CN117769432A - 针对muc1-c/胞外结构域（muc1-c/ecd）的多特异性抗体构建体 - Google Patents

针对muc1-c/胞外结构域（muc1-c/ecd）的多特异性抗体构建体 Download PDF

Info

Publication number
CN117769432A
CN117769432A CN202280045669.5A CN202280045669A CN117769432A CN 117769432 A CN117769432 A CN 117769432A CN 202280045669 A CN202280045669 A CN 202280045669A CN 117769432 A CN117769432 A CN 117769432A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
antibody construct
antibody
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280045669.5A
Other languages
English (en)
Inventor
苏伦德·克哈班达
戈文达斯瓦米·潘切穆尔蒂
唐纳德·W·库弗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xirong Medical Co
Dana Farber Cancer Institute Inc
Original Assignee
Xirong Medical Co
Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xirong Medical Co, Dana Farber Cancer Institute Inc filed Critical Xirong Medical Co
Publication of CN117769432A publication Critical patent/CN117769432A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开内容涉及与MUC1‑C/胞外结构域(MUC1‑C/ECD)并与至少一种其他结合靶标结合的多特异性抗体构建体，其中所述结合靶标包含CD3(分化簇3)。还提供了使用这样的构建体治疗表达MUC1抗原的癌症的方法。还公开了重组多特异性抗体的序列。

Description

针对MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)的多特异性抗体构 建体
优先权声明
本申请要求2021年5月28日提交的美国临时申请序列号63/194,597的优先权权益，其全部内容在此通过引用并入。
序列表的引用
本申请包含已经通过EFS-Web以ASCII格式提交并且在此通过引用整体并入的序列表。创建于2022年5月26日的所述ASCII拷贝命名为GENU0048WO_ST25.txt，并且大小为112KB。
背景
1.技术领域
本公开内容总体上涉及医学、肿瘤学和免疫治疗学领域。更特别地，其涉及用于治疗MUC1阳性癌症的多特异性免疫试剂的开发。
2.背景技术
黏蛋白普遍是主要由上皮细胞表达的O-糖基化的蛋白质。分泌的和膜结合的黏蛋白形成物理屏障，该物理屏障保护上皮细胞的顶端边缘免受由毒素、微生物和在与外部环境的接触面处发生的其他形式的应激所诱导的损伤。跨膜黏蛋白1(mucin 1，MUC1)也可以向细胞内部发出信号。除了存在海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白(sea urchin spermprotein-enterokinase-agrin，SEA)结构域之外，MUC1与其他膜结合黏蛋白没有序列相似性(Duraisamy et al.，2006)。在这方面，MUC1被翻译为单一多肽，并随后在SEA结构域处进行自切割(Macao，2006)。
本发明人和其他人已经广泛研究了MUC1在癌症中的作用。如上所述，人MUC1是翻译为单一多肽并在内质网中切割成N端和C端亚基(MUC1-N和MUC1-C)的异二聚体糖蛋白(Ligtenberg et al.，1992；Macao et al.，2006；Levitin et al.，2005)。如在大多数人癌中存在的MUC1的异常过表达(Kufe et al.，1984)赋予了锚定非依赖性生长和致瘤性(Liet al.，2003a；Huang et al.，2003；Schroeder et al.，2004；Huang et al.，2005)。其他研究已经表明，MUC1的过表达赋予对氧化应激和基因毒性抗癌药剂诱导的凋亡的抗性(Yinand Kufe，2003；Ren et al.，2004；Raina et al.，2004；Yin et al.，2004；Raina et al.，2006；Yin et al.，2007)。
系链和分泌黏蛋白家族在提供上皮细胞表面的保护屏障中发挥作用。随着上皮层的损伤，相邻细胞之间的紧密连接被破坏，并且当细胞启动调蛋白诱导的修复程序时极性丧失(Vermeer et al.，2003)。MUC1-N从细胞表面脱落(Abe and Kufe，1989)，留下MUC1-C用作环境压力信号的传递者进入细胞内部。在该方面，MUC1-C与ErbB受体家族的成员形成细胞表面复合物，并且MUC1-C在对调蛋白刺激的响应中靶向细胞核(Li et al.，2001；Liet al.，2003c)。MUC1-C还通过MUC1胞质结构域(cytoplasmic domain，CD)和连环蛋白家族成员之间的直接相互作用在整合ErbB受体和Wnt信号传导途径中发挥作用(Huang et al.，2005；Li et al.，2003c；Yamamoto et al.，1997；Li et al.，1998；Li et al.，2001；Liand Kufe，2001)。其他研究已表明，MUC1-CD被糖原合酶激酶3β、c-Src、蛋白激酶Cδ和c-Abl磷酸化(Raina et al.，2006；Li et al.，1998；Li et al.，2001；Ren et al.，2002)。抑制任何前述相互作用代表了MUC1相关癌症的潜在治疗性干预点。
发明内容
因此，根据本公开内容，提供了重组抗体构建体，其与由SEQ ID NO：2限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合，其中所述抗体构建体还与以下结合：
(a)CD3；
(b)CD16；
(c)CD28；
(d)髓性特异性抗原；
(e)ErbB2；
(f)EGFR；
(g)CD3和PD1；
(h)CD16和PD1；
(i)CD47；
(j)SIRPα；
(k)NKG2D，
(1)Siglec 9。
抗体构建体可以是二价、三价或四价的。抗体构建体可针对MUC1-C-/ECD具有两种不同的结合特异性。抗体构建体可具有分别由SEQ ID NO：3、5和7的重CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别由SEQ ID NO：4、6和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列引起的MUC1结合特异性；和/或分别由SEQ ID NO：9、11和13的重CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别由SEQ ID NO：10、12和14的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列引起的MUC1结合特异性。
抗体构建体可以包含一个或更多个允许两种不同抗体链锁定的突变。抗体构建体可以包含IgG序列和/或可以是鼠抗体的人源化形式，例如包含IgG序列的人源化抗体构建体。抗体构建体还包含标记，例如肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。抗体构建体还可包含与其连接的抗肿瘤药物，例如其中抗肿瘤药物通过光不稳定接头或酶促切割接头与所述抗体构建体连接。抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
抗体构建体可包含SEQ ID NO：22至42的序列。抗体构建体可包含与SEQ ID NO：22至42具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。抗体构建体可与纳米粒或脂质体缀合。对细胞死亡的诱导可包含抗体依赖性细胞细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
还提供了治疗癌症的方法，其包括使对象中的MUC1阳性癌细胞与如本文中所限定的抗体构建体接触。MUC1阳性癌细胞可以是实体瘤细胞，例如肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食管癌细胞。MUC1阳性癌细胞可以是白血病或骨髓瘤，例如急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
所述方法还可包括使所述MUC1阳性癌细胞与第二抗癌药剂或治疗接触，例如其中所述第二抗癌药剂或治疗选自化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗。第二抗癌药剂或治疗可抑制胞内MUC1功能。第二抗癌药剂或治疗可以与所述抗体构建体同时给予，或者可以在所述抗体构建体之前和/或之后给予。MUC1阳性癌细胞可以是转移性癌细胞、多重药物抗性癌细胞或复发性癌细胞。抗体构建体可导致对细胞死亡的诱导，例如通过抗体依赖性细胞细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
还提供了表达如本文中所述的抗体构建体的细胞。
预期本文中所述的任何方法或组合物可以相对于本文中所述的任何其他方法或组合物来实施。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词的使用可意指“一个/种”，但是其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。“约”一词意指所述数字的正负5％。
本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例虽然指示了本公开内容的具体实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文中给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
图1A至N：多种形式的双特异性抗体的示意图。(图1A)h3D1-hCD3双特异性抗体(构 建体对‘A’)。产生双特异性DNA构建体(构建体A)以产生二价hMUC1-C(h3D1克隆)和二价人CD3(hCD3)结合互补位的同二聚体。h3D1(VH-CH1)-hFc-hCD3(VL-VH)+h3D1(VL-CL)。本发明人还产生了LALA-PG突变以消除任何Fc受体介导的效应机制(SEQ ID NO：30+31)。(图1B)h7B8-1-hCD3双特异性抗体(构建体对‘B’)。发明人已经产生了包含h7B8-1抗体的单独轻链的单体。通过并入具有更好稳定性且不二聚化的单体Fc而产生具有单个MUC1-C结合位点的h7B8-1-hCD3双特异性构建体(SEQ ID NO：32+33)。(图1C)h3D1-hCD3双特异性抗体(构建体 对‘C’)。本发明人已经产生了异二聚体，其中scFv通过结进孔(Knob-into-Hole)结合而聚集在一起。该构建体由于通过使用结进孔技术用Fc区中所指示突变(针对T366W的T366S、T368A、Y407V)异二聚化而具有针对MUC1-C的二价结合位点和针对CD3的一价结合位点。结进孔技术在一条链中应用大的氨基酸来产生“结”，而在另一条链中采用较小的氨基酸用于相应的“孔”。另外，两条带相反电荷的重链的静电转向(electrostatic steering)与单链可变片段(single chain variable fragment，scFv)技术的组合确保了正确的链组装(SEQID NO：22+23)。(图1D)h3D1-hCD3双特异性抗体(scFv)(构建体‘D’)。这种形式的双特异性抗体具有单链可变片段(scFv)，其具有针对MUC1-C和CD3的各一个结合位点，并且由于所指示的突变而保持为单体(SEQ ID NO：22)。(图1E)h3D1-hCD3-hPD-1三特异性抗体(构建体对 ‘E’)。这种形式采用了与图1C中相同的异二聚化策略，但其包含针对PD-1的结合位点(SEQID NO：22+34)。(图1F)h3D1-hCD3-hPD-1三特异性抗体(构建体对‘F’)。这种形式采用了如图1C中的异二聚化的策略，但其包含针对PD-1的结合位点，以及具有h3D1和hPD-1的重链和轻链的不同取向(SEQ ID NO：24+35)。(图1G)h7B8-1-hCD3-hPD-1三特异性抗体(构建体对 ‘G’)。这种形式采用了与图1C中相同的异二聚化的策略，但其包含针对PD-1的结合位点(SEQ ID NO：26+36)。(图1H)h7B8-1-hCD3-hPD-1三特异性抗体(构建体对‘H’)。这种形式采用了如图1C中的异二聚化的策略，但其包含针对PD-1的结合位点，以及具有h7B8-1和hPD-1的重链和轻链的不同取向(SEQ ID NO：28+37)。(图1I)h7B8-1-hCD3双特异性抗体(构建体 对‘I’)。本发明人已经产生了其中scFv通过结进孔结合而聚集在一起的异二聚体。该构建体由于通过使用结进孔技术用Fc区中所指示突变(针对T366W的T366S、T368A、Y407V)异二聚化而具有针对MUC1-C的二价结合位点和针对CD3的一价结合位点。结进孔技术在一条链中应用大的氨基酸来产生“结”，而在另一条链中采用较小的氨基酸用于相应的“孔”。另外，两条带相反电荷的重链的静电转向与单链可变片段(scFv)技术的组合确保了正确的链组装(SEQ ID NO：26+27)。(图1J)h7B8-1-hCD3双特异性抗体(scFv)(构建体‘J’)。这种形式的双特异性抗体具有单链可变片段(scFv)，其具有针对MUC1-C和CD3的各一个结合位点，并且由于所指示的突变而保持为单体(SEQ ID NO：26)。(图1K至N)四种不同设计中的双互补位 双特异性MUC1-C/CD3构建体。
图2：双特异性抗体的纯化。所有指示的构建体在CHO-K1细胞中表达，并产生每种双特异性形式的单细胞克隆。扩增来自克隆的细胞，维持混悬培养物，并使用蛋白A柱纯化双特异性抗体。纯化的蛋白通过SDS-PAGE检查。泳道1至3包含还原条件下的所指示双特异性蛋白质。泳道4至6包含在非还原条件下的相同蛋白质。
A＝h3D1(VH-CH1)-hFc-hCD3(VL-VH)+h3D1(VL-CL)；B＝h7B8-1(VH-CH1)-mhFc-hCD3(VL-VH)+h7B8-1(VL-CL)；D＝h3D1(VH-VL)-hFc-hCD3(VL-VH)-scFv。
图3：通过流式细胞术对与ZR-75-1激素依赖性乳腺癌细胞上的MUC1-C抗原结合的双特异性抗体的评估。将细胞用4μg/ml的测试抗体或IgG1同种型对照抗体孵育60分钟，随后用合适的二抗孵育。使用流式细胞术分析与细胞表面结合的抗体。h3D1-hCD3双特异性抗体与乳腺腺癌细胞系ZR75-1的细胞表面MUC1-C的结合。同种型匹配的人IgG1和h3D1分别用作结合的阴性和阳性对照。
图4：通过流式细胞术对与Jurkat T细胞系上CD3结合的双特异性抗体构建体的评估。h3D1-hCD3双特异性抗体构建体与T细胞系Jurkat上CD3的结合。同种型匹配的人IgG1和抗hCD3分别用作结合的阴性和阳性对照。
图5A至C：通过双特异性抗体的T细胞活化。将靶细胞孔平板接种在96孔板中的生长培养基中，并孵育过夜。将不同浓度的双特异性抗体(所指示的)添加至细胞，随后添加TCR/CD3效应细胞(NFAT-Jurkat)并孵育6小时。添加Bio-GloTM试剂，并使用MolecularDevices FilterMax F5读取器对发光进行定量。使用GraphPad Prism软件将数据拟合成4PL曲线。(图5A)将乳腺腺癌细胞ZR-75-1(10,000个细胞/孔)用从20μg/ml开始以2倍系列稀释的所指示双特异性抗体和100,000个细胞/孔的NFAT-Jurkat进行处理。(图5B)将乳腺腺癌细胞ZR-75-1(40,000个细胞/孔)用从30μg/ml开始以3倍系列稀释的所指示双特异性抗体和100,000个细胞/孔的NFAT-Jurkat进行处理。(图5C)将表达MUC1(HCT/MUC1)或载体(HCT116/载体)的HCT116细胞(10,000个细胞/孔)用从10μg/ml开始以3倍系列稀释的所指示双特异性抗体和100,000个细胞/孔的NFAT-Jurkat进行处理。
具体实施方式
本发明人已经产生了多特异性抗体构建体，其对MUC1-C蛋白外部结构域的58个氨基酸非脱落部分以及对至少一个且任选地两个其他结合靶标具有结合特异性。这样的构建体也可以被改造成对多个MUC1-C表位具有结合特异性。这些抗体已被表明具有刺激T细胞的能力，并因此可用于治疗MUC1相关癌症。下文更详细地描述了本公开内容的这些和其他方面。
I.MUC1
A.结构
MUC1是在正常分泌上皮细胞的顶端边缘表达的黏蛋白型糖蛋白，(Kufe et al.，1984)。MUC1在合成为单一多肽并在内质网中将前体切割成两个亚基后形成异二聚体(Ligtenberg et al.，1992)。这种切割可以是由自动催化过程介导的(Levitan et al.，2005)。＞250kDa的MUC1 N端(MUC1-N)亚基包含可变数量的20个氨基酸串联重复，这些重复是不完美的，具有高度保守的变异并被O-连接的聚糖修饰(Gendler et al.，1988；Siddiqui et al.，1988)。MUC1-N通过与约23kDa的C端亚基(MUC1-C)二聚化而被系链至细胞表面，其包含58个氨基酸的胞外区域、28个氨基酸的跨膜结构域(带下划线)和72个氨基酸的胞质结构域(cytoplasmic domain)(CD；粗体)(Merlo et al.，1989)。本公开内容的抗体结合的是MUC1-C/ECD的58个氨基酸部分(斜体)。以下示出了人MUC1-C序列：
粗体序列表示CD，带下划线部分是寡聚体抑制肽。随着正常上皮向癌的转化，MUC1在胞质溶胶中和整个细胞膜上异常过表达(Kufe et al.，1984；Perey et al.，1992)。细胞膜相关MUC1通过网格蛋白介导的内吞作用靶向内体(Kinlough et al.，2004)。另外，MUC1-C而非MUC1-N靶向细胞核(Baldus et al.，2004；Huang et al.，2003；Li et al.，2003a；Liet al.，2003b；Li et al.，2003c；Wei et al.，2005；Wen et al.，2003)和线粒体(Ren etal.，2004)。
B.功能
MUC1-C与ErbB受体家族的成员(Li et al.，2001b；Li et al.，2003c；Schroederet al.，2001)以及与Wnt效应子β-连环蛋白(Yamamoto et al.，1997)相互作用。表皮生长因子受体和c-Src磷酸化Y-46上的MUC1胞质结构域(MUC1-CD)，并由此提高MUC1和β-连环蛋白的结合(Li et al.，2001a；Li et al.，2001b)。MUC1和β-连环蛋白的结合还受糖原合酶激酶3β和蛋白激酶Cδ的调节(Li et al.，1998；Ren et al.，2002)。MUC1在细胞核中与β-连环蛋白共定位(Baldus et al.，2004；Li et al.，2003a；Li et al.，2003c；Wen et al.，2003)并共激活Wnt靶基因的转录(Huang et al.，2003)。其他研究已表明，MUC1还直接与p53结合并调节p53靶基因的转录(Wei et al.，2005)。值得注意的是，MUC1-C的过表达足以诱导锚定非依赖性生长和致瘤性(Huang et al.，2003；Li et al.，2003b；Ren et al.，2002；Schroeder et al.，2004)。
II.产生单克隆抗体
A.一般方法
针对MUC1-C/ECD的抗体可通过本领域公知的标准方法来产生(参见，例如，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；美国专利4,196,265)。用于产生单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的方法相同的路线开始。这两种方法的第一步均是对合适的宿主进行免疫接种或鉴定由于之前的自然感染而免疫接种的对象。如本领域中公知的，用于免疫接种的给定组合物的免疫原性可不同。因此，通常有必要加强宿主的免疫系统，如可通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。一些示例性且优选的载体是钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。其他白蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。用于使多肽与载体蛋白缀合的方式是本领域中公知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺(carbodiimyde)和双-重氮联苯胺(bis-biazotized benzidine)。同样如本领域中公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。示例性且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含经杀伤结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的非特异性免疫应答刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而不同。可使用多种途径来施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可通过在免疫接种之后的不同时间点对经免疫接种的动物采血来监测多克隆抗体的产生。还可给予第二、加强注射。重复加强免疫和滴定过程直至获得合适的效价。当获得期望的免疫原性水平时，可对经免疫接种的动物采血并分离和储存血清，和/或可将动物用于产生MAb。
在免疫接种之后，选择具有产生抗体之潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)用于MAb产生方案。这些细胞可从经活检脾或淋巴结或者从循环血液中获得。然后使来自经免疫接种动物之产生抗体的B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞(其通常为与经免疫接种动物相同物种的细胞，或者人或人/小鼠嵌合细胞)的细胞融合。适用于产生杂交瘤的融合操作的骨髓瘤细胞系优选地不产生抗体、具有高融合效率和酶缺陷，这然后使得其不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。
如本领域技术人员已知的，可使用多种骨髓瘤细胞中的任一种(Goding，第65至66页，1986；Campbell，第75至83页，1984)。例如，在经免疫接种的动物是小鼠的情况下，可使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO，NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，可使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；以及U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6全部均可用于与人细胞融合结合。一种特定的鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，其可容易地通过请求细胞系储库号GM3573从NIGMS人遗传突变细胞储库(Human Genetic Mutant Cell Repository)获得。另一种可使用的小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠鼠骨髓瘤SP2/0非产生细胞系。最近，已经描述了用于人B细胞的其他融合配偶体系，包括KR12(ATCC CRL-8658；K6H6/B5(ATCC CRL-1823SHM-D33(ATCC CRL-1668)和HMMA2.5(Posner et al.，1987)。本公开内容中的抗体使用SP2/0/mIL-6细胞系(SP2/0系的分泌IL-6的衍生物)产生。
用于产生抗体产生脾细胞或抗体产生淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括：在存在促进细胞膜融合的一种或更多种试剂(化学的或电学的)的情况下使体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例混合，但是该比例可分别为约20∶1至约1∶1而不等。Kohler和Milstein(1975；1976)已描述了使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，并且Gefter etal.，(1977)已描述了使用聚乙二醇(PEG)例如37％(v/v)PEG的融合方法。使用电诱导融合方法也是合适的(Goding，第71至74页，1986)。
融合操作通常以约1×10-6至1×10-8的较低频率产生活的杂交体。然而，这并不造成问题，因为通过在选择培养基中培养，活的融合杂合体与亲本未融合细胞(特别是在正常情况下将持续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区分开来。选择培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，向培养基中补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，向培养基中补充次黄嘌呤。如果B细胞来源是EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)转化的人B细胞系，则添加哇巴因(ouabain)以清除未与骨髓瘤融合的EBV转化系。
优选的选择培养基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能够进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT))中有缺陷，因此其不能存活。B细胞可进行该途径，但是其在培养中具有有限的寿命并且通常在约两周内死亡。因此，只有可在选择培养基中存活的细胞才是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。当用于融合的B细胞的来源是EBV转化B细胞系时，此时还将哇巴因用于杂合体的药物选择，因为EBV转化B细胞对药物杀伤易感，而选择所使用的骨髓瘤配偶体对哇巴因具有抗性。
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常来说，杂交瘤的选择如下进行：通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，随后测试单独的克隆上清液(在约两至三周之后)的期望反应性。测定应灵敏、简单并且迅速，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、斑点免疫结合测定等。
然后将选择的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆到单独抗体产生细胞系中，所述克隆然后可无限增殖以提供mAb。细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。可将杂交瘤样品注射(通常注射到腹膜腔中)到动物(例如，小鼠)中。任选地，在注射之前将动物用烃，特别是油(例如姥鲛烷(四甲基十五烷))致敏(prime)。当以这种方式使用人杂交瘤时，注射免疫妥协小鼠(例如SCID小鼠)是最佳的，以防止肿瘤排斥。经注射动物产生分泌由融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可取出动物的体液(例如血清或腹水)以提供高浓度的MAb。也可在体外培养单个细胞系，其中MAb自然地分泌到培养基中，从中可容易地获得高浓度的MAb。或者，可在体外使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。可将细胞系调整为在不含血清的培养基中生长，以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果期望的话，可使用过滤、离心和多种色谱方法(例如FPLC或亲和色谱)对通过任一种方式产生的MAb进行进一步纯化。本公开内容的单克隆抗体的片段可通过以下方法由经纯化的单克隆抗体获得：其包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化，和/或通过经化学还原切割二硫键。或者，本公开内容所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪合成。
还考虑了可使用分子克隆方法来产生单克隆。为此，可从杂交瘤系分离RNA，并通过RT-PCR获得抗体基因，并将其克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，由从细胞系分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并使用病毒抗原通过淘选选择表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点是可在单轮中产生并筛选多达约104倍的抗体，并且通过H链和L链组合产生新特异性，其进一步提高了发现合适抗体的机会。
教导产生可用于本公开内容的抗体的其他美国专利(其各自通过引用并入本文)包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；和美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。
B.本公开内容的抗体
根据本公开内容的抗体可以首先通过其结合特异性来限定，其在这种情况下是针对MUC1-C/ECD，并且特别是：
(SEQ ID NO：2)。通过使用本领域技术人员公知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，本领域技术人员可确定这样的抗体是否落入本发明权利要求书的范围内。
在一个实施方案中，抗体构建体保留了免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)抗体同种型序列。IgG占人中血清免疫球蛋白的约75％，是循环中存在最丰富的抗体同种型。IgG分子由血浆B细胞合成和分泌。在人中有四种IgG亚类(IgG1、2、3和4)，按照其在血清中的丰度顺序来命名(IgG1是最丰富的)。范围从对Fc受体具有高亲和力至没有亲和力。
IgG是存在于血液和胞外流体中的主要抗体同种型，使其能够控制身体组织的感染。通过结合多种病原体-代表病毒、细菌和真菌-IgG保护身体免受感染。IgG通过以下数种免疫机制做到这一点：IgG介导的病原体结合导致其固定并通过凝集结合在一起；病原体表面的IgG包衣(已知为调理作用)允许其通过吞噬免疫细胞的识别和摄取；IgG激活补体系统的经典途径，即免疫蛋白产生的级联反应，其导致病原体消除；IgG还结合并中和毒素。IgG还在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)和胞内抗体介导的蛋白水解中发挥重要作用，其中IgG与TRIM21(人中与IgG具有最大亲和力的受体)结合，以便将标记的病毒体导向胞质溶胶中的蛋白酶体。IgG还与II型和III型超敏反应有关。IgG抗体是在抗体应答的类别转换和成熟后产生的，并因此主要参与二次免疫应答。IgG作为单体分泌，其尺寸小使其易于灌注组织。IgG是唯一具有受体以促进穿过人胎盘的同种型。与母乳中分泌的IgA一起，通过胎盘吸收的残余IgG在新生儿自身的免疫系统发育之前为其提供了体液免疫。初乳含有高百分比的IgG，尤其是牛初乳。在先前对病原体有免疫力的个体中，IgG在抗原刺激之后约24至48小时出现。
另外，本发明要求保护的抗体将具有至少第二结合特异性，即与CD3、CD16、髓性特异性抗原、EGFR、ErbB2、TIL、CD3/PD1或CD16/PD1结合。在另一个方面中，抗体可以由决定其结合特异性的序列来限定。在下文的实施例中提供了序列。
本公开内容中使用的抗体的一些特定实例是命名为7B8-1和3D1的那些抗体，其CDR列于表1中。
表1-抗体构建体CDR序列
此外，抗体序列可以不同于以上提供的序列，任选使用以下更详细讨论的方法。例如，氨基酸序列可在以下方面与上面列出的那些不同：(a)可变区可与轻链的恒定结构域分开，(b)氨基酸可与列出的那些不同，同时因此不显著影响残基的化学性质(所谓的保守替换)，(c)氨基酸可与上面列出的那些以给定的百分比变化，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。或者，编码抗体的核酸可(a)与轻链的恒定结构域隔开，(b)在不改变由其编码的残基的同时与上面列出的那些不同，(c)可与上面列出的那些以给定的百分比变化，例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，或者(d)由于在高严格性条件下杂交的能力而与上面列出的那些不同，如通过低盐和/或高温条件所例示的，例如在约50℃至约70℃的温度下由约0.02M至约0.15M NaCl提供。
在进行保守改变氨基酸序列时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常理解的(Kyte andDoolittle，1982)。公认的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其继而限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
本领域中还应理解的是，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。通过引用并入本文的美国专利4,554,101声称：蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性控制)与该蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中所详述的，已向氨基酸残基分配了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性非芳族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应理解，氨基酸可被替换为具有类似亲水性的另一氨基酸，并且产生在生物学或免疫学上修饰的蛋白质。在这样的变化中，亲水性值在±2之内的氨基酸的替换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，并且在±0.5之内的那些是甚至更特别优选的。
如以上所概括的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。预期多个前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
C.抗体构建体的改造
在多个实施方案中，可出于多种原因，例如改善表达、改善交叉反应性、降低脱靶结合或消除一种或更多种天然效应子功能，例如补体的激活或免疫细胞(例如T细胞)的募集而选择对所鉴定抗体的序列进行改造。特别是，IgM抗体可以转化为IgG抗体。以下是用于抗体改造的相关技术的一般讨论。
可培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总RNA。可使用随机六聚体和RT一起来产生RNA的cDNA拷贝，并随后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。可将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，然后使用标准载体引物通过自动化DNA测序进行测序。可使用从杂交瘤上清液收集并使用G蛋白柱通过FPLC纯化的抗体进行结合和中和的测定。可通过以下产生重组全长IgG抗体：将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到Lonza pConIgG1或pConK2质粒载体中，将其转染到293Freestyle细胞或Lonza CHO细胞中，并从CHO细胞上清液中收集和纯化。
与最终cGMP制造过程在相同宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的迅速可用性有可能降低过程开发计划的持续时间。Lonza已经开发了使用在CDACF培养基中培养的合并转染子用于在CHO细胞中迅速产生少量(多至50g)抗体的一般方法。尽管比真正的瞬时系统稍慢，但是其优点包括更高的产物浓度和与产生细胞系使用相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体之GS-CHO库的生长和产生力的实例为：在以补料分批模式进行的一次性袋状生物反应器培养(5L工作体积)中，在转染后9周内达到了2g/L的收获抗体浓度。
pCon载体TM是重新表达完整抗体的简单方法。恒定区载体是提供了克隆到pEE载体中的一系列免疫球蛋白恒定区载体的一组载体。这些载体提供了具有人恒定区的全长抗体的简单构建和GS系统TM的便利性。
可期望将在非人宿主中产生的抗体“人源化”，以便在用于人治疗时减弱任何免疫应答。这样的人源化抗体可以在体外或体内环境中进行研究。可以产生人源化抗体，例如通过用相应的但非免疫原性部分替换抗体的免疫原性部分(即嵌合抗体)。PCT申请PCT/US86/02269；EP申请184,187；EP申请171,496；EP申请173,494；PCT申请WO 86/01533；EP申请125,023；Sun et al.(1987)；Wood et al.(1985)；以及Shaw et al.(1988)；所有这些参考文献通过引用并入本文。Morrison(1985)提供了“人源化”嵌合抗体的综述；也通过引用并入本文。“人源化”抗体或者可以通过CDR或CEA取代来产生。Jones et al.(1986)；Verhoeyen etal.(1988)；Beidler et al.(1988)；所有这些参考文献通过引用并入本文。
本公开内容还考虑了同种型修饰。通过修饰Fc区域以具有不同同种型，可实现不同功能。例如，改变为IgG4可以降低与其他同种型相关的免疫效应功能。
经修饰抗体可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，所述技术包括通过标准分子生物技术表达、或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件的其他地方提出。
D.表达
根据本公开内容的核酸将编码抗体，其任选地与其他蛋白质序列连接。如在本申请中所使用的，术语“编码MUC1-C抗体构建体的核酸”是指已经分离的不含总细胞核酸的核酸分子。在某些实施方案中，本公开内容涉及由本文所述的任何序列编码的抗体。
表2-密码子
本公开内容的DNA区段包括上述序列的编码生物功能上等同蛋白质和肽的那些。这样的序列可由于已知在核酸序列和由此编码的蛋白质中天然存在的密码子冗余和氨基酸功能等同而产生。或者，可以通过应用重组DNA技术来产生功能上等同的蛋白质或肽，其中可以基于对所交换氨基酸的特性的考虑来改造蛋白质结构的变化。如下文所述，可通过应用定点诱变技术引入人为设计的变化，或可随机引入并随后筛选期望的功能。
在某些实施方案内，使用表达载体来表达MUC1-C配体陷阱，以便产生和分离由其表达的多肽。在另一些实施方案中，表达载体用于基因治疗。表达需要在载体中提供适当的信号，并且其包括多种调节元件，例如驱动目的基因在宿主细胞中表达的来自病毒和哺乳动物来源二者的增强子/启动子。还定义了设计成优化信使RNA在宿主细胞中的稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用许多显性药物选择标志物来建立表达产物的永久的稳定细胞克隆的条件，以及将药物选择标志物的表达与多肽的表达联系起来的元件。
在本申请通篇，术语“表达构建体”意在包括包含编码基因产物的核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部的核酸编码序列能够被转录。转录物可以翻译成蛋白质，但不是必须的。在某些实施方案中，表达包括基因转录和mRNA翻译成基因产物二者。在另一些实施方案中，表达仅包括编码目的基因的核酸的转录。
术语“载体”用于指载体核酸分子，其中可插入核酸序列以引入到其可在那里进行复制的细胞中。核酸序列可以是“外源的”，这意味着其对引入载体的细胞是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源但处于宿主细胞核酸内该序列通常不存在的位置中。载体包括质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员通过标准重组技术将很熟练地构建载体，所述标准重组技术描述于Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al.(1994)中，二者均通过引用并入本文中。
术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的基因产物的至少一部分之核酸序列的载体。在一些情况下，随后将RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。在另一些情况下，这些序列不翻译，例如在反义分子或核酶的产生中。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指在特定宿主生物体中转录并可以翻译可操作地连接的编码序列所需的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可包含用于其他功能的核酸序列，并且在下文中进行描述。
1.调节元件
“启动子”是控制序列，其是控制转录的起始和速率的核酸序列的区域。启动子可包含调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合的基因元件。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子处于相对于核酸序列的正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可与或可不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
启动子可以是与基因或序列自然缔合的启动子，因为其可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。这样的启动子可被称为“内源性”的。类似地，增强子可以是与核酸序列自然缔合、位于该序列的上游或下游的增强子。或者，通过将编码核酸区段定位在重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述启动子指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。
重组或异源增强子也是指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。这样的启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子以及非“天然存在”的启动子或增强子(即包含不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变)。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，可结合本文中公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)产生序列(参见美国专利4,683,202、美国专利5,928,906，各自通过引用并入本文)。此外，考虑到也可以使用指导在非核细胞器(例如线粒体、叶绿体等)内的序列转录和/或表达的控制序列。
当然，利用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中进行表达的启动子和/或增强子将是非常重要的。分子生物学领域的技术人员通常已知使用启动子、增强子和细胞类型组合来进行蛋白质表达，例如，参见Sambrook et al.(1989)，通过引用并入本文。所使用的启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型和/或在合适的条件下有用的以指导引入的DNA区段的高水平表达，例如有利于大规模产生重组蛋白和/或肽。启动子可以是异源的或内源的。
表3列出了在本发明的上下文中可用于调节基因表达的数种元件/启动子。该列表并不旨在穷尽在促进表达中所涉及的所有可能的元件，而仅仅是示例性的元件。表4提供了诱导型元件的一些实例，该诱导型元件是可响应于特定刺激而被激活的核酸序列的区域。
/>
/>
/>
/>
组织特异性启动子或元件的特性以及表征其活性的测定是本领域技术人员公知的。这样的区域的一些实例包括人LIMK2基因(Nomoto et al.1999)、生长抑素受体2基因(Kraus et al.，1998)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre et al.，1999)、人CD4(Zhao-Emonet et al.，1998)、小鼠α2(XI)胶原蛋白(Tsumaki，et al.，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee，et al.，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu et al.，1997)、人血小板内皮细胞黏附分子-1(Almendro et al.，1996)。发现肿瘤特异性启动子也可用于本公开内容中。表5中列出了一些这样的启动子。
表5-用于癌症基因治疗的候选组织特异性启动子
/>
/>
编码序列的有效翻译也可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。本领域普通技术人员将能够容易地对此进行确定并提供所需信号。公知的是，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框“同框”以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可增强表达效率。
2.IRES
在本公开内容的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site，IRES)元件用来产生多基因或多顺反子信息(message)。IRES元件能够绕过5’甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框架可以一起转录，每个由IRES分隔开，从而产生多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框是核糖体可及的以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信息，多基因可以有效表达(参见美国专利5,925,565和5,935,819，其通过引用并入本文)。
3.多用途克隆位点
载体可包含多克隆位点(multiple cloning site，MCS)，其是包含多个限制酶位点的核酸区域，其中任一个可与标准重组技术结合使用来消化载体。参见Carbonelli etal.，1999；Levenson et al.，1998；和Cocea，1997，其通过引用并入本文。“限制酶消化”是指用仅在核酸分子中的特定位置发挥功能的酶对核酸分子进行催化切割。这些限制酶中的许多是可商购的。这样的酶的使用是本领域技术人员广泛理解的。通常，使用在MCS内切割的限制酶将载体线性化或片段化，以使外源序列能够连接至载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可彼此连续或可不连续。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员公知的。
4.剪接位点
大多数转录的真核生物RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物除去内含子。包含基因组真核序列的载体可需要供体和/或接受体剪接位点以确保转录物的正确加工用于蛋白质表达(参见Chandler et al.，1997，其通过引用并入本文)。
5.终止信号
本公开内容的载体或构建体将通常包含至少一种终止信号。“终止信号”或“终止子”由通过RNA聚合酶参与RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，考虑了结束RNA转录物产生的终止信号。终止子可以是在体内达到期望信使水平所必需的。
在真核生物系统中，终止子区域还可包含特异性DNA序列，该序列允许新转录物的位点特异性切割以暴露多腺苷酸化位点。其发出信号使特化的内源聚合酶将一段约200个A残基(polyA)添加至转录物的3’端。用这种polyA尾修饰的RNA分子显示出更稳定并且更有效地翻译。因此，在涉及真核生物的另一些实施方案中，优选地，终止子包含用于RNA切割的信号，并且更优选地，终止子信号促进信使的多腺苷酸化。终止子和/或多腺苷酸化位点元件可用来提高信使水平和/或使从该盒通读到其他序列中减至最小。
考虑用于本公开内容的终止子包括本文中所述或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于例如基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可缺少可转录或可翻译的序列，例如由于序列截短。
6.多腺苷酸化信号
在表达中，特别是在真核生物表达中，通常将包含多腺苷酸化信号以实现转录物合适的多腺苷酸化。不认为多腺苷酸化信号的性质是成功实践本公开内容的关键，和/或可采用任何这样的序列。一些优选实施方案包括SV40多腺苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸化信号，其在多种靶细胞中是方便的和/或已知能发挥良好的功能。多腺苷酸化可提高转录物的稳定性或可促进胞质运输。
7.复制的起始
为了在宿主细胞中增殖载体，其可包含一个或更多个复制起始位点(一般称为“ori”)，其是在此处起始复制的特异性核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)。
8.选择标志物和筛选标志物
在本公开内容的某些实施方案中，可通过在表达载体中包含标志物来体外或体内鉴定包含本公开内容的核酸构建体的细胞。这样的标志物将赋予细胞可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。一般来说，选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其中标志物的存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的一个实例是抗药性标志物。
通常包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇之抗性的基因是有用的选择标志物。除赋予允许基于条件实施来区分转化体之表型的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括筛选标志物，例如GFP，其基础是比色分析。或者，可利用筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)。本领域技术人员还知晓如何使用免疫标志物，可能与FACS分析结合。认为所使用的标志物不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择标志物和筛选标志物的另外的实例是本领域技术人员公知的。
9.病毒载体
某些病毒载体有效感染或进入细胞、整合到宿主细胞基因组中并稳定表达病毒基因的能力已导致许多不同病毒载体系统的开发和应用(Robbins et al.，1998)。目前正在开发的病毒系统用作离体和体内基因转移的载体。例如，目前正在评价腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体用于治疗疾病，例如癌症、囊性纤维化、戈谢病(Gaucherdisease)、肾病和关节炎(Robbins和Ghivizzani，1998；Imai et al.，1998；美国专利5,670,488)。根据具体的基因治疗应用，以下描述的多种病毒载体呈现特定的优点和缺点。
腺病毒载体。在一些具体实施方案中，腺病毒表达载体被考虑用于表达构建体的递送。“腺病毒表达载体”意指包括包含足以(a)支持构建体包装和(b)最终表达在其中克隆的组织特异性或细胞特异性构建体之腺病毒序列的那些构建体。
腺病毒包含线性双链DNA，其基因组大小为30至35kb(Reddy et al.，1998；Morrison et al.，1997；Chillon et al.，1999)。根据本公开内容的腺病毒表达载体包含腺病毒的基因工程化形式。腺病毒基因转移的优点包括感染广泛多种细胞类型(包括非分裂细胞)的能力、中等大小的基因组、易于操作、高感染性和生长至高滴度的能力(Wilson，1996)。此外，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以附加体的方式复制，而没有与其他病毒载体相关的潜在遗传毒性。腺病毒也是结构上稳定的(Marienfeld et al.，1999)并且在广泛扩增之后未检测到基因组重排(Parks et al.，1997；Bett et al.，1993)。
腺病毒基因组的突出特征是早期区域(E1、E2、E3和E4基因)、中间区域(pIX基因、Iva2基因)、晚期区域(L1、L2、L3、L4和L5基因)、主要晚期启动子(major late promoter，MLP)、末端反向重复(inverted-terminal-repeat，ITR)和ψ序列(Zheng，et al.，1999；Robbins et al.，1998；Graham and Prevec，1995)。早期基因E1、E2、E3和E4在感染之后由病毒表达，并且编码调节病毒基因表达、细胞基因表达、病毒复制和细胞凋亡抑制的多肽。此外，在病毒感染期间，MLP被激活，导致晚期(L)基因的表达，编码腺病毒衣壳化所需的多肽。中间区域编码腺病毒衣壳的组分。腺病毒的末端反向重复序列(ITR；长度为100至200bp)是顺式元件，起复制起点的作用并且是病毒DNA复制所必需的。腺病毒基因组的包装需要ψ序列。
产生用作基因转移载体的腺病毒的通用方法是缺失E1基因(E1-)，其参与E2、E3和E4启动子的诱导(Graham and Prevec，1995)。随后，可以重组插入治疗基因来代替E1基因，其中治疗基因的表达由E1启动子或异源启动子驱动。然后，复制缺陷型病毒E1-在以反式提供E1多肽的“辅助”细胞系(例如人胚肾细胞系293)中增殖。因此，在本公开内容中，可以方便地将转化构建体引入已经去除E1编码序列的位置。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置对于本公开内容并不重要。或者，可以缺失E3区域、E4区域的部分、或两者，其中将在真核细胞中可操作启动子的控制下的异源核酸序列插入腺病毒基因组中用于基因转移(美国专利5,670,488；美国专利5,932,210，其各自通过引用明确并入本文)。
尽管基于腺病毒的载体提供了相对于其他载体系统的数个独特优势，但它们通常受到载体免疫原性、重组基因插入的尺寸限制和低复制水平的限制。制备包含全长肌营养不良蛋白基因和复制所需末端重复的缺失了所有开放阅读框的重组腺病毒载体(Haeckeret al.，1996)为上述腺病毒缺点提供了一些潜在的有希望的优点。该载体在293细胞中与辅助病毒一起生长至高滴度，并且能够在mdx小鼠、在体外肌管和体内肌纤维中有效转导肌营养不良蛋白。以下讨论了辅助细胞依赖性病毒载体。
使用腺病毒载体的主要问题是在包装细胞系中的载体产生期间或在个体的基因治疗治疗期间产生具有复制能力的病毒。具有复制能力的病毒的产生可对患者造成非预期的病毒感染和病理后果的严重威胁。Armentano et al.(1990)描述了复制缺陷型腺病毒载体的制备，声称消除了无意中产生具有复制能力的病毒的可能性(美国专利5,824,544，其通过引用明确并入本文)。复制缺陷型腺病毒方法包含缺失的E1区和重新定位的蛋白IX基因，其中载体表达异源的哺乳动物基因。
除了要求腺病毒载体是复制缺陷型的或至少条件性缺陷的之外，不认为腺病毒载体的性质对成功实施本公开内容至关重要。腺病毒可以是42种不同的已知血清型和/或A-F亚群中的任何一种。为了获得用于本公开内容的条件复制缺陷型腺病毒载体，C亚群的5型腺病毒是优选的起始材料。这是因为5型腺病毒是关于其已知大量的生物化学和遗传信息的人腺病毒，并且其历史上已被用于采用腺病毒作为载体的大多数构建体。
如上所述，根据本公开内容的典型载体是复制缺陷型的，并且不具有腺病毒E1区。腺病毒的生长和操作是本领域技术人员已知的，并且在体外和体内表现出广泛的宿主范围(美国专利5,670,488；美国专利5,932,210；美国专利5,824,544)。这组病毒可以以高滴度获得，例如每ml 109至1011个噬斑形成单位，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外来基因是附加体，因此对宿主细胞的遗传毒性低。目前许多实验、创新、临床前研究和临床试验正在研究使用腺病毒作为基因递送载体。例如，基于腺病毒基因递送的基因治疗正被开发用于肝病(Han et al.，1999)、精神疾病(Lesch，1999)、神经疾病(Smith，1998；Hermens和Verhaagen，1998)、冠状动脉疾病(Feldman et al.，1996)、肌肉疾病(Petrof，1998)、胃肠疾病(Wu，1998)和多种癌症例如结直肠癌(Fujiwara and Tanaka，1998；Dorai et al.，1999)、胰腺癌、膀胱癌(Irieet al.，1999)、头颈癌(Blackwell et al.，1999)、乳腺癌(Stewart et al.，1999)、肺癌(Batra et al.，1999)和卵巢癌(Vanderkwaak et al.，1999)。
逆转录病毒载体。在本公开内容的某些实施方案中，考虑了使用逆转录病毒进行基因递送。逆转录病毒是包含RNA基因组的RNA病毒。当宿主细胞被逆转录病毒感染时，基因组RNA被逆转录成DNA中间体，其整合到感染细胞的染色体DNA中。这种整合的DNA中间体被称为原病毒。逆转录病毒的特别的优点是它们可以通过整合到宿主DNA中用目的基因(例如治疗基因)稳定地感染的分裂细胞，而不表达免疫原性病毒蛋白。理论上，整合的逆转录病毒载体将在感染的宿主细胞的生命内维持，表达目的基因。
逆转录病毒基因组和原病毒DNA具有三个基因：gag、pol和env，其以两个长末端重复(long terminal repeat，LTR)序列为侧翼。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)，并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和多腺苷酸化。LTR包含病毒复制所必需的所有其他顺式作用序列。
本公开内容的重组逆转录病毒可以以这样的方式进行遗传修饰：天然病毒的一些结构感染基因已经被去除并替换为待递送至靶细胞的核酸序列(美国专利5,858,744；美国专利5,739,018，其各自通过引用并入本文)。在用病毒感染细胞之后，病毒将其核酸注入细胞中，并且逆转录病毒遗传物质可整合到宿主细胞基因组中。然后转移的逆转录病毒遗传物质在宿主细胞内被转录并翻译成蛋白质。与其他病毒载体系统一样，在载体产生期间或在治疗期间具有复制能力的逆转录病毒的产生是主要问题。适用于本公开内容的逆转录病毒载体通常是有缺陷的逆转录病毒载体，所述有缺陷的逆转录病毒载体能够感染靶细胞、逆转录其RNA基因组、并将逆转录的DNA整合到靶细胞基因组中，但不能在靶细胞内复制以产生感染性的逆转录病毒颗粒(例如，转移到靶细胞中的逆转录病毒基因组的gag(编码病毒粒子结构蛋白的基因)和/或pol(编码逆转录酶的基因)是有缺陷的)。因此，原病毒和组装体转录成感染性病毒在合适的辅助病毒的存在下或在包含能够进行衣壳化而不会同时产生污染的辅助病毒的合适序列的细胞系中发生。
逆转录病毒的生长和维持是本领域已知的(美国专利5,955,331；美国专利5,888,502，其各自均通过引用明确并入本文)。Nolan et al.描述了包含异源基因的稳定的高滴度、无辅助病毒的逆转录病毒的产生(美国专利5,830,725，其通过引用明确并入本文)。在本公开内容(美国专利5,955,331)中考虑了用于构建包装细胞系(所述包装细胞系用于产生具有双嗜性(amphoteric)或单嗜性(ecotrophic)宿主范围的无辅助病毒的重组逆转录病毒)的方法，以及使用重组逆转录病毒在体内和体外将目的基因引入到真核细胞中的方法。
目前，大多数载体介导的基因递送的临床试验使用基于鼠白血病病毒(murineleukemia virus，MLV)的逆转录病毒载体基因递送(Robbins et al.，1998；Miller etal.，1993)。逆转录病毒基因递送的缺点包括稳定感染需要进行中的细胞分裂，以及阻止大基因递送的编码能力。然而，载体(例如慢病毒(例如HIV)、猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiency virus，SIV)和马传染性贫血病毒(equine infectious-anemia virus，EIAV))的最新进展可感染某些非分裂细胞，潜在地允许在体内使用逆转录病毒载体进行基因治疗应用(Amado and Chen，1999；Klimatcheva et al.，1999；White et al.，1999；Caseet al.，1999)。例如，基于HIV的载体已被用于感染非分裂细胞，例如神经元(Miyatake etal.，1999)、胰岛(Leibowitz et al.，1999)和肌肉细胞(Johnston et al.，1999)。目前正在评估通过逆转录病毒的基因的治疗性递送用于治疗多种病症，例如炎性疾病(Moldaweret al.，1999)、AIDS(Amado and Chen，1999；Engel and Kohn，1999)、癌症(Clay et al.，1999)、脑血管疾病(Weihl et al.，1999)和血友病(Kay，1998)。
疱疹病毒载体。I型和II型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)包含编码70至80个基因的约150kb的双链线性DNA基因组。野生型HSV能够溶解地感染细胞并在某些细胞类型(例如神经元)中建立潜伏期。与腺病毒类似，HSV也可以感染多种细胞类型，包括肌肉(Yeung et al.，1999)、耳(Derby et al.，1999)、眼(Kaufman et al.，1999)、肿瘤(Yoon et al.，1999；Howard et al.，1999)、肺(Kohut et al.，1998)、神经元(Garrido etal.，1999；Lachmann and Efstathiou，1999)、肝(Miytake etal.，1999；Kooby et al.，1999)和胰岛(Rabinovitch et al.，1999)。
HSV病毒基因由细胞RNA聚合酶II转录并暂时受到调节，导致大约三个可辨别的阶段或动力学类别的基因产物的转录和随后的合成。这些基因阶段被称为立即早期(Immediate Early，IE)或α基因，早期(Early，E)或β基因和晚期(Late，L)或γ基因。在病毒基因组到达新感染的细胞的核之后，立即转录IE基因。这些基因的有效表达不需要先前的病毒蛋白质合成。需要IE基因的产物来激活转录并调节病毒基因组的剩余部分。
为了用于递送治疗基因，必须使HSV复制缺陷。已经描述了用于产生复制缺陷型HSV无辅助病毒细胞系的方案(美国专利5,879,934；美国专利5,851,826，其各自通过引用整体明确并入本文)。一种也称为α4或Vmw175的IE蛋白ICP4对于病毒感染性和从IE转录到后期转录均是绝对需要的。因此，由于其复杂、多功能的性质以及在HSV基因表达调节中的核心作用，ICP4通常是HSV遗传研究的对象。
缺失ICP4的HSV病毒的表型研究表明这样的病毒可能对基因转移的目的有用(Krisky et al.，1998a)。缺失ICP4使其成为基因转移理想的病毒的一个特性是它们只表达五个其他IE基因：ICP0、ICP6、ICP27、ICP22和ICP47(DeLuca et al.，1985)，而不表达编码指导病毒DNA合成的蛋白质以及病毒的结构蛋白的病毒基因。这种特性对于使基因转移之后对宿主细胞代谢或免疫应答的可能有害影响最小化是理想的。除ICP4之外，IE基因ICP22和ICP27的进一步缺失显著改善了HSV细胞毒性的降低并且阻止了早期和晚期病毒基因表达(Krisky et al.，1998b)。
已经在多种体外模型系统和体内中证明了HSV在基因转移中对于例如以下的疾病的治疗潜力：帕金森病(Parkinson’s)(Yamada et al.，1999)、视网膜母细胞瘤(Hayashiet al.，1999)、脑内和皮内肿瘤(Moriuchi et al.，1998)、B细胞恶性肿瘤(Suzuki etal.，1998)、卵巢癌(Wang et al.，1998)和杜氏肌营养不良(Duchenne musculardystrophy)(Huard et al.，1997)。
腺相关病毒载体。腺病毒相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是细小病毒家族的成员，是越来越多地用于基因递送治疗的人病毒。AAV具有数个在其他病毒系统中未发现的有利特征。第一，AAV可以感染多种宿主细胞，包括非分裂细胞。第二，AAV可以感染来自不同物种的细胞。第三，AAV未与任何人或动物疾病相关，并且在整合时似乎不改变宿主细胞的生物学特性。例如，估计人群体的80％至85％暴露于AAV。最后，AAV在不同的物理和化学条件下都是稳定的，这适合于其自身生产、储存和运输要求。
AAV基因组是包含4681个核苷酸的线性单链DNA分子。AAV基因组通常包含内部非重复基因组，其在每个末端以长度为约145bp的末端反向重复序列(ITR)为侧翼。ITR具有多种功能，包括DNA复制的起源以及病毒基因组的包装信号。基因组的内部非重复部分包含两个大的开放阅读框，称为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。rep和cap基因编码病毒蛋白质，其允许病毒复制并将病毒基因组包装成病毒粒子。从AAV rep区域Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40(根据它们的表观分子量命名)表达家族的至少四种病毒蛋白质。AAV cap区域编码至少三种蛋白质：VP1、VP2和VP3。
AAV是辅助依赖性病毒，需要与辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共感染以形成AAV病毒粒子。在没有与辅助病毒共感染的情况下，AAV建立了潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体中，但不产生感染性病毒粒子。由辅助病毒进行的随后感染“拯救”整合的基因组，允许其复制并将其基因组包装成感染性AAV病毒粒子。尽管AAV可以感染来自不同物种的细胞，但是辅助病毒必须与宿主细胞是同一物种(例如，人AAV将在用犬腺病毒共感染的犬细胞中复制)。
已经通过删除AAV基因组的内部非重复部分并在ITR之间插入异源基因来工程化AAV以递送目的基因。异源基因可以与能够在靶细胞中驱动基因表达的异源启动子(组成型、细胞特异性或诱导型)功能性连接。为了产生包含异源基因的感染性重组AAV(rAAV)，用包含异源基因的rAAV载体转染合适的生产细胞系。生产细胞用具有AAV rep和cap基因的第二质粒在其各自的内源启动子或异源启动子的控制下同时转染。最后，用辅助病毒感染生产细胞。
一旦这些因素聚集在一起，异源基因如同其是野生型AAV基因组被复制和包装。当靶细胞感染了产生的rAAV病毒体时，异源基因进入并在靶细胞中表达。因为靶细胞缺乏rep和cap基因以及腺病毒辅助基因，所以rAAV不能进一步复制、包装或形成野生型AAV。
然而，辅助病毒的使用带来了许多问题。首先，在rAAV产生系统中使用腺病毒导致宿主细胞产生rAAV和感染性腺病毒二者。污染的感染性腺病毒可以通过热处理灭活(56℃，持续1小时)。然而，热处理导致功能性rAAV病毒体的滴度下降约50％。第二，在这些制剂中存在不同量的腺病毒蛋白。例如，在这样的rAAV病毒体制剂中获得的总蛋白的约50％或更多是游离腺病毒纤维蛋白。如果不完全清除，这些腺病毒蛋白具有引发患者的免疫应答的可能性。第三，使用辅助病毒的AAV载体产生方法需要使用和操作大量的高滴度感染性辅助病毒，这带来了许多健康和安全问题，特别是关于疱疹病毒的使用。第四，辅助病毒颗粒在rAAV病毒体产生细胞中的伴随产生转移大量宿主细胞资源远离rAAV病毒体产生，可能导致较低的rAAV病毒体产量。
慢病毒载体。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env以外，其还包含具有调节功能或结构功能的其他基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，就像在潜伏感染过程中一样。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过对HIV毒力基因进行多次减毒(例如，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef)产生慢病毒载体，使得载体在生物学上是安全的。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可以用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达二者。慢病毒基因组和原病毒DNA具有在逆转录病毒中存在的三种基因：gag、pol和env，其以两个长末端重复(LTR)序列为侧翼。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和多腺苷酸化。LTR包含病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。
与5’LTR相邻的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效衣壳化成颗粒(Psi位点)所需的序列。如果从病毒基因组中缺失衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒粒子)所需的序列，则顺式缺陷会阻止基因组RNA的衣壳化。然而，所得的突变体仍然能够指导所有病毒粒子蛋白质的合成。
慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini et al.，(1996)；Zufferey et al.，(1997)；美国专利6,013,516和5,994,136。通常，载体是基于质粒或基于病毒的，并且被配置为携带并入外来核酸所必需的序列，用于选择和将核酸转移到宿主细胞中。目的载体的gag、pol和env基因也是本领域中已知的。因此，将相关的基因克隆到所选择的载体中，然后用于转移目的靶细胞。
美国专利5,994,136(其通过引用并入本文)中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞用携带包装功能的两种或更多种载体转染，即gag、pol和env，以及rev和tat。这描述了可以提供编码病毒gag和pol基因的核酸的第一载体，以及可以提供编码病毒env的核酸以产生包装细胞的另一载体。将提供异源基因(例如本公开内容中的STAT-1α基因)的载体引入到该包装细胞，产生释放携带目的外源基因的感染性病毒颗粒的生产细胞。env优选是允许转导人和其他物种的细胞的兼向性包膜蛋白。
提供病毒env核酸序列的载体与调节序列，例如启动子或增强子可操作地相关联。调节序列可以是任何真核启动子或增强子，包括例如莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件、人巨细胞病毒增强子或牛痘P7.5启动子。在一些情况下，例如莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件，启动子-增强子元件位于LTR序列内或与LTR序列相邻。
异源或外源核酸序列，例如本文中编码STAT-1α的多核苷酸序列与调节性核酸序列可操作地连接。优选地，异源序列与启动子连接，产生嵌合基因。异源核酸序列还可处于病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的控制之下，并且逆转录病毒LTR内保留的信号仍然可以导致转基因的有效表达。标记基因可用于检测载体的存在，从而以确认感染和整合。标记基因的存在确保了仅那些表达插入物的宿主细胞被选择和生长。典型的选择基因编码赋予抗生素和其他毒性物质抗性的蛋白质，例如，组氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、氨甲喋呤等和细胞表面标志物。
通过转染或感染将载体引入到包装细胞系中。包装细胞系产生包含载体基因组的病毒颗粒。转染或感染的方法是本领域技术人员公知的。将包装载体和转移载体共转染至包装细胞系之后，从培养基中回收重组病毒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。因此，包装构建体通常与显性选择标志物例如neo、DHFR、Gln合成酶或ADA一起可通过磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔引入到人细胞系中，随后在合适药物的存在下进行选择并分离克隆。可选择标记基因可以与构建体中的包装基因物理连接。
慢病毒转移载体Naldini et al.(1996)已用于体外感染生长停滞的人细胞，并在直接注射到成年大鼠的脑中之后来转导神经元。该载体在体内将标记基因转移到神经元中是有效的，并且在不存在可检测的病理状况的情况下实现了长期表达。在单次注射载体之后10个月分析的动物显示转基因表达的平均水平没有降低，并且没有组织病理学或免疫应答的迹象(Blomer et al.，1997)。因此，在本公开内容中，可以离体移植或植入感染了重组慢病毒的细胞，或体内感染细胞。
其他病毒载体。用于基因递送的病毒载体的开发和功用正在不断改进和发展。其他病毒载体，例如痘病毒；例如痘苗病毒(Gnant et al.，1999；Gnant et al.，1999)，α病毒；例如辛德比斯病毒(sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(Lundstrom，1999)、呼肠孤病毒(Coffey et al.，1998)和甲型流感病毒(Neumann et al.，1999)预期用于本公开内容，并可根据靶标系统的必要特性进行选择。
在某些实施方案中，考虑将痘苗病毒载体用于本公开内容。痘苗病毒是用于表达异源基因的特别有用的真核病毒载体系统。例如，当重组痘苗病毒被适当地工程化时，蛋白质被合成、加工并运输至质膜。最近已证明痘苗病毒作为基因递送载体可将基因转移至人肿瘤细胞，例如EMAP-II(Gnant et al.，1999)、内耳(Derby et al.，1999)、神经胶质瘤细胞，例如p53(Timiryasova et al.，1999)和多种哺乳动物细胞，例如P450(美国专利5,506,138)。在美国专利5,849,304和美国专利5,506,138(其各自通过引用明确并入本文)中描述了痘苗病毒的制备、生长和操作。
在另一些实施方案中，辛德比斯病毒载体被考虑用于基因递送。辛德比斯病毒是甲病毒属的一种(Garoff和Li，1998)，其包括重要的病原体如委内瑞拉(Venezuelan)、西部和东部马脑炎病毒(equine encephalitis virus)(Sawai et al.，1999；Mastrangelo etal.，1999)。在体外，辛德比斯病毒感染多种鸟类、哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞。辛德比斯病毒的基因组由单链RNA的单分子组成，长度为11,703个核苷酸。基因组RNA是感染性的，在5’末端处加帽并在3’末端处多腺苷酸化，并用作mRNA。痘苗病毒26S mRNA的翻译产生多蛋白，该多蛋白被病毒和可能的宿主编码的蛋白酶的组合共翻译和翻译后切割，以得到三种病毒结构蛋白(衣壳蛋白(C)和两种包膜糖蛋白(E1和PE2，病毒体E2的前体)。
辛德比斯病毒的三个特征表明，其将是表达异源基因的有用载体。首先，辛德比斯病毒在自然界和在实验室二者中有广泛的宿主范围。第二，基因表达发生在宿主细胞的胞质中，并且快速且有效。第三，RNA合成中的温度敏感性突变是可用的，其可用于仅通过在感染后的不同时间将培养物转移至非许可温度来调节异源编码序列的表达。辛德比斯病毒的生长和维持是本领域已知的(美国专利5,217,879，其通过引用明确并入本文)。
嵌合病毒载体。正在开发嵌合或杂交病毒载体用于治疗基因递送，并且预期用于本公开内容。已经描述了嵌合痘病毒/逆转录病毒载体(Holzer et al.，1999)、腺病毒/逆转录病毒载体(Feng et al.，1997；Bilbao et al.，1997；Caplen et al.，1999)和腺病毒/腺相关病毒载体(Fisher et al.，1996；美国专利5,871,982)。
这些“嵌合”病毒基因转移系统可以利用两种或更多种亲本病毒物种的有利特征。例如，Wilson等人提供了嵌合载体构建体，其包含腺病毒的部分，AAV 5’和3’ITR序列和所选择的转基因，如下所述(美国专利5,871,983，通过引用明确并入本文)。
腺病毒/AAV嵌合病毒使用腺病毒核酸序列作为穿梭物(shuttle)来将重组AAV/转基因基因组递送至靶细胞。杂合载体中使用的腺病毒核酸序列的范围可以从需要使用辅助病毒来产生杂合病毒颗粒的最小序列量至仅腺病毒基因的选择性缺失，该缺失的基因产物可以由选择的包装细胞在杂合病毒产生过程中提供。至少，pAdA穿梭载体中使用的腺病毒核酸序列是其中删除了所有病毒基因并且只含有将腺病毒基因组DNA包装到预先形成的衣壳头中所需的那些腺病毒序列的腺病毒基因组序列。更特别地，所用的腺病毒序列是腺病毒的顺式作用5’和3’反向末端重复(ITR)序列(其用作复制起点)和含有包装线性Ad基因组和用于E1启动子的增强子元件所必需序列的天然5’包装/增强子结构域。腺病毒序列可以被修饰以包含所期望的缺失、替代或突变，前提是不消除所期望的功能。
在上述嵌合载体中有用的AAV序列是其中删除了rep和cap多肽编码序列的病毒序列。更特别地，所用的AAV序列是顺式作用5’和3’反向末端重复(ITR)序列。这些嵌合体的特征在于向宿主细胞的高滴度转基因递送以及将转基因稳定整合到宿主细胞染色体中的能力(美国专利5,871,983，其通过引用明确并入本文)。在杂交载体构建体中，AAV序列的侧翼是以上讨论的所选择的腺病毒序列。5’和3’AAV ITR序列本身位于选定的转基因序列和相关调节元件的侧翼，如下所述。因此，由转基因和侧翼的5’和3’AAV序列形成的序列可以插入载体腺病毒序列的任何缺失位点。例如，期望在腺病毒缺失的E1a/E1b基因的位点处插入AAV序列。或者，可以在E3缺失、E2a缺失等处插入AAV序列。如果在杂交病毒中仅使用腺病毒5’ITR/包装序列和3’ITR序列，则在它们之间插入AAV序列。
载体和重组病毒的转基因序列可以是与腺病毒序列异源的基因、核酸序列或其反向转录物，其编码目的蛋白质、多肽或肽片段。转基因以允许转基因转录的方式与调节组件有效连接。转基因序列的组成将取决于将导入的所得杂交载体的用途。例如，一种类型的转基因序列包括在宿主细胞中表达所期望基因产物的治疗性基因。这些治疗性基因或核酸序列通常编码用于体内或离体在患者中施用和表达的产物，以替代或纠正遗传或非遗传性遗传缺陷或治疗表观遗传病症或疾病。
10.非病毒转化
认为用于转化用于本公开内容的细胞器、细胞、组织或生物体的核酸递送的合适方法实际上包括可将核酸(例如DNA)引入到细胞器、细胞、组织或生物体中的任何方法，如本文中所述或本领域普通技术人员已知的。这样的方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，其各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利5,789,215，其通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利5,384,253，其通过引用并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe et al.，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，随后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声加载(Fechheimer et al.，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley et al.，1979；Nicolau et al.，1987；Wong et al.，1980；Kaneda etal.，1989；Kato et al.，1991)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且其各自通过引用并入本文)；通过与碳化硅纤维一起搅拌(Kaeppler et al.，1990；美国专利5,302,523和5,464,765，其各自通过引用并入本文)；或者通过PEG介导的原生质体的转化(Omirullehet al.，1993；美国专利4,684,611和4,952,500，其各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus et al.，1985)。通过应用技术例如这些，细胞器、细胞、组织或生物体可被稳定或瞬时转化。
注射。在某些实施方案中，可通过一次或更多次例如皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内注射(即针注射)将核酸递送至细胞器、细胞、组织或生物体。注射疫苗的方法是本领域普通技术人员公知的(例如，注射包含盐水溶液的组合物)。本公开内容的另一些实施方案包括通过直接显微注射引入核酸。已经使用直接显微注射将核酸构建体引入到非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)中(Harland和Weintraub，1985)。
电穿孔。在本公开内容的某些实施方案中，通过电穿孔将核酸引入到细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔涉及将细胞和DNA的混悬液暴露于高压放电。在该方法的一些变体中，使用某些细胞壁降解酶(例如果胶降解酶)使靶接受者细胞比未经处理的细胞更易于通过电穿孔转化(美国专利5,384,253，其通过引用并入本文)。或者，可以使接受者细胞更易受通过机械伤害的转化的影响。
使用电穿孔转染真核细胞已经相当成功。已经以这种方式用人κ免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter et al.，1984)，并且用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa et al.，1986)。
为了通过电穿孔在细胞(例如植物细胞)中进行转化，可以使用易碎组织，例如细胞混悬培养物或胚性愈伤组织，或者可以直接转化未成熟胚胎或其他有机组织。在该技术中，通过将所选细胞暴露于果胶降解酶(果胶酶)或以受控的方式进行机械伤害，可部分降解所选细胞的细胞壁。已通过对完整细胞的电穿孔进行转化的一些物种的一些实例包括玉米(美国专利5,384,253；Rhodes et al.，1995；D’Halluin et al.，1992)、小麦(Zhou etal.，1993)、番茄(Hou和Lin，1996)、大豆(Christou et al.，1987)和烟草(Lee et al.，1989)。
还可使用原生质体进行植物细胞的电穿孔转化(Braes，1994；Lazzeri，1995)。例如，Dhir和Widholm在国际专利申请号WO 92/17598(其通过引用并入本文)中描述了通过对子叶来源的原生质体进行电穿孔来产生转基因大豆植物。已经描述了原生质体转化的物种的另一些实例，包括大麦(Lazerri，1995)、高粱(Battraw et al.，1991)、玉米(Bhattacharjee et al.，1997)、小麦(He et al.，1994)和番茄(Tsukada，1989)。
磷酸钙。在本公开内容的另一些实施方案中，使用磷酸钙沉淀将核酸引入细胞。已经使用该技术用腺病毒5DNA转染了人KB细胞(Graham和Van Der Eb，1973)。同样以这种方式，用新霉素标志物基因转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞(Chen和Okayama，1987)，并用多种标志物基因转染了大鼠肝细胞(Rippe et al.，1990)。
DEAE-葡聚糖：在另一个实施方案中，使用DEAE-葡聚糖随后使用聚乙二醇将核酸递送至细胞中。以这种方式，将报道质粒引入到小鼠骨髓瘤和红白血病细胞中(Gopal，1985)。
超声加载。本公开内容的另外一些实施方案包括通过直接声波加载引入核酸。已经通过超声加载用胸苷激酶基因转染LTK-成纤维细胞(Fechheimer et al.，1987)。
脂质体介导的转染。在本公开内容的另一个实施方案中，核酸可包载在脂质复合物(例如脂质体)中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。其在磷脂悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排并包载脂双层之间的水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还考虑了与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)复合的核酸。
脂质体介导的核酸递送和外来DNA的体外表达是非常成功的(Nicolau和Sene，1982；Fraley et al.，1979；Nicolau et al.，1987)。还已经证明了培养的鸡胚胎、HeLa和肝癌细胞中外来DNA之脂质体介导的递送和表达的可行性(Wong et al.，1980)。
在本公开内容的某些实施方案中，脂质体可与血凝病毒(hemagglutinatingvirus，HVJ)复合。已显示这有助于与细胞膜融合并促进脂质体包封的DNA进入细胞(Kanedaet al.，1989)。在另一些实施方案中，脂质体可与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或结合使用(Kato et al.，1991)。在另一些的实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1两者复合或与其结合使用。在另一些实施方案中，递送载剂可包含配体和脂质体。
受体介导的转染。更进一步地，核酸可通过受体介导的递送载剂递送至靶细胞。这些利用大分子的选择摄取，其通过将在靶细胞中发生的受体介导的内吞作用进行。鉴于不同受体的细胞类型特异性分布，该递送方法为本公开内容补充了另一程度的特异性。
某些受体介导的基因靶向的载剂包含细胞受体特异性配体和核酸结合剂。另一些包含已与待递送的核酸有效地连接的细胞受体特异性配体。已经将数种配体用于受体介导的基因转移(Wu和Wu，1987；Wagner et al.，1990；Perales et al.，1994；Myers，EPO0273085)，其确立了该技术的可操作性。已经描述了在另一哺乳动物细胞类型的背景下的特异性递送(Wu和Wu，1993；其通过引用并入本文)。在本公开内容的某些方面中，将选择配体以对应于在靶细胞群上特异性表达的受体。
在另一些实施方案中，细胞特异性核酸靶向的载剂的核酸递送载剂组分可包含与脂质体组合的特异性结合配体。待递送的核酸容纳在脂质体内，并且特异性结合配体功能性地并入脂质体膜中。因此，脂质体将与靶细胞的受体特异性结合并将内容物递送至细胞。已经显示这样的系统是功能性使用的系统，其中例如表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)用于受体介导地将核酸递送至表现出EGF受体上调的细胞。
在另一些实施方案中，靶向递送载剂的核酸递送载剂组分可以是脂质体本身，其将优选地包含指导细胞特异性结合的一种或更多种脂质或糖蛋白。例如，乳糖基神经酰胺(半乳糖末端脱唾液酸神经节苷脂)，已并入到脂质体中，并观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取提高(Nicolau et al.，1987)。考虑到本公开内容的组织特异性转化构建体可以以相似的方式特异性地递送到靶细胞中。
11.表达系统
存在许多表达系统，其包含以上所讨论组合物的至少部分或全部。基于原核生物和/或真核生物的系统可用于与本公开内容一起使用以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统是可商购的并且可广泛获得的。
昆虫细胞/杆状病毒(baculovirus)系统可产生高水平的异源核酸区段的蛋白表达，例如在美国专利5,871,986和4,879,236中所述，二者均通过引用并入本文，并且其可例如从以名称/>2.0和从/>以BacPackTM BaculovirusExpression System购买。
表达系统的另一些实例包括的Complete ControlTM诱导型哺乳动物表达系统，其涉及合成的蜕皮激素诱导型受体，或其pET表达系统，该系统是大肠杆菌(E.coli)表达系统。诱导型表达系统的另一个实例可从/>获得，其携带T-RexTM(四环素调节的表达)系统，该系统是使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。还提供了称为甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)表达系统的酵母表达系统，其被设计用于在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平产生重组蛋白。本领域技术人员将知道如何表达载体，例如表达构建体，以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。
原代哺乳动物细胞培养物可以以多种方式制备。为了使细胞在体外并与表达构建体接触时保持活力，必需确保细胞维持与合适比例的氧气和二氧化碳和营养物接触，但要保护其免受微生物污染。细胞培养技术已有充分的文献记载。
前述的一个实施方案涉及使用基因转移使细胞永生化以用于产生蛋白质。可如上所述将目的蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中，随后在合适的条件下培养细胞。实际上，任何多肽的基因都可以以该方式使用。以上讨论了重组表达载体的产生以及其中包含的元件。或者，待产生的蛋白质可以是通常由所讨论细胞合成的内源性蛋白质。
可用的哺乳动物宿主细胞系的一些实例是Vero和HeLa细胞以及中国仓鼠卵巢细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN和MDCK细胞。另外，可选择调节插入序列的表达或以所期望方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以保证所表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。
可使用许多选择系统，包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。同样，抗代谢物抗性可用作选择以下的基础：dhfr，其赋予抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；neo，其赋予对氨基糖苷G418的抗性；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性。
E.纯化
在某些实施方案中，本公开内容的抗体可以是经纯化的。如本文中使用的术语“纯化的”旨在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质被纯化至相对于其可天然获得状态的任何程度。因此，经纯化的蛋白质也指这样的蛋白质，其脱离了其可天然存在的环境。当使用术语“基本上纯化的”时，该指定将指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成该组合物的主要组分，例如构成组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级至多肽级分和非多肽级分。在使多肽与其他蛋白质分离之后，可使用色谱和电泳技术进一步纯化目的多肽以实现部分纯化或完全纯化(或纯化至均质)。特备适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚集。其他用于蛋白质纯化的方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性进行沉淀，然后进行离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；以及这样的技术与其他技术的组合。
在纯化本公开内容的抗体构建体中，可期望在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可使用与多肽的标记部分结合的亲和柱使多肽从其他细胞组分纯化。如本领域中通常已知的，认为进行各纯化步骤的顺序可改变，或者可省略某些步骤，并且仍然获得适合制备基本上纯化的蛋白质或肽的方法。
通常，使用与抗体构建体的Fc部分结合的试剂(即，蛋白A)对完全抗体进行分级。或者，可使用抗原以同时纯化和选择合适的抗体。这样的方法通常使用结合在支持物(例如柱、过滤器或珠)上的选择剂。使抗体与支持物结合，除去(例如，冲洗掉)污染物，并通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
根据本公开内容，本领域技术人员将知道多种用于对蛋白质或肽之纯化程度进行定量的方法。这些包括例如确定活性级分的比活性(specific activity)，或者通过SDS/PAGE分析来评估级分中多肽的量。另一种用于评估级分纯度的方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，并因此计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于根据纯化而选择的特定测定技术，以及所表达蛋白质或肽是否表现出可检测活性。
已知多肽的迁移可随着不同的SDS/PAGE条件而改变，有时候显著地改变(Capaldiet al.，1977)。因此，应理解的是，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可改变。
F.多特异性抗体构建体形式
多特异性抗体是携带针对至少两种不同表位或抗原的结合特异性的那些抗体。该形式不同于显示出移植到重/轻链可变区臂上的具有不同结合特异性的传统二价抗体。其他形式使用双或三单链排列，一些使用Fc组件，而另一些不使用。多种形式在图1A至J中示出。
除了针对MUC1-C具有一种或两种不同的结合特异性之外，本申请的多特异性抗体还可以结合以下抗原中的一种或两种：
CD3。CD3(分化簇3)是参与活化细胞毒性T细胞(CD8+初始T细胞)和T辅助细胞(CD4+初始T细胞)二者的T细胞共受体和蛋白质复合物。其由四条不同的链构成。在哺乳动物中，该复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(T-cell receptor，TCR)和ζ链(zeta链)缔合以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、ζ链和CD3分子共同构成TCR复合物。
CD3γ、CD3δ和CD3ε链是包含单一胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族中高度相关的细胞表面蛋白。CD3γε/CD3δε/CD3ζζ/TCRαβ复合物的胞外区和跨膜区的结构用CryoEM解析，首次示出了CD3跨膜区如何以开口桶包围TCR跨膜区。含有天冬氨酸残基的CD3链跨膜区带负电荷，该特征允许这些链与带正电荷的TCR链缔合。CD3γ、CD3ε和CD3δ分子的胞内尾各自包含单一保守基序，其称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或简称ITAM，这对于TCR的信号传导能力是必不可少的。CD3ζ的胞内尾包含3个ITAM基序。
针对CD3的可商购抗体包括murmonab、oltelixizumab、替利组单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。
CD16。也称为FcγRIII的CD16是存在于自然杀伤细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的表面上的分化簇分子。CD16已被鉴定为Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)，其参与信号转导。最充分研究的涉及触发通过NK细胞的裂解的膜受体CD16是涉及抗体依赖性细胞细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)的免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IgSF)的分子。其可用于通过荧光激活细胞分选(fluorescent-activated cell sorting，FACS)或磁激活细胞分选，使用针对CD16的抗体来分离特定免疫细胞群。
CD16是III型Fcγ受体。在人中，其以两种不同的形式存在：FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)，其在胞外免疫球蛋白结合区具有96％序列相似性。虽然FcγRIIIa作为跨膜受体在肥大细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞上表达，但FcγRIIIb仅在中性粒细胞上表达。另外，FcγRIIIb是唯一通过糖基-磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)接头锚定至细胞膜的Fc受体，并且还在触发钙移动和中性粒细胞脱颗粒中发挥显著作用。FcγRIIIa和FcγRIIIb一起能够激活脱颗粒、吞噬作用和氧化爆发，从而允许中性粒细胞清除经调理的病原体。
针对CD28的可商购抗体获自Novus Biologicals、Invitrogen-Thermo FisherScientific、Bio-Rad、Miltenyi Biotec、BD Biosciences和Agilent。
CD28。CD28(分化簇28)是T细胞上表达的蛋白质之一，其提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。除了T细胞受体(TCR)之外，通过CD28的T细胞刺激可以提供用于多种白介素(特别是IL-6)产生的有效信号。
CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白质的受体。当被Toll样受体配体激活时，CD80表达在抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)中上调。抗原呈递细胞上的CD86表达是组成型的(表达独立于环境因素)。CD28是在初始T细胞上组成型地表达的唯一B7受体。在没有CD28：B7相互作用的情况下，初始T细胞的TCR与MHC：抗原复合物的缔合导致无反应性的T细胞。
CD28具有胞内结构域，所述胞内结构域具有数个对其有效信号传导至关重要的残基。以酪氨酸170开始的YMNM基序对于募集含SH2结构域的蛋白质，尤其是PI3K、Grb2和Gads特别重要。Y170残基对于通过mTOR诱导Bcl-xL和通过PKCθ增强IL-2转录是重要的，但对增殖没有影响，并导致IL-2产生的轻微减少。N172残基(作为YMNM的一部分)对Grb2和Gads的结合是重要的，并且似乎能够诱导IL-2mRNA的稳定性，但不能诱导NF-κB易位。NF-κB的诱导似乎多得多地依赖于Gads与YMNM和分子内两个富含脯氨酸的基序二者的结合。然而，该基序的最后氨基酸M173的突变产生很少的NF-κB或IL-2，所述突变不能结合PI3K但能结合Grb2和Gads，这表明这些Grb2和Gads不能补偿PI3K的损失。IL-2转录显示出具有两个阶段：允许转录的Y170依赖性、PI3K依赖性的初始阶段，和依赖于免疫突触的形成的PI3K非依赖性的第二阶段，这导致IL-2mRNA稳定性的增强。两者都对充分产生IL-2是必需的。
CD28还包含两个富含脯氨酸的基序，其能够结合含SH3的蛋白质。Itk和Tec能够与紧接在Y170YMNM之后的这两个基序的N端结合；Lck结合C端。Itk和Lck二者都能够使酪氨酸残基磷酸化，其然后允许含SH2的蛋白质与CD28的结合。Tec与CD28的结合增强了IL-2产生，这取决于其SH3和PH结构域分别与CD28和PIP3的结合。CD28中的C端富含脯氨酸基序对于通过细丝蛋白-A将Lck和脂筏带入到免疫突触中是非常重要的。C端基序内两个脯氨酸的突变导致增殖降低和IL-2产生降低，但Bcl-xL的诱导正常。PYAP基序内酪氨酸(成熟人CD28中的Y191)的磷酸化形成针对src激酶Lck的SH2结构域的高亲和力结合位点，其继而与丝氨酸激酶PKCθ结合。
针对CD28的可商购抗体获自Novus Biologicals、Invitrogen-Thermo FisherScientific、Bio-Rad、Miltenyi Biotec、BD Biosciences和Beckman Coulter。
髓性特异性抗原。髓性特异性抗原CD33或Siglec-3(唾液酸结合Ig样凝集素3，SIGLEC3，SIGLEC-3，gp67，p67)是在髓系细胞上表达的跨膜受体。其通常被认为是髓性特异性的，但其也可存在于一些淋巴细胞上。其结合唾液酸，因此是凝集素SIGLEC家族的成员。该受体的胞外部分包含两个免疫球蛋白结构域(一个IgV和一个IgC2结构域)，将CD33置于免疫球蛋白超家族中。CD33的胞内部分包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)，其涉及细胞活性的抑制。
CD33可以被任何具有唾液酸残基的分子，例如糖蛋白或糖脂刺激。在结合之后，CD33的存在于蛋白质的胞质部分的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)被磷酸化并充当含Src同源2(Src homology 2，SH2)结构域的蛋白质如SHP磷酸酶的对接位点。这导致抑制细胞中吞噬作用的级联。
CD33是用于治疗患有急性髓性白血病的患者的抗体-药物缀合物吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(商品名：Pfizer/Wyeth-AyerstLaboratories)的靶标。该药物是其通过双功能接头(4-(4-乙酰苯氧基)丁酸)与细胞毒性抗肿瘤抗生素加利车霉素(calicheamicin)(N-乙酰基-γ-加利车霉素)共价连接的重组、人源化抗CD33单克隆抗体(IgG4κ抗体hP67.6)。在2017年9月1日，FDA批准辉瑞(Pfizer)的Mylotarg。吉妥单抗奥佐米星最初于2000年由美国食品和药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration)批准。然而，在上市后临床试验期间，研究人员注意到与接受单独化学治疗的患者相比，接受吉妥单抗奥佐米星的患者的组中死亡数更大。基于这些结果，辉瑞于2010年年中自愿将吉妥单抗奥佐米星撤出市场，但于2017年重新引入至市场。CD33也是由Seattle Genetics利用该公司的ADC技术开发的新的抗体-药物缀合物vadastuximabtalirine(SGN-CD33A)的靶标。
巨噬细胞特异性抗原。CD47是普遍存在的50kDa五跨膜受体，其属于免疫球蛋白超家族。也称为整合素相关蛋白的该受体通过与跨膜信号调节蛋白SIRPα和SIRPγ连接来介导细胞与细胞通讯，并与整合素相互作用。CD47还通过与血小板应答蛋白的连接来参与细胞-胞外基质相互作用。此外，CD47涉及许多且不同的细胞过程，包括凋亡、增殖、黏附和迁移。其还在许多免疫和心血管响应中发挥关键作用。因此，这种多方面的受体在肿瘤微环境中可以是核心角色。实体瘤不仅由活跃增殖的癌细胞构成，还由构成肿瘤微环境的其他细胞类型，包括免疫细胞和成纤维细胞构成。肿瘤细胞增殖是通过连续萌发新的血管来强烈维持的，这也代表了转移的设门。此外，在大多数肿瘤中观察到炎性细胞的浸润。已累积了表明浸润的白细胞促进癌症进展的大量证据。鉴于CD47在构成肿瘤微环境的所有不同细胞类型上的普遍表达，靶向CD47可代表肿瘤学领域中的原始治疗策略。
关键的固有巨噬细胞检查点是可成药靶标CD47/信号调节蛋白α(Signal-regulatory protein alpha，SIRPα)途径，其向巨噬细胞递送抗吞噬信号，抑制过表达CD47(分化簇47)的癌细胞的破坏。过表达CD47的肿瘤包括急性髓性白血病(acute myeloidleukemia，AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-celllymphoma，DLBCL)、套细胞淋巴瘤和边缘细胞淋巴瘤，以及膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。除了促进经巨噬细胞介导的吞噬作用之外，CD47拮抗作用还与树突细胞和自然杀伤细胞细胞毒性的提高相关，这有助于增强产生CD47/SIRPα拮抗作用的目的。
莫洛利单抗(magrolimab)是针对CD47和巨噬细胞检查点抑制剂的单克隆抗体，其旨在干扰由巨噬细胞上SIRPα受体对CD47的识别，从而阻断由癌细胞使用的信号以避免被巨噬细胞摄入。针对CD47的其他抗体可商购自Abcam、Invitrogen-Thermo Fisher、R&DSystems、Bio-Rad和Biovision Inc。
SIRPα。信号调节蛋白α(SIRPα)是主要由髓性细胞表达并且也由干细胞或神经元表达的来自SIRP家族的调节性膜糖蛋白。SIRPα充当抑制性受体，并与广泛表达的跨膜蛋白CD47相互作用，也称为“别吃我(don’t eat me)”信号。这种相互作用负控制固有免疫细胞的效应功能，例如宿主细胞吞噬作用。SIRPα在巨噬细胞膜上横向扩散，并在吞噬突触处累积以结合CD47并发出信号“自身”，这抑制通过巨噬细胞的吞噬作用的细胞骨架密集过程。这与由MHC I类分子通过Ig样或Ly49受体向NK细胞提供的自身信号类似。右边示出的蛋白质是CD47，而不是SIRPα。
SIRPα的胞质区域在大鼠、小鼠和人之间高度保守。胞质区域包含大量酪氨酸残基，其可充当为ITIM。在CD47连接之后，SIRPα被磷酸化并募集磷酸酶如SHP1和SHP2。胞外区包含三个免疫球蛋白超家族结构域-单个V组和两个C1组IgSF结构域。SIRPβ和γ具有相似的胞外结构但不同的产生对比类型信号的胞质区域。SIRPα多态性存在于配体结合IgSF V组结构域中，但其不影响配体结合。一种观点为多态性对保护病原体结合的受体是重要的。SIRPα识别将活细胞与垂死细胞区分开来的抗吞噬信号CD47。CD47具有单个Ig样胞外结构域和五个跨膜区。SIRPα与CD47之间的相互作用可以通过受体的内吞或切割，或者与表面活性蛋白的相互作用来修饰。表面活性蛋白A和D是在肺中高度表达的可溶性配体，其像CD47一样与SIRPα的相同区域结合，并因此可以竞争性阻断结合。
SIRPα的胞外结构域与CD47结合，并通过其胞质结构域传递胞内信号。CD47结合是通过SIRPα的NH2端V样结构域介导的。胞质区域包含四个在配体的结合之后变得磷酸化的ITIM。磷酸化介导酪氨酸激酶SHP2的激活。已显示出SIRPα也结合磷酸酶SHP1、衔接蛋白SCAP2和FYN结合蛋白。将SHP磷酸酶募集至膜导致肌球蛋白在细胞表面处累积的抑制，并导致吞噬作用的抑制。
癌细胞高度表达CD47，其激活SIRPα并抑制巨噬细胞介导的破坏。在一项研究中，他们改造了SIRPα的高亲和力变体，其拮抗癌细胞上的CD47并导致癌细胞吞噬作用的提高。另一项研究(在小鼠中)发现，抗SIRPα抗体单独或与其他癌症治疗协同来帮助巨噬细胞以减少癌症生长和转移。
存在许多可从公司如Bio X Cell、Biolegend、Sino Biological、Thermo-Fisher、R&D Systems和Arigo Bio商购的抗SIRPα抗体。
erbB2。也称为CD340(分化簇340)、原癌基因Neu、Erbb2(啮齿动物)或ERBB2(人)的受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2是在人中由ERBB2基因编码的蛋白质。ERBB是由成红细胞癌基因B缩写的，所述成红细胞癌基因B是从禽基因组中分离的基因。其也经常被称为HER2(来自人表皮生长因子受体2)或HER2/neu。
HER2是人表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员。这种癌基因的扩增或过表达已显示出在某些侵袭型乳腺癌的发生和进展中发挥重要作用。近年来，该蛋白质已成为用于约30％乳腺癌患者的治疗的重要生物标志物和靶标。
HER2因为其与人表皮生长因子受体或HER1具有相似的结构而如此命名。Neu因为其来源于啮齿动物胶质母细胞瘤细胞系即一种类型的神经肿瘤而如此命名。ErbB-2因其与ErbB(禽成红细胞增多症癌基因B)相似而命名，该癌基因随后被发现编码EGFR。基因的分子克隆显示出HER2、Neu和ErbB-2都由相同的直系同源物编码。
erbB家族由四种质膜结合受体酪氨酸激酶组成。其中一种是erbB-2，并且其他成员是表皮生长因子受体、erbB-3(神经调节蛋白结合；缺乏激酶结构域)和erbB-4。所有四种都包含胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其可以与大量信号传导分子相互作用并表现出配体依赖性和配体非依赖性活性二者。值得注意的是，尚未鉴定出HER2的配体。HER2可以与其他三种受体中的任一种异二聚化，并且被认为是其他ErbB受体的优选二聚化配偶体。二聚化导致受体的胞质结构域内的酪氨酸残基的自磷酸化，并启动多种信号传导途径。
针对erbB2的可商购抗体包括曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)和马格妥昔单抗(margetuximab)。
EGFR。表皮生长因子受体(EGFR；ErbB-1；人中的HER1)是跨膜蛋白，其是胞外蛋白配体的表皮生长因子家族(EGF家族)成员的受体。表皮生长因子受体是ErbB受体家族的成员，ErbB受体家族是以下四种密切相关的受体酪氨酸激酶的亚家族：EGFR(ErbB-1)、HER2/neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。在许多癌症类型中，影响EGFR表达或活性的突变可导致癌症。人中EGFR和其他受体酪氨酸激酶的信号传导不足与疾病(例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s))相关，而过表达与广泛多种肿瘤的发生相关。通过阻断受体的胞外结构域上的EGFR结合位点或通过抑制胞内酪氨酸激酶活性来中断EGFR信号传导可以阻止表达EGFR的肿瘤的生长并改善患者的状况。
EGFR是通过结合其特异性配体包括表皮生长因子和转化生长因子α(TGFα)而被激活的跨膜蛋白。ErbB2没有已知的直接激活配体，并且可处于组成型激活状态或在与其他家族成员例如EGFR异二聚化之后变得有活性。在通过其生长因子配体激活之后，EGFR经受从无活性单体形式至有活性同二聚体的转变，但是有一些在配体结合之前也可存在预先形成的无活性二聚体的证据。除了在配体结合之后形成同二聚体之外，EGFR可以与ErbB受体家族的另一个成员例如ErbB2/Her2/neu配对，以产生活化的异二聚体。也有证据表明活化的EGFR簇形成，但是尚不清楚这种簇对于活化本身是重要的还是在单独二聚体活化之后发生的。
EGFR二聚化刺激其固有胞内蛋白酪氨酸激酶活性。因此，EGFR的C端结构域中的数个酪氨酸(Y)残基发生了自磷酸化。这些包括Y992、Y1045、Y1068、Y1148和Y1173，如相邻图中所示。这种自磷酸化引发下游激活并通过数种其他蛋白质发出信号，所述其他蛋白质通过其自身的结合磷酸酪氨酸的SH2结构域与磷酸化酪氨酸缔合。这些下游信号传导蛋白质启动数种信号转导级联，主要是MAPK、Akt和JNK途径，导致DNA合成和细胞增殖。这样的蛋白质调节表型例如细胞迁移、黏附和增殖。受体的激活对于人皮肤中的固有免疫应答是重要的。EGFR的激酶结构域也可以与其聚集的其他受体的酪氨酸残基交叉磷酸化，并且可以以该方式激活自身。
针对EGRF的可商购抗体包括西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)和耐昔妥珠单抗(necitumumab)。
PD1。也称为PD1和CD279(分化簇279)的程序性细胞死亡蛋白1是细胞表面上的蛋白质，其具有通过经由抑制T细胞炎性活性来下调免疫系统并促进自身耐受以调节免疫系统对人体细胞应答的作用。这阻止了自身免疫病，但其也可阻止免疫系统杀伤癌细胞。PD-1是免疫检查点，并通过两种机制针对自身免疫提供保护。第一，它促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。第二，它降低调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)的凋亡。PD-1抑制剂是阻断PD-1、激活免疫系统来攻击肿瘤并用于治疗某些类型的癌症的新型药物。
人中的PD-1蛋白由PDCD1基因编码。PD-1是细胞表面受体，其属于免疫球蛋白超家族并且在T细胞和祖B(pro-B)细胞上表达。PD-1结合两种配体，PD-L1和PD-L2。PD-1是288个氨基酸的I型膜蛋白。PD-1是扩展的CD28/CTLA-4家族T细胞调节剂的成员。该蛋白质的结构包含胞外IgV结构域，随后是跨膜区和胞内尾。胞内尾包含定位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的开关基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调节T细胞受体TCR信号。这与配体结合之后SHP-1和SHP-2磷酸酶与PD-1的胞质尾的结合相一致。另外，PD-1连接上调了E3-泛素连接酶CBL-b和c-CBL，这触发了T细胞受体下调。PD-1在活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞表面表达，表明与CTLA-4相比，PD-1更广泛地负调节免疫应答。
PD-1具有两种配体，PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员。PD-L1蛋白在响应LPS和GM-CSF处理时在巨噬细胞和树突细胞(DC)上上调，并且在TCR和B细胞受体信号传导之后，在T细胞和B细胞上上调，而在静息小鼠中，PD-L1 mRNA可在心、肺、胸腺、脾和肾中检测到。用IFN-γ处理之后，PD-L1在几乎所有鼠肿瘤细胞系中表达，包括PA1骨髓瘤、P815肥大细胞瘤和B16黑素瘤。PD-L2的表达受到更多限制，并且主要由DC和一些肿瘤系表达。
数条证据表明PD-1及其配体负调节免疫应答。已显示，PD-1敲除小鼠分别在C57BL/6和BALB/c背景下发生狼疮样肾小球肾炎和扩张型心肌病。在体外，用PD-L1-Ig处理抗CD3刺激的T细胞导致降低的T细胞增殖和IFN-γ分泌。IFN-γ是促进T细胞炎性活性的关键促炎细胞因子之一。T细胞增殖的降低也与IL-2分泌减弱相关，并且这些数据共同表明PD-1负调节T细胞应答。
使用PD-L1转染的DC和表达PD-1的转基因(transgenic，Tg)CD4+和CD8+T细胞进行的实验表明，CD8+T细胞更易受PD-L1的抑制，尽管这可取决于TCR信号传导的强度。与负调节CD8+T细胞应答的作用一致，Rafi Ahmed组使用慢性感染的LCMV病毒载体模型表明，PD-1-PD-L1相互作用抑制病毒特异性CD8+T细胞的活化、扩增和获得效应功能，这可以通过阻断PD-1-PD-L1相互作用来逆转。
PD-L1在肿瘤细胞上的表达通过PD-1在效应T细胞上的接合来抑制抗肿瘤活性。PD-L1在肿瘤上的表达与食管癌、胰腺癌和其他类型癌症的存活降低相关，这突出了该途径作为免疫治疗的靶标。通过PD-1的配体PD-L1触发在单核细胞上表达并在单核细胞活化之后上调的PD-1诱导了IL-10产生，这抑制了CD4T细胞功能。
在小鼠中，当注射抗CD3抗体时，在胸腺中诱导了该基因的表达，并且大量胸腺细胞经受凋亡。在BALB/c背景下繁殖的缺乏该基因的小鼠发生扩张型心肌病，并且死于充血性心力衰竭。这些研究表明该基因产物在T细胞功能中也可以是重要的，并有助于预防自身免疫病。
存在许多针对PD1的可商购的抗体，包括帕博利珠单抗(pemrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、度伐利尤单抗(duravalumab)和阿维单抗(avelumab)。
NKG2D。NKG2D是属于C型凝集素样受体的NKG2家族的跨膜蛋白。NKG2D由位于在小鼠6号染色体和人12号染色体上的NK基因复合物(NK-gene complex，NKC)中的KLRK1基因编码。在小鼠中，其由NK细胞、NK1.1+T细胞、γδT细胞、活化的CD8+αβT细胞和活化的巨噬细胞表达。在人中，其由NK细胞、γδT细胞和CD8+αβT细胞表达。NKG2D识别来自MIC和RAET1/ULBP家族的自身诱导蛋白，这些蛋白出现在应激、恶性转化和受感染细胞的表面。
人NKG2D受体复合物组装成六聚体结构。NKG2D自身形成同二聚体，其胞外域用于配体结合。每个NKG2D单体与DAP10二聚体缔合。这种缔合是通过NKG2D跨膜区段中存在的带正电荷的精氨酸和DAP10二聚体的两个跨膜区内的带负电荷的天冬氨酸的离子相互作用来维持的。DAP10作为衔接蛋白发挥功能，并在配体结合之后通过募集PI3K的p85亚基和负责随后的下游事件的Grb2-Vav1复合物来转导信号。
在小鼠中，选择性剪接产生两种不同的NKG2D同种型：长NKG2D(NKG2D-L)和短NKG2D(NKG2D-S)。NKG2D-L结合DAP10，类似于人NKG2D。相比之下，NKG2D-S与两种衔接蛋白缔合：DAP10和DAP12。DAP10招募了PI3K的p85亚基以及Grb2和Vav1的复合物。DAP12携带ITAM基序并激活蛋白酪氨酸激酶Syk和Zap70信号传导。
NKG2D是用于检测和消除经转化和受感染细胞的主要识别受体，因为其配体在细胞应激期间被诱导，或者作为感染或基因组应激(例如在癌症中)的结果。在NK细胞中，NKG2D用作激活受体，其本身能够触发细胞毒性。NKG2D在CD8+T细胞上的功能是发送共刺激信号以激活它们。
NKG2D配体是自身诱导蛋白，其在正常细胞表面上完全不存在或仅以低水平存在，但它们在受感染、经转化、衰老和应激细胞中过表达。它们的表达在不同阶段(转录、mRNA和蛋白质稳定、从细胞表面切割)通过多种应激途径进行调节。其中，最突出的应激途径之一是DNA损伤响应。遗传毒性应激、停滞的DNA复制、肿瘤发生中不良调节的细胞增殖、病毒复制或一些病毒产物激活ATM和ATR激酶。这些激酶启动参与NKG2D配体上调的DNA损伤响应途径。因此，DNA损伤响应参与警示免疫系统存在潜在的危险细胞。
所有NKG2D配体都与MHC I类分子同源，并且被分成两个家族：MIC和RAET1/ULBP。针对NKG2D的可商购的抗体获自Invitrogen、Abcam、BioLegend、Bio X Cell、R&D Systems、EMD Millipore和Milteny Biotec。
Siglec-9。与在由正常上皮细胞表达的MUC1上看到的长的支链相比，由于癌症中存在异常糖基化，由MUC1携带的多个O-连接的聚糖主要是短的和唾液酸化的。在癌中，MUC1的异常O-连接糖基化可以改变MUC1与免疫系统的凝集素的相互作用，并从而可以影响肿瘤-免疫系统相互作用。Siglec-9主要在髓性细胞上表达。Siglec(“唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素”)是唾液酸结合凝集素的家族，其在免疫系统的多种细胞上表达。大多数Siglec的胞质结构域包含募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，并因此调节固有和适应性免疫应答的细胞。已经清楚的是，Siglec在癌症免疫抑制中具有作用，因为在癌症中观察到的高唾液酸化诱导与这些凝集素的结合。
III.药物制剂和癌症的治疗
A.癌症
癌症由来自组织的细胞的克隆群的外生长所致。癌症的发生(称为致癌作用)可以以多种方式进行建模和表征。早已认识到癌症的发生与炎症之间的关联。炎性应答涉及宿主针对微生物感染的防御，并且还驱动组织修复和再生。相当多的证据表明炎症与癌症发生风险之间存在联系，即，慢性炎症可导致发育异常。
可应用本公开内容的方法的癌细胞一般地包括表达MUC1并且更特别地过表达MUC1的任何细胞。合适的癌细胞可以是乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液学癌症(例如，白血病或淋巴瘤)、神经组织癌症、黑素瘤、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌或膀胱癌的细胞。另外，本公开内容的方法可应用于多种物种，例如人、非人灵长类(例如猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。癌症还可以是复发性的、转移性的和/或多重抗药性的，并且本公开内容的方法可特别地应用于这样的癌症以使其可切除、延长或重新诱导缓解、抑制血管生成、预防或限制转移，和/或治疗多重抗药性癌症。在细胞水平上，这可转化为杀伤癌细胞、抑制癌细胞生长或以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型。
B.制剂和施用
本公开内容提供了包含抗MUC1-C抗体构建体的药物组合物。在一个具体实施方案中，术语“可药用”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物并且更特别地用于人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。另一些合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、盐水、右旋糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
所述组合物可以配制为中性或盐形式。可药用盐包括与阴离子形成的那些，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些；以及与阳离子形成的那些，所述阳离子例如来源于钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
本公开内容的抗体可包括经典药物制剂。根据本公开内容的这些组合物的施用将通过任何常见途径进行，只要靶组织通过该途径可及即可。这包括经口、经鼻、含服、经直肠、经阴道或表面。或者，施用可通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射来进行。这样的组合物通常作为上述的可药用组合物施用。特别感兴趣的是直接瘤内施用、肿瘤输注或者局部或区域性施用到肿瘤，例如在局部或区域性脉管系统或淋巴系统中，或者在切除的肿瘤床中。
活性化合物还可经肠胃外或腹膜内施用。作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
C.组合治疗
在本公开内容的上下文中，还考虑本文中所述的抗MUC1-C抗体构建体可类似地与化学或放射治疗干预或其他治疗联合使用。特别地，将抗MUC1-C/ECD抗体与靶向MUC1功能不同方面的其他治疗(例如靶向MUC1胞质结构域的肽和小分子)进行组合也可证明是有效的。
为了使用本公开内容的方法和组合物来杀伤细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管生成或以其他方式逆转或降低肿瘤细胞的恶性表型，通常将使“靶”细胞与根据本公开内容的抗MUC1-C抗体构建体和至少一种其他药剂接触。这些组合物将以有效杀伤或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可包括使细胞与根据本公开内容的抗MUC1-C抗体构建体和另外药剂或因子同时接触。这可通过使细胞与包含这两种药剂的单一组合物或药理制剂接触来实现，或者通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包含根据本公开内容的抗MUC1-C抗体构建体并且另一种包含其他药剂。
或者，抗MUC1-C抗体构建体治疗可在另外药剂治疗之前或之后，间隔数分钟至数周进行。在另外药剂和抗MUC1抗体构建体单独施加于细胞的一些实施方案中，通常应确保每次递送的时间之间不超过很长时间，使得药剂和表达构建体仍能够对细胞发挥有利组合作用。在这种情况下，考虑在彼此约12至24小时内使细胞与这两种形式接触，并且更优选地在彼此约6至12小时内，并且延迟时间为仅约12小时是最优选的。在一些情况下，可期望显著延长治疗时间段，然而，在各施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
还可考虑期望将抗MUC1抗体构建体或另外药剂施用多于一次。如下所示，可使用多种组合，其中根据本公开内容的抗MUC1-C抗体构建体的治疗是“A”，另外治疗是“B”：
考虑其他组合。再次，为了实现细胞杀伤，将这两种药剂以有效杀伤细胞的组合量递送至细胞。
适合于癌症治疗的药剂或因素包括在向细胞施加时诱导DNA损伤的任何化学化合物或治疗方法。这样的药剂和因素包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如辐照、微波、电子发射等。可使用多种化学化合物，其也描述为“化学治疗剂”或“遗传毒性剂”。这可通过对局部肿瘤部位进行辐照来实现；或者，可通过向对象施用治疗有效量的药物组合物来使肿瘤细胞与药剂接触。
考虑将多个种类的化学治疗剂与本公开内容一起使用。例如，选择性雌激素受体拮抗剂(selective estrogen receptor antagonist，“SERM”)，例如他莫昔芬(Tamoxifen)、4-羟基他莫昔芬(Afimoxfene)、氟维司群(Falsodex)、雷洛昔芬(Raloxifene)、巴多昔芬(Bazedoxifene)、氯米芬(Clomifene)、Femarelle、拉索昔芬(Lasofoxifene)、奥美昔芬(Ormeloxifene)和托瑞米芬(Toremifene)。
考虑将使用的化学治疗剂包括例如喜树碱(camptothecin)、放线菌素D(actinomycin D)、丝裂霉素C(mitomycin C)。本公开内容还涵盖使用一种或更多种DNA损伤剂(无论是基于辐射还是真实的化合物)的组合，例如使用X射线与顺铂或使用顺铂与依托泊苷(etoposide)。如上所述，所述药剂可通过将其与MUC1肽组合来制备并用作组合的治疗性组合物或药盒。
热休克蛋白90是发现于许多真核细胞中的调节蛋白。已经表明HSP90抑制剂可用于治疗癌症。这样的抑制剂包括格尔德霉素(Geldanamycin)、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、PU-H71和利福布汀(Rifabutin)。
还设想了直接交联DNA或形成加合物的药剂。可使用药剂(例如顺铂)和其他DNA烷化剂。顺铂已被广泛用于治疗癌症，临床应用中使用的有效剂量为每三周20mg/m25天，总共三个疗程。顺铂经口不吸收，并去因此必须通过静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射来递送。
损伤DNA的药剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这样的化学治疗化合物包括阿霉素(adriamycin)(也称为多柔比星(doxorubicin))、依托泊苷、维拉帕米(verapamil)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)等。在用于治疗赘生物的临床环境中广泛使用时，这些化合物通过静脉内推注注射(bolus injection)施用，剂量对于多柔比星为每隔21天25至75mg/m2，对于依托泊苷为静脉内35至50mg/m2或者经口给药为静脉内的2倍。还预期了微管抑制剂，例如紫杉烷。这些分子是由红豆杉(Taxus)属植物产生的二萜，并且包含紫杉醇和多西他赛。
表皮生长因子受体抑制剂，例如易瑞沙(Iressa)，哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶蛋白mTOR，也称为FK506结合蛋白12-雷帕霉素相关蛋白1(FK506-binding protein 12-rapamycin associated protein 1，FRAP1)，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动性、细胞存活、蛋白质合成和转录。因此，根据本公开内容，考虑将雷帕霉素及其类似物(rapalogs)用于癌症治疗。
另一种可能的治疗是TNF-α(肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha))，其是参与全身炎症的细胞因子并且是刺激急性期反应的一组细胞因子的成员。TNF的主要作用是调节免疫细胞。TNF还能够诱导凋亡细胞死亡，诱导炎症以及抑制肿瘤发生和病毒复制。
破坏核酸前体和亚单位的合成和保真度的药剂也导致DNA损伤。因此，已经开发了许多核酸前体。特别有用的是经历广泛测试并且容易获得的药剂。因此，药剂(如5-氟尿嘧啶(5-FU))优先被赘生性组织所使用，使得这种药剂特别可用于靶向赘生性细胞。尽管具有非常大的毒性，5-FU可适用于多种载体中(包括表面)，但是常用的是以3至15mg/kg/天的剂量静脉内施用。
造成DNA损伤并且已经广泛使用的其他因素包括通常已知的γ-射线、x-射线和/或直接向肿瘤细胞递送放射性同位素。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波和UV辐照。最可能的是所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成广泛的损伤。x射线的剂量范围为从50至200伦琴的每日剂量持续延长的一段时间(3至4周)到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射的放射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
用于递送放射治疗剂的特定方式是纳米粒。例如，金纳米粒(nanoparticle，NP)是第一种在小动物中测试用于肿瘤治疗的基于NP的放射增强剂。发现它们增强外部束放射的效力的能力是通过光电效应和通过俄歇电子(Auger electron)簇射介导的，所述俄歇电子簇射是由于金原子与由外部束产生的低能光子之间的相互作用而产生的。基于这些早期发现，已经开发了多种无机NP来类似地加强放射治疗的效力，包括由铋、铪和钆等构成的无机NP。已经采用了多种方法来在临床前肿瘤模型中改善放射增强剂的内化，包括通过用抗体使NP功能化，以帮助肿瘤靶向。努力还集中在经由通过计算机断层扫描(computedtomography，CT)或通过磁共振成像对同一NP构建体成像来优化放射时间。
在水凝胶中的瘤内注射的基于氧化铪的NP(NBTXR3)已经通过CT有效成像，表明了植入之后在肿瘤床内的持久性以及在注射部位外的有限扩散。并行地，通过磁共振成像成功追踪了静脉内(IV)施用的含钆NP(AGuIX)，使得放射治疗仅能够在肿瘤定位之后进行。这两种方法均是有前景的，并且支持无机NP在临床应用中用作放射增强剂的普遍能力。尽管成像剂的IV注射能够实现对多种癌症的可及性，但是如在NANO-RAD试验(NCT02820454)中观察到的，经由IV途径施用的NP已经显示出如果不被肿瘤细胞内化，则可以快速从肿瘤中洗出。
在最近的研究中，Detappe et al.(2020)假设，改造成在肿瘤环境中持续的NP可以更有效地增强分次放射处理的剂量，并可以避免重复放射增强剂施用的需要，这可降低潜在发病率和/或治疗相关成本。作者将多个NP与单个肿瘤特异性单克隆抗体(mAb)缀合以提高递送至肿瘤细胞的放射增强剂的剂量。作为这些经抗体缀合的NP的靶标，他们基于其在多种实体和血液恶性病中的高表达水平而选择黏蛋白1(mucin 1，MUC1)。为了比较MUC1-C抗体缀合的NP与其未缀合对应物的放射增强特性，作者使用了与NANO-RAD试验中使用的相同类型的纳米粒，并且两种组合物都与单次高剂量的外部束或与分次放射治疗组合施用，并且在肺癌和三阴性乳腺癌的多种模型中比较了处理效果。发现在肿瘤内累积的抗MUC1-C/NP的％ID/g与其未缀合对应物的那些相似。重要的是，抗MUC1-C/NP表明了在体内肿瘤微环境中延长的保留；因此，在分次治疗(3×5.2Gy)过程期间维持了放射加强。作者发现，与施用在XRT下的对照NP(31.1±2.4天)或单独XRT(27.3±1.6天；P＜.01，对数秩)相比，通过施用在XRT下的抗MUC1-C/NP，可以显著增强肿瘤生长抑制并延长动物的总存活(46.2±3.1天)。
另外，还考虑可使用免疫治疗、激素治疗、毒素治疗和手术。特别地，可使用靶向治疗，例如阿瓦斯汀(Avastin)、爱必妥(Erbitux)、格列卫(Gleevec)、赫赛汀(Herceptin)和利妥昔单抗(Rituxan)。
组合治疗的一个特别有利的方法是选择靶向MUC1的第二药剂。在本发明人提交的共同待审的申请中，公开了在对象中抑制MUC1阳性肿瘤细胞的方法，该方法包括向所述对象施用至少4个连续MUC1残基且不超过20个连续MUC1残基并且包含序列CQC的MUC1肽，其中CQC的氨基末端半胱氨酸在其NH2端被不需要对应于天然MUC-1跨膜序列的至少一个氨基酸残基覆盖。该肽可包含至少5个连续的MUC1残基、至少6个连续的MUC1残基、至少7个连续的MUC1残基、至少8个连续的MUC1残基，并且所述序列可更特别地包含
CQCR(SEQ ID NO：15)，CQCRR(SEQ ID NO：16)，CQCRRR(SEQ ID NO：17)，CQCRRRR(SEQ ID NO：18)，CQCRRK(SEQ ID NO：19)，CQCRRKN(SEQ ID NO：20)，或RRRRRRRRRCQCRRKN(SEQ ID NO：21)。
该肽可包含MUC1的不超过10个连续残基、11个连续残基、12个连续残基、13个连续残基、14个连续残基、15个连续残基、16个连续残基、17个连续残基、18个连续残基或19个连续残基。该肽可以与细胞递送结构域融合，例如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K。该肽可以包含所有L氨基酸、所有D氨基酸或L和D氨基酸的混合物。参见美国专利No.8,524,669。
在美国专利申请序列No.13/026,858中描述了该技术的变体。在该申请中，公开了抑制MUC1阳性癌细胞的方法，其包括使细胞与至少4个连续MUC1残基且不超过20个连续MUC1残基并且包含序列CQC的MUC1肽接触，其中(i)CQC的氨基末端半胱氨酸在其NH2末端被不需要对应于天然MUC1跨膜序列的至少一个氨基酸残基覆盖；以及(ii)除了对应于天然MUC1残基的那些带正电荷的氨基酸残基之外，该肽还包含3至5个连续的带正电荷的氨基酸残基。MUC1阳性细胞可以是实体瘤细胞，例如肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食管癌细胞。MUC1阳性细胞可以是白血病或骨髓瘤细胞，例如急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。该肽可以是固定肽、环化肽、肽模拟物或类肽。该方法还可包括使细胞与第二抗癌药剂接触，例如在肽之前、在肽之后或与肽同时接触第二抗癌药剂。抑制可包含抑制癌细胞生长、癌细胞增殖或诱导癌细胞死亡，例如通过凋亡。
技术人员受“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第33章，具体是第624至652页的指导。根据所治疗对象的情况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定对个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应符合由FDA生物制品办公室标准要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
IV.药盒
在又一些实施方案中，存在与本文中所述的方法一起使用的药盒。药盒因此将在合适的容器装置中包含如在此所述的抗体构建体。药盒的组分可包装在水性介质中或以冻干形式包装。药盒还可包含抗体构建体的使用说明。
药盒的容器装置通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，其中可放置抗体构建体，或者优选将抗体适当地等分。药盒还包括用于封闭限制式容纳抗体、抗原和任何其他试剂容器以用于商业销售的装置。这样的容器可包含其中保持期望小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。
V.实施例
包括以下实施例以说明优选实施方案。本领域技术人员应当理解，在下面的实例中公开的技术代表了发明人发现的在实施方案的实践中很好地发挥作用的技术，因此可以被认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应当理解可以对公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得类似的或相似的结果而不脱离本公开内容的精神和范围。
实施例1
具有单独轻链的h3D1-hCD3双特异性抗体。h3D1-hCD3是同二聚体，其包含二价h3D1和二价hCD3结合互补位以及LALA-PG突变以消除任何Fc受体介导的效应机制。包含scFv形式的构建体通过以以下顺序融合两种不同抗体的不同结构域来产生：ScFv的N端包含3D1抗体的VH结构域以及CH1结构域，随后是人IgG1的Fc区。Fc的C端通过甘氨酸-丝氨酸接头与CD3抗体的VL和VH结构域融合，所述甘氨酸-丝氨酸接头将能够实现个体结构域的柔性和折叠性。还产生了包含h3D1的VL和CL区域的第二构建体。当这两种构建体在CHO细胞中共表达时，它迫使通过h3D1的轻链与h3D1的重链配对来形成典型的免疫球蛋白结构，并且还迫使通过Fc区中的二硫化物接头像天然免疫球蛋白分子一样形成蛋白质的同二聚体。人IgG1 Fc包含三个突变(L234A、L235A、P329G)，其消除了与造血细胞的Fc受体和补体系统的组分C1q的结合，并因此其可以使继发性免疫反应例如细胞因子释放综合征和补体激活最小化。参见图1A。
h7B8-1-hCD3双特异性抗体。h7B8-1-hCD3是包含单独轻链的单体。人源化7B8-1(h7B8-1)的亲和力是人源化3D1的10倍高。因此，具有单一MUC1结合位点的h7B8-1-hCD3双特异性构建体是通过并入具有更好稳定性且不二聚化的单体Fc来产生的。构建体通过以以下顺序融合7B8-1和抗CD3抗体的不同结构域来产生：构建体的N端包含7B8-1抗体的VH结构域以及CH1结构域，随后是单体人Fc区。单体人Fc的C端通过甘氨酸-丝氨酸接头与CD3抗体的VL和VH结构域融合，所述甘氨酸-丝氨酸接头将能够实现单个结构域的柔性和折叠性。还表达了包含h3D1抗体的VL和VH结构域的第二构建体，其可以与h3D1的VH配对。参见图1B。
h3D1-hCD3双特异性抗体。h3D1-hCD3是其中scFv通过结进孔结合而聚集在一起的异二聚体。该构建体由于通过使用结进孔技术用Fc区中所指示突变(针对T366W的T366S、T368A、Y407V)异二聚化而具有针对MUC1的二价结合位点和针对CD3的一价结合位点。结进孔技术在一条链中应用大的氨基酸来产生“结”，而在另一条链中应用较小的氨基酸用于相应的“孔”。另外，两条带相反电荷的重链的静电转向与单链可变片段(scFv)技术的组合确保了正确的链组装。构建体通过以以下顺序融合不同结构域人源化3D1和人源化CD3抗体来产生：构建体的N端包含使用甘氨酸-丝氨酸接头与VL结构域融合的h3D1抗体的VH结构域，随后是人IgG1的Fc区。Fc的C端通过甘氨酸-丝氨酸接头与CD3抗体的VL和VH结构域融合，所述甘氨酸-丝氨酸接头将能够实现单个结构域的柔性和折叠性。Fc区包含形成孔的三个突变(T366S、T368A、Y407V)和产生用于正确链配对的静电转向的另一个突变(K392D)。产生了第二构建体，其包含通过甘氨酸-丝氨酸接头与VL结构域融合的VH结构域，随后是hIgG1的Fc区，所述Fc区具有形成结的突变(T366W)。人IgG1 Fc包含三个突变(L234A、L235A、P329G)，其消除了与造血细胞的Fc受体和补体系统的组分C1q的结合，并因此其可以使继发性免疫反应例如细胞因子释放综合征和补体激活最小化。参见图1C。
h3D1-hCD3双特异性抗体(scFv)。这种形式的双特异性抗体具有单链可变片段(scFv)，其具有针对MUC1和CD3的各一个结合位点，并且由于所指示的突变而保持为单体。构建体通过将h3D1的VL结构域与人IgG1的Fc融合，随后添加人源化CD3抗体的VL结构域而产生。在两端使用甘氨酸-丝氨酸接头，将h3D1的VH结构域添加至构建体的N端，并将人源化CD3抗体的VH结构域添加至构建体的C端。人IgG1的Fc包含突变(L234A、L235A、P329G)以消除Fc受体介导的效应机制以及C1q结合。参见图1D。
h3D1-hCD3-hPD1三特异性抗体。这种双重免疫细胞接合器(Dual Immune CellEngager，DICE)形式采用了与图1C中相同的异二聚化策略，但其在第二构建体的N端处包含针对PD1的结合位点。PD-1结合位点的添加通过阻断由PD-1和PD-L1相互作用引起的检查点抑制来增强T细胞活化。参见图1E。
h3D1-hCD3-hPD1三特异性抗体。h3D1-hCD3-hPD1是其中scFv通过结进孔结合而聚集在一起的异二聚体。该构建体具有针对MUC1的二价结合位点和针对CD3的一价结合位点和针对PD1的一价结合位点。通过使用结进孔技术用Fc区中所指示突变(针对T366W的T366S、T368A、Y407V)进行异二聚化。构建体通过以以下顺序融合不同结构域人源化h3D1和人源化CD3和PD1抗体来产生：构建体的N端包含使用甘氨酸-丝氨酸接头与VH结构域融合的h3D1抗体的VL结构域，随后是人IgG1的Fc区。Fc的C端通过甘氨酸-丝氨酸接头与CD3抗体的VH和VL结构域融合，所述甘氨酸-丝氨酸接头将能够实现单个结构域的柔性和折叠性。这种双重免疫细胞接合器(DICE)也在第二构建体的N端处包含针对PD1的结合位点。PD-1结合位点的添加通过阻断由PD-1和PD-L1相互作用引起的检查点抑制来增强T细胞活化。Fc区包含形成孔的三个突变(T366S、T368A、Y407V)和产生用于正确链配对的静电转向的另一个突变(K392D)。产生了第二构建体，其包含通过甘氨酸-丝氨酸接头与VH结构域融合的VL结构域，随后是hIgG1的Fc区，所述Fc区具有形成结的突变(T366W)。人IgG1 Fc包含三个突变(L234A、L235A、P329G)，其消除了与造血细胞的Fc受体和补体系统的组分C1q的结合，并因此其可以使继发性免疫反应例如细胞因子释放综合征和补体激活最小化。参见图1F。
h7B8-1-hCD3-hPD1三特异性抗体。h7B8-1-hCD3-hPD1是其中scFv通过结进孔结合而聚集在一起的异二聚体。该构建体具有针对MUC1的二价结合位点和针对CD3的一价结合位点和针对PD1的一价结合位点。通过使用结进孔技术用Fc区中所指示突变(针对T366W的T366S、T368A、Y407V)进行异二聚化。构建体通过以以下顺序融合不同结构域人源化h7B8-1和人源化CD3和PD1抗体来产生：构建体的N端包含使用甘氨酸-丝氨酸接头与VL结构域融合的h7B8-1抗体的VH结构域，随后是人IgG1的Fc区。Fc的C端通过甘氨酸-丝氨酸接头与CD3抗体的VL和VH结构域融合，所述甘氨酸-丝氨酸接头将能够实现单个结构域的柔性和折叠性。这种双重免疫细胞接合器(DICE)也在第二构建体的N端处包含针对PD1的结合位点。Fc区包含形成孔的三个突变(T366S、T368A、Y407V)和产生用于正确链配对的静电转向的另一个突变(K392D)。产生了第二构建体，其包含通过甘氨酸-丝氨酸接头与VL结构域融合的VH结构域，随后是hIgG1的Fc区，所述Fc区具有形成结的突变(T366W)。人IgG1Fc包含三个突变(L234A、L235A、P329G)，其消除了与造血细胞的Fc受体和补体系统的组分C1q的结合，并因此其可以使继发性免疫反应例如细胞因子释放综合征和补体激活最小化。参见图1G。
h7B8-1-hCD3-hPD1三特异性抗体。h7B8-1-hCD3-hPD1是其中scFv通过结进孔结合而聚集在一起的异二聚体。该构建体具有针对MUC1的二价结合位点和针对CD3的一价结合位点和针对PD1的一价结合位点。通过使用结进孔技术用Fc区中所指示突变(针对T366W的T366S、T368A、Y407V)进行异二聚化。构建体通过以以下顺序融合不同结构域人源化h7B8-1和人源化CD3和PD1抗体来产生：构建体的N端包含使用甘氨酸-丝氨酸接头与VH结构域融合的h7B8-1抗体的VL结构域，随后是人IgG1的Fc区。Fc的C端通过甘氨酸-丝氨酸接头与CD3抗体的VH和VL结构域融合，所述甘氨酸-丝氨酸接头将能够实现单个结构域的柔性和折叠性。这种双重免疫细胞接合器(DICE)还在第二构建体的N端处包含针对PD1的结合位点。Fc区包含形成孔的三个突变(T366S、T368A、Y407V)和产生用于正确链配对的静电转向的另一个突变(K392D)。产生了第二构建体，其包含通过甘氨酸-丝氨酸接头与VH结构域融合的VL结构域，随后是hIgG1的Fc区，所述Fc区具有形成结的突变(T366W)。人IgG1Fc包含三个突变(L234A、L235A、P329G)。参见图1H。
h7B8-1-hCD3双特异性抗体。h7B8-1-hCD3是其中scFv通过结进孔结合而聚集在一起的异二聚体。该构建体由于通过使用结进孔技术用Fc区中所指示突变(针对T366W的T366S、T368A、Y407V)异二聚化而具有针对MUC1的二价结合位点和针对CD3的一价结合位点。结进孔技术在一条链中应用大的氨基酸来产生“结”，而在另一条链中应用较小的氨基酸用于相应的“孔”。另外，两条带相反电荷的重链的静电转向与单链可变片段(scFv)技术的组合确保了正确的链组装。构建体通过以以下顺序融合不同结构域人源化7B8-1和人源化CD3抗体来产生：构建体的N端包含使用甘氨酸-丝氨酸接头与VH结构域融合的h7B8-1抗体的VH结构域，随后是人IgG1的Fc区。Fc的C端通过甘氨酸-丝氨酸接头与CD3抗体的VL和VH结构域融合，所述甘氨酸-丝氨酸接头将能够实现单个结构域的柔性和折叠性。Fc区包含形成孔的三个突变(T366S、T368A、Y407V)和产生用于正确链配对的静电转向的另一个突变(K392D)。产生了第二构建体，其包含通过甘氨酸-丝氨酸接头与VL结构域融合的VH结构域，随后是hIgG1的Fc区，所述Fc区具有形成结的突变(T366W)。人IgG1Fc包含三个突变(L234A、L235A、P329G)，其消除了与造血细胞的Fc受体和补体系统的组分C1q的结合，并因此其可以使继发性免疫反应例如细胞因子释放综合征和补体激活最小化。参见图1I。
h3D1-hCD3双特异性抗体(scFv)。这种形式的双特异性抗体具有单链可变片段(scFv)，其具有针对MUC1和CD3的各一个结合位点，并且由于所指示的突变而保持为单体。构建体通过将h7B8-1的VL结构域与人IgG1的Fc融合，随后添加人源化CD3抗体的VL结构域来产生。在两端使用甘氨酸-丝氨酸接头将h7B8-1的VH结构域添加至构建体的N端，并将人源化CD3抗体的VH结构域添加至构建体的C端。人IgG1的Fc包含突变(L234A、L235A、P329G)以消除Fc受体介导的效应机制以及C1q结合。参见图1J。
多种双特异性抗体的纯化。所有指示的构建体在CHO-K1细胞中表达，并产生每种双特异性形式的单细胞克隆。扩增来自克隆的细胞并维持混悬培养物，并使用蛋白A柱纯化双特异性抗体。纯化的蛋白质通过SDS-PAGE来检查。泳道1至3包含还原条件下的所指示双特异性蛋白质。泳道4至6包含在非还原条件下的相同蛋白质。蛋白质D是分子量为78,500道尔顿的单链，并在还原和非还原泳道中呈现出相同的尺寸。蛋白质A具有两条各23,515道尔顿的轻链和各75,679道尔顿的较大片段。在凝胶的还原条件下观察到了这些条带，并且在非还原条件下观察到了约200,000道尔顿的条带。蛋白质B具有75,679道尔顿的较大链和23,885道尔顿的轻链；在还原条件下观察到了它们，并且在非还原条件下观察到了100,000的条带。这些结果证实了正确蛋白质的产生。参见图2。
通过流式细胞术在乳腺腺癌细胞系ZR75-1上对h3D1-hCD3双特异性抗体与细胞表 面MUC1的结合的评估。将ZR75-1细胞收获，并用1％BSA/PBS孵育以用于封闭非特异性结合位点20分钟，并用4μg/ml测试抗体(双特异性抗体)或IgG1同种型对照抗体孵育。同种型匹配的人IgG1和h3D1分别用作结合的阴性和阳性对照。在孵育60分钟之后，将细胞用PBS洗涤2×。将细胞用合适的二抗孵育45分钟，并用PBS洗涤3×。将异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)缀合的山羊F(ab’)2抗人免疫球蛋白用作第二试剂。使用流式细胞术评估抗体与细胞表面的结合，并使用FlowJo软件分析数据。参见图3。
通过流式细胞术在T细胞系Jurkat上对h3D1-hCD3双特异性抗体与细胞表面CD3的 结合的评估。将Jurkat细胞收获，并用1％BSA/PBS孵育以用于封闭非特异性结合位点20分钟，并用4mg/ml测试抗体(双特异性抗体)或IgG1同种型对照抗体孵育。同种型匹配的人IgG1和抗hCD3分别用作结合的阴性和阳性对照。在孵育60分钟之后，将细胞用PBS洗涤2×。将细胞用合适的二抗孵育45分钟，并用PBS洗涤3×。将异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的山羊F(ab’)2抗人免疫球蛋白用作第二试剂。使用流式细胞术评估抗体与细胞表面的结合，并使用FlowJo软件分析数据。参见图4。
在内源性表达MUC1的细胞(ZR75-1)中通过双特异性抗体的T细胞活化。将靶细胞(ZR75-1，乳腺腺癌细胞)平板接种在96孔板中的生长培养基中(10,000个细胞/孔)并孵育过夜。将从20μg/ml开始以2倍系列稀释的不同浓度的双特异性抗体(D、B或A)添加至细胞，随后添加TCR/CD3效应细胞(NFAT-Jurkat，100,000个细胞/孔)，并孵育6小时。添加Bio-GloTM试剂，并使用Molecular Devices FilterMax F5读取器对发光进行定量。使用GraphPad Prism软件将数据拟合成4PL曲线。参见图5A。
通过双特异性抗体的T细胞活化。将靶细胞(ZR75-1，乳腺腺癌细胞)平板接种在96孔板中的生长培养基中(40,000个细胞/孔)并孵育过夜。将从30μg/ml开始以3倍系列稀释的不同浓度的双特异性抗体(B或A)添加至细胞，随后添加TCR/CD3效应细胞(NFAT-Jurkat，100,000个细胞/孔)并孵育6小时。添加Bio-GloTM试剂，并使用Molecular DevicesFilterMax F5读取器对发光进行定量。使用GraphPad Prism软件将数据拟合成4PL曲线。参见图5B。
在HCT116/载体和HCT116/MUC1稳定表达细胞中通过双特异性抗体的T细胞活化。将表达MUC1(HCT/MUC1)或载体(HCT116/载体)的HCT116细胞(10,000个细胞/孔)用从10ug/ml开始以3倍系列稀释的所指示双特异性抗体(D、B或A)和100,000个细胞/孔的NFAT-Jurkat进行处理，并孵育6小时。添加Bio-GloTM试剂，并使用Molecular Devices FilterMaxF5读取器对发光进行定量。使用GraphPad Prism软件将数据拟合成4PL曲线。参见图5C。
双互补位双特异性抗MUC1-C组分与MUC1-C抗原的结合。使用阳性对照(3D1)和作为阴性对照的培养基，通过ELISA测量双互补位双特异性抗MUC1-C组分与MUC1-C抗原的结合。结果在下表中示出：
实施例2-抗体构建体序列
1)h3D1(VH-VL)-hFc-hCD3(VL-VH)-scFv
前导序列-3D1重链可变区-(G4S)3-3D1轻链可变区-G4S-人IgG1 Fc-G4S-CD3轻链可变区-(G4S)3-CD3重链可变区：
2)h3D1(VH-VL)-hFc-scFv
前导序列-3D1重链可变区-(G4S)3-3D1轻链可变区-G4S-人IgG1 Fc：
3)h3D1(VL-VH)-hFc-hCD3(VH-VL)-scFv
前导序列-3D1轻链可变区-(G4S)3-3D1重链可变区-G4S-人IgG1 Fc-G4S-CD3重链可变区-(G4S)3-CD3轻链可变区：
4)h3D1(VL-VH)-hFc-scFv
前导序列-3D1轻链可变区-(G4S)3-3D1重链可变区-G4S-人IgG1 Fc：
5)h7B8-1(VH-VL)-hFc-hCD3(VL-VH)-scFv
前导序列-7B8-1重链可变区-(G4S)3-7B8-1轻链可变区-G4S-人IgG1 Fc-G4S-CD3轻链可变区-(G4S)3-CD3重链可变区：
6)h7B8-1(VH-VL)-hFc-scFv
前导序列-7B8-1重链可变区-(G4S)3-7B8-1轻链可变区-G4S-人IgG1 Fc：
7)h7B8-1(VL-VH)-hFc-CD3(VH-VL)-scFv
前导序列-7B8-1轻链可变区-(G4S)37B8-1重链可变区-G4S-人IgG1 Fc-G4S-CD3重链可变区-(G4S)3-CD3轻链可变区：
8)h7B8-(VL-VH)-hFc-scFv
前导序列-7B8-1轻链可变区-(G4S)3-7B8-1重链可变区-G4S-人IgG1 Fc：
9)h3D1(VH-CH1)-hFc-hCD3(VL-VH)-scFv
人源化抗MUC-1抗体3D1的VH，人IgG1的CH1，具有LALA-PG突变的人IgG1的Fc，接头＝抗人CD3 VL，接头＝抗人CD3 VH：
10)h3D1(VL-CL)
人源化抗MUC-1抗体3D1的VL，人IgG1的CL：
11)h7B8-1(VH-CH1)-mhFc-hCD3(VL-VH)-scFv
人源化抗MUC-1抗体7B8-1的VH，人IgG1的CH1，人IgG1的mhFc，接头＝抗人CD3 VL，接头＝抗人CD3 VH：
12)h7B8-1(VL-CL)
人源化抗MUC-1抗体7B8-1的VL，人IgG1的CL：
13)h3D1(VH-VL)-hFc-hPD-1(VL-VH)-scFv
前导序列-3D1重链可变区-(G4S)3-3D1轻链可变区-G4S-人IgG1 Fc-PD1轻链可变区-(G4S)3-PD1重链可变区：
14)h3D1(VL-VH)-hFc-hPD-1(VH-VL)-scFv
前导序列-3D1轻链可变区-(G4S)3-3D1重链可变区-G4S-人IgG1 Fc-G4S-PD1重链可变区-(G4S)3-PD1轻链可变区：
15)h7B8-1(VH-VL)-hFc-hPD-1(VL-VH)-scFv
前导序列-7B8重链可变区-(G4S)3-7B8轻链可变区-G4S-人IgG1 Fc-PD1轻链可变区-(G4S)3-PD1重链可变区：
16)h7B8-1(VL-VH)-hFc-hPD-1(VH-VL)-scFv
前导序列-7B8轻链可变区-(G4S)3-7B8重链可变区-G4S-人IgG1 Fc-G4S-PD1重链可变区-(G4S)3-PD1轻链可变区：
h7B8/h3D1-hCD3双互补位双特异性
7B8(VH-CH1)-Fc-CD3(VL-VH)：
前导序列-7B8重链可变区(VH5)-人IgG1恒定区-CD3(VL-VH)
7B8(VH-CH1)-Fc-CD3(VH-VL)：
前导序列-7B8重链可变区(VH5)-人IgG1恒定区-CD3-CD3(VH-VL)
h7B8轻链(VL-CL)：
前导序列-7B8轻链可变区(VL3)-人Igκ恒定区
3D1(VH5-VL1)-Fc同种异型2：
前导序列-3D1重链可变区-(G4S)3接头-3D1轻链可变区-人IgG1 Fc
具有Fc同种异型2的3D1(VL1-VH5)：
前导序列-3D1轻链可变区-(G4S)3-3D1重链可变区G4S-人IgG1 Fc
*****************
根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有组合物和方法均可以在不进行过度实验的情况下制造和执行。虽然已经按照优选的实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将明显的是，在不脱离本公开内容的构思、精神和范围的情况下，可以对本文中所描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变。更具体地，明显的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂替代本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员来说明显的所有这样的类似的替代和修饰被认为在所附权利要求书限定的本公开内容的精神、范围和概念之内。
VI.参考文献
以下参考文献就其提供补充本文中所阐述的那些操作或细节的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。
美国专利 3,817,837
美国专利 3,850,752
美国专利 3,939,350
美国专利 3,996,345
美国专利 4,196,265
美国专利 4,275,149
美国专利 4,277,437
美国专利 4,366,241
美国专利 4,472,509
美国专利 4,554,101
美国专利 4,680,338
美国专利 4,683,202
美国专利 4,684,611
美国专利 4,816,567
美国专利 4,867,973
美国专利 4,879,236
美国专利 4,938,948
美国专利 4,952,500
美国专利 5,021,236
美国专利 5,141,648
美国专利 5,196,066
美国专利 5,217,879
美国专利 5,302,523
美国专利 5,322,783
美国专利 5,384,253
美国专利 5,464,765
美国专利 5,506,138
美国专利 5,538,877
美国专利 5,538,880
美国专利 5,550,318
美国专利 5,563,055
美国专利 5,563,250
美国专利 5,565,332
美国专利 5,580,859
美国专利 5,589,466
美国专利 5,610,042
美国专利 5,656,610
美国专利 5,670,488
美国专利 5,702,932
美国专利 5,736,524
美国专利 5,739,018
美国专利 5,780,448
美国专利 5,789,215
美国专利 5,824,544
美国专利 5,830,725
美国专利 5,849,304
美国专利 5,851,826
美国专利 5,856,456
美国专利 5,858,744
美国专利 5,871,982
美国专利 5,871,983
美国专利 5,871,986
美国专利 5,879,934
美国专利 5,880,270
美国专利 5,888,502
美国专利 5,925,565
美国专利 5,928,906
美国专利 5,932,210
美国专利 5,935,819
美国专利 5,945,100
美国专利 5,955,331
美国专利 5,981,274
美国专利 5,994,136
美国专利 5,994,624
美国专利 6,013,516
美国专利序列号 12/789,127
美国专利序列号 13/026,858
美国专利序列号 13/045,033
“Antibodies：A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，1988.
Abbondanzo et al.，Am.J.Pediatr.Hematol.Oncol.，12(4)，480-489，1990.
Allred et al.，Arch.Surg.，125(1)，107-113，1990.
Almendro et al.，J.Immunol.，157(12)：5411-5421，1996.
Amado and Chen，Science，285(5428)：674-676，1999.
Angel et al.，Cell，49：729，1987a.
Angel et al.，Cell，49：729，1987b.
Armentano et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87(16)：6141-6145，1990.
Atchison and Perry，Cell，46：253，1986.
Atchison and Perry，Cell，48：121，1987.
Atherton et al.，Biol.of Reproduction，32，155-171，1985.
Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，1994.
Baldus et al.，Clin.Cancer Res.，10(8)：2790-2796，2004.
Banerji et al.，Cell，27：299，1981.
Banerji et al.，Cell，33(3)：729-740，1983.
Bates，Mol.Biotechnol.，2(2)：135-145，1994.
Batra et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，21(2)：238-245，1999.
Battraw and Hall，Theor.App.Genet.，82(2)：161-168，1991.
Beidler et al.，J.Immunol.，141(11)：4053-4060，1988.
Berkhout et al.，Cell，59：273-282，1989.
Bett et al.，J.Virololgy，67(10)：5911-5921，1993.
Bhattacharjee et al.，J.Plant Bioch.Biotech.，6(2)：69-73.1997.
Bilbao et al.，FASEB J.，11(8)：624-634，1997.
Blackwell et al.，Arch.Otolaryngol Head Neck Surg.，125(8)：856-863，1999.
Blanar et al.，EMBO J.，8：1139，1989.
Blomer et al.，J.Virol.，71(9)：6641-6649，1997.
Bodine and Ley，EMBO J.，6：2997，1987.
Boshart et al.，Cell，41：521，1985.
Bosze et al.，EMBO J.，5(7)：1615-1623，1986.
Braddock et al.，Cell，58：269，1989.
Brown et al.，J.Immunol.Meth.，12；130(1)，：111-121，1990.
Bulla and Siddiqui，J.Virol.，62：1437，1986.
Campbell and Villarreal，Mol.Cell.Biol.，8：1993，1988.
Campbell，In：Monoclonal Antibody Technology，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Burden and Von Knippenberg，Eds.pp.75-83，Amsterdam，Elsevier，1984.
Campere and Tilghman，Genes and Dev.，3：537，1989.
Campo et al.，Nature，303：77，1983.
Capaldi et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，74(2)：425-433，1977.
Caplen et al.，Gene Ther.，6(3)：454-459，1999.
Carbonelli et al.，FEMS Microbiol.Lett.，177(1)：75-82，1999.
Case et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(6)：2988-2993，1999.
Celander and Haseltine，J.Virology，61：269，1987.
Celander et al.，J.Virology，62：1314，1988.
Chandler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(8)：3596-601，1997.
Chang et al.，Mol.Cell.Biol.，9：2153，1989.
Chatterjee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9114，1989.
Chen and Okayama，Mol.Cell Biol.，7(8)：2745-2752，1987.
Chillon et al.，J.Virol.，73(3)：2537-2540，1999.
Choi et al.，J.Mol.Biol.，262(2)：151-167，1996.
Christou et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84(12)：3962-3966，1987.
Clay et al.，J.Immunol.，162：1749，1999.
Cocea，Biotechniques，23(5)：814-816，1997.
Coffey et al.，Science，282(5392)：1332-1334，1998.
Cohen et al.，J.Cell.Physiol.，5：75，1987.
Costa et al.，Mol.Cell.Biol.，8：81-90，1988.
Cripe et al.，EMBO J.，6：3745，1987.
Culotta and Hamer，Mol.Cell.Biol.，9：1376-1380，1989.
D’Halluin et al.，Plant Cell，4(12)：1495-1505，1992.
Dandolo et al.，J.Virology，47：55-64，1983.
De Jager et al.，Semin.Nucl.Med.23(2)，165-179，1993.
DeLuca et al.，J.Virol.，56(2)：558-570，1985.
Derby et al.，Hear Res，134(1-2)：1-8，1999.
Deschamps et al.，Science，230：1174-1177，1985.
Detappe et al.，Int.J.Radiation Oncol.108(5)：1380-1389，2020.
Dholakia et al.，J.Biol.Chem.，264，20638-20642，1989.
Doolittle and Ben-Zeev，Methods Mol.Biol.，109，：215-237，1999.
Dorai et al.，Int.J.Cancer，82(6)：846-52，1999.
Duraisamy et al.，Gene，373：28-34，2006.
Edbrooke et al.，Mol.Cell.Biol.，9：1908-1916，1989.
Edlund et al.，Science，230：912-916，1985.
Engel and Kohn，Front Biosci，4：e26-33，1999.
EP申请 125,023
EP申请 171,496
EP申请 173,494
EP申请 184,187
EPO 0273085
Fechheimer et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，84：8463-8467，1987.
Feldman et al.，Cardiovasc.Res.，32(2)：194-207，1996.
Feldman et al.，Semin.Interv.Cardiol.，1(3)：203-208，1996.
Feng and Holland，Nature，334：6178，1988.
Feng et al.，Nat.Biotechnol.，15(9)：866-870，1997.
Firak and Subramanian，Mol.Cell.Biol.，6：3667，1986.
Fisher et al.，Hum.Gene Ther.，7(17)：2079-2087，1996.
Foecking and Hofstetter，Gene，45(1)：101-105，1986.
Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979.
Fujita et al.，Cell，49：357，1987.
Fujiwara and Tanaka，Nippon Geka Gakkai Zasshi，99(7)：463-468，1998.
Garoff and Li，Curr.Opin.Biotechnol.，9(5)：464-469，1998.
Garrido et al.，J.Neurovirol.，5(3)：280-288，1999.
Gefter et al.，Somatic Cell Genet.，3：231-236，1977.
Gendler et al.，J.Biol.Chem.，263：12820-12823，1988.
Ghosh and Bachhawat，In：Liver Diseases，Targeted Diagnosis and TherapyUsing Specific Receptors and Ligands，Wu et al.(Eds.)，Marcel Dekker，NY，87-104，1991.
Gillies et al.，Cell，33：717，1983.
Gloss et al.，EMBO J.，6：3735，1987.
Gnant et al.，Cancer Res.，59(14)：3396-403，1999.
Gnant et al.，J.Natl.Cancer Inst.，91(20)：1744-1750，1999.
Godbout et al.，Mol.Cell.Biol.，8：1169，1988.
Goding，In：Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，2d ed.，Orlando，Fla.，Academic Press，60-61，65-66，71-74，1986.
Goodbourn and Maniatis，Cell，41(2)：509-520，1985.
Goodbourn et al.，Cell，45：601，1986.
Gopal，Mol.Cell Biol.，5：1188-1190，1985.
Graham and Prevec，Mol Biotechnol，3(3)：207-220，1995.
Graham and Van Der Eb，Virology，52：456-467，1973.
Greene et al.，Immunology Today，10：272，1989.
Grosschedl and Baltimore，Cell，41：885，1985.
Gulbis and Galand，Hum.Pathol.24(12)，1271-1285，1993.
Haecker et al.，Hum.Gene Ther.，7(15)：1907-1914，1996.
Han et al.，J.Infect.Dis.，179：230-233，1999.
Harland and Weintraub，J.Cell Biol.，101(3)：1094-1099，1985.
Haslinger and Karin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：8572，1985.
Hauber and Cullen，J.Virology，62：673，1988.
Hayashi et al.，Neurosci.Lett.，267(1)：37-40，1999.
He et al.，Plant Cell Reports，14(2-3)：192-196，1994.
Hen et al.，Nature，321：249，1986.
Hensel et al.，Lymphokine Res.，8：347，1989.
Hermens and Verhaagen，Prog.Neurobiol.，55(4)：399-432，1998.
Herr and Clarke，Cell，45：461，1986.
Hirochika et al.，J.Virol.，61：2599，1987.
Hirsch et al.，Mol.Cell.Biol.，10：1959，1990.
Holbrook et al.，Virology，157：211，1987.
Holzer et al.Virology，253(1)：107-114，1999.
Horlick and Benfield，Mol.Cell.Biol.，9：2396，1989.
Hou and Lin，Plant Physiology，111：166，1996.
Howard et al.，Ann.NY Acad.Sci.，880：352-365，1999.
Huang et al.，Cell，27：245，1981.
Huard et al.，Neuromuscul Disord，7(5)：299-313，1997.
Hug et al.，Mol.Cell.Biol.，8：3065-3079，1988.
Hwang et al.，Mol.Cell.Biol.，10：585，1990.
Imagawa et al.，Cell，51：251，1987.
Imai et al.，Nephrologie，19(7)：397-402，1998.
Imbra and Karin，Nature，323：555，1986.
Imler et al.，Mol.Cell.Biol.，7：2558，1987.
Imperiale and Nevins，Mol.Cell.Biol.，4：875，1984.
Irie et al.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，9(4)：341-349，1999.
Jakobovits et al.，Mol.Cell.Biol.，8：2555，1988.
Jameel and Siddiqui，Mol.Cell.Biol.，6：710，1986.
Jaynes et al.，Mol.Cell.Biol.，8：62，1988.
Johnson et al.，Mol.Cell.Biol.，9(8)：3393-3399，1989.
Johnston et al.，J.Virol.，73(6)：4991-5000，1999.
Jones et al.，Nature，321：522-525，1986.
Kadesch and Berg，Mol.Cell.Biol.，6：2593，1986.
Kaeppler et al.，Plant Cell Rep.，8：415-418，1990.
Kaneda et al.，Science，243：375-378，1989.
Karin et al.，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.
Karin et al.，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.
Katinka et al.，Cell，20：393，1980.
Katinka et al.，Nature，290：720，1981.
Kato et al，J.Biol.Chem.，266：3361-3364，1991.
Kaufman et al.，Arch.Ophthalmol.，117(7)：925-928，1999.
Kawamoto et al.，Mol.Cell.Biol.，8：267，1988.
Kay，Haemophilia，4(4)：389-392，1998.
Khatoon et al.，Ann.of Neurology，26，210-219，1989.
Kiledjian et al.，Mol.Cell.Biol.，8：145，1988.
King et al.，J.Biol.Chem.，269，10210-10218，1989.
Kinlough et al.，J.Biol.Chem.，279(51)：53071-53077，2004.
Kinoshita et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，394：205-210，2010.
Klamut et al.，Mol.Cell.Biol.，10：193，1990.
Klimatcheva et al.，Front Biosci，4：D481-496，1999.
Koch et al.，Mol.Cell.Biol.，9：303，1989.
Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.，6，511-519，1976.
Kohler and Milstein，Nature，256，495-497，1975.
Kohut et al.，Am.J.Physiol.，275(6Pt1)：L1089-1094，1998.
Kooby et al.，FASEB J，13(11)：1325-34，1999.
Kraus et al.FEBS Lett.，428(3)：165-170，1998.
Kriegler and Botchan，Mol.Cell.Biol.，3：325，1983.
Kriegler et al.，Cell，38：483，1984a.
Kriegler et al.，In：Cancer Cells 2/Oncogenes and Viral Genes，Van deWoude et al.eds，Cold Spring Harbor，Cold Spring Harbor Laboratory，1984b.
Krisky et al.，Gene Ther，5(11)：1517-1530，1998a.
Krisky et al.，Gene Ther，5(12)：1593-1603，1998b.
Kuhl et al.，Cell，50：1057，1987.
Kunz et al.，Nucl.Acids Res.，17：1121，1989.
Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.，157(1)：105-132，1982.
Lachmann and Efstathiou，Curr.Opin.Mol.Ther.，1(5)：622-632，1999..
Lareyre et al.，J.Biol.Chem.，274(12)：8282-8290，1999.
Larsen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：8283，1986.
Laspia et al.，Cell，59：283，1989.
Latimer et al.，Mol.Cell.Biol.，10：760，1990.
Lazzeri，Methods Mol.Biol.，49：95-106，1995.
Lee et al.，Environ.Mol.Mutagen.，13(1)：54-59，1989.
Lee et al.，Nature，294：228，1981.
Lee et al.，Nucleic Acids Res.，12：4191-206，1984.
Lee et al.，DNA Cell Biol.，16(11)：1267-1275，1997.
Leibowitz et al.，Diabetes，48(4)：745-753，1999.
Lesch，Biol Psychiatry，45(3)：247-253，1999.
Levenson et al.，Hum.Gene 7her.，9(8)：1233-1236，1998.
Li et al.，Cancer Biol.Ther.，2：187-193，2003b.
Lin et al.，Mol.Cell.Biol.，10：850，1990.
Lundstrom，J.Recept Signal Transduct.Res.，19(1-4)：673-686，1999.
Luria et al.，EMBO J.，6：3307，1987.
Lusky and Botchan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3609，1986.
Lusky et al.，Mol.Cell.Biol.，3：1108，1983.
Macejak and Sarnow，Nature，353：90-94，1991.
Majors and Varmus，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：5866，1983.
Marienfeld et al.，Gene Ther.，6(6)：1101-1113，1999.
Mastrangelo et al.，Biotechnol.Bioeng.，65(3)：298-305，1999.
McNeall et al.，Gene，76：81，1989.
Miksicek et al.，Cell，46：203，1986.
Miller et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，264：11-16，1993.
Miyatake et al.，Gene Ther.，6：564-572，1999.
Moldawer et al.，Shock，12(2)：83-101，1999.
Mordacq and Linzer，Genes and Dev.，3：760，1989.
Moreau et al.，Nucl.Acids Res.，9：6047，1981.
Moriuchi et al.，Cancer Res，58(24)：5731-5737，1998.
Morrison et al.，J.Gen.Virol.，78(Pt 4)：873-878，1997.
Morrison，Science，229(4719)：1202-1207，1985.
Muesing et al.，Cell，48：691，1987.
Nakamura et al.，In：Enzyme Immunoassays：Heterogeneous and HomogeneousSystems，Chapter 27，1987.
Naldini et al.，Science，272(5259)：263-267，1996.
Neuberger et al.，Nucleic Acids Res.，16(14B)：6713-6724，1988.
Neumann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(16)：9345-9350，1999.
Ng et al.，Nuc.Acids Res.，17：601，1989.
Nicolau and Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982.
Nicolau et al.，Methods Enzymol.，149：157-176，1987.
Nomoto et al.，Gene，236(2)：259-271，1999.
Omirulleh et al.，Plant Mol.Biol.，21(3)：415-428，1993.
Omitz et al.，Mol.Cell.Biol.，7：3466，1987.
Ondek et al.，EMBO J.，6：1017，1987.
O′Shannessy et al.，J.Immun.Meth.，99，153-161，1987.
Owens and Haley，J.Biol.Chem.，259，14843-14848，1987.
Palmiter et al.，Cell，29：701，1982.
Parks et al.，J.Virol.，71(4)：3293-8，1997.
PCT申请 PCT/US86/02269
PCT申请 WO 86/01533
PCT申请 WO 92/17598
PCT申请 WO 94/09699
PCT申请 WO 95/06128
Pech et al.，Mol.Cell.Biol.，9：396，1989.
Pelletier and Sonenberg，Nature，334(6180)：320-325，1988.
Perales et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：4086-4090，1994.
Perez-Stable and Constantini，Mol.Cell.Biol.，10：1116，1990.
Petrof，Eur Respir J，11(2)：492-497，1998.
Picard and Schaffner，Nature，307：83，1984.
Pinkert et al.，Genes and Dev.，1：268，1987.
Ponta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1020，1985.
Posner et al.，Hybridoma 6，611-625，1987.
Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.，199(2)：169-177，1985.
Potter and Haley，Meth.Enzymol.，91，613-633，1983.
Potter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：7161-7165，1984.
Queen and Baltimore，Cell，35：741，1983.
Quinn et al.，Mol.Cell.Biol.，9：4713，1989.
Rabinovitchet al.，Diabetes，48(6)：1223-1229，1999.
Reddy et al.，Virology，251(2)：414-26，1998.
Redondo et al.，Science，247：1225，1990.
Reisman and Rotter，Mol.Cell.Biol.，9：3571，1989.
Remington’s Pharmaceutical Sciences，15th Ed.，33：624-652，1990.
Resendez Jr.et al.，Mol.Cell.Biol.，8：4579，1988.
Rhodes et al.，Methods Mol.Biol.，55：121-131，1995.
Rippe et al.，Mol.Cell.Biol.，9(5)：2224-22277，1989.
Rippe，et al.，Mol.Cell Biol.，10：689-695，1990.
Rittling et al.，Nucl.Acids Res.，17：1619，1989.
Robbins and Ghivizzani，Pharmacol Ther，80(1)：35-47，1998.
Robbins et al.，Trends Biotechnol.，16(1)：35-40，1998.
Sambrook et al.，In：Molecular cloning：a laboratory manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989.
Sawai et al.Mol.Genet.Metab.，67(1)：36-42，1999.
Schaffner et al.，J.Mol.Biol.，201：81，1988.
Searle et al.，Mol.Cell.Biol.，5：1480，1985.
Sharp and Marciniak，Cell，59：229，1989.
Shaul and Ben-Levy，EMBO J.，6：1913，1987.
Shaw et al.，J.Natl.Cancer Inst.，80(19)：1553-1559，1988.
Sherman et al.，Mol.Cell.Biol.，9：50，1989.
Sleigh and Lockett，J.EMBO，4：3831，1985.
Smith et al.，Neuron.，20：1093-1102，1998.
Spalholz et al.，Cell，42：183，1985.
Spandau and Lee，J.Virology，62：427，1988.
Spandidos and Wilkie，EMBO J.，2：1193，1983.
Stephens and Hentschel，Biochem.J.，248：1，1987.
Stewart et al.，Arch.Biochem.Biophys.365：71-74；1999.
Stuart et al.，Nature，317：828，1985.
Sullivan and Peterlin，Mol.Cell.Biol.，7：3315，1987.
Sun et al.，J.Steroid Biochem.，26(1)：83-92，1987.
Suzuki et al.，Biochem Biophys Res Commun，252(3)：686-90，1998.
Swartzendruber and Lehman，J.Cell Physiology，85：179，1975.
Takebe et al.，Mol.Cell.Biol.，8：466，1988.
Tavernier et al.，Nature，301：634，1983.
Taylor and Kingston，Mol.Cell.Biol.，10：165，1990a.
Taylor and Kingston，Mol.Cell.Biol.，10：176，1990b.
Taylor et al.，J.Biol.Chem.，264：15160，1989.
Thiesen et al.，J.Virology，62：614，1988.
Timiryasova et al.，Int.J.Oncol.，14(5)：845-854，1999.
Treisman，Cell，42：889，1985.
Tronche et al.，Mol.Biol.Med.，7：173，1990.
Tronche et al.，Mol.Cell.Biol.，9：4759，1989.
Trudel and Constantini，Genes and Dev.，6：954，1987.
Tsukada et al.，Plant Cell Physiol.，30(4)599-604，1989.
Tsumaki et al.，J.Biol.Chem.，273(36)：22861-22864，1998.
Tur-Kaspa et al.，Mol.Cell Biol.，6：716-718，1986.
Tyndall et al.，Nuc.Acids.Res.，9：6231，1981.
Vanderkwaak et al.，Gynecol Oncol，74(2)：227-234，1999.
Vasseur et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：1068，1980.
Verhoeyen et al.，Science，239(4847)：1534-1536，1988.
Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(9)：3410-3414，1990.
Wang and Calame，Cell，47：241，1986.
Wang et al.，Infect.Immun.，66：4193-202，1998.
Wawrzynczak & Thorpe，Cancer Treat Res.，37：239-51，1988.
Weber et al.，Cell，36：983，1984.
Wei et al.，Cancer Cell，7：167-178，2005.
Weihl et al.，Neurosurgery，44(2)：239-252，1999.
Wen et al.，J.Biol.Chem.，278：38029-38039，2003.
White et al.J.Virol.，73(4)：2832-2840，1999.
Wilson，J.Clin.Invest.，98(11)：2435，1996.
Winoto and Baltimore，Cell，59：649，1989.
Wong et al.，Gene，10：87-94，1980.
Wood et al.，J.Clin.Lab.Immunol.，17(4)：167-171，1985.
Wu and Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12：159-167，1993.
Wu and Wu，J.Biol.Chem.，262：4429-4432，1987.
Wu et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，233(1)：221-226，1997.
Wu et al.，Cancer Res.，58(8)：1605-8，1998.
Yamada et al.，Brain Res.，833(2)：302-307，1999.
Yeung et al.，Gene Ther.，6(9)：1536-1544，1999.
Yoon et al.，J.Gastrointest.Surg.，3(1)：34-48，1999.
Yutzey et al.Mol.Cell.Biol.，9：1397，1989.
Zhao-Emonet et al.，Biochim.Biophys.Acta，1442(2-3)：109-119，1998.
Zheng et al.，J.Gen.Virol.，80(Pt 7)：1735-1742，1999.
Zhou et al.，Nature，361(6412)：543-547，1993.
Zufferey et al.，Nat.Biotechnol.，15(9)：871-875，1997.

Claims (33)

1.重组抗体构建体，其与由SEQ ID NO：2限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合，其中所述抗体构建体还与以下结合：
(a)CD3；
(b)CD16；
(c)CD28；
(d)髓性特异性抗原；
(e)ErbB2；
(f)EGFR；
(g)CD3和PD1；
(h)CD16和PD1；
(i)CD47；
(j)SIRPα；
(k)NKG2D，或
(l)Siglec 9。
2.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体是二价的。
3.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体是三价的。
4.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体是四价的。
5.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体针对MUC1-C/ECD结合具有两种不同的结合特异性。
6.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体具有分别由SEQ ID NO：3、5和7的重CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别由SEQ ID NO：4、6和8的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列引起的MUC1结合特异性；和/或分别由SEQ ID NO：9、11和13的重CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别由SEQ ID NO：10、12和14的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列引起的MUC1结合特异性。
7.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含一个或更多个允许两种不同抗体链锁定的突变。
8.权利要求7所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含IgG序列。
9.权利要求1所述的抗体构建体，其中抗体构建体是鼠抗体的人源化形式。
10.权利要求9所述的抗体构建体，其中所述人源化抗体构建体包含IgG序列。
11.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体还包含标记。
12.权利要求11所述的抗体构建体，其中所述标记是肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。
13.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体还包含与其连接的抗肿瘤药物。
14.权利要求13所述的抗体，其中所述抗肿瘤药物通过光不稳定接头与所述抗体构建体连接。
15.权利要求13所述的抗体构建体，其中所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体构建体连接。
16.权利要求13所述的抗体构建体，其中所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
17.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含SEQ ID NO：22至42的序列。
18.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体构建体包含与SEQ ID NO：22至42具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。
19.权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体与纳米粒或脂质体缀合。
20.权利要求1所述的抗体构建体，其中对细胞死亡的诱导包含抗体依赖性细胞细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
21.治疗癌症的方法，其包括使对象中的MUC1阳性癌细胞与权利要求1至20所述的抗体构建体接触。
22.权利要求21所述的方法，其中所述MUC1阳性癌细胞是实体瘤细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中所述实体瘤细胞是肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食管癌细胞。
24.权利要求21所述的方法，其中所述MUC1阳性癌细胞是白血病或骨髓瘤。
25.权利要求24所述的方法，其中所述白血病或骨髓瘤是急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
26.权利要求21所述的方法，其还包括使所述MUC1阳性癌细胞与第二抗癌药剂或治疗接触。
27.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌药剂或治疗选自化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗。
28.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌药剂或治疗抑制胞内MUC1功能。
29.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌药剂或治疗与所述抗体构建体同时给予。
30.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌药剂或治疗在所述抗体构建体之前和/或之后给予。
31.权利要求21所述的方法，其中所述MUC1阳性癌细胞是转移性癌细胞、多重药物抗性癌细胞或复发性癌细胞。
32.权利要求21所述的方法，其中所述抗体导致对细胞死亡的诱导，例如通过抗体依赖性细胞细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
33.细胞，其表达权利要求1至20所述的抗体构建体。
CN202280045669.5A 2021-05-28 2022-05-27 针对muc1-c/胞外结构域（muc1-c/ecd）的多特异性抗体构建体 Pending CN117769432A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163194597P 2021-05-28 2021-05-28
US63/194,597 2021-05-28
PCT/US2022/031431 WO2022251695A2 (en) 2021-05-28 2022-05-27 Multi-specific antibody constructs against the muc1-c/extracellular domain ( muc1-c/ecd)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117769432A true CN117769432A (zh) 2024-03-26

Family

ID=84230363

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280045669.5A Pending CN117769432A (zh) 2021-05-28 2022-05-27 针对muc1-c/胞外结构域（muc1-c/ecd）的多特异性抗体构建体

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP4346890A2 (zh)
JP (1) JP2024522116A (zh)
KR (1) KR20240021828A (zh)
CN (1) CN117769432A (zh)
AU (1) AU2022283436A1 (zh)
BR (1) BR112023024724A2 (zh)
CA (1) CA3220049A1 (zh)
IL (1) IL308881A (zh)
WO (1) WO2022251695A2 (zh)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080279850A1 (en) * 2005-07-25 2008-11-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-Cell Reduction Using CD37-Specific and CD20-Specific Binding Molecules
CA3149553C (en) * 2006-06-12 2023-11-21 Aptevo Research And Development Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
EP2604280A3 (en) * 2008-03-27 2013-10-16 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for inhibiting PDGFRBETA and VEGF-A
KR20120027031A (ko) * 2009-06-18 2012-03-20 와이어쓰 엘엘씨 소형 모듈 면역제약용 동결건조 제제
EP3327035A1 (en) * 2010-06-22 2018-05-30 Precision Biologics Inc. Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
US20150038682A1 (en) * 2013-08-02 2015-02-05 Jn Biosciences Llc Antibodies or fusion proteins multimerized via homomultimerizing peptide
EP3099719B1 (en) * 2014-01-29 2020-04-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)
BR112020001180A2 (pt) * 2017-07-20 2020-09-08 Aptevo Research And Development Llc proteínas de ligação a antígenos que se ligam a 5t4 e 4-1bb e composições e métodos relacionados
AU2018366199A1 (en) * 2017-11-08 2020-05-28 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
SG11202008474QA (en) * 2018-03-27 2020-10-29 Systimmune Inc Guidance and navigation control proteins and method of making and using thereof
CN112512575A (zh) * 2018-05-16 2021-03-16 嘉立医疗科技(广州)有限公司 双特异性抗体组合物及其使用方法
CA3111462A1 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Improved anti-flt3 antigen binding proteins

Also Published As

Publication number Publication date
BR112023024724A2 (pt) 2024-02-15
WO2022251695A3 (en) 2023-01-05
WO2022251695A8 (en) 2024-01-18
AU2022283436A1 (en) 2023-11-30
IL308881A (en) 2024-01-01
AU2022283436A9 (en) 2023-12-07
JP2024522116A (ja) 2024-06-11
CA3220049A1 (en) 2022-12-01
EP4346890A2 (en) 2024-04-10
KR20240021828A (ko) 2024-02-19
WO2022251695A2 (en) 2022-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220049014A1 (en) Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)
AU2013347184B2 (en) Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
JP7282401B2 (ja) 癌治療のための抗ｆａｍ１９ａ５抗体の用途
KR20230074637A (ko) 클라우딘 발현 암 질환을 치료하기 위한 클라우딘6 또는 클라우딘18.2 및 cd3에 결합하는 이중특이적 3가 항체
JP2017505625A5 (zh)
US10617773B2 (en) Antibodies against the MUC1-C/extracellular domain (MUC1-C/ECD)
JP2022502074A (ja) 改変された腫瘍溶解性ウイルス、組成物、およびその使用
JP2023554422A (ja) がんの治療のための多重特異性抗体
EP2920209B1 (en) Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
CN117769432A (zh) 针对muc1-c/胞外结构域（muc1-c/ecd）的多特异性抗体构建体
CN112368016A (zh) 抗肿瘤剂及其评价方法
RU2798988C2 (ru) Биспецифические трехвалентные антитела, связывающиеся с клаудином 6 или клаудином 18.2, и cd3, для лечения онкологических заболеваний с экспрессией клаудина
CN117693530A (zh) 针对muc1-c/胞外结构域（muc1-c/ecd）的抗体
CN117355331A (zh) 抗Siglec组合物及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination