB VH의 위치 150의 HCDR1에서의 Y의 H로의 치환 및/또는 항-4-1BB VH의 위치 127의 FR3에서의 R의 H로의 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 14, 20, 26, 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인 폴리펩티드는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
예시적인 항-4-1BB-결합 도메인 서열이 표 7에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 (예를 들어, 이중특이적 폴리펩티드)를 제공한다. 다중특이적 4-1BB-결합 폴리펩티드 또는 단백질은 2개의 결합 도메인 (도메인은 동일하거나 상이한 표적에 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있음), 힌지 영역, 링커 (예를 들어, 카르복실-말단 또는 아미노-말단 링커), 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 다중특이적 4-1BB-결합 단백질은 2개의 동일한 이황화 결합된 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인은 4-1BB에 결합하는 단일 클론 항체로부터 유래되거나 (예를 들어, 우렐루맙(Urelumab, BMS-66513) 또는 PF-05082566 (Pfizer)), PCT 출원 공개 번호 WO 2016/185016에 기재된 4-1BB-결합 도메인으로부터 유래되거나, PCT 출원 번호PCT/EP2017/059656에 기재된 4-1BB-결합 도메인으로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로: (i) 제1 결합 도메인; (ii) 힌지 영역; (iii) 면역 글로불린 불변 영역; (iv) 결합 도메인 링커; 및 (v) 4-1BB-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로: (i) 4-1BB-결합 도메인; (ii) 결합 도메인 링커; (iii) 면역 글로불린 불변 영역; (iv) 힌지 영역; 및 (v) 제1 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 항-4-1BB-결합 도메인 서열에 대한 아미노산 및 핵산 서열이 표 7에 제공된다.
특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 단백질 또는 폴리펩티드는 4-1BB 이외의 표적에 결합하는 하나 이상의 추가의 결합 도메인 (예를 들어, 제2 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 이들 다른 결합 도메인은 예를 들어, 특정 사이토카인 또는 결합 도메인 폴리펩티드를 표적화하는 분자, 예를 들어 특정 세포 유형, 독소, 추가 세포 수용체 또는 항체를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 4-1BB-결합 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드 쇄와 함께 이종이량체를 형성할 수 있고, (a) 즉시 아미노-말단을 면역 글로불린 불변 영역으로 (예를 들어, 아미노-말단에서 CH2 도메인에 (여기서 면역 글로불린 불변 영역이 CH2 및 CH3 도메인을 포함함), 또는 아미노-말단에서 CH3 도메인에 (여기서 면역 글로불린 하위 영역이 CH3 및 CH4 도메인을 포함함)), (b) 결합 도메인 (예를 들어, scFv)과 면역 글로불린 이종이량체화 도메인 사이에 개재되어 연결하고, (c) 면역 글로불린 이종이량체화 도메인과 면역 글로불린 불변 영역 (예를 들어, 면역 글로불린 불변 영역은 CH2 및 CH3 도메인, 또는 CH3 및 CH4 도메인을 포함함) 사이에 개재되어 연결하고, (d) 면역 글로불린 불변 영역과 결합 도메인 사이에 개재되어 연결하는, (e) 폴리펩티드 쇄의 아미노-말단에서, 또는 (f) 폴리펩티드 쇄의 카르복실-말단에서의 힌지 영역을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 힌지 영역을 포함하는 폴리펩티드 쇄는 상이한 폴리펩티드 쇄와 회합하여 본원에 제공된 이종이량체 단백질을 형성할 수 있고, 형성된 이종이량체는 그의 표적 특이성 또는 그의 특이적 표적 결합 친화성을 보유하는 결합 도메인을 함유할 것이다.
특정 실시양태에서, 4-1BB-결합 폴리펩티드는 4-1BB를 발현하는 이펙터 세포로 표적 세포를 동원하기 위한 표적 세포 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 세포 결합 도메인은 5T4에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 4-1BB-결합 단백질은 (i) 4-1BB에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 (ii) 5T4에 특이적으로 결합하는 다른 결합 도메인을 포함할 수 있다. 5T4 결합 도메인이 유래될 수 있는 항-5T4 항체의 비제한적인 예로는 PCT 출원 공개 공보 WO 2016/185016 및 PCT 출원 번호 PCT/EP2017/059656에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 4-1BB-결합 폴리펩티드는 2개의 scFv를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 2개의 scFv는 4-1BB-결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2개의 scFv는 동일한 4-1BB-결합 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 2개의 scFv는 상이한 4-1BB-결합 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 제1 scFv로서 4-1BB-결합 도메인 및 제2 scFv로서 표적 세포 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 표적 세포 결합 도메인은 5T4에 특이적인 scFv일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 이중특이적 4-1BB-결합 폴리펩티드 및 단백질은 서열 번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 약 82% 이상, 약 85% 이상, 약 87% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 또는 100% 동일한 항-4-1BB scFv를 포함하되 폴리펩티드는 scFv-Fc-scFv 형식의 다중특이적 폴리펩티드이고, 항 4-1BB VH의 위치 150의 HCDR1에서 Y의 H로의 치환 및/또는 항 4-1BB VH의 위치 127의 FR3에서 R 의 H로의 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 이중특이적 4-1BB-결합 폴리펩티드 및 단백질은 서열 번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항-4-1BB scFv를 포함한다. 예시적인 항-4-1BB scFv에 대한 아미노산 및 핵산 서열이 하기 표 8에 제공된다.
이중특이적 분자
일부 실시양태에서, 본 발명은 2개의 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 5T4-결합 폴리펩티드를 제공하되 하나의 결합 도메인은 5T4에 특이적이고 제2 결합 도메인은 상이한 표적 항원에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 2개의 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 4-1BB-결합 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 결합 도메인은 4-1BB에 특이적이고 제2 결합 도메인은 상이한 표적 항원에 특이적이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 2개의 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 하나의 결합 도메인은 4-1BB에 특이적이고 다른 결합 도메인은 5T4에 특이적이다. 이러한 실시양태는 본원에서 항-5T4 x 항-4-1BB 분자 또는 항-5T4 x 항-4-1BB 폴리펩티드 또는 단백질로 지칭된다. 특정 실시양태에서, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자의 5T4 및 4-1BB-결합 도메인은 각각 5T4 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 scFv 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (i) 5T4-결합 도메인; (ii) 결합 도메인 링커; 및 (iii) 4-1BB-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (i) 4-1BB-결합 도메인; (ii) 결합 도메인 링커; 및 (iii) 5T4-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (또는 카르복실-말단에서 아미노-말단까지 순서대로) (i) 5T4-결합 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 카르복실-말단 링커 (또는 아미노-말단 링커), 및 (v) 제2 결합 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 표 4 내지 7에 나타낸 항-5T4 및 항-4-1BB-결합 도메인 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 5T4-결합 도메인 및 4TBB-결합 도메인을 포함하고, 각각은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 (a) (i) 서열 번호 30, 52 및 60으로 이루어진 군에서 선택되는 HCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 32 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 34의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 8, 42 및 54로 이루어진 군에서 선택되는 LCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 10의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 36의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제1 scFv 도메인, 및 (b) (i) 서열 번호 2, 18, 및 24로 이루어진 군에서 선택되는 HCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 4의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 6의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열 번호 8의 LCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 10의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 12의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제2 scFv 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 5T4-결합 도메인과 4-1BB-결합 도메인을 포함하고, 각각은 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 i) 서열 번호 38, 46, 56 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 40, 44, 48, 50, 58, 66, 68, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 VL을 포함하는 제1 scFv 도메인; 및 ii) 서열 번호 14, 20, 26, 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 VH, 및 서열 번호 16 및 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 VL을 포함하는 제2 scFv 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자의 5T4-결합 도메인은 서열 번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 및 170으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상 또는 100% 동일한 scFv를 포함하거나 그 scFv이고, 여기서 분자는 scFv-Fc-scFv 형식의 다중특이적 폴리펩티드이고, 항-5T4 VL의 위치 99의 LCDR1에서 Y의 F로의 치환 및/또는 항-5T4 VL의 위치 148의 FR3에서 F의 S로의 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자의 5T4-결합 도메인은 서열 번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 및 170으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자의 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 또는 100% 동일한 scFv를 포함하거나 그 scFv이며, 여기서 분자는 scFv-Fc-scFv 형식의 다중특이적 폴리펩티드이고, 항-4-1BB VH의 위치 150의 HCDR1에서 Y의 H로의 치환 및/또는 항-4-1BB VH의 위치 127의 FR3에서 R의 H로의 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자의 4-1BB-결합 도메인은 서열 번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
특정 실시양태에서, 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 CDR 서열, VH/VL 서열, 및/또는 scFv 서열의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174 및 176으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자에 대한 예시적인 아미노산 및 핵산 서열은 표 10 및 11에 제공된다. 표 10 및 11 각각에서, 면역 글로불린 Fc 도메인 (힌지 - CH1 - CH2)은 밑줄 친 텍스트로 표시되고, 결합 도메인 링커 서열은 굵은 글씨로 표시된다.
폴리뉴클레오티드 및 단백질 발현 방법
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질) 또는 본원에 기재된 폴리펩티드의 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)을 포함한다. 본 개시내용의 핵산은 표 1 내지 10, 그 이하에 열거된 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 영역을 갖는 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 핵산은 표 1 내지 10에 나열된 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드에 80% 이상, 전형적으로 약 90% 이상, 더욱 전형적으로 약 95% 이상 또는 약 98% 이상의 동일성을 갖고, 여기서 핵산은 scFv-Fc-scFv 형식의 다중특이적 폴리펩티드인 폴리펩티드를 코딩하고, 코딩된 폴리펩티드는 (1) 항-5T4 VL의 위치 99의 LCDR1에서 Y의 F로의 치환; (2) 항-5T4 VL의 위치 148의 FR3에서 F의 S로의 치환; (3) 항-4-1BB VH의 위치 150의 HCDR1의 Y의 H로의 치환; 및 (4) 항-4-1BB VH의 위치 127의 FR3에서 R의 H로의 치환 중 하나 이상을 포함한다. 본 개시내용의 핵산은 또한 상보적 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 서열은 정렬될 때 완전히 상보적일 것이다 (불일치 없음). 다른 경우에, 서열에는 최대 약 20%의 불일치가 있을 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄를 모두 코딩하는 핵산이 제공된다. 본원에 제공된 핵산 서열은 특정 숙주에서의 발현을 최적화하기 위해 코돈 최적화, 변성 서열, 침묵 돌연변이 및 다른 DNA 기술을 사용하여 이용될 수 있으며, 본 발명은 이러한 서열 변형을 포함한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 상기 핵산 분자는 서열 번호 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 171, 173 및 175로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자는 분자를 벡터에 위치시킴으로써 전파된다. 플라스미드를 포함하여 바이러스성 및 비-바이러스성 벡터가 사용된다. 플라스미드의 선택은 전파가 요구되는 세포의 유형 및 전파의 목적에 따라 달라질 것이다. 특정 벡터는 다량의 목적하는 DNA 서열을 증폭시키고 제조하는데 유용하다. 다른 벡터는 배양 중 세포에서의 발현에 적합하다. 또 다른 벡터는 전체 동물 또는 사람의 세포에서 전이 및 발현에 적합하다. 적절한 벡터의 선택은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 이러한 많은 벡터는 상업적으로 이용 가능하다. 부분 또는 전장 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 벡터에서 절단 제한 효소 부위에 DNA 리가아제 부착에 의해 벡터에 삽입된다. 대안적으로, 원하는 뉴클레오티드 서열은 생체 내 상동 재조합에 의해 삽입될 수 있다. 전형적으로 이것은 원하는 뉴클레오티드 서열의 측면상의 벡터에 상동성 영역을 부착함으로써 달성된다. 상동성 영역은 예를 들어, 올리고 뉴클레오티드의 결찰, 또는 상동성 영역 및 원하는 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 프라이머를 사용한 중합 효소 연쇄 반응에 의해 첨가된다.
발현을 위해, 발현 카세트 또는 시스템이 사용될 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현시키기 위해, 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 숙주 세포 내로 도입된다. 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열 이외에도, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 발현 벡터를 보유하는 세포의 선택에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 유전자 생성물은 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충, 양서류 및 포유 동물 시스템을 비롯한 임의의 편리한 발현 시스템에서 발현된다. 발현 벡터에서, 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드는 원하는 발현 특성을 얻기 위해 적절하게 조절 서열에 연결된다. 여기에는 프로모터, 인핸서, 터미네이터, 오퍼레이터, 리프레서 및 인듀서가 포함될 수 있다. 프로모터는 조절될 수 있고 (예를 들어, 스테로이드 유도성 pIND 벡터 (Invitrogen)로부터의 프로모터) 또는 구성될 수 있다 (예를 들어, CMV, SV40, 신장 인자 또는 LTR 서열로부터의 프로모터). 이들은 벡터에 연결하기 위해 전술한 기술을 사용하여 원하는 뉴클레오티드 서열에 연결된다. 당 업계에 알려진 임의의 기술이 사용될 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 일반적으로 전사 및 번역 개시 영역을 제공할 것이고, 이는 유도 가능하거나 구성 가능할 수 있으며, 코딩 영역은 전사 개시 영역, 및 전사 및 번역 종결 영역의 전사 제어하에 작동 가능하게 연결된다.
발현 카세트 ("발현 단위")는 다양한 벡터, 예를 들어 플라스미드, BAC, YAC, 박테리오파지, 예컨대 람다, P1, M13 등, 식물 또는 동물 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로 바이러스 기반 벡터, 아데노 바이러스 벡터) 등에 도입될 수 있고, 여기서 벡터는 일반적으로 발현 벡터를 포함하는 세포의 선택을 제공하는 능력에 의해 특징 지워진다. 벡터는 특히 플라스미드 또는 바이러스와 같은 염색체 외 유지, 또는 숙주 염색체로의 통합을 위해 제공될 수 있다. 염색체 외 유지가 요구되는 경우, 플라스미드의 복제를 위한 원 서열이 제공되며, 이는 카피 수가 적거나 많을 수 있다. 광범위한 마커를 선택할 수 있는데, 특히 독소로부터, 더욱 특히 항생제로부터 보호하는 마커를 선택할 수 있다. 선택되는 특정 마커는 숙주의 성질에 따라 선택되며, 경우에 따라 영양 요구성 숙주에 상보성을 이용할 수 있다. DNA 작제물의 도입은 예를 들어 접합, 박테리아 형질 전환, 칼슘-침전된 DNA, 전기 천공, 융합, 형질 감염, 바이러스 벡터에 의한 감염, 생물 목록학 등을 비롯한 임의의 편리한 방법을 사용할 수 있다. 본 개시내용은 핵산 세그먼트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 핵산 세그먼트는 서열 번호 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 171, 173 및 175로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 개시내용에서 사용하기 위한 단백질은 통상적인 기술에 따라 유전자 조작된 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 외인성 DNA로 형질 전환 또는 형질 감염되고 배양으로 성장할 수 있는 세포 유형이며, 박테리아, 진균 세포 및 배양된 고등 진핵 세포 (다세포 유기체의 배양된 세포 포함), 특히 배양된 포유 동물 세포를 포함한다. 복제된 DNA 분자를 조작하고 외인성 DNA를 다양한 숙주 세포에 도입하는 기술은 Sambrook and Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001) 및 Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley & Sons, 1999)에 기재되어 있다.
예를 들어, 본원에 기술된 2개의 동일한 결합 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체 결합 단백질의 재조합 발현을 위해, 발현 벡터는 일반적으로 프로모터에 작동 가능하게 연결된 결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 세그먼트를 포함할 것이다. 상이한 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이종이량체 결합 단백질의 재조합 발현을 위해, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄는 전체 이종이량체 단백질의 발현을 위해 숙주 세포에서 별도의 벡터로부터 공-발현될 수 있다. 대안적으로, 이종이량체 결합 단백질의 발현을 위해, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄는 전체 이종이량체 단백질의 발현을 위해 숙주 세포에서 동일한 벡터의 개별 발현 단위로부터 공-발현된다. 발현 벡터(들)는 통상적인 기술에 의해 숙주 세포로 전달되고, 이어서 형질 감염된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 상응하는 결합 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)을 생성한다.
재조합 단백질을 숙주 세포의 분비 경로로 안내하기 위해, 분비 신호 서열 (리더 서열이라고도 함)이 발현 벡터에 제공된다. 분비 신호 서열은 재조합 단백질의 고유 형태의 것일 수 있거나, 또 다른 분비된 단백질 또는 합성된 드 노보 (de novo)로부터 유래될 수 있다. 분비 신호 서열은 폴리펩티드-코딩 DNA 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 즉, 2개의 서열은 정확한 판독 프레임에서 연결되고 새로 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 안내하도록 위치된다. 분비 신호 서열은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 5'로 일반적으로 위치하지만, 특정 신호 서열은 관심 DNA 서열의 다른 곳에 위치할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,037,743 및 5,143,830 참조).
배양된 포유 동물 세포는 본 개시내용 내에서 사용하기 위하여 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 본 개시내용에서 사용하기 위한 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 생산에 적합한 숙주이다. 외인성 DNA를 포유 동물 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 인산 칼슘-매개 형질 감염 (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), 전기 천공법 (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), DEAE- 덱스트란 매개 형질 감염 (Ausubel et al., supra) 및 리포좀 매개 형질 감염 (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993)을 포함한다. 배양된 포유 동물 세포에서 재조합 폴리펩티드의 생성은 예를 들어 미국 특허 번호 4,713,339; 4,784,950; 4,579,821; 및 4,656,134에 기재되어 있다. 적합한 포유 동물 숙주 세포의 예는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (Vero; ATCC CRL 1587), 인간 배아 신장 세포 (293-HEK; ATCC CRL 1573), 아기 햄스터 신장 세포 (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개 신장 세포 (MDCK; ATCC CCL 34), 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44; CHO DXB11 (Hyclone, Logan, UT); 예를 들어, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986 참조)), 쥐 뇌하수체 세포 (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포 (ATCC CCL2.2), 쥐 간암 세포 (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) SV40-변형 원숭이 신장 세포 (COS-1; ATCC CRL 1650) 및 뮤린 배아 세포 (NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다. 추가의 적합한 세포주는 당 업계에 공지되어 있으며 버지니아 주 매너서스(Manassas) 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)과 같은 공공 기탁소에서 입수할 수 있다. SV-40 또는 사이토메갈로 바이러스로부터의 프로모터와 같은 강력한 전사 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,956,288을 참조한다. 다른 적합한 프로모터에는 메탈로티오네인 유전자 (미국 특허 번호 4,579,821 및 4,601,978)로부터의 것들 및 아데노 바이러스 주요 후기 프로모터가 포함된다.
약물 선택은 일반적으로 외래 DNA가 삽입된 배양된 포유류 세포를 선택하는데 사용된다. 이러한 세포는 일반적으로 "형질 감염제"로 지칭된다. 선택적 작용제의 존재하에 배양되고 관심 유전자를 그의 자손에게 전달할 수 있는 세포는 "안정한 형질 감염제"로 지칭된다. 예시적인 선별 마커는 G-418 등과 같은 네오마이신 유형 약물의 존재하에 선택될 수 있게 하는 항생제 네오마이신에 대한 내성을 코딩하는 유전자; 미코페놀산/크산틴의 존재 하에서 숙주 세포 성장을 허용하는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제에 대한 gpt 유전자; 및 제오신, 블레오마이신, 블라쏘시딘 및 하이그로마이신에 내성을 제공하는 마커 (예를 들어, Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990 참조)를 포함한다. 선별 시스템은 또한 "증폭"으로 지칭되는 과정인 관심 유전자의 발현 수준을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 증폭은 낮은 수준의 선택적 작용제의 존재하에 형질 감염체를 배양한 다음, 도입된 유전자의 높은 수준의 생성물을 생성하는 세포를 선택하기 위한 선택적 작용제의 양을 증가시킴으로써 수행된다. 예시적인 증폭 가능한 선별 마커는 디히드로폴레이트 리덕타제이며, 이는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 다른 약물 내성 유전자 (예를 들어, 하이그로마이신 내성, 다약제 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼 라제)도 곤충 세포, 식물 세포 및 조류 세포를 포함하는 다른 고등 진핵 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포에서 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 아그로박테리움 리조겐(Agrobacterium rhizogenes)의 사용은 Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987에서 검토되었다. 곤충 세포의 형질 전환 및 그 안의 외래 폴리펩티드의 생성은 미국 특허 번호 5,162,222 및 PCT 공개 번호 WO 94/06463에 개시되어 있다.
곤충 세포는 일반적으로 아우토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 다면체 바이러스 (AcNPV)에서 유래된 재조합 바큘로바이러스에 감염될 수 있다. King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994); and Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995)를 참조한다. 재조합 바큘로바이러스는 또한 Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993)에 기재된 트랜스포손 기반 시스템을 이용하여 생성할 수도 있다. 전달 벡터를 이용하는 이 시스템은 키트 형태 (BAC-TO-BAC 키트; Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 시판되고 있다. 전송 벡터 (예를 들어, PFASTBAC1, Life Technologies)는 "바크미드(bacmid)"라고 불리는 큰 플라스미드로서 대장균 유지 배큘로 바이러스 게놈에 관심 단백질을 코딩하는 DNA를 이동하는 TN7 트랜스포손을 함유한다. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; and Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995를 참조한다. 또한, 전달 벡터는 상기 개시된 폴리펩티드 연장 또는 친화성 태그를 코딩하는 DNA와의 인-프레임 융합을 포함할 수 있다. 당 업계에 공지된 기술을 사용하여, 단백질-코딩 DNA 서열을 함유하는 전이 벡터를 대장균 숙주 세포로 형질 전환시키고,재조합 바큘로바이러스를 나타내는 중단된 lacZ 유전자를 함유하는 바크미드에 대해 세포를 스크리닝한다. 재조합 바큘로바이러스 게놈을 함유하는 바크미드 DNA는 일반적인 기술을 사용하여 단리되고, Sf9 세포와 같은 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질 감염시키는 데 사용된다. 관심 단백질을 발현하는 재조합 바이러스가 이어서 생성된다. 재조합 바이러스 스톡은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조된다.
단백질 생산을 위해, 재조합 바이러스는 숙주 세포, 전형적으로 밤나방 유충 (fall armyworm), 스포도프테라프 루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (예를 들어, Sf9 또는 Sf21 세포) 또는 트리코플러시아 니 (Trichoplusia ni) (예를 들어, HIGH FIVETM 세포; Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 유도된 세포 주를 감염시키는 데 사용된다. Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994)를 일반적으로 참조한다. 미국 특허 번호 5,300,435도 참조한다. 무 혈청 배지를 사용하여 세포를 성장시키고 유지한다. 적합한 배지 제제는 당 업계에 공지되어 있으며 상업적 공급 업체로부터 얻을 수 있다. 세포는 대략 2-5 x 105 세포의 접종 밀도에서 1-2 x 106 세포의 밀도로 자라며, 이 때 재조합 바이러스 스톡은 0.1 내지 10, 보다 일반적으로 3 근처의 감염 다중도(MOI)로 첨가된다. 사용 절차는 일반적으로 사용 가능한 실험실 매뉴얼에 설명되어 있다 (예컨대, King and Possee, supra; O'Reilly et al., supra; Richardson, supra 참조).
효모 세포를 포함하는 진균 세포가 또한 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)를 생성하기 위해 본 개시내용 내에서 사용될 수 있다. 이와 관련한 효모 종에는, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica)가 포함된다. 외인성 DNA로 S. 세레비지애(S. cerevisiae) 세포를 형질 전환시키고 이로부터 재조합 폴리펩티드를 생성하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 4,599,311; 4,931,373; 4,870,008; 5,037,743; 및 4,845,075에 기재되어 있다. 형질 전환된 세포는 선별 마커, 일반적으로 약물 저항성, 또는 특정 영양소 (예를 들어, 류신)의 부재 하에서 성장하는 능력에 의해 결정되는 표현형에 의해 선택된다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 사용하기 위한 예시적인 벡터 시스템은 가와사키 (Kawasaki) 등 (미국 특허 번호 4,931,373)에 의해 개시된 POT1 벡터 시스템으로, 글루코스 함유 배지에서의 성장에 의해 형질 전환된 세포가 선택될 수 있게 한다. 효모에 사용하기에 적합한 프로모터 및 터미네이터는 해당 효소 효소 유전자 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,599,311; 4,615,974; 및 4,977,092 참조) 및 알코올 탈수소 효소 유전자의 것들을 포함한다. 또한 미국 특허 번호 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936; 및 4,661,454를 참조한다. 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 길레르몬디이(Pichia guillermondii) 및 칸디다 말토사(Candida maltose)를 포함한 다른 효모에 대한 형질 전환 시스템이 당 업계에 알려져 있다. 예를 들어 Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; 미국 특허 번호 4,882,279; 및 Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998를 참조한다. 아스페르길루스(Aspergillus) 세포는 맥나이트(McKnight) 등의 미국 특허 번호 4,935,349의 방법에 따라 이용될 수 있다. 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)의 형질 전환 방법은 수미노(Sumino) 등의 미국 특허 번호 5,162,228에 개시되어 있다. 뉴로스포라를 형질 전환시키는 방법은 라보위츠(Lambowitz)의 미국 특허 번호 4,486,533에 개시되어 있다. 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica)에서 재조합 단백질의 생산은 미국 특허 번호 5,716,808; 5,736,383; 5,854,039; 및 5,888,768에 개시되어 있다.
박테리아 대장균, 바실루스 및 다른 속의 균주를 포함하는 원핵 생물 숙주 세포는 또한 예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자를 포함하는 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질을 생성하는 데 본 개시내용 내에서 유용한 숙주 세포이다. 이들 숙주를 형질 전환시키고 그 안에 복제된 외래 DNA 서열을 발현시키는 기술은 당 업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, Sambrook and Russell의 상기 문헌 참조). 대장균과 같은 박테리아에서 재조합 단백질을 발현할 때, 단백질은 세포질, 전형적으로는 불용성 과립으로 유지될 수 있거나, 박테리아 분비 서열에 의해 주변 세포질 공간으로 향할 수 있다. 전자의 경우에, 세포는 용해되고, 과립은 예를 들어 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여 회수 및 변성된다. 변성 단백질은 이어서 우레아 용액에 대한 투석, 및 환원 글루타티온 및 산화 글루타티온의 조합, 이어서 완충된 식염수 용액에 대한 투석과 같이 변성제를 희석시킴으로써 재폴딩되고 이량체화될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 가용성 형태로 세포질로부터 회수되어 변성제를 사용하지 않고 단리될 수 있다. 단백질은 예를 들어 포스페이트 완충 식염수에서 수성 추출물로서 세포로부터 회수된다. 관심 단백질을 포획하기 위해, 추출물은 고정화된 항체 또는 헤파린-세파로스 컬럼과 같은 크로마토그래피 매체에 직접 적용된다. 분비된 단백질은 세포를 파괴 (예를 들어, 초음파 처리 또는 삼투 충격에 의해)하여 세포질 공간의 내용물을 방출하고 단백질을 회수함으로써 용해 가능하고 기능적인 형태로 주변 세포질 공간으로부터 회수될 수 있으며, 이에 의해 변성 및 리폴딩에 대한 필요성을 제거한다. 단일쇄 항체를 포함하는 항체는 공지된 방법에 따라 박테리아 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 예를 들어, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; 및 Pantoliano et al., Biochem. 30:10117-10125, 1991를 참조한다.
본원 개시의 폴리펩티드 및 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)을 생성하기 위해 형질 전환 또는 형질 감염된 숙주 세포는 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양소 및 기타 성분을 함유하는 배양 배지에서 통상적인 절차에 따라 배양된다. 한정된 배지 및 복합 배지를 비롯하여 다양한 적합한 배지가 당 업계에 공지되어 있으며 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함한다. 배지는 또한 필요에 따라 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분을 함유할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로, 예를 들어, 발현 벡터 상에 운반되거나 숙주 세포로 공동 형질 감염된 선별 마커에 의해 보완되는 필수 영양소에서의 약물 선택 또는 결핍에 의해 외인적으로 첨가된 DNA를 함유하는 세포에 따라 선택할 것이다.
본 개시내용의 단백질 및 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 통상적인 단백질 정제 방법, 전형적으로 크로마토그래피 기술의 조합에 의해 정제될 수 있다. 일반적으로, 친화성 크로마토 그래피: 원리 및 방법 (Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988); Scopes, 단백질 정제: 원리 및 실습 (Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York 1994)를 참조한다. 면역 글로불린 Fc 영역을 포함하는 단백질은 고정화된 단백질 A 또는 단백질 G상의 친화성 크로마토 그래피에 의해 정제될 수 있다. 겔 여과와 같은 추가의 정제 단계는 원하는 순도 수준을 얻거나 탈염, 완충액 교환 등을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
조성물 및 사용 방법
본 개시내용은 5T4의 발현을 특징으로 하는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이러한 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)은 최소 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 활성 및/또는 보체-의존적 세포독성 (CDC) 활성를 유도하거나 유도하지 않는다.
다른 실시양태에서, 결합 단백질 (예를 들어, 다중특이적 결합 단백질)이 이펙터 세포 (예를 들어, 4-1BB)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 경우, 결합 단백질 및/또는 다중특이적 결합 단백질은 대상체에서 5T4-발현 세포에 대해 향상된 이펙터 세포 활성화를 초래한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 결합 단백질 및/또는 다중특이적 결합 단백질은 이펙터 세포 증식의 증가, 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, IFNγ, TNFα, IL-6, IL-8, IL-12, IL-1α 등)의 이펙터 세포 생성의 증가, 또는 하나 이상의 세포-표면 활성화 마커 (예를 들어, CD137, MHC-II 또는 CD69)의 발현 증가를 초래한다. 이펙터 세포의 활성화는 세포 표면 마커 발현의 변화를 평가하기 위한 유동 세포 분석법, 면역 형광법 및 면역 조직 화학법, 사이토카인 및 기타 인자의 생산을 평가하기 위한 ELISA, 증식을 평가하기 위한 세포 수 계수, 유전자 발현의 변화 등을 평가하기 위한 qPCR 등을 포함하여 당 업계에 공지되어 있는 다양한 수단으로 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 다중특이적 결합 단백질은 상이한 구조의 제2 다중특이적 폴리펩티드에 비해 향상된 이펙터 세포 활성화를 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 다중특이적 폴리펩티드는 결합 도메인 링커 및 면역 글로불린 Fc 도메인에 의해 함께 5T4에 특이적으로 결합하는 제1 scFv 도메인 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 다음과 같은 구성으로 포함한다: 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 (i) 제1 scFv 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 결합 도메인 링커, 및 (v) 제2 scFv 도메인. 이 예에서, 제2 다중특이적 결합 단백질은 항 4-1BB 항체와 항-5T4 scFv를 포함하는 IgG-scFv 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 다중특이적 결합 단백질은 제2 다중특이적 폴리펩티드와 비교하여 이펙터 세포 활성화에서 통계적으로 유의미한 향상을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 다중특이적 결합 단백질은 Jurkat/NF-κB 리포터 세포 분석에서 제2 다중특이적 결합 단백질에 대해 관찰된 것보다 낮은 EC50 값을 나타낸다 (예를 들어, 실시예 10 참조). 일부 실시양태에서, 제1 다중특이적 결합 단백질의 EC50는 제2 다중특이적 결합 단백질의 EC50과 비교하여, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배 이상 감소한다. EC50 값은 비선형 회귀 분석 및 당 업계에 알려진 다른 통계적 방법에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 다중특이적 결합 단백질은 제2 다중특이적 폴리펩티드와 비교하여 이펙터 세포 증식에서 통계적으로 유의한 증가를 유도한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 다중특이적 결합 단백질은 제2 다중특이적 결합 단백질에 의해 유도된 증식과 비교하여 프라이밍된 인간 CD8+ T 세포의 증식에서 통계적으로 유의한 증가를 유도한다 (예를 들어, 실시예 22 참조). 일부 실시양태에서, 제1 다중특이적 결합 단백질은 제2 다중특이적 결합 단백질에 의해 유도된 이펙터 세포 증식에 비해, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배 이상의 이펙터 세포 증식의 증가를 유도한다.
대상체를 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)로 치료하는 방법의 특정 변형에서, 장애는 암이다. 본 개시내용의 단백질에 따라 치료할 수 있는 예시적인 암은 예를 들어 유방암 (예를 들어, 삼중 음성 유방암 (TNBC)), 췌장암, 난소암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암), 혈액 악성 종양 (예를 들어, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀 세포 백혈병(MCL) 또는 급성 림프 모구 백혈병(ALL)), 피부암 (예를 들어, 편평 세포 암종 또는 흑색종), 부신암, 방광암, 자궁 경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 갑상선암, 간암, 자궁암, 신경 세포 또는 신경 세포 외피 (예를 들어, 신경 섬유종)에 형성된 종양, 육종, 암종 또는 두 경부암을 포함한다. TNBC는 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2/neu를 위한 염색이 부재한 유방암으로 정의된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 대상체의 중피종을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 대상체의 투명 세포 암종을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 대상체의 줄무늬근 종양을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 5T4를 발현하는 세포에 대한 이펙터 세포 활성화를 향상시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 5T4-발현 세포를 본 개시내용의 단백질(예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 접촉은 5T4-발현 세포에 대한 향상된 이펙터 세포 활성화가 유도되는 조건하에 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 5T4를 발현하는 세포에 대한 이펙터 세포 활성화를 향상시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 5T4-발현 세포를 인간 5T4의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자) 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)을 접촉시키는 것을 포함하되 상기 접촉은 5T4-발현 세포에 대한 향상된 이펙터 세포 활성화가 유도되는 조건하에서 이루어진다. 본 개시내용은 5T4를 발현하는 세포의 이펙터 세포 의존적 용해를 유도하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 5T4-발현 세포를 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 제2 결합 도메인이 4-1BB에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드, 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)과 접촉시키는 것을 포함하되 상기 제2 결합 도메인은 4-1BB에 특이적으로 결합하고 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자); 상기 접촉은 5T4-발현 세포의 향상된 이펙터 세포 활성화가 유도되어 5T4-발현 세포의 용해를 야기하는 조건하에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 5T4를 발현하는 세포의 이펙터 세포 의존적 용해를 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 인간 5T4를 인간 5T4의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자) 본 개시내용의 단백질과 접촉시키는 것을 포함하고; 상기 접촉은 5T4-발현 세포의 향상된 이펙터 세포 활성화가 유도되어 5T4-발현 세포의 용해를 야기하는 조건하에서 이루어진다.
본 개시내용은 또한 5T4의 발현을 특징으로 하는 장애 (예를 들어, 암)의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 단백질 및 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)을 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 항-5T4 및 항-4-1BB-결합 도메인 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)을 포함하고 향상된 이펙터 세포 활성화 활성을 갖는다. 일 실시양태에서, 본 개시내용은 5T4의 발현을 특징으로 하는 장애 (예: 암)를 치료하는데 사용하기 위한 단백질 및 폴리펩티드 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체의 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 장애는 5T4의 발현을 특징으로 하며, 상기 방법은 대상체에게 인간 5T4의 에피토프에 특이적으로 결합하는 5T4 결합 도메인을 포함하는 본 개시내용의 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)를 치료적 유효량 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 환자에게 본원에 기재된 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174, 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열)을 포함하는 폴리펩티드를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 Fc를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 환자에게 5T4-결합 도메인 및 Fc를 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 암이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174, 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 환자에게 5T4-결합 도메인 및 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 암이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 172, 174, 및 176으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 개시내용은 환자에게 5T4-결합 도메인 및 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 암이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 172를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 환자에게 5T4-결합 도메인 및 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 암이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 174를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 방법 및 용도의 경우, 본원에 기재된 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 치료하고자 하는 질환 또는 장애의 관리와 관련된 통상적인 방법론과 일치하는 방식으로 전달된다. 본원의 개시에 따르면, 치료적 유효량의 단백질 또는 폴리펩티드는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)의 투여를 위한 대상체는 5T4 발현을 특징으로 하는 특정 장애의 발병 위험이 높은 환자 및 이러한 장애를 기존에 가지고 있는 환자를 포함한다. 일반적으로, 대상체는 치료하고자 하는 장애가 있는 것으로 진단되었다. 또한, 장애의 임의의 변화 (예를 들어, 장애의 임상 증상의 증가 또는 감소)에 대해 치료 과정 동안 대상을 모니터링할 수 있다. 또한, 일부 변형에서, 대상체는 5T4-발현 세포를 표적화하는 것을 포함하는 치료를 필요로 하는 다른 장애를 겪지 않는다.
예방 용도에서, 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)을 포함하는 제약 조성물 또는 약제는 특정 장애에 걸리기 쉬운 또는 그렇지 않은 경우 위험이 있는 환자에게 그 위험을 제거 또는 감소시키거나 그 장애 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 적용에서, 본 개시내용의 단백질을 포함하는 조성물 또는 약제는 장애의 증상 및 그의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 이러한 장애가 의심되거나 이미 고통받는 환자에게 투여된다. 이를 달성하기에 적합한 양은 치료적으로 유효한 용량 또는 양으로 지칭된다. 예방 및 치료 요법 둘 다에서, 제제는 충분한 반응 (예를 들어, 부적절한 혈관 신생 활성의 억제)이 달성될 때까지 일반적으로 여러 용량으로 투여된다. 전형적으로, 반응이 모니터링되고, 원하는 반응이 사라지기 시작하면 반복 투여량을 제공한다.
본 개시의 방법 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)에 따른 치료 대상 환자를 확인하기 위해, 허용된 스크리닝 방법을 이용하여 특정 장애와 관련된 위험 인자를 결정하거나 대상체에서 확인된 기존 장애의 상태를 측정할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 개인에게 특정 장애로 진단된 친척이 있는지 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 스크리닝 방법은 또한 예를 들어 유전성 성분을 갖는 것으로 알려진 특정 장애에 대한 가족 상태를 결정하기 위한 통상적인 워크업을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 암은 또한 특정 유전성 성분을 갖는 것으로 알려져 있다. 암의 유전성 성분은 예를 들어 형질 전환되는 여러 유전자에서의 돌연변이 (예를 들어, Ras, Raf, EGFR, cMet 등), 특정 HLA 및 킬러 억제 수용체 (KIR) 분자의 존재 또는 부재, 또는 어느 암 세포가 NK 세포 및 T 세포와 같은 세포의 면역 억제를 직접적으로 또는 간접적으로 조절할 수 있는지 (예를 들어, Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007 참조)를 포함한다. 이러한 목적으로, 뉴클레오티드 프로브는 일상적으로 특정 관심 장애와 관련된 유전자 마커를 보유하는 개체를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 특정 장애에 대한 마커를 식별하는데 유용한 광범위한 면역학적 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 특정 종양과 관련된 항원을 검출하기 위해 단일 클론 항체 프로브를 사용하는 다양한 ELISA 면역 분석법이 이용 가능하고 공지되어 있다. 스크리닝은 공지된 환자 증상, 연령 인자, 관련 위험 인자 등에 의해 지시된 바와 같이 구현될 수 있다. 이들 방법은 임상의가 치료를 위해 본원에 기재된 방법을 필요로 하는 환자를 일상적으로 선택할 수 있게 한다. 이들 방법에 따르면, 병리학적 5T4-발현 세포를 표적화하는 것은 독립적인 치료 프로그램으로서 또는 다른 치료에 대한 후속 치료, 보조제 또는 배위 치료 요법으로서 구현될 수 있다.
투여를 위해, 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 제약 조성물은 (i) 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자); 및 (ii) 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)을 포함하는 제약 조성물은 공지된 방법에 따라 제형화되어 제약학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있으며, 치료적 분자는 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와의 혼합물로 조합된다. 담체는 투여가 수용자 환자에 의해 허용될 수 있는 경우 "제약학적으로 허용되는 담체"라고 한다. 멸균 인산염 완충 식염수가 제약학적으로 허용되는 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체, 희석제 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. (예를 들어, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995) 참조.) 제제는 하나 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 바이알 표면 상의 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 동종이량체 또는 이종이량체인 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)를 포함한다. "동종이량체"는 2개의 동일한 폴리펩티드 (예를 들어, 본원에 기재된 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)로부터 형성된 이량체일 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 제약 조성물은 경구 단위 투여 형태, 정맥 내 단위 투여 형태, 비강 내 단위 투여 형태, 좌제 단위 투여 형태, 피내 단위 투여 형태, 근육 내 단위 투여 형태, 복강 내 단위 투여 형태, 피하 단위 투여 형태, 경막 외 단위 투여 형태, 설하 단위 투여 형태 및 뇌내 단위 투여 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 단위 투여 형태는 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 분말제, 로젠지, 과립제, 용액제, 현탁액제, 유제, 시럽제, 엘릭시르제, 서방성 제제, 에어로졸 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)질을 포함하는 제약 조성물은 치료적으로 유효한 양으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 따르면, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 다양한 투여 방식, 예를 들어 근육 내, 피하, 정맥 내, 심방 내, 관절 내, 비경구, 비강 내, 폐내, 경피, 흉막 내, 척수강 내 및 경구 투여 경로로 대상체에게 투여될 수 있다. 예방 및 치료 목적으로 작용제 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)은 단일 볼루스 전달, 연장된 기간에 걸친 연속 전달 (예를 들어, 연속 경피 전달)을 통해 또는 반복 투여 프로토콜 (예를 들어, 시간별, 일별, 주별 또는 월별)을 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
이러한 맥락에서 유효 용량의 결정은 전형적으로 동물 임상 연구에 이어 인간 임상 시험에 기초하고, 모델 대상체에서 대상 장애의 발생 또는 중증도를 상당히 감소시키는 유효 용량 및 투여 프로토콜을 결정함으로써 안내된다. 본 개시내용의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지, 투여되는 다른 약물, 치료가 예방적 또는 치료적인지, 뿐만 아니라 조성물 자체의 특정 활성 및 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 능력을 비롯한 다른 여러가지 요소들에 따라 달라진다. 일반적으로 환자는 인간이지만 일부 질병에서는 비인간 포유 동물일 수 있다. 전형적으로, 투여 요법은 최적의 치료 반응, 즉 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 조정된다. 따라서, 치료 유효량은 또한 임의의 원하지 않는 부수 효과가 본원에 기재된 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 그의 다중특이적 결합 단백질 (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)를 투여하는 유리한 효과에 의해 능가되는 양이다. 본원에 기재된 단백질 또는 폴리펩티드의 투여를 위해, 용량은 대상체 체중의 약 0.1 ㎍ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 1 ㎍/kg 내지 약 50 ㎎/㎏, 더욱 일반적으로 10 ㎍ 내지 5 ㎎/㎏의 범위일 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 작용제의 유효량은 약 1 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 10 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg이다. 이 범위 내의 용량은 예를 들어 하루 또는 매일, 매주, 격주 또는 매월 다중 투여와 같은 단일 또는 다중 투여에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정 변형에서, 요법은 초기 투여에 이어 매주 또는 격주 간격으로 다수의 후속 투여로 구성된다. 다른 요법은 초기 투여에 이어 매월 또는 격월 간격으로 다수의 후속 투여로 구성된다. 대안적으로, 투여는 장애의 임상 증상을 모니터링함으로써 지시된 바와 같이 비정기적으로 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질)을 포함하는 제약 조성물의 투여량은 주치의에 의해 표적 부위에서 원하는 농도를 유지하도록 변화될 수 있다. 예를 들어, 정맥 내 전달 방식이 선택되면, 표적 조직에서 혈류 내 작용제의 국소 농도는 대상체의 상태 및 예상되는 측정 반응에 따라 리터당 조성물 약 0.01 내지 50 나노몰, 때로는 리터당 약 1.0 나노몰, 및 리터당 10, 15, 또는 25 나노몰일 수 있다. 전달 방식, 예를 들어, 표피 전달 대 점막 표면으로의 전달에 기초하여 더 높거나 더 낮은 농도가 선택될 수 있다. 투여량은 투여된 제형의 방출 속도, 예를 들어 비강 스프레이 대 분말, 서방형 경구 또는 주사된 입자, 경피 제형 등을 기준으로 조정되어야 한다. 동일한 혈청 농도 수준을 달성하기 위해, 예를 들어, 방출 속도가 5 나노몰 (표준 조건 하에서)인 서방형 입자는 10 나노몰의 방출 속도인 입자의 투약량의 약 2 배로 투여될 것이다.
본원에 기재된 단백질 및 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질) (예를 들어, 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)는 또한 체중 킬로그램 (mpk) 당 약 0.001 내지 약 10 밀리그램 (mg)의 일일 투여량으로, 바람직하게는 1일 1회 용량 또는 하루에 약 2 내지 6 회 분할 용량으로 제공되어 투여될 수 있다. 인간 성인 환자에게 투여하기 위해, 치료적 유효량은 용량 당 0.2 mg, 용량 당 0.5 mg, 용량 당 1 mg, 용량 당 5 mg, 용량 당 10 mg, 용량 당 25 mg, 용량 당 100 mg, 용량 당 200 mg 및 용량 당 400 mg를 포함하나 이에 제한되지 않는, 용량 당 0.2 mg 내지 800 mg 범위의 용량으로 투여될 수 있고, 일반적으로 연속적인 1일 용량이 치료 과정에서 투여될 수 있다. 본원에 기재된 단백질 및 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드, 및/또는 이의 다중특이적 결합 단백질, 예컨대 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)는 하루 중 다른 시간에 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 최적 치료 용량은 저녁에 투여될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 최적 치료 용량은 아침에 투여될 수 있다. 따라서 본원에 기술된 단백질 및 폴리펩티드의 총 일일 용량은 한 실시양태에서 약 1 mg 내지 약 2 g의 범위일 수 있이고, 종종 약 100 mg 내지 약 1.5 g의 범위일 수 있으며, 가장 흔히 약 200 mg 내지 약 1200 mg의 범위일 수 있다. 전형적인 70 kg 성인 인간의 경우, 항-5T4 치료제의 총 일일 투여량은 약 2 mg 내지 약 1200 mg의 범위일 수 있고, 종종 상기 인용된 바와 같이 약 0.2 mg 내지 약 800 mg의 범위일 것이다.
고형 종양의 치료와 관련하여, 종말점 및 항-종양 활성을 평가하기 위한 프로토콜이 당 업계에 널리 공지되어 있다. 각 프로토콜은 종양 반응 평가를 다르게 정의할 수 있지만 RECIST (고형 종양의 반응 평가 기준) 기준은 현재 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 종양 반응 평가를 위한 권장 지침으로 간주된다 (Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000 참조). RECIST 기준에 따르면 종양 반응은 모든 측정 가능한 병변 또는 전이의 감소 또는 제거를 의미한다. 적어도 하나의 치수에서 통상의 기술로 > 20 mm, 또는 의료 사진이나 X 선에 의해 명확하게 정의된 나선형 CT 스캔, 전산화 단층 촬영술 (CT), 자기 공명 영상 (MRI), 또는 임상 검사 (병변이 피상적인 경우)로 > 10 mm로 정확하게 측정할 수 있는 병변을 포함하는 경우, 질병은 일반적 측정 가능한 것으로 간주된다. 측정 불가능한 질병은 이 질환이 통상의 기술로 < 20 mm, 또는 나선형 CT 스캔으로 < 10 mm의 병변, 그리고 진정으로 측정 불가능한 병변 (정확히 측정하기에는 너무 작음)을 포함함을 의미한다. 측정 불가능한 질병에는 흉막 삼출액, 복수 및 간접적 증거로 문서화된 질병이 포함된다.
프로토콜이 고형 종양 반응을 평가하기 위해서는 객관적인 상태에 대한 기준이 필요한다. 대표적인 기준은 다음을 포함한다: (1) 모든 측정 가능한 질병의 완전한 소멸; 새로운 병변 없음; 질병 관련 증상 없음; 측정 불가능한 질병의 증거 없음으로 정의된 완전 반응 (CR); (2) 표적 병변의 가장 긴 직경의 합에서 30% 감소로 정의된 부분 반응 (PR) (3) 표적 병변의 가장 긴 직경의 합에서 20% 증가, 또는 새로운 병변의 발생으로 정의되는 진행성 질환 (PD); (4) CR, PR 또는 진행성 질환에 적합하지 않은 것으로 정의된 안정 또는 무 반응. (Therasse et al., 상기 문헌 참조.)
종양학 분야 내에서 허용되는 추가 종점에는 전체 생존 (OS), 무병 생존 (DFS), 객관적 반응률 (ORR), 진행까지의 시간 (TTP) 및 무 진행 생존 (PFS)이 포함된다 (산업 지침: 암 의약품 및 생물 제제 승인을 위한 임상 시험 종점 (Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics, April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD.) 참조).
본원에 기재된 단백질 및 폴리펩티드 (예를 들어, 5T4-결합 폴리펩티드, 4-1BB-결합 폴리펩티드 및/또는 그의 다중특이적 결합 단백질, 예컨대 항-5T4 x 항-4-1BB 분자)를 포함하는 제약 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 제약 조성물을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 제약 조성물은 예를 들어 단일 또는 다중 용량의 주사용 용액 형태로, 또는 주사 전에 재구성되는 멸균 분말로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 이러한 키트는 제약 조성물의 투여를 위한 건조 분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기 또는 분무기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 제약 조성물의 적응증 및 용도에 대한 서면 정보를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 명백해질 것이며, 이는 본 발명을 순전히 예시하는 것일 뿐 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: "1618" 항-CD137 단일 클론 항체의 scFv 형식으로의 전환 및 ADAPTIR TM 형식 (scFv-Fc-scFv)의 이중특이적 항-CD137 x 항-5T4 분자의 생성
1618 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위해, 1618 항-4-1BB 단일 클론 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 (각각 서열 번호 28 및 16)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 합성하고/거나 기존의 플라스미드 DNA로부터 증폭되었고, 예를 들어, PCT 출원 공개 공보 번호 WO 2007/146968, WO 2010/040105 및 WO 2010/003108; 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0051844; 및 미국 특허 번호 7,166,707 (이들로 제한되는 것은 아님)에 개시된 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 (Gly)4Ser-기반 링커에 의해 함께 연결되었다. 이어서, 1618 scFv의 뉴클레오티드 서열을 점 돌연변이를 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역 서열에 융합시켜 Fc 영역의 이펙터 기능 활성을 제거했다. 마찬가지로 1210 항-5T4 단일 클론 항체의 VH 및 VL 도메인 (각각 서열 번호 38 및 68)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가의 (Gly)4Ser-기반 링커에 의해 함께 연결했다. 생성된 이중특이적 분자를 HEK-293 또는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포의 일시적 형질 감염을 통해 발현시키고 단백질 A 친화도 정제 (ProA) 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 조절된 배지로부터 정제했다. 단백질 순도는 각 단백질 A 및 SEC 정제 단계 후 분석 SEC에 의해 결정되었다. 시험관내 활성 분석 결과가 내독소의 존재에 의해 혼동되지 않도록 하기 위해 제조자의 지시에 따라 내독소 PTS 기구를 사용하여 내독소 수준을 결정했다. 각 단백질 배치를 SEC 정제 공정의 일부로 PBS로 완충제 교환하고, 1 mg/mL로 농축하고, 멸균 여과하고, 필요할 때까지 4℃에서 저장했다. 280 nm에서의 흡광도 및 이론적 흡광 계수를 사용하여 단백질 농도를 측정했다.
일부 경우에, 이중특이적 분자는 N-말단에서 C-말단까지 1618 scFv - Fc - 1210 scFv 구조를 갖는 2개의 scFv 및 1개의 Fc 도메인 (scFv-Fc-scFv)으로 구성되었다. 1618 scFv가 작제물의 C-말단에, 1210 scFv가 N-말단에 위치한 (즉, 1210 scFv - Fc - 1618 scFv) 추가 이중특이적 분자가 생성되었다. 그러나, 이러한 대안적인 배향을 갖는 분자는 1618 scFv - Fc - 1210 scFv-Fc-scFv 분자와 비교하여 평가했을 때 바람직한 특성이 덜했다.
1618-Fc-1210 scFv-Fc-scFv ADAPTIRTM 분자의 전부는 아니지만 대부분 (예: ALG.APV-006, ALG.APV-010, ALG.APV-014 및 ALG.APV-018)은 모리슨 형식 (즉, ALG.APV-004)과 비교하여, HEK-293 세포로 일시적으로 형질 감염될 때 발현 수준이 상당히 개선되었다. 표 12는 모리슨 이중특이적 작제물 (ALG.APV-004)에 비해 ADAPTIRTM 이중특이적 분자 (예를 들어, ALG.APV-006, ALG.APV-010, ALG.APV-014 및 ALG.APV-018)의 개선된 발현 수준을 나타내는 대표적인 데이터를 포함한다. 1618 및 1210 가변 도메인의 아미노산 서열이 이러한 개선을 얻기 위해 변형되지 않았기 때문에 이것은 예기치 않은 결과였다. 이러한 결과는 ADAPTIRTM 이중특이적 분자가 치료용 단백질 약물의 제조에 유리할 수 있음을 나타내는데; 보다 높은 발현 수준은 일반적으로 치료용 단백질 약물 제조에 유리한 것으로 여겨지며, 이는 시장의 요구 사항을 충족시키는 데 필요한 생산 횟수를 감소시키는 것과 같이 제품의 비용을 낮추고 제조 공정에 있어서 다른 효율을 제공할 수 있기 때문이다.
HEK-293에서의 명백한 개선된 발현에 추가하여, 조절된 배지로부터의 이중특이적 분자의 단백질 A 정제 후 정량된 응집 수준은 표 12에 나타낸 바와 같이 모리슨 형식 이중 특이성 (ALG.APV-004)과 비교했을 때 ADAPTIRTM 이중 특이성 (ALG.APV-006, ALG.APV-010, ALG.APV-014 및 ALG.APV-018)에서 상당히 개선되었다.
VH 및 VL 도메인의 순서는 1210 및 1618 scFv (VH-VL 또는 VL-VH)을 모두 평가하였으며, VL-VH 배향이 이용되었을 때 scFv-FC-scFv 분자의 발현 수준이 현저하게 감소하였기 때문에, 1618 scFv의 바람직한 배향은 VH-VL 것으로 결정되었다. 1210 scFv의 바람직한 배향은 VH-VL이며, 이는 표 13에 나타낸 바와 같이 VL-VH 형식의 1210 scFv로 구성된 이중 특이성 분자와 비교할 때 CD137 리포터 분석에서 5T4-발현 세포에 대한 개선된 결합 및 시험관 내 활성을 부여했다.
1618 및 1210 scFv의 VH 및 VL 도메인 사이의 링커의 길이 또한 평가했다. VH 및 VL을 연결하는 링커 길이를 Gly4Ser 링커의 4X 또는 3X 반복체로 변경해도 활성 또는 안정성에 큰 차이가 나타나지 않는 것으로 나타났으므로 (데이터는 표시되지 않음) 달리 달리 언급하지 않는 한, 4X 반복체가 일반적으로 사용되었다.
실시예 2: 1618 항-CD137scFv 및 항-5T4 scFv를 결합 도메인의 최적화
ADAPTIRTM 이중 특이성 (ALG.APV-006)의 초기 특성화 후, 1) 이들 각각의 표적에 대한 scFv 결합 도메인의 결합 친화도; 2) 생물 물리학적 안정성; 및 3) 시험관 내 활성을 증가시키는 것이 바람직했다. 이들 파라미터의 개선은 제품 비용, 제조 용이성 및 임상 투여 용량 감소로 이어질 것으로 예상된다. 결합 도메인 최적화를 위해서, 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 이용하여 1618 및 1210 scFv 모두에 대해 무작위 돌연변이 유발 파지 라이브러리를 생성하였다. 간략하게, 각각의 scFv는 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 돌연변이 유발 키트 (GeneMorph II 무작위 돌연변이 생성 키트, Agilent Technologies)를 사용하여 오류가 발생하기 쉬운 PCR 반응에서 주형으로 사용되었다. epPCR 생성물을 소화시키고, 파지미드-scFV 벡터에 결찰시키고, 대장균 SS320/M13K07 컴피턴트 세포로 형질 전환시켜 파지 라이브러리를 생성시켰다. 비오티닐화된 4-1BB 또는 5T4 ECD (각각 1618 또는 1210 결합 도메인에 대해)를 항원으로 사용하여 각 라이브러리에서 5회 패닝을 수행했다. 항원 농도를 감소시키고 세척 시간을 증가시킴으로써 각 연속 라운드마다 증가된 패닝 엄격성이 이용됐다. 패닝 최종 라운드 후에, 파지 출력을 도금하고 준비된 ADAPTIRTM 발현 벡터로의 scFv 풀의 대량 복제를 준비했다. 대략 400개의 개별 콜로니를 골라 내고, 파지미드를 단리하고 서열 분석하고, 고-처리량 소규모 293 일시적 형질 감염 (약 0.6 mL 배양 부피)에 정제된 DNA를 사용했다. 5일 정화된 상청액을 유동 세포 분석법 및 SPR으로 결합에 대해 분석했다. 그런 다음, 세포 결합, 시험관 내 활성 및 다양한 안정성 분석을 포함하는 시험 배터리를 통해 가장 우수한 변이체를 달성했다. 이러한 이중특이적 ADAPTIRTM 변이체는 다른 scFv는 수정되지 않은 모 서열로 유지하는 반면, 1210 또는 1618 scFv로의 변경으로 생성되었다. 이것은 데이터의 해석을 단순화하고 결합, 활성 및 안정성에 대한 이러한 단일 변경의 영향을 평가할 수 있게 했다. 안정성, 친화성 또는 생체 활성의 개선에 기초하여 유익한 점 돌연변이가 확인되었다. 이어서 이들을 조합하여 ADAPTIR DNA 작제물의 추가 세트를 생성했다. 이들 작제물은 1210 및/또는 1618 scFv에서 다수의 변화를 포함시켰다. 각각의 작제물은 250 mL의 배양 부피에서 일시적인 형질 감염을 통해 HEK-293 세포에서 발현시키고 ProA 및 SEC 단계를 이용하여 정제했다. 최종 단백질 순도는 분석 SEC에 의해 확인되었고, 시험관 내 활성 분석 결과가 내독소의 존재에 의해 혼동되지 않도록 제조사의 지시에 따라 내독소 PTS 기기를 사용하여 내독소 수준을 결정했다. 생성된 단백질을 SEC 정제 공정의 일부로서 PBS로 완충제 교환하고, 1 mg/mL로 농축하고, 멸균 여과하고, 필요할 때까지 4℃에서 저장했다. 280 nm에서의 흡광도 및 이론적 흡광 계수를 사용하여 단백질 농도를 결정했다.
실시예 3: 파지 유래 최적화된 변이체의 평가
모 ALG.APV-006 작제물과 비교할 때, 1210 및 1618 scFv 로의 몇몇 유리한 아미노산 변화가 파지 패닝 노력의 일부로서 확인되었다. 단백질 콜로이드 안정성의 한 가지 척도는 암모늄 설페이트를 약 1M의 최종 농도에 첨가될 때 용액으로부터 침전되는 단백질의 양을 조사하는 것이다. 이러한 조건 하에서, 모 작제물 ALG.APV-006은 용액 중에서 단백질의 거의 89%를 소실했다 (표 14). 이에 비해, ALG.APV-099, ALG.APV-127, ALG.APV-148 및 ALG.APV-150으로 표시되는 변화는 모두 이러한 조건에서 단백질 손실이 감소된 것으로 나타났으며, 이는 이러한 작제물에서 이루어진 개별 아미노산 변화가 ADAPTIRTM 이중 특이성의 콜로이드 안정성을 개선시킴을 시사한다. 단백질 안정성의 또 다른 척도는 단백질 샘플에 전단력을 가하고 이중 특이성의 가용성을 갖는 응집된 형태의 침전 또는 형성으로 인한 손실에 대해 샘플을 검사하는 것이다. 단백질 용액을 96-웰 플레이트에 놓고 2시간 동안 2,000 RPM에서 진탕하는 전단 분석으로 평가했을 때, ALG.APV-127 돌연변이는 단백질 손실의 양을 현저히 감소시켰지만, 다른 변이체는 최소의 효과 또는 약간 악화된 손실을 보였다 (표 14). 열 안정성의 다른 척도는 시차 주사 열량계 (DSC) 또는 시차 주사 형광 측정기 (DSF)를 사용하여 Tm으로도 알려져 있는 용융 곡선의 중간점 온도를 결정함으로써 결정될 수 있다. 1618 및 1210 변이체의 Tm을 결정할 때, ALG.APV-127 및 ALG.APV-150 변이체는 ALG.APV-006 모 서열과 비교할 때 1618 scFv의 Tm을 3 내지 4도 증가시켰다 (표 14). Tm 값의 증가는 단백질이 열-유도된 펼침/변성에 더욱 내성이 있음을 의미하기 때문에 일반적으로 접힌 단백질의 안정성이 개선된 것으로 해석될 수 있다. ALG.APV-148은 1210 scFv의 열 안정성을 증가시켰는데, 이는 Tm이 ALG.APV-006에 사용된 모 1210 서열에 비해 거의 3도 증가했기 때문이다.
ALG.APV-099, ALG.APV-127, ALG.APV-148 및 ALG.APV-150 돌연변이의 다양한 조합을 평가하여 조합 돌연변이가 ADAPTIRTM 이중특이적 작제물의 생물 물리적 안정성에 부가적인 이점을 제공하는 지를 보았다. 이들은 동일한 방법을 이용하여 발현 및 정제되었고 개별 점 돌연변이와 동일한 분석법으로 평가되었다. 표 14의 결과는 대표적인 예로서 ALG.APV-178 및 ALG.APV-179에 포함된 돌연변이의 조합이 개별 변화로부터 수득된 것보다 일반적으로 동등하거나 더 우수한 안정성 증가를 가져왔음을 보여준다.
수행된 안정성 평가에 더하여, ALG.APV-006 및 파지 유래 변이체의 결합 친화도를 인간 5T4 및 인간 CD137의 재조합 세포 외 도메인을 사용하여 Biacore T-200을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 결정하였다. ALG.APV-127 및 ALG.APV-150 변형은 CD137에 대한 결합 친화도를 상당히 더 강하게 만들었다 (표 15). 유사하게, ALG.APV-099는 ALG.APV-006보다 상당히 더 밀접하게 결합하는 것으로 관찰되었다 (각각 149 대 13 nM).
세포 표면에서 발현된 CD137 및 5T4에 대한 ALG.APV-099, ALG.APV-127, ALG.APV-148 및 ALG.APV-150 변이체의 결합을 ALG.APV-006의 결합과 비교하였다. 이들 돌연변이 중 일부가 나타내는 가용성 CD137 또는 5T4에 대한 개선된 친화도에도 불구하고, 세포 상(on-cell) 결합 실험에서는 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). CD137의 표적-의존적 활성화를 유도할 때 파지-디스플레이 유래 변이체의 효과를 비교하기 위해, 변이체를 CD137 리포터 분석에서 비교했다.
CD137 리포터 분석: NF-κB 프로모터 (Promega)의 제어하에 루시퍼라제 리포터 유전자를 보유하는 Jurkat/CD137 형질 감염체를 제조사의 프로토콜에 따라 배양했다. Jurkat/NF-κB 리포터 세포는 96-웰 플레이트에서 대략 15,000 리포터 세포대 30,000개의 표적 세포로 인간 5T4로 형질 감염된 CHO-K1 세포와 함께 배양했다. 최종 농도가 10 nM 내지 0.002 nM 범위가 되는 이중특이적 분자의 농도를 첨가했다. 세포를 1% 소태아혈청, 피루브산 나트륨, 항생제 및 비필수 아미노산이 보충된 총 부피 100 ㎕의 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 5 내지 6시간 동안 인큐베이션했다. 100 마이크로 리터의 Bio-Glow 완충액 (Promega)을 각 웰에 첨가하고 5 내지 10분 동안 인큐베이션하여 형광을 측정하였다. MicroBeta2 2450 마이크로 플레이트 카운터 (Perkin Elmer)에서 발광을 측정했다. EC50 값을 결정하기 위한 비선형 회귀 분석을 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어에서 수행했다.
도 1은 모든 작제물이 5T4(+) 세포의 존재 하에서 작용제 기능을 나타냄을 보여주고; 5T4(+) 세포의 부재하에 리포터 활성이 관찰되지 않았다 (도시되지 않음). 작제물 ALG.APV-099, ALG.APV-127, ALG.APV-148 및 ALG.APV-150은 원래의 ALG.APV-006 작제물보다 더 우수한 작용제 기능 (더 낮은 EC50 값)을 나타냈다. 곡선의 모든 점은 복제 웰의 평균을 나타낸다. 비교를 위해 모리슨 형식 분자 ALG.APV-004를 포함하였다. y축은 최대 형광의 백분율로 표시되는 상대 형광 단위 (RLU)의 값을 보여준다.
ALG.APV-099, ALG.APV-127, ALG.APV-148 및 ALG.APV-150으로 표시되는 단일 점 돌연변이로 얻은 개선으로 인해, 개체의 특성이 동일한 단백질에 포함될 때 부가적인 이점을 가지는 지 결정하기 위해 다양한 방식으로 조합하였다. 이러한 독특한 돌연변이는 ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196, ALG.APV-198 및 ALG.APV-199와 같이 현저하게 개선된 특성을 갖는 1618 및 1210 scFv의 변이체를 유도하기 위해 조합하여 평가되었다. ALG.APV-191, ALG.APV-196, ALG.APV-198 및 ALG.APV-199 작제물을 생성하기 위해, 단일 점 돌연변이를 PCT 출원 번호 PCT/EP2017/059656의 실시예 22 및 23에 기재된 LO1, LO2 및 LO11 돌연변이와 추가로 조합했다. 또한, 불안정성에 기여할 수 있는 영역을 식별하기 위해 1618 및 1210 scFv의 영역을 분석한 후 표적화된 파지 라이브러리를 생성했다. 그러나 이러한 라이브러리를 패닝해도 특성이 개선된 scFv가 생성되지 않았다 (데이터는 표시하지 않음).
실시예 4: 이황화 결합 안정화 평가
1618 및 1210 scFvs 모두의 VH 및 VL 도메인으로 추가 시스테인 잔기를 포함하도록 점 돌연변이를 만들었다. 이들 이중특이적 분자가 발현될 때, 이들 시스테인은 반응하여 이황화 결합을 형성하고 scFv의 안정성을 증가시키고 이들 생성물의 제조 및 저장을 개선하는 데 유리한 특성을 부여하도록 작용할 수 있다. 1210 scFv에서 안정화 이황화물을 갖는 최적화된 이중특이적 분자를 4 또는 25℃에서 1주일 동안 저장하거나 -80℃ 내지 실온 사이에서 3번의 동결-해동 사이클을 진행했을 때, 이들의 순도가 이황화물이 없는 이중특이적 분자보다 우수하게 유지된다는 실험을 수행했다. 대표적인 데이터는 표 16에 나와 있다. 1618 scFv에 안정화 이황화 결합을 첨가하는 것 또한 평가하였다. 이황화물이 안정성 이점을 제공하는 것으로 보이지만, Biacore 결합 데이터는 샘플에 이종성이 존재하여 비정형 결합 동역학을 유발한다는 것을 시사했다 (데이터는 표시하지 않음).
1210 scFv에 안정화 이황화 결합을 포함하여 이중특이적 분자 안정성이 개선되는 것은 40℃에서 수행된 후속 평가에서도 명백했다. ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 두 작제물은 ALG.APV-210의 1210 scFv에 안정화 이황화물의 첨가가 상이하다. 이 승온한 온도에서 1주 후 ALG.APV-210이 훨씬 적은 응집 물질을 형성했다 (표 17).
1210에의 이황화 결합의 포함은 저장 안정성에 상당한 이점을 제공하지만, 평가된 다른 안정성 파라미터에서는 두 작제물 사이의 유의한 차이가 발견되지 않았다 (표 18). 모 이중특이적 분자 ALG-006 (표 14)과 비교하여 이들 분석에서 두 작제물 모두 유의하게 더 우수하게 수행되었다.
실시예 5 : 이중특이적 scFv2Fc 단백질의 인간 5T4 및 인간 CD137에 대한 결합 친화도의 평가
방법
재조합 인간 5T4 및 인간 CD137 세포 외 도메인 (ECD)의 발현 및 정제: 표준 분자 생물학 기술을 이용하고 5T4 및 CD137 단백질의 전장 서열을 인코딩하는 벡터로 시작하여, 인간 5T4 및 인간 CD137의 세포 외 영역을 증폭시키도록 뉴클레오티드 프라이머를 설계했다. 천연 단백질이 막으로 들어갈 것으로 예상되는 위치에서 ECD의 c-말단에 추가의 펩티드 서열을 첨가했다. 이 펩티드는 친화성 정제 목적으로 이용될 수 있는 인식 서열을 함유했다. 발현 벡터를 HEK-293 세포에 일시적으로 형질 감염시켰다. 재조합 ECD를 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 조절된 배지로부터 정제했다. 단백질 순도는 분석 SEC를 사용하여 확인되었다.
재조합 CD137 및 5T4 엑토-도메인에 대한 이중특이적 단백질의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 친화도 분석: 재조합 단량체 5T4 및 CD137 엑토 도메인 (ECD)에 대한 이중특이적 항-5T4 x 항-CD137 단백질의 SPR 결합 친화도 연구를 25℃에서Biacore T200 시스템 상의 HBS-EP+ 완충액 중에서 수행했다. 10 mM 소듐 아세테이트 (pH 4.5)에서 20 ㎍/mL의 염소 항-인간 IgG F(ab')2 단편(Jackson ImmunoResearch)을 CM5 연구급 센서 칩 (GE)의 유동 세포에 2000 응답 단위 (RU)의 밀도로 표준 아민 커플링 화학에 의해 고정시켰다. HBS-EP+ 완충액 내 200 nM의 각각의 이중특이적 변이체는 고정된 항-인간 IgG를 갖는 유동 세포에서 60초 동안 50 ㎕/분의 유속으로 포획되어 약 500 RU 반응에 도달시키고, 하나의 유동 세포 표면은 기준로서 변형시키지 않고 남겨두었다. 30초의 안정화 기간 후, 4 가지 상이한 농도를 갖는 각 ECD (0, 20, 60 및 180 nM)를 50 ㎕/분으로 120초간 주입 후 240초의 해리 기간 (5T4의 경우)을 갖거나, 90초간 주입 후 180초의 해리 기간 (4-1BB의 경우)을 갖게 했다. 재생은 10 mM 글리신 (pH 1.5)을 30초 동안 50 ㎕/분의 유속으로 이중 주사한 후 1분 동안 HBS-EP+ 완충제 안정화시킴으로써 달성되었다.
동역학 SPR 측정으로부터 얻어진 센서그램을 이중 감산법에 의해 분석했다. 기준 유동 세포로부터의 신호를, 고정화되거나 포획된 리간드를 갖는 유동 세포로부터 수득된 분석물 결합 반응으로부터 공제했다. 완충액 기준 반응은 다중 주사에서 평균했다. 이어서, 평균 완충제 기준 반응을 분석물 결합 반응으로부터 공제하고, 최종 이중으로 기준이 된 데이터를 전 세계적 피팅 데이터인 Biacore T200 평가 소프트웨어 (2.0, GE)로 분석하여 운동 파라미터를 도출했다. 모든 센서그램은 간단한 일대일 바인딩 모델을 사용하여 피팅되었다.
결과
표 19는 CD137 및 5T4에 결합하는 ADAPTIRTM 이중 특이성에 대해 SPR로 결정된 결합 파라미터를 보여준다. 칩에 포획되고 재조합 단량체 CD137 또는 5T4 ECD를 주입하는 이중특이적 분자로, 이 형식으로 친화도 측정을 수행하면 결합 효과에 의해 혼동되지 않는 진정한 친화도 값이 생성되어야 한다. 표 19에 나타낸 바와 같이, 무작위 파지 라이브러리를 신중하게 스크리닝하여 결합 도메인 변이체를 단리하여 항-CD137 및/또는 항-5T4 scFv 중 어느 하나의 결합 친화도를 현저하게 개선시킬 수 있었다. Hu CD137 KD 값의 큰 감소는 최적화된 ADAPTIRTM 이중특이적 ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210을 최적화되지 않은 모 작제물 ALG.APV-006와 비교하여 달성되었다. 유사하게, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210은 최적화되지 않은 ALG.APV-006과 비교할 때 인간 5T4에 대해 개선된 친화도 값을 나타냈다.
실시예 6 : 인간 5T4 및 인간 CD137에 대한 이중특이적 scFv-Fc-scFv 단백질의 열 안정성 평가
시차 주사 열량계 (DSC) 및 시차 주사 형광 측정기 (DSF)는 재조합 단백질의 구조적 안정성을 평가하기 위해 전형적으로 사용되는 도구이다. 단백질 샘플의 온도를 증가시키는데 필요한 에너지를 측정함으로써, 개별 단백질 도메인의 용융점 (Tm)의 중간점을 결정할 수 있다. 더 높은 Tm 값을 갖는 단백질 도메인이 보다 안정한 것으로 간주되는 것이 일반적으로 받아 들여진다. DSF 분석은 최적화된 이중특이적 ADAPTIRTM 이중특이적 단백질 (ALG.APV-178, ALG.APV-179 및 ALG.APV-187)의 세트로 수행되었으며 최적화되지 않은 ADAPTIRTM 이중 특이성 버전 (ALG.APV-006)과 비교되었다 (표 20). 1618 항-CD137 및 1210 항-5T4의 Tm의 유의한 증가는 상기 기재된 무작위 돌연변이 유발 파지 디스플레이 접근법에 의해 확인된 유리한 돌연변이의 도입 후 관찰되었다.
실시예 7: 인간 및 비인간 영장류 CD137(+) 세포주에 대한 이중특이적 scFv-Fc-scFv 단백질 분자의 결합
가변 도메인 또는 도입된 돌연변이의 scFv 전환시에 세포 표면상의 CD137에 대한 결합이 소실되지 않았음을 확인하기 위해, 유동 세포 측정법을 사용하여 작제된 이중특이적 CD137 x 5T4 결합 ADAPTIRTM 분자의 인간 또는 시노몰구스 마카크 (cynomolgus macaque) CD137을 발현하는 세포주에 대한 결합을 정량했다.
CD137을 발현하는 CHO-K1 세포주에 대한 결합 연구를 표준 유동 세포 측정법 기반 염색 절차에 의해 수행했다. CHO-K1 세포 (Alligator 사에 의해 생성됨)를 인간 또는 시노몰구스 마카크 CD137로 형질 감염시켰다. 전형적인 실험은 96-웰 플레이트에서 2% BSA 및 2 mM EDTA를 함유한 50 ㎕의 식염수 완충액에서 100 nM 내지 0.05 nM 범위의 결합 분자로 얼음에서 30분 동안 웰당 대략 100,000개의 세포를 표지하고, 이어서 세척하고 PE-표지된 2차 항체인 염소 항-인간 IgG Fcγ (Jackson Laboratory)와 함께 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션한다. 결합된 분자로부터의 신호는 LSR-IITM 또는 Symphony A3 유동 세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 검출하고 FlowJo 유동 세포 분석 소프트웨어으로 분석하였다. 이중 세포를 배제한 후 살아있는 세포에서 결합된 분자의 중간 형광 강도 (MFI-중앙)를 측정했다. EC50 값을 결정하기 위한 비선형 회귀 분석을 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어에서 수행했다.
도 2는 CHO-K1/인간 CD137 세포주에 대한 7개의 ADAPTIRTM 분자 (ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196 및 ALG.APV-198)의 결합 곡선을 보여준다. 모든 분자는 유사한 수준의 결합 (EC50 값) 및 포화를 나타냈다. 도 3은 CHO-K1/시노몰구스 CD137 세포주에 대한 동일한 7개의 작제물의 결합 곡선을 보여준다. 시노몰구스 표적상의 7개의 작제물 모두에서 유사한 수준의 결합 및 포화가 관찰되었다. 도 12는 CHO-K1/인간 CD137 세포주에 대한 6개의 ADAPTIRTM 분자 (ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210) 및 모리슨 형식 대조군 ALG.APV-004의 결합 곡선을 보여준다. 모든 분자는 0.3 내지 0.6 nM 범위에서 유사한 EC50 값 및 유사한 수준의 포화를 나타냈다.
실시예 8: 인간 및 비인간 영장류 5T4(+) 세포주에 대한 이중특이적 scFv-Fc-scFv 단백질의 결합
scFv 도메인으로의 변화가 도입된 후 암 세포 표면상의 5T4의 결합을 비교하기 위해, 유동 세포 측정법을 이용하여 작제된 이중특이적 CD137 x 5T4 결합 ADAPTIRTM 분자의 5T4를 발현하는 세포주에 대한 결합을 정량화했다.
5T4(+) 세포주에 대한 이중특이적 CD137 x 5T4 분자의 결합: 이중특이적 ADAPTIRTM 분자 (ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-196, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210)의 결합 특성들을 비교했다. 결합 연구는 표준 유동 세포 분석법 기반 염색 절차에 의해 수행하여 5T4를 발현하는 2개의 세포주: (인간) 5T4를 발현하는 인간 또는 시노몰구스 마카크 5T4로 형질 도입된 CHO-K1 세포 (Alligator 사로부터 입수) 및 SKOV-3 인간 난소 선암종 세포에 대해 수행했다. 모든 표지 및 세척을 0.1% BSA 및 2 mM EDTA를 함유하는 식염수 완충액 중에서 U-바닥 96-웰 플레이트에서 수행했다. 세포를 웰당 대략 100,000개의 세포로 플레이팅하고, 얼음상에서 30분 동안 50 ㎕ 부피/웰로 100 nM 내지 0.05 nM 농도 범위의 시험 분자와 함께 인큐베이션했다. 세포를 3회 세척한 후, 형광 표지된 2차 다중 클론 항체, F(ab')2 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories)와 함께 얼음상에서 30분 동안 추가로 인큐베이션했다. 이어서 세포를 2회 세척하고 샘플을 BD LSRII 또는 Symphony A3 유동 세포 분석기에서 획득했다. 샘플 파일은 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 웰에서 살아있는 세포 집단의 평균 형광 강도 (MFI-평균) 또는 중간 형광 강도 (MFI-중앙)는 살아있는 세포 상에서 게이팅한 후 (전방 대 측면 산란) 계산하였다. EC50 값을 결정하기 위한 비선형 회귀 분석을 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어에서 수행했다.
도 4는 CHO-K1/인간 5T4 세포주에 대한 7개의 ADAPTIRTM 분자 (ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196 및 ALG.APV-198)의 결합 곡선을 보여준다. 작제물 ALG.APV-006은 > 10 nM의 EC50 값을 나타낸 반면, 나머지 ADAPTIRTM 작제물 (ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG. APV-196 및 ALG.APV-198)은 3 내지 10 nM 범위의 EC50 값을 나타냈다. SKOV-3 세포에 대한 결합 분석이 수행될 때 작제물들간의 EC50 값의 차이가 보다 분명했다. SKOV-3 세포는 CHO-K1/인간 5T4 형질 감염체보다 대략 10배 더 낮은 수준으로 인간 5T4를 발현한다 (도 5). 도 6은 SKOV-3 세포 상의 작제물의 ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-196 및 ALG.APV-198의 결합 곡선을 보여준다. 작제물 ALG.APV-006, ALG.APV-078, ALG.APV-179, 및 ALG.APV-187은 ALG.APV-196 및 ALG.APV-198 작제물보다 약간 낮은 친화도 (높은 EC50 값) 및 높은 최대 결합 수준을 나타냈다. 도 7은 CHO-K1/시노몰구스 5T4 형질 감염체 상의 ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196 및 ALG.APV-198의 결합 곡선을 도시한다. 인간 5T4(+) 세포의 결합 프로파일과 유사하게, 작제물 ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196, 및 ALG.APV-198은 작제물 ALG.APV-196 및 ALG.APV-198보다 친화도가 낮고 최대 결합 수준이 높았다.
도 13은 인간 5T4를 발현하는 뮤린 CT26 세포 (ATCC)에 대한 6개의 ADAPTIRTM 분자 (ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210) 및 모리슨 형식 대조군 ALG.APV-004의 결합 곡선을 보여준다. 이들 세포는 SKOV-3 세포에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 인간 5T4를 발현한다 (도 5). 모든 작제물은 1 내지 3 nM 범위의 EC50 값을 나타냈다. 작제물 ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210은 ALG.APV-178 및 ALG.APV-208보다 더 높은 수준의 최대 결합을 나타냈다. 모리슨 형식 대조군 분자 ALG.APV-004는 가장 낮은 수준의 최대 결합을 나타냈다. 도 14는 CHO-K1/시노몰구스 5T4 형질 감염체에 대한 ALG.APV-004, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 결합 곡선을 도시한다. 모든 분자는 6 내지 10 nM 범위의 유사한 EC50 값 및 유사한 수준의 포화를 나타냈다. 도 15는 CD137나 5T4를 발현하지 않는 인간 세포주 (MOLM13 세포, ATCC)에서의 ALG.APV-004, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 결합 곡선을 보여준다. 어떤 분자도 어떤 농도에서도 결합을 보이지 않았다.
실시예 9: 5T4 발현 세포주에 대한 5T4-CD137 이중특이적 항체의 결합
상이한 수용체 밀도에서 세포상에서 발현된 인간 5T4에 대한 ALG.APV-210의 결합을 결정하기 위해 실험을 수행했다. 내인성 수준의 5T4를 갖는 인간 종양 세포주 및 5T4를 생성하도록 형질 감염된 세포 둘 다에 대해 ALG.APV-210의 표적 결합을 평가했다.
재료 및 방법
비오티닐화 : 5T4 발현 세포주에 대한 ALG.APV-210 결합을 검출하기 위해, ALG.APV-210을 먼저 비오티닐화시켰다. 비오티닐화된 단백질의 품질 및 그의 표적에 대한 결합에 대한 영향은 ELISA를 사용하여 평가하였다.
5T4-발현 세포주의 FACS 염색 및 분석 : FACS 염색 전에, 모든 세포주는 수용체 밀도 키트 (Quantum Simply Cellular, 항-인간 IgG, Bangs Laboratories, Inc)를 사용하여 이들의 5T4 발현 수준에 대해 특성화되었다. 사용된 세포주 및 각각의 5T4 발현 밀도에 대한 정보는 표 21에 제시되어 있다. 부착된 세포주는 공급 업체의 지시에 따라 배양하고 트립신/EDTA를 사용하여 세포 배양 플라스크로부터 수확하고, 버커 챔버에서 R10 배지 중에서 계수하고, FACS 완충제 (PBS + 0.5% BSA, 0.05% NaN3)를 사용하여 4 x 106 세포/mL의 농도가 되도록 희석했다. 세포 용액 50 ㎕ (0.20 x 106)를 96-웰 FACS 염색 플레이트 (Falcon #351190)에 첨가했다. 세포를 50 ㎕의 비오티닐화된 ALG.APV-210 (2배 최종 농도)과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션했다. 20 ㎍/mL에서 시작하여 12 단계 1/2 희석으로 0.010 ㎍/mL까지 적정 감소시키는 연속 희석 중에 항체를 첨가했다. FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 100 ㎕의 2차 항체 (스트렙타비딘-PE, BD #554061, 1/500으로 희석)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. FACS 완충액으로 2회 세척 단계를 거친 후, 세포를 200 ㎕의 세포 고정 (BD CellFIX 10x BD, #340181, MQ H2O로 희석)에 재현탁시켰다. 단일 세포상에서 게이팅함으로써 유동 세포 분석법 (FACSVerse)을 이용하여 ALG.APV-210 결합에 대해 세포를 분석했다. 2개의 독립적인 실험 중 1개로부터의 MFI 값 (2차 항체만 공제) 및 2개의 실험으로부터 풀링된 데이터의 정규화된 데이터 및 EC50 값을 결정하고 GraphPad Prism 7을 이용하여, 비선형 회귀 로그 (작용제) 대 정규화된 반응 - 가변 기울기를 플로팅하였다.
결과 및 결론
ELISA를 이용하여, 비오티닐화된 ALG.APV-210의 5T4에 대한 결합은 비-비오티닐화된 ALG.APV-210의 것과 유사한 것으로 측정되었다 (데이터는 나타내지 않음).
인간 종양 세포 또는 5T4를 발현하기 위해 형질 감염된 세포 상에서 내인성 수준에서 세포 상에 발현되었을 때 비오티닐화된 ALG.APV-210의 5T4에의 결합 (EC50)을 평가했다. MFI를 사용하여 도 39에 도시된 바와 같이, ALG.APV-210은 내인성 수준의 5T4를 발현하는 인간 종양 세포 및 형질 감염된 세포주 모두에 용량-의존적 방식으로 결합한다.
상기 표 21은 도 40에 나타낸 용량-반응 곡선으로 플로팅한 2개의 풀링된 실험에서 얻어진 (배경 공제함) 정규화된 MFI 값으로부터 결정된, 5T4 양성 인간 종양 세포주 및 5T4 형질 감염된 세포에 대한 ALG.APV-210의 결합 EC50을 나타낸다. 평균 EC50 값은 상이한 5T4 양성 세포주에 대해 8 내지 23 nM 범위였다. 결론적으로, ALG.APV-210은 8 내지 23 nM 범위의 EC50 에서 5T4-발현 세포에 결합한다.
실시예 10: 리포터 분석에서 이중특이적 scFv-Fc-scFv 단백질의 작용제 기능
CD137의 표적-의존적 활성화를 유도할 때 상이한 이중특이적 CD137-결합 분자의 효과를 비교하기 위해, 실시예 3에 기재된 바와 같이 7개의 상이한 이중특이적 항-CD137 x 항-5T4 분자를 CD137 리포터 분석에서 비교했다.
CD137 리포터 분석
NF-κB 프로모터 (Promega)의 제어하에 루시퍼라제 리포터 유전자를 보유한 Jurkat/CD137 형질 감염체를 제조사의 프로토콜에 따라 배양했다. Jurkat/NF-κB 리포터 세포를 96-웰 플레이트에서 대략 15,000 리포터 세포 대 30,000개의 표적 세포로, 인간 5T4를 발현하는 인간 1차 도관 유방암 세포 HCC1143 (ATCC)과 함께 배양했다. 10 nM 내지 0.002 nM 범위의 최종 농도를 갖도록 하는 이중특이적 분자의 농도를 첨가했다. 세포를 10% 소태아혈청, 피루브산 나트륨, 항생제 및 비필수 아미노산이 보충된 총 부피 100 ㎕의 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서에서 5 내지 6시간 동안 인큐베이션했다. 100 마이크로 리터의 Bio-Glow 완충액 (Promega)을 각 웰에 첨가하고 5 내지 10분 동안 인큐베이션하여 형광을 측정하였다. MicroBeta2 2450 마이크로 플레이트 카운터 (Perkin Elmer)에서 발광을 측정했다. EC50 값을 결정하기 위한 비선형 회귀 분석을 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어에서 수행했다.
결과
도 8에서, 모든 작제물은 5T4(+) 세포의 존재하에 작용제 기능을 나타내고; 5T4(+) 세포의 부재하에 리포터 활성이 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 작제물 ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-191, ALG.APV-196 및 ALG.APV-198은 최적화되지 않은 ADAPTIRTM 작제물 ALG.APV-006 및 모리슨 형식 대조군 ALG.APV-004보다 더 우수한 작용제 기능을 나타냈다 (최대 6배 낮은 EC50 값). 곡선의 모든 점은 복제 웰의 평균을 나타낸다. y축은 상대 형광 단위 (RLU)로 값을 표시한다. 도 16은 5T4(+) 세포 (HCC1143) 또는 5T4(-) 세포 (MOLM13)의 존재하에 5시간 인큐베이션 후 Jurkat/NF-κB 리포터 세포에서 이중특이적 작제물의 활성을 보여준다. 작제물 ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210은 모리슨 형식 대조군 ALG.APV-004보다 더 우수한 작용제 기능을 나타냈다 (10배 낮은 EC50 값). 5T4(-) 세포 (MOLM13)의 존재하에서는 리포터 활성이 관찰되지 않았다. 곡선의 모든 점은 복제 웰의 평균을 나타낸다. y축은 상대 형광 단위 (RLU)로 값을 표시한다.
실시예 11: 1차 T 세포 분석에서 이중특이적 scFv-Fc-scFv 단백질의 작용제 기능
CD137의 표적-의존적 활성화를 유도할 때 상이한 항-CD137 x 항-5T4 이중특이적 분자의 작용제 기능을 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 배양에서 시험했다. 항-CD137 이중특이적 작제물의 기능을 시험하기 위해, 1차 PMBC를 항-CD3 항체로 자극하여 휴지 T 세포에서 발현되지 않는 CD137을 상향 조절하였다. TCR 및 CD137을 통한 1차 T 세포의 공동-자극은 사이토카인 인터페론 감마 (IFN-γ)의 T-세포 분비를 향상시킨다.
PBMC의 CD137 자극:
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 피콜 구배를 이용하여 인간 혈액으로부터 단리했다. 단리된 세포를 식염수 완충액으로 세척했다. PBMC를 96-웰 플레이트에서 대략 120,000 PBMC 대 30,000 5T4(+) 세포로 CHO-K1/인간 5T4 세포와 함께 배양했다. 항-CD3 항체 OKT3 (eBioscience)을 0.1 ㎍/mL의 농도로 모든 웰에 첨가했다. 세포를 1% 소태아혈청, 피루브산 나트륨, 항생제 및 비필수 아미노산이 보충된 총 부피 200 ㎕의 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션했다. 100 마이크로 리터의 배지를 72시간 째에 수거하였다. IFN-γ의 수준은 제조사의 지침에 따라 Milliplex® 키트 (Millipore)를 사용하여 상청액에서 측정되었다. Bio-Plex Reader 200 시스템 (Bio-Rad)에서 데이터를 수집했다. EC50 값을 결정하기 위한 비선형 회귀 분석을 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어에서 수행했다.
도 9는 ALG.APV-006, ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-196, ALG.APV-198 및 모리슨 형식 대조군 ALG.APV-004에 의해 유도된 IFN-γ의 수준을 나타낸다. 모든 작제물은 용량-의존적 방식으로 항-CD3 단독보다 더 높은 수준의 IFN-γ를 유도했다. 곡선의 모든 점은 복제 웰의 평균을 나타낸다. 도 17은 CHO-K1/인간 5T4 세포의 존재하에 ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-187, ALG.APV-208, ALG.APV-209 및 ALG.APV-210 및 모리슨 형식 대조군 ALG.APV-004에 의해 72에서 1차 PBMC 배양에서 유도된 IFN-γ의 수준을 보여준다. 모든 작제물은 용량-의존적 방식으로 항-CD3 단독보다 더 높은 수준의 IFN-γ를 유도했다. 곡선의 모든 점은 복제 웰의 평균을 나타낸다.
항-5T4 x 항-CD137 이중특이적 작제물의 기능적 활성은 또한 세포가 5T4-Fc 작제물 및 항-CD3 항체로 코팅된 마이크로 타이터 플레이트에서 배양된 CD8+ T 세포 분석으로 평가되었다.
정제된 T 세포의 5T4 자극:
PBMC를 건강한 공여자로부터 얻은 백혈구 농축물로부터 Ficoll-Paque (ρ 1.077 g/mL) (GE Healthcare #17-1440-02)를 사용하여 밀도 구배 원심 분리에 의해 단리했다 (임상 면역학 및 수혈 의학, Labundin Region Skne, Lund Sweden). CD8+ T 세포는 CD8+ T 세포 단리 키트 (Miltenyi 130-096-495)를 사용하여 음성 선택에 의해 강화되었다. 플레이트를 3 ㎍/mL α-CD3, 클론 OKT3 (Affymetrix eBioscience #16-0037-85)로 4℃에서 밤새 코팅하고, 세척하고 37℃에서 2시간 동안 5 ㎍/mL 5T4-Fc로 코팅했다. 5T4-Fc로 코팅한 후, 플레이트를 세척하고 10% FCS (열 불활성화됨, Gibco #10270-106 로트 41Q9248K) 및 10 mM Hepes (Gibco #15630056)를 함유하는 RPMI (Gibco #61870010)로 최소 30분 동안 차단했다. 이중특이적 작제물을 10% FCS 및 10 mM Hepes를 함유하는 RPMI로 희석하고 CD8+ T 세포 (0.07 x 106 세포/웰)의 첨가하기 30분 전에 플레이트에 첨가했다. 분석 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 배양 상청액을 수확했다. 상청액 중의 IFN-γ 수준을 ELISA (BD OptiEIA #555142)로 측정했다. 총 3명의 공여자로 실험을 2회 반복했다. 첫 번째 실험의 결과는 도 11a에 도시되어 있다. 세포 및 이중특이적 작제물이 5T4-Fc로 코팅되지 않은 플레이트에서 배양된 대조군 샘플의 결과는 도 11b에 도시되어 있다.
도 11a는 ADAPTIRTM 형식 항-5T4 x 항-CD137 이중특이적 작제물 (ALG.APV-178, ALG.APV-179, ALG.APV-196 및 ALG.APV-198)이 모리슨 형식 이중특이적 작제물 (ALG.APV-004)에 비해 기능적 활성이 증가되었음을 보여주는데, 이는 5T4의 존재하에 배양 상청액에 존재하는 IFN-γ 수준의 증가에 의해 입증된다. 실제로, ADAPTIRTM 형식 작제물은 모리슨 형식 작제물에 의해 유도된 것보다 2 내지 4.5배 높은 IFN-γ 수준을 유도했다 (도 11a).
실시예 12: 생체 내 5T4 양성 종양에서의 이중특이적 항체의 항원 의존성 국소화
5T4 및 4-1BB를 표적으로 하는 이중특이적 작제물의 5T4 양성 B16-5T4 종양에 대한 항원-의존적 국소화를 야생형 C57BL/6 마우스에서 평가했다.
재료 및 방법
마우스: 프랑스 Janvier로부터 입수한 8주령 암컷 C57BL/6 마우스를 실험에 사용했다. 모든 실험은 말뫼/룬드 윤리위원회의 승인으로 수행되었다.
이중특이적 작제물: ADAPTIRTM 형식의 2가지 최적화된 5T4- 및 CD137-표적화 이중특이적 작제물인 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210이 사용되었다. 모리슨 형식의 이중특이적 작제물인 ALG.APV-004는 양성 대조군으로 사용되었다. 비히클 투여는 음성 대조군으로 사용되었다.
세포: B16.F10 WT (B16) 세포를 ATCC로부터 수득하고 이들의 권고에 따라 배양했다. 인간 5T4를 발현하는 B16 세포 (이하 B16-5T4)는 피터 스턴 교수로부터 입수하여 1.2 mg/mL의 G418 선별 배지에서 성장시켰다.
방법: 이중특이적 작제물의 항원 의존성 국소화를 위해, B16 흑색종 트윈 종양 모델을 사용하였으며, 여기서 각 마우스는 뒷 측면/등 쪽의 각 측면에서 하나의 5T4 음성 및 하나의 5T4 양성 종양을 수용했다. 로그 단계에서 성장하는 종양 세포주를 0일에 피하 주사 (100 ㎕에 1x105 세포)하였다. 복강 내 작제물 처리 (100 ㎍)를 6일 및 13일에 제공하였고 마우스를 14일 (최종 처리 후 24 시간)에 희생시켰다.
FACS 분석: 유동 세포 측정법 분석을 위한 종양을 Liberase TL 및 DNase I (Roche)을 사용하여 기계적으로 그리고 효소적으로 소화시키고 70 ㎛ 스트레이너를 통과시켰다. 생성된 단일 세포 현탁액을 FACS 분석을 위해 염색했다. 간략하게, 작제물의 비-특이적 결합은 마우스 IgG 또는 Fc 블록을 사용하여 차단되었다. 제조사의 지시에 따라 Fixable Viability Stain 450 (분자 프로브)을 사용하여 죽은 세포를 제외시켰다. 2개의 ADAPTIRTM 이중특이적 작제물 또는 대조군 작제물의 종양 세포에 대한 결합은 2차 항체: 염소-항-인간 Fc-PE (Jackson Immunoresearch)를 사용하여 분석했다. 대안적으로, 이중특이적 작제물의 검출은 비오티닐화된 4-1BB 항원에 이어서 스트렙타비딘-PE/PerCP-Cy5.5를 사용하여 수행되었다. BD FACSVerse에서 샘플을 분석하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다. 맨-휘트니 비모수 T-검정, 2-테일 및 GraphPad 프리즘 프로그램을 사용하여 통계 분석을 수행했다.
면역 조직 화학: 면역 조직 화학을 위한 종양을 드라이 아이스 상의 이소프로판올에서 급속 냉동시켰다. 토끼 항-인간 5T4 (Abcam) 또는 토끼 항-인간 Fc (Jackson Immunoresearch), 이어서 항-토끼 Brightvision - HRP (Immunologic) 및 DAPI 염색을 사용하여 5T4 발현에 대해 크리토섹션 (Cryosections) (8 mm)을 염색했다. 면역 조직 화학 염색은 다음과 같이 평가되었다; 음성 (0), 약한 염색 (1+), 중간 염색 (2+) 또는 강한 염색 (3+).
결과
ADAPTIRTM 형식의 이중특이적 작제물인 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210, 및 양성 대조군 ALG.APV-004는 5T4-발현 B16 종양에 국소화되었지만 5T4 음성 종양에는 국소화되지 않았다 (B16.F10). 이는 유동 세포 분석법 (도 18a 및 18b) 및 면역 조직 화학에 의해 입증되었다. (도 19a 및 19b).
이중특이적 작제물 (ALG.APV-209, ALG.APV-210) 및 양성 대조군 (ALG.APV-004)은 유동 세포 분석법에 의해 측정된 바와 같이, 음성 비히클 대조군과 비교하여 항원-양성 종양에 대한 통계적으로 유의한 5T4 의존성 국소화를 입증했다 (도 18a). 5T4-발현 종양에 대한 결합 역시 검출용 비오티닐화된 4-1BB를 사용하여 검출할 수 있었고 (도 18b), 이중특이적 분자가 온전하다는 것을 확인했다.
국소화는 면역 조직 화학에 의해 추가로 입증되었다 (도 19a 및 19b, 및 표 22). 이중특이적 항체는 5T4 양성 종양 (B16-5T4, 도 19a)에 강하게 결합하지만 5T4 음성 종양 (B16.F10, 도 19b)에는 강하게 결합하지 않았다.
실시예 13: 인간 CD8 T 세포 및 5T4-CT26 종양 세포를 사용한 IFNγ 방출 분석에서 5T4-CD137 이중특이적 항체의 시험관 내 활성
5T4-CD137 이중특이적 항체 ALG.APV-210의 기능적 활성은 CD8 T 세포 분석으로 평가되었고, 여기서 비드 상에 코팅된 CD3 항체로 자극된 CD8 T 세포는 상이한 수준의 5T4를 발현하는 CT26 종양 세포와 함께 플레이트에서 공동 배양했다.
뮤린 결장 암종 세포주 (ATCC® CRL-2638)인 CT26 종양 세포는 이전에 인간 5T4를 발현하도록 형질 감염된 후, 유동 세포 측정법을 이용하여 단일 세포를 분류하여 높거나 낮은 수준의 인간 5T4 (수용체 밀도에 대해, 표 23 참조)를 발현하는 단일 세포 클론을 생성했다. 5T4-CT26 종양 세포 또는 형질 감염되지 않은 야생형 세포 (CT26 wt)는 UVB 가교제 (AnalytikJena, 램프: 254 nm)를 사용하여 UV 조사되었다. 플레이트를 조사한 후, 세포를 배지에서 1회 세척한 후, 새로운 성장 배지 R10 (10%의 열 불활성화된 FBS, Hyclone #SV30160 로트 RB35944 및 10 mM Hepes, Gibco #15630056를 함유하는 RPMI, Gibco #61870010)에서 4x106 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 50 ㎕ (2x105 세포/웰)의 UV 조사된 CT26-h5T4높음, CT26-h5T4낮음 또는 CT26 wt 세포를 TC 처리된 분석 플레이트 (Eppendorf #0030 730.119)에 첨가하고 밤새 37℃에서 배양했다.
CT26 세포의 UV 조사 후 다음 날, 건강한 공여자로부터 얻은 백혈구 농축액(임상 면역학 및 수혈 의학, Labmedicin Region Skne, Lund Sweden) 으로부터 Ficoll-Paque (GE Healthcare #17-1440-02)을 이용한 밀도 구배 원심 분리에 의해 인간 PBMC를 단리했다. CD8+ 세포는 CD8+ T 세포 단리 키트 (Miltenyi 130-096-495)를 사용하여 음성 선택에 의해 강화되었다.
이중특이적 항체 ALG.APV-210을 R10 배지에서 연속 희석으로 희석하고, 50㎕를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 50㎕의 αCD3 비드 (4 x 108/mL의 항-CD3 항체 클론: OKT-3, Affymetrix eBioscience #16-0037-85, 비드에 코팅, 2 x 106/mL로 희석)를 1 : 1 CD8+ T 세포 대 비드의 비율로 첨가한 후, 이펙터 세포 (강화된 CD8+ 세포, 2 x 106/mL 또는 1 x 105/웰) 50 ㎕를 첨가했다. 분석 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 배양 상청액을 수확했다. 상청액 중의 IFNγ 수준을 ELISA (BD OptiEIA #555142)로 측정했다. EC50은 GraphPad Prism 7을 사용하여 비선형 회귀 로그 (작용제) 대 정규화된 반응 (가변 기울기)에 의해 결정되었다. 배양 상청액 중 IFNγ 생성에 있어서 2개의 가장 높은 값의 평균을 계산함으로써 TOP 값 (최대 기능적 효과)을 결정했다. 실험은 총 12명의 공여자를 포함하여 5회 수행되었다.
이 연구는 서로 다른 수준의 5T4를 발현하는 CT26 세포 (5T4에의 결합을 통한 CD137의 가교를 위해)와 공동 배양된 인간 CD8 T 세포 (이펙터 세포)를 사용하여 CD137-5T4 이중특이적 항체 ALG.APV-210의 기능적 효과를 제공했다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 CD137-5T4 항체 ALG.APV-210은 높거나 (CT26-h5T4높음) 낮은 (CT26-h5T4낮음) 수준의 5T4를 발현하는 CT26 세포의 존재하에 용량-의존적인 방식으로 강력한 T 세포 활성화를 유도하고, 이는 IFNγ 방출에 의해 측정된다. IFNγ 방출이 ALG.APV-210의 정규화된 데이터로서 도 20에 제시되어 있고, 5개의 풀링된 실험으로부터 12명의 공여자의 평균 값이 도시되어 있다.
표 24는 인간 5T4 발현 CT26 세포의 존재하에 CD8 T 세포 분석에서 ALG.APV-210의 EC50을 나타낸다. 5개의 풀링된 실험으로부터 12명의 공여자의 로그 (작용제) 대 정규화된 반응 (가변 기울기) 평균값 및 95% CI가 표에 제시되어 있다. 도 21a 및 21b에 도시된 바와 같이, CT26-h5T4높음 세포와의 공동 배양과 비교하여 CT26-h5T4낮음 세포와의 공동 배양에서 최대 IFNγ 방출이 약간 낮게 분비되는 것으로 도시된 바와 같이 (CT26-h5T4낮음의 최대 효과는 CT26-h5T4높음의 82%였다), ALG.APV-210의 최대 기능적 효과는 CT26 세포 상의 5T4의 발현 수준에 의존했다. CT26-wt 세포를 사용한 5T4-유도된 가교의 부재시, T 세포 활성이 없거나 매우 낮다 (CT26-h5T4높음의 최대 효과의 7%). 최대 IFNγ 방출이 절대값 (ng/mL) (도 21a) 또는 CT26-h5T4높음에 대한 정규화된 값 (도 21b)으로서 도 21에 도시되어 있다. 5개의 풀링된 실험으로부터 12명의 공여자의 평균 및 SEM 값이 도시되어 있다.
실시예 14: 인간 및 시노몰구스 1차 CD3-자극된 CD8 T 세포상의 CD137에 대한 5T4-CD137 이중특이적 항체의 결합
ALG.APV-210의 활성화된 1차 CD8 T 세포 (CD3 자극된 PBMC로부터 게이팅됨)에서 발현된 인간 및 시노몰구스 CD137에 대한 ALG.APV-210의 상대적인 결합을 비교하기 위한 연구가 수행되었다.
재료 및 방법
FACS에서 1차 인간 및 시노몰구스 세포에 대한 ALG.APV-210 결합을 검출하기 위해, ALG.APV-210을 먼저 비오티닐화시켰다. 비오티닐화된 단백질의 품질을 HPLC를 사용하여 평가하고, 그의 표적에 대한 결합에 대한 영향을 ELISA를 사용하여 평가했다. ALG.APV-210 (생식계열 CDR)과 동일한 프레임 워크를 갖는 ADAPTIR 형식의 항체인 ANC017을 음성 대조군으로 사용하였고 또한 비오티닐화시켰다.
인간 PBMC의 단리 및 자극: 인간 PBMC는 3명의 건강한 인간 공여자로부터 얻은 백혈구 농축물 (임상 면역학 및 수혈 의학, Labmedicin Region Skne, Lund Sweden) 로부터 Ficoll-Paque (GE Healthcare #17-1440-02)를 사용하여 밀도 구배 원심 분리에 의해 단리하였다. 비조직 처리한 96-웰 플레이트 (Nunc #268200)를 10 ㎍/mL αCD3, 클론 OKT3 (Affymetrix eBioscience #16-0037-85)로 4℃에서 밤새 사전 코팅했다. 다음날, 플레이트를 PBS에서 세척하고, R10 (10%의 열 불활성화된 FBS, Hyclone #SV30160 로트 RB35944 및 10 mM Hepes, Gibco #15630056를 함유하는 RPMI, Gibco #61870010)으로 희석된 인간 PBMC를 0.2 x 106 세포/웰 농도에서 첨가하고, CD3 자극의 유무와 관계없이 웰에서 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다.
시노몰구스 PBMC의 단리 및 자극: 시노몰구스 PBMC를 제조사의 지시에 따라 림프구-포유류 (Cedarlane labs)를 사용하여 밀도 구배 원심 분리에 의해 프랑스 실라베 (Silabe) 사로부터 얻은 3개의 상이한 공여자로부터의 시노몰구스 원숭이 혈액 20mL로부터 단리했다. 비조직 처리된 96-웰 플레이트를 3㎍/mL α-원숭이 CD3, 클론 FN-18 (Invitrogen #APS0301)로 4℃에서 밤새 사전 코팅했다. 이어서 시노몰구스 PBMC를 상기 기재된 인간 PBMC와 동일하게 자극시켰다.
CD8 T 세포의 FACS 염색 및 분석: CD3의 유무에 관계없이 48시간 동안 인큐베이션한 후, 인간 및 시노몰구스 PBMC를 수확하고, 풀링하고, 재-계수하고, FACS 완충액 (PBS + 0.5% BSA, 0.05% NaN3)에서 5 x 106 세포/mL의 농도가 되도록 희석했다. 세포 용액 50 ㎕ (0.25 x 106 세포)를 96-웰 FACS 염색 플레이트 (Falcon #351190)에 첨가했다. 베리글로빈 (hIgG, 200 ㎍/mL)을 사용하여 RT에서 10분의 Fc-차단 후, 세포를 FACS 완충액에서 세척한 다음, 100 ㎕의 비오티닐화된 ALG.APV-210 또는 음성 대조군과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 5 ㎍/mL에서 시작하여 12 단계 1/3 희석으로 0.0003 ㎍/mL (실험 1)까지 적정 감소시키거나, 1 ㎍/mL에서 시작하여 12 단계 1/2 희석으로 0.0005 ㎍/mL (실험 2)까지 적정 감소시키는 연속 희석 중에 항체를 첨가했다. FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 50 ㎕의 2차 항체 (스트렙타비딘-APC, BD #554067) 및 상이한 T 세포 표면 마커 (CD4-FITC #550628, CD3-PECy7 #557749 및 CD8-APC-H7 #5601797, BD)에 대하여 형광 접합된 항체 50 ㎕와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. PBS로 세척한 후, 세포를 50 ㎕의 Fixable Viability Stain BV510 (비-생존 세포를 게이팅하기 위해)으로 4℃에서 15분 동안 염색하고, 다시 세척한 다음 130 ㎕의 세포 고정 (BD CellFIX 10x BD, #340181, MQ H2O로 희석)에 재현탁시켰다. CD3 및 CD8을 발현하는 생존 가능한 단일 세포상에서 게이팅함으로써 유동 세포 분석을 이용하여 세포의 ALG.APV-210 결합에 대해 분석했다. 2개의 독립적인 실험에서 얻은 MFI 값 (FMO 공제함) 및 2개의 실험으로부터의 정규화된 풀링된 데이터 및 EC50 값을 결정하고 GraphPad Prism 7, 비선형 회귀 로그 (작용제) 대 정규화된 반응 - 가변 기울기, n = 6 공여자/그룹을 이용하여 플로팅했다.
결과
ELISA 시험에서, 비오티닐화된 ALG.APV-210의 CD137에 대한 결합은 비-비오티닐화된 ALG.APV-210의 것과 유사했다 (0.6 nM 대 0.7 nM). CD3 자극된 PBMC로부터의 활성화된 1차 인간 및 시노몰구스 CD8 T 세포 상에서 발현되었을 때 비오티닐화된 ALG.APV-210의 면역 조절 표적 CD137에의 결합 (EC50)을 평가하고, 두 종 사이뿐만 아니라, 자극되지 않은 세포와도 비교했다. 도 22a, 22b 및 22c, 및 표 25에서 모든 CD3+CD8+ 세포의 MFI를 사용하여 나타낸 바와 같이, ALG.APV-210은 용량 의존적 방식으로 인간 및 시노몰구스 CD8 T 세포 둘 다에 결합하지만 자극되지 않은 세포에는 결합하지 않는다. 음성 대조군인 ANC107에 대한 결합은 CD3-자극 또는 자극되지 않은 인간 PBMC 또는 시노몰구스 PBMC 세포에 비해 낮거나 검출 불가능했다. CD3-자극된 시노몰구스 PBMC에 결합된 ALG.APV-210의 최대량 (MFI)은 인간 PBMC와 비교하여 더 높았으며, 이는 CD137을 발현하는 CD3-자극된 시노몰구스 PBMC의 비율이 더 높기 때문이거나 또는 시노몰구스 CD8 T 세포에서 CD137의 발현이 일반적으로 더 높기 때문이다. 시노몰구스 세포가 인간 세포와 비교하여 CD3 자극에 대해 더 민감한 지 여부는 불확실하고, 따라서 종 사이의 항-CD3 시약의 교차 반응성의 부족으로 인해 세포가 항-CD3의 상이한 클론으로 자극되었기 때문에 CD137을 더 상향 조절했다.
ALG.APV-210 결합은 또한 ALG.APV-210에 의해 결합된 CD8 T 세포의 백분율을 관찰함으로써 평가되었다. 인간 CD8 T 세포와 비교하여 ALG.APV-210에 의해 결합된 시노몰구스 CD8 T 세포의 백분율이 더 높았다 (시노몰구스의 경우 71 내지 96%, 인간의 경우 65 내지 76%, 도 23a, 23b 및 23c 참조). 결합 EC50 값은 또한 CD137 양성 세포의 MFI에서 계산되었으며, 결과는 인간 CD137에 대한 결합에 대해 0.17 nM, 시노몰구스 원숭이 원숭이 CD137에 대해 0.20 nM의 EC50 이었다.
종합하면, 연구 결과는 ALG.APV-210이 인간 및 시노몰구스의 CD3-자극된 1차 CD8 T 세포에 대해서는 유사한 EC50: 0.2 nM로 결합하지만 자극되지 않은 세포에는 결합하지 않음을 보여 주었다.
실시예 15: 5T4의 존재하에 인간 또는 시노몰구스 CD8 T 세포를 사용하는 IFNγ 방출 분석에서 5T4-CD137 이중특이적 항체의 시험관 내 활성
플레이트 고정된 5T4의 존재하에 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD8 T 세포를 사용하여 작용제 분석에서 기능적 활성을 비교하고 ALG.APV-210의 EC50을 결정하기 위한 연구를 수행했다.
재료 및 방법
CD8 T 세포는 플레이트 고정화된 CD3 항체로 차선적으로 자극되었고, 플레이트 고정화된 5T4-Fc에 대한 ALG.APV-210 결합을 통해 CD137의 가교에 의해 활성화되었다. CD8 T 세포 활성화는 세포 배양 상청액에서 IFNg 방출을 측정함으로써 측정되었다.
인간 CD8 T 세포를 이용한 단리 및 분석 셋업: 건강한 공여자로부터 얻은 백혈구 농축물로부터 Ficoll-Paque (GE Healthcare #17-1440-02)를 이용한 밀도 구배 원심 분리에 의해 인간 PBMC를 단리했다 (임상 면역학 및 수혈 의학, Labmedicin Region Skne, Lund Sweden). CD8+ 세포는 CD8+ T 세포 단리 키트 (Miltenyi #130-096-495)를 사용하여 음성 선택에 의해 강화되었다. 비조직 처리된 96-웰 분석 플레이트를 3 ㎍/mL 항-CD3 항체 (클론: OKT-3, Affymetrix eBioscience #16-0037-85)로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음날, 플레이트를 PBS에서 세척하고 37℃에서 2시간 동안 5㎍/mL 5T4-Fc로 코팅했다. 5T4-Fc 고정화 후, 분석 플레이트를 PBS에서 세척하고, R10 (10%의 열 불활성화된 FBS, Hyclone #SV30160 로트 RB35944 및 10mM Hepes, Gibco #15630056를 함유하는 RPMI, Gi640 #61870010)으로 최소 30분 동안 차단시켰다. ALG.APV-210을 R10에서 연속 희석으로 희석하고, 50 ㎕의 이펙터 세포 (강화된 CD8 T 세포, 1.4 x 106 세포/mL 또는 0.07 x 105 세포/웰)를 첨가하기 30분 전에 50 ㎕를 분석 플레이트에 3회 첨가했다. 분석 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 배양 상청액을 수확했다. 상청액 중 IFNγ 수준을 ELISA (BD OptiEIA #555142)로 측정했다. 실험은 총 8명의 공여자를 포함하여 4회 수행되었다.
시노몰구스 CD8 T 세포를 이용한 단리 및 분석 셋업: 프랑스 실라베 (Silabe) 사로부터 얻은 시노몰구스 (Macaca fascicularis, 성인 수컷, 3-15세) 전혈을 사용했다. 적혈구를 제조 프로토콜에 따라 적혈구 용해 (BD Pharma lyse, BD Biosciences, #555899)에 의해 제거했다. CD8 마이크로비드(MicroBead) 키트 (Miltenyi Biotec, #130-091-112)를 사용하여 CD8+ 세포를 양성 선택에 의해 강화시켰다. 플레이트를 1 ㎍/mL α-원숭이 CD3, 클론 FN-18 (Invitrogen, #APS0301)로 4℃에서 밤새 코팅한 후, 세척하고 37℃에서 2시간 동안 5 ㎍/mL 5T4-Fc로 코팅했다. 5T4-Fc 코팅 후 플레이트를 세척하고 R10으로 최소 30분 동안 차단시켰다. ALG.APV-210을 R10에 희석하고 50 ㎕의 CD8 T 세포 (0.07 x 106 세포/웰)을 첨가하기 30분 전에 플레이트에 50 ㎕를 3회 첨가했다. 분석 플레이트를 37℃에서 72 시간 동안 인큐베이션하고, 배양 상청액을 수확했다. 상청액 중 IFNγ 수준을 ELISA (원숭이 IFNγ ELISA 개발 키트, MABTECH, #3421M-1H-20)로 측정했다. 실험은 총 8 공여자를 포함하여 3회 수행되었다. 각각 인간 및 시노몰구스 공여자로부터 얻은 IFNγ 수준을 정규화하고 평균을 계산했다. 모든 8개의 인간 또는 시노몰구스 공여자로부터의 정규화 IFNγ 레벨의 평균을 풀링하고, EC50는 GraphPad 7을 이용하여 비선형 회귀 분석 (로그 작용제 대 정규화 반응, 가변 기울기)에 의해 결정했다.
결과
도 24 및 표 26에 도시된 바와 같이, 인간 CD8 T 세포의 분석에서, 이중특이적 CD137-5T4 항체 ALG.APV-210은 0.2 nM의 EC50의 고 기능성 활성을 가졌다. 4회의 실험 및 총 8명의 공여자로부터의 정규화 IFNγ 수준을 풀링하고, EC50은 GraphPad 7를 이용한 비선형 회귀 분석에 의해 결정했다. 평균 및 SEM이 도24에 제시되어 있다. 하나의 대표적인 실험에서 2명의 공여자로부터의 절대 평균 IFNγ 값이 도 25a 및 25b에 도시되어 있다. 배경 IFNγ 수준뿐만 아니라 항-CD3 시약의 최고값은 하나의 실험 내에서 공여자마다 다르다. 공여자 사이에서 관찰된 변동으로 인해, 데이터는 풀링된 데이터 세트의 분석 전에 정규화되었다. ALG.APV-210의 CD8 T 세포 활성화를 5T4-Fc의 존재 및 부재하에 평가하여 5T4 가교 의존성을 확인했다. 결과는 이중특이적 CD137-5T4 항체 ALG.APV-210이 5T4-에 의해 가교될 때 IFNγ 방출에 의해 측정되는, 강력한 T 세포 활성화를 유도하고; 5T4가 없으면 T 세포 활성이 없다는 것을 보여주었다 (도 25a 및 25b).
시노몰구스 CD8 T 세포를 사용할 때 CD137-5T4 이중특이적 항체 ALG.APV-210의 기능적 효과가 또한 평가되었다. 3개의 실험 및 총 8 공여자로부터의 풀링된 데이터에 기초하여, 시노몰구스 CD8 T 세포 분석에서 ALG.APV-210의 EC50은 0.4 nM인 것으로 측정되었다 (도 26 및 표 26). 하나의 대표적인 실험에서 3 공여자로부터의 절대 평균값 또한 도 27a, 27b 및 27c에 도시되어 있다. 인간 환경과 유사하게, 절대값 (상위값 및 배경 IFNγ 수준 포함)도 하나의 실험내에서 개별 시노몰구스 공여체들 사이에서 다르다. 따라서 풀링된 데이터 세트의 EC50 분석 전에 데이터를 정규화했다. ALG.APV-210의 CD8 T 세포 활성화를 5T4-Fc의 존재 및 부재하에서 평가하여 CD137의 5T4-유도된 가교 의존성을 확인했다. 도 27a 내지 27c에 나타낸 바와 같이, ALG.APV-210의 작용제 효과는 인간 환경에서 관찰된 것과 유사한 방식으로 시노몰구스 CD8 T 세포 분석에서 5T4-의존적이다. 각각의 도 27a, 27b 및 27c는 하나의 대표적인 실험으로부터 3 개별 공여자의 IFNγ의 절대 평균 및 SEM 값을 보여준다. 음성 대조군으로서, 5T4가 없는 웰이 포함되었다.
연구는 기능성 CD8 T 세포 활성화 분석에서 CD137-5T4 이중특이적 항체 ALG.APV-210의 EC50이 인간 (0.2 nM)과 시노몰구스 원숭이 (0.4 nM) 사이에 필적한다는 것을 보여 주었다. T 세포 활성화는 인간 및 시노몰구스 CD8 T 세포 분석 모두에서 5T4에 의존하는 CD137의 가교에 의해 매개되었다.
실시예 16: T-세포 IFN-γ 분비 및 T 세포 증식 분석에서 5T4-CD137 이중특이적 항체 ALG.APV-210의 시험관 내 활성
CD137의 표적-의존적 활성화를 유도하는 5T4-CD137 이중 특이성 분자 ALG.APV-210의 작용제 기능을 분리되지 않은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여 T-세포 IFN-γ 분비 분석 및 T-세포 증식 분석으로 평가했다. 항-CD137 이중특이적 작제물의 기능을 시험하기 위해, 1차 PMBC를 항-CD3 항체로 자극하여 휴지 T 세포상에서 발현되지 않거나 낮은 수준으로 발현되는 CD137을 상향 조절했다. TCR 및 CD137을 통한 1차 T 세포의 공동-자극은 사이토카인 인터페론 감마 (IFN-γ)의 T-세포 분비를 향상시킨다.
방법
IFN-γ 분비 분석:
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 피콜 구배를 사용하여 건강한 인간 혈액으로부터 단리했다. 단리된 세포를 식염수 완충액으로 세척하여 혈소판을 제거했다. PBMC를 96-웰 플레이트에서 대략 120,000 PBMC 대 30,000 CHO-K1 세포로, 인간 5T4 또는 빈 벡터로 형질 감염된 CHO-K1 세포와 함께 배양했다. 항-CD3 항체 OKT3 (eBioscience)을 모든 웰에 1 ng/mL의 농도로 첨가했다. 세포를 10% 소태아혈청, 피루브산 나트륨, 항생제 및 비필수 아미노산이 보충된 총 부피 200 ㎕의 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션했다. CD137의 상향 조절을 유도하기 위해 차선의 농도의 항-CD3 항체로 프라이밍된 PBMC 배양을 72시간 자극한 후 100 ㎕의 배지를 수집했다. IFN-γ의 수준은 제조사의 지침에 따라 Milliplex® 키트 (Millipore)를 사용하여 상청액에서 측정되었다. Bio-Plex Reader 200 시스템 (Bio-Rad)에서 데이터를 수집했다. EC50 값을 결정하기 위한 비선형 회귀 분석을 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어에서 수행했다.
T- 세포 증식 분석 :
표준 피콜 구배를 이용하여 건강한 인간 혈액으로부터 PBMC를 단리했다. 단리되면, 세포를 식염수 완충액으로 세척하여 혈소판을 제거했다. PBMC를 CellTraceTM Violet (Thermofisher)으로 표지하고, 세척하고, 96-웰 플레이트에서 대략 120,000 PBMC 대 30,000개의 CHO-K1 세포로, 인간 5T4로 형질 감염된 조사된 CHO-K1 세포와 함께 배양했다. CHO-K1 세포를 조사하고 (x-선 세포 라드(Cell Rad) 조사기, Faxitron Bioptics, LLC), 배지에서 세척하고 PBMC로 도금했다. 항-CD3 항체 OKT3 (eBioscience)을 모든 웰에 5 ng/mL의 농도로 첨가했다. 세포를 10% 인간 혈청 (SIGMA), 피루브산 나트륨, 항생제 및 비필수 아미노산이 보충된 총 부피 200 ㎕의 RPMI 1640 배지 (GIBCO)에서 배양했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 96시간 동안 인큐베이션했다.
상청액을 제거하고 세포를 얼음에서 30분 동안 2% BSA 및 2 mM EDTA를 함유한 PBS 완충제 중에서 CD4, CD8 및 CD5에 대한 항체로 동일한 분석 플레이트에서 표지했다. 분석에서 죽은 세포를 배제하기 위해 7AAD (SIGMA)가 추가되었다. 세척 후, 세포를 120 ㎕/웰로 재현탁시키고, 70 ㎕/웰 부피를 각 웰로부터 수집하고 유동 세포 분석기 (LSR-IITM, BD Biosciences)에서 분석했다. 데이터 분석은 Flowjo 소프트웨어를 사용하여 두 가지 방식으로 수행되었다: 적어도 하나의 세포 분열을 겪은 CD8+ 라이브 T 세포 이벤트의 백분율 (CD4- CD8+ CD5+, 7AAD-)의 계산, 또는 CD8+ 라이브 T 세포 이벤트의 수를 계수 (CD4- CD8+ CD5+, 7AAD-). 두 경우 모두, FSC 대 SSC 파라미터를 사용하여 림프구에 게이팅한 후 분석을 수행했다. 각 조건을 이중으로 테스트하고 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 각 중복 세트의 평균을 그래프로 표시했다.
결과 및 결론
IFN-γ 분비 실험의 결과는 도 32에 도시되어 있다. 그래프의 모든 데이터 포인트는 복제 웰의 평균을 나타낸다. 이중특이적 항체가 없는 항-CD3 단독의 첨가는 매우 낮은 수준의 IFN-γ를 유도했다. ALG.APV-210 이중특이적 분자의 첨가는 용량-의존적 방식으로 IFN-γ의 분비를 증가시켰다. 항-CD3 항체에 의해 유도된 IFN-γ의 기준선 수준 및 ALG.APV-210에 의해 유도된 IFN-γ 분비의 총량은 PBMC 공여자에 따라 다양했다 (도 32a 대 도 32b). IFN-γ의 향상된 분비는 5T4를 발현하는 CHO-K1 세포 존재하에서 관찰되었지만, 빈 벡터 대조군으로 형질 감염된 CHO-K1 세포 존재하에서는 관찰되지 않았다. 따라서, 이중 특이성 분자 ALG.APV-210은 IFN-γ 분비에 의해 측정된 CD137 기능을 자극하기 위해 5T4의 결합을 필요로 한다.
T 세포 증식 실험의 결과는 도 33에 도시되어 있다. 그래프의 모든 데이터 포인트는 복제 웰의 평균을 나타낸다. 차선의 농도의 항-CD3 항체에서 프라이밍하여 96시간의 자극 후 CD8+ T 세포의 다중 클론 증식을 평가했다. 이중특이적 항체가 없는 항-CD3 단독의 첨가는 낮은 수준의 CD8+ T-세포 증식을 유도했다. ALG.APV-210의 첨가는 용량-의존적 방식으로 CD8+ T 세포의 증식을 증가시켰다 (도 33a 및 도 33b). 세포 분열을 겪는 세포의 백분율 (상부 패널) 및 웰 당 수집된 총 세포 수 (하부 패널) 모두는 강력한 세포 분열 및 웰에서 분열된 CD8+ T 세포의 축적과 일치했다. 결과는 여러 공여자에 걸쳐 일관되었다.
실시예 17: 5T4 단백질 밀도의 범위를 발현하는 다양한 인간 종양 라인의 존재하에 ALG.APV-210의 기능적 리포터 활성
ALG.APV-210 작제물이 세포 표면의 다양한 밀도에서 5T4를 발현하는 다수의 인간 종양 세포주에 걸쳐 결합 및 기능적 리포터 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행했다. ALG.APV-210의 최대 결합능은 세포의 5T4 종양 항원 발현 수준에 따라 달라질 것이다. 따라서 ALG.APV-210의 결합은 5T4 밀도의 범위를 자연적으로 발현하는 3개의 종양 세포주 (MDA-MB-231, H1975 및 TF-1) 및 5T4로 안정적으로 형질 감염된 CHO-K1 세포 (CHO/5T4)에서 테스트되었다.
재료 및 방법
5T4 결합 분석: ALG.APV-210 작제물의 3배 적정 (100 nM 내지 0.14 nM 범위)을 4℃에서 FACS 완충액에서 40분 동안 인간 5T4-발현 세포주와 함께 배양하고, 3회 세척하고, PE-표지된 염소-항-인간 Fc 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch)로 검출했다. ALG.APV-210의 결합은 유동 세포 분석에 의해 검출되었다. 모든 샘플을 이중으로 수행했다. EC50 값을 결정하기 위한 비선형 회귀 분석을 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어에서 수행했다.
5T4 단백질 밀도: QuantibriteTM 비드 (BD Pharmingen)를 사용하여 각 세포주에 존재하는 5T4의 표면 단백질 밀도를 검사했다. QuantibriteTM 비드는 ALG.APV-210과의 결합 곡선에 대한 세포를 획득하는 데 사용된 정확한 세포 계수 설정을 사용하여 획득되었다. 4개의 비드 집단을 게이팅하고 각각의 피크에 대해 기하 평균 형광을 측정했다. 비드 당 PE 분자의 선형 회귀 log10을 방정식 y = mx + c (여기서, y는 log10 형광이고, x는 비드 당 PE 분자의 log10이다)을 이용하여 log10 형광에 대하여 플로팅했다. 그로부터 세포 당 PE 분자 (5T4)의 수를 계산할 수 있다. 이 특정 분석에서, 방정식은 y = 1.036 x - 1.478이었다. 모든 형광 평균값은 제조자의 프로토콜에 의해 제안된 바와 같이 샘플의 기하학적 평균을 사용하여 계산되었다.
CD137 리포터 분석: NF-κB 프로모터 (Promega)의 제어하에 루시퍼라제 리포터 유전자를 보유한 Jurkat/CD137 형질 감염체를 30,000개의 리포터 세포 대 60,000개의 표적 세포의 비율로, H1975, TF-1, MDA-MB-231 또는 CHO/5T4 종양 세포와 함께 96-웰 플레이트에서 배양했다. 최종 농도가 10 nM 내지 0.0006 nM가 되도록 ALG.APV-210 분자의 5배 농도를 첨가했다. 세포를 1% 소태아혈청, 피루브산 나트륨, 항생제 및 비필수 아미노산이 보충된 총 부피 100 ㎕의 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 5시간 동안 인큐베이션했다. 100 ㎕의 Bio-Glow 완충액 (Promega)을 각 웰에 첨가하고, 혼합하고, 10분 동안 인큐베이션하여 발광을 측정했다. MicroBeta2 2450 마이크로플레이트 카운터 (Perkin Elmer)에서 발광을 측정했다. 모든 데이터 포인트는 중복 샘플을 나타낸다. EC50 값을 결정하기 위한 비선형 회귀 분석을 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어에서 수행했다. 곡선의 모든 점은 복제 웰의 평균을 나타낸다. y축은 상대 형광 단위 (RLU)로 값을 표시한다.
결과 및 결론
시험된 각각의 종양 세포주는 QuantibriteTM 비드를 사용하여 결정된 바와 같이 세포 표면에서 발현되는 5T4 단백질의 양이 다양했다. 따라서, ALG.APV-210의 5T4 발현 범위에 결합하고 기능적으로 활성인 능력을 조사할 수 있었다.
ALG.APV-210은 다양한 5T4 세포 표면-발현 종양 세포주에 결합했다. 도 34에 도시된 바와 같이, CHO/5T4는 내인성 발현 5T4 종양 세포주보다 10배 높은 5T4 발현을 갖는다. 형질 감염되지 않은 3종의 종양 세포주 중에서 H1975의 5T4 발현이 가장 높았고, TF-1 세포의 5T4 단백질 밀도가 가장 낮았다. MDA-MB-231 세포는 중간 5T4 발현을 나타냈다. 결합 곡선으로부터 표면 5T4 단백질 밀도를 계산하고 17,000 내지 250,000 초과의 분자/세포의 범위를 나타낸다. 표 27은 결합 곡선으로부터 생성된 5T4 세포 표면 단백질 밀도 및 결합 EC50 값을 보여준다. 종양 세포주에서의 5T4 발현 밀도는 형광 표준을 사용하여 계산되었다.
도 35는 기능성 CD137 리포터 분석 결과를 나타낸다. 도시된 바와 같이, ALG.APV-210은 17,000 내지 250,000 이상의 세포 표면 5T4 발현의 범위에도 불구하고 CHO/hu5T4, H1975, MDA.MB.231 또는 TF-1 종양 라인에 대한 결합을 통해 CD137을 가교시킬 때 NF-κB 신호 전달을 충분히 유도할 수 있었다. 표면 5T4 단백질 밀도는 최대 기능적 활성 (최대 RLU)에 영향을 미쳤으며, CHO/hu5T4 세포는 가장 높은 RLU 값을 나타냈다. 그러나, 3개의 종양 세포주는 강력한 리포터 기능을 유도했다. 결과는 ALG.APV-210이 5T4 밀도 범위를 발현하는 5T4 양성 세포의 존재하에서 작용제로서 기능한다는 것을 나타낸다. 표 28은 다양한 인간 5T4-발현 종양 라인의 존재하에 CD137 리포터 분석에서 ALG.APV-210으로 유도된 EC50 및 최대 RLU를 보여준다.
실시예 18: 인간 CD8 T 세포 및 인간 HCT116 종양 세포를 사용한 IFNγ 방출 분석에서 5T4-CD137 이중특이적 항체의 시험관 내 활성
5T4-CD137 이중특이적 항체 ALG.APV-210의 기능적 활성을 CD8 T 세포 분석에서 평가하였으며, 여기서 비드 상에 코팅된 αCD3 항체로 자극된 CD8+ T 세포는 내인성 수준의 5T4를 발현하는 인간 HCT116 종양 세포와 함께 플레이트에서 공동 배양했다.
재료 및 방법
HCT116 세포의 미토마이신 C 처리: HCT116 종양 세포, 내인성 수준의 인간 5T4 (수용체 밀도 = 6.2 x 104/세포, 표 21)를 발현하는 인간 결장 암종 세포주 (ATCC® CCL-247TM)를 종양 세포의 과대성장을 방지하기 위해 50 ㎍/mL의 농도에서 미토마이신 C (0.5 mg/mL, Sigma-Aldrich)로 전처리했다. 37℃에서 미토마이신 C와 함께 45분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 R10 배지 (10%의 열 불활성화된 FBS, Hyclone #SV30160 로트 RB35944 및 10mM Hepes, Gibco #15630056를 함유하는 RPMI, Gibco #61870010)로 3회 세척한 후 새로운 R10 배지에서 10 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 미토마이신 C 처리된 HCT116 세포의 50 ㎕ (5 x 105 세포/웰)를 TC 처리 분석 플레이트 (Eppendorf #0030 730.119)에 첨가하고 37℃에서 밤새 인큐베이션했다.
CD8 T 세포 분석 셋업: 다음날, 건강한 공여자로부터 얻은 백혈구 농축물로부터 Ficoll-Paque (GE Healthcare #17-1440-02)를 사용한 밀도 구배 원심 분리에 의해 인간 PBMC를 단리했다 (임상 면역학 및 수혈 의학, Labmedicin Region Skne, Lund Sweden). CD8+ 세포는 CD8+ T 세포 단리 키트 (Miltenyi 130-096-495)를 사용하여 음성 선택에 의해 강화되었다. 이중특이적 항체, ALG.APV-210 또는 Adaptir 형식의 이소형 대조군, ANC017 (ANC017에 대한 가변 중쇄 및 경쇄 서열은 표 29a 및 29b에 나와 있음)을 R10 배지에서 연속 희석으로 희석하고, 50 ㎕를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 50 ㎕의 αCD3 비드 (4x108/mL의 항-CD3 항체 클론: OKT-3, Affymetrix eBioscience #16-0037-85, 비드 상에 코팅되고, 2 x 106/mL로 희석됨)를 1 : 1 CD8+ T 세포 대 비드 비율로 첨가하고, 50 ㎕의 이펙터 세포 (강화된 CD8+ 세포, 2 x 106/mL 또는 1 x 105/웰)를 첨가했다. 분석 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 배양 상청액을 수확했다. 상청액 중의 IFNγ 수준을 ELISA (BD OptiEIA #555142)로 측정하고 정규화된 데이터 (평균 및 SD 값)로서 도 36에 나타내었다. EC50 값은 GraphPad Prism 7을 이용하여 비선형 회귀 로그 (작용제) 대 정규화된 반응 (가변 기울기)으로 결정했다. 배양 상청액에서 IFNγ 생성의 2개의 가장 높은 값의 평균을 계산함으로써 최고값 (최대 기능적 효과)을 결정했다. 실험은 총 12명의 공여자를 포함하여 4회 수행되었다.
결과 및 결론
CD137-5T4 이중특이적 항체 ALG.APV-210의 기능적 효과는 HCT116 세포와 함께 플레이트에서 공동 배양된 인간 CD8+ T 세포 (이펙터 세포)를 사용하여 결정되었다. 도 36에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 CD137-5T4 항체 ALG.APV-210은 내인성 수준의 5T4를 발현하는 HCT116 세포의 존재하에서 용량-의존적 방식으로 IFNγ 방출에 의해 측정되는 강력한 T 세포 활성화를 유도했다. EC50의 결정에 대해서는 4개의 풀링된 실험으로부터 12명의 공여자의 평균값 및 95% CI를 보여주는 표 30을 참조한다. HCT116 세포에 의해 발현된 내인성 수준의 5T4는 도 37에 도시된 바와 같이 ALG.APV-210의 높은 작용제 기능 효과를 유도하기에 충분하되 6개의 개별 공여자의 IFNγ 수준을 ALG.APV-210으로 처리한 후 이소형 대조군 (ANC017)과 비교한다. 효능 (최대 IFNγ 반응)이 또한 도 38에 제시되어 있다. (배수 변화 대 이소형 대조군, 12명의 공여자의 평균 및 SD).
실시예 19: HCT-116에서 이중특이적 항체의 생체 내 항-종양 효능 SCID 베이지색 마우스에서 5T4 양성 이종 이식 종양 모델
ALG.APV-210의 생체 내 항 종양 효능을 평가하기 위한 연구가 수행되었다.
재료 및 방법
덴마크 타코닉 (Taconic)사의 암컷 SCID 베이지색 마우스 (6-8 주령)를 실험에 사용했다. 모든 동물 절차는 동물의 권리와 보호에 관한 스웨덴 법률에 따라 수행되었으며 룬드/말뫼의 윤리 동물 실험위원회 (윤리 출원 번호: M151-13)에 의해 승인되었다. PBMC는 제조사의 지시에 따라 Ficoll-Paque (GE Healthcare #17-1440-02)를 사용한 밀도 구배 원심 분리에 의해 4명의 건강한 공여자 (임상 면역학 및 수혈 의학, Labmedicin Region Skne, Lund Sweden)로부터 얻은 백혈구 농축물로부터 단리되었다. 종양 관련 항원 5T4에 대해 양성인 인간 결장 암종 세포주인 HCT-116 세포주를 ATCC (ATCC® CCL-247TM, 로트 #62765668)로부터 구입하여 권장 사항에 따라 배양했다.
0 일에, 로그 단계에서 성장하는 HCT-116 종양 세포를 마우스의 오른쪽 뒤 측면 (110 ㎕ PBS에서 3x106) 에 피하로 접종했다. 다음날 (제1일), 100 ㎕의 PBS 중 4명의 공여자로부터의 인간 PBMC 7 x 106 을 복강 내 주사했다. 복강 내 항체 처리 (PBS에서 100 ㎕)는 제 6일에 시작하여 비히클 (PBS), ALG.APV-210 10 ㎍/마우스 또는 ALG.APV-210 100 ㎍/마우스로 주당 2회로 총 5회 주사 제공되었다 (n = 5 마우스/처리/공여자). 종양 성장을 관찰하고, 캘리퍼(w/2x1/2xh/2x pi x (4/3))로 종양 부피가 계산도록 폭, 길이 및 높이를 주당 2회 측정했다. 실험 종점시 종양 부피는 ≥ 2 cm3, 상처 또는 마우스의 건강에 영향이 있었다. 상이한 시점 (제 9, 13, 16, 20 및 23일)에서 GraphPad Prism 7을 사용한 맨-휘트니 비모수 2-테일 T-검정을 이용하여 종양 성장을 통계적으로 분석했다.
결과
도 28에 도시된 바와 같이, 10 ㎍/마우스 또는 100 ㎍/마우스의 용량에서의 ALG.APV-210은 제13일 내지 23일에서 비히클 군과 비교하여 통계적으로 유의한 항 종양 효능 (예를 들어, 종양 부피 억제)을 나타냈다 (4명의 공여자로부터 풀링된 데이터, 통계 분석 및 p-값; 표 31 참조).
결론적으로, 본 연구는 ALG.APV-210이 5T4 양성 인간 결장 암종 이종 이식 종양 모델에서 항 종양 특성을 가짐을 보여 주었다.
실시예 20: BALB/c 마우스에서 ALG.APV-209의 약동학적 특성
마우스에서 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 약동학 (PK) 특성을 평가하기 위한 연구가 수행되었다. 정상 BALB/c 암컷 마우스에 시간 0에 ALG.APV-209 또는 ALG.APV-210를 200 ㎍의 단일 용량으로 정맥 내 (IV) 주사하고, 시점 당 1 내지 3 마리의 마우스로부터 혈액을 수집했다. 마취된 마우스를 심장 천공을 통해 방혈시키고, 혈청을 t = 15분 및 주사 후 2, 6, 24, 48, 72, 96, 168, 336 및 504시간에 수집했다. 혈청 중의 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 농도는 항-CD137 BD를 포획하기 위한 huCD137 ECD-AFH (ALG027) 및 항-5T4 BD를 검출하기 위한 비오티닐화된 5T4 ECD-mFc(ALG029)를 이용하여 온전한 단백질만을 검출하도록 개발된 ELISA 방법으로 측정했다. Phoenix 64 소프트웨어 (v6.4 WinNonlinTM 라이센스)를 사용한 비구획 분석 (NCA)으로부터의 추정 PK 배치 파라미터가 표 32에 나열되어 있으며, 반감기 추정치와 적합도 통계가 도 29에 나와 있다. 희소 샘플링 및 균일한 가중치를 갖는 IV 투여를 위한 사전 컴파일된 모델을 NCA 중에 사용했다.
200 ㎍ 볼루스 용량의 ALG.APV-209 또는 ALG.APV-210을 IV로 주사한 정상 암컷 BALB/c 마우스에서, NCA를 사용하여 측정된 겉보기 말단 제거 반감기는 각각 142 및 215시간이었다 (ADA에 의해 잠재적으로 영향을 받는 샘플 제외). 구획 분석 (IV 투약을 한 2-구획물)을 사용하여 결정된 반감기에 대한 파라미터 추정치는 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210에 대해 유사했다. NCA는 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 클리어런스 및 부피가 각각 0.263 및 0.204 mL/hr/kg, 54 및 63 mL/kg인 것으로 추정했다. 두 가지 분석 방법 모두 ALG.APV-210은 가장 긴 말단 제거 반감기와 약간 더 나은 클리어런스 값을 가졌다. 항-약물 항체 (ADA)를 나타내는 혈청 농도의 갑작스런 하락이 ALG.APV-210을 투여한 마우스의 후기 시점에서 관찰되었지만, 여전히 샘플에 존재하는 약물로 인해 ELISA 방법으로 ADA의 존재를 확인할 수 없었으며, 이는 또한 ADA의 신속한 제거를 가져오는 것 같다.
실시예 21: ALG.APV-210의 Fc 부분은 Fcγ 수용체와 상호 작용하지 않는다.
ALG.APV-210은 FcγR-매개 T-세포 활성화 또는 ADCC, ADCP, CDC 등을 초래할 수 있는 Fcγ 수용체 (FcγR)와의 상호 작용을 방지하기 위해 도입된 돌연변이를 함유한다. 따라서 ALG.APV-210의 결합은 하기 FcγR: FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32a His131), FcγRIIb (CD32b), FcγRIIIa (CD16a Val158 및 CD16a Phe158), 및 FcγRIIIb (CD16b)를 안정적으로 발현하는 CHO 세포 형질 감염체에서 시험되었다. 형질 감염되지 않은 CHO 세포를 음성 대조군으로 사용했다. 대조군 인간 IgG1 분자를 양성 대조군으로 사용했다. 상이한 농도의 ALG.APV-210 또는 대조군 IgG1을 FcγR-발현 세포주와 함께 인큐베이션하고 세척하고 2차 항-인간 IgG 시약으로 표지했다. ALG.APV-210 및 대조군 IgG1의 결합은 유동 세포 분석에 의해 검출되었다.
결과는 도30a 및 30b에 제공된다. 도 30b는 대조군 IgG1가 모든 시험된 FcγR 발현 세포주: FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32a His131), FcγRIIb (CD32b), FcγRIIIa (CD16a Val158 및 CD16a Phe158) 및 FcγRIIIb (CD16b)에는 결합하지만 형질 감염되지 않은 CHO 세포 (음성 대조군)에는 결합하지 않음을 나타낸다. 일부 FcγR 발현 세포주에 대한 대조군 IgG1의 유의한 결합은 4 nM 만큼 낮은 농도에서도 관찰되었다. 도 30a는 ALG.APV-210 작제물에서는 시험된 FcγR: FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32a His131), FcγRIIb (CD32b), FcγRIIIa (CD16a Val158 및 CD16a Phe158), 및 FcγRIIIb (CD16b)에 대해 검출 가능한 결합이 관찰되지 않음을 보여준다.
실시예 22: 인간 PBMC 및 CHO-5T4 세포를 사용한 T-세포 증식 분석에서 5T4-CD137 이중특이적 항체의 시험관 내 활성
5T4-CD137 이중특이적 분자 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210의 기능적 활성은 PBMC를 사용하여 T-세포 증식 분석으로 평가되었다. 표준 피콜 구배를 이용하여 건강한 인간 혈액으로부터 PBMC를 단리했다. 단리되면, 세포를 식염수 완충액으로 세척하여 혈소판을 제거했다. PBMC를 96-웰 플레이트에서 대략 120,000 PBMC 대 30,000 5T4 (+) 세포로, 조사된 CHO-K1/인간 5T4 세포와 함께 배양했다. CHO-K1/5T4 세포를 조사하고 (x-선 세포 라드 조사기, Faxitron Bioptics, LLC), 배지에서 세척하고 PBMC로 도금했다. 항-CD3 항체 OKT3 (eBioscience)을 모든 웰에 1 ng/mL의 농도에서 첨가했다. 세포를 10% 소태아혈청 (SIGMA), 피루브산 나트륨, 항생제 및 비필수 아미노산이 보충된 총 부피 200 ㎕의 RPMI 1640 배지 (GIBCO)에서 배양했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션했다. 상청액을 제거하고, 세포를 2% BSA 및 2 mM EDTA를 함유한 PBS 완충제 중의 CD4, CD8 및 CD5에 대한 항체로 동일한 분석 플레이트에서 얼음상에서 30분 동안 라벨링하고, 7AAD를 첨가하여 죽은 세포를 배제시켰다. 세척 후 세포를 120 ㎕/웰로 재현탁시키고 70 ㎕/웰 부피를 유동 세포 분석기 (LSR-IITM, BD Biosciences)에서 각 웰로부터 수집했다. Flowjo 소프트웨어를 사용하여 세포 분석을 수행하고, FSC 대 SSC 파라미터를 사용하여 림프구상에서 게이팅한 후 CD4+ 또는 CD8+ 라이브 T 세포 이벤트 (CD4+ CD8-CD5+, 7AAD- 또는 CD4- CD8+ CD5+ 7AAD-) 이벤트의 수를 계수하여 분석했다. 각 조건을 이중으로 테스트하고 GraphPad Prism 6® 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 각 중복 세트의 평균을 그래프로 표시했다.
연구 결과는 도 31a 및 31b에 제공된다. CD8+ T 세포의 항원-특이적 증식은 저농도의 항-CD3 항체로 프라이밍된 T 세포의 72 시간 자극 후에 평가되었다. 항-CD3 자극은 CD137의 상향 조절을 유도한다. 이중특이적 항체가 없는 항-CD3 단독의 첨가는 일정량의 CD8+ 및 CD4+ T- 세포 증식을 유도했다. ALG.APV-209 또는 ALG.APV-210의 첨가는 CD8+ T 세포의 증식을 증가시켰다 (도 31a). 대조적으로, CD8+ T 세포에서 CD137의 우선적 발현에 기초하여 예상된 바와 같이, 이중특이적 항체는 CD4+ T 세포의 항-CD3 유도된 증식에 제한적인 영향을 미쳤다 (도 31b). 결과는 여러 실험에서 일관되었다. 모리슨 형식 대조군 분자 (ALG.APV-004)가 비교를 위해 포함되었다.
종합하면, 결과는 ALG.APV-209 및 ALG.APV-210 모두 CD8+ T 세포의 증식을 향상시켰음을 보여 주었다. ALG.APV-209 및 ALG.APV-210은 모리슨 형식 작제물 ALG.APV-004보다 많은 양의 세포 증식을 유도했다.
실시예 23: 면역 조직 화학에 의해 평가된 정상 및 종양 조직에서의 5T4 발현
정상 인간 조직 및 다양한 종양 유형에서 종양 항원 5T4의 발현을 면역 조직 화학 (IHC)에 의해 평가했다.
염색 방법의 개발: 5개의 상업적인 항-5T4 항체 및 2개의 사내 생성된 항-5T4 항체를 대조군 세포 및 시험 인간 조직의 동결 섹션 대 포르말린-고정, 파라핀-매립 (FFPE) 섹션에서의 5T4-결합에 대해 평가하였다. 이소형 대조군 염색도 포함되었다. 마우스 단일 클론 항체 (클론: MAB4975, R&D Systems)는 동결 섹션 및 FFPE 섹션 모두에서 매우 특이적이고 기능적이기 때문에 가장 우수한 성능의 항체로 선택되었다. 이 항체에 대해 항원 검색 방법 및 항체 역가를 최적화했다.
조직 및 조직 마이크로 어레이: 인간 태반 조직 및 인간 5T4를 발현시키기 위해 형질 감염된 뮤린 결장 암종 세포주 CT26 (ATCC174; CRL-2638)을 양성 대조군으로서 사용했다. 인간 대뇌, 간 및 형질 감염되지 않은 CT26 세포를 음성 대조군으로 사용했다. 양성 대조군 및 음성 대조군에 사용된 인간 조직은 Charles River Laboratories의 보관소에서 얻었다. FFPE 조직 마이크로 어레이 (TMA)는 US Biomax Inc.로부터 입수했다. 모든 염색은 PAI (Charles River Laboratories)의 연구 병리학자에 의해 평가되었다.
정상 인간 조직 마이크로 어레이의 IHC 염색: 3명의 공여자 (FDA808j-1)로부터의 24개의 조직 유형을 갖는 정상 인간 조직 패널에서, 5T4 발현은 어떠한 주요 기관에서도 발견되지 않았다.
인간 종양 조직 유형에서의 IHC 염색: 5T4 발현을 종양 당 단일 코어에 의해 제시된 72개의 종양 사례 (FDA808j-2)의 다중 기관 암 조직 어레이에서 스크리닝했다. 5T4 발현은 췌장, 갑상선, 유방, 간, 자궁, 자궁 경부, 줄무늬근, 피부 (편평 상피 세포암), 신경 (신경 섬유종) 및 방광의 종양에서 검출되었다.
5T4 발현은 2중 또는 3중 코어로 표시되는 표 33에 나타낸 선별 적응증 각각에 대해 10 내지 50개의 종양 사례를 함유하는 TMA에서 평가되었다. 방광암, 두 경부암 (H&N), 비-소세포 폐암 (NSCLC) 및 중피종에서, 조사된 종양의 50 내지 56%가 5T4 양성이었다. 상당한 수의 췌장 종양도 5T4 양성이었다 (36%). 조사된 투명 세포 암종 종양의 50%가 5T4 양성이었다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 그러나, 여기에 인용된 모든 참고 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 또는 세계 어느 나라에서나 일반적인 지식의 일부를 형성하는 것으로 인정하거나 제안하는 어떤 형태로도 받아들여져서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Aptevo Research and Development LLC Alligator Bioscience AB Bienvenue, David Misher, Lynda Hoyos, Gabriela H. Mitchell, Danielle Ellmark, Peter Sall, Anna Furebring, Christina Von Schantz, Laura Fritzell, Sara Varas, Laura <120> ONCOFETAL ANTIGEN BINDING PROTEINS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS <130> APVO-057/03WO 327714-2734 <150> US 62/535,107 <151> 2017-07-20 <150> US 62/575,820 <151> 2017-10-23 <150> US 62/648,072 <151> 2018-03-26 <160> 181 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Made in Lab - antibody fragments <400> 1 ggattcacct tttctcacgg ttct 24 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - antibody fragments <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser His Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Made in Lab - antibody fragments <400> 3 atttcttctg gttctggttc taca 24 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - antibody fragments <400> 4 Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Made in 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caccgtctcc 420 tcaggtggag gtggctccgg gggtggaggt tccggaggag gcggatcagg tggaggcgga 480 agcgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgagcg catctgtagg agaccgcgtc 540 accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 600 ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 660 tcacgtttca gtggcagtgg aagcgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctacaa 720 cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtactacg acaacctgcc cacttttggc 780 caggggacca agctggagat caaagagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggtgca ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gaatacaagt gcgcggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc aagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggttcc 1500 ggaggtggcg gttcgggagg tggcgggtca ggaggtgggg gatccccttc agaagtgcag 1560 ctgctggagt ccggaggagg actggtgcag cctggcggaa gcctgaggct gagctgcgct 1620 gcctccggct tcacattcag cagctatgct atgagctggg tgaggcaagc ccctggaaag 1680 tgcctggagt gggtgtccgc tatctccggc agcggcggaa gcacctacta cgctgactcc 1740 gtcaagggca ggttcaccat cagccgggac aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg 1800 aatagcctca gggctgaaga caccgctgtg tactactgcg ccaggtacta tggcggctac 1860 tactccgcct ggatggacta ctggggacag ggcacactgg tgaccgtgtc cagcggcgga 1920 ggcggctccg gaggcggtgg ctccggagga ggcggaagcg gaggaggagg ctccgatatt 1980 cagatgacac agtcccctag ctccctgtcc gccagcgtgg gagatcgggt gaccatcacc 2040 tgcagggcca gccagtccat ctccagcttc ttaaactggt accagcagaa gcctggaaag 2100 gctcccaagc tgctgatcta cgccgcttcc agcctccaga gcggcgtgcc tagcaggttc 2160 tccggctccg gaagcggaac agacttcacc ctgaccatca gctccctgca gcccgaggac 2220 tccgctacct actactgcca gcagacctat ggctacctgc acaccttcgg ctgcggcaca 2280 aagctggaga tcaagcgc 2298 <210> 174 <211> 766 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - anti-5T4 x anti-4-1BB polypeptide construct <400> 174 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 35 40 45 Phe Ser His Gly Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ser Lys 85 90 95 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Ser Ile 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 165 170 175 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 180 185 190 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 195 200 205 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 225 230 235 240 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Asn Leu 245 250 255 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 275 280 285 Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 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Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 545 550 555 560 Cys Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 565 570 575 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 580 585 590 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 595 600 605 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Gly Tyr Tyr Ser Ala Trp 610 615 620 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 625 630 635 640 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 645 650 655 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 660 665 670 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 675 680 685 Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 690 695 700 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 705 710 715 720 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 725 730 735 Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Gly Tyr 740 745 750 Leu His Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys 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cagtctacaa 720 cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtactacg acaacctgcc cacttttggc 780 caggggacca agctggagat caaagagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggtgca ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gaatacaagt gcgcggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc aagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggttcc 1500 ggaggtggcg gttcgggagg tggcgggtca ggaggtgggg gatccccttc agaagtgcag 1560 ctgctggagt ccggaggagg actggtgcag cctggcggaa gcctgaggct gagctgcgct 1620 gcctccggct tcacattcag cagctatgct atgagctggg tgaggcaagc ccctggaaag 1680 ggcctggagt gggtgtccgc tatctccggc agcggcggaa gcacctacta cgctgactcc 1740 gtcaagggca ggttcaccat cagccgggac aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg 1800 aatagcctca gggctgaaga caccgctgtg tactactgcg ccaggtacta tggcggctac 1860 tactccgcct ggatggacta ctggggacag ggcacactgg tgaccgtgtc cagcggcgga 1920 ggcggctccg gaggcggtgg ctccggagga ggcggaagcg gaggaggagg ctccgatatt 1980 cagatgacac agtcccctag ctccctgtcc gccagcgtgg gagatcgggt gaccatcacc 2040 tgcagggcca gccagtccat ctccagctat ttaaactggt accagcagaa gcctggaaag 2100 gctcccaagc tgctgatcta cgccgcttcc agcctccaga gcggcgtgcc tagcaggttc 2160 tccggctccg gaagcggaac agacttcacc ctgaccatca gctccctgca gcccgaggac 2220 tccgctacct actactgcca gcagacctat ggctacctgc acaccttcgg ccagggcaca 2280 aagctggaga tcaagcgc 2298 <210> 176 <211> 766 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - anti-5T4 x anti-4-1BB polypeptide construct <400> 176 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 35 40 45 Phe Ser His Gly Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ser Lys 85 90 95 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Ser Ile 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 165 170 175 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 180 185 190 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 195 200 205 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 225 230 235 240 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Asn Leu 245 250 255 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 275 280 285 Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 500 505 510 Gly Gly Ser Pro Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 515 520 525 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 530 535 540 Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 545 550 555 560 Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 565 570 575 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 580 585 590 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 595 600 605 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Gly Tyr Tyr Ser Ala Trp 610 615 620 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 625 630 635 640 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 645 650 655 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 660 665 670 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 675 680 685 Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 690 695 700 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 705 710 715 720 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 725 730 735 Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Gly Tyr 740 745 750 Leu His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 755 760 765 <210> 177 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACN017 CDRH1 Sequence <400> 177 Ala Lys Gly Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACN017 CDRL3 <400> 178 Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 179 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACN017 VH <400> 179 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 180 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACN017 VL <400> 180 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 181 <211> 741 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACN017 Full <400> 181 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln 180 185 190 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ile Lys Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 245 250 255 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Glu 485 490 495 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 500 505 510 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 515 520 525 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 530 535 540 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 545 550 555 560 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 565 570 575 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 580 585 590 Lys Gly Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 595 600 605 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 610 615 620 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 625 630 635 640 Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 645 650 655 Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 660 665 670 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 675 680 685 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 690 695 700 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 705 710 715 720 Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 725 730 735 Glu Ile Lys Arg Ser 740

Claims (200)

  1. 인간 5T4에 특이적으로 결합하는 5T4-결합 도메인, 및 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 4-1BB-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드로서,
    상기 5T4-결합 도메인은 (i) HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 여기에서
    (a) HCDR1은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HCDR2는 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HCDR3은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) LCDR1은 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) LCDR2는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) LCDR3은 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 4-1BB-결합 도메인은 (i) HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH), 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하되, 여기에서
    (a) HCDR1은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HCDR2는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HCDR3은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) LCDR1은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) LCDR2는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) LCDR3은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는
    다중특이적 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 5T4-결합 도메인이
    - 서열번호 38 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    - 서열번호 38 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    - 서열번호 44, 48, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해서 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    - 서열번호 44, 48, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 상기 4-1BB-결합 도메인은
    - 서열번호 14와 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    - 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    - 서열번호 16과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    - 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 5T4-결합 도메인의 VH 및 VL 영역 중 하나 이상은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나,
    상기 4-1BB-결합 도메인의 VH 및 VL 영역 중 하나 이상은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나, 또는
    상기 5T4-결합 도메인의 VH 및 VL 영역 중 하나 이상은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 4-1BB-결합 도메인의 VH 및 VL 영역 중 하나 이상은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 5T4-결합 도메인 및 4-1BB-결합 도메인은 결합 도메인 링커, 또는 결합 도메인 링커 및 면역 글로불린 Fc 도메인을 통하여 연결되고, 상기 면역 글로불린 Fc 도메인은 힌지 영역 및 면역 글로불린 불변 영역을 포함하고,
    상기 다중특이적 폴리펩티드는 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (i) 상기 5T4-결합 도메인, (ii) 힌지 영역, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 결합 도메인 링커, 및 (v) 상기 4-1BB-결합 도메인을 포함하거나, 또는
    아미노-말단에서 카르복실-말단까지 순서대로 (i) 상기 4-1BB-결합 도메인, (ii) 결합 도메인 링커, (iii) 면역 글로불린 불변 영역, (iv) 힌지 영역, 및 (v) 상기 5T4-결합 도메인을 포함하는 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 5T4 결합 도메인 및 상기 4-1BB-결합 도메인 중 하나 이상은 단일쇄 가변 단편(scFv)인 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 scFv가 링커 폴리펩티드를 포함하고,
    상기 링커 폴리펩티드는 상기 scFv의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 사이에 위치하거나, 또는
    상기 링커 폴리펩티드는
    Gly4Ser 링커를 포함하는 링커 폴리펩티드;
    화학식 (Gly4Ser)n를 포함하되 n = 1 내지 5인, 링커 폴리펩티드;
    서열번호 85 내지 108로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 링커 폴리펩티드; 및
    서열번호 98에 제시된 아미노산 서열 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)을 포함하는 링커 폴리펩티드로 구성된 목록에서 선택되거나, 또는
    상기 링커 폴리펩티드가 상기 scFv의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 사이에 위치하고,
    상기 링커 폴리펩티드는
    Gly4Ser 링커를 포함하는 링커 폴리펩티드;
    화학식 (Gly4Ser)n를 포함하되 n = 1 내지 5인, 링커 폴리펩티드;
    서열번호 85 내지 108로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 링커 폴리펩티드; 및
    서열번호 98에 제시된 아미노산 서열 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)을 포함하는 링커 폴리펩티드로 구성된 목록에서 선택되는 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 5T4 결합 도메인 scFv가
    - 서열번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 및 170으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해서 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    - 서열번호 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 및 170으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고, 및
    상기 4-1BB-결합 도메인 scFv가
    - 서열번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열; 또는
    - 서열번호 110, 112, 114 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 다중특이적 폴리펩티드의 이펙터 세포에 대한 결합이 향상된 이펙터 세포 활성화를 가져오거나,
    상기 다중특이적 폴리펩티드의 이펙터 세포에 대한 결합이 이펙터 세포 활성화 및 이펙터 세포 증식 중 하나 이상을 증가시키거나,
    상기 다중특이적 폴리펩티드의 이펙터 세포 및 5T4-발현 세포에 대한 결합이 5T4-발현 세포의 이펙터 세포-의존성 분해를 향상시키는 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 5T4-결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 중 하나 이상이 인간화되거나,
    상기 4-1BB-결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 중 하나 이상이 인간화되거나, 또는
    상기 5T4-결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 중 하나 이상이 인간화되고, 상기 4-1BB-결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 중 하나 이상이 인간화되는 것인 다중특이적 폴리펩티드.
  11. 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하는 이량체로서, 상기 2개의 폴리펩티드가 각각 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드인, 이량체.
  12. 활성성분으로서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 이들의 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하는 이량체를 포함하는, 암 치료용 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제약 조성물은 경구 단위 투여 형태, 정맥 내 단위 투여 형태, 비강 내 단위 투여 형태, 좌제 단위 투여 형태, 피내 단위 투여 형태, 근육 내 단위 투여 형태, 복강 내 단위 투여 형태, 피하 단위 투여 형태, 경막 외 단위 투여 형태, 설하 단위 투여 형태 및 뇌내 단위 투여 형태로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 형태로 제형화되고;
    상기 경구 단위 투여 형태는 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 분말, 로젠지, 과립제, 용액제, 현탁액제, 유제, 시럽제, 엘릭시르제, 서방성 제제, 에어로졸 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 암이 유방암, 췌장암, 난소암, 비-소세포 폐암, 악성 중피종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀 세포 백혈병(MCL), 급성 림프성 백혈병(ALL), 흑색종, 편평 상피 세포암, 부신암, 방광암, 자궁 경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 갑상선암, 간암, 자궁암, 신경 섬유종, 육종, 암종 또는 두 경부암인, 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 이들의 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하는 이량체를 코딩하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자가 서열 번호 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 171, 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  16. 제15항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로서, 상기 핵산 분자가 숙주 세포에서 핵산 세그먼트의 발현에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 것인 발현 벡터.
  17. 제16항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  18. 핵산 세그먼트가 발현되는 조건 하에서 제16항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 5T4-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함하는, 5T4-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.




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