KR20170137111A - 에스. 아우레우스의 면역글로불린 결합 단백질에 대해 지시된 항체 - Google Patents

에스. 아우레우스의 면역글로불린 결합 단백질에 대해 지시된 항체 Download PDF

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Abstract

단백질 A (SpA) 도메인 및 면역글로불린 결합 단백질 (Sbi) 도메인 SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D, SpA-E, Sbi-I, 및 Sbi-II로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 3개의 면역글로불린 결합 단백질(IGBP) 도메인을 인식하는 교차 특이적 CDR 결합 부위를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 야생형 IGBP에 특이적으로 결합시킴으로써 에스. 아우레우스(S. aureus)에 대항하는 모노클로날 항체로서, 상기 항체는 F(ab)2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 5x10-9M 미만의 KD로 SpA-E에 결합하는 친화도를 갖고, 바람직하게는 IgG Fc 또는 VH3에 대한 결합이 결여된 돌연변이체 SpA-KKAA와 비교하여 동등하거나 더 우수하게 wt SpA에 결합한다.

Description

에스. 아우레우스의 면역글로불린 결합 단백질에 대해 지시된 항체
본 발명은 에스. 아우레우스(S. aureus)의 면역글로불린 결합 단백질(IGBP)에 특이적으로 결합시킴으로써 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대항하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
스타필로코컬 표면 단백질 A(SpA 또는 단백질 A) 및 IgG의 스타필로코컬 결합제(Sbi)는 다수의 인간 단백질과 상호작용하는 다작용성 독성 인자이고, 주로 면역 회피 분자로서 작용한다(참조: Falugi, 2013; Smith, 201 1 ). 면역글로불린의 Fc 부분에 결합시킴으로써, SpA 및 Sbi는 식균 작용으로부터 스타필로코커스 아우레우스를 보호한다. SpA는 또한 B-세포 수용체(BCR) 가교결합 및 따라서 비항원 특이적 B-세포 활성화 및 고갈을 유도하는 항체의 VH3-형 Fab 영역에 결합한다. 결과는 뮤린 모델에서 확실하게 보여지는 스타필로코컬 감염에 대한 적응성 면역 반응의 억제이다(참조: Sasso, 1991 ; Goodyear and Silverman, 2004&2005).
세포 벽 고정 단백질인 SpA는 에스. 아우레우스의 가장 풍부한 표면 단백질 중의 하나이다. 이는 약 60 내지 90% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 5개의 IgG 결합 도메인(IGBP A-E)을 갖는다(도 3 및 4). 상이한 아미노산이 상호작용 부위에 관여함에도 불구하고, 이러한 도메인은 Fc 및 VH3 Fab 결합 모두를 담당한다. Sbi는 IgG의 Fc 영역에 결합하는(IgG-Fc) 두 개의 도메인(IGBP Sbi-I 및 Sbi-II) 및 상보성 단백질 C3에 결합할 수 있고 이의 유체 상에서 이의 무용 소비를 촉진시킬 수 있는 두 개의 도메인을 갖는다(참조: Smith, 201 1 ). Sbi의 두 IGBP 도메인은 그들 사이에 약 30% 아미노산 동일성을 나타내고, 5개의 SpA 도메인과 비교된다(도 3 및 4).
SpA는 전염증성 신호전달의 조절을 유도하는 TNF-알파 수용체 1, 또는 초기 폐렴 병인에 중요한 TNF-1 신호전달과의 간섭을 야기하는 일련의 사상을 유발하는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)와 같은 다수의 인간 분자에의 결합을 통해 몇몇 독성 기능을 갖는다(참조: Gomez, 2004, 2006, 2007). 이 후자 상호작용은 IgG 결합 도메인에서 발생한다(참조: Gomez, 2006). SpA와 폰 빌레브란트 인자의 상호작용은 유착 및 미세색전증 현상과 관련되어 세균 생존율 및 혈류에 의한 확산을 향상시킨다(참조: Hartleib, 2000). 본 발명에 중요하게는, vWF 결합은 또한 Ig 결합 도메인을 통해 매개된다(참조: O'Seaghdha, 2006).
SpA 결실 돌연변이체 에스. 아우레우스 균주는 다수의 동물 모델에서 스타필로코컬 질환에 대해 감소된 독성을 나타내어 SpA가 질환 병인에 중요한 기여를 한다는 것을 시사한다(참조: Jonsson 1985, Patel 1987, Cheng 2009). 뮤린 모델에서 SpA의 주요 기능은 B 세포에 대한 이의 면역억제 효과인 것 같다. VH3-Fab 및 Fc 부분과 결합할 수 없는 SpA 변이체를 발현시키는 돌연변이체 에스. 아우레우스 균주가 마우스의 노출에 사용될 때, 마우스가 상이한 에스. 아우레우스 성분(세포독소, 표면 항원)에 대해 상당히 높은 수준의 항체를 생성한다는 것이 명쾌하게 입증되었다(참조: Kim, 2010). 이러한 마우스는 야생형 에스. 아우레우스에 의한 후속적 감염에 대해 보호되지만, 야생형 에스. 아우레우스에 의한 치사 감염에 노출된 것들은 그렇지 않다(참조: Kim, 2010).
SpA의 B 세포 슈퍼-항원 기능은 B 세포 풀을 발현시키는 VH3에서 상당한 증가(정상 약 50으로부터 최대 80%까지)를 나타낸 에스. 아우레우스 감염 대상체에서 B 세포의 항체 서열 레퍼토리의 분석에 의해 인간에서 최근에 입증되어 VH3 Fab 결합을 통한 BCR 관여로 인한 비항원 특이적 B 세포 증식 및 확대를 시사한다(참조: Pauli, 2014).
이러한 데이터에 기초하여, 에스. 아우스레스 감염 동안 SpA의 효과를 중화시키는 항체가 숙주에 유익한 것으로 기대된다. 실제로, 야생형 SpA 단백질을 이용하는 것이 아니라 느슨한 Fc 및 VH3 Fab 결합 활성(SpAKKAA)으로 돌연변이된 재조합 SpA 단백질을 이용하는 면역화가 에스. 아우레우스 감염의 뮤린 모델에서의 보호를 유도한다는 것이 입증되었다(참조: Kim, 2010; Kim, 2015). 야생형 SpA로가 아니라 SpAKKAA로 면역화된 마우스를 사용하는 하이브리도마 기술에 의해 생성된 모노클로날 항체는 야생형 에스. 아우레우스 균주에 의한 감염에 대해 보호 면역을 유도하는 것으로 나타났다(참조: Kim, 2012; Kim, 2014, Thammavongsa, 2015). 이러한 결과는 야생형 SpA 단백질을 면역원으로 사용하는 SpA-특이적 mAb로는 달성되지 않았다(참조: Kim, 2012; Kim, 2014).
US2014/0170134A1은 5개의 IGBP 도메인에 결합하는 SpAKKAA 돌연변이체에 대한 항체를 기재한다. 3F6으로 지정된 mAb는 SpAKKAA 돌연변이체에 대한 최고 친화도를 가졌다. SpA-E 도메인은 덜 관련되는 것으로 밝혀졌다. E 도메인은 가장 유사하지 않은 도메인으로 기재되었고, SpA-E 도메인 항체는 보호되지 않는 것으로 밝혀졌다.
킴 등(Kim et al.)(참조: Infection and Immunity 2012, 80(10)3460-3470)은 면역글로불린 결합 도메인의 삼중 나선 번들 폴드에 결합하는 SpAKKAA 돌연변이체에 대해 야기된 단백질 A-특이적 마우스 모노클로날 항체를 기재한다.
WO2013/096948A1은, 예를 들면, 에스. 아우레우스의 면역글로불린 결합 도메인으로부터 선택된 미생물 독성 인자에 대한 비면역 결합을 약화시키는 중쇄 불변 영역에 치환을 갖는 항균성 mAb를 개시한다.
WO01/40306 A1, 실시예 22는 IL-8 항체 및 각각의 서열을 개시하고, 에스. 아우레우스의 임의의 면역글로불린 결합 단백질과 관련되지 않는다.
본 발명의 목적은 에스. 아우레우스의 IGBP를 표적화하는 보호 항체를 제공하는 것이다. 상기 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다.
본 발명에 따라서, 단백질 A (SpA) 도메인 및 면역글로불린 결합 단백질 (Sbi) 도메인 SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D, SpA-E, Sbi-I, 및 Sbi-II로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 3개의 면역글로불린 결합 단백질(IGBP) 도메인을 인식하는 교차 특이적 CDR 결합 부위를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스의 적어도 하나의 야생형 IGBP에 특이적으로 결합시킴으로써 에스. 아우레우스에 대항하는 모노클로날 항체로서, 상기 항체가 F(ab)2 또는 F(ab')2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 5x10-9M 미만의 KD로 SpA-E에 결합하는 친화도를 갖는, 모노클로날 항체가 제공된다.
본 발명은 구체적으로 F(ab)2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 5x10-9M 미만의 KD로 야생형 SpA-E에 특이적으로 결합하는 CDR 결합 부위를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스에 대항하는 모노클로날 항체를 제공하고, 이 CDR 결합 부위는 적어도 SpA-A 및 SpA-D를 추가로 인식하는 교차 특이적이다.
구체적으로, CDR 결합 부위는 SpA-B, SpA-C, Sbi-I 및 Sbi-II 중의 적어도 하나를 추가로 인식한다.
특정 구현예에 따라서, 항체는 적어도 SpA-E, SpA-A 및 SpA-D를 인식한다.
특정 국면에 따라서, 항체는 적어도 3개의 IGBP 도메인, 바람직하게는 적어도 4개, 5개 또는 6개의 IGBP 도메인을 인식하는 특이성을 갖고, 바람직하게는 이는 F(ab)2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 각각 5x10-9M 미만의 KD로 적어도 3개의 IGBP 도메인을, 바람직하게는 각각 5x10-9M 미만의 KD로 적어도 4개 또는 5개의 IGBP를 인식한다.
구체적으로, 항체는 F(ab)2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 각각 5x10-9M 미만의 KD로 적어도 SpA-E, SpA-A 및 SpA-D를 인식한다.
다른 특정 구현예에 따라서, 항체는 적어도 SpA-E, SpA-A, SpA-B, 및 SpA-D, SpA-C, Sbi-I, 및 Sbi-II를 인식한다.
다른 특정 구현예에 따라서, 항체는 적어도 SpA-E, SpA-A, SpA-B, SpA-D, 및 Sbi-I를 인식한다.
다른 특정 구현예에 따라서, 항체는 적어도 SpA-E, SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D, 및 Sbi-I를 인식한다.
다른 특정 구현예에 따라서, 항체는 적어도 SpA-E, SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D, Sbi-I, 및 Sbi-II를 인식한다.
구체적으로, 항체는 적어도 3개의 IGBP 도메인을 각각 5x10-9M 미만의 KD로, 바람직하게는 적어도 4개 또는 5개의 IGBP를 각각 5x10-9M 미만의 KD로 인식한다.
구체적으로, 항체는 SpA 및 Sbi 둘 다를, 바람직하게는 각각 5x10-9M 미만의 KD로 인식한다.
구체적으로, 항체는 IgG Fc 및/또는 VH3에 대한 SpA 결합을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 SpAKKAA와 비교하여 실질적으로 동일한 친화도 또는 보다 높은 친화도를 갖는, 구체적으로 서열번호 145 및 146으로 동정된 컨센서스 아미노산 서열을 포함하는 본원에서 동정된 아미노산 서열을 특징으로 하는 야생형 SpA를 인식한다. 구체적으로, 돌연변이체 SpA는 서열번호 147에 의해 동정된 서열을 포함하고, 임의로 서열번호 148에 의해 동정된 서열을 추가로 포함하는 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 구체적으로, 돌연변이체 SpA는 서열번호 147에 의해 동정된 서열을 포함하고, 서열번호 148에 의해 동정된 서열을 추가로 포함하는 SpA 도메인인 SpAKKAA이다. 구체적으로, 결합 친화도는 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 SpA-D와 서열번호 143의 아미노산을 포함하는 돌연변이체 SpA-DKKAA를 결합시키는 친화도를 비교함으로써 측정된다.
하나의 구현예에 따라서, 항체는 야생형을 적어도 실질적으로 동일한 친화도를 갖는, 예를 들면, SpA-D(야생형)와 비교하여 SpA-DKKAA 또는 SpA-DKK에 결합시킴으로써 측정된 바와 같이, 예를 들면, 해리 상수 비 KD(SpAKKAA)/KD(SpA) 또는 비 KD(SpAKK)/KD(SpA)가 적어도 0.5 또는 적어도 0.75 또는 약 1 또는 적어도 1인 돌연변이체 SpAKKAA 또는 SpAKK와 결합시킬 수 있다.
다른 구현예에 따라서, 항체는 야생형을 적어도 더 높은 친화도를 갖는, 예를 들면, SpA-D(야생형)와 비교하여 SpA-DKKAA 또는 SpA-DKK에 결합시킴으로써 측정된 바와 같이, 예를 들면, 해리 상수 비 KD(SpAKKAA)/KD(SpA) 또는 비 KD(SpAKK)/KD(SpA)가 적어도 2 또는 적어도 3 또는 적어도 4 또는 적어도 5인 돌연변이체 SpAKKAA 또는 SpAKK와 결합시킬 수 있다.
항-IGBP 항체의 표적 항원은 SpA 또는 Sbi의 임의의 에스. 아우레우스 IgG 결합 도메인, 또는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 특정 도메인의 선택으로서 이해된다. 구체적으로, 적어도 SpA-E 및 SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D, Sbi-I 및 Sbi-II로 이루어진 그룹으로부터 선택된 IGBP 도메인의 적어도 하나 또는 두 개의 추가는 나노몰 또는 서브나노몰 친화도를 갖는 것으로 인식된다.
SpA 및 Sbi의 Fc-결합 활성을 억제하는 이러한 모노클로날 항체는 그들의 Fc 영역을 통한 비면역 결합에 의해 불활성화된 것보다 그들의 상보성 결정 영역(CDR)을 통해 에스. 아우레우스의 표면 항원에 대한 혈청 IgG의 결합을 향상시킬 것으로 기대된다.
구체적으로, 항체는 IgG-Fc에 대한 SpA- 및 임의로 Sbi-결합과 경쟁한다. 따라서, 항체는 IgG의 IgG-Fc에 대한 IGBP 결합을 특이적으로 방해한다, 즉 천연 리간드 IgG-Fc에 대한 IGBP의 결합을 억제하거나 감소시켜 IGBP와 혈청 면역글로불린의 비면역 상호작용을 감소시킨다. 구체적으로, 항체는, 예를 들면, 개별 IGBP 도메인의 친화도를 비교함으로써 측정된 바와 같이, SpA 또는 Sbi에 의한 IgG-Fc의 비면역 결합보다 표적 항원(즉, 임의의 SpA 또는 Sbi, 또는 각각의 도메인)에 결합하는 높은 친화도를 갖는다. SpA 또는 Sbi에 의한 비면역 IgG-Fc 결합은 구체적으로 다음 컨센서스 서열을 포함하는 IgG-Fc 결합 영역에 의해 측정된다:
서열번호 145:
QQXAFYXXL
여기서,
위치 3의 X는 N, S 또는 K 중 하나이고,
위치 7의 X는 E, Q 또는 N 중 하나이고,
위치 8의 X는 I 또는 V 중 하나이다.
구체적으로, 항체는 강화된 옵소닌식균 작용 및 포식세포에 의한 살상에 의해 스타필로코커스 아우레우스와 대항하거나 중화시킨다. 이러한 항체의 활성을 측정하기 위한 특정 시험은 항체에 의한 배양(옵소닌화)에 이어, 인간 호중구 과립구와 같은 전문 포식세포와의 공배양 후 살아 있는 세균을 열거하는 것이다. 이어서, 포식세포는 전형적으로 세균의 내부화 및 세포내 살상을 일으키는 Fc-수용체를 통해 옵소닌화 병원균을 흡수한다(참조: 실시예 6).
구체적으로, 항체는 상이한 SpA 및 Sbi 변이체 사이에 교차 반응성이다. 특이적 항체는 균주 USA300 TCH1516, MSSA476, JH1, 뉴만 균주, JH9, MW2, Mu3, MRSA252, N315, Mu50, NCTC8325, COL 및 USA300_FPR3757로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 두 개의 균주의 IGBP 변이체에 결합할 수 있다. 특이적 항체는 적어도 하나의 MSSA 균주 및 적어도 하나의 MRSA 균주의 IGBP 변이체에 결합할 수 있다. 특이적 항체는 MRSA 균주인 적어도 두 개의 균주의 IGBP 변이체에 결합할 수 있다.
특정 국면에 따라서, 항체는 100:1 미만의 mAb:단백질 비(mol/mol), 바람직하게는 50:1 미만, 바람직하게는 25:1 미만, 바람직하게는 10:1 미만, 더욱 바람직하게는 1:1 미만의 IC50을 사용하는 시험관내 검정에서 Fc 및 VH3 결합, 폰 빌레브란트 인자에 대한 결합과 같은 SpA 및 Sbi의 독성 기능에 대한 중화 효능을 나타낸다.
추가의 특정 국면에 따라서, 항체는 인간 및 비인간 동물 모두를 포함하는 동물에서 에스. 아우레우스에 결합하고, 생체내, 바람직하게는 임의의 폐렴, 균혈증, 패혈증, 농양, 피부 감염, 복막염, 카테터 및 보철 장치 관련 감염 및 골수염 모델에서 에스. 아우레우스 병인을 억제한다.
구체적으로, 항체는 전장 모노클로날 항체, 결합 부위를 도입하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편, 또는 결합 부위를 도입하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질이고, 구체적으로 상기 항체는 무작위화된 또는 인위적인 아미노산 서열을 포함하는 비천연 항체이다. 바람직하게는, 항체는 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 중쇄 항체, Fab, F(ab')2, Fd, scFv 및 VH, VHH 또는 VL과 같은 단일 도메인 항체, 바람직하게는 인간 lgG1 항체, 또는, 예를 들면, 인간 IgG3과 같은 Fc에 대한 IGBP 또는 SpA의 결합을 감소시키기 위해 IgG-Fc 돌연변이를 포함하는 인간 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
구체적으로, 항체는 CDR 및 CDR 항원 결합 부위를 통해 표적 항원에 결합하는 구조를 포함하는 가변 영역 및/또는 가변 도메인을 포함하고, 예를 들면, 임의의 전장 항체, 중쇄 항체, Fab, F(ab')2, Fd, scFv 및 VH, VHH 또는 VL과 같은 단일 도메인 항체의 (인간) 프레임워크를 포함하는 불변 영역 및/또는 불변 도메인을 추가로 포함한다.
구체적으로, 항체는 표 1에 나열된 임의의 CDR1 내지 CDR3 서열을 특징으로 하는 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH), 및 임의로 표 1에 나열된 임의의 CDR4 내지 CDR6 서열을 특징으로 하는 항체 경쇄 영역(VL)을 포함하고, 이 CDR 서열은 카바트의 넘버링 시스템에 따라 지정되거나 상기한 것 중 어느 하나의 기능적 활성 CDR 변이체이다.
구체적으로, 항체는 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 영역(VL)을 포함하고, 이 항체는 표 1에 나열된 임의의 CDR1 내지 CDR3 서열을 특징으로 하고, 임의로 표 1에 나열된 임의의 CDR4 내지 CDR6 서열을 추가로 특징으로 하고, 이 CDR 서열은 카바트의 넘버링 시스템에 따라 지정되거나 상기한 것 중 어느 하나의 기능적 활성 CDR 변이체이다.
항체는 VH 서열 단독, 예를 들면, VH 항체 또는 중쇄 항체의 CDR 서열에 의해 측정된 결합 부위를 포함하는 항체로서 제공될 수 있지만, 특정 국면에 따라서, 결합 부위는 바람직하게는 표 1에 나열된 임의의 CDR4 내지 CDR6 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR 서열 또는 이의 기능적 활성 CDR 변이체에 의해 추가로 측정될 수 있다.
구체적으로, 항체는 VH 및 VL 영역을 포함하고, CDR 결합 부위는 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 VL의 CDR4, CDR5 및 CDR6을 특징으로 한다.
구체적으로, 항체는 표 1에 나열된 임의의 항체의 CDR1 내지 CDR3 서열을 특징으로 하는 VH, 및 표 1에 나열된 임의의 항체의 CDR4 내지 CDR6 서열을 특징으로 하는 VL을 포함하고, 이 CDR 서열은 카바트의 넘버링 시스템에 따라 지정되거나 상기한 것 중 어느 하나의 기능적 활성 CDR 변이체이다.
구체적으로, 항체는 표 1에 나열된 임의의 항체의 6개의 CDR 서열, 또는 표 1에 나열된 임의의 항체의 기능적 활성 CDR 변이체를 특징으로 한다.
구체적으로, 항체는 중쇄 서열을 특징으로 하고, 임의로 도 1b에 나열된 경쇄 서열을 추가로 특징으로 하는 임의의 예시적 항체이다. 구체적으로, 항체는 서열번호 152-162의 HC 서열 및 임의로 서열번호 163의 LC 서열 중 임의의 것을 포함한다.
구체적으로, 항체는 다음을 특징으로 하는 6개의 CDR 서열을 포함한다:
VH CDR1: YTFXXXYXH (서열번호 164), 여기서
위치 4의 X = T, R, Q, P, D, E, G, S, A, M 중의 하나;
위치 5의 X = S, R, A, E, H, L, G 중의 하나;
위치 6의 X = Y, L, R, H 중의 하나;
위치 8의 X = I, M 중의 하나;
VH CDR2: XINPXXXXTXYAQKFQG (서열번호 165), 여기서
위치 1의 X = I, W 중의 하나;
위치 5의 X = S, H, N, P, R, M, G 중의 하나;
위치 6의 X = G, V, N, S, L, Y, I, V, F 중의 하나;
위치 7의 X = G, D 중의 하나;
위치 8의 X = S, H, N, R, G 중의 하나;
위치 10의 X = S, H, N 중의 하나;
VH CDR3은 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 24, 서열번호 36, 서열번호 51 및 서열번호 151로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
VL CDR1 (CDR4): XASQXXSXXLX (서열번호 166), 여기서
위치 1의 X = R, Q 중의 하나;
위치 5의 X = S, D 중의 하나;
위치 6의 X = V, I 중의 하나;
위치 8의 X = S, N 중의 하나;
위치 9의 X = S, Y, N 중의 하나;
위치 11의 X = A, N 중의 하나;
VL CDR2 (CDR5): XASXXXX (서열번호 167), 여기서
위치 1의 X = G, A, D 중의 하나;
위치 4의 X = T, S, N 중의 하나;
위치 5의 X = R, L 중의 하나;
위치 6의 X = A, Q, E 중의 하나;
위치 7의 X = T, S 중의 하나;
및
서열번호 63, 서열번호 66, 서열번호 69, 서열번호 84, 서열번호 87, 서열번호 96 및 서열번호 111로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL CDR3 (CDR6).
구체적으로, 항체는
a) 표 1에 나열된 임의의 CDR1 내지 CDR3 서열 조합을 특징으로 하는 VH 도메인, 및 표 1에 나열된 임의의 CDR4 내지 CDR6 서열 조합을 특징으로 하는 VL 도메인을 포함하고;
b) 표 1에 나열된 임의의 항체의 CDR 서열의 세트(CDR1-CDR6)를 포함하고;
c) 표 1에 나열된 임의의 항체이거나; 또는
d) a) - c)의 서열을 특징으로 하는 모체 항체의 기능적 활성 변이체이고,
바람직하게는, 여기서
i. 상기 기능적 활성 변이체는 모체 항체의 임의의 CDR1-CDR6의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고/하거나;
ii. 상기 기능적 활성 변이체는 임의의 VH 및 VL 서열의 프레임워크 영역에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고;
추가로,
iii. 상기 기능적 활성 변이체는 모체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖고/갖거나;
iv. 상기 기능적 활성 변이체는 모체 항체의 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 및/또는 친화도 성숙 변이체이다.
구체적으로, 항체는 표 1에 나열된 임의의 CDR 서열의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고, 여기서 상기 기능적 활성 CDR 변이체는
a) 상기 모체 CDR 서열 중의 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 및/또는
b) 상기 모체 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 어느 하나 중의 1 또는 2개의 점 돌연변이; 및/또는
c) 상기 모체 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성 중의 적어도 하나를 포함하고;
바람직하게는, 상기 기능적 활성 CDR 변이체는 임의의 CDR 서열에 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함한다.
구체적으로, 항체는 다음 그룹 구성원 i) 내지 vi)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
i)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지고;
ii)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어지고;
iii)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 100의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 101의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 102의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 100의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 101의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 102의 아미노산 서열로 이루어지고;
iv)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 104의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 104의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어지고;
v)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 107의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 107의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어지고;
vi)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 118의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 120의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 118의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 120의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명은 본원에 기재된 항체의 의학적 사용, 및 각각의 치료 방법 또는 의학적 사용을 위한 제제의 제조 방법을 추가로 제공한다.
본 발명에 따라서, 항체는 에스. 아우레우스 감염 또는 콜론화의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 대상체에게 상기 대상체에서 감염을 제한하거나 상기 감염으로부터 발생되는 질환 상태를 개선시키거나 폐렴, 패혈증, 균혈증, 상처 감염, 농양, 수술 부위 감염, 내안구염(endothalmitis), 절종증, 카르분클증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염과 같은 에스. 아우레우스 질환 병인을 억제하기 위한 항체의 유효량을 투여함을 포함하여 상기 대상체를 치료하는 데 사용하기 위해 추가로 제공된다.
본 발명에 따라서, 본원에 기재된 항체를 포함하는, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하는, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 약제학적 제제가 추가로 제공된다. 본원에 기재된 항체의 제제는 구체적으로 항체를 단리된 형태로, 임의로 약제학적으로 허용되는 제형으로 포함한다.
구체적으로, 약제학적 제제는 병원성 에스. 아우레우스에 대해 또는 에스. 아우레우스 감염에 대해 보호하기 위해 제공된다.
구체적으로, 약제학적 제제는 항체를 단독 활성 물질로서, 또는 다른 활성 물질(들), 또는, 예를 들면, 에스. 아우레우스를 추가로 표적화하는 하나 이상의 추가의 항체, 예를 들면, OPK 항체 또는 적어도 하나의 독소를 표적화하는 항체를 투여하기 위한 조합 또는 칵테일과 같은 활성 물질(들)의 칵테일과 함께 포함할 수 있다. 구체적으로, 항체의 칵테일은 혼합물로 본원에 기재된 하나 이상의 항체 및 임의로 추가의 활성 물질을 포함한다.
본 발명에 따라서, 항체는 괴사성 폐렴과 같은 고독소 생산 MRSA 감염, 및 절종증 및 카르분클증에서 독소 생산을 포함하는 임의의 에스. 아우레우스 감염을 검출하기 위한 진단 용도를 위해 추가로 제공된다.
구체적으로, 항체는 진단 용도를 위해 제공되고, 여기서 대상체에서 에스. 아우레우스에 의한 전신 감염은 상기 대상체의 체액 샘플을 항체와 접촉시킴으로써 생체외 측정되고, 여기서 항체의 특이적 면역 반응은 감염을 측정한다.
따라서, 본 발명은 또한 대상체에서 에스. 아우레우스 감염을 진단하는 각각의 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 대상체에서 에스. 아우레우스에 의한 전신 감염이 측정된다.
본 발명에 따라서, 임의로 표지를 갖는 항체 및/또는 표지를 갖는 추가의 진단 시약을 함유하는, 본원에 기재된 항체의 진단 제제가 추가로 제공된다.
본 발명에 따라서, 본원에 기재된 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 추가로 제공된다.
본 발명에 따라서, 본원에 기재된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현시키는 코딩 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트 또는 플라스미드가 추가로 제공된다.
본 발명에 따라서, 본원에 기재된 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포가 추가로 제공된다.
숙주 세포 및 이러한 숙주 세폴르 사용하는 생산 방법이 구체적으로 바람직하고, 이 숙주 세포는
- 항체 경쇄를 발현시키는 코딩 서열을 도입하는 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트; 및
- 항체 중쇄를 발현시키는 코딩 서열을 도입하는 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트를 포함한다.
본 발명에 따라서, 본원에 기재된 항체를 생산하는 방법이 추가로 제공되고, 여기서 숙주 세포는 상기 항체를 생산하기 위한 조건하에 배양되거나 유지된다.
본 발명에 따라서, 모체 항체의 기능적 활성 변이체 항체를 생산하는 방법이 추가로 제공되고, 이 모체 항체는 표 1에 나열된 CDR 서열을 특징으로 하는 임의의 항체이고, 이 방법은 임의의 프레임워크 영역(FR) 또는 불면 도메인, 또는 변이체 항체를 수득하기 위한 모체 항체의 임의의 CDR 서열에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 유전자 조작하는 단계 및 변이체 항체의 기능적 활성을 10-8M 미만의 KD로 SpA 및/또는 Sbi에 결합시키는 이의 친화도로 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 기능적 활성의 측정시, 기능적 활성 변이체 항체는 재조합 생산 방법에 의한 생산을 위해 선택된다.
본 발명은
(a) 비인간 동물을 스타필로코커스 아우레우스의 야생형 IGBP의 3차원 구조로 면역화하는 단계;
(b) 단리된 B-세포로부터 불멸화 세포주를 형성하는 단계;
(c) IGBP 및 임의로 상이한 SpA 또는 Sbi 도메인 또는 변이체인 추가의 IGBP에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 세포주를 동정하기 위해 세포주를 스크리닝하는 단계; 및
(d) 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 인간화 또는 인간 형태, 또는 모노클로날 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 이의 유도체를 생산하는 단계를 포함하여, 본원에 기재된 항체를 생산하는 방법을 추가로 제공한다.
추가의 국면에 따라서, 본 발명은
(a) 비인간 동물을 스타필로코커스 아우레우스의 야생형 IGBP로 면역화하고 B-세포 생산 항체를 단리시키는 단계;
(b) 단리된 B-세포로부터 불멸화 세포주를 형성하는 단계;
(c) IGBP 및 임의로 상이한 SpA 또는 Sbi 도메인 또는 변이체인 추가의 IGBP에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 세포주를 동정하기 위해 세포주를 스크리닝하는 단계; 및
(d) 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 인간화 또는 인간 형태, 또는 모노클로날 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 이의 유도체를 생산하는 단계를 포함하여, 본원에 기재된 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일련의 항체는 본원에서 실시예의 항체를 포함하여 도 1, 표 1에 나열된 예시적 항체로서 기재된다. 이러한 항체 및 기능적 활성 변이체는 CDR 변이체, FR 변이체, 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 변이체, 또는 본원에 기재된 VH 및 VL 또는 HC(VH 포함) 및 LC(VL 포함)로 구성된 조합 이외의 임의의 항체 도메인 조합, 예를 들면, 다양한 공급원의 FR 서열을 갖는 동일한 CDR1-6 또는 VH/VL 조합을 포함하는 항체를 포함하나, 이에 국한되지 않는 본 청구범위의 주제에 포함되는 것으로 이해된다.
VH 또는 VL 서열의 특이적 기능적 활성 CDR 변이체가 본원에 기재되고, 여기서 상기 임의의 CDR 1-6 서열은 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이을 포함하고 적어도 60% 서열 동일성, 또는 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이다.
특정 국면에서, 본 발명은 또한 모체 항체로서 사용되는, 임의의 예시적 항체로부터 유도된 가변 서열 및/또는 CDR 서열과 같은 각각의 결합 서열을 포함하는 이러한 변이체 항체를 제공하고, 여기서 상기 결합 서열 또는 CDR은 상기 모체 항체로부터 유도된 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 변이체는 기능적 활성 변이체이다.
임의의 예시적 항체가 이러한 모체 항체의 기능적 활성 항체 변이체를 생성하기 위한 모체 항체로서 사용될 수 있고, 여기서 상기 기능적 활성은, 표적 항원이 고친화도로 결합된 경우, 예를 들면, 10-8M 미만의 KD(예: SpA-E 이외의 임의의 IGBP 도메인의 경우), 바람직하게는 5x10-9M 미만, 4x 10~9M 미만, 3x 10~9M 미만, 2x 10-9M 미만, 10-9M 미만, 5x10-10M 미만, 4x10-10M 미만, 3x10-10M 미만, 2x10-10 미만 또는 10- 10M 미만(예: SpA-E의 경우) 중의 어느 하나, 또는 바람직하게는 10-9M 미만, 또는 바람직하게는 5x10-10M 미만으로 측정되고/되거나, 표적 항원에 대한 변이체 항체의 결합은 모체 항체에 의한 결합과 경쟁하거나, 변이체 항체는 모체 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
기능적 활성 변이체 항체는 임의의 VH 또는 VL 서열에서 상이하거나, 공통 VH 및 VL 서열을 공유하고, 각각의 FR에 변형을 포함할 수 있다. 돌연변이유발에 의해 모체 항체로부터 유래된 변이체 항체는 당업계에 익히 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다.
예시적인 모체 항체는 이하 실시예 단락 및 도 1에 기재된다. 구체적으로, 본원에 기재된 제제는 도 1에 나열된 모체 항체의 기능적 활성 유도체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 변형된 CDR 서열을 갖는 변이체가 조작될 수 있다.
항체가 여전히 기능적으로 활성인 한, CDR 조합은 도 1에 나열된 바와 같이 또는 상이한 CDR 조합으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 본원에 기재된 항체는 도 1에 나열된 임의의 항체의 CDR1-6을 포함한다. 그러나, 대안의 구현예에 따라서, 항체는, 예를 들면, 도 1에 나열된 항체가 적어도 하나의 CDR 서열, 예를 들면, 하나의 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 서열 및 도 1에 나열된 임의의 항체의 상이한 항체의 적어도 하나의 추가의 CDR 서열을 포함하는 상이한 CDR 조합을 포함할 수 있다. 특정 예에 따라서, 항체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 서열을 포함하고, 여기서 CDR 서열은 1개 이상의 항체, 예를 들면, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상이한 항체의 CDR 조합이다. 예를 들면, CDR 서열은 바람직하게는 도 1에 나열된 임의의 항체의 CDR1-3 중 1, 2 또는 3개 모두 및 도 1에 나열된 동일하거나 임의의 다른 항체의 CDR4-6 중 1, 2 또는 3개 모두를 포함하도록 조합될 수 있다.
CDR1, 2 및 3으로 넘버링된 CDR은 VH 도메인의 결합 영역을 나타내고, CDR4, 5 및 6은 VL 도메인의 결합 영역을 나타내는 것으로 본원에서 구체적으로 이해된다.
구체적으로, 기능적 활성 변이체는 아미노산 서열 중의 적어도 하나의 점 돌연변이에서 모체 항체, 예를 들면, 도 1에 나열된 임의의 항체와 상이하다. 구체적으로, 적어도 하나의 점 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 임의의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이다.
구체적으로, CDR 서열은, 예를 들면, 각각의 CDR 아미노산 서열 중의 점 돌연변이의 수가 0, 1, 2 또는 3인 기능적 활성 CDR 변이체를 수득하는 것과 같은 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함할 수 있다.
구체적으로, 항체는 각각의 CDR 서열 또는, 예를 들면, 하나의 CDR 루프 내, 예를 들면, 5 내지 18 아미노산의 CDR 길이 내, 예를 들면, 5-15 아미노산 또는 5-10 아미노산의 CDR 영역 내에 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이를 갖는 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하는 CDR 돌연변이체를 사용하여 이러한 항체로부터 유도된다. 또는, 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체를 제공하기 위해, 하나의 CDR 루프 내, 예를 들면, 5 미만의 아미노산의 CDR 길이 내에 1 내지 2개의 점 돌연변이가 존재할 수 있다. 특정 CDR 서열은 짧을 수 있고, 예를 들면, CDR2 또는 CDR5 서열일 수 있다. 특정 구현예에 따라서, 기능적 활성 CDR 변이체는 4 또는 5개 미만의 아미노산으로 이루어진 임의의 CDR 서열에 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함한다.
특이적 항체는, 예를 들면, 항체의 친화도를, 예를 들면, 친화도 성숙에 의해 향상시키고/시키거나 동일한 에피토프 또는 모체 항체에 의해 표적화된 에피토프 근처의 에피토프들(에피토프 쉬프트)를 표적화하기 위해 CDR 돌연변이된 항체로서 제공된다.
특정 국면에 따라서, 본원에 기재된 항체는 CDR 및 프레임워크 서열을 포함하고, 여기서 상기 CDR 및 프레임워크 서열 중 적어도 하나는 인간, 인간화, 키메라, 뮤린 또는 친화도 성숙 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 프레임워크 서열은 IgG 항체, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형 또는 IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체이다.
특이적 항체는, 예를 들면, 모체 항체의 제조능 또는 내성을 향상시키기 위해, 예를 들면, 낮은 면역원성 잠재성을 갖는 개선된 (돌연변이된) 항체, 예를 들면, 모체 항체와 비교하여 임의의 CDR 서열 및/또는 프레임워크 서열에 돌연변이를 갖는 인간화 항체를 제공하기 위해 프레임워크 돌연변이된 항체로서 제공된다.
도 1a. 표 1
표 1a: VH CDR 서열;
표 1b: VL CDR 서열.
본원에 사용된 명명법은 다음 의미를 갖는다:
VH CDR1 = CDR1
VH CDR2 = CDR2
VH CDR3 = CDR3
VL CDR4 = CDR4 = VL CDR1
VL CDR5 = CDR5 = VL CDR2
VL CDR6 = CDR6 = VL CDR3
표 1c: SpA-E 및 SpA 야생형 대 SpA 돌연변이체에 결합하는 선택된 mAb의 친화도:
친화도는 다음과 같이 측정했다: 비오티닐화 SpA-E, SpA-D 및 SpA-DKKAA를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, F(ab')2 단편을 실시예 2에 기재된 바와 같이 펩신 소화에 의해 효모 또는 CHO 유래 IgG로부터 생성했다. SpA 도메인에 대한 mAb의 결합은 ForteBio Octet Red 기구[Pall Life Sciences]를 사용하여 간섭계로 측정하였고; 비오티닐화 항원(5㎍/ml)은 약 2㎚의 센서 부하량을 수득하기 위해 스트렙타비딘 센서에 고정화시켰다. 용액(PBS, pH 7.2 + 1% BSA) 중에서 항체 F(ab')2 단편의 회합 및 해리(50㎚; SpA-E를 갖는 효모 유래 물질에 대해 100nM)는 회합에 대해 10분(SpA-E를 갖는 효모 유래 물질 5분) 및 해리 상에 대해 5분(SpA-E를 갖는 효모 유래 물질 3분) 동안 30℃에서 측정했다. 해리 상수(KD 값)은 Octet 데이터 분석 소프트웨어 버전 7을 사용하여 결합 및 해리 상을 1:1 결합 모델로 동시에 적합화하여 측정된 운동 파라미터((kon 및 koff)에 기초하여 계산했다. WT 대 KKAA 돌연변이체 SpA-D에 대한 개선된 결합은 KD 비로서 표현된다. NB는 SpA-D 돌연변이체에 대한 결합이 없슴을 나타낸다.
도 1b: 선택된 mAb의 전장 서열
선택된 항체의 중쇄가 나열된다(서열번호 152-162). 모든 항체는 경쇄 10901(서열번호 163)을 공유한다.
10895 HC: 서열번호 152
10895 HC CHO (Q1E ΔΚ): 서열번호 153
10898 HC: 서열번호 154
10898 HC CHO (Q1E ΔΚ): 서열번호 155
10899 HC: 서열번호 156
10899 HC CHO (Q1E ΔΚ): 서열번호 157
10901 HC: 서열번호 158
10901 HC CHO (Q1E ΔΚ) 서열번호 159
10901 HC CHO QRF 서열번호 160
10901 HC CHO RF 서열번호 161
10901 HC CHO R 서열번호 162
10901 LC 서열번호 163
도 2. IGBP 서열. 다음 IGBP 도메인의 서열은 항원의 부위 지시된 표지화를 촉진시키기 위해 C-말단 GGC 태그를 함유할 수 있다. 본원에 제공된 서열은 GGC 태그를 갖거나 갖지 않는 IGBP 도메인의 아미노산 서열을 나타내는 것으로 이해된다.
서열번호 121. USA300 TCH1516 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 122. MSSA476 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 123. JH1 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 124. 뉴만 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 125. JH9 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 126. MW2 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 127. MRSA252 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 128. Mu3 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 129. N315 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 130. Mu50 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 131. NCTC8325 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 132. COL 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 133. USA300_FPR3757 균주의 SpA 아미노산 서열
서열번호 134. USA300 TCH1516 균주의 Sbi 아미노산 서열
서열번호 135. USA300 TCH1516 균주의 SpA 도메인 A 아미노산 서열
서열번호 136. USA300 TCH1516 균주의 SpA 도메인 B 아미노산 서열
서열번호 137. USA300 TCH1516 균주의 SpA 도메인 C 아미노산 서열
서열번호 138. USA300 TCH1516 균주의 SpA 도메인 D 아미노산 서열
서열번호 139. USA300 TCH1516 균주의 SpA 도메인 E 아미노산 서열
서열번호 140. USA300 TCH1516 균주의 Sbi 도메인 I 아미노산 서열
서열번호 141. USA300 TCH1516 균주의 Sbi 도메인 II 아미노산 서열
서열번호 142. USA300 TCH 1516 균주의 SpA 도메인 E 아미노산 서열의 SpA-EKKAA 돌연변이체
서열번호 143. USA300 TCH 1516 균주의 SpA 도메인 D 아미노산 서열의 SpA-DKKAA 돌연변이체
서열번호 144. USA300 TCH 1516 균주의 SpA 도메인 D 아미노산 서열의 SpA-DKK 돌연변이체
도 3. SpA 및 Sbi의 도메인 구조. 실시예 1에 기재된 SpA 및 Sbi의 도메인 조직의 개략도.
도 4. SpA 및 Sbi의 IgG 결합 도메인 중의 서열 상동성: 실시예 1에 기재된 USA300 TCH1516 균주로부터 5개의 SpA 및 2개의 Sbi 도메인의 서열 동일성 퍼센트(%).
도 5. 실시예 2에 기재된 IgG 결합 도메인 SpA-A, B, C, D, E 및 Sbi-I에 대한 항-SpA(A) 천연 및 (B) 친화도 성숙된 mAb F(ab')2 단편(각각 (A) 및 (B)에서, 100 및 50nM)의 결합 반응.
도 6. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 친화도 성숙된 항-SpA mAb F(ab')2 및 Fab 단편(100nM)의 개선된 결합 반응(A) 및 친화도(B).
도 7. 실시예 3에 기재된 바와 같은 살아 있는 에스. 아우레우스에 대한 항-SpA Fab 및 F(ab')2 단편의 결합.
도 8. 실시예 3에 기재된 바와 같은 ΔspAΔsbi에 대해서가 아니라 살아 있는 에스. 아우레우스에 대한 항-SpA F(ab')2 단편의 특이적 결합.
도 9. 실시예 3에 기재된 바와 같은 모체 계통에 대한 살아 있는 에스. 아우레우스 세포의 표면에 대한 친화도 성숙된 자손 항-SpA F(ab')2 단편의 개선된 결합.
도 10. 실시예 4에 기재된 바와 같은 forteBio 분석에 의해 항-SpA F(ab')2 단편(100nM)에 의한 SpA에 대한 비-VH3 인간 IgG(66.7μΜ) 결합의 억제.
도 11. 실시예 4에 기재된 유동 세포 분석법 기반 검정으로 항-SpA F(ab')2에 의한 에스. 아우레우스에 대한 인간 IgG 결합의 억제.
도 12. 실시예 5에 기재된 바와 같이 인간 혈청 IgG의 존재하에 에스. 아우레우스에 대한 직접 표지된 항-SpA 완전 IgG의 결합.
도 13. 실시예 5에 기재된 바와 같이 인간 혈청 IgG의 존재하에 에스. 아우레우스에 대한 친화도 개선된 항-SpA 완전 IgG의 증가된 결합.
도 14. 실시예 6에 기재된 바와 같이 PMN 옵소닌 식균 작용 검정에서 에스. 아우레우스의 특이적 SpA 의존 살상.
도 15. 실시예 7에 기재된 바와 같이 에스. 아우레우스 유도된 뮤린 균혈증/패혈증 모델에서 항-SpA mAb에 의한 보호.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 링커 서열의 존재 또는 부재하의 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로서 이해되는 항체 도메인들로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 것이다. 폴리펩티드는, 루프 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 2개의 베타-가닥으로 이루어지는 베타-원통 구조를 포함하는 경우의 항체 도메인으로서 이해된다. 항체 도메인은 천연 구조를 갖거나, 또는, 예를 들면, 항원 결합 성질 또는 임의의 다른 성질, 예를 들면, 안정성 또는 기능적 성질, 예를 들면, Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fc감마 수용체에의 결합을 변형시키기 위해 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 항체는 하나 이상의 항원 또는 상기와 같은 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 특이적인 결합 부위를 가지며, 구체적으로 단일 가변 항체 도메인, 예를 들면, VH, VL 또는 VHH의 CDR 결합 부위, 또는 가변 항체 도메인의 쌍, 예를 들면, VL/VH 쌍, VL/VH 도메인 쌍을 포함하는 항체 및 불변 항체 도메인, 예를 들면, Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fv 또는 전장 항체의 결합 부위를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 특히 단일 가변 항체 도메인, 예를 들면, VH, VL 또는 VHH, 또는 연결 서열 또는 힌지 영역의 존재 또는 부재하의 가변 및/또는 불변 항체 도메인의 조합, 예를 들면, 가변 항체 도메인의 쌍, 예를 들면, VL/VH 쌍을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 항체 포맷, VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 항체, 예를 들면, 중쇄 항체, Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv 또는 전장 항체, 예를 들면, IgG 유형(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형)의 항체, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체를 지칭할 것이다. "전장 항체"란 용어는 Fc 도메인 및 천연 항체 단량체에서 통상적으로 발견되는 다른 도메인의 적어도 대부분을 포함하는 임의의 항체 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 이 어구는 특정 항체 분자가 항체 단편이 아님을 강조하기 위해 본원에 사용된다.
"항체"란 용어는 구체적으로 단리된 형태의 항체를 포함하며, 상기 항체는 상이한 표적 항원에 대해 지시되거나 항체 도메인의 상이한 구조 배열을 포함하는 다른 항체를 실질적으로 함유하지 않는다. 더욱이, 단리된 항체는 상기 단리된 항체와, 예를 들면, 적어도 하나의 다른 항체, 예를 들면, 상이한 특이성을 갖는 모노클로날 항체 또는 항체 단편과의 조합을 함유하는 병용 제제 중에 포함될 수 있다.
"항체"란 용어는 인간 종을 포함한 동물 기원, 예를 들면, 인간, 뮤린, 토끼, 염소, 라마, 소 및 말을 포함한 포유동물, 또는 조류, 예를 들면, 닭의 항체에 적용할 것이며, 이 용어는 특히 동물 기원의 서열, 예를 들면, 인간 서열에 기초하는 재조합 항체를 포함할 것이다.
"항체"란 용어는 또한 상이한 종들의 기원의 서열, 예를 들면, 뮤린 및 인간 기원의 서열을 갖는 키메라 항체에 적용한다.
항체에 관하여 사용된 용어 "키메라"는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열 중 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열에 상동성인 반면, 상기 쇄의 나머지 세그먼트는 또 다른 종 또는 부류의 상응하는 서열에 상동성인 항체들을 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 하나의 포유동물 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 항체의 서열에 상동성이다. 예를 들면, 상기 가변 영역은, 예를 들면, 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 함께, 비-인간 숙주 유기체로부터 쉽게 입수할 수 있는 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 유래될 수 있다.
"항체"란 용어는 인간화된 항체에 추가로 적용할 수 있다.
항체에 관하여 사용되는 바와 같은 "인간화된"이란 용어는 비-인간 종의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기서 상기 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한다. 상기 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전 가변 도메인을 포함하거나, 또는 가변 도메인 중의 적합한 프레임워크 영역 상에 그래프팅된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나, 또는, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다, 바람직하게는 인간 면역글로불린에 보다 가깝게 닮도록 변형될 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열(예를 들면, 마우스 항체로부터의 6개 CDR을 모두 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태들은 원래 항체에 대해 변형된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
"항체"란 용어는 또한 인간 항체에 추가로 적용한다.
항체에 관하여 사용된 용어 "인간"은 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 기재된 인간 항체는, 예를 들면, CDR 중에 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예: 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 유전자 이식 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.
"항체"란 용어는 구체적으로 임의의 부류 또는 하위부류의 항체에 적용한다. 이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 항체의 주요 부류들 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 할당될 수 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다.
상기 용어는 추가로 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 구체적으로 재조합 항체에 적용하며, 이 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리되는 모든 항체 및 항체 구조물, 예를 들면, 상이한 기원으로부터의 유전자 또는 서열을 포함하는 동물, 예를 들면, 인간을 포함하는 포유동물로부터 기원하는 항체, 예를 들면, 뮤린, 키메라, 인간화된 항체, 또는 하이브리도마 유래 항체를 포함한다. 추가의 예는 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합, 조합적 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 항체 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱(splicing)을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체를 지칭한다.
"항체"란 용어는 또한 항체의 유도체, 특히 기능적 활성 유도체를 지칭하는 것으로 이해된다. 항체 유도체는 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 및/또는 융합 단백질의 임의의 조합으로서 이해되고, 여기서, 상기 항체의 임의의 도메인은 하나 이상의 다른 단백질, 예를 들면, 다른 항체, 예를 들면, CDR 루프를 포함하는 결합 구조물, 수용체 폴리펩티드 뿐만 아니라 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 독소 등의 임의의 위치에서 융합될 수 있다. 항체의 유도체는 다양한 화학적 기술, 예를 들면, 공유 결합, 정전기적 상호작용, 디-설파이드 결합 등에 의한 다른 물질에의 회합 또는 결합에 의해 수득할 수 있다. 항체에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자 또는 이들의 임의의 조합(예: PEG, 전구약물 또는 약물)일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 생물학적으로 허용되는 화합물과의 특이적 상호작용을 가능하게 하는 추가의 태그를 포함하는 유도체이다. 태그가 항체의 그의 표적에의 결합에 대해 부정적인 영향을 미치지 않거나 허용가능한 영향을 미치는 한, 본 발명에 사용가능한 태그에 대한 특별한 제한은 없다. 적합한 태그의 예는 Hls-태그, Myc-태그, FLAG-태그, 스트렙-태그, 칼모듈린-태그, GST-태그, MBP-태그 및 S-태그를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 표지를 포함하는 유도체이다. 본 발명에 사용된 용어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성시키기 위해 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체로 검출가능하거나, 예를 들면, 방사성동위원소 표지 또는 형광성 표지이거나, 또는 효소 표지의 경우에는, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다.
본 발명에 기재된 바와 같은 바람직한 유도체는 항원 결합에 관하여 기능적으로 활성이며, 유도체화되지 않은 항체와 같이, 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스를 중화시키는 효능을 갖고/갖거나 보호 항체이다.
모체 항체 또는 항체 서열, 예를 들면, 모체 CDR 또는 FR 서열로부터 유도된 항체는 본원에서 특히, 예를 들면, 인실리코 또는 재조합 조작에 의해 또는 그 밖에 화학적 유도체화 또는 합성에 의해 수득되는 돌연변이체 또는 변이체로서 이해된다.
구체적으로, 본원에 기재된 항체로부터 유도된 항체는 CDR 영역 또는 이의 CDR 변이체 중 적어도 하나 이상, 예를 들면, 중쇄 가변 영역의 적어도 3개의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 3개의 CDR을 포함할 수 있으며, 이때 상기 CDR 및 FR 영역 중 적어도 하나 중의, 또는 상기 HC 또는 LC의 불변 영역 중의 적어도 하나의 점 돌연변이는 기능적으로 활성이고, 예를 들면, 표적 항원과 본질적으로 동일하거나 향상된 결합 특성에 의해 측정된다.
"항체"란 용어는 또한 모체 CDR 서열의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체를 포함하는 항체의 변이체 및 모체 항체의 기능적 활성 변이체 항체를 지칭하는 것으로 이해된다.
"변이체"란 용어는 특히, 예를 들면, 특히 특이적 항체 아미노산 서열 또는 영역에서 삽입물을 결실시키거나, 교환하거나, 도입시키거나, 또는, 예를 들면, 항체 안정성, 이펙터 기능 또는 반감기를 조작하기 위한 불변 도메인에서 또는, 예를 들면, 당해 분야에서 이용가능한 친화도 성숙 기술에 의해 항원 결합 성질을 개선시키기 위한 가변 도메인에서 아미노산 서열을 화학적으로 유도체화하는 돌연변이유발 방법에 의해 수득되는 항체, 예를 들면, 돌연변이체 항체 또는 항체의 단편을 지칭할 것이다. 예를 들면, 무작위화 기술에 의해 수득되는, 목적하는 위치에서의 점 돌연변이를 포함하는 임의의 공지된 돌연변이유발 방법이 사용될 수 있다. 일부의 경우에, 위치는, 예를 들면, 항체 서열을 무작위화하기 위해 임의의 가능한 아미노산 또는 바람직한 아미노산의 선택에 의해 무작위로 선택된다. "돌연변이유발"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 변경시키기 위한 임의의 당해 분야 인식 기술을 지칭한다. 바람직한 유형의 돌연변이유발은 오류 유발 PCR 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 또는 다른 부위 지시된 돌연변이유발을 포함한다.
"변이체"란 용어는 구체적으로 기능적 활성 변이체를 포함할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 CDR 서열의 "기능적 활성 변이체"란 용어는 "기능적 활성 CDR 변이체"로서 이해되며, 본원에 사용된 바와 같은 항체의 "기능적 활성 변이체"는 "기능적 활성 항체 변이체"로서 이해된다. 기능적 활성 변이체는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 뉴클레오티드 서열 내 뉴클레오티드, 또는 상기 서열, 예를 들면, CDR 서열의 원위 말단부 중 임의의 것 또는 둘 다에서 N-말단 및/또는 C-말단 1, 2, 3 또는 4개 아미노산, 및/또는 중심 1, 2, 3 또는 4개 아미노산(즉, CDR 서열의 한 가운데)의 화학적 유도체화에 의한 이 서열(모체 항체 또는 모체 서열)의 변형으로부터 생성되는 서열을 의미하며, 이 변형은 이 서열의 활성에 영향을 미치지 않고, 특히 손상시키지 않는다. 선택된 표적 항원에 대해 특이성을 갖는 결합 부위의 경우에, 항체의 기능적 활성 변이체는, 예를 들면, 특정 에피토프에 대한 미세한 특이성, 친화도, 결합능, Kon 또는 Koff 비율 등을 변경하도록 변화될 수 있지만, 여전히 소정의 결합 특이성을 가질 것이다. 예를 들면, 친화도 성숙 항체는 구체적으로 기능적 활성 변이체 항체로서 이해된다. 따라서, 친화도 성숙 항체에서 변형된 CDR 서열은 기능적 활성 CDR 변이체로서 이해된다. 추가의 변형이, 예를 들면, 모체 항체 외에 더 많은 IGBP 도메인(예: 상이한 균주로부터 발생하는 상이한 형태의 도메인 또는 도메인 변이체)을 표적화하도록 교차-특이성을 확장시키거나, 또는 하나 이상의 표적과 이의 반응성을 증가시키기 위해 돌연변이유발을 통해 수행될 수 있다. 기능적 활성의 특정 지표는 천연 리간드, 즉, 혈청 면역글로불린의 IgG-Fc에 대한 임의의 IGBP의 결합을 억제하기 위한 경쟁적 결합으로서 간주된다.
본원에 기재된 바람직한 항체는 개별적인 표적 항원(개별적 IGBP 도메인)에 높은 친화도로, 특히 높은 온 비율(on rate) 및/또는 낮은 오프 비율(off rate), 또는 높은 결합능으로 결합한다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 항원 결합 부위의 절반이 점유되는, 해리 상수(Kd 또는 KD)로서 공지된 항체의 농도에 의해 특성화한다. 일반적으로, 결합제는 KD<10-8 M, 바람직하게는 KD<5x10-9 M, 더욱 더 바람직하게는 KD<10-9 M, 또는 KD<5x10-10 M, 또는 KD<10-10 M을 갖는 높은 친화도 결합제로 간주된다.
그러나, 특히 바람직한 구현예에서, 개별적 항원 결합 친화도는, 예를 들면, 적어도 2개의 항원에 결합하는 경우, 예를 들면, 10-6 미만 및 10-8 M 이하의 KD를 갖는 중간 친화도이다.
중간 친화도 결합제가 본 발명에 따라서, 바람직하게는, 필요한 경우, 친화도 성숙 과정과 함께 제공될 수 있다.
친화도 성숙은 표적 항원에 대해 증가된 친화도를 갖는 항체가 생성되는 과정이다. 본원에 개시된 본 발명의 다양한 구현예에 따르는 친화도 성숙된 항체를 생성시키기 위해서 당해 분야에서 이용가능한 친화도 성숙 라이브러리를 제조하고/하거나 사용하는 임의의 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다. 예시적인 이러한 친화도 성숙 방법 및 용도, 예를 들면, 무작위 돌연변이유발, 세균 돌연변이 균주 계대배양, 부위-지시된 돌연변이유발, 돌연변이 다발점 표적화, 인색한 돌연변이유발, 항체 셔플링, 경쇄 셔플링, 중쇄 셔플링, CDR1 및/또는 CDR1 돌연변이유발, 및 본원에 개시된 본 발명의 다양한 구현예에 따르는 실행 방법 및 용도에 따르는 친화도 성숙 라이브러리를 생성시키고 사용하는 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352; WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; US2002/0177170; WO2003/074679]에 개시된 것들을 포함한다.
아미노산 돌연변이유발을 포함한 항체의 구조적 변화에 의해, 또는 면역글로불린 유전자 세그먼트 중의 체세포 돌연변이의 결과로서, 항원에 대한 결합 부위의 변이체가 생성되고 더 큰 친화도를 위해 선택된다. 친화도 성숙된 항체는 모체 항체보다 수 로그배 더 큰 친화도를 나타낼 수 있다. 단일 모체 항체는 친화도 성숙에 적용시킬 수 있다. 대안적으로, 표적 항원에 대한 유사한 결합 친화도를 갖는 항체의 풀은 친화도 성숙된 단일 항체 또는 이러한 항체의 친화도 성숙된 풀을 수득하기 위해 변화된 모체 구조로서 간주할 수 있다.
본원에 기재된 항체의 바람직한 친화도 성숙된 변이체는 적어도 2배의 결합 친화도 증가, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배, 또는 바람직하게는 적어도 100배의 증가를 나타낸다. 친화도 성숙은 모체 분자의 각 라이브러리를 사용하는 선택 캠페인의 과정에 사용할 수 있으며, 이때 본 발명의 항체를 수득하기 위한 중간 결합 친화도를 갖는 항체는 결합 친화도 KD<10-8 M의 특이적 표적 결합 성질을 갖는다. 대안적으로, 친화도는 10-9 M 미만, 바람직하게는 10-10 M 미만 또는 심지어 10-11 M 미만, 가장 바람직하게는 피코몰 범위의 KD에 상응하는 높은 값을 수득하도록 본 발명에 따르는 항체의 친화도 성숙에 의해 훨씬 더 증가시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 결합 친화도는 친화도 ELISA 검정에 의해 측정된다. 특정 구현예에서, 결합 친화도는 비아코어(BIAcore), 포르테바이오(ForteBio) 또는 MSD 검정에 의해 측정된다. 특정 구현예에서, 결합 친화도는 동적 방법에 의해 측정된다. 특정 구현에에서, 결합 친화도는 평형/용액 방법에 의해 측정된다.
기능적 활성은 바람직하게는 항체의 옵소닌 포식세포 살상 활성을 측정하기 위한 검정에서 측정된다, 예를 들면, 감소된 생존력 또는 세균 세포를 측정함으로써 표준 OPK 검정에서 측정된다. 보호를 측정하기 위한 특정 시험은 시험관내 OPK 검정 또는 실시예 단락에 기재된 바와 같은 뮤린 균혈증 또는 패혈증 모델의 생체내 효능 시험이다.
전형적으로, 변이체의 기능적 활성은, 그들이 비교가능한 (모체 또는 비변형된) 항체와 실질적으로 동일한 기능적 활성 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는 경우에 입증된다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한 기능적 활성" 또는 "실질적으로 동일한 생물학적 활성"은 비교가능한 또는 모체 항체에 대해 측정된 활성의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 예를 들면, 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는, 예를 들면, 200% 이하인 실질적으로 동일한 활성에 의해 지시되는 바와 같은 활성을 지칭한다.
야생형 또는 돌연변이체 IGBP 도메인, 예를 들면, IGBPKK 또는 IGBPKKAA 도메인의 결합에 관한 용어 "실질적으로 동일한 결합 친화도"는, 예를 들면, 각각 koff 및 kon 및 KD의 필적할 만한 결과를 생성하기 위해 동일한 유형의 항체 및 동일한 유형의 항원을 사용하는 동일한 검정에서 측정된 KD로 나타내는 친화도로서 이해되고, 여기서 KD 차이는 2배 미만 또는 4배 미만이다.
본원에 제공된 실시예에 따라서, 친화도 측정은 다음과 같이 수행된다: 친화도 측정은 항원으로서 재조합 IGBP 도메인을 사용하여 간섭법으로 수행되고, 항체는 CDR 결합 부위에 의한 항원의 결합 친화도를 측정하기 위해 F(ab')2 또는 F(ab) 단편으로서 생성된다. F(ab')2 또는 F(ab) 단편은 재조합 숙주로서 발현되고, 임의로 친화도 측정을 방해할 수 있는 오염 물질을 피하기 위해 추가로 정제된다. 항체가 IgG로서 생산되고 F(ab')2 제제를 수득하기 위해 펩신에 의해 추가로 소화되는 경우, F(ab')2 제제는 친화도 측정을 방해할 수 있는 오염성 Fc 단편을 피하기 위해 임의로 정제된다.
본원에 제공된 특정 실시예에 따라서, 친화도 측정은 ForteBio Octet Red 기구[Pall Life Sciences]를 사용하여 간섭계에 의해 수행되었고; 비오티닐화 항원은 약 2㎚의 센서 부하량을 수득하기 위해 스트렙타비딘 센서 상에 고정화시켰다. 용액(PBS, pH 7.2 + 1% BSA) 중에서 항체 F(ab')2 또는 F(ab) 단편(각각 50-100 및 100-200nM)의 회합 및 해리는 회합 상에 대해 3 내지 10분 동안, 해리 상에 대해 3 내지 30분 동안 30℃에서 측정했다. 해리 상수(KD 값)는 Octet 데이터 분석 소프트웨어 버전 7을 사용하여 회합 및 해리 상을 1:1 결합 모델로 동시에 적합화함으로써 측정된 동적 파라미터(kon 및 koff)에 기초하여 계산되었다. 비오티닐화 SpA 및 Sbi 도메인(SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D, SpA-E, Sbi-I 및 Sbi-II)은 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성되었고, F(ab')2 단편은 실시예 2에 기재된 바와 같이 펩신 소화에 의해 효모 및/또는 CHO 유래 IgG로부터 생성되었다.
본원에 개시된 바와 같은 바람직한 변이체 또는 유도체는 바람직하게는, 예를 들면, 적어도 2 로그, 바람직하게는 적어도 3 로그의 KD 값 차이로, 개별적 표적에 특이적으로 결합하고 표적 항원이 아닌 다른 항원에는 현저하게 결합하지 않는 효능을 갖는 항원 결합에 관하여 기능적으로 활성이다. 상기 기능적 활성 변이체에 의한 항원 결합은 전형적으로 손상되지 않고, 모체 항체 또는 서열, 또는 서열 변이체를 포함하는 항체와 대략 실질적으로 동일한 결합 친화도에 상응하며, 예를 들면, 2 로그 미만, 바람직하게는 3 로그 미만의 KD 값 차이를 갖지만, 예를 들면, 적어도 1 로그, 바람직하게는 적어도 2 로그의 KD 값 차이로 훨씬 더 개선된 친화도의 가능성을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 모체 항체의 기능적 활성 변이체는
a) 상기 항체의 생물학적 활성 단편이고, 상기 단편은 분자의 서열의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%를 포함하며;
b) 적어도 하나의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 항체로부터 유도되고, 여기서 상기 기능적 활성 변이체는 분자 또는 그의 부분에 대한 서열 동일성, 예를 들면, 적어도 50% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성의 항체를 가지며; 및/또는
c) 항체 또는 그의 기능적 활성 변이체 및 추가로 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 이종인 적어도 하나의 아미노산 또는 뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따르는 항체의 기능적 활성 변이체는 상기한 변이체와 본질적으로 동일하지만, 상이한 종의 상동성 서열로부터 유래된다는 점에서 각각 그의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열과 상이하다. 이들은 천연 변이체 또는 유사체라 지칭한다.
"기능적 활성 변이체"란 용어는 또한 천연 대립유전자 변이체 뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 다른 비-천연(예: 합성 또는 인공)항체, 또는 변이체, 예를 들면, 인공 항체 라이브러리로부터 유도된 항원 결합 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리펩티드의 생물학적 기능을 본질적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 가짐을 특징으로 하는 (폴리)펩티드의 대안적인 형태이다.
기능적 활성 변이체는 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열 중의 서열 변경에 의해, 예를 들면, 하나 이상의 점 돌연변이에 의해 수득할 수 있고, 여기서 상기 서열 변경은 본 발명과 함께 사용될 때 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 기능을 유지하거나 개선시킨다. 이러한 서열 변경은 (보존적) 치환, 부가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
특정 기능적 활성 변이체는 CDR 변이체이다. CDR 변이체는 CDR 영역 중의 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 변형은 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적 변경일 수 있고, 이 변경은 변이체가 변경되지 않은 서열의 생물학적 특징을 유지할 수 있게 한다. CDR 아미노산 서열의 부분적 변경은 1개 내지 다수의 아미노산, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 결실 또는 치환에 의하거나, 또는 1개 내지 다수의 아미노산, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 부가 또는 삽입에 의하거나, 또는 1개 내지 다수의 아미노산, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 화학적 유도체화에 의하거나, 또는 이들의 조합에 의할 수 있다. 아미노산 잔기에서 치환은 보존적 치환일 수 있다, 예를 들면, 대안적인 소수성 아미노산을 하나의 소수성 아미노산으로 치환시킬 수 있다.
보존적 치환은 측쇄 및 화학적 성질에 관련된 아미노산 계열 내에서 발생하는 것들이다. 이러한 계열의 예는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비-극성 지방족 측쇄, 비-극성 방향족 측쇄, 하전되지 않은 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산들이다.
점 돌연변이는 특히, 상이한 아미노산에 대한 하나 이상의 단일 (비-보존적) 또는 이중 아미노산의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 조작되지 않은 아미노산과 상이한 아미노산 서열의 발현을 초래하는 폴리뉴클레오티드의 조작으로서 이해된다.
바람직한 점 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하의 아미노산의 교환을 지칭한다. 이에 관하여, 아미노산은 64개 삼중 코돈에 의해 코딩되는 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이들 20개 아미노산은 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 것들로 분류할 수 있다:
"중성" 아미노산은 각각의 3-문자 및 단일-문자 코드 및 극성과 함께 하기에 나타낸다:
알라닌: (Ala, A) 비극성, 중성;
아스파라긴: (Asn, N) 극성, 중성;
시스테인: (Cys, C) 비극성, 중성;
글루타민: (Gln, Q) 극성, 중성;
글리신: (Gly, G) 비극성, 중성;
이소류신: (Ile, I) 비극성, 중성;
류신: (Leu, L) 비극성, 중성;
메티오닌: (Met, M) 비극성, 중성;
페닐알라닌: (Phe, F) 비극성, 중성;
프롤린: (Pro, P) 비극성, 중성;
세린: (Ser, S) 극성, 중성;
트레오닌: (Thr, T) 극성, 중성;
트립토판: (Trp, W) 비극성, 중성;
티로신: (Tyr, Y) 극성, 중성;
발린: (Val, V) 비극성, 중성; 및
히스티딘: (His, H) 극성, 양성(10%) 중성(90%).
"양으로" 하전된 아미노산은 다음과 같다:
아르기닌: (Arg, R) 극성, 양성; 및
리신: (Lys, K) 극성, 양성.
"음으로" 하전된 아미노산은 다음과 같다:
아스파르트산: (Asp, D) 극성, 음성; 및
글루탐산: (Glu, E) 극성, 음성.
본 발명에 기재된 항체 서열 및 상동체에 관하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우, 서열 및 도입 갭을 최대의 서열 동일성 퍼센트를 성취하도록 정렬한 후에, 서열 동일성의 부분으로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않으면서, 특정한 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 당해 분야의 숙련가들은 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 측정할 수 있다.
항체 변이체는 구체적으로, 예를 들면, 당공학(glycoengineering)에 의해 생성된 특정 글리코실화 패턴을 갖는 상동체, 유사체, 단편, 변형 또는 변이체를 포함하는 것으로 이해되며, 이는 기능적이고, 예를 들면, 특정 표적에 결합하고 기능적 성질들을 갖는 기능적 등가물로서 작용할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 변이체는 항원 결합에 대하여 기능적으로 활성이고, 바람직하게 이는 에스. 아우레우스를 중화시키는 효능을 갖고/갖거나 보호 항체이다.
본원에 기재된 항체는 Fc 이펙터 기능을 나타낼 수도, 나타내지 않을 수도 있다. 작용 방식은 주로 Fc 이펙터 기능이 없는 중화 항체에 의해 매개되지만, Fc는 보체를 모집하며 면역 복합체의 형성을 통한 순환으로부터 표적 항원, 예를 들면, 독소의 제거를 도울 수 있다.
특이적 항체는 활성 Fc 부분이 없을 수 있으며, 따라서 항체의 Fc 부분을 함유하지 않거나 Fc감마 수용체 결합 부위를 함유하지 않는 항체 도메인으로 구성되거나, 또는, 예를 들면, Fc 이펙터 기능을 감소시키는, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 없애거나 감소시키는 변형에 의해 Fc 이펙터 기능이 없는 항체 도메인을 포함할 수 있다. 대안의 항체는, Fc 이펙터 기능을 증가시키는, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 증대시키는 변형을 포함하도록 조작될 수 있다.
이러한 변형은 Fc 이펙터 기능의 감소 또는 증가를 달성하기 위해 돌연변이유발, 예를 들면, Fc감마 수용체 결합 부위의 돌연변이에 의해 또는 항체 포맷의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 방해하는 유도체 또는 제제에 의해 수행될 수 있다.
Fc 이펙터 기능의 현저한 감소는 전형적으로, ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정시 변형되지 않은 (야생형) 포맷의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 Fc 이펙터 기능을 지칭하는 것으로 이해된다.
Fc 이펙터 기능의 현저한 증가는 전형적으로, ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정시 변형되지 않은 (야생형) 포맷의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%의 Fc 이펙터 기능의 증가를 지칭하는 것으로 이해된다.
항체 서열에 관하여 "당공학" 변이체란 용어는 당공학의 결과로서 변형된 면역원성 또는 면역조절성(예: 소염성) 성질, ADCC 및/또는 CDC를 갖는 글리코실화 변이체를 지칭할 것이다. 모든 항체는 중쇄 불변 영역 중의 보존된 위치에 탄수화물 구조를 함유하며, 이때 각각의 이소타입은 단백질 조립, 분비 또는 기능적 활성에 가변적으로 영향을 미치는 N-연결된 탄수화물 구조의 독특한 배열을 갖는다. IgG1 유형 항체는, 각각의 CH2 도메인 중의 Asn297에서 보존된 N 연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합 2-안테나 올리고사카라이드가 상기 CH2 도메인 사이에 묻혀 폴리펩티드 주쇄와의 광범위한 접촉부를 형성하고, 그의 존재는 항체가 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)과 같은 이펙터 기능을 매개하는데 필수적이다. N297에서, 예를 들면, N297의, 예를 들면, A로의 돌연변이를 통해, 또는 T299에서 N-글리칸의 제거는 전형적으로 감소된 ADCC와 함께 아글리코실화된 항체 포맷을 생성시킨다. 구체적으로, 본원에 기재된 항체는 글리코실화되거나 당공학에 의해 변형된 또는 아글리코실화된 항체일 수 있다.
항체 글리코실화에 있어서 주요한 차이가 세포주 사이에 발생하고, 심지어 최소한의 차이가 상이한 배양 조건하에서 성장된 소정의 세포주에 대해 관찰된다. 세균 세포에서 발현은 전형적으로 아글리코실화된 항체를 제공한다. 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라제, β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다[참조: Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180]. 숙주 세포의 선택 외에, 항체의 재조합 생성 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 배지 제형, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 구조 등을 포함한다.
"항원-결합 부위" 또는 "결합 부위"란 용어는 항원 결합에 관여하는 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 부위는 중("H") 및/또는 경("L")쇄의 N-말단 가변("V") 영역, 또는 이의 가변 도메인의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "고가변 영역"이라 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내 3개의 매우 이질적인 신장부가 프레임워크 영역으로서 공지된 보다 보존된 측면 인접 신장부들 사이에 삽입된다. 항원-결합 부위는 결합된 에피토프 또는 항원의 3차원 표면에 상보성인 표면을 제공하고, 고가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"이라 지칭된다. CDR에 통합된 결합 부위는 본원에서 또한 "CDR 결합 부위"라 지칭된다.
구체적으로, 본원에 언급된 바와 같은 CDR 서열은 카바트 명명법에 따라 측정된 바와 같은 항체의 아미노산 서열들로서 이해된다(참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services. (1991)).
본원에서 "표적" 또는 "표적 항원"이란 용어와 상호교환가능하게 사용되는 바와 같은 "항원"이란 용어는 항체 결합 부위에 의해 인식되는 전체 표적 분자 또는 이러한 분자의 단편을 지칭할 것이다. 구체적으로, 면역학적으로 관련된 "에피토프", 예를 들면, B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프로서 일반적으로 지칭되는 항원의 하위구조, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조는 이러한 결합 부위에 의해 인식될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "에피토프"란 용어는 특히 항체의 결합 부위에 대한 특정 결합 파트너를 완벽하게 구성하거나 또는 특정 결합 파트너의 부분일 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 에피토프는 탄수화물, 펩티드 구조, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 그의 유도체 및 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩티드 구조, 예를 들면, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 중에 포함되는 경우, 이는 대개 적어도 3개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 40개 아미노산, 보다 바람직하게는 약 10 내지 20개 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 배좌 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물쇄의 1차 서열의 단일 세그먼트로 구성된다. 선형 에피토프는 연속적이거나 또는 중첩될 수 있다.
배좌 에피토프는 폴리펩티드를 함께 폴딩시킴으로써 3차 구조를 형성하는 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며, 아미노산은 선형 서열에서 서로 반드시 인접할 필요는 없다. 구체적으로 및 폴리펩티드 항원에 관하여 배좌 또는 불연속 에피토프는 1차 서열에서 분리되었지만 폴리펩티드가 천연 단백질/항원으로 폴딩되는 경우 분자의 표면상에서 일치하는 구조로 조립되는 2개 이상의 별도의 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 한다. 구체적으로, 배좌 에피토프는 비-선형 정렬인, 즉 잔기들이 폴리펩티드 서열의 길이를 따라 비연속적인 방식으로 이격되거나 그룹화되는 일련의 아미노산 잔기들로 구성되는 에피토프이다. 이러한 배좌 에피토프는 아미노산 잔기들을 접촉시킴으로써 및/또는 결정학적 분석, 예를 들면, 특이적 항체 또는 Fab 단편에 의해 결합된 에피토프의 면역 복합체에 의해 형성된 결정의 분석에 의해 측정된 바와 같은 특정 구조 좌표를 갖는 3차원 구조를 특징으로 한다.
본원에서 용어 "에피토프"는 특히 항체에 의해 인식되는 단일 에피토프, 또는 각각 교차 반응성 항체에 의해 인식되는 일련의 에피토프 변이체를 지칭할 것이다.
본 발명의 항체에 의해 표적화된 특이적 교차 반응성 에피토프는 서열번호 145의 컨센서스 서열에 혼입될 수 있거나 이러한 컨센서스 서열에 대한 천연 리간드의 결합을 방해할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 항-IGBP 항체는 돌연변이체 IGBPKK 또는 IGBPKKAA와 적어도 실질적으로 동일한 정도로 야생형 IGBP에 결합할 수 있다. 구체적으로, 본원에 기재된 항-IGBP 항체는, 예를 들면, (SpA 및 Sbi 도메인 각각에 포함된 야생형 IGBP의) 서열번호 145의 이러한 컨센서스 서열에 우선적으로 결합하는 야생형 IGBP에 우선적으로 결합하고, 돌연변이체 IGBP 도메인의 서열에 보다 적은 정도로만 결합할 수 있다.
IGBPKK로서 지정된 IGBP 돌연변이체(예: SpA-AKK, SpA-BKK, SpA-CKK, SpA-DKK, SpA-ΕKK, Sbi-IKK, SBi-IIKK)는 다음 서열을 포함한다:
서열번호 147
KKXAFYXXL
여기서,
위치 3의 X는 N, S 또는 K 중의 하나이고,
위치 7의 X는 E, Q 또는 N 중의 하나이고,
위치 8의 X는 I 또는 V 중의 하나이다.
IGBPKKAA로 지정된 IGBP 돌연변이체(예: SPA-AKKAA, SPA-BKKAA, SPA-CKKAA, SPA-DKKAA, SPA-EKKAA)는 서열번호 147의 서열을 포함하고, 서열번호 148을 추가로 포함한다:
서열번호 148
QRNGFIQSLKAAPSXS
여기서,
위치 15의 X는 Q 또는 V 중의 하나이다.
각각의 SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D 및 SpA-E에 포함된 각각의 야생형 컨센서스 서열은 다음과 같다(서열번호 146):
서열번호 146
QRNGFIQSLKDDPSXS
여기서,
위치 15의 X는 Q 또는 V 중의 하나이다.
본 발명은 구체적으로, 예를 들면, 교차-반응성 발견 선택 구조에 의해 다중 특이성을 갖는 중화 항체를 동정하는 과정에 의해 수득되는 교차-반응성 항체를 사용한다. 따라서, 2개의 표적, 표적 A 및 B와 반응성을 나타내는 항체들을 포함하는 항체 라이브러리를 먼저 상기 표적 중 하나, 예를 들면, 표적 A와의 반응성을 위해 선택한 다음, 다른 표적, 예를 들면, 표적 B와의 반응성을 위해 선택할 수 있다. 각각의 연속적인 선택 라운드는 두 표적 모두에 대해 생성되는 풀의 반응성 강도를 강화시킨다. 따라서, 이 방법은 2개의 상이한 표적에 대해 지시된 교차-반응성, 및 병원체를 교차-중화시키는 잠재성을 갖는 항체를 동정하는 데 특히 유용하다. 상기 방법은, 추가적인 표적(들)에 대한 추가의 농축 라운드를 포함시킴으로써 추가의 표적들에 대해 반응성을 보이는 항체를 동정하는 데까지 확장시킬 수 있다.
일부의 경우에, 교차-반응성 항체는 단일 항원에 대한 스크리닝을 통해 드러난다. 교차-반응성 클론의 단리 가능성을 증가시키기 위해서, 다중 항원에 대한 점진적인 스크리닝에 의한 다중 선택압을 적용할 수 있다. 특정 mAb 선택 전략은 상이한 독소 성분들 또는 상이한 독소 변이체, 또는 상이한 IGBP 도메인을 교호 방식으로 사용한다.
예를 들면, 독특한 접근법에 따라서, 고친화도 완전 인간 모노클로날 항체는 야생형 (비돌연변이된) IgG 결합 도메인 서열을 사용하는 각각의 항체 라이브러리 및 VH3 서브-계열이 없는 인간 IgG의 시험관내 발현 라이브러리로부터 선택된다.
도 2에 제공된 각 서열을 사용하는 재조합 기술에 의해 생성된 재조합 IGBP 도메인은 항체 라이브러리, 예를 들면, 효모 플랫폼 유도 항체 라이브러리로부터 항체를 선택하는데 사용할 수 있다[참조: Blaise L, Wehnert A, Steukers MP, van den Beucken T, Hoogenboom HR, Hufton SE. Construction and diversification of yeast cell surface displayed libraries by yeast mating: application to the affinity maturation of Fab antibody fragments. Gene. 2004 Nov 24;342(2):211-8; Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7; Kuroda K, Ueda M. Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology. Biotechnol Lett. 2011 Jan;33(1):1-9. doi: 10.1007/s10529-010-0403-9. Review; Lauer TM, Agrawal NJ, Chennamsetty N, Egodage K, Helk B, Trout BL. Developability index: a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity. J Pharm Sci. 2012 Jan;101(1):102-15; Orcutt K.D. and Wittrup K.D. (2010), 207-233　doi: 10.1007/978-3-642-01144-3_15; Rakestraw JA, Aird D, Aha PM, Baynes BM, Lipovsek D. Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins. Protein Eng Des Sel. 2011 Jun;24(6):525-30; 미국 특허 제6,423,538호; 미국 특허 제6,696,251호; 미국 특허 제6,699,658호; 공개된 PCT 출원 공보 제WO2008118476호].
어느 경우든, 반응성 또는 교차-반응성은 당해 분야에 공지된 항체 최적화 방법에 의해 추가로 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 면역글로불린 쇄의 가변 영역 중 특정 영역은 경쇄 셔플링, 목적 돌연변이유발, CDR 융합, 및 선택된 CDR 및/또는 프레임워크 영역의 지시된 돌연변이유발을 포함하는 하나 이상의 최적화 전략에 적용할 수 있다.
목적하는 중화 성질을 갖는 항체를 동정하기 위한 스크리닝 방법은 옵소닌 식균 활성, 표적 면역글로불린에 대한 IGBP 결합의 억제, 또는 동물에 대한 생체내 효과(사망, 용혈, 지나친 염증, 기관 기능장애)의 억제일 수 있다.
일단 목적하는 성질을 갖는 반응성 또는 교차-중화성 항체가 동정되었으면, 상기 항체에 의해 인식되는 우세한 에피토프 또는 에피토프들을 측정할 수 있다. 에피토프 맵핑 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Epitope Mapping: A Practical Approach, Westwood and Hay, eds., Oxford University Press, 2001]에 개시되어 있다.
"발현"이란 용어는 하기의 방식으로 이해된다. 발현 생산물, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 목적하는 코딩 서열, 및 조절 서열, 예를 들면, 작동성 연결에서 프로모터를 함유하는 핵산 분자를 발현 목적에 사용할 수 있다. 이들 서열에 의해 형질전환되거나 형질감염된 숙주는 코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 형질전환을 수행하기 위해서, 발현 시스템을 벡터에 포함시킬 수 있으나; 관련 DNA는 또한 숙주 염색체에 통합될 수도 있다. 구체적으로, 상기 용어는, 예를 들면, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입되는 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현에 적합한 조건하의 숙주 세포 및 양립성 벡터를 지칭한다.
코딩 DNA는, 예를 들면, 항체와 같은 특별한 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 코딩 DNA의 발현을 개시하거나, 조절하거나, 또는 달리 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 코딩 DNA는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 유래할 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래할 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들면, 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
본 발명에 사용된 "벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 적합한 숙주 유기체에서 그들의 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로서 정의된다.
"발현 카세트"는 정의된 제한 부위에서 벡터내에 삽입될 수 있는 발현 생산물을 코딩하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 카세트 제한 부위는 적절한 판독 프레임에 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 일반적으로, 외래 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입된 다음, 상기 벡터에 의해 전달 벡터 DNA와 함께 숙주 세포내로 운반된다. 삽입되거나 부가된 DNA를 갖는 DNA의 세그먼트 또는 서열, 예를 들면, 발현 벡터는 또한 "DNA 작제물"이라 지칭될 수 있다.
발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며, 추가로 일반적으로 숙주 세포 중 자율 복제 기원 또는 게놈 삽입 부위, 하나 이상의 선택성 마커(예: 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 칸나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결자를 포함하고, 이들 성분들은 함께 작동적으로 연결된다. 본원에 사용된 바와 같은 "벡터"란 용어는 자율 복제 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 게놈 통합 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 통상적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 일반적으로, 추가적인 (외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포내에 쉽게 도입될 수 있는 이본쇄 DNA의 자립 분자이다. 플라스미드 벡터는 종종 코딩 DNA 및 프로모터 DNA를 함유하며, 외래 DNA의 삽입에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 구체적으로, "벡터" 또는 "플라스미드"란 용어는 DNA 또는 RNA 서열(예: 외래 유전자)이 숙주 세포에 도입되어 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예: 전사 및 번역)을 촉진시킬 수 있는 비히클을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"란 용어는 특별한 재조합 단백질, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 항체, 및 그의 임의의 자손을 생산하도록 형질전환된 1차 대상체 세포를 지칭한다. 모든 자손이 모체 세포와 정확하게 동일할 필요는 없으나(의도적인 또는 우연한 돌연변이 또는 환경상 차이로 인해), 이러한 변경된 자손은 상기 자손이 최초로 형질전환된 세포와 동일한 기능성을 유지하는 한 이러한 용어에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. "숙주 세포주"란 용어는 재조합 폴리펩티드, 예를 들면, 재조합 항체를 생산하도록 재조합 유전자를 발현하는데 사용되는 바와 같은 숙주 세포의 세포주를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "세포주"란 용어는 연장된 기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. 이러한 숙주 세포 또는 숙주 세포주를 세포 배양물 중에 유지시키고/시키거나 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 배양할 수 있다.
항체 또는 항체 단편은, 예를 들면, 하이브리도마 기술 또는 재조합 DNA 기술을 포함하는 당해 기술 분야에 익히 공지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들면, 햄스터를 면역시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역시킬 수도 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다.
하이브리도마 세포가 생장하는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들면, 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정된다.
재조합 모노클로날 항체는, 예를 들면, 필요한 항체 쇄를 코딩하는 DNA를 단리시키고 재조합 숙주 세포를 익히 공지된 재조합 발현 벡터, 예를 들면, 항체 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트(들)를 사용하여 발현을 위한 코딩 서열로 형질감염시킴으로써 생성시킬 수 있다. 재조합 숙주 세포는, 예를 들면, 세포 배양물 중 동물 또는 인간 세포주를 포함하는 원핵생물 및 진핵생물 세포일 수 있다.
특정 국면에 따라서, 코딩 뉴클레오티드 서열은 항체를 인간화시키거나, 친화도 또는 항체의 다른 특성을 개선시키기 위한 유전자 조작을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체가 인간의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우, 불변 영역은 인간 불변 영역에 보다 가깝게 닮도록 조작하여 면역 반응을 피할 수 있다. 항체 서열을, 표적 독소에 대해 더 큰 친화도를 수득하고 에스. 아우레우스에 대해 보다 큰 효능을 수득하기 위해서 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항체에 대해 수행될 수 있고, 표적 항원에 대한 이의 결합 능력을 여전히 유지할 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다.
다양한 수단에 의한 항체 분자의 생성은 일반적으로 충분히 이해되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6331415호(Cabilly et al.)는 중쇄 및 경쇄가 단일 벡터 또는 단일 세포 중 2개의 별도의 벡터로부터 동시에 발현되는 항체의 재조합 생성 방법을 기재한다. 문헌[참조: Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)] 및 문헌[참조: Lee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101 :189-198)]은 이. 콜라이(E. coli)의 별도의 배양물에서 발현된 플라스미드를 사용하여 별도로 생성된 중쇄 및 경쇄로부터 모노클로날 항체를 생성시키는 방법을 기재한다. 항체의 생성에 관련된 다양한 다른 기술들이, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]에 제공된다.
특정 국면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체의 생성을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
항체 코딩 핵산은 임의의 적합한 특성을 가질 수 있으며, 임의의 적합한 특징들 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항체 코딩 핵산은 DNA, RNA 또는 이의 하이브리드 형태로 존재할 수 있으며, 비-천연 염기, 변형된 주쇄, 예를 들면, 핵산의 안정성을 촉진하는 포스포로티오에이트 주쇄, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 핵산은 유리하게는 표적 숙주 세포(들)에서 목적하는 발현, 복제 및/또는 선택을 촉진하는 특징들을 포함하는 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 플라스미드 중에 통합시킬 수 있다. 이러한 특징의 예는 복제 성분의 기원, 선택 유전자 성분, 프로모터 성분, 인핸서 요소 성분, 폴리아데닐화 서열 성분, 종결 성분 등을 포함하며, 이들의 다수의 적합한 예는 공지되어 있다.
본 명세서는 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 추가로 제공한다. 이들 재조합 작제물은 임의의 개시된 항체를 코딩하는 DNA 분자가 삽입되는 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 함께 사용된다.
경우에 따라, 예시된 항체 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 또는 증식을 위해 벡터로 클로닝시킬 수 있다. 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 중 벡터에 유지시킬 수 있고, 이어서 숙주 세포는 장래의 사용을 위해 확대시키고 동결시킬 수 있다. 세포 배양물 중의 재조합 모노클로날 항체의 생성은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터 항체 유전자의 클로닝을 통해 수행될 수 있다.
모노클로날 항체는 전형적으로 배양물 중에서 연속적인 세포주에 의해 항체 분자를 생성시키는 임의의 방법을 사용하여 생성시킨다. 모노클로날 항체의 제조에 적합한 방법들의 예는 하이브리도마 방법[참조: Kohler et al., (1975, Nature 256:495-497)] 및 인간 B-세포 하이브리도마 방법[참조: Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; 및 Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63]을 포함한다.
항체에 관하여 본원에 사용된 바와 같은 "단리된" 또는 "단리"란 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록 자연적으로 결합되었을 수도 있는 환경으로부터 충분히 분리된 이러한 화합물을 지칭할 것이다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공적 또는 합성적 혼합물의 배제, 또는 근본적인 활성을 방해하지 않으며, 예를 들면, 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 반드시 의미하는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 또한 천연이 아닌, 예를 들면, 코돈 최적화된 핵산 또는 cDNA이거나 화학적으로 합성된 것들을 포함함을 의미한다.
마찬가지로, 일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체는 구체적으로, 예를 들면, 조합이 자연에서 발생하지 않는 다른 항체와의 병용 제제(예: 하나 이상의 단일특이적 항체 및/또는 적어도 두 개의 상이한 표적을 인식하는 교차 특이적 항체와의 조합)로 제공된 바와 같은 비천연이거나 천연 항체의 최적화된 또는 친화도 성숙된 변이체 또는 항체의 제조능을 개선시키도록 조작된 프레임워크-영역을 갖는 항체이다.
본 발명의 핵산에 관하여, "단리된 핵산"이란 용어가 때때로 사용된다. 이 용어는 DNA에 적용될 때, 기원되는 유기체의 천연 게놈에서 바로 인접한 서열들로부터 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들면, "단리된 핵산"은 벡터, 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입되거나, 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA에 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용될 때, "단리된 핵산"이라는 용어는 주로 상기 정의된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 코딩되는 RNA 분자를 지칭한다. 대안적으로, 상기 용어는 천연 상태(즉, 세포 또는 조직 중에서)로 결합될 수 있는 다른 핵산으로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 지칭할 수 있다. "단리된 핵산"(DNA 또는 RNA)은 또한 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 생성되고 그의 생성 동안 존재하는 다른 성분들로부터 분리된 분자를 나타낼 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들면, 단리된 항체와 관련하여, "단리된"이란 용어는 구체적으로 그들이, 자연 환경, 또는 이러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실행된 재조합 DNA 기술에 의해 제조시 그들이 제조되는 환경(예: 세포 배양물)에서 함께 발견되는 다른 화합물과 같이, 자연적으로 결합된 물질이 없거나 실질적으로 없는 화합물을 지칭할 것이다. 단리된 화합물은 희석제 또는 애쥬반트와 함께 제형화될 수 있으며, 더욱이 단리를 목적으로, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 진단 또는 치료법에 사용할 때, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합할 수 있다. 본원에 사용된 "단리된 항체"란 용어는 구체적으로 항체를 코딩하는 인공 핵산 작제물로 형질전환된 재조합 숙주 세포 또는 화학적으로 합성된 것들을 배양함으로써 생성되는 것과 같은 세포 배양물로부터 수득된 재조합 항체 또는 모노클로날 항체를 포함함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "IGBP" 및 "IGBP 도메인"이란 용어는 구체적으로 나선 1 및 2에 위치된 보존된 잔기를 통해 IgG(Fc)의 불변 영역에 결합할 수 있는 삼중 나선 구조를 갖는 5개의 SpA 및 2개의 Sbi 도메인(SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D, SpA-E, Sbi-I, Sbi-II) 중 어느 하나로서 이해되고(참조: Deisenhofer, J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of Protein A from S. aureus at 2.9- and 2.8-A resolution, Biochemistry 20, 1981, 2361), SpA 도메인은 VH3 생식세포계열을 갖는 면역글로불린의 가변 영역과 상호작용하는 나선 2 및 3 상에 추가의 결합 부위를 갖는다(참조: Graille, SV1. et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: Structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, 5399). IGBP 도메인의 무독성 KKAA 변이체는 Fc 및 VH3에 대한 결합을 감소시킨다(참조: WO 2014/179744A1, US 2014/0170134).
"중화하는" 또는 "중화"란 용어는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 중화가 달성되는 기전에 관계없이 병원체에 대응하거나, 병원체, 예를 들면, 에스. 아우레우스가 대상체를 감염시키는 것을 억제하거나, 또는 상기 병원체가 강한 독성 인자를 생성시킴으로써 감염을 촉진하는 것을 억제하거나, 또는 독성 인자가 대상체에서 이의 효과를 발휘하는 것을 억제하는 임의의 분자를 지칭한다. 중화는, 예를 들면, 표적 세포 상에서 또는 용액 중에서 분자에 대한 이의 결합을 갖는 에스. 아우레우스 독성 인자(들)의 결합 및/또는 상호작용을 억제하는 항체에 의해 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 독성 인자 활성을 억제할 수 있고, 여기서 독성 인자와 숙주 사이의 상호작용의 생체내 또는 시험관내 효과는 감소되거나 제거된다. IGBP 도메인의 경우, 중화는 에스. 아우레우스의 IGBP에 의한 간섭 없이 에스. 아우레우스의 표면 항원에 대한 혈청 IgG 결합에 의한 공격을 가능하게 함으로써 발생할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 항체는 OPK를 촉진시킴으로써 에스, 아우레우스에 대항한다.
"스타필로코커스 아우레우스" 또는 "에스. 아우레우스" 또는 "병원성 에스. 아우레우스"란 용어는 하기의 방식으로 이해된다. 스타필로코커스 아우레우스 세균은 통상적으로 사람 및 동물의 피부상에서 또는 코안에서 발견된다. 세균은 자상 또는 다른 상처를 통해 체내로 들어가지 않는 한 일반적으로는 무해하다. 전형적으로, 감염은 건강한 사람에게는 최소한의 피부 문제이다. 역사적으로, 감염은 메티실린과 같은 광범위한 항생제에 의해 치료되었다. 그러나, 현재 메티실린 및 다른 베타-락탐 항생제, 예를 들면, 페니실린 및 세팔로스포린에 내성인 몇몇 균주들이 출현하였다. 그들은 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(또한 다중약물 내성 스타필로코커스 아우레우스, 또는 "MRSA"로서 공지됨)라 지칭한다.
중요한 인간 병원체인 스타필로코커스 아우레우스는 다수의 분비된 독소(외독소)를 발현한다. 이들은 적혈구, 호중구 과립구 및 다른 면역 세포뿐만 아니라 폐 또는 피부의 상피세포를 포함하는 다양한 숙주 세포 유형을 공격할 수 있다. 에스. 아우레우스 독소의 중요한 구성원은 림프구, 대식세포, 폐 상피세포 및 폐 내피 세포 상에서 세포용해 기능을 발휘하는 알파 용혈소(Hla)이다.
MRSA를 포함한 에스. 아우레우스 감염은 일반적으로 여드름, 종기 또는 거미에 물린 상처를 닮은 작은 적색 혹으로 시작한다. 이러한 혹 또는 흠은 외과 배수가 필요한 심부의 고통스러운 농양으로 빠르게 변할 수 있다. 때때로, 세균은 피부에 국한된 채로 잔류한다. 때때로, 그들은 체내에 깊게 파고들어 피부, 연조직, 뼈, 관절, 수술 상처, 혈류, 심장 판막, 폐 또는 다른 기관을 포함하는 광범위한 인간 조직에 잠재적으로 생명-위협적인 감염을 야기할 수 있다. 따라서, 에스. 아우레우스 감염은 그와 관련된 질환 상태를 생성시킬 수 있으며, 이는 괴사성 근막염, 심내막염, 패혈증, 균혈증, 복막염, 독성 쇼크 증후군, 및 괴사성 폐렴을 포함한 다양한 형태의 폐렴, 및 절종증 및 카르분클증에서의 독소 생성과 같은 잠재적으로 치명적인 질환이다. MRSA 감염은, 환자들이 상처, 침습성 장치 및 약해진 면역계에 개방될 위험이 있거나 경향이 있고 따라서 일반적인 대중보다 더 큰 감염 위험에 처하게 되는 병원 또는 요양 환경에서 특히 문제가 된다.
에스. 아우레우스 독소를 중화시키는 항체는 상기 병원체 및 병원성 반응을 방해하며, 따라서 감염을 제한하거나 예방하고/하거나 이러한 감염으로부터 초래되는 질환 상태를 개선시키거나, 또는 에스. 아우레우스 병인, 특히 폐렴, 복막염, 골수염, 균혈증 및 패혈증 병인을 억제할 수 있다. 이와 관련하여, "보호 항체"는 본원에서 능동 또는 수동 면역성에서 관찰되는 감염제에 대한 면역성의 원인이 되는 중화 항체로서 이해된다. 특히, 본원에 기재된 보호 항체는 분비된 독성 인자(외독소)의 독성 효과(예: 세포용해, 표적 세포에 의한 점염증성 사이토카인 발현의 유도)를 중화시킬 수 있으며, 따라서 에스. 아우레우스의 병원성 잠재성을 방해할 수 있다.
본원에 사용된 "재조합"이란 용어는 "유전 공학에 의해 또는 이의 결과에 의해 제조됨"을 의미한다. 재조합 숙주는 구체적으로 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 또는 이는 특히 숙주에 대해 외래인 뉴클레오티드 서열을 사용하는 재조합 핵산 서열을 함유하도록 유전자 조작되었다. 재조합 단백질은 숙주에서 각각의 재조합 핵산을 발현시킴으로써 생성된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "재조합 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체, 예를 들면, (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마에 대한 유전자 이식 또는 트랜스염색체성 동물(예: 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들면, 형질감염종(transfectoma)으로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 항체는, 예를 들면, 항체 성숙 동안발생하는 재배열 및 돌연변이를 포함하도록 조작된 항체들을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "특이성" 또는 "특이적 결합"이란 용어는 분자의 이종 집단에서 관심의 동족 리간드를 측정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지시된 조건(예: 면역검정 조건)하에서, 항체는 그의 특정 표적에 특이적으로 결합하며, 샘플 중에 존재하는 다른 분자에는 현저한 양으로 결합하지 않는다. 특이적 결합은 결합이, 선택시 표적 동일성, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화도 또는 결합능과 관련하여 선택적임을 의미한다. 선택적 결합은 일반적으로 결합 상수 또는 결합 역학이 또 다른 항원과 비교시, 적어도 10배 상이하고(적어도 1 로그 차이로서 이해됨), 바람직하게는 차이가 적어도 100배(적어도 2 로그 차이로서 이해됨), 보다 바람직하게 적어도 1000배(적어도 3 로그 차이로서 이해됨)인 경우에 달성된다.
"특이성" 또는 "특이적 결합"이란 용어는 또한 하나 이상의 분자에 결합하는 결합제, 예를 들면, 교차-특이적 결합제에 적용되는 것으로 이해된다. 적어도 2개의 상이한 항원(예: IGBP의 상이한 도메인)을 표적화하고, 적어도 2개의 상이한 항원상의 교차-반응성 에피토프를 표적화하는 바람직한 교차-특이적 (또한 다중특이적 또는 교차-반응성이라 지칭됨) 결합제는 실질적으로 유사한 결합 친화도, 예를 들면, 100배 미만 차이 또는 심지어 10배 미만 차이의 친화도로 항원에 특이적으로 결합한다.
예를 들면, 교차-특이적 항체는 교차-반응성 에피토프를 수반하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다. 항체의 이러한 결합 부위 또는 및 적어도 2개의 상이한 항원 또는 적어도 2개의 상이한 항원의 교차-반응성 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는 항체는 또한 각각 다중특이적 또는 교차-특이적 결합 부위 및 항체라 지칭한다. 예를 들면, 항체는 에피토프 내에 서열 상동성, 및/또는 구조적 유사성을 갖는 다수의 상이한 항원을 교차 반응성인 에피토프에 특이적으로 결합시키는 다중특이적 결합 부위를 가져 본질적으로 동일한 구조의 배좌 에피토프, 교차 반응성인 적어도 상이한 유형의 SpA-E 도메인 및 2개의 추가의 IGBP 도메인, 또는 교차 반응성인 적어도 2개의 상이한 균주의 동일한 유형의 IGBP 도메인을 제공할 수 있다.
항체의 면역특이성, 이의 결합 능력 및 항체가 교차-반응성 결합 서열에 대해 나타내는 수반되는 친화도는 항체가 면역반응하는(결합하는) 교차-반응성 결합 서열에 의해 측정된다. 교차-반응성 결합 서열 특이성은 적어도 부분적으로 면역글로불린 항체의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 잔기 및/또는 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 서열에 의해 정의될 수 있다.
"동일한 특이성을 갖는", "동일한 결합 부위를 갖는" 또는 "동일한 에피토프에 결합하는"이란 용어의 사용은 등가의 항체가 동일하거나 또는 본질적으로 동일한, 즉 유사한 면역반응(결합) 특성을 나타내며 사전-선택된 표적 결합 서열에의 결합에 대해 경쟁함을 나타낸다. 특정 표적에 대한 항체 분자의 상대적인 특이성은, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]에 기재된 바와 같이, 경쟁 검정에 의해 상대적으로 측정될 수 있다.
특히, 변이체의 기능적 활성은, 예를 들면, 각각의 모체 항체와 동일한 에피토프 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합시킴으로써 표적 항원(들)에 대한 특이성에 의해 측정된다.
만약 항체가 교차-경쟁하여 단 하나의 항체만이 소정의 시점에서 에피토프에 결합할 수 있다면, 즉 한 항체가 다른 항체의 결합을 방지하거나 그의 효과를 조절한다면, 항체는 "동일한 에피토프에 결합하고" 또는 "동일한 결합 부위를 포함하고" 또는 "실질적으로 동일한 결합" 특성을 갖는 것이라고 간주된다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "경쟁하다" 또는 "교차-경쟁하다"는 제1 항체와 이의 동족 에피토프의 결합 결과가 제2 항체의 부재시 제1 항체의 결합에 비해 제2 항체의 존재시 검출 가능하게 감소되도록, 제1 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 제2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 제2 항체의 이의 에피토프에 대한 결합이 또한 제1 항체의 존재시에 검출 가능하게 감소되는 대안이 있을 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 즉, 제1 항체는, 제2 항체가 제1 항체의 이의 각각의 에피토프에의 결합을 억제하지 않으면서, 제2 항체의 이의 에피토프에의 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프의 결합을 동일하거나, 더 높거나, 더 낮은 수준으로, 검출 가능하게 억제하는 경우, 항체는 이들 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁한다"고 간주된다. 경쟁 및 교차-경쟁하는 항체 모두가 본 발명에 포함된다.
본원에서 경쟁은 경쟁 ELISA 분석 또는 ForteBio 분석에 의해 측정되는 바와 같이 약 30%보다 더 큰 상대적 억제를 의미한다. 경쟁 분석이 에스. 아우레우스의 추가의 또는 다른 IGBP 도메인의 결합의 의도된 기능을 갖도록 설계된 새로운 항체를 선택하거나 스크리닝하는데 사용되는 경우와 같이 특별한 맥락에서 적합한 수준의 경쟁의 기준으로서 상대적 억제의 더 높은 임계값을 설정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항체가 충분히 경쟁적인 것으로 고려되기 전에, 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 심지어 적어도 100%의 상대적 억제가 검출되는 경쟁적 결합에 대한 기준을 설정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "대상체"란 용어는 온혈 포유동물, 특히 인간 또는 비-인간 동물을 지칭할 것이다. MRSA는 수의학에 또한 출현 우려가 있는 결정적으로 중요한 인간 병원체이다. 이는 광범위한 비-인간 동물 종에 존재한다. 따라서, "대상체"란 용어는 또한 특히 개, 고양이, 토끼, 말, 소, 돼지 및 가금류를 포함하는 동물을 지칭할 수 있다. 특히 본 발명의 의학적 용도 또는 각각의 치료 방법은 에스. 아우레우스 감염과 관련된 질환 상태의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 적용한다. 대상체는 스타필로코커스 아우레우스 감염의 위험이 있거나 또는 초기 또는 말기 질환을 포함하는 질환을 앓고 있는 환자일 수 있다. "환자"란 용어는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다. 따라서 "치료"란 용어는 예방적 및 치료적 치료 모두를 포함함을 의미한다.
대상체는, 예를 들면, 에스. 아우레우스 질환 상태의 예방 또는 치료를 위해 치료된다. 특히, 감염의 위험이 있거나 또는 이러한 질환 또는 질환 재발이 발생할 위험이 있는 대상체, 또는 이러한 감염 및/또는 이러한 감염과 관련된 질환을 앓고 있는 대상체가 치료된다.
구체적으로 "예방"이란 용어는 병인의 개시의 방지를 포함하고자 하는 예방적 조치 또는 병인의 위험을 감소시키기 위한 예방적 조치를 지칭한다.
구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 대상체에서 질환 상태를 치료하거나, 예방하거나 지연시키는 방법은 상기 상태의 원인 제제로서 에스. 아우레우스의 병인을 방해함에 의하며, 여기서 상기 병인은, 예를 들면, 특정 독성 인자 또는 독소에 의한 대상체의 세포막 상의 기공 형성 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"이란 용어는 화합물, 예를 들면, 핵산 분자 또는 항체의 적어도 50% (w/w), 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 포함하는 제제를 지칭할 것이다. 순도는 화합물에 적합한 방법들(예: 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다. 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체는 구체적으로 세포 배양물로부터 정제되거나 실질적으로 순수한 단백질로서 제공된다.
화합물, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 "유효량" 또는 "충분량"이란 용어 중 임의의 것과 상호교환적으로 본원에서 사용된 "치료적 유효량"이란 용어는, 대상체에게 투여시, 임상 결과를 포함하여 이롭거나 목적하는 결과를 초래하기에 충분한 양 또는 활성이며, 그 자체로, 유효량 또는 이의 동의어는 적용되는 상황에 따라 변한다.
유효량은 이러한 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미하고자 한다. 질환과 관련하여, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 치료적 유효량은 구체적으로 에스. 아우레우스 또는 에스. 아우레우스 병인의 억제가 유리한 질환 또는 상태를 치료하거나, 조절하거나, 감소시키거나, 역전시키거나 또는 영향을 미치는데 사용된다.
이러한 유효량에 상응할 화합물의 양은 다양한 인자들, 예를 들면, 소정의 약물 또는 화합물, 약제학적 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 치료되는 대상체 또는 숙주의 정체 등에 따라 변할 것이지만, 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 통상적으로 측정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 병용 제제는 예방적으로 사용하여 에스. 아우레우스 감염의 개시를 억제하거나, 또는 치료적으로 사용하여 에스. 아우레우스 감염, 특히 무반응성인 것으로 공지된, 또는 특정 대상체의 경우, 다른 통상적인 항생제 요법에 의한 치료에 무반응성인 것으로 입증된 MRSA와 같은 에스. 아우레우스 감염을 치료할 수 있다.
항체가 필요한 인간 환자에게 제공되는 바와 같은, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 치료적 유효량은 구체적으로 0.5 내지 50㎎/㎏, 바람직하게는 5 내지 40㎎/㎏, 더욱 더 바람직하게는 20㎎/㎏ 이하, 10㎎/㎏ 이하, 5㎎/㎏ 이하의 범위일 수 있지만, 예를 들면, 급성 질환 상태를 치료하기 위해 더 높은 용량이 지시될 수도 있다. 병용 제제는 각각의 항체의 각각의 치료적 유효량을 함유할 수 있다.
더욱이, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 치료적 유효량에 의한 대상체의 치료 또는 예방 섭생은 단일 투여로 이루어지거나, 또는 대안적으로 일련의 적용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체는 적어도 1년에 1회, 적어도 반년에 1회, 또는 적어도 1개월에 1회 투여할 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 항체는 대상체에게, 소정의 치료에 대해 주당 약 1회 내지 대략 매일 투여로 투여할 수 있다. 치료 기간의 길이는 다양한 인자들, 예를 들면, 질환의 중증도, 급성 또는 만성 질환, 환자의 연령, 항체 포맷의 농도 및 활성에 따라 변한다. 치료 또는 예방에 사용되는 유효 투여량은 특정 치료 또는 예방 섭생의 과정 동안 증가시키거나 감소시킬 수 있음도 또한 인식될 것이다. 투여량의 변화가 생성될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 표준 진단 검정에 의해 명백해진다. 일부의 경우에, 만성 투여가 요구될 수 있다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 조합 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이들 약제학적 조성물은 본 발명에 따라 볼루스 주사 또는 주입으로서 또는 연속 주입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 투여 수단을 촉진하는데 적합한 약제학적 담체는 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 관련 조성물 또는 조합과 생리적으로 상용성인 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 추가의 예는 멸균수, 생리 식염수, 포스페이트 완충 생리 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
하나의 이러한 국면에서, 항체는 목적하는 투여 경로에 적합한 하나 이상의 담체와 조합할 수 있으며, 항체는, 예를 들면, 락토스, 수크로스, 전분, 알칸산, 스테아르산의 셀룰로스 에스테르, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 아카시아, 젤라틴, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리딘, 폴리비닐 알콜 중 임의의 것과 혼합될 수 있고, 통상적인 투여를 위해 임의로 추가로 정제화되거나 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 항체는 생리 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 에탄올, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 참깨유, 트라가칸트 검, 및/또는 다양한 완충제 중에 용해시킬 수 있다. 다른 담체, 애쥬반트, 및 투여 방식은 약학 분야에 익히 공지되어 있다. 담체는 조절 방출 물질 또는 시간 지연 물질, 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로, 또는 왁스 또는 당해 분야에 익히 공지된 다른 물질들과 함께 포함할 수 있다.
추가의 약제학적으로 허용되는 담체는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]에 기재되어 있다. 액체 제형은 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있으며, 부형제, 예를 들면, 현탁제, 가용화제, 계면활성제, 방부제 및 킬레이트제를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항체 및 하나 이상의 치료적 활성제가 제형화되는 약제학적 조성물이 고려된다. 항체의 안정한 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 저장용으로 제조한다. 생체내 투여용으로 사용되는 제형은 구체적으로 무균성, 바람직하게는 무균성 수용액 형태이다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과 또는 다른 방법에 의해 용이하게 달성된다. 본원에 개시된 항체 및 다른 치료적 활성제는 또한 면역리포솜으로서 제형화되고/되거나 미세캡슐에 포획될 수 있다.
본원에 기재된 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 경구, 피하, 정맥내, 비강내, 귀내, 경피, 점막, 국소, 예를 들면, 젤, 연고, 로션, 크림 등, 복강내, 근육내, 흡입 기술 또는 폐 전달 시스템을 사용하는 폐내, 질, 비경구, 직장 또는 안내를 포함하는 다양한 방식으로 수행할 수 있다.
비경구 투여용으로 사용되는 예시적인 제형은, 예를 들면, 무균 용액, 에멀젼 또는 현탁액으로서 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 것들을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체는, 예를 들면, 질환 변형 또는 예방 단독요법으로서 대상체에게 투여되는 유일한 치료적 활성제이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체는, 칵테일이, 예를 들면, 질환 변형 또는 예방 병용 요법으로서 대상체에게 투여되는 보다 치료적 활성제를 함유하도록 에스. 아우레우스를 치료하기 위해 칵테일 중의 추가의 항체와 조합된다. 예를 들면, 혼합물 또는 부분들의 키트 중에 조합된다.
대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 항체는 표준 치료, 예를 들면, 항생제, 스테로이드 및 비-스테로이드 염증 억제제, 및/또는, 예를 들면, 항균제 또는 소염제를 사용하는 다른 항체 기반 요법을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 하나 이상의 다른 치료제 또는 예방제와 함께 투여한다.
병용 요법은 특히, 예를 들면, MRSA 감염의 치료에 사용되는 바와 같은 표준 섭생을 사용한다. 이는 항생제, 예를 들면, 티게사이클린, 리네졸리드, 메티실린 및/또는 반코마이신을 포함할 수 있다.
병용 요법에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체는 혼합물로서, 또는 하나 이상의 다른 치료 섭생과 동반하여, 예를 들면, 동반 요법 전에, 동시에 또는 이후에 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 추가의 활성 물질을 다른 용기에 포함하는 치료적 사용을 위한 키트를 제공한다. 키트는 하나 이상의 항체 외에, 사용할 준비가 된 약제학적 제형을 제조하기 위한 다양한 다른 치료제 및 보조제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 치료 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함할 수도 있다. 이러한 설명서는, 예를 들면, 키트에 포함되는 장치 상에 제공될 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 키트는 항체를, 동결건조물을 재구성하고 가까운 기간 투여를 위한 주사성 조성물을 형성시키기 위해 사용전에 혼합될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체(들)와 함께, 동결건조된 형태로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 병용 제제 또는 각각의 약제학적 제제의 생물학적 성질은 세포, 조직 및 완전 유기체 실험으로 생체외에서 특성화할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 약물은 종종, 질환 또는 질환 모델에 대한 약물의 치료 효능을 측정하거나 또는 약물의 약동학, 약역학, 독성 및 다른 성질을 측정하기 위해, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이를 포함하지만, 이에 국한되지 않는 동물에서 생체내 시험한다. 상기 동물들은 질환 모델로서 지칭할 수도 있다. 치료제는 종종 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스 및 유전자 도입 마우스(녹인 및 녹아웃 포함)를 포함하지만, 이에 국한되지 않는 마우스에서 시험한다. 이러한 실험은 적합한 반감기, 이펙터 기능, (교차-) 중화 활성 및/또는 능동 또는 수동 면역요법에 대한 면역 반응을 갖는 치료제 또는 예방제로서 사용될 상기 항체의 가능성을 측정하는데 의미 있는 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유동물을 시험에 사용할 수 있다. 예를 들면, 인간에 대한 유전적 유사성으로 인해, 영장류인 원숭이가 적합한 치료 모델일 수 있으며, 따라서 대상 제제 또는 조성물의 효능, 독성, 약동학, 약역학, 반감기 또는 다른 성질을 시험하는데 사용될 수 있다. 약물로서의 승인을 위해서는 최종적으로 인간에서의 시험이 요구되며, 따라서 물론 이러한 실험이 고려된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 병용 제제 및 본 발명의 각각의 약제학적 조성물을 인간에서 시험하여 이들의 치료적 또는 예방적 효능, 독성, 면역원성, 약동학, 및/또는 다른 임상적 성질을 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 진단을 목적으로, 예를 들면, 생물학적 유체 샘플에서 면역시약 또는 표적으로서 IGBP의 농도를 검출하고 정량적으로 측정하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 대상 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플, 예를 들면, 체액을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하여, 상기 샘플 중 IGBP 또는 에스. 아우레우스 감염의 수준을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 임의의 공지된 검정 방법, 예를 들면, 경쟁 결합 (IgG-Fc 결합과의 경쟁에서의) 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 면역침전 검정 및 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)에 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 체액은 대상체의 생물학적 샘플, 예를 들면, 조직 추출물, 소변, 혈액, 혈청, 대변 및 객담을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은, 항체를 고체 지지체의 표면에 부착되게 하는 조건하에서 상기 고체 지지체를 특이적으로 표적, 예를 들면, 본 발명의 항체에 의해 표적화되는 IGBP 도메인 중 적어도 하나와 복합체를 형성하는 과량의 특정 유형의 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이어서, 상기 항체가 부착되는 생성되는 고체 지지체를, 생물학적 유체 중의 표적이 항체와 결합하여 표적-항체 복합체를 형성하도록 상기 생물학적 유체 샘플과 접촉시킨다. 복합체를 검출 가능한 마커로 표지화할 수 있다. 대안적으로, 표적 또는 항체는 복합체를 형성하기 전에 표지화할 수 있다. 예를 들면, 검출 가능한 마커(표지)를 항체에 접합시킬 수 있다. 이어서, 복합체를 검출하고 정량적으로 측정하여, 생물학적 유체 샘플 중의 표적의 농도를 검출하고 정량적으로 측정할 수 있다.
특정한 적용을 위해, 본 발명의 항체는 유기 분자, 효소 표지, 방사성 표지, 착색된 표지, 형광 표지, 발색성 표지, 발광 표지, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 금속 착체, 금속, 콜로이드성 금 및 이들의 혼합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 표지 또는 리포터 분자에 접합시킨다. 표지 또는 리포터 분자에 접합된 항체는, 예를 들면, 에스. 아우레우스 감염 또는 이와 관련된 질환 상태를 진단하기 위한 검정 시스템 또는 진단 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들면, 결합 검정(예: ELISA) 및 결합 연구에서 상기 접합체의 간단한 검출을 가능하게 하는 다른 분자에 접합시킬 수 있다.
다음 정의의 주제는 본 발명의 구현예로 고려된다:
1. 단백질 A(SpA) 도메인 및 면역글로불린 결합 단백질 (Sbi) 도메인 SpA-A, SpA-B, SpA-C, SpA-D, SpA-E, Sbi-I 및 Sbi-II로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역글로불린 결합 단백질(IGBP) 도메인 중 적어도 3개를 인식하는 교차 특이적 CDR 결합 부위를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 야생형 IGBP에 특이적으로 결합시킴으로써 에스. 아우레우스에 대항하거나 중화시키는 모노클로날 항체로서, 상기 항체가 F(ab)2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 5x10-9M 미만의 KD로 SpA-E에 결합하는 친화도를 갖는, 모노클로날 항체.
2. 정의 1에 있어서, 적어도 3개의 IGBP 도메인, 바람직하게는 적어도 4개, 5개 또는 6개의 IGBP 도메인을 인식하는, 항체.
3. 정의 1 또는 2에 있어서, 각각 5x10-9M 미만의 KD로 적어도 3개의 IGBP 도메인을, 바람직하게는 각각 5x10-9M 미만의 KD로 적어도 4개 또는 5개의 IGBP를 인식하는, 항체.
4. 정의 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, IgG Fc 또는 VH3에 대한 결합이 없는 돌연변이체 SpA와 비교하거나 돌연변이체 SpAKK 또는 SpAKKAA와 비교하여 적어도 실질적으로 동일한 친화도 또는 실질적으로 더 높은 친화도로 야생형 SpA를 인식하고, 바람직하게는 상기 야생형 SpA가, 바람직하게는 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 SpA-D 및 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 SpA-DKKAA에 결합하는 친화도를 비교함으로써 측정되는 바와 같이, 서열번호 145로 동정된 서열을 포함하고 임의로 서열번호 146으로 동정된 서열을 추가로 포함하는 임의의 SpA-도메인인, 항체.
5. 정의 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, SpA 및 Sbi 둘 다를 인식하는, 항체.
6. 정의 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, SpA 및 임의로 IgG-Fc에 결합하는 Sbi와 경쟁하는, 항체.
7. 정의 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 강화된 옵소닌 식균 작용 및 포식세포에 의한 살상에 의해 스타필로코커스 아우레우스를 중화시키는, 항체.
8. 정의 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 전장 모노클로날 항체, 상기 결합 부위를 도입하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편 또는 상기 결합 부위를 도입하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질인 항체로서, 구체적으로 상기 항체가 무작위화된 또는 인위적인 아미노산 서열을 포함하는 비천연 항체인, 항체.
9. 정의 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 표 1에 나열된 CDR1 내지 CDR3 서열 중의 어느 하나를 특징으로 하는 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 임의로 표 1에 나열된 CDR4 내지 CDR6 서열 중의 어느 하나를 특징으로 하는 항체 경쇄 영역(VL)을 포함하고, 이 CDR 서열이 카바트의 넘버링 시스템에 따라 지정되거나 전술한 임의의 것의 기능적 활성 CDR 변이체인, 항체.
10. 정의 9에 있어서,
a) 표 1에 나열된 임의의 CDR1 내지 CDR3 서열 조합을 특징으로 하는 VH 도메인, 및 표 1에 나열된 임의의 CDR4 내지 CDR6 서열 조합을 특징으로 하는 VL 도메인을 포함하고;
b) 표 1에 나열된 임의의 항체의 CDR 서열의 세트(CDR1-CDR6)를 포함하고;
c) 표 1에 나열된 임의의 항체이거나; 또는
d) a) - c)의 서열을 특징으로 하는 모체 항체의 기능적 활성 변이체이고,
바람직하게는, 여기서
i. 상기 기능적 활성 변이체가 상기 모체 항체의 임의의 CDR1-CDR6의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고/하거나;
ii. 상기 기능적 활성 변이체가 임의의 VH 및 VL 서열의 프레임워크 영역에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고;
추가로,
iii. 상기 기능적 활성 변이체가 상기 모체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖고/갖거나;
iv. 상기 기능적 활성 변이체가 상기 모체 항체의 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 및/또는 친화도 성숙 변이체인, 항체.
11. 정의 9 또는 10에 있어서, 표 1에 나열된 임의의 CDR 서열의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고, 상기 기능적 활성 CDR 변이체가
a) 상기 모체 CDR 서열 중의 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 및/또는
b) 상기 모체 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 어느 하나 중의 1 또는 2개의 점 돌연변이; 및/또는
c) 상기 모체 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성 중의 적어도 하나를 포함하고;
바람직하게는, 상기 기능적 활성 CDR 변이체가 임의의 CDR 서열에 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함하는, 항체.
12. 정의 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 다음 그룹 구성원 i) 내지 vi)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체.
i)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지고;
ii)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어지고;
iii)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 100의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 101의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 102의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 100의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 101의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 102의 아미노산 서열로 이루어지고;
iv)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 104의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 104의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어지고;
v)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 107의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 107의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어지고;
vi)
A) 상기 항체는
a) 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
임으로,
d) 서열번호 118의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
e) 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
f) 서열번호 120의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하고;
또는
B) 상기 항체는 A의 항체이고, 여기서 상기 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 상기 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
a) 상기 모체 CDR1은 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) 상기 모체 CDR2는 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어지고;
c) 상기 모체 CDR3은 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어지고;
d) 상기 모체 CDR4는 서열번호 118의 아미노산 서열로 이루어지고;
e) 상기 모체 CDR5는 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어지고;
f) 상기 모체 CDR6은 서열번호 120의 아미노산 서열로 이루어진다.
13. 정의 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 에스. 아우레우스 감염 또는 콜론화의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 대상체에게 상기 대상체에서 감염을 제한하거나 상기 감염으로부터 발생되는 질환 상태를 개선시키거나 폐렴, 패혈증, 균혈증, 상처 감염, 농양, 수술 부위 감염, 내안구염, 절종증, 카르분클증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염과 같은 에스. 아우레우스 질환 병인을 억제하기 위한 상기 항체의 유효량을 투여함을 포함하여 상기 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 항체.
14. 정의 1 내지 12 중 어느 하나의 항체를 포함하는, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하는, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 약제학적 제제.
15. 정의 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 괴사성 폐렴과 같은 고독소 생산 MRSA 감염, 및 절종증 및 카르분클증에서 독소 생산을 포함하는 임의의 에스. 아우레우스 감염을 검출하기 위한 진단 용도를 위한, 항체.
16. 임의로, 표지를 갖는 항체 및/또는 표지를 갖는 추가의 진단 시약을 함유하는, 정의 1 내지 12 중 어느 하나에 따르는 항체의 진단 제제.
17. 정의 1 내지 12 중 어느 하나에 따르는 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
18. 정의 1 내지 12 중 어느 하나에 따르는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현시키는 코딩 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트 또는 플라스미드.
19. 정의 18의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
20. 정의 1 내지 12 중 어느 하나에 따르는 항체의 생산 방법으로서, 정의 19에 따르는 숙주 세포를 상기 항체를 생산하기 위한 조건하에 배양하거나 유지시키는, 방법.
21. 모체 항체의 기능적 활성 변이체 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 모체 항체가 표 1에 나열된 CDR 서열에 의해 특성화되는 임의의 항체이고, 상기 방법이 임의의 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 변이체 항체를 수득하기 위한 상기 모체 항체의 임의의 CDR 서열에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 조작하는 단계 및 10-8M 미만, 바람직하게는 9x10-9M 미만의 KD로 SpA 및/또는 Sbi에 결합하는 이의 친화도에 의해 상기 변이체 항체의 기능적 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 기능적 활성의 측정시, 상기 기능적 활성 변이체 항체가 재조합 생산 방법에 의한 생산용으로 선택되는, 방법.
상기 설명은 다음 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 본 발명의 하나 이상의 구현예를 실행하는 방법의 대표일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: SpA 및 Sbi의 IgG 결합 도메인을 나타내는 단백질 베이트의 생성
에스. 아우레우스의 2개 IgG 결합 단백질, 즉 SpA 및 Sbi는 다중-도메인 단백질이고, 각각 5개 및 2개 IgG 결합 도메인을 함유한다(도 3). SpA 도메인 A-E는 63-91% 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 2개의 Sbi 도메인은 서로에 대해 또는 SpA 도메인에 대해 보다 적은 상동성이다(27-32%)(도 4a,b). 이들 도메인은 상이한 에스. 아우레우스 균주에서 고도로 보존되고, SpA는 C-말단에서 5개 IgG 결합 도메인의 외측에 서열 변동을 표시한다(서열번호 121-134). 에스. 아우레우스 IgG 결합 단백질에 결합하는 모노클로날 항체의 선택 및 특성화를 지지하기 위해, 단백질 A(SpA)의 5개 IgG 결합 도메인 및 Sbi의 2개 도메인을 이. 콜라이(E. coli) 터너 DE3 세포에서 재조합에 의해 생성했다. 7개 도메인의 DNA 서열은 스타필로코커스 아우레우스 균주 USA300_TCH1516(서열번호 135-141)의 공개된 게놈 서열로부터 유래했고, 이. 콜라이 발현을 위해 최적화시켰다. C-말단 Gly-Gly-Cys 아미노산을 각 유전자에 부가하여 비오틴을 사용한 부위-특이적 표지화를 가능하게 했다. pET16b에서 클로닝한 발현 플라스미드를 이. 콜라이 터너 DE3에 형질전환시키고, 세포를 0.6 내지 1.0의 OD600에 도달할 때까지 37℃에서 성장시키고, 4시간 동안 37℃에서 0.5mM IPTG로 유도했다. 세포 펠렛을 50mM 트리스(pH 7.5) + 150mM NaCl, 및 벤조나제, rLysosyme(Novagen) 및 프로테아제 억제제(Roche)를 함유하는 0.05% 트윈 20(완충액 A)에 재현탁시키고, 세포를 초음파처리에 의해 파쇄했다. 정화된 용액물을, 완충액 A로 평형화시킨 IgG-세파로즈 FF 친화도 매트릭스(트리콘 10/50 컬럼에 충전한 5ml, GE Healthcare)에 부하했다. 컬럼은 완충액 A로 세척한 다음, 5mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 세척하고, 단백질을 0.5M 나트륨 아세테이트(pH 3.4)로 용출시켰다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 중화시키고, 환원[약 2시간 동안 4℃에서 10mM 디티오트레이톨(DTT)로]시키고, 50mM 인산나트륨(pH 7.2) + 150mM NaCl에서 평형화시킨 수퍼덱스(Superdex) 75(16/60, GE Healthcare) 겔 여과 컬럼을 사용하여 추가로 정제했다. 단백질을 순도(SDS-PAGE에 의해) 및 단량체 상태(크기 배제에 의해) 뿐만 아니라, 기능성, 즉 실시예 2에 기재된 바와 같이 IgG1에 대한 결합(Fc 및 VH3 도메인을 통해)에 대해 검정했다. 모든 단백질을 설프하이드릴 반응성 시약 EZ-연결 비오틴-BCC(Thermo Scientific)로 C-말단 시스테인에 표지했다. 비-표지된 단백질을 위해, 유리 Cys를 요오도아세트아미드로 차단시켰다.
실시예 2: 효모 발현된 인간 IgG 라이브러리 및 야생형 서열을 갖는 SpA IgG 결합 도메인을 사용한 인간 모노클로날 항체의 발견
SpA 및 Sbi 결합 모노클로날 항체는 WO2009/036379A2 , WO2010105256 및 WO2012009568에 따라 개발된 효모-기반 항체 제시 라이브러리로부터 선택했다.
전장 인간 IgG1 항체를 대략 109 다양성으로서 발현하도록 조작된 효모 세포의 라이브러리를 상이한 농도의 천연 전장 길이 SpA(에스. 아우레우스 NCTC 8325로부터 정제됨, Sigma로부터 구매, cat# P6031) 또는 재조합 Spa-D 도메인과 함께 배양했고, 전자는 아미노산 시약 설포-NHS-LC(Thermo Scientific)을 사용하여 비오티닐화시키고, 후자는 상기한 바와 같다. Fab 도메인을 통한 비-특이적 결합을 회피하기 위해, 모든 VH3 생식세포계열 서열을 선택에 사용된 라이브러리로부터 제외했다. 이들 베이트에 대한 결합능을 갖는 항체를 발현하는 효모 세포는 자기 비드 선택, 및 몇몇 연속(최대 5회) 선택 라운드로 스트렙트아비딘 2차 시약을 사용하는 형광-활성화 세포 선별(FACS)에 의해 단리했다. 이어서, 항체를 선택된 효모 클론에 의해 생성하고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제했다. 표적 단백질에 대한 개별적인 가용성 mAb의 결합은 ForteBio Octet Red 기구[Pall Life Sciences]를 사용한 간섭계 측정에 의해 확인했고, 비오티닐화 항원을 스트렙트아비딘 센서 상에 고정시켜 약 2nm의 센서 부하를 제공했다. 용액(PBS, pH 7.2 + 1% BSA)에서 항체 F(ab')2 또는 F(ab) 단편(각각 50-100 및 100-200nM)의 회합 및 해리는 회합 상의 경우에 3 내지 10분 동안 및 해리 상의 경우에 3 내지 30분 동안 30℃에서 측정했다. 해리 상수(KD 값)는 Octet 데이터 분석 소프트웨어 버전 7을 사용하여 회합 및 해리 상을 1:1 결합 모델에 동시에 적합시켜 측정한 동적 파라미터(kon 및 koff)에 기초하여 계산했다.
선택의 최초 라운드에서, 고유한 서열을 갖는 46개 mAb가 2개 베이트로 발견되었다. 이들 항체의 비-Fc 단편 의존성 결합은, Fab 단편이 사용되었기 때문에, 친화도 측정에서 이미 입증되었다. 라이브러리는 VH3 생식세포계열을 함유하지 않도록 예비-선택되었기 때문에, Fab의 비-특이적 상호작용도 또한 배제했다.
전형적으로, Fab 및 F(ab')2 단편은 효모에서 생성된 전장 IgG의 각각 파파인 및 펩신 소화에 의해 제조했고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제했다. Fab 단편은 포획 선택 LC-카파에 의해 정제한 반면, F(ab')2 단편은 포획 선택 IgG-CH1 친화도 크로마토그래피(Life Techologies)에 의해 정제했다. 선택된 경우에서, mAb는, mAb 선택 SuRe(GE Healthcare) 친화도 크로마토그래피에 의해 정제된 완전 IgG로서 CHO 세포에서 생성되었고, F(ab)2 단편은 효모 항체에 대해 기재된 바와 같이 생성 및 정제했다.
46개 항체는 SpA의 5개의 상이한 IgG-결합 도메인에 대해 광범위한 결합 활성을 가졌고, 스트렙트아비딘 코팅된 센서 팁(5pg/ml) 상에 고정된 비오티닐화 재조합 도메인, 및 100nM 농도로 (PBS에서, pH 7.2, 1% BSA와 함께) 첨가된 IgG의 F(ab')2 도메인을 사용하여 ForteBio Octet에 의해 측정된 상이한 패턴을 나타냈다. 이 측정에서(도 5), 10분(30℃에서) 후의 결합 강도는 반응 단위(RU)로서 표시된다. 3개 mAb(10092, 10322 및 10323)는 모든 5개 도메인에 결합한 반면, 다른 것은 하나의 도메인 또는 2 내지 4개 도메인에만 결합했다. 예를 들면, 12개 mAb는 SpA 도메인 E(예: 10289, 10314 및 10319)에 특이적이었고, 하나는 도메인 A(10279) 또는 도메인 B(10296) 또는 도메인 C(10310)에 특이적이었다. 18개 항체는 3개 N-말단 도메인 E, D 및 A에 결합했다. 흥미롭게도, 다중-도메인 결합 항-SpA 항체도 또한 Sbi 도메인 I를 인식했다.
46개 항체 중의 12개 항체(도 5에서 볼드체로 나타냄)를 연속 선택 라운드에서 친화도 성숙을 위해 선택하여, 전체 77개 자손을 제공했다. 개선된 친화도로 SpA에 대한 증가된 항체 결합은 대부분의 계통의 자손에서 관찰되었다(도 6a, b에 도시된 예; 여기서, PBS(pH 7.2) + 1% BSA에서 30℃에서 스트렙트아비딘 센서에 고정된 비오티닐화 천연 SpA 또는 재조합 SpA 또는 Sbi 도메인에 대한 100nM Fab 또는 F(ab')2 단편의 회합은 3분 동안 측정한 반면(결합 반응을 수득하기 위해), 동일한 완충제에서 해리는 3분 동안 모니터링했다).
친화도 측정은 상기 기재된 바와 같이 ForteBio Octet Red 기구[Pall Life Sciences]를 사용하여 광학 간섭계에 의해 수행했다. 일반적으로, CHO 발현된 IgG로부터 유래된 F(ab')2는 보다 순수하고, 즉, 비-환원 SDS-PAGE로부터 판단된 바와 같이 보다 적은 Fab 오염을 나타냈고, 효모 IgG로부터 유래된 것들보다 높은 친화도(보다 낮은 해리 상수)를 나타냈다. 비교 목적을 위해, 2개 공급원으로부터 F(ab')2를 사용한 친화도 값은 표 1c에 제시되어 있다.
SpA KKAA와 비교하여 야생형(WT) SpA에 대한 항-SpA mAb의 선택성을 측정하기 위해, SpA-D(서열번호 138) 및 SpA-D KKAA(서열번호 143)에 대한 mAb의 결합은 상기 기재된 바와 같이 비오티닐화 항원을 사용하여 측정했다. SpA-D KKAA를 재조합에 의해 발현시키고, 야생형 도메인에 대해 기재된 바와 같이 정제하고 비오티닐화시켰고, 다만 Q 세파로즈 FF 컬럼(GE Healthcare) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 IgG 세파로즈 친화도 크로마토그래피 대신에 사용했고; 컬럼을 20mM 트리스(pH 8.0)에서 평형화시키고, 단백질을 동일한 완충제에서 0 내지 1M NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 항-SpA mAb는 SpA-D KKAA에 대해 우선성을 갖는 3F6과 반대로, KKAA 변이체에 대한 감소된 결합을 나타냈다(표 1c).
재조합에 의해 발현된 항체는 일련의 번역후 변형, 그 중에서, 특히 글루타민이 중쇄의 N-말단에 존재하는 경우, 피로글루타메이트 형성 및 중쇄로부터의 C-말단 리신 잔기의 절단의 경향이 있는 것으로 공지되어 있다[참조: Liu H, Ponniah G, Zhang HM, Nowak C, Neill A, Gonzalez-Lopez N, Patel R, Cheng G, Kita AZ, Andrien B. In vitro and in vivo modifications of recombinant and human IgG antibodies. MAbs. 2014;6(5):1 145-54]. 따라서, CHO 세포에서 발현된 선택된 항체의 경우, N-말단 글루타민은 글루타메이트로 돌연변이되었고, C-말단 리신은 샘플 이종원성을 회피하기 위해 제거되어, Q1ΕΔK 변이체(예: 서열번호 153, 155, 157, 159)를 제공했다. 이들 돌연변이는 mAb 특성, 즉 항원 결합 및 Fc 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 예상된다[참조: Liu H, Ponniah G, Zhang HM, Nowak C, Neill A, Gonzalez-Lopez N, Patel R, Cheng G, Kita AZ, Andrien B. In vitro and in vivo modifications of recombinant and human IgG antibodies. MAbs. 2014;6(5):1145-54].
항-SpA mAb의 Fc 영역에서 비-면역 SpA 결합 부위의 존재는 원칙적으로 2개의 기전에 의해 Fc 수용체 결합을 간섭할 수 있다. 가변 및 불변 영역 둘 다를 통한 mAb의 잠재적 원하는 결합은, Fc 감마 수용체의 계합을 방해할 수 있는 배향에서 세균 표면 상에 mAb를 제공할 것이다. 둘째, Fc가 표면 결합된 단백질 A와의 상호작용에 관여하지 않는 경우에도, 가용성 단백질 A(이는 세균 표면으로부터 탈락할 수 있다)는 세균 상에 제시된 항체와 결합/가교결합할 수 있고, Fc 감마 수용체의 결합을 입체적으로 방지할 수 있다. 두 기전은 손상된 Fc 감마 수용체 매개된 식균 작용을 제공할 수 있다. 따라서, 항-SpA의 Fc 영역에 mAb 돌연변이가 도입되었고, 이는 SpA 결합, 즉 His435Arg 및 Tyr436Phe를 감소/폐지하는 것으로 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Stapleton NM, Andersen JT, Stemerding AM, Bjarnarson SP, Verheul RC, Gerritsen J, Zhao Y, Kleijer M, Sandlie I, de Haas M, Jonsdottir I, van der Schoot CE, Vidarsson G. Competition for FcRn-mediated transport gives rise to short half-life of human lgG3 and offers therapeutic potential. Nat Commun. 201 1 Dec 20;2:599; W02003063772 A2]. 이들 돌연변이는 또한 천연 IgG3 이소타입에 존재하고, 이는 단백질 A 결합이 결여된 것으로 공지되어 있다. 더욱이, 이들 잔기는 Fc 감마 수용체 결합 부위로부터 떨어진 CH2-CH3 계면에서 발견되고, 이 돌연변이는 항체의 면역 기능을 간섭하지 않을 것으로 예상된다[참조: Deisenhofer, J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of Protein A from S. aureus at 2.9- and 2.8-A resolution, Biochemistry 20, 1981, 2361; Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG. High resolution mapping of the binding site on human lgG1 for Fc gamma Rl, Fc gamma Rll, Fc gamma Rill, and FcRn and design of lgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604; Wines BD, Powell MS, Parren PW, Barnes N, Hogarth PM. The IgG Fc contains distinct Fc receptor (FcR) binding sites: the leukocyte receptors Fc gamma Rl and Fc gamma Rlla bind to a region in the Fc distinct from that recognized by neonatal FcR and Protein A. J Immunol. 2000 May 15;164(10):5313-8; Bruhns P, lannascoli B, England P, Mancardi DA, Fernandez N, Jorieux S, Daeron M. Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood. 2009 Apr 16; 3(16):37 6-25]. 10901 mAb의 경우, His435Arg 단일 돌연변이체(R, 중쇄 서열번호 162, 경쇄 서열번호 163), 및 His435Arg, Tyr436Phe 이중 돌연변이체(RF 중쇄 서열번호 161, 경쇄 서열번호 163)를 CHO 세포에서 생성했고, MabSelect SuRe 친화도 크로마토그래피(GE Healthcare)에 의해 정제했고, 이들의 활성을 실시예 5에 기재된 바와 같이 OPK 검정으로 시험했다. 또한, 삼중 "QRF" Fc 돌연변이체(Lys274Gln, His435Arg, Tyr436Phe)를 10901(중쇄 서열번호 160, 경쇄 서열번호 163)용으로 생성했고, Lys274Gln 돌연변이는 에스. 아우레우스 표면 항원 SSL10에 대한 Fc 결합을 방지하고[참조: Patel D, Wines BD, Langley RJ, Fraser JD. Specificity of staphylococcal superantigen-like Protein 10 toward the human lgG1 Fc domain. J Immunol. 2010 Jun 1;184(11):6283-92], 이 삼중 돌연변이체는 항-SpA 항체의 OPK를 증강시키고(WO/2013/096948), 이를 단일 "R" 및 이중 "RF" 돌연변이체와 비교하는 것으로 보고되었다(실시예 5).
실시예 3: 살아있는 에스 . 아우레우스 세포에 대한 항- SpA mAb의 특이적 결합
살아있는 에스. 아우레우스 세균에 대한 항-SpA 항체의 결합을 유동 세포 분석에 의해 TCH1516(USA300 MRSA 균주)으로 시험했다. Fc-결합에 의한 임의의 잠재적 간섭을 배제하고 결합이 CDR 영역에 의해 매개되는 것을 입증하기 위해, 항체를 Fab 또는 F(ab')2 단편으로 시험했다. 특히, 시험된 항체(음성 대조군 항체 포함)의 어떤 것도 Fab 영역을 통해 SpA에 결합하는 것으로 공지된 VH3 계열에 속하지 않았다[참조: Sasso et. al., 1991].
세균은 1% 카스아미노산(Amresco)이 보충된 RPMI(Life Technologies)에서 중기-대수 상으로 성장시켰다. 배양물을 0.5% 소 혈청 알부민(BSA, PAA) 및 0.01% 나트륨 아지드가 보충된 행크 평형 염 용액(HBSS, Life Technologies)으로 세척했다. 1×106개 세균을 아이스 상에서 45분 동안 10, 2 또는 0.4nM의 항-SpA F(ab')2 단편과 함께 배양했다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 0.01% 나트륨 아지드가 보충된 HBSS로 세척한 후, 세균을 500×에서 2차 시약(Jackson ImmunoResearch)으로서 Alexa 488 표지된 염소 항-인간-IgG F(ab')2 단편으로 염색했다. 유동 기반 검정으로 세균의 동정을 위해, 세균을 실온(RT)에서 10분 동안 5μM SYTO 62(Life Technologies)로 추가로 염색한 다음, iCyt 이클립스 유동 세포 분석기를 사용하여 측정했다. 데이터는 FCS Express 소프트웨어(Version 4, Flow Research Edition)로 분석했다.
에스. 아우레우스 표면 결합은 이러한 발견 작업 동안 생성된 모두 123개 항-SpA F(ab')2 단편으로 검출되었다. 결합 강도는 개개의 항체로 낮은 것으로부터 매우 높은 범위였고, 0.4-100nM 범위에서 용량 의존적이었다(10nM 농도를 사용하여 도 7에 제시된 예).
중요하게는, 어떠한 결합도 무관계 항원에 특이적인 음성 대조군 F(ab')2로 또는 spa 및 sbi에 대한 유전자를 결여하는 동계 돌연벼이체에 대한 항-SpA F(ab')2로 검출되지 않았다(도 8에 제시된 예).
결합 및 친화도의 증가는 forteBio에 의해 측정된 모체와 관련된 자손 중에서 관찰되었고, 이는 전형적으로 에스. 아우레우스에 대한 개선된 표면 결합으로 해석된다(도 9에 제시된 예).
실시예 4. 항- SpA 항체에 의한 SpA에 대한 인간 IgG의 Fc - 매개된 결합의 억제
SpA에 대한 IgG 결합의 억제는 에스. 아우레우스의 IgG 결합 단백질에 의한 면역 회피 기전에 대항하기 위해 항-SpA mAb의 작용의 중요한 방식일 가능성이 있다. 이는 2개의 상이한 검정 시스템으로 시험했다.
forteBio 기반 결합 검정에서, 비오티닐화 천연 전장 SpA를 스트렙트아비딘 코팅된 센서(약 2nm의 최종 부하) 상에 고정시킨 다음, 항-SpA F(ab')2(10pg/ml)의 회합(10분)(회합 1) 및 센서 상으로 인간 비-VH3 IgG(10pg/ml)의 후속 회합(회합 2)을 수행했다. 모든 실험은 30℃에서 PBS(pH 7.2) + 1% BSA에서 수행했다. 각 회합은 동일한 완충액에서 5분 해리 단계가 계속되었다. 이어서, 2차 회합 동안 관찰된 % 결합 반응을 계산했다(항-SpA F(ab')2 단편의 부재하의 100% 결합에 기반)(도 10에 제시된 예). 10272 및 10893은 낮은 경쟁을 나타낸 반면, 10886, 10901 및 10919는 Fc 매개된 IgG 결합의 강력한 억제를 나타냈다.
에스. 아우레우스 세포에 대한 인간 IgG 결합에 의한 항-SpA 항체의 간섭은 유동 세포 분석 기반 표면 염색 검정으로 시험했다. 에스. 아우레우스(TCH1516 wt 균주)를 고정 농도(100nM)에서 항-SpA F(ab')2 단편과 함께 예비-배양하고, 결합되지 않은 F(ab')2 단편을 제거하기 위한 세척 단계 후, 세균을 이의 CDR을 통해 에스. 아우레우스에 결합하지 않은 Alexa 488 형광단 표지된 인간 IgG mAb와 함께 배양했다. 항-SpA F(ab')2 단편의 광범위한 IgG 결합 억제 활성을 검출했고, 이는 유의한 억제에 대한 효과가 없는 범위였다(도 11에 제시된 예). 예를 들면, 표지된 인간 IgG의 160 및 32ng/ml 농도(각각, 1.07 및 0.21nM)를 사용한 실험 설정에서, 10279 및 10313 F(ab')2 단편은 비효과적인 반면, 10092 및 10298은 에스. 아우레우스에 대한 IgG 결합을 유의적으로 감소시켰다(최대 70%).
실시예 5: 인간 혈청 IgG의 존재하에 에스 . 아우레우스에 대한 항- SpA 완전 IgG의 결합
인간 혈청은 이들의 Fc 영역을 통해 SpA에 결합할 수 있는 10-14mg/ml IgG를 함유한다. 질문은 항-SpA mAb가, 세균이 혈청에 의해 둘러싸여 있고 SpA가 이들의 Fc를 통해 부착된 혈청 IgG에 의해 점유되는 경우, 잠재적 옵소닌 식균 작용 효과를 매개하기 위해 세균 표면 상의 SpA에 결합할 수 있는지를 해결했다. 이는 인간 혈청의 존재하에 에스. 아우레우스에 대한 형광단 표지된 항-SpA mAb를 사용한 유동 세포 분석 기반 검정으로 시험했다. 이 검정을 위해, 에스. 아우레우스 TCH1516을 1% 카스아미노산이 보충된 RPMI에서 중기-대수 상으로 성장시켰다. 배양물을 0.5% BSA 및 0.01% 나트륨 아지드가 보충된 HBSS로 세척했다. 1×106개 세균을 아이스 상에서 30분 동안 346× 희석된 인간 혈청(PAA)과 함께 배양하여 대략 35㎍/ml 전체 IgG를 제공함으로써, 세균 표면에 대한 혈청 IgG의 Fc-매개된 결합을 가능하게 했다. 이러한 예비배양 후, 세균을 암 상태로 아이스 상에서 45분 동안 1-10nM 농도 범위(0.15-1.5pg/ml)에서 형광단 표지된 항-SpA 완전 IgG로 염색시켰다. 샘플을 0.01% 나트륨 아지드가 보충된 HBSS로 세척하고, 실온에서 10분 동안 5μM SYTO 62(Life Technologies)로 염색한 다음, iCyt 이클립스 유동 세포 분석기를 사용하여 측정했다. 데이터를 FCS Express 소프트웨어(Version 4, Flow Research edition)로 분석했다. 이들 실험에 사용된 농도는 1:200, 1:80 및 1:20의 특이적 항체 대 전체 혈청 IgG의 비율에 상응한다. 인간에서 이들 비율은 2.5-25mg/체중 kg의 용량에서 mAb를 투여함으로써 달성할 수 있다.
경쟁 혈청 항체의 부재하에, 모든 항-SpA mAb 뿐만 아니라 음성 대조군 항체는 살아있는 내지 에스. 아우레우스에 대한 결합을 나타냈다(특이적 항체 및 Fc 결합 사이를 구별할 수 없음). 그러나, 표지된 음성 대조군 항체의 결합은, SpA-특이적 IgG와 비교하여, 전체 IgG/표지된 시험 IgG 비율의 증가와 함께 보다 빠르게 감소하는 것으로 관찰되었다(도 12에 제시된 예). 이들 데이터는 SpA-특이적 mAb의 CDR 매개된 항원 결합이, Fc 결합 부위가 비-특이적 면역글로불린으로 점유되는 경우에도 발생하는 것을 확인시켜 준다. 이는, 모든 5개 도메인에서 개개 도메인에 대한 대략 10-7M 및 전장 SpA에 대해 10-8M의 KD로 Fc 매개된 결합을 통해서만 회합하는 비-SpA 특이적 IgG와 비교하여, SpA에 대한 항-SpA CDR의 보다 높은 친화도 및 결합력(보다 빠른 회합 및 보다 느린 해리)의 결과일 가능성이 있다. 최고 친화도 SpA-특이적 mAb는 적어도 1로그 더 높은 친화도로 결합한다.
이러한 결론을 서포트하기 위해, 친화도 성숙 전후에 항-SpA 항체의 표면 결합 강도를 비교했다. 모든 계통에서, 친화도 성숙은 이들의 모체와 비교하여 SpA-특이적 자손 IgG의 개선된 결합을 제공했다(도 13에 제시된 예).
실시예 6: 항- SpA 모노클로날 항체의 옵소닌 식균 작용 살상( OPK ) 활성의 측정
병원체의 옵소닌 식균 작용 흡수 및 포식세포 살상의 증강은 세균 병원체에 대해 발생한 항체의 일반적 작용 방식이다. 그람 양성 유기체에 대해, 보체 매개된 살상이 그람 양성 세포벽에 기인하여 가능하지 않기 때문에 이는 주요 항균 기전이다. 따라서, 효모 플랫폼 유래된, 포유동물-세포 발현된 항-SpA 항체가 전문 포식세포의 존재하에 에스. 아우레우스 흡수 및 살상에 기여할 수 있는지를 평가하는 것이 중요하다. 에스. 아우레우스의 생존은 새롭게 단리된 인간 폴리다형핵 세포(PMN)를 사용하여 시험관내 OPK 검정으로 측정했다. 에스. 아우레우스 TCH1516 및 동계 ΔspAΔsbi 돌연변이체(특이성 대조군으로 사용됨)를 1% 카스아미노산이 보충된 RPMI에서 중기-대수 상으로 성장시켰다. 이어서, 배양물을 검정 완충제(2mM L-글루타민 및 2mg/mL 중탄산나트륨이 보충된 RPMI 중의 50g/L 인간 알부민(Albiomin, Biotest))로 세척하고, 8.6×104 CFU/ml로 희석시켰다. 세균(20㎕)을 37℃에서 진탕하에 15분 동안 100㎍/ml 농도에서 시험 및 대조군 IgG로 예비-옵소닌화시켰다. 2단계 퍼콜(Percoll) 구배 원심분리(Rouha et al., 2015)에 의해 인간 전혈로부터 정제된 인간 PMN을 1.7×107 세포/ml로 희석시키고, 절반-면적 평저 96-웰 플레이트에 25㎕ 용적으로 씨딩했다. 세포를 15분(37℃, 5% CO2) 동안 침전시킨 다음, 75㎕의 용적으로 세포 층에 예비-옵소닌화 세균을 첨가했다. 세균 및 PMN을 8분 동안 525×g으로 원심분리에 의해 압축(동기화)했다. 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 배양한 후, 반응은 플레이트를 아이스 상에 위치시켜 정지시켰다. 웰의 내용물을 1% 사포닌의 존재하에 격렬하게 재현탁시켜 포식세포를 용해시켰다. 완전한 세포 용해를 보장하기 위해 아이스 상에서 추가의 10분 배양 단계 후, 샘플을 물로 연속 희석시키고, 100㎕를 트립틱-대두-아가(TSA) 상에 이중으로 플레이팅하고, 다음날 CFU 열거를 위해 37℃에서 o/n 배양했다.
이들 검정에서 CHO 발현된 IgG1 mAb(wt 단백질 A에 대해 선택됨)가 관찰되었고, 에스. 아우레우스 생존의 현저한 감소가 관찰되었다(도 14에서 mAb 10901-서열번호 159, 163에 대한 예 참조). 이 효과는, ΔspAΔsbi 돌연변이체 동계 에스. 아우레우스 균주의 살상이 대조군(비-특이적 IgG1으로 옵소닌화시킴)과 상이하지 않기 때문에 SpA에 특이적이었다. 주목할 만하게, 모든 Fc 돌연변이는 10901에 도입되어 Fc-매개된 SpA 결합을 감소/폐지시켰고(10901_QRF-서열번호 160, 163; 10901_RF-서열번호 161, 163; 및 10901_R-서열번호 162, 163), 항체의 옵소닌 식균 작용 효능을 추가로 증가시켜 살상을 약 40%에서 약 80%까지 증가시켰다.
실시예 7. 정맥내 에스 . 아우레우스 도전으로 뮤린 균혈증 /패혈증 모델에서 항-SpA IgG의 유효성 시험
병원체 특이적 항체는, 이들이 감염성 질환으로부터의 보호에 기여하는지를 측정하기 위해 생체내 모델에서 시험했다. SpA-특이적 항체는 몇몇 작용 방식, 예를 들면, SpA 독성 인자 기능(예: IgG-Fc 결합)의 억제 및 표면 발현된 SpA의 표적화에 의해 에스. 아우레우스의 포식세포 흡수 및 살상의 증강을 가질 수 있다.
CHO 세포에서 발현된 몇몇 SpA-특이적 인간 IgG1 항체를 세균의 정맥내 주사에 의해 유도된 치사적 에스. 아우레우스 도전 모델에서 시험했다. 에스. 아우레우스 균주 TCH1516(USA300 CA-MRSA; BAA-1717™, ATCC)을 트립틱 대두 브로쓰에서 중기-로그 상(0.5의 OD600)으로 성장시키고, 정맥내 주사를 위해 희석시켰다(동물당 2×107cfu 도전 용량으로 100㎕). 모든 실험에서, 암컷 6-8주령 BALB/cJRj 마우스를 사용했다. 동물당 2×107cfu 도전 용량을 정맥내 적용했다. 항체를 사용한 수동 면역화는 세균에 의한 치사적 정맥내 도전 24시간 전에 PBS에서 500㎕로 희석시킨 mAb의 복강내 주사에 의해 수행했다. 전형적으로, 100㎍ mAb/동물(약 5mg/kg) 용량을 5마리 마우스/그룹(전체 15마리 마우스/mAb 처리)으로 3개의 독립 실험에 사용했다. 대조군 그룹은 이소타입-정합된(IgG1) 무관계 mAb를 수용했다. 통계학적 분석은 그래프패드(GraphPad) 프리즘 5.04 소프트웨어를 사용하여 로그-랭크(Mantel-Cox) 시험에 의해 생존 곡선의 분석으로 수행했다.
시험된 모든 항-SpA mAb는 이 모델에서 유의한 보호를 제공했다(<p=0.01)(도 15).
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Staphylococcus aureus <400> 129 Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro 20 25 30 Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 35 40 45 Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe 50 55 60 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly 65 70 75 80 Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln 85 90 95 Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 100 105 110 Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 115 120 125 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys 130 135 140 Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys 145 150 155 160 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn 165 170 175 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 180 185 190 Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln 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Cys Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val 35 40 45 Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Pro 100 105 110 Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <220> <221> MUTAGEN <222> 4 <223> wherein X is any of T, R, Q, P, D, E, G, S, A, M <220> <221> MUTAGEN <222> 5 <223> wherein X is any of S, R, A, E, H, L, G <220> <221> MUTAGEN <222> 6 <223> wherein X is any of Y, L, R, H <220> <221> MUTAGEN <222> 8 <223> wherein X is any of I, M <400> 164 Tyr Thr Phe Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa His 1 5 <210> 165 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MUTAGEN <222> 1 <223> wherein X is any of I, W <220> <223> VH CDR2 <220> <221> MUTAGEN <222> 5 <223> wherein X is any of S, H, N, P, R, M, G <220> <221> MUTAGEN <222> 6 <223> wherein X is any of G, V, N, S, L, Y, I, V, F <220> <221> MUTAGEN <222> 7 <223> wherein X is any of G, D <220> <221> MUTAGEN <222> 8 <223> wherein X is any of S, H, N, R, G <220> <221> MUTAGEN <222> 10 <223> wherein X is any of S, H, N <400> 165 Xaa Ile Asn Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 166 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MUTAGEN <222> 1 <223> wherein X is any of R, Q <220> <223> VL CDR1 <220> <221> MUTAGEN <222> 5 <223> wherein X is any of S, D <220> <221> MUTAGEN <222> 6 <223> wherein X is any of V, I <220> <221> MUTAGEN <222> 8 <223> wherein X is any of S, N <220> <221> MUTAGEN <222> 9 <223> wherein X is any of S, Y, N <220> <221> MUTAGEN <222> 11 <223> wherein X is any of A, N <400> 166 Xaa Ala Ser Gln Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Xaa 1 5 10 <210> 167 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MUTAGEN <222> 1 <223> wherein X is any of G, A, D <220> <223> VL CDR2 <220> <221> MUTAGEN <222> 4 <223> wherein X is any T, S, N <220> <221> MUTAGEN <222> 5 <223> wherein X is any R, L <220> <221> MUTAGEN <222> 6 <223> wherein X is any A, Q, E <220> <221> MUTAGEN <222> 7 <223> wherein X is any T, S <400> 167 Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims (18)

  1. F(ab)2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 5x10-9M 미만의 KD로 야생형 SpA-E에 특이적으로 결합하는 CDR 결합 부위를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대항하는 모노클로날 항체로서, CDR 결합 부위가 적어도 SpA-A 및 SpA-D를 추가로 인식하는 교차 특이적인, 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, CDR 결합 부위가 SpA-B, SpA-C, Sbi-I 및 Sbi-II 중 적어도 하나를 추가로 인식하는, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 3개의 면역글로불린 결합 단백질 (IGBP) 도메인, 바람직하게는 적어도 4개, 5개 또는 6개의 IGBP 도메인을 인식하는, 바람직하게는 F(ab)2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 각각 5x10-9M 미만의 KD로 적어도 3개의 IGBP 도메인, 바람직하게는 각각 5x10-9M 미만의 KD로 적어도 4개 또는 5개의 IGBP를 인식하는, 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, F(ab)2 단편에 대한 표준 광학 간섭법에 의해 측정시 각각 5x10-9M 미만의 KD로 적어도 SpA-E, SpA-A 및 SpA-D를 인식하는, 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 SpAKKAA와 비교하여 적어도 실질적으로 동일한 친화도 또는 실질적으로 더 높은 친화도로 야생형 SpA를 인식하는, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 및 임의로 IgG-Fc에 결합하는 Sbi와 경쟁하는, 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 모노클로날 항체, 결합 부위를 도입하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편, 또는 결합 부위를 도입하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질이고, 특히 무작위화된 또는 인위적인 아미노산 서열을 포함하는 비천연 항체인, 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 영역(VL)을 포함하고, 표 1에 나열된 CDR1 내지 CDR3 서열 중 임의의 서열로 특징지어지고, 임의로 표 1에 나열된 CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 서열로 추가로 특징지어지며, CDR 서열이 카바트(Kabat)의 넘버링 시스템에 따라 지정되거나 전술한 임의의 것의 기능적 활성 CDR 변이체인, 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    a) 표 1에 나열된 임의의 CDR1 내지 CDR3 서열 조합으로 특징지어지는 VH 도메인, 및 표 1에 나열된 임의의 CDR4 내지 CDR6 서열 조합으로 특징지어지는 VL 도메인을 포함하거나;
    b) 표 1에 나열된 임의의 항체의 CDR 서열의 세트(CDR1-CDR6)를 포함하거나;
    c) 표 1에 나열된 임의의 항체이거나; 또는
    d) a) - c)의 서열로 특징지어지는 모체 항체의 기능적 활성 변이체이고,
    바람직하게는,
    i. 기능적 활성 변이체가 모체 항체의 임의의 CDR1-CDR6의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고/하거나;
    ii. 기능적 활성 변이체가 임의의 VH 및 VL 서열의 프레임워크 영역에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고;
    추가로,
    iii. 기능적 활성 변이체가 모체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖고/갖거나;
    iv. 기능적 활성 변이체가 모체 항체의 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 및/또는 친화도 성숙 변이체인, 항체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 표 1에 나열된 임의의 CDR 서열의 기능적 활성 CDR 변이체를 포함하고, 기능적 활성 CDR 변이체가
    a) 모체 CDR 서열 중의 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 및/또는
    b) 모체 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 위치에서 1 또는 2개의 점 돌연변이; 및/또는
    c) 모체 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성 중 적어도 하나를 포함하고;
    바람직하게는, 기능적 활성 CDR 변이체가 임의의 CDR 서열에 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함하는, 항체.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    i)
    A) 항체는
    a) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
    b) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
    c) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
    임으로,
    d) 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
    e) 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
    f) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하거나;
    또는
    B) 항체는 A의 항체이고, 여기서 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
    a) 모체 CDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지고;
    b) 모체 CDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지고;
    c) 모체 CDR3은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지고;
    d) 모체 CDR4는 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어지고;
    e) 모체 CDR5는 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어지고;
    f) 모체 CDR6은 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지고;
    ii)
    A) 항체는
    a) 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
    b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
    c) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
    임으로,
    d) 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
    e) 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
    f) 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하거나;
    또는
    B) 항체는 A의 항체이고, 여기서 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
    a) 모체 CDR1은 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어지고;
    b) 모체 CDR2는 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지고;
    c) 모체 CDR3은 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지고;
    d) 모체 CDR4는 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지고;
    e) 모체 CDR5는 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어지고;
    f) 모체 CDR6은 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어지고;
    iii)
    A) 항체는
    a) 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
    b) 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
    c) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
    임으로,
    d) 서열번호 100의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
    e) 서열번호 101의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
    f) 서열번호 102의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하거나;
    또는
    B) 항체는 A의 항체이고, 여기서 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
    a) 모체 CDR1은 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지고;
    b) 모체 CDR2는 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지고;
    c) 모체 CDR3은 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지고;
    d) 모체 CDR4는 서열번호 100의 아미노산 서열로 이루어지고;
    e) 모체 CDR5는 서열번호 101의 아미노산 서열로 이루어지고;
    f) 모체 CDR6은 서열번호 102의 아미노산 서열로 이루어지고;
    iv)
    A) 항체는
    a) 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
    b) 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
    c) 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
    임으로,
    d) 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
    e) 서열번호 104의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
    f) 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하거나;
    또는
    B) 항체는 A의 항체이고, 여기서 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
    a) 모체 CDR1은 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지고;
    b) 모체 CDR2는 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지고;
    c) 모체 CDR3은 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지고;
    d) 모체 CDR4는 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어지고;
    e) 모체 CDR5는 서열번호 104의 아미노산 서열로 이루어지고;
    f) 모체 CDR6은 서열번호 105의 아미노산 서열로 이루어지고;
    v)
    A) 항체는
    a) 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
    b) 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
    c) 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
    임으로,
    d) 서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
    e) 서열번호 107의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
    f) 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하거나;
    또는
    B) 항체는 A의 항체이고, 여기서 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
    a) 모체 CDR1은 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지고;
    b) 모체 CDR2는 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어지고;
    c) 모체 CDR3은 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어지고;
    d) 모체 CDR4는 서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어지고;
    e) 모체 CDR5는 서열번호 107의 아미노산 서열로 이루어지고;
    f) 모체 CDR6은 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어지고;
    vi)
    A) 항체는
    a) 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 및
    b) 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및
    c) 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하고;
    임으로,
    d) 서열번호 118의 아미노산 서열로 이루어진 CDR4; 및
    e) 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어진 CDR5; 및
    f) 서열번호 120의 아미노산 서열로 이루어진 CDR6을 추가로 포함하거나;
    또는
    B) 항체는 A의 항체이고, 여기서 CDR 중 적어도 하나는 모체 CDR에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는, 모체 CDR의 기능적 활성 CDR 변이체이고, 여기서
    a) 모체 CDR1은 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지고;
    b) 모체 CDR2는 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어지고;
    c) 모체 CDR3은 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어지고;
    d) 모체 CDR4는 서열번호 118의 아미노산 서열로 이루어지고;
    e) 모체 CDR5는 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어지고;
    f) 모체 CDR6은 서열번호 120의 아미노산 서열로 이루어지는,
    상기 그룹 구성원 i) 내지 vi)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 152-162의 HC 서열 중 임의의 서열 및 임의로 서열번호 163의 LC 서열을 포함하는, 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 에스. 아우레우스 감염 또는 콜론화의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 대상체에게 상기 대상체에서 감염을 제한하거나 상기 감염으로부터 발생되는 질환 병태를 개선시키거나 폐렴, 패혈증, 균혈증, 상처 감염, 농양, 수술 부위 감염, 내안구염, 절종증, 카르분클증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염과 같은 에스. 아우레우스 질환 병인을 억제하기 위해 유효량의 항체를 투여함을 포함하여 상기 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 항체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하는, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는, 약제학적 제제.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 괴사성 폐렴과 같은 고독소 생산 MRSA 감염, 및 절종증 및 카르분클증에서 독소 생산을 포함하는 임의의 에스. 아우레우스 감염을 검출하기 위한 진단 용도를 위한, 항체.
  16. 표지를 갖는 항체 및/또는 표지를 갖는 추가의 진단 시약을 임의로 함유하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 항체의 진단 제제.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 항체의 생산 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현시키는 코딩 서열을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체를 생산하기 위한 조건하에 배양하거나 유지시키는, 방법.
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