ES2957940T3

ES2957940T3 - Anticuerpos bispecíficos anti-PD-L1-anti-TIM-3

Info

Publication number: ES2957940T3
Application number: ES18720834T
Authority: ES
Inventors: Igor Edmondo Paolo D'angelo; Yiwen Li; Dale Lincoln Ludwig; Yang Shen; Yi Zhang
Original assignee: Zymeworks BC Inc; Eli Lilly and Co
Current assignee: Zymeworks BC Inc; Eli Lilly and Co
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2038-04-04
Also published as: AU2018250793B2; MA50222A; US20190247497A1; CL2019002802A1; IL269577B; EP3609920B1; US11351251B2; CR20190409A; ECSP19073314A; KR102261582B1; IL269577A; CA3057834A1; BR112019020812A2; EP3609920A1; DOP2019000235A; EA201992145A1; CN110546165A; ZA201905711B; PE20191743A1; MX2019012222A

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos que son heterodiméricos y se unen a PD-L1 humano y TIM-3 humano, y pueden ser útiles para tratar el cáncer solos y en combinación con quimioterapia y otras terapias contra el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos bispecíficos anti-PD-L1-anti-TIM-3

La presente invención se relaciona con el campo de la medicina. Más concretamente, la presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que se unen al ligando 1 de la muerte celular programada humana (PD-L1) y a la proteína-3 que contiene inmunoglobulina de células T y dominio mucina (TIM-3), y pueden ser útiles para tratar tumores sólidos y hematológicos solos y en combinación con quimioterapia y otras terapias contra el cáncer.

Las células tumorales escapan a la detección y eliminación por parte del sistema inmunológico a través de múltiples mecanismos. Las vías del punto de control inmunitario se utilizan en el mantenimiento de la autotolerancia y el control de la activación de las células T, pero las células cancerosas pueden utilizarlas para suprimir la respuesta antitumoral y evitar su destrucción.

La vía PD-L1 / muerte celular programada humana 1 (PD-1) es uno de estos puntos de control inmunitario. La PD-1 humana se encuentra en los linfocitos T y la PD-L1 se expresa de forma aberrante en diversos tipos de tumores; la unión de la PD-L1 a la PD-1 inhibe la proliferación de los linfocitos T y la producción de citoquinas. El eje inhibidor PD-1/PD-L1 ha sido subyugado por los tumores como parte del procedimiento selectivo natural que moldea la evolución tumoral en el contexto de una respuesta inmunitaria antitumoral.

TIM-3 es un receptor de punto de control identificado por desempeñar un papel clave en la supresión funcional de células T agotadas. Las células T que reconocen antígenos tumorales se pueden aislar de pacientes y modelos de ratón, pero dichas células pueden exhibir un fenotipo agotado caracterizado por deterioro de las funciones citotóxicas, producción de citoquinas efectoras y proliferación. Estas células T pueden expresar niveles elevados del regulador del punto de control TIM-3.

Si bien la orientación terapéutica de la vía PD-1/PD-L1 está validada clínicamente, existe una respuesta objetiva variable en pacientes con cáncer de entre 9 y 45% en tumores PD-L1 negativos y PD-L2 altamente positivos, y muchos pacientes no logran una respuesta duradera. El bloqueo combinado de dos o más receptores de puntos de control puede aumentar la frecuencia de respuestas objetivas y lograr eficacia en pacientes con cáncer que pueden ser refractarios a la monoterapia con un anticuerpo bloqueante de PD-1 o PD-L1. El documento WO 2017/034916 A1 divulga anticuerpos que se unen a PD-L1 humano, útiles para tratar tumores sólidos y hematológicos solos y en combinación con quimioterapia y otras terapias contra el cáncer.

El tratamientoin vitrode linfocitos infiltrantes de tumores recogidos de ratones portadores de tumores CT26 con dos anticuerpos, un anticuerpo TIM-3 anti-ratón que puede interactuar con células T y un anticuerpo PD-L1 anti-ratón que puede interactuar por separado con las células tumorales del ratón, dio lugar a un control más eficaz del crecimiento tumoral del ratón que la orientación en cualquiera de las vías por sí sola (Sakuishi et al. JEM 2010, 207: 2187 y el documento WO 2015/048312).

Se ha notificado una pequeña molécula oral que antagoniza PD-L1 y TIM-3 (Sasikumar et al., AACR; Cancer Res 2016;76(14 Suppl): Resumen 4861). Este compuesto de molécula pequeña demostró su eficacia en modelos tumorales de ratones singénicos.

Sigue existiendo la necesidad de proporcionar compuestos que puedan unirse e inhibir tanto PD-L1 humano como TIM-3 humano, pero que también tengan la especificidad objetivo y la farmacocinética de un anticuerpo. En particular, sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos biespecíficos heterodiméricos que se unan tanto a PD-L1 humano como a TIM-3 humano, en los que el anticuerpo biespecífico heterodimérico permita emparejar dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes en un único anticuerpo de tipo IgG. Además, existe la necesidad de que el anticuerpo biespecífico se asemeje a la estructura nativa del anticuerpo medida por modelado, espectrometría de masas y análisis de estabilidad con fines tales como baja inmunogenicidad, farmacocinéticainvivo estable y estabilidad adecuada. Además, sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos biespecíficos anti-PD-L1 humano y anti-TIM-3 humano que posean una o más de las siguientes características: se unen y puentean simultáneamente a células tumorales que expresan PD-L1 y células T que expresan TIM-3, suprimen las vías inhibidoras de los puntos de control PD-1 y TIM-3, muestran una mejor actividad antitumoral medida en un modelo tumoral que una combinación de un anticuerpo anti-PD-L1 y un anticuerpo anti-TIM-3, y carecen de funciones de anticuerpo efector inmunitario.

a) En consecuencia, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1<) y TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2) que comprende:>

a) una primera HC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 22,

b) una primera LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 27, c) una segunda HC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 26,

d) una segunda LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 28;

y en donde la primera LC forma un enlace disulfuro entre cadenas con la primera HC, la segunda LC forma un enlace disulfuro entre cadenas con la segunda HC, y la primera HC forma dos enlaces disulfuro entre cadenas con la segunda HC, y la primera HC y la segunda HC son de isotipo IgG1 humano.

En el presente documento se divulga un anticuerpo que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1) y TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2) que comprende:

a) una primera cadena pesada (HC) que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3,

b) una primera cadena ligera (LC) que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4,

c) una segunda HC que comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7,

d) una segunda LC que comprende una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10;

En el presente documento se divulga además un anticuerpo en donde la segunda HC comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y la segunda LC comprende una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. La presente invención proporciona además un anticuerpo en donde la segunda HC comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y la segunda LC comprende una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. La presente invención proporciona además un anticuerpo, en donde la segunda HC comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y la segunda LC comprende una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En el presente documento se divulga además un anticuerpo, en donde:

b) la primera HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 22,

c) la segunda HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 26,

d) la primera LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, y la segunda LC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

Aún más se describe en el presente documento un anticuerpo que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1) y TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2) que comprende:

b) una primera LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 27, c) una segunda HC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 26,

d) una segunda LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 28;

b) una primera LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 27, c) una segunda HC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 26,

d) una segunda LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 28;

La presente invención proporciona además un anticuerpo que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1) y TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2) en donde:

a) la primera HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, y b) la segunda HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25.

Para SEQ ID NOs: 19-28, la Tabla 1 mapea dónde se correlacionan las secuencias en el anticuerpo. Para SEQ ID NO: 3-10, la Tabla 2 mapea dónde se correlacionan las secuencias en el anticuerpo.

La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1) y TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2) que comprende dos cadenas ligeras (CL) y dos cadenas pesadas (HC), en las que:

a) la primera LC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12,

b) la primera HC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11,

c) la segunda LC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, y

d) la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15. La presente invención proporciona un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras (LC) y dos cadenas pesadas (HC), en donde:

a) la primera LC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12,

b) la primera HC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11,

d) la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15. La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1) y TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2) que comprende dos cadenas ligeras (CL) y dos cadenas pesadas (HC), en las que:

a) la primera LC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y la primera HC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, y

b) la segunda LC y la segunda HC tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 15, respectivamente.

La presente invención proporciona además un anticuerpo, en donde la segunda LC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16, y la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. La presente invención proporciona además un anticuerpo, en donde la segunda LC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, y la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. La presente invención proporciona además un anticuerpo, en donde la segunda LC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

En el presente documento se divulga un medio anticuerpo que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1) que comprende una LC y una HC, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 11.

Además, en el presente documento se divulga un semianticuerpo que se une a TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2) que comprende una LC y una HC, en donde la LC y la HC tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 15, respectivamente.

T l 1: n i i n l r i n l n li r I 1

(continuación)

La presente invención proporciona una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID N<o>: 18, en donde la célula es capaz de expresar un anticuerpo de la presente invención.

La presente invención proporciona una célula de mamífero que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN comprende una secuencia polinucleotídica que codifica polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, y en donde la segunda molécula de ADN comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 18, en donde la célula es capaz de expresar un anticuerpo de la presente invención.

En el presente documento se divulga una célula de mamífero que comprende una primera molécula de ADN, una segunda molécula de ADN, una tercera molécula de ADN y una cuarta molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, la segunda molécula de ADN comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, la tercera molécula de ADN comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y la cuarta molécula de ADN comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde la célula es capaz de expresar un anticuerpo de la presente invención.

La presente invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo de la presente invención que comprende cultivar una célula de mamífero de la presente invención en condiciones tales que se exprese el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo expresado.

La presente invención proporciona un anticuerpo producido mediante un procedimiento de la presente invención.

La presente invención proporciona un anticuerpo producido cultivando una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ iD NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 18 en condiciones tales que se exprese el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo expresado.

La presente invención proporciona un anticuerpo producido cultivando una célula de mamífero que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN comprende una secuencia polinucleotídica que codifica polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, y en donde la segunda molécula de ADN comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 18 en condiciones tales que se exprese el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo expresado.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención y un vehículo, diluyente o excipiente aceptable.

En el presente documento se describe un método para tratar el cáncer, que comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, sarcoma de tejido blando, colangiocarcinoma o carcinoma hepatocelular.

En el presente documento se divulga un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es melanoma. Además, se divulga un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de pulmón. Además, se divulga un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas o mesotelioma. También se divulga un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de cabeza y cuello. También se divulga un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de hígado. También se divulga un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es colorrectal. Aún más se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es cáncer de páncreas. Aún más se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es cáncer gástrico. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de riñón. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de vejiga. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de próstata. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de mama. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de ovario. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de endometrio. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es de esófago. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es un sarcoma de tejidos blandos. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es un colangiocarcinoma. También se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar el cáncer, en donde el cáncer es un carcinoma hepatocelular.

En el presente documento se divulgan procedimientos que comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo divulgado en el presente documento en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes de atención estándar seleccionados del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán), gemcitabina, topotecán, irinotecán liposomal, pemetrexed y cetuximab.

En el presente documento se divulgan procedimientos que comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo divulgado en el presente documento en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados del grupo que consiste en nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab, epacadostat y durvalumab.

En el presente documento se divulgan procedimientos que comprenden la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo de la presente invención que comprende una combinación simultánea, separada o secuencial con radiación ionizante.

La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso como medicamento. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento del cáncer. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para uso en el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, sarcoma de tejidos blandos, colangiocarcinoma o carcinoma hepatocelular.

La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del melanoma. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón. La presente invención proporciona además un anticuerpo de la presente invención, en donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas o mesotelioma. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de hígado. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer gástrico. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de riñón. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de vejiga. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de mama. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de ovario.La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de endometrio. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de esófago. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para su uso en el tratamiento del sarcoma de tejidos blandos. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del colangiocarcinoma. La presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento del carcinoma hepatocelular.

La presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes de atención estándar seleccionados del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo, y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán), gemcitabina, topotecán, irinotecán liposomal, pemetrexed y cetuximab, en el tratamiento del cáncer.

En el presente documento se divulga el anticuerpo como se divulga en el presente documento para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados del grupo que consiste en nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab, epacadostat y durvalumab, en el tratamiento del cáncer.

En el presente documento se divulga el anticuerpo como se divulga en el presente documento para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con radiación ionizante, en el tratamiento del cáncer.

En el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, se divulga en el presente documento una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón. cáncer, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, sarcoma de tejido blando, colangiocarcinoma o carcinoma hepatocelular. Además, se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento, en donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas o mesotelioma.

En el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del melanoma, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer de hígado, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer colorrectal, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer gástrico, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de riñón, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de vejiga, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer de próstata, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de mama, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer de ovario, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de endometrio, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer de esófago, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del sarcoma de tejidos blandos, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento del colangiocarcinoma, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento. Además, en el presente documento se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento del carcinoma hepatocelular, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo divulgado en el presente documento.

En el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde dicha composición farmacéutica se administra en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes de atención estándar seleccionados del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán), gemcitabina, topotecán, irinotecán liposomal, pemetrexed y cetuximab.

En el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde dicha composición farmacéutica se administra en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados del grupo que consiste en nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab, epacadostat y durvalumab.

En el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde dicha composición farmacéutica se administra en combinación simultánea, separada o secuencial con radiación ionizante.

En el presente documento se divulga el uso de un anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Además se divulga en el presente documento el uso de un anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, sarcoma de tejidos blandos, colangiocarcinoma o carcinoma hepatocelular. Aún más en el presente documento se divulga el uso de un anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, o mesotelioma.

En el presente documento se divulga el uso de un anticuerpo de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en donde dicho medicamento se va a administrar simultáneamente, por separado o secuencialmente con uno o más agentes de atención estándar seleccionados del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán), gemcitabina, topotecán, irinotecán liposomal, pemetrexed y cetuximab.

En el presente documento se divulga el uso de un anticuerpo de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en donde dicho medicamento se administra simultáneamente, por separado o secuencialmente con uno o más agentes antitumorales seleccionados del grupo que consiste en nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab, epacadostat y durvalumab.

En el presente documento se divulga el uso de un anticuerpo de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en donde dicho medicamento debe administrarse simultánea, separada o secuencialmente con radiación ionizante.

Un anticuerpo de la presente invención es un complejo polipeptídico diseñado por ingeniería genética que no se produce de forma natural. Una molécula de ADN de la presente invención es una molécula de ADN de origen no natural que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos en un anticuerpo de la presente invención.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de tipo IgG y tiene cadenas "pesadas" y cadenas "ligeras" que están reticuladas a través de enlaces disulfuro intra e intercadenas. Cada cadena pesada está compuesta por una HCVR N-terminal y una región constante de la cadena pesada ("HCCR"). Cada cadena ligera está compuesta por una LCVR y una región constante de la cadena ligera ("LCCR"). Cada cadena ligera forma enlaces disulfuro con una cadena pesada, y las dos cadenas pesadas forman dos enlaces disulfuro entre sí.

La región constante de las cadenas pesadas contiene dominios CH1, CH2y CH3. La CH1 viene después de la HCVR; la CH1 y la HCVR forman la porción de cadena pesada de un Fab. CH2viene después de la región bisagra y antes de CH3. La CH3 viene después de la CH2y se encuentra en el extremo carboxi-terminal de la cadena pesada.

La región constante de las cadenas ligeras contiene un dominio, CL. La CL viene después de la LCVR; la CL y la LCVR forman la porción de cadena ligera de un Fab.

Los anticuerpos de la presente invención son heterodiméricos en el sentido de que cada brazo del anticuerpo exhibe unión monovalente selectiva a su antígeno cognado debido a dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes que forman el anticuerpo. En la presente invención, un brazo del anticuerpo se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1), y el otro brazo se une a TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2). Para garantizar el correcto ensamblaje de estos anticuerpos biespecíficos, se incorporan mutaciones en la secuencia de las cadenas pesadas dentro de la región CH1 y CH3 y en la secuencia de las cadenas ligeras dentro de la región constante de la cadena ligera. Las mutaciones CH1 y L<c>se realizan para favorecer el emparejamiento nativo de los pares necesarios de cadenas ligeras y cadenas pesadas y desfavorecer el desajuste de las cadenas ligeras. Las mutaciones CH3 se realizan para favorecer el emparejamiento heterodimérico de las dos cadenas pesadas distintas y desfavorecer la formación de homodímeros. Las mutaciones en la región CH3 de la porción anti-PD-L1 del anticuerpo incluyen preferentemente las posiciones 356, 372, 398 y 400, numeradas por posición absoluta en SEQ ID NO: 11 (posiciones 350, 366, 392 y 394 si se utiliza la numeración de la UE). Las mutaciones en la región CH3 de la porción anti-TIM-3 del anticuerpo incluyen preferentemente las posiciones 350, 351, 356, 405 y 407 numeradas por posición absoluta en SEQ ID NO: 15 (posiciones 350, 351, 405 y 407 si se utiliza la numeración de la UE). Las mutaciones en la región CH1 de la porción anti-PD-LI del anticuerpo incluyen preferentemente las posiciones 189 numeradas por posición absoluta en SEQ ID NO: 11 (posición 183 si se utiliza la numeración de la UE). Las mutaciones en la región CH1 de la porción anti-TIM-3 del anticuerpo incluyen preferentemente las posiciones 128, 147, 175 y 183, numeradas por posición absoluta en SEQ ID NO: 15 (posiciones 128, 147, 175 y 183 si se utiliza la numeración de la UE).

Las mutaciones en la región CL de la porción anti-PD-L1 del anticuerpo incluyen preferentemente las posiciones 179 y 181 numeradas por posición absoluta en SEQ ID NO: 11 (posiciones 176 y 178 si se utiliza la numeración de la UE). Las mutaciones en la región CL de la porción anti-TIM-3 del anticuerpo incluyen preferentemente las posiciones 131, 133, 176 y 178, numeradas por posición absoluta en SEQ ID NO: 15 (posiciones 131, 133, 176 y 178 si se utiliza la numeración de la UE).

En ciertos anticuerpos de la presente invención, las mutaciones de emparejamiento heterodimérico de cadena pesada producen una estabilidad térmica CH3 superior a 80° C, que es comparable a la de los anticuerpos nativos (Tabla 1 y Von Kreudenstein, et al., 2014).

Cuando se expresan en ciertos sistemas biológicos, los anticuerpos que tienen secuencias Fc están glicosilados en la región Fc. Normalmente, la glicosilación se produce en la región Fc del anticuerpo en un sitio de glicosilación N altamente conservado. Los N-glicanos se unen típicamente a la asparagina. Los anticuerpos también pueden estar glicosilados en otras posiciones.

Opcionalmente, ciertos anticuerpos de la presente invención contienen una porción Fc que se deriva de IgG1 humana. Se sabe que la IgG1 se une a las proteínas de la familia de receptores Fc-gamma (F<cy>R), así como a la C1q. La interacción con estos receptores puede inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por lo tanto, se introducen ciertas sustituciones de aminoácidos en IgG1 Fc para ciertos anticuerpos de la presente invención, incluidos los anticuerpos A, B y C, para suprimir la función de efector inmunitario. Las mutaciones en la región CH2de la porción anti-PD-L1 del anticuerpo pueden incluir las posiciones 240, 241 y 271 numeradas por posición absoluta en SEQ ID NO: 11 (posiciones 234, 235 y 265 si se utiliza la numeración de la UE). Las mutaciones en la región CH2de la porción anti-TIM-3 del anticuerpo pueden incluir las posiciones 234, 235 y 265 numeradas por posición absoluta en SEQ ID NO: 15 (posiciones 234, 235 y 265 si se utiliza la numeración de la UE).

Un ADN aislado que codifica una región HCVR se puede convertir en un gen de la cadena pesada de longitud completa por medio del enlace operativo del ADN que codifica HCVR a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de la cadena pesada. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada en humanos, así como en otros mamíferos, son conocidas en la técnica. Los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener, por ejemplo, por medio de la amplificación estándar por PCR.

Un ADN aislado que codifica una región LCVR se puede convertir en un gen de la cadena ligera de longitud completa por medio de la unión operable del ADN que codifica la LCVR con otra molécula de ADN que codifica una región constante de la cadena ligera. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana, así como de otros mamíferos, son conocidas en la técnica. Los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por medio de la amplificación estándar por PCR. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. Preferentemente para anticuerpos de la presente invención, la región constante de cadena ligera de la porción anti-PD-L1 del anticuerpo es una cadena ligera lambda y la región constante de cadena ligera de la porción anti-TIM-3 del anticuerpo es una cadena ligera kappa.

Los polinucleótidos de la presente invención se expresarán en una célula huésped después de que las secuencias se hayan unido operativamente a una secuencia de control de la expresión. Los vectores de expresión suelen ser replicables en los organismos huéspedes, ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina, neomicina y dihidrofolato reductasa, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

El anticuerpo de la presente invención se puede producir fácilmente en células de mamíferos tales como células CHO, NS0, HEK293 o<c>O<s>. Las células huésped se cultivan por medio de técnicas muy conocidas en la técnica.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (por ejemplo, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos del anticuerpo y las secuencias de control de expresión) se pueden transferir a la célula huésped por procedimientos muy conocidos, que varían en función del tipo de huésped celular.

Se pueden emplear varios procedimientos de purificación de proteínas y tales procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher,Methods in Enzymology182: 83 a 89 (1990) y Scopes,Protein Purification: Principies and Practice,3ra edición, Springer, NY (1994).

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo, o los ácidos nucleicos que codifican el mismo, se proporcionan en forma aislada. Como se utiliza en la presente memoria, el término "aislado" se refiere a una proteína, péptido o ácido nucleico que está libre o sustancialmente libre de cualquier otra especie macromolecular que se encuentre en un entorno celular. "Sustancialmente libre", como se utiliza en la presente memoria, significa que la proteína, el péptido o el ácido nucleico de interés comprende más del 80% (en base molar) de las especies macromoleculares presentes, preferentemente más del 90%, y más preferentemente más del 95%.

El anticuerpo de la presente invención, o las composiciones farmacéuticas que lo comprenden, se pueden administrar por vía parenteral (por ejemplo, subcutánea e intravenosa). Un anticuerpo de la presente invención se puede administrar a un paciente junto con portadores, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico en dosis únicas o múltiples. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar por procedimientos muy conocidos en la técnica (por ejemplo,Remington: The Science and Practice of Pharmacy,22da ed. (2012), A. Loydet al., Pharmaceutical Press)y comprenden un anticuerpo, como se desvela en la presente memoria, y uno o más portadores, diluyentes o excipientes aceptables para uso farmacéutico.

El término "tratar" (o "tratar" o "tratamiento") se refiere a ralentizar, interrumpir, detener, aliviar, parar, reducir o revertir la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existente.

"Se une" tal como se utiliza en el presente documento en referencia a la afinidad de un anticuerpo para PD-L1 humana (SEQ ID NO: 1), TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2), o ambos se entiende, a menos que se indique lo contrario, una K<d>de menos de aproximadamente 1*10<-6>M, preferentemente, menos de aproximadamente 1 ><10<-9>M según se determina por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo el uso de un biosensor de resonancia de plasmón superficial (SPR) a 37°C esencialmente como se describe en el presente documento.

Por "cantidad efectiva" se entiende la cantidad de un anticuerpo de la presente invención o de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médica o el efecto terapéutico deseado en un tejido, sistema, animal, mamífero o ser humano que busca el investigador, médico u otro clínico. Una cantidad efectiva del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad efectiva es también aquella en donde cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo es superado por los efectos terapéuticos beneficiosos.

Ejemplo 1 Expresión y purificación de anticuerpos.

Los polipéptidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, las secuencias completas de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera del Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C, y las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas, se enumeran a continuación en la sección titulada "Secuencias de aminoácidos y nucleótidos". Además, las SEQ ID NO para la cadena ligera, la cadena pesada, la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo A, B y C se muestran en la Tabla 2.

Los anticuerpos de la presente invención, incluyendo, entre otros, el Anticuerpo A, el Anticuerpo B y el Anticuerpo C, se pueden preparar y purificar esencialmente de la siguiente manera. Una célula huésped apropiada, tal como CHO, puede transfectarse de forma transitoria o estable con un sistema de expresión para secretar anticuerpos usando un vector cuádruple, vectores duales o cuatro vectores únicos en una proporción de 20HC anti-TIM-3: 10HC anti-PD-LI : 24LC anti-TIM-3 : 46LC anti-PD-LI. SEC. ID Núm.: 29 a SEQ ID N<o>: 32 son secuencias de ADN para las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo C; la cadena ligera del anticuerpo PD-L1 tiene un intrón interno para aumentar los niveles de expresión en relación con la cadena ligera TIM-3. Los medios clarificados, en los que se ha secretado el anticuerpo, se pueden purificar mediante el uso de cualquiera de las numerosas técnicas comúnmente utilizadas. Por ejemplo, el medio se puede aplicar convenientemente a una columna MabSelect (GE Healthcare), o a una columna KappaSelect (GE Healthcare) para el fragmento Fab, que se ha equilibrado con un tampón compatible, tal como la solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La columna se puede lavar para eliminar los componentes de unión no específicos. El anticuerpo unido puede eluirse, por ejemplo, por medio de un gradiente de pH (tal como el tampón Tris 20 mM pH 7 a un tampón citrato de sodio 10 mM pH 3,0, o el tampón fosfato salino pH 7,4 a un tampón de glicina 100 mM pH 3,0). Las fracciones de anticuerpos pueden detectarse, por ejemplo, mediante SDS-PAGE, y luego pueden combinarse. Los agregados y multímeros solubles se pueden eliminar eficazmente por medio de técnicas comunes, tales como la exclusión por tamaño, la interacción hidrofóbica, el intercambio iónico, la cromatografía multimodal o la hidroxiapatita. El anticuerpo puede concentrarse y/o esterilizarse por filtración utilizando técnicas comunes. El producto puede congelarse inmediatamente a -70 °C o pueden liofilizarse.

Tabla 2: SEQ ID NOs

(continuación)

Ensayos

Unión in vitro de anticuerpos

Con un anticuerpo biespecífico heterodimérico, un brazo del anticuerpo (una cadena ligera y una cadena pesada) se une monovalentemente a un antígeno, y el segundo brazo del anticuerpo (una cadena ligera y una cadena pesada) se une monovalentemente al segundo antígeno. La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para mantener una unión comparable a cada antígeno en comparación con los anticuerpos parentales que se unen bivalentemente al antígeno puede evaluarse mediante un ensayo Biacore.

La cinética de unión y la afinidad del anticuerpo C y sus anticuerpos parentales a los antígenos correspondientes TIM-3 y PD-L1 se analizaron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando el instrumento biosensor BIAcore T200 (GE Healthcare) a 37 °C. El Fab humano se inmovilizó en el chip sensor CM5 utilizando acoplamiento de amina a un nivel de inmovilización de 7000 a 9000 RU. Las muestras de anticuerpos se diluyeron en tampón HBS-EP+ y se inyectaron a un caudal de 30 μl/min. A continuación, se inyectaron concentraciones seriadas de antígeno de brazo único TIM-3 humano (TIM-3-SAG) y PD-L1 marcado con Fc (PD-L1-Fc) durante 180 segundos, seguidas de un tiempo de disociación de 1200 segundos. Los sensorgramas se evaluaron utilizando el software de evaluación Biacore T200 3.0 y el cálculo de las constantes de velocidad de asociación (Ka) y disociación (Kd) se basó en un ajuste de modelo de unión Langmuir 1:1. La constante de disociación de equilibrio (KD) o constante de afinidad de unión se calculó a partir de la relación de las constantes de velocidad cinética Kd/Ka.

La unión monovalente del antígeno a PD-L1 para el Fab del anticuerpo A fue de 6,5 * 10-<10>M y fue comparable a la unión bivalente de PD-L1 por el Fab del anticuerpo anti-PD-L1 parental. La unión monovalente a PD-L1 de los Fabs de los anticuerpos B y C también fue comparable a la del Fab del anticuerpo anti-PD-L1 parental.

La unión de antígeno monovalente a TIM-3 para el Fab del anticuerpo A fue de 2,53 * 10-<9>M y fue aproximadamente 33 veces menor que la afinidad de unión bivalente del anticuerpo anti-TIM-3 parental. El Fab del anticuerpo B tenía una Kd de 1,91 * 10-<10>M contra TIM-3, y el Fab del anticuerpo C tenía una Kd de 1,11 *<10>M contra TIM-3. La unión Fab monovalente del anticuerpo B era tres veces inferior a la afinidad de unión bivalente del anticuerpo anti-TIM-3 parental, mientras que la unión Fab monovalente del anticuerpo C era comparable a la afinidad de unión bivalente del parental.

Estabilidad térmica

Con un anticuerpo biespecífico heterodimérico, se requiere el emparejamiento de dos cadenas pesadas diferentes y el emparejamiento selectivo de cadenas ligeras afines con cada cadena pesada respectiva. La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para mantener una estabilidad comparable a la de un anticuerpo nativo puede comprobarse mediante análisis DSC.

Los estudios se realizaron a 1 mg/mL en PBS utilizando un MicroCal VP-Capillary DSC (Serial# 11.05083.CAP). Todas las muestras se escanearon dentro del intervalo de temperatura de 25-100 °C con una velocidad de escaneado de 60 °C/hora. Las soluciones se presurizaron a aproximadamente 60 psi en los capilares durante cada exploración. Para cada proteína, el barrido tampón/tampón se restó del barrido tampón/proteína y el termograma se normalizó para la concentración de proteína. Se realizó una corrección de la línea de base y se obtuvo el punto medio de cada desnaturalización térmica (T<m>) a partir de los picos máximos.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el análisis DSC del anticuerpo C mostró estabilidad térmica (Tmi 67°C, Tm<2>76°C, Tm<3>83°C) con temperaturas de desdoblamiento comparables a las de los anticuerpos parentales (anti-PD-L1 Ab: T<it h>67°C, Tm<2>75°C, Tm<3>82 °C, anti-TIM-3 Ab: T<it h>64°C, Tm<2>85°C).

Unión simultánea a PD-L1 y TIM-3 medida por ELISA

La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para unirse a PD-L1 y TIM-3 simultáneamente se puede medir en un ensayo ELISA tipo intercalado. La proteína TIM-3-Fc puede recubrirse en la placa para probar la unión de anticuerpos de la presente invención a TIM-3, pero sólo se genera señal si los anticuerpos unidos a la placa también<unen PD-L>1<-Fc biotinilado soluble.>

Para el ensayo de unión, se recubrió una placa de 96 pocillos (Immulon 2HB) con 50 μl/pocillo de 1 μg/ml de TIM-3-Fc humano, a 4°C, durante la noche. A continuación, la placa se lavó tres veces con PBS que contenía 0,2% de Tween-20, y se bloqueó con 250 μl/pocillo de PBS con 3% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente. Se retiró el tampón de bloqueo y se añadieron a la placa 50 μl de anticuerpos titulados, comenzando a 200 nM, y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Luego se lavó la placa tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,2% y se añadieron 50 μl de 100 ng/ml de biotina PD-L1 humana y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lavó tres veces con PBS que contenía 0,2% de Tween-20, y se añadieron 50 μl de Strep HRP (Jackson Immuno 106-030-084), diluido 1:5000, y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Luego se lavó la placa tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,2 % y se desarrolló usando 100 μl/pocillo de solución de sustrato A y B de TMB 1:1 (KPL) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 100 ul/pocillo<de H>2<SO>4<0,1 N y se leyó en un lector de placas Spectramax. Los datos se graficaron con GraphPad Prism.>

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el anticuerpo C produjo una señal que aumentó con la concentración del anticuerpo C demostrando que el anticuerpo C se une a PD-L1 humano y TlM-3 simultáneamente en estas condiciones. Un anticuerpo TIM-3 de control solo produjo una señal de fondo.

El anticuerpo C se une a las PD-L1 y TIM-3 objetivo simultáneamente en la superficie celular

La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para acoplarse simultáneamente a las proteínas TIM-3 y PD-L1 en la superficie celular puede probarse en un ensayo de reportero de células vivas para medir la Asociación Heterotípica de Receptores TIM-3:PD-L1 (HRA) (DiscoverX, Fremont, CA). El ensayo HRA se basa en la complementación de fragmentos enzimáticos y emplea dos fragmentos recombinantes de p-galactosidasa que son catalíticamente inactivos por separado y muestran poca afinidad entre sí. Cuando se añaden como compañeros de fusión a proteínas que sí se unen entre sí, los dos fragmentos pueden acercarse para reconstituir una enzima pgalactosidasa funcional. La actividad enzimática se controla mediante la luz producida durante la escisión de un sustrato quimioluminiscente.

Para el ensayo, las células U2OS se transfectaron en serie con constructos que codificaban TIM-3 (1-223)-PK y PD-L1(1-259)-EA (PK = fragmento de p-galactosidasa ProLink, EA = fragmento aceptor de enzima). Se eligieron células U2OS por su capacidad para tolerar la expresión ectópica de proteínas de membrana y se diseñaron constructos de TIM-3, PD-L1 para eliminar la mayor parte de los dominios intracelulares y posibles complicaciones tal como la internalización del receptor y la agrupación inducida por señales.

Las células de grupos estables U2OS TIM-3(1-223)-PK PD-L1(1-259)-EA se sembraron por cuadruplicado en placas de 384 pocillos (5000 células / pocillo). Se añadió a las células una serie de diluciones del anticuerpo C y de los correspondientes anticuerpos parentales anti-TIM-3 y anti-PD-L1 y se incubaron durante la noche (16 horas) a 37°C /<5% CO>2<. A continuación, se añadieron a las células reactivos de detección que contenían tampón de lisis y sustrato>enzimático, y la placa se leyó en un luminómetro Envision.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el anticuerpo C produce un aumento titulable de la señal con una EC50 de aproximadamente 2 nM, mientras que los correspondientes anticuerpos monoclonales de especificidad única frente a TIM-3 y PD-L1 son completamente inactivos. Estos datos indican que el anticuerpo C puede captar simultáneamente TIM-3 y PD-L1 en la superficie celular en estas condiciones.

El anticuerpo C une las células que expresan TIM-3 con las que expresan PD-L1

La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para puentear células que expresan TIM-3 y PD-L1 puede determinarse mediante análisis de citometría de flujo utilizando células CHO transfectadas que expresan PD-L1 y células DO11 que expresan TIM-3. En pocas palabras, las células que sobreexpresan CHO-PD-L1 y DO11-TIM-3 pueden marcarse diferencialmente con CFSE (éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína) (BD Horizon) o Cell Tracker Deep Red (CTDR/Thermo). Las células DO11-TIM-3 y CHO-PDL1 se incuban por separado durante 30 minutos con un anticuerpo de prueba, como el anticuerpo C (en hielo en PBS 1% de BSA 0,09% de azida sódica). Los anticuerpos no unidos pueden eliminarse mediante lavado (2X con 200 μl de PBS 1% de BSA 0,09% de azida sódica). Las células CHO-PDL1 se incuban 2 horas con 45 μg/ml del anticuerpo PD-L1 parental o control hIgG1 en hielo en PBS 1% BSA 0,09% azida sódico. Las células DO11-TIM-3 se incuban 2 horas con 45 μg/ml del anticuerpo TIM-3 progenitor o huIgG4-PAA en hielo en PBS 1%BSA 0,09% azida sódico. Las células Do11-TIM-3/anticuerpo C se mezclan con CHO-PDL1 el anticuerpo PD-L1 progenitor o hIgG1 a una concentración final de 22,5 ug/ml. Las células CHO-PDL1/Anticuerpo C se mezclan con DO11-TIM-3 el progenitor del anticuerpo TIM-3 o huIgG4-PAA a una concentración final de 22,5 μg/ml. Tras una incubación de aproximadamente 72 horas a 4°C, las células se miden en Fortessa X20 (con muestreador HTS) en canales adecuados para CFSE y CTDR. Utilizando el software FLOWJO® (FlowJo, LLC, Ashland, OR), los eventos doblemente positivos (CFSE+/ CTDR+) se separan y el porcentaje de eventos totales puede calcularse y notificarse (para 2 pocillos replicados). Los ajustes y las estadísticas se generan con Graphpad Prism utilizando regresión no lineal (pendiente variable, 4 parámetros).

En experimentos realizados esencialmente como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo C mediaba la formación de puentes celulares que se detectaban como eventos doblemente positivos por citometría de flujo. La unión del anticuerpo C a células DO11-TIM-3 o CHO-PDL1 (con posterior eliminación de los no unidos) y posterior mezcla con células CHO-PDL1 o DO11-TIM-3, respectivamente, provocó un aumento dependiente de la dosis de eventos doble positivos en relación con el fondo (aumento de hasta 4 veces en comparación con el tampón solo). Este aumento de eventos doble positivos se bloqueó mediante la adición de un exceso de mAbs PD-L1 y/o TIM-3 competidores a alta concentración, pero no mediante un control IgG no específico emparejado, lo que demuestra especificidad y dependencia de la expresión del antígeno objetivo.

Actividad funcional in vitro

1. ensayo basado en células hTIM-3 DO11

La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para aliviar la supresión de las células T mediante la inhibición de TIM-3 puede medirse en un ensayoin vitroDO11.

Para el ensayo basado en células DO11 hTIM-3, se colocaron 50 μl de células DO11 o DO11 sobreexpresantes de hTIM-3 a2*104 células/pocillo y 50 μl de células A20 a 2*104 células/pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con fondo en U (Greiner Cellstar, #651180), utilizando medio RμMI 1640 (Gibco, #11875-085). Se añadieron 50 μl de OVA (Sigma, #01641) a una concentración final de 0,2 μM (diluido en medio). Se añadieron 50 μl de anticuerpos diluidos en serie (diluidos en medio). Se añadió medio a algunos pocillos para que el volumen total fuera de 200 μl/pocillo. Se recogió el sobrenadante después de 18-22 horas y se midió la mIL-2 utilizando un kit ELISA (R&D, #SM2000).

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el anticuerpo C aumentó la activación de células T específica del antígeno OVA de una manera dependiente de la dosis con una EC50 de 4,366 nM medida por el aumento de los niveles de mIL-2, pero un control IgG humano no lo hizo.

2. Ensayo de reacción leucocitaria mixta (MLR)

La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para bloquear las señales de PD-L1 puede evaluarse midiendo la liberación de citoquinas durante la activación de células T en un ensayo MLRin vitro.Se espera que los niveles de ciertas citoquinas, tales como el IFN-y, aumenten si se promueve la activación de las células T por medio del tratamiento con anticuerpos de la presente invención.

Para el ensayo MLR, se aislaron monocitos de PBMC humanas (Allcells, # PB001) con el kit de aislamiento de monocitos humanos II (Miltenyi, #130-091-153) y se cultivaron durante 7 días con 62,5 ng/ml de GM-CSF y 20 ng/ml de IL-4 para diferenciar células dendríticas. Se colocaron 100 μl de 1*105 células T CD4 aisladas de PBMC (donante diferente de Allcells) con el kit de aislamiento de células T CD4 (Miltenyi, cat#130-091-155) y1*104 células dendríticas humanas derivadas de monocitos en una placa de 96 pocillos con fondo en U, con 100 μl de anticuerpos. Las células se incubaron en un incubador humidificado a 37 °C y 5% deC02, y los sobrenadantes se recogieron al cabo de tres días. La prueba ELISA de IFN-y humano se realizó en los sobrenadantes utilizando un kit R&D ELISA (# SIF50).

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, 4 nM de Anticuerpo C aumentaron los niveles de IFN-y en aproximadamente tres veces mientras que 8 nM de Anticuerpo C aumentaron los niveles de IFN-y en aproximadamente cinco veces. Estos resultados demuestran la capacidad del anticuerpo C para potenciar la respuesta de las células T alogénicas en este ensayo.

Estudios funcionales in vivo

1. Anticuerpo C en el modelo de xenoinjerto de CPNM humano HCC827

La eficacia de los anticuerpos de la presente invención se puede probar en el modelo de xenoinjerto de NSCLC humano HCC827 para evaluar la capacidad de retrasar o destruir tumores establecidos en el modelo mediante la mejora de la respuesta de las células T a los aloantígenos.

Para el estudio, el día 0, a ratones NSG de Jackson Laboratories (7 semanas de edad, hembras, en grupos de 8 ratones) se les implantó en el flanco por vía subcutánea 10 x106 células HCC827 en HBSS (0,2 ml de volumen total). Las células T humanas a granel aisladas de sangre total (New York Blood Center) se expandieron utilizando Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads® durante 10 días y se criopreservaron. Las células T se descongelaron, lavaron, contaron e infundieron por vía intravenosa (2,5 x106 células T en 0,2 ml de PBS por ratón) en ratones portadores del tumor HCC827 el día 36. A partir del día 36, los ratones se trataron con una inyección i.p. de IgG humana (20 mg/kg), el anticuerpo anti-PD-L1 parental del anticuerpo C (10 mg/kg) en combinación con el anticuerpo anti-TIM-3 parental del anticuerpo B (10 mg/kg) o el anticuerpo anti-TIM-3 parental del anticuerpo C (10 mg/kg), el anticuerpo B (20 mg/kg) o el anticuerpo C (20 mg/kg), una vez a la semana durante tres semanas (dosificación en d36, d43, d50). El bienestar y el comportamiento de los animales, incluyendo el aseo y la deambulación, se controlaron al menos dos veces por semana. El peso corporal y el volumen del tumor se midieron dos veces por semana. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana a partir del día 4 después de la implantación de las células utilizando calibradores electrónicos como se describe en el POE titulado: Medición del crecimiento tumoral por IM. El volumen tumoral se calculó mediante una fórmula: Volumen del tumor (mm3) = n/6 * Longitud * Anchura2.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, en el día 50, la combinación del anticuerpo anti-PD-LI parental del anticuerpo C y el anticuerpo anti-TIM-3 parental del anticuerpo C desaceleró el crecimiento tumoral en 62,5% al comparar el tamaño tumoral para tratados versus no tratados (T/C = 27,5%). La combinación del anticuerpo anti-PD-LI parental del anticuerpo B y el anticuerpo anti-TIM-3 parental del anticuerpo B ralentizó el crecimiento tumoral con T/C = 41,5%. En el día 5o, el tratamiento con el anticuerpo C hizo que el tamaño del tumor retrocediera 8,3% en comparación con el día 35, cuando se infundieron las células T. Por lo tanto, mientras que la combinación de un anticuerpo TIM-3 y un anticuerpo PD-L1 en el modelo HCC827 ralentizó el crecimiento tumoral, el anticuerpo C provocó la regresión del tamaño del tumor.

2. Anticuerpo C en ratones HSCTFL-NOG-F humanizados portadores del tumor L55 (modelo de CPNM)

La eficacia de los anticuerpos de la presente invención se puede probar en el modelo de xenoinjerto de NSCLC humano L55 para evaluar la capacidad de retrasar o destruir tumores establecidos en el modelo mediante la mejora de la respuesta de las células T a los aloantígenos.

Ratones NOG hembra de Jackson Laboratories se injertaron con células madre hematopoyéticas CD34+ humanas. La presencia de células huCD45+ y células CD45+ murinas (mCD45) en la sangre periférica del ratón se confirmó mediante citometría de flujo 16 semanas después del injerto. Para el estudio, el día 0, a los ratones HSCTFL-NOG-F se les implantó en el flanco por vía subcutánea el fragmento L55. Las células L55 se cultivaron en medio RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal más 1mM de Na piruvato y L-glutamina y los tumores L55 se cultivaron en ratones NSG para producir fragmentos para este estudio. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en grupos en función de un volumen tumoral medio de aproximadamente 180 mm3. El tratamiento se inició el día 26 seguido de una administración semanal (Q7DX3) de todos los anticuerpos los días 33, y 40. Para la combinación del anticuerpo anti-PD-L1 parental del anticuerpo C y el anticuerpo anti-TlM-3 parental del anticuerpo C, cada anticuerpo se dosificó a 10 mg/kg. Para el anticuerpo biespecífico, el anticuerpo C se dosificó a 20 mg/kg. El bienestar y el comportamiento de los animales, incluyendo el aseo y la deambulación, se controlaron al menos dos veces por semana. El peso corporal y el volumen del tumor se midieron dos veces por semana. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana a partir del día 4 después de la implantación de las células utilizando calibradores electrónicos como se describe en el POE titulado: Medición del crecimiento tumoral por IM. El volumen tumoral se calculó mediante una fórmula: Volumen del tumor (mm3) = n/6 * Longitud * Anchura2.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, en el día 40, la combinación del anticuerpo anti-PD-L1 parental del anticuerpo C y el anticuerpo anti-TIM-3 parental del anticuerpo C tuvo un T/C% del 50% al comparar el tamaño del tumor para el tratado versus el control (P=0,314 para el volumen del tumor). En el día 40, el tratamiento con el anticuerpo C retrasó el crecimiento del tumor en comparación con la combinación de los dos anticuerpos parentales y tuvo un T/C% del 7% al comparar el tamaño del tumor para el tratado frente al control (P=0,013 para el volumen del tumor).

3. Terapia combinada de anticuerpo C y pemetrexed en el modelo de xenoinjerto de CPNM humano L55

La eficacia de los anticuerpos de la presente invención en combinación con pemetrexed puede probarse en el modelo de xenoinjerto de NSCLC humano L55 para evaluar la capacidad de retrasar o destruir tumores establecidos en el modelo a través de la mejora de la respuesta de células T a aloantígenos.

Las células L55 se cultivarán en medio RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal más 1mM de Na-Piruvato y L-Glutamina. Para el estudio, el día 0, ratones NSG de Jackson Laboratories (7 semanas de edad, hembras, en grupos de 8 ratones) fueron implantados en el flanco por vía subcutánea con 5x106 células L55 en (50/50) matrigekHBSS (0,2 ml de volumen total). Se aislaron PBMC humanas a partir de aféresis (BioSpec) y se infundieron por vía intravenosa (11*106 células PBMC en 0,2 ml de PBS por ratón) en ratones portadores de tumores L55 el día 33, cuando los tumores alcanzaron ~250 mm3. A partir del día 34, los ratones se trataron con una inyección i.p. de IgG humana (20 mg/kg), anticuerpo C (20 mg/kg), o en combinación con pemetrexed (50 mg/kg). Pemetrexed estaba haciendo 5 días cada semana con 2 días de descanso en el medio. El anticuerpo se administró una vez por semana durante cuatro semanas (d34, d41, d48, d55). El día 47, se inyectó un segundo lote de PBMC 5M (mismo lote que la primera infusión) en ratones portadores del tumor L55. El bienestar y el comportamiento de los animales, incluyendo el aseo y la deambulación, se controlaron al menos dos veces por semana. El peso corporal y el volumen del tumor se midieron dos veces por semana. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana a partir del día 4 después de la implantación de las células utilizando calibradores electrónicos como se describe en el POE titulado: Medición del crecimiento tumoral por IM. El volumen tumoral se calculó mediante una fórmula: Volumen del tumor (mm3) = n/6 * Longitud * Anchura2.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el Anticuerpo C por sí mismo o la combinación de huIgG y pemetrexed resultó en "Sin Efecto" como se define por el procedimiento de Independencia de Bliss en este modelo. La combinación de anticuerpo C y pemetrexed ralentizó el crecimiento tumoral con T/C = 48,9% al final del estudio.

Estudio de liberación de citoquinas in vitro con anticuerpo C unido a placas en PBMC humanas

El potencial de los anticuerpos de la presente invención para provocar el síndrome de liberación de citoquinas puede evaluarse midiendo la liberación de citoquinas en un ensayo en placa utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) frescas. El síndrome de liberación de citoquinas inducido por el tratamiento con anticuerpos es una reacción indeseable para la mayoría de los pacientes, y el tratamiento con un anticuerpo biespecífico podría elevar el riesgo.

Se incubaron PBMC recién aisladas de seis sujetos sanos con el anticuerpo C unido a la placa, o con anticuerpos de control durante 24 horas, en un amplio intervalo de titulación de 0,1 |jg a 10 |jg. Los controles positivos fueron el anticuerpo anti CD3<e>humano, OKT3, y un anticuerpo terapéutico superagonista homólogo específico de CD28, TGN1412. Se sabe que ambos anticuerpos provocan una tormenta de citoquinas en la clínica. El control negativo fue un anticuerpo de isotipo hIgGI (IgG1-EN) nulo. Se añadieron por triplicado un total de 2 * 105 células por pocillo (200 jL ) a las placas recubiertas de anticuerpos y se incubaron durante 24 horas a 37°C, 5% CO2. Tras la incubación, las placas se centrifugaron a 400 g durante 5 minutos; los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron y almacenaron a -80 °C antes de la determinación de las citoquinas. Utilizando un kit MSD personalizado de ensayo 5-plex (Cat# K151A0H-2; Meso Scale Discovery), se midieron cinco citoquinas incluyendo, IFN- y, IL-2, IL-6, IL-10, y TNF-a en sobrenadantes de cultivos celulares siguiendo las instrucciones del fabricante.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, la incubación de PBMC humanas con el anticuerpo C en una amplia gama de concentraciones no produjo niveles significativos de liberación de citoquinas para IFN- y, IL-2, IL-6, IL-10 y TNF-a. Por el contrario, la incubación de PBMC con anticuerpos anti-CD3£ y control positivo TGN1412 dio lugar a una producción robusta de citoquinas para las cinco citoquinas analizadas en la mayoría de los donantes.

Estudio de liberación de citoquinas in vitro con anticuerpo C soluble en sangre humana total

El potencial de los anticuerpos de la presente invención para provocar el síndrome de liberación de citoquinas también puede evaluarse midiendo la liberación de citoquinas con anticuerpos solubles de la presente invención en sangre total humana.

Muestras de sangre humana entera fresca de 10 donantes sanos se incubaron con el anticuerpo soluble C, o el anticuerpo de control durante 24 horas, a 100 jg/mL. Los controles positivos incluyeron el anticuerpo anti CD3<e>humano, OKT3, y un homólogo anti CD52 humano (Campath). Se sabe que OKT3 y Campath provocan una "tormenta de citoquinas" en la clínica. Los controles negativos fueron un anticuerpo terapéutico disponible comercialmente infliximab no asociado con el síndrome de liberación de citoquinas en clínica y un anticuerpo de isotipo hIgG1 (IgG1-EN) de efector nulo (EN). Se analizó un amplio panel de citoquinas, incluyendo IFN-<y>, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 y TNF-a, utilizando un ensayo multiplex personalizado basado en la plataforma Mesoscale en sobrenadantes de plasma humano (Cat# K15049D-1, Meso Scale Discovery).

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, la incubación de muestras de sangre humana con Campath u OKT3 resultó en una liberación robusta de citoquinas en todos los donantes de varias de las citoquinas analizadas incluyendo las citoquinas asociadas con la RSC (IFN-y, IL-6, TNF-a, e IL-10). Por el contrario, la incubación con el anticuerpo C o con infliximab no desencadenó ninguna liberación significativa de citoquinas en 10 donantes sanos. El anticuerpo C no dio lugar a una liberación intensa de citoquinas cuando se incubó con sangre total humana durante un máximo de 24 horas a una concentración de hasta 100 jg/ml.

Ensayo de inmunogenicidad in vitro

Los anticuerpos de la presente invención están diseñados para ser heterodiméricos con cada mitad del anticuerpo uniendo un objetivo diferente. Con la composición no natural de los anticuerpos heterodiméricos, la inmunogenicidad es un riesgo potencial que debe evaluarse.

El EpiScreen™ DC: Se utilizó un ensayo de células T para determinar el potencial relativo de inmunogenicidad clínica del anticuerpo C. Se prepararon células dendríticas derivadas de monocitos a partir de PBMC de una cohorte de 50 donantes sanos, se cargaron con el anticuerpo C y se indujeron a un fenotipo maduro para presentar epítopos de células T a células T CD4+ autólogas purificadas. Las respuestas de las células T se midieron mediante la proliferación de células T (captación de[3H]-timidina) y la secreción de citoquinas IL-2 (ELISpot).

Los ensayos EpiScreen™ de curso temporal de células T con un grupo de biológicos conocidos (tales como infliximab, adalimumab y bevacizumab) han mostrado una correlación clara entre la frecuencia de respuestas de células T del donante en el ensayo EpiScreen™ y el nivel de inmunogenicidad (respuestas de anticuerpos terapéuticos antiproteína) observado en la clínica. Se han observado respuestas de donantes de alta frecuencia en los ensayos EpiScreen<™>para anticuerpos inmunogénicos tales como alemtuzumab, mientras que se observaron respuestas de donantes de frecuencia relativamente baja para anticuerpos no inmunogénicos tales como omalizumab y trastuzumab. En general, las terapias proteicas que inducen una respuesta positiva inferior o igual al 10% en el ensayo EpiScreen<™>se asocian a un bajo riesgo de inmunogenicidad en la clínica.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el análisis de la frecuencia y magnitud de las respuestas de células T CD4+ indicó que el anticuerpo C indujo respuestas positivas modestas en 6-8% de la cohorte de donantes y, por lo tanto, muestra un bajo riesgo de inmunogenicidad clínica.

Análisis in vitro de la función de efector inmunitario del anticuerpo C

Como terapia potencial en cáncer con un anticuerpo biespecífico contra PD-L1 humano y TIM-3 humano, no es deseable la función efectora inmunitaria producida por el anticuerpo. El anticuerpo C está diseñado para carecer de la función de efector inmunitario. Para confirmar la ausencia de función efectora inmunitaria, el anticuerpo C se probó en ensayos de unión en fase sólida estándar para la unión a receptores Fcy humanos y C1q, y para la inducción de una respuesta de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en ensayosin vitroestándar basados en células.

Para el ensayo de unión del receptor Fcy humano en fase sólida, las proteínas recombinantes del receptor Fcy (FcyR) utilizadas en este ensayo son FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb y FcyRIIIa(V). La proteína receptora se diluyó en PBS y se recubrió (50 ng/pocillo) en una placa Meso Scale (MSD cat# L15XA-3). Tras una incubación de una noche a 4°C, las placas se lavaron con PBS/0,05% Tween-20 (PBST) tres veces y se bloquearon durante 1-2 horas a temperatura ambiente con 150 μl/pocillo de Bloqueador A de MSD al 5% (MSD cat# R93BA-1) en PBST. A continuación, se lavaron las placas tres veces con PBST y se añadieron a cada pocillo 30 μl de anticuerpo de prueba o anticuerpo de control (Tabla 3), diluidos en Bloqueador A de MSD al 1%, y se dejaron incubar durante dos horas. Tras la incubación, las placas se lavaron dos veces con PBST y se añadieron 30 μl de anticuerpo secundario (MSD Cat#D20TF-6) a cada pocillo y se dejaron incubar durante una hora a temperatura ambiente con agitación. A continuación, se lavaron las placas con PBS<t>y se añadieron 150 μl de tampón de lectura 1X (MSD cat # R92TC-1) a cada pocillo. A continuación, las placas se leyeron en el Sector Imager 2400.

Para el ensayo ELISA de unión a C1q, se utilizó una placa ELISA de poliestireno de 96 pocillos (Thermo Scientific Cat.

3855) se recubrió con anticuerpos de prueba y controles (Rituximab-IgG1-efector nulo y otro anticuerpo IgG1-efector nulo humano) a concentraciones que oscilaban entre 200-0,0305 μg/mL en PBS. Tras una incubación de una noche a 4°C, las placas se lavaron tres veces con PBST y luego se bloquearon con 300 μl de tampón de caseína (Thermo Fisher cat#37528) durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBST y después se añadieron 0,5 μg/pocillo de C1q (Quidel Cat# A400), diluido en tampón de bloqueo de caseína. Tras dos horas a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con PBST y se añadieron 50μl de anticuerpo secundario (1:200, Abd Serotec Inc #2221-5004P) a cada pocillo. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces con PBST. 100 μL de 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina (TMB: KPL cat# 50-65-01/02 ), un sustrato de HRP, y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se detuvo la reacción (KPL cat# 50-85-06 ) y se midió la absorbancia a 450 nM utilizando un lector de microplacas.

Para el ensayo ADCC, las células objetivo PD-L1 y TIM-3-positivas y las células Wil2S CD20-positivas se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos (Perkin Elmer, #600-5680) a una densidad de 10000 células/pocillo en 50 μl de tampón de ensayo ADCC (0,5%BSA en RPMI 1640). Las células se incubaron durante 30 minutos (todas las incubaciones con células se realizaron a 37°C y 5% de CO<2>a menos que se indique lo contrario) seguidas de la adición de 25 μl/pocillo de anticuerpos de prueba titulados diluidos en tampón de ensayo ADCC. Tras una incubación de 30 minutos con los anticuerpos de prueba, se añadieron 25 μl de células efectoras (células Jurkat positivas para FcyRIIIa con un constructo reportero de NFAT-luciferasa) en una proporción de 15:1 (efector:objetivo) y se incubaron durante 5-6 horas. La actividad luciferasa de las células efectoras activadas se midió tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con 100 μl de sustrato Bright-Glo<™>Luciferase (Promega, #G7940). La luminiscencia se cuantificó utilizando un lector de placas de microtitulación y los datos se analizaron utilizando un modelo de cuatro parámetros para determinar los valores EC<50>de cada anticuerpo.

Para el ensayo ADCP, las células objetivo PD-L1 y TIM-3-positivas y las células Wil2S CD20-positivas se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos (Perkin Elmer, #600-5680) a una densidad de 10000 células/pocillo en 50 μl de tampón de ensayo ADCP (0,5%BSA en RPMI 1640). Las células se incubaron durante 30 minutos (todas las incubaciones con células se realizaron a 37°C y 5% de CO<2>a menos que se indique lo contrario) seguidas de la adición de 25 μl/pocillo de anticuerpos de prueba titulados diluidos en tampón de ensayo ADCP. Tras una incubación de 30 minutos con los anticuerpos de prueba, se añadieron 25 μl de células efectoras (células Jurkat positivas para FcyRIIa con un constructo reportero de NFAT-luciferasa; Promega G9885) en una proporción de 6:1 (efector:objetivo) y se incubaron durante 5-6 horas. La actividad luciferasa de las células efectoras activadas se midió tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con 100 μl de sustrato Bright-Glo<™>Luciferase (Promega, #G7940). La luminiscencia se cuantificó utilizando un lector de placas de microtitulación y los datos se analizaron utilizando un modelo de cuatro parámetros para determinar los valores EC<50>de cada anticuerpo.

Para el ensayo CDC, se sembraron células objetivo adherentes en placas blancas de fondo plano de 96 pocilios (Perkin Elmer, #600-5680) a 25000 células/pocillo en 100 μl/pocillo de medio de crecimiento celular. Tras una incubación de una noche (todas las incubaciones con células se realizaron a 37 °C y 5% de CO2, salvo que se indique lo contrario), se retiró el medio y se añadieron 50 μl de tampón de ensayo CDC (RPMI 1640, 10% FBS con 0,1% BSA y 25 mM de HEPES). Las células en suspensión se sembraron el día del ensayo a una densidad de 50.000 células/pocillo en 50 μl de tampón de ensayo CDC. Los anticuerpos de prueba y de control se añadieron por duplicado a las placas y se incubaron durante 30 minutos. Tras la incubación, se añadieron 50 μl de complemento humano (S1764; Sigma), diluido en 5 ml de tampón de ensayo (1:5), a cada pocillo durante una hora. Tras la incubación, se añadieron a cada pocillo 16 μl/pocillo de reactivo Alamar Blue (Invitrogen, DAL1100). Las placas se incubaron durante 22 horas y después se sacaron de la incubadora y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante 5 minutos. La fluorescencia se leyó en Synergy Neo2 (excitación:560 nm, emisión: 590 nm) y la lisis celular CDC se expresó en relación con la lisis celular completa inducida por Triton x 100.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el anticuerpo C no demostró unión específica a ninguno de los receptores Fcy humanos probados, ni a C1q. Además, no hubo respuesta detectable en ensayos ADCC, ADCP o CDC basados en células utilizando líneas celulares TIM-3 y PD-L1 positivas relevantes para el anticuerpo C. Estos resultados demuestran que el anticuerpo C carece de función efectora inmunitaria detectable dentro de los límites de detección de los ensayos realizados.

Farmacocinética en mono

Se puede probar la estabilidad de los anticuerpos de la presente invención en monos utilizando análisis farmacocinéticos (FC) séricos en ensayos ELISA.

Para caracterizar la FC sérica del anticuerpo C, se analizaron muestras de suero en tres formatos diferentes de ensayo inmunoenzimático (ELISA). Se empleó un ELISA de inmunoglobulina total (IgG) para cuantificar la presencia de IgG total en el esqueleto, independientemente de la competencia de unión a TIM-3 o PD-L1. El intervalo de la curva estándar para el anticuerpo C fue de 125-8000 ng/mL, con un límite superior de cuantificación (ULOQ) de 3000 ng/mL y un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de 300 ng/mL. Además, se emplearon un ELISA de captura de antígeno TIM-3 y un ELISA de captura de antígeno PD-L1 para cuantificar la presencia de fármaco activo en suero. Para el ELISA de captura del antígeno TIM-3, el intervalo de ensayo para el anticuerpo C fue de 125-8000 ng/mL, con un ULOQ de 3000 ng/mL y un LLOQ de 300 ng/mL. Para el ELISA de captura del antígeno PD-L1, el intervalo de la curva estándar para el anticuerpo C fue de 125-8000 ng/mL, con un límite superior de cuantificación (ULOQ) de 3000 ng/mL y un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de 300 ng/mL.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, los ensayos ELISA de captura de antígeno funcional e IgG total para TIM-3 y PD-L1 fueron cuantitativamente similares en todos los niveles de dosis, lo que indica estabilidad en el anticuerpo C y retención de la capacidad de unión funcional con el tiempoin vivo.

Secuencias de aminoácidos y nucleótidos

SEQ ID NO: 1 (PD-L1 humano)

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIV

YWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDA

GVYRCMIS Y GGAD YKRIT VKVNAP YNKIN QRIL VVDP VT SEHELTCQ AEGYPK A

EVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENH

TAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQD

TN SKKQ SDTHLEET SEQ ID NO: 2 (TIM-3 humano)

MF SHLPFDC VLLLLLLLLTRS SEVEYRAE V GQNAYLPCF YTP AAPGNL VP V CW G

KGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTffiNVTLADSGIY CCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIK SEQ ID NO: 3 (HCVR de PD-L1 Ab en el anticuerpo A, el anticuerpo B y el anticuerpo C)

Q YQL VQ S GAE VKKP GS S VK V S CK A SGGTF S S Y AI S W VRQ APGQ GLEWMGGIEPIF GT AN Y A QKF Q GR VTIT ADK S TS T A YMEL S SLRSEDT A V Y Y C ARSPD Y SP Y Y Y Y G MDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 4 (LCVR de PD-L1 Ab en el anticuerpo A, el anticuerpo B y el anticuerpo C) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRP SGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGIKLTVLG

SEQ ID NO: 5 (HCVR de TIM-3 Ab en el Anticuerpo A) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGS GGS T Y Y AD S VKGRF TISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDT A Y Y Y C ARY ART AFDL W GQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 6 (HCVR de TIM-3 Ab en el Anticuerpo B) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFSF S SFYFSWVRQAPGKGLEWVS AISGNG RS T Y Y AD S VKGRF TISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDT A V Y Y C ARY YNT GFDL W G QGTLVTVSS

SEQ ID NO: 7 (HCVR de TIM-3 Ab en el Anticuerpo C) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGN GK S T Y Y AD S VKGRF TISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDT A V Y Y C AR YYNT GFDL W GQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 8 (LCVR de TIM-3 Ab en el Anticuerpo A)

DIVMT Q SP S SLS AS VGDRVTITC Q ASE AIY GYLNW Y QQKPGKAPKLLIY AAS SLPI GVP SRF S GS GS GTDF TLTIS SLQPEDF AT Y Y C QQ A Y GFPPTF GQGTKLEIK

SEQ ID NO: 9 (LCVR de TIM-3 Ab en el Anticuerpo B)

DIVMT Q SP S SLS AS VGDRVTITC Q ASE AIY GYLNW Y QQKPGKAPKLLI Y AAS SLPI GVP SRF S GS GS GTDF TLTIS SLQPEDF AT Y Y C QQ A Y GFPPTF GQGTKLEIK

SEQ ID NO: 10 (LCVR de TIM-3 Ab en el Anticuerpo C) DIVMTQSPSSLSASVGDGVTITCQASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSIVS GVP SRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDF AT YY C QQ AS SFPPTF GQGTKLEIK

SEQ ID NO: 11 (HC de PD-L1 Ab en el anticuerpo A, el anticuerpo B y el anticuerpo C) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIEPIF GTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSPDYSPYYYYG MD VWGQGTTVT V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST SGGT A ALGCLVKD YFPEP VT VS WNSG ALTSGVHTFP A VLQS SGL Y SLK S V VT VP S S SLGT QT YICN VNHKP SNTK VD KRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 12 (LC de PD-L1 Ab en el anticuerpo A, el anticuerpo B y el anticuerpo C) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRP SGVPDRESGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGnCLTVLGQ PK AAP S VTLFPP S SEELQ ANK ATL V CLISDF YPGA VT V AWK AD S SP VK AGVETTT PSKQSNNKYAAESELSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS

SEQ ID NO: 13 (HC de TIM-3 Ab en el Anticuerpo A) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGS GGS T Y Y AD S VKGRF TISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDT A Y Y Y C AR Y ART AFDL W GQGTLVTVSSASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVTD YFPEP VTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLESSGLYSLWSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYYYSYSHEDPEY KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW E SN GQPENNYKTTPP VLD SDGSF AL V SKL T VDK SRWQQGN VF S C S VMHE ALHN HYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 14 (HC de TIM-3 Ab en el Anticuerpo B) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSFYFSWVRQAPGKGLEWVSAISGNG RS T Y Y AD S VKGRF TISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDT A V Y Y C ARY YNT GFDL W G QGTLVTVSSASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVTD YFPEP VTVSWNSGAL T SGVHTFP AVLES SGL Y SLW S VVTVP S S SLGTQT YICNVNFDCP SNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYVYPP SRDELTKNQ V SLT CL VKGF YP SDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 15 (HC de TIM-3 Ab en el Anticuerpo C) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGN GK S T Y Y AD S VKGRF TISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDT AY Y Y C AR YYNT GFDL W GQGTLVTVSSASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVTDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFP AYLES SGLYSLWS YVT VP S S SLGTQT YICNVNHKPSNTK VDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEV KFNW YVDGYEVHN AKTKPREEQ YN ST YRVV S VL T VLHQD WLN GKE YKCKV SN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW E SN GQPENN YKTTPP VLD SDGSF AL V SKL T VDK SRW Q QGN VF SC S VMHE ALFTN HYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 16 (LC de TIM-3 Ab en el Anticuerpo A) DIVMTQSPSSLSASVGDGVTITCQASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLRSALTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 17 (LC de TIM-3 Ab en el Anticuerpo B) DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEAIYGYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLPI GVP SRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDF AT YY C QQ AY GFPPTF GQGTKLEIKRT VAA PSVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKD ST Y SLRS ALTL SKAD YEKHK VY ACE VTHQGL S SP VTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 18 (LC de TIM-3 Ab en el Anticuerpo C) DIVMTQSPSSLSASVGDGVTITCQASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSIVS GVPSRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDF ATYYCQQ AS SFPPTFGQGTKLEIKRT VAAP SVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLRSALTLSKAD YEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 19 (región del dominio CH1 de PD-L1 Ab HC) GPSYFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLKS SEQ ID NO: 20 (región del dominio CH2de PD-L1 Ab HC) APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVS

SEQ ID NO: 21 (región del dominio CH2de PD-L1 Ab HC)

SNKALPAPIEK

SEQ ID NO: 22 (región del dominio CH3 de PD-L1 Ab HC)

REPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVL DSDGSF SEQ ID NO: 23 (región del dominio CH1 de TIM-3 Ab HC)

EAPSSKSTS GGT AALGCL VTD YFPEP VT V S WN S GALT S GVHTFP A VLE S S GL YSL WSVVTVPS

SEQ ID NO: 24 (región del dominio CH2 de TIM-3 Ab HC) APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVS

SEQ ID NO: 25 (región del dominio CH2 de TIM-3 Ab HC)

APIEKTISKAK

SEQ ID NO: 26 (región del dominio CH3 de TIM-3 Ab HC) VYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF ALVSKL

SEQ ID NO: 27 (región de la constante de la cadena ligera de PD-L1 Ab) ANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAAESE

SEQ ID NO: 28 (región de la constante de la cadena ligera de TIM-3 Ab) RVGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLRSALTL

SEQ ID NO: 29 Secuencia de ADN de PD-L1 LC para anticuerpo C

CAGTCCGTCC TGACTCAGCC ACCTTCCGCT AGCGGTACCC CCGGCCAGAG AGTGACAATC TCATGCTCCG GTTCCAGCTC TAACATTGGC TCTAACACTG TCAATTGGTA CCAGCAGCTG CCAGGAACCG CACCAAAGCT GCTGATCTAT GGAAACTCAA ATAGGCCTAG CGGGGTGCCA GACCGGTTTA GCGGATCTAA AAGTGGGACT TCAGCTTCCC TGGCAATTTC TGGACTGCAG AGTGAGGACG AAGCTGATTA CTATTGCCAG TCCTACGATA GTTCACTGAG CGGTTCCGTG TTCGGCGGAG GGATCAAGCT GACAGTCCTG GGCCAGCCCA AGGTGAGTTC TAGAGGATCC ATCTGGGATA AGCATGCTGT TTTCTGTCTG TCCCTAACAT GCCCTGTGAT TATCCGCAAA CAACACACCC AAGGGCAGAA CTTTGTTACT TAAACACCAT CCTGTTTGCT TCTTTCCTCA GGCCGCTCCT TCCGTGACTC TGTTTCCCCC TTCCAGCGAG GAACTGCAGG CCAATAAGGC CACCCTGGTG TGCCTGATTA GCGACTTCTA TCCTGGAGCT GTGACAGTCG CATGGAAGGC CGATTCTAGT CCAGTGAAAG CAGGGGTCGA GACCACAACT CCCTCCAAGC AGAGCAACAA CAAGTACGCA GCCGAGTCTG AACTGAGTCT GACCCCAGAA CAGTGGAAGT CCCACAGGAG TTATTCATGC CAGGTGACCC ATGAGGGCTC CACAGTGGAG AAGACCGTGG CCCCTGCTGA GTGTAGC SEQ ID NO: 30 Secuencia de ADN de PD-L1 LC para anticuerpo C

GACATCGTGA TGACCCAGTC CCCTTCCAGC CTGTCTGCCT CCGTGGGCGA CGGAGTGACC ATCACATGCC AGGCTAGCCA GGATATCTAC AACTATCTGA ATTGGTACCA GCAGAAGCCT GGCAAGGCCC CAAAGCTGCT GATCTATTAC GCTTCTTCCA TCGTGTCTGG AGTGCCATCC AGGTTCAGCG GATCTGGATC CGGAACCGAC TTTACCCTGA CAATCAGCTC TCTGCAGCCT GAGGATTTCG CCACATACTA TTGCCAGCAG GCTTCCTCTT TCCCCCCTAC CTTTGGCCAG GGCACAAAGC TGGAGATCAA GAGAACCGTG GCCGCTCCAT CCGTGTTCAT CTTTCCACCC AGCGACGAGC AGCTGAAGTC TGGCACAGCT AGGGTGGGCT GTCTGCTGAA CAACTTCTAC CCCCGGGAGG CCAAGGTGCA GTGGAAGGTG GATAACGCTC TGCAGAGCGG CAATTCTCAG GAGTCCGTGA CCGAGCAGGA CAGCAAGGAT TCTACATATT CCCTGAGAAG CGCCCTGACA CTGAGCAAGG CCGATTACGA GAAGCACAAG GTGTATGCTT GCGAGGTGAC CCATCAGGGC CTGTCCAGCC CAGTGACAAA GTCTTTCAAT CGCGGCGAGT GT SEQ ID NO: 31 Secuencia de ADN de PD-L1 LC para anticuerpo C

CAGGTCCAGC TGGTGCAGAG CGGAGCCGAA GTGAAGAAAC CCGGTAGCAG CGTCAAAGTG TCATGTAAAG CCTCAGGGGG AACATTCTCC AGCTACGCCA TCTCCTGGGT GAGACAGGCT CCAGGACAGG GACTGGAGTG GATGGGAGGA ATCATCCCTA TCTTCGGCAC CGCCAACTAC GCTCAGAAGT TTCAGGGCCG CGTGACCATC ACAGCCGACA AGAGCACCTC TACAGCTTAT ATGGAGCTGT CTTCCCTGAG AAGCGAGGAT ACAGCCGTGT ACTATTGCGC TCGCTCCCCC GACTACAGCC CTTACTATTA CTATGGCATG GACGTGTGGG GCCAGGGCAC CACAGTGACC GTGAGCTCTG CTAGCACAAA GGGCCCATCC GTGTTCCCAC TGGCTCCATC CAGCAAGTCC ACCAGCGGAG GAACAGCCGC TCTGGGCTGT CTGGTGAAGG ACTATTTCCC AGAGCCAGTG ACCGTGTCCT GGAACAGCGG CGCCCTGACC TCTGGAGTGC ACACATTTCC CGCTGTGCTG CAGTCTTCCG GCCTGTACTC TCTGAAGTCC GTGGTGACCG TGCCTAGCTC TTCCCTGGGC ACCCAGACAT ATATCTGCAA CGTGAATCAC AAGCCTTCCA ATACAAAGGT GGACAAGAGG GTGGAGCCAA AGAGCTGTGA TAAGACCCAT ACATGCCCCC CTTGTCCTGC TCCAGAGGCT GCTGGAGGAC CAAGCGTGTT CCTGTTTCCA CCCAAGCCCA AGGACACCCT GATGATCTCT AGGACCCCTG AGGTGACATG CGTGGTGGTG TCCGTGTCCC ACGAGGACCC AGAGGTGAAG TTTAACTGGT ACGTGGATGG CGTGGAGGTG CATAATGCTA AGACCAAGCC TAGGGAGGAG CAGTACAACA GCACCTATCG GGTGGTGTCT GTGCTGACAG TGCTGCATCA GGATTGGCTG AACGGCAAGG AGTATAAGTG CAAGGTGTCT AATAAGGCCC TGCCCGCTCC TATCGAGAAG ACCATCTCCA AGGCCAAGGG CCAGCCTAGG GAGCCACAGG TGTACGTGCT GCCTCCAAGC CGGGACGAGC TGACAAAGAA CCAGGTGTCT CTGCTGTGCC TGGTGAAGGG CTTCTATCCA TCTGATATCG CTGTGGAGTG GGAGTCCAAT GGCCAGCCCG AGAACAATTA CCTGACCTGG CCCCCTGTGC TGGACAGCGA TGGCTCTTTC TTTCTGTATT CCAAGCTGAC AGTGGATAAG AGCCGGTGGC AGCAGGGCAA CGTGTTCTCC TGTTCTGTGA TGCACGAGGC ACTGCACAAT CATTACACCC AGAAATCCCT GTCACTGAGC CCCGGCAAG SEQ ID NO: 32 Secuencia de ADN de TIM-3 LC para anticuerpo C

GAGGTGCAGC TGCTGGAGTC TGGGGGGGGT CTGGTGCAGC CCGGGGGTAG CCTGCGTCTG TCTTGTGCCG CCTCTGGGTT TACTTTTTCC AGCTACTATA TGAGCTGGGT GAGACAGGCT CCTGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGTCTGCC ATCAGCGGCA ACGGCAAATC TACCTACTAT GCTGACTCCG TGAAGGGCAG ATTCACCATC AGCCGCGATA ACTCTAAGAA TACACTGTAC CTGCAGATGA ACAGCCTGCG CGCTGAGGAC ACCGCCGTGT ACTATTGCGC CAGATATTAT AACACAGGCT TCGATCTGTG GGGCCAGGGC ACCCTGGTGA CAGTGTCTTC CGCTAGCACC AAGGGCCCAA GCGTGTTTCC AGAGGCTCCA AGCTCTAAGT CCACCAGCGG AGGAACAGCC GCTCTGGGCT GTCTGGTGAC CGACTACTTC CCAGAGCCCG TGACAGTGTC CTGGAACAGC GGCGCTCTGA CCTCTGGCGT GCACACATTT CCAGCCGTGC TGGAGTCCAG CGGCCTGTAC TCCCTGTGGT CCGTGGTGAC CGTGCCCAGC TCTTCCCTGG GCACCCAGAC ATATATCTGC AACGTGAATC ACAAGCCATC CAATACAAAG GTGGACAAGA GGGTGGAGCC CAAGAGCTGT GATAAGACCC ATACATGCCC CCCTTGTCCT GCTCCAGAGG CTGCTGGAGG ACCATCCGTG TTCCTGTTTC CACCCAAGCC TAAGGACACC CTGATGATCA GCAGGACCCC AGAGGTGACA TGCGTGGTGG TGTCCGTGTC CCACGAGGAC CCTGAGGTGA AGTTCAACTG GTACGTGGAT GGCGTGGAGG TGCATAATGC TAAGACAAAG CCCAGGGAGG AGCAGTACAA CAGCACCTAT CGGGTGGTGT CTGTGCTGAC AGTGCTGCAT CAGGATTGGC TGAACGGCAA GGAGTATAAG TGCAAGGTGT CTAATAAGGC TCTGCCCGCC CCTATCGAGA AGACCATCTC CAAGGCCAAG GGCCAGCCTA GAGAGCCACA GGTGTACGTG TATCCTCCAA GCCGCGACGA GCTGACCAAG AACCAGGTGT CTCTGACATG TCTGGTGAAG GGCTTTTACC CTTCTGATAT CGCTGTGGAG TGGGAGTCCA ATGGCCAGCC AGAGAACAAT TATAAGACCA CACCCCCTGT GCTGGACTCT GATGGCTCCT TCGCCCTGGT GTCCAAGCTG ACCGTGGATA AGAGCAGGTG GCAGCAGGGC AACGTGTTCT CCTGTTCTGT GATGCACGAG GCACTGCACA ACCATTACAC CCAGAAGTCC CTGTCCCTGA GCCCCGGCAA A

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1) y TIM-3 humano (SEQ ID NO: 2) que comprende:

a) una primera cadena pesada (HC) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 22,

b) una primera cadena ligera (LC) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 27,

c) una segunda HC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 26,

d) una segunda LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 28; y en donde la primera LC forma un enlace disulfuro entre cadenas con la primera HC, la segunda LC forma un enlace disulfuro entre cadenas con la segunda HC, y la primera HC forma dos enlaces disulfuro entre cadenas con la segunda HC, y la primera HC y la segunda HC son de isotipo IgG1 humano.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde:

a) la primera HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:

20 y SEQ ID NO:

21, y

b) la segunda HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO:

25.

3. Un anticuerpo biespecífico que se une a PD-L1 humano (SEQ ID NO: 1) y TIM-3 humano (SEQ ID NO:

2) que comprende dos cadenas ligeras (CL) y dos cadenas pesadas (HC), en las que:

a) la primera LC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12,

b) la primera HC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11,

d) la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, y la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

5. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, y la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

6. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, y la segunda HC tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

7. Una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 18, en donde la célula es capaz de expresar el anticuerpo de la reivindicación 6.

8. Una célula de mamífero que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de ADN comprende una secuencia polinucleotídica que codifica polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO:

12, y en donde la segunda molécula de ADN comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 18, en donde la célula es capaz de expresar el anticuerpo de la reivindicación 6.

9. Un procedimiento para producir un anticuerpo biespecífico que comprende cultivar la célula de mamífero de la reivindicación 7 u 8 en condiciones tales que se exprese el anticuerpo biespecífico, y recuperar el anticuerpo expresado.

10. Un anticuerpo biespecífico producido cultivando una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID n O: 18 en condiciones tales que se exprese el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo expresado.

11. Un anticuerpo biespecífico producido cultivando una célula de mamífero que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en donde la primera molécula de a Dn comprende una secuencia polinucleotídica que codifica polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, y en donde la segunda molécula de<a>D<n>comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 18 en condiciones tales que se exprese el anticuerpo biespecífico, y recuperar el anticuerpo expresado.

12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 11 y un vehículo, diluyente o excipiente aceptable.

13. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 11, para uso como medicamento.

14. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 10 a 11, para uso en el tratamiento del cáncer.

15. 15. El anticuerpo biespecífico para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, sarcoma de tejidos blandos, colangiocarcinoma o carcinoma hepatocelular.

16. El anticuerpo biespecífico para su uso según la reivindicación 15, en donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas o mesotelioma.

17. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o 10-11 para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes de tratamiento estándar seleccionados del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas de paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFO<x>(leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecán), gemcitabina, topotecán, irinotecán liposomal, pemetrexed y cetuximab, en el tratamiento del cáncer.