BR112019020812A2

BR112019020812A2 - anticorpos anti-pd-l1-anti-tim-3 biespecíficos

Info

Publication number: BR112019020812A2
Application number: BR112019020812A
Authority: BR
Inventors: Lincoln Ludwig Dale; Edmondo Paolo D'ANGELO Igor; Shen Yang; Zhang Yi; Li Yiwen
Original assignee: Lilly Co Eli; Zymeworks Inc
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2020-04-28
Also published as: AU2018250793B2; MA50222A; US20190247497A1; CL2019002802A1; IL269577B; EP3609920B1; US11351251B2; CR20190409A; ECSP19073314A; KR102261582B1; IL269577A; CA3057834A1; EP3609920A1; DOP2019000235A; EA201992145A1; CN110546165A; ZA201905711B; PE20191743A1; MX2019012222A; TWI677503B

Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos que são heterodiméricos e se ligam a pd-l1 humana e ao tim-3 humano, e podem ser úteis para o tratamento de câncer sozinhos e em combinação com quimioterapia e outros terapêuticos de câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para

ANTICORPOS ANTI-PD-L1-ANTI-TIM-3 BIESPECÍFICOS.

[001] A presente invenção refere-se ao campo da medicina. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a anticorpos biespecíficos que ligam morte celular programada humana 1 ligante 1 (PD-L1) e imunoglobulina de célula T e proteína-3 contendo o domínio de mucina (TIM-3) e pode ser útil para tratar tumores sólidos e hematológicos isoladamente e em combinação com quimioterapia e outras terapias de câncer.

[002] As células tumorais escapam à detecção e eliminação pelo sistema imunológico através de múltiplos mecanismos. As vias de pontos de verificação imunológicas são usadas na manutenção da autotolerância e controle da ativação das células T, porém as células cancerígenas podem usar as vias para suprimir a resposta antitumoral e evitar sua destruição.

[003] A PD-L1/via de morte celular programada humana 1 (PD-1) é um desses pontos de verificação imunes. A PD-1 humana é encontrada nas células T e PD-L1 é aberrantemente expressa por uma variedade de tipos de tumores; A ligação de PD-L1 a PD-1 inibe a proliferação de células Tea produção de citocinas. O eixo inibitório de PD-1/PD-L1 foi subjugado por tumores como parte do processo seletivo natural que molda a evolução do tumor no contexto de uma resposta imune antitumoral.

[004] TIM-3 é um receptor de ponto de verificação identificado como tendo um papel fundamental na supressão funcional de células T exauridas. As células T que reconhecem antígenos tumorais podem ser isoladas de modelos de pacientes e camundongos, porém essas células podem exibir um fenótipo esgotado caracterizado por deficiência nas funções citotóxicas, produção de citocinas efetoras e

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2/54 proliferação. Essas células T podem expressar altos níveis do regulador de ponto de verificação TIM-3.

[005] Enquanto o alvejamento terapêutico da via de PD-1/PD-L1 é clinicamente validado, há uma resposta objetiva variável em pacientes com câncer entre 9-45% em tumores PD-L1-negativos e PDL2-positivos, e muitos pacientes não alcançam uma resposta duradoura. O bloqueio combinado de dois ou mais receptores de pontos de verificação pode aumentar a frequência de respostas objetivas e alcançar eficácia em pacientes com câncer que podem ser refratários à monoterapia com um anticorpo de bloqueio de PD-1 ou PD-L1.

[006] Tratamento in vitro de linfócitos infiltrados de tumor colhidos de camundongos portadores de tumor CT26 com dois anticorpos, um anticorpo anti-camundongo TIM-3, que pode interagir com células T e um anticorpo anti-camundongo PD-L1, que pode interagir separadamente com as células tumorais de camundongo resultou em controle mais eficaz do crescimento do tumor de camundongo do que o alvejamento de qualquer via isolada (Sakuishi e outros JEM 2010, 207: 2187 e WO 2015/048312).

[007] Uma molécula pequena oral que antagonize PD-L1 e TIM-3 foi registrada (Sasikumar e outros, AACR; Cancer Res 2016; 76 (14 Suppl): Abstract 4861). Este composto de molécula pequena foi relatado para demonstrar eficácia em modelos de tumores de camundongos singênicos.

[008] Permanece a necessidade de fornecer compostos que possam ligar e inibir igualmente PD-L1 humana e TIM-3 humano, porém da mesma forma têm a especificidade alvo e a farmacocinéticos de um anticorpo. Em particular, permanece a necessidade de fornecer anticorpos biespecíficos heterodiméricos que se ligam igualmente PDL1 humana e TIM-3 humano, em que o anticorpo biespecífico

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3/54 heterodimérico permite emparelhamento de duas cadeias pesadas diferentes e duas cadeias leves diferentes em um único anticorpo semelhante a IgG. Além disso, existe uma necessidade de o anticorpo biespecífico assemelhar-se à estrutura do anticorpo nativo como medido por modelagem, espectrometria de massa e análises de estabilidade para propósitos tais como baixa imunogenicidade, farmacocinéticas in vivo estáveis e estabilidade adequada. Adicionalmente, permanece a necessidade de fornecer anticorpos biespecíficos anti-humano PD-L1 e anti-humano TIM-3 que possuam uma ou mais das seguintes características: simultaneamente ligar e conectar células tumorais expressando PD-L1 e células T expressando TIM-3, suprimem as vias inibidoras do ponto de verificação de PD-1 e TIM-3, exibem melhor atividade antitumoral como medido em um modelo de tumor do que uma combinação de um anticorpo anti-PD-L1 e um anticorpo anti-TIM-3, e falta de funções efetoras imunológicas.

[009] Desta maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N^Q: 1) e ao TIM-3 humano (SEQ ID N^Q: 2) compreendendo:

uma primeira cadeia pesada (HC) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 3, uma primeira cadeia leve (LC) compreendendo uma região variável de cadeia leve (LCVR) possuindo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 4, uma segunda HC compreendendo um HCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 5, SEQ ID N^Q: 6, ou SEQ ID N^Q: 7, uma segunda LC compreendendo um LCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 8, SEQ ID N^Q: 9, ou SEQ ID N^Q: 10;

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4/54 e em que, a primeira LC forma uma ligação de dissulfeto de intercadeia com a primeira HC, a segunda LC forma uma ligação de dissulfeto de intercadeia com a segunda HC, e a primeira HC forma duas ligações de dissulfeto de intercadeia com a segunda HC, e a primeira HC e a segunda HC são isotipo de IgG 1 humano.

[0010] A presente invenção da mesma forma fornece um anticorpo em que a segunda HC compreende um HCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 5, e a segunda LC compreende um LCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 8. A presente invenção da mesma forma fornece um anticorpo em que a segunda HC compreende um HCVR possuindo a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 6 e a segunda LC compreende um LCVR possuindo a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 9. A presente invenção da mesma forma fornece um anticorpo, em que a segunda HC compreende um HCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 7, e a segunda LC compreende um LCVR possuindo a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 10.

[0011] A presente invenção da mesma forma fornece urn anticorpo, em que:

a primeira HC compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 19 e SEQ ID N²: 22, a segunda HC compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 23 e SEQ ID N²: 26, a primeira LC compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 27 e a segunda LC compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 28.

[0012] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N²: 1) e ao TIM-3 humano (SEQ ID N²: 2) compreendendo:

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5/54 uma primeira HC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 3, SEQ ID N²: 19 e SEQ ID N²: 22, uma primeira LC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 4 e SEQ ID N²: 27, uma segunda HC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 5, SEQ ID N²: 23 e SEQ ID N²: 26, uma segunda LC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 8 e SEQ ID N²: 28;

e em que, a primeira LC forma uma ligação de dissulfeto de intercadeia com a primeira HC, a segunda LC forma uma ligação de dissulfeto de intercadeia com a segunda HC, e a primeira HC forma duas ligações de dissulfeto de intercadeia com a segunda HC, e a primeira HC e a segunda HC são isotipo de IgG 1 humano.

[0013] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N²: 1) e ao TIM-3 humano (SEQ ID N²: 2) compreendendo:

uma primeira HC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 3, SEQ ID N²: 19 e SEQ ID N²: 22, uma primeira LC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 4 e SEQ ID N²: 27, uma segunda HC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 6, SEQ ID N²: 23 e SEQ ID N²: 26, uma segunda LC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 9 e SEQ ID N²: 28;

[0014] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a

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PD-L1 humana (SEQ ID N²: 1) e ao TIM-3 humano (SEQ ID N²: 2) compreendendo:

uma primeira HC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 3, SEQ ID N²: 19 e SEQ ID N²: 22, uma primeira LC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 4 e SEQ ID N²: 27, uma segunda HC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 7, SEQ ID N²: 23 e SEQ ID N²: 26, uma segunda LC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 10 e SEQ ID N²: 28;

[0015] A presente invenção da mesma forma fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N²: 1) e ao TIM-3 humano (SEQ ID N²: 2), em que:

a primeira HC compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 20 e SEQ ID N²: 21, e a segunda HC compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 24 e SEQ ID N²: 25.

[0016] Para as SEQ ID N^2S: 19-28, a Tabela 1 mapeia onde as sequências se correlacionam no anticorpo. Para as SEQ ID N^2S: 3-10, a Tabela 2 mapeia onde as sequências se correlacionam no anticorpo.

[0017] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N²: 1) e ao TIM-3 humano (SEQ ID N²: 2) compreendendo duas cadeias leves (LC) e duas cadeias pesadas (HC), em que:

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7/54 a primeira LC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 12, a primeira HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 11, a segunda LC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 16, SEQ ID N²: 17, ou SEQ ID N²: 18, e a segunda HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 13, SEQ ID N²: 14 ou SEQ ID N²: 15.

[0018] A presente invenção fornece um anticorpo compreendendo duas cadeias leves (LC) e duas cadeias pesadas (HC), em que:

a primeira LC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 12, a primeira HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 11, a segunda LC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 16, SEQ ID N²: 17, ou SEQ ID N²: 18, e a segunda HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 13, SEQ ID N²: 14 ou SEQ ID N²: 15.

[0019] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N²: 1) e ao TIM-3 humano (SEQ ID N²: 2) compreendendo duas cadeias leves (LC) e duas cadeias pesadas (HC), em que:

a primeira LC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 12, e a primeira HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 11, e a segunda LC e a segunda HC têm as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 16 e SEQ ID N²: 13, SEQ ID N²: 17 e SEQ ID N²: 14, ou SEQ ID N²: 18 e SEQ ID N²: 15, respectivamente.

[0020] A presente invenção da mesma forma fornece um anticorpo, em que a segunda LC tem a sequência de aminoácido de

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SEQ ID N²: 16 e a segunda HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 13. A presente invenção da mesma forma fornece urn anticorpo, em que a segunda LC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 17 e a segunda HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 14. A presente invenção da mesma forma fornece urn anticorpo, em que a segunda LC tem a sequência de aminoácido da SEQ ID. N²: 18, e a segunda HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 15.

[0021] A presente invenção fornece um meio anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N²: 1) compreendendo uma LC e uma HC, em que a LC possui a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 12 e a HC tem a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 11.

[0022] A presente invenção fornece um meio anticorpo que se liga ao TIM-3 humano (SEQ ID N²: 2) compreendendo uma LC e uma HC, em que a LC e a HC possuem as sequências de aminoácido de SEQ ID N²: 16 e SEQ ID N²: 13, SEQ ID N²: 17 e SEQ ID N²: 14, ou SEQ ID N²: 18 e SEQ ID N²: 15, respectivamente.

Tabela 1: Sequências mapeadas para a região da cadeia pesada ou cadeia leve de lgG1

SEQ ID N^e	Região	Posições de aminoácido de Anticorpo C que se correlaciona com a sequência
19	CH1	128-190 de cadeia pesada de anticorpo PD-L1 (SEQ ID N^s: 11)
20	CH2	237-271 de cadeia pesada de anticorpo PD-L1 (SEQ ID N^s: 11)
21	CH2	330-340 de cadeia pesada de anticorpo PD-L1 (SEQ ID N^s: 11)
22	CH3	350-410 de cadeia pesada de anticorpo PD-L1 (SEQ ID N^s: 11)
23	CH1	128-190 de cadeia pesada de anticorpo TIM-3 (SEQ ID N^s: 15)
24	CH2	231-265 de cadeia pesada de anticorpo TIM-3 (SEQ ID N^s: 15)
25	CH2	330-340 de cadeia pesada de anticorpo TIM-3 (SEQ ID N^s: 15)
26	CH3	350-410 de cadeia pesada de anticorpo TIM-3 (SEQ ID N^s: 15)
27	CL	131-181 de cadeia leve de anticorpo PD-L1 (SEQ ID N^s: 12)
28	CL	131 -181 de cadeia leve de TIM-3 (SEQ ID N^s: 18)

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9/54 [0023] A presente invenção fornece uma célula de mamífero compreendendo uma molécula de DNA compreendendo uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos tendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 11, SEQ ID N^Q: 15, SEQ ID N^Q: 12, e SEQ ID N^Q: 18, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo da presente invenção.

[0024] A presente invenção fornece uma célula de mamífero compreendendo uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 11 e SEQ ID N^Q: 12 e em que a segunda molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 15 e SEQ ID N^Q: 18, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo da presente invenção.

[0025] A presente invenção fornece uma célula de mamífero compreendendo uma primeira molécula de DNA, uma segunda molécula de DNA, uma terceira molécula de DNA e uma quarta molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 11, a segunda molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 12, a terceira molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácido de SEQ ID N-: 15 e a quarta molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 18, em que a célula é capaz de expressar um anticorpo da presente invenção.

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10/54 [0026] A presente invenção fornece um processo para a produção de um anticorpo da presente invenção compreendendo a cultura de uma célula de mamífero da presente invenção em condições tais que o anticorpo seja expresso e recupere o anticorpo expresso.

[0027] A presente invenção fornece um anticorpo produzido por um processo da presente invenção.

[0028] A presente invenção fornece um anticorpo produzido por cultura de uma célula de mamífero compreendendo uma molécula de DNA compreendendo uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos tendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 11, SEQ ID N^Q: 15, SEQ ID N^Q: 12 e SEQ ID N^Q: 18 sob condições tais que o anticorpo é expresso e recuperar o anticorpo expresso.

[0029] A presente invenção fornece um anticorpo produzido por cultura de uma célula de mamífero compreendendo uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 11 e SEQ ID N^Q: 12, e em que a segunda molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID N^Q: 15 e da SEQ ID N^Q: 18 sob condições tais que o anticorpo seja expresso e recuperar o anticorpo expresso.

[0030] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica, compreendendo um anticorpo da presente invenção e um veículo, diluente ou excipiente aceitável.

[0031] A presente invenção fornece um método de tratamento do câncer, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção da mesma forma fornece um modo de tratamento do câncer, compreendendo administrar a um paciente em necessidade

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11/54 do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, em que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer do fígado, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer dos rins, câncer da bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário, câncer do endométrio, câncer do esôfago, sarcoma dos tecidos moles, colangiocarcinoma ou carcinoma hepatocelular.

[0032] A presente invenção fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é melanoma. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer de pulmão. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas ou mesotelioma. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer de cabeça e pescoço. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer do fígado. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer colorretal. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer do pâncreas. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer gástrico. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer do rim. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer da bexiga. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer da próstata. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer de mama. A presente invenção

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12/54 da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer do ovário. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer endometrial. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é câncer do esôfago. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é sarcoma dos tecidos moles. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é colangiocarcinoma. A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento do câncer, em que o câncer é carcinoma hepatocelular.

[0033] A presente invenção da mesma forma fornece métodos compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo da presente invenção em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais padrões de agentes de auxílio selecionados a partir do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossômica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteína paclitaxel para suspensões injetáveis, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluoruracila e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluoruracila e irinotecano), gencitabina, topotecano, irinotecano lipossômico, pemetrexedo e cetuximabe.

[0034] A presente invenção da mesma forma fornece métodos compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo da presente invenção em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitumorais selecionados a partir do grupo consistindo em nivolumabe, ipilimumabe, pidilizumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilumabe, atezolizumabe, epacadosatato e durvalumabe.

[0035] A presente invenção da mesma forma fornece métodos

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13/54 compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo da presente invenção compreendendo combinação simultânea, separada ou sequencial com radiação ionizante.

[0036] A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso em terapia. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer, em que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer do fígado, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer dos rins, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer de mama, câncer do ovário, câncer do endométrio, câncer do estômago, sarcoma dos tecidos moles, colangiocarcinoma ou carcinoma hepatocelular.

[0037] A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de melanoma. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer de pulmão. A presente invenção da mesma forma fornece um anticorpo da presente invenção, em que o câncer de pulmão é um câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas ou mesotelioma. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer de cabeça e pescoço. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer de fígado. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer colorretal. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer pancreático. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer gástrico. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer renal. A presente invenção fornece um anticorpo

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14/54 da presente invenção, para uso no tratamento de câncer de bexiga. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer de próstata. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer de mama. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de câncer de ovário. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer endometrial. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do câncer de esôfago. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de sarcoma de tecidos moles. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento de colangiocarcinoma. A presente invenção fornece um anticorpo da presente invenção, para uso no tratamento do carcinoma hepatocelular.

[0038] A presente invenção fornece o anticorpo da presente invenção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais padrões de agentes de cuidado selecionados a partir do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossômica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, paclitaxel, partículas ligadas a proteína paclitaxel para suspensão injectável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluoruracila e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluoruracila e irinotecano), gencitabina, topotecano, irinotecano lipossômico, pemetrexedo e cetuximabe, no tratamento do câncer.

[0039] A presente invenção fornece o anticorpo da presente invenção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitumorais selecionados a partir do grupo consistindo em nivolumabe, ipilimumabe, pidilizumabe,

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15/54 pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilumabe, atezolizumabe, epacadostato, e durvalumabe, no tratamento de câncer.

[0040] A presente invenção fornece o anticorpo da presente invenção para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com radiação ionizante, no tratamento de câncer.

[0041] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, em que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer do fígado, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer do rim, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer de mama, câncer dos ovários, câncer do endométrio, câncer do estômago, sarcoma dos tecidos moles, colangiocarcinoma ou carcinoma hepatocelular. A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, em que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas ou mesotelioma.

[0042] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de melanoma, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer de pulmão, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer de cabeça e pescoço, compreendendo uma quantidade eficaz

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16/54 de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer do fígado, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer colorretal, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer pancreático, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer do rim, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer da bexiga, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer de próstata, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer de mama, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer do ovário, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer do endométrio, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer esofágico, compreendendo uma quantidade

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17/54 eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de sarcoma de tecidos moles, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de colangiocarcinoma, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento do carcinoma hepatocelular, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção.

[0043] A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, em que a referida composição farmacêutica administrada em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais padrões de agentes de cuidado selecionados a partir do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossômica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteína paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluoruracila e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluoruracila e irinotecano), gemcitabina, topotecano, irinotecano lipossômico, pemetrexedo e cetuximabe.

[0044] A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, em que a referida composição farmacêutica administrada em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes antitumorais selecionados a partir do grupo consistindo em nivolumabe, ipilimumabe, pidilizumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilumabe, atezolizumabe, epacadosatato e durvalumabe.

[0045] A presente invenção da mesma forma fornece uma

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18/54 composição farmacêutica para uso no tratamento do câncer, em que a referida composição farmacêutica é administrada em combinação simultânea, separada ou sequencial com radiação ionizante.

[0046] A presente invenção fornece o uso de um anticorpo da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer. A presente invenção da mesma forma fornece o uso de um anticorpo da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer, em que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer do fígado, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer do rim, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer de mama, câncer dos ovários, câncer do endométrio, câncer do estômago, sarcoma dos tecidos moles, colangiocarcinoma ou carcinoma hepatocelular. A presente invenção da mesma forma fornece o uso de um anticorpo da presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas ou mesotelioma.

[0047] A presente invenção da mesma forma fornece o uso de um anticorpo da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em que o referido medicamento é para ser administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com um ou mais padrões de agentes de cuidado selecionados a partir do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossomal, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteína paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluoruracila e irinotecano), gemcitabina, topotecano, irinotecano lipossômico, pemetrexedo e cetuximabe.

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19/54 [0048] A presente invenção da mesma forma fornece o uso de um anticorpo da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em que o referido medicamento será administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com um ou mais agentes antitumorais selecionados a partir do grupo consistindo em nivolumabe, ipilimumabe, pidilizumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, urelumabe, lirilumabe, atezolizumabe, epacadosatato e durvalumabe.

[0049] A presente invenção fornece o uso de um anticorpo da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em que o referido medicamento será administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com radiação ionizante.

[0050] Um anticorpo da presente invenção é um complexo polipeptídico manipulado, que não ocorre naturalmente. Uma molécula de DNA da presente invenção é uma molécula de DNA de ocorrência não natural compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos em um anticorpo da presente invenção.

[0051] O anticorpo da presente invenção é um anticorpo do tipo IgG e tem cadeias “pesadas” e cadeias “leves” que são reticuladas através de ligações de dissulfeto intra e intercadeias. Cada cadeia pesada é composta por uma HCVR N-terminal e uma região constante da cadeia pesada (“HCCR”). Cada cadeia leve é composta por uma LCVR e uma região constante de cadeia leve (“LCCR”). As cadeias leves formam ligações de dissulfeto com uma cadeia pesada, e as duas cadeias pesadas formam duas ligações de dissulfeto entre si.

[0052] A região constante das cadeias pesadas contém domínios de CH1, CH2 e CH3. CH1 vem depois do HCVR; o CH1 e o HCVR formam a porção da cadeia pesada de um Fab. CH2 vem depois da

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20/54 região de articulação e antes de CH3. O CH3 vem depois do CH2 e está na extremidade de terminal carbóxi da cadeia pesada.

[0053] A região constante das cadeias leves contém um domínio, CL. CL vem depois do LCVR; o CL e o LCVR formam a parte de cadeia leve de um Fab.

[0054] Os anticorpos da presente invenção são heterodiméricos em que cada braço do anticorpo exibe ligação monovalente seletiva ao seu antígeno cognato devido a duas cadeias pesadas diferentes e a duas cadeias leves diferentes que formam o anticorpo. Na presente invenção, um braço do anticorpo liga-se a PD-L1 humana (SEQ ID N^Q:

1) e o outro braço liga-se ao TIM-3 humano (SEQ ID N^Q: 2). Para garantir uma reunião adequada destes anticorpos biespecíficos, as mutações são incorporadas na sequência das cadeias pesadas na região de CH1 e CH3 e na sequência das cadeias leves dentro da região constante de cadeia leve. As mutações de CH1 e LC são feitas para favorecer o emparelhamento nativo dos pares de cadeias leves e cadeias pesadas requeridas e desfavorecem o desemparelhamento de cadeia leve. As mutações de CH3 são feitas para favorecer o emparelhamento heterodimérico das duas cadeias pesadas distintas e desfavorecer a formação de homodímeros. As mutações na região CH3 da porção anti-PD-L1 do anticorpo preferivelmente incluem as posições 356, 372, 398 e 400, numeradas pela posição absoluta em SEQ ID N^Q: 11 (posições 350, 366, 392 e 394 se utilizarem Numeração UE). Mutações na região CH3 da porção anti-TIM-3 do anticorpo preferencialmente incluem posições 350, 351, 356, 405 e 407 como numeradas pela posição absoluta em SEQ ID N^Q: 15 (posições 350, 351,405 e 407 se usar a Numeração UE). As mutações na região CH1 da porção anti-PD-L1 do anticorpo preferivelmente inclui as posições 189, tal como numeradas por posição absoluta em SEQ ID N^Q: 11 (posição 183, se utilizar a Numeração UE). As mutações na região

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CH1 da porção anti-TIM-3 do anticorpo preferivelmente incluem, as posições 128, 147, 175 e 183 como numeradas por posição absoluta em SEQ ID N^Q: 15 (posições 128, 147, 175 e 183 se utilizar Numeração UE).

[0055] As mutações na região CL da porção anti-PD-L1 do anticorpo preferivelmente incluem, as posições 179 e 181, tal como numeradas por posição absoluta em SEQ ID N^Q: 11 (posições 176 e 178 se utilizar a Numeração UE). Mutações na região CL da porção anti-TIM-3 do anticorpo preferencialmente incluem posições 131, 133, 176 e 178 como numeradas pela posição absoluta em SEQ ID N^Q: 15 (posições 131, 133, 176 e 178 se usando Numeração de UE).

[0056] Em certos anticorpos da presente invenção, as mutações de emparelhamento heterodimérico de cadeia pesada produzem uma estabilidade térmica de CH3 superior a 80°C, que é comparável aos anticorpos nativos (Tabela 1 e Von Kreudenstein, e outros, 2014).

[0057] Quando expressos em certos sistemas biológicos, os anticorpos com sequências Fc são glicosilados na região Fc. Tipicamente, glicosilação ocorre na região Fc do anticorpo em um sítio de N-glicosilação altamente conservado. Os N-glicanos tipicamente se ligam à asparagina. Anticorpos podem ser glicosilados em outras posições também.

[0058] Opcionalmente, certos anticorpos da presente invenção contêm uma porção Fc que é derivada de lgG1 humana. IgG 1 é bem conhecido por ligar as proteínas da família de receptores de Fc-gama (FcyR) bem como a C1 q. A interação com esses receptores pode induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Portanto, certas substituições de aminoácidos são introduzidas em IgG 1 Fc para certos anticorpos da presente invenção, incluindo os Anticorpos A, B e C, para ablacionar a função efetora imunitária. Mutações na região CH2

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22/54 da porção anti-PD-L1 do anticorpo pode incluir as posições 240, 241 e 271 como numeradas por posição absoluta em SEQ ID N^Q: 11 (posições 234, 235 e 265 se utilizar a numeração de UE). Mutações na região CH2 da porção anti-TIM-3 do anticorpo podem incluir posições 234, 235 e 265 como numeradas por posição absoluta em SEQ ID N^Q: 15 (posições 234, 235 e 265 se usando numeração EU).

[0059] Um DNA isolado codificando uma região de HCVR pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de tamanho natural através de ligação operativa do DNA de codificação de HCVR a outra molécula de DNA codificando regiões constantes de cadeia pesada. As sequências de genes, da região constante de cadeia pesada de humano, assim como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos, por exemplo, por amplificação de PCR convencional.

[0060] Um DNA isolado que codifica uma região LCVR pode ser convertido em um gene de cadeia leve de tamanho natural operativamente ligando-se o DNA de codificação de LCVR a outra molécula de DNA codificando uma região constante de cadeia leve. As sequências de genes da região constante de cadeia leve de seres humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda. Preferencialmente, para anticorpos da presente invenção, a região constante de cadeia leve da porção anti-PD-L1 do anticorpo é uma cadeia leve lambda e a região constante de cadeia leve da porção anti-TIM-3 do anticorpo é uma cadeia leve kappa.

[0061] Os polinucleotídeos da presente invenção serão expressos em uma célula hospedeira após as sequências terem sido operativamente ligadas a uma sequência de controle da expressão. Os

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23/54 vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico do hospedeiro. Comumente, os vetores de expressão conterão marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina, neomicina e diidrofolato redutase, para permitir detecção daquelas células transformadas com as sequências de DNA desejadas.

[0062] O anticorpo da presente invenção pode ser facilmente produzido em células de mamífero tais como células CHO, NSO, HEK293 ou COS. As células hospedeiras são cultivadas usando técnicas bem conhecidas na técnica.

[0063] Os vetores contendo as sequências polinucleotídicas de interesse (por exemplo, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos do anticorpo e as sequências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular.

[0064] Vários métodos de purificação de proteínas podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) e Scopes, Purification Protein: Principies and Practice, 3rd Edition, Springer., NY (1994).

[0065] Em outra modalidade da presente invenção, o anticorpo, ou os ácidos nucleicos que codificam o mesmo, é fornecido na forma isolada. Quando aqui utilizado, o termo “isolado” se refere a uma proteína, peptídeo ou ácido nucleico que está livre ou substancialmente livre de qualquer outra espécie macromolecular encontrada em um ambiente celular. Substancialmente livre como aqui utilizado significa que a proteína, peptídeo ou ácido nucleico de interesse compreende mais do que 80% (em uma base molar) das espécies macromoleculares presentes, preferencialmente mais do que 90% e mais preferencialmente mais do que 95%.

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24/54 [0066] O anticorpo da presente invenção, ou composições farmacêuticas compreendendo o mesmo, pode ser administrado por vias parenterais (por exemplo, subcutânea e intravenosa). Um anticorpo da presente invenção pode ser administrado a um paciente apenas com veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis em doses únicas ou múltiplas. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas por métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Remington: The Science e Practice de Pharmacy, 22- ed. (2012), A. Loyd e outros, Pharmaceutical Press) e compreendem um anticorpo, como descrito aqui, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0067] O termo tratando (ou tratar ou tratamento) se refere a atrasar, interromper, deter, aliviar, parar, reduzir ou reverter a progressão ou gravidade de um sintoma existente, distúrbio, condição ou doença.

[0068] Liga-se como aqui usado em referência à afinidade de um anticorpo para PD-L1 humana (SEQ ID N^Q: 1), TIM-3 humano (SEQ ID N^Q: 2), ou ambos é pretendido significar, a menos que de outra maneira indicado, um Kd de menos do que cerca de 1 x 10^-6 M, preferivelmente menos do que cerca de 1 x 10^-9 M como determinado por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo por uso de um biossensor de ressonância de plásmon superficial (SPR) a 37°C essencialmente como descrito aqui.

[0069] Quantidade eficaz significa a quantidade de um anticorpo da presente invenção ou composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da presente invenção que elicitará a resposta biológica ou médica de ou efeito terapêutico desejado em um tecido, sistema, animal, mamífero ou humano que está sendo procurado pelo pesquisador, médico, o outro clínico. Uma quantidade eficaz do

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25/54 anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz é da mesma forma aquela em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo é superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[0070] Esta invenção é também ilustrada pelo seguinte exemplo não limitante.

Exemplo 1: Expressão e purificação de anticorpo [0071] Os polipeptídeos das regiões variáveis da cadeia pesada e de cadeia leve, as sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve completas do Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C, e as sequências nucleotídicas que as codificam, estão listadas abaixo na seção intitulada Sequências de Aminoácidos e Nucleotídeos. Além disso, as SEQ ID NOs para a região variável de cadeia leve, cadeia pesada, cadeia leve e cadeia pesada do Anticorpo A, B e C são mostradas na Tabela 2.

[0072] Os anticorpos da presente invenção, incluindo, porém não limitados a, Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C, podem ser feitos e purificados essencialmente como se segue. Uma célula hospedeira apropriada, tal como CHO, pode ser transitoriamente ou estavelmente transfectada com um sistema de expressão para segregar anticorpos utilizando um vector quad, vetores duplos ou quatro vetores simples em uma relação de 20HC anti-TIM-3: 10HC anti-PD-L1: 24LC antiTIM-3: 46LC anti-PD-L1. SEQ ID N^Q: 29 a SEQ ID N^Q: 32 são sequências de DNA para cadeias leves e cadeias pesadas do Anticorpo C; a cadeia leve do anticorpo PD-L1 tem um íntron interno para aumentar os níveis de expressão em relação à cadeia leve do TIM-3. Meios clarificados, em que o anticorpo foi secretado, podem ser purificados usando qualquer uma das muitas técnicas comumente usadas. Por exemplo, o meio pode ser convenientemente aplicado a

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26/54 uma coluna MabSelect (GE Healthcare), ou coluna KappaSelect (GE Healthcare) para o fragmento Fab, que foi equilibrado com um tampão compatível, tal como solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). A coluna pode ser lavada para remover os componentes de ligação não específicos. O anticorpo ligado pode ser eluído, por exemplo, por gradiente de pH (tal como 20 mM de tampão Tris pH 7 em tampão de citrato de sódio 10 mM pH 3,0 ou solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 em tampão de glicina 100 mM pH 3,0). Frações de anticorpos podem ser detectadas, tal como por SDS-PAGE, e em seguida podem ser agrupadas. O agregado solúvel e multímeros podem ser efetivamente removidos por técnicas comuns, incluindo a exclusão por tamanho, interação hidrofóbica, troca iônica, cromatografia multimodal ou hidroxiapatita. O anticorpo pode ser concentrado e/ou esterilizado por filtração utilizando técnicas comuns. O produto pode ser imediatamente congelado a -70°C ou pode ser liofilizado.

Tabela 2: SEQ ID N^2S

	Anticorpo A	Anticorpo B	Anticorpo C
HCVR1 -anti-PD-L1	3	3	3
HCVR2 - anti-TIM-3	5	6	7
LCVR1 - anti-PD-L1	4	4	4
LCVR2 - anti-TIM-3	8	9	10
Cadeia pesada 1 - anti-PD-L1	11	11	11
Cadeia pesada 2 - anti-TIM-3	13	14	15
Cadeia leve 1 - anti-PD-L1	12	12	12
Cadeia leve 2 - anti-TIM-3	16	17	18

Ensaios

Ligação in vitro de anticorpos [0073] Com um anticorpo biespecífico heterodimérico, um braço

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27/54 do anticorpo (uma cadeia leve e uma cadeia pesada) liga-se monovalentemente a um antígeno e o segundo braço do anticorpo (uma cadeia leve e uma cadeia pesada) liga-se monovalentemente ao segundo antígeno. A capacidade dos anticorpos da presente invenção para manter uma ligação comparável a cada antígeno, quando comparada com os anticorpos parentais que se ligam bivalentemente ao antígeno, pode ser avaliada por um ensaio Biacore.

[0074] A cinética de ligação e a afinidade do Anticorpo C e seus anticorpos parentais aos antígenos correspondentes TIM-3 e PD-L1 foram analisadas por ressonância de plásmon superficial (SPR) usando o instrumento biossensor BIAcore T200 (GE Healthcare) a 37°C. O Fab humano foi imobilizado em chip sensor CM5 usando acoplamento de amina no nível de imobilização 7000 a 9000 RU. As amostras de anticorpos foram diluídas em tampão HBS-EP + e injetadas a uma taxa de fluxo de 30 μΙ_/ιτιίη. Uma concentração serial de antígeno de braço único TIM-3 humano (TIM-3-SAG) e PD-L1 foi marcado com Fc (PD-L1-Fc) durante 180 segundos, seguido por um tempo de dissociação de 1200 segundos. Sensoresgramas foram avaliados utilizando o software de avaliação Biacore T200 3.0 e o cálculo das constantes de taxa de associação (Ka) e dissociação (Kd) foi baseado em um ajuste de modelo de ligação de Langmuir 1:1. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) ou constante de afinidade de ligação foi calculada a partir da relação das constantes da taxa cinética Kd/Ka.

[0075] A ligação de antígeno monovalente a PD-L1 para o Fab do Anticorpo A foi 6,5 x 10^-10 M e foi comparável com a ligação bivalente de PD-L1 pelo Fab do anticorpo parental anti-PD-L1. A ligação de PDL1 monovalente dos Fabs dos Anticorpos B e C foram da mesma forma comparáveis ao Fab do anticorpo parental anti-PD-L1.

[0076] A ligação de antígeno monovalente a TIM-3 para o Fab do

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Anticorpo A foi de 2,53 x 10'⁹ M e foi aproximadamente 33 vezes menor do que a afinidade de ligação bivalente do anticorpo anti-TIM-3 parental. O Fab do Anticorpo B tinha um Kd de 1.91 x 10 ¹⁰ M contra TIM-3 e o Fab do Anticorpo C tinha um Kd de 1,11 x 10 ¹⁰ M contra TIM-3. A ligação monovalente de Fab do Anticorpo B tinha uma afinidade três vezes mais baixa do que a afinidade de ligação bivalente do anticorpo anti-TIM-3 parental, enquanto a ligação monovalente de Fab do Anticorpo C foi comparável com a afinidade de ligação bivalente do parental.

Estabilidade Térmica [0077] Com um anticorpo biespecífico heterodimérico, emparelhamento de duas cadeias pesadas diferentes e o emparelhamento seletivo de cadeias leves cognatas com cada cadeia pesada respectiva é exigido. A capacidade dos anticorpos da presente invenção manter a estabilidade comparável a um anticorpo nativo pode ser testada por análise de DSC.

[0078] Os estudos foram realizados a 1 mg/mL em PBS utilizando um MicroCai VP-Capillary DSC (Serial# 11.05083.CAP). Todas as amostras foram escaneadas dentro da faixa de temperatura de 25100°C com uma taxa de varredura de 60°C/hora. As soluções foram pressurizadas a cerca de 60 psi nos capilares durante cada varredura. Para cada proteína, varredura de tampão/tampão foi subtraída da varredura de tampão/proteína e o termograma foi normalizado para a concentração de proteínas. A correção da linha de base foi realizada e o ponto médio de cada desnaturação térmica (T_m) foi obtido a partir do pico máximo.

[0079] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, a análise DSC do Anticorpo C mostrou estabilidade térmica (Tmi 67°C, Tmi2 76°C, Tms 83°C) com temperaturas de desdobramento comparáveis como os anticorpos parentais (anti-PD

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L1 Ab: Tmi 67°C, Trri2 75°C, Tms 82°C, anti-TIM-3 Ab: Tmi 64°C, Trri2 85°C).

Ligação simultânea a PD-L1 e TIM-3, conforme medido por ELISA [0080] A capacidade para os anticorpos da presente invenção se ligarem a PD-L1 e TIM-3 simultaneamente pode ser medida em um ensaio ELISA sanduíche. A proteína TIM-3-Fc pode ser revestida na placa para testar a ligação de anticorpos da presente invenção a TIM3, porém 0 sinal é apenas gerado se os anticorpos ligados a placas da mesma forma se ligarem a PD-L1-Fc biotinilado solúvel.

[0081] Para 0 ensaio de ligação, uma placa de 96 cavidades (Immulon 2HB) foi revestida com 50 μΙ/cavidade de 1 pg/mL de TIM-3Fc humano, a 4°C, durante a noite. A placa foi em seguida lavada três vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,2% e bloqueada com 250 μΙ/cavidade de PBS com BSA a 3% durante uma hora em temperatura ambiente. Tampão de bloqueio foi removido e 50 μΙ de anticorpos titulados, começando em 200 nM, foram adicionados à placa e incubados durante uma hora em temperatura ambiente. A placa foi em seguida lavada três vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,2%, e 50 μΙ de biotina PD-L1 humana a 100 ng/mL foi adicionado e incubado durante 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi em seguida lavada três vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,2% e 50 μΙ de Strep HRP (Jackson Immuno 106-030-084), diluído a 1:5000, foi adicionado e incubado durante 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi em seguida lavada três vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,2% e desenvolvida utilizando 100 μΙ/cavidade de solução de substrato TMB A e B 1:1 (KPL) durante 10 minutos em temperatura ambiente. A reação foi parada com 100 μΙ/cavidade de 0,1 N de H2SO4 e lida em uma leitora de placas Spectramax. Os dados foram representados graficamente usando 0 GraphPad Prism.

[0082] Em experiências realizadas essencialmente como descrito

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30/54 neste ensaio, o Anticorpo C produziu um sinal que aumentou com a concentração do Anticorpo C demonstrando que o Anticorpo C se liga a PD-L1 e TIM-3 humano simultaneamente sob estas condições. Um anticorpo de controle TIM-3 sozinho produziu apenas um sinal antecedente.

Anticorpo C liga-se a alvos de PD-L1 e TIM-3 simultaneamente na superfície celular [0083] A capacidade para os anticorpos da presente invenção para simultaneamente envolverem as proteínas TIM-3 e PD-L1 na superfície celular pode ser testada em um ensaio repórter de células vivas para medir TIM-3: PD-L1 Heterotypic Receptor Association (HRA) (DiscoverX, Fremont, CA). O ensaio de HRA está com base em complementação de fragmento de enzima e emprega dois fragmentos de β-galactosidase recombinantes que são individualmente cataliticamente inativos e apresentam pouca afinidade entre si. Quando adicionados como parceiros de fusão a proteínas que se ligam, os dois fragmentos podem ser aproximados para reconstituir uma enzima de β-galactosidase funcional. A atividade da enzima é monitorada pela luz produzida durante a divagem de um substrato quimioluminescente.

[0084] Para o ensaio, as células U2OS foram serialmente transfectadas com codificação de constructos de TIM-3 (1-223)-PK e PD-L1 (1-259)-EA (PK = fragmento ProLink β-galactosidase, EA = fragmento aceptor de enzima). As células U2OS foram escolhidas por sua capacidade de tolerar a expressão de proteína da membrana ectópica e constructos de TIM-3, PD-L1 foram designados para eliminar a maioria dos domínios intracelulares e complicações potenciais, tal como internalização do receptor e agrupamento induzido por sinal.

[0085] Células de poços estáveis U2OS TIM-3 (1-223) -PK PD-L1

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31/54 (1-259) -EA foram semeadas em quadruplicate em placas de 384 cavidades (5000 células/cavidade). Uma série de diluições do Anticorpo C e os correspondentes anticorpos parentais anti-TIM-3 e anti-PD-L1 foram adicionados às células e incubados durante a noite (16 horas) a 37°C/5% de CO2. Reagentes de detecção contendo tampão de lise e substrato enzimático foram em seguida adicionados às células e a placa foi lida em um luminômetro Envision.

[0086] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, 0 Anticorpo C produz um aumento titulável no sinal com um EC50 de aproximadamente 2 nM, enquanto os anticorpos monoclonais de especificidade única correspondentes a TIM-3 e PDL1 são completamente inativos. Estes dados indicam que 0 Anticorpo C pode simultaneamente envolver igualmente 0 TIM-3 e PD-L1 na superfície da célula sob estas condições.

Anticorpo C liga células expressando TIM-3 com células expressando PD-L1 [0087] A capacidade dos anticorpos da presente invenção de se ligarem às células expressando TIM-3 e PD-L1 pode ser determinada por análise de citometria de fluxo utilizando células PD-L1 e DO11 transfectadas com CHO expressando TIM-3. Resumidamente, as células superexpressando CHO-PD-L1 e DO11-TIM-3 podem ser diferencialmente rotuladas com CFSE (éster sucinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína) (BD Horizon) ou Cell Tracker Deep Red (CTDR/Thermo). Células DO11-TIM-3 e CHO-PDL1 são separadamente incubadas durante 30 minutos com um anticorpo de teste, tal como Anticorpo C (em gelo em PBS + 1% de BSA + 0,09% de azida de sódio). Os anticorpos não ligados podem ser removidos por lavagem (2x com 200 μΙ de PBS + 1% de BSA + 0,09% de azida de sódio). As células CHO-PDL1 são incubadas duas horas com 45/mL do anticorpo parental PD-L1 ou controle de hlgG1 em gelo em

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PBS + BSA a 1% + azida de sódio a 0,09%. As células DO11-TIM-3 são incubadas duas horas com 45 pg/mL do anticorpo TIM-3 parental ou hulgG4-PAA em gelo em PBS + BSA a 1% + azida de sódio a 0,09%. Células DO11-TIM-3/Anticorpo C são misturados com CHOPDL1 + o anticorpo parental PD-L1 ou hlgG1 em uma concentração final de 22,5 pg/mL. Células CHO-PDL1/Anticorpo C são misturadas com DO11-TIM-3 + o parente do anticorpo TIM-3 ou hulgG4-PAA em uma concentração final de 22,5 pg/mL. Após uma incubação de aproximadamente 72 horas a 4°C, as células são medidas em Fortessa X20 (com amostrador HTS) em canais adequados para CFSE e CTDR. Usando o software FLOWJO® (FlowJo, LLC, Ashland, OR), os eventos duplos positivos (CFSE+/CTDR +) são controlados e a porcentagem dos eventos totais pode ser calculada e reportada (para 2 cavidades replicadas). Ajustes e estatísticas são gerados com o Graphpad Prism usando regressão não linear (inclinação variável, 4 parâmetros).

[0088] Em experiências realizadas essencialmente como descrito acima, a ponte celular mediada por Anticorpo C foi detectada como eventos positivos duplos por citometria de fluxo. A ligação do Anticorpo C a células DO11 -TIM-3 ou CHO-PDL1 (com subsequente remoção de não ligado) e em seguida mistura com células CHO-PDL1 ou DO11TIM-3, respectivamente, causou um aumento dependente da dose em eventos positivos duplos em relação ao antecedente (aumento de até 4 vezes em comparação com o tampão apenas). Este aumento em eventos duplos positivos foi bloqueado pela adição de mAbs PD-L1 e/ou TIM-3 de competição em excesso em concentrações elevadas porém não por controle de IgG não específico emparelhado, demonstrando especificidade e dependência da expressão do antígeno alvo.

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Atividade Funcional In Vitro

Ensaio com base em células hTIM-3 DO11 [0089] A capacidade dos anticorpos da presente invenção para aliviar a supressão de células T através da inibição de TIM-3 pode ser medida em um ensaio in vitro de DO11.

[0090] Para o ensaio com base em células hTIM-3 DO11, 50 μΙ de DO11 ou hTIM-3 superexpressando células DO11 em 2x10⁴células/cavidade e 50 μΙ de células A20 a 2x10⁴ células/cavidade foram semeadas em uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades de base U (Greiner Cellstar, #651180), utilizando meios de RPMI 1640 (Gibco, #11875-085). 50 μΙ de OVA (Sigma, #01641) foi adicionado em uma concentração final de 0,2 μΜ (diluído na metade). 50 μΙ de anticorpos serialmente diluídos foram adicionados (diluídos na metade). Meios foram adicionados a algumas cavidades para preparar o volume total de 200 μΙ/cavidade. O sobrenadante foi coletado depois de 18-22 horas e medido para mll_-2 utilizando um kit ELISA (R&D, #SM2000).

[0091] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, a ativação de célula T específica de antígeno OVA aumentada de Anticorpo C de uma maneira dependente da dose com EC50 de 4,366 nM medida aumentando-se níveis de mlL-2, porém um controle de IgG humana não.

Ensaio de reação leucócitos misturado (MLR) [0092] A capacidade dos anticorpos da presente invenção para bloquear os sinais de PD-L1 pode ser avaliada medindo-se a liberação de citocinas durante a ativação de células T em um ensaio de MLR in vitro. Os níveis de certas citocinas, tais como IFN-γ, são esperadas para aumentar se a ativação de células T for promovida por tratamento com anticorpos da presente invenção.

[0093] Para o ensaio de MLR, os monócitos foram isolados de

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PBMC humano (Allcells, #PB001) com kit de isolamento de monócitos humanos II (Miltenyi, #130-091-153) e cultivados durante 7 dias com 62,5 ng/mL de GM-CSF e 20 ng/mL de IL-4 para diferenciar células dendríticas. 100 μΙ de 1x10⁵ células Τ CD4 isoladas de PBMC (doador diferente de Allcells) com kit de isolamento de células T CD4 (Miltenyi, cat #130-091-155) e 1x10⁴ células dendríticas humanas derivadas de monócitos foram semeadas em placa de base U de 96 cavidades, com 100 μΙ de anticorpos. As células foram incubadas em uma incubadora humidificada a 37°C, com CO2 a 5% e os sobrenadantes foram coletados após três dias. O IFN-γ ELISA humano foi feito nos sobrenadantes utilizando um k/fR&D ELISA (#SIF50 ).

[0094] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, 4 nM de Anticorpo C aumentaram os níveis de IFN-γ em aproximadamente três vezes enquanto 8 nM de Anticorpo C aumentaram os níveis de IFN-γ em aproximadamente cinco vezes. Estes resultados demonstram a capacidade do Anticorpo C para aumentar a resposta de células T alogênicas neste ensaio.

Estudos Funcionais In Vivo

Anticorpo C no modelo de xenoenxerto de NSCLC humano HCC827 [0095] A eficácia dos anticorpos da presente invenção pode ser testada no modelo de xenoenxerto de NSCLC humano HCC827 para avaliar a capacidade de atrasar ou destruir tumores estabelecidos no modelo através do aumento da resposta de células T a alo-antígenos.

[0096] Para 0 estudo, no dia 0, camundongos NSG de Jackson Laboratories (7 semanas de idade, fêmea, em grupos de 8 camundongos) foram implementados no flanco subcutaneamente com 10x106 células HCC827 em HBSS (0,2 mL de volume total). As células T humanas em volume isoladas de sangue total (New York Blood Center) foram expandidas utilizando Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads® durante 10 dias e criopreservadas. As células

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T foram descongeladas, lavadas, contadas e infundidas intravenosamente (2,5x106 células T em 0,2 ml_ de PBS por camundongo) em camundongos portadores de tumor HCC827 no dia 36. A partir do dia 36, os camundongos foram tratados com uma injeção

i.p. de IgG humana (20 mg/kg), o anticorpo parental anti-PD-L1 do Anticorpo C (10 mg/kg) em combinação com o anticorpo parental antiTIM-3 do Anticorpo B (10 mg/kg) ou o anticorpo parental anti-TIM-3 do Anticorpo C (10 mg/kg), Anticorpo B (20 mg/kg) ou Anticorpo C (20 mg/kg), uma vez por semana durante três semanas (dosado em d36, d43, d50). Bem-estar animal e comportamento, incluindo higiene e deambulação foram monitorados pelo menos duas vezes por semana. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana. Os volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana, começando no dia 4 após o implante das células, utilizando pinças eletrônicas, como descrito no SOP intitulado: IM-Medição do Crescimento do Tumor. O volume do tumor foi calculado usando uma fórmula: Volume do tumor (mm3) = π/6 * Comprimento * Largura².

[0097] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, no dia 50, a combinação do anticorpo parental anti-PDL1 do Anticorpo Ceo anticorpo parental anti-TIM-3 do Anticorpo C retardaram o crescimento do tumor em 62,5% quando comparado ao tamanho do tumor para tratado versus não tratado (T/C = 27,5%). A combinação do anticorpo parental anti-PD-L1 do Anticorpo B e o anticorpo parental anti-TIM-3 do Anticorpo B retardou o crescimento do tumor com T/C = 41,5%. No dia 50, o tratamento com Anticorpo C fez com que o tamanho do tumor regredisse 8,3% em comparação com o dia 35, quando as células T foram infundidas. Portanto, enquanto a combinação de um anticorpo TIM-3 e um anticorpo PD-L1 no modelo HCC827 retardou o crescimento do tumor, o Anticorpo C levou à regressão do tamanho do tumor.

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2. Anticorpo C em camundongos HSCTFL-NOG-F humanizados com tumor L55 (modelo NSCLC) [0098] A eficácia dos anticorpos da presente invenção pode ser testada no modelo de xenoenxerto de NSCLC humano L55 para avaliar a capacidade de retardar ou destruir tumores estabelecidos no modelo através do aumento da resposta de células T a alo-antígenos.

[0099] Camundongos NOG fêmeas de Jackson Laboratories foram enxertados com células tronco hematopoiéticas humanas CD34⁺. A presença de células huCD45⁺ e células CD45⁺ de murino (mCD45) no sangue periférico de camundongo foi confirmada por citometria de fluxo 16 semanas após enxertada. Para o estudo, no dia 0, os camundongos HSCTFL-NOG-F foram implantados no flanco subcutaneamente com o fragmento L55. As células L55 foram cultivadas em meio de RPMI-1640 com 10% de soro bovino fetal mais 1 mM de piruvato de Na e os tumores L-Glutamina e L55 foram cultivados em camundongos NSG para produzir fragmento para este estudo. Os animais foram aleatorizados em um volume médio de tumor de aproximadamente 180 mm³ em grupos. O tratamento foi iniciado no dia 26 seguido de uma administração semanal (Q7DX3) de todos os anticorpos nos dias 33 e 40. Para a combinação do anticorpo parental anti-PD-L1 do Anticorpo C e do anticorpo parental anti-TIM-3 do Anticorpo C, cada anticorpo foi dosado em 10 mg/kg. Para o anticorpo biespecífico, o Anticorpo C foi dosado em 20 mg/kg. Bem-estar animal e comportamento, incluindo higiene e deambulação foram monitorados pelo menos duas vezes por semana. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana. Os volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana, começando no dia 4 após o implante das células, utilizando pinças eletrônicas, como descrito no SOP intitulado: IM-Medição do Crescimento do Tumor. O volume do tumor foi calculado usando uma fórmula: Volume do tumor (mm³) = π/6 * Comprimento * Largura².

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37/54 [00100] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, no dia 40, a combinação do anticorpo parental anti-PDL1 do Anticorpo Ceo anticorpo parental anti-TIM-3 do Anticorpo C teve um % de T/C de 50% quando comparando o tamanho do tumor para tratados versus controle (P = 0,314 para o volume do tumor). No dia 40, o tratamento com Anticorpo C retardou o crescimento do tumor em comparação com a combinação dos dois anticorpos parentais e teve um % de T/C de 7% quando comparado ao tamanho do tumor para tratado versus controle (P = 0,013 para o volume do tumor).

Terapia de combinação do Anticorpo C e pemetrexedo em modelo de xenoenxerto de NSCLC humano L55 [00101] A eficácia dos anticorpos da presente invenção em combinação com pemetrexedo pode ser testada no modelo de xenoenxerto de NSCLC humano L55 para avaliar a capacidade de retardar ou destruir tumores estabelecidos no modelo através do aumento da resposta de células T a alo-antígenos.

[00102] As células L55 serão cultivadas em meio de RPMI-1640 com 10% de soro bovino fetal mais 1mM de piruvato de sódio e Lglutamina. Para o estudo, no dia 0, camundongos NSG de Jackson Laboratories (7 semanas de idade, fêmea, em grupos de 8 camundongos) foram implantados no flanco subcutaneamente com 5x106 células L55 em (50/50) matrigel: HBSS (0,2 mL volume total). As PBMC humanas em volume foram isoladas a partir de aférese (BioSpec) e infundidas intravenosamente (11x10⁶ células PBMC em 0,2 mL de PBS por camundongo) em camundongos portadores de tumor L55 no dia 33 quando os tumores atingem -250 mm3. Começando no dia 34, os camundongos foram tratados com uma injeção i.p. de IgG humana (20 mg/kg), Anticorpo C (20 mg/kg) ou em combinação com pemetrexedo (50 mg/kg). Pemetrexedo fazia 5 dias por semana com 2 dias de pausa entre eles. O anticorpo estava

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38/54 fazendo uma vez por semana durante quatro semanas (administrado em d34, d41, d48, d55). No dia 47, um segundo lote de 5M de PBMC (mesmo lote que a primeira infusão) foi injetado em camundongos portadores de tumor L55. Bem-estar animal e comportamento, incluindo higiene e deambulação foram monitorados pelo menos duas vezes por semana. O peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana. Os volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana, começando no dia 4 após o implante das células, utilizando pinças eletrônicas, como descrito no SOP intitulado: IM-Medição do Crescimento do Tumor. O volume do tumor foi calculado usando uma fórmula: Volume do tumor (mm3) = π/6 * Comprimento * Largura².

[00103] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, o Anticorpo C em si ou a combinação de hulgG e pemetrexedo resultou em “Nenhum Efeito” como definido pelo método Bliss Independence neste modelo. A combinação do Anticorpo C e pemetrexedo retardou o crescimento do tumor com T/C = 48,9% no final do estudo.

Estudo de liberação de citocinas in vitro com Anticorpo C ligado a placas em PBMCs humanos [00104] O potencial para anticorpos da presente invenção para induzir a síndrome de liberação de citocinas pode ser avaliado medindo a liberação de citocinas em um ensaio ligado à placa utilizando células mononucleares de sangue periférico frescas (PBMCs). A síndrome de liberação de citocinas induzida pelo tratamento com anticorpos é uma reação indesejável para a maioria dos pacientes, e o tratamento com um anticorpo biespecífico podería elevar o risco.

[00105] As PBMCs recentemente isoladas de seis indivíduos saudáveis foram incubadas com Anticorpo C ligado na placa ou

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39/54 anticorpos de controle durante 24 horas, em uma ampla faixa de titulação de 0,1 μς a 10 μρ. Os controles positivos foram o anticorpo anti-CD3s humano, OKT3, e um homólogo do anticorpo terapêutico superagonista CD28 específico, TGN1412. Ambos os anticorpos são conhecidos por causar uma tempestade de citocinas na clínica. O controle negativo foi um anticorpo isotipo efetor hlgG1 (lgG1-EN) nulo. Um total de 2x10⁵ células por cavidade (200 μΙ_) foram adicionadas em triplicatas às placas revestidas com anticorpo e incubadas durante 24 horas a 37^QC, 5% de CO2. Após a incubação, as placas foram centrifugadas a 400 g durante 5 minutos; sobrenadantes da cultura celular foram coletados e armazenados a -80^QC antes da determinação da citocina. Utilizando um kit de MSD de ensaio 5 complexos (Cat# K151A0H-2; Meso Scale Discovery), cinco citocinas incluindo, IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10 e TNF-α foram medidas em sobrenadantes de cultura de células seguindo as instruções do fabricante.

[00106] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, a incubação de PBMCs humana com Anticorpo C em uma ampla faixa de concentrações não resultou em níveis significantes de liberação de citocinas para IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10, e TNF-α. Em contraste, a incubação de PBMC com anticorpos de controle positivos anti-CD3s e TGN1412 resultou em uma produção robusta de citocinas para todas as cinco citocinas analisadas na maioria dos doadores.

Estudo de liberação de citocinas in vitro com o anticorpo C solúvel em sangue total humano [00107] O potencial para anticorpos da presente invenção para induzir a síndrome de liberação de citocinas pode da mesma forma ser avaliado medindo a liberação de citocinas com anticorpos solúveis da presente invenção em sangue total humano.

[00108] Amostras de sangue total humano fresco de 10 doadores

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40/54 saudáveis foram incubadas com Anticorpo solúvel C, ou anticorpo de controle durante 24 horas, a 100/mL. Os controles positivos incluíram anticorpo anti-CD3s humano, OKT3 e um CD52 anti-humano homólogo (Campath). OKT3 e Campath são conhecidos por causar tempestade de citocinas na clínica. Os controles negativos foram um anticorpo terapêutico comercialmente disponível, o infliximabe, não associado à síndrome de liberação de citocinas na clínica e um anticorpo isotipo efector (EN) hlgG1 (lgG1-EN). Um amplo painel de citocinas incluindo IFN-γ, IL-Ιβ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 e TNF-α foi analisado um ensaio multiplex personalizado com base na plataforma Mesoscale em sobrenadantes de plasma humano (Cat# K15049D-1, Meso Scale Discovery).

[00109] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, incubação de amostras de sangue humano com Campath ou OKT3 resultou na liberação robusta de citocinas em todos os doadores de várias das citocinas analisadas, incluindo as citocinas associadas à RSC (IFN-γ, IL-6, TNF-α e IL-10). Em contraste, a incubação com Anticorpo C ou com infliximabe não desencadeou qualquer liberação substancial de citocinas em 10 doadores saudáveis. O anticorpo C não resultou em liberação robusta de citocinas quando incubado com sangue total humano durante 24 horas em uma concentração de até 100 pg/mL.

Ensaio de imunogenicidade in vitro [00110] Anticorpos da presente invenção são modificados para serem heterodiméricos, com cada metade do anticorpo ligando-se a um alvo diferente. Com a composição não natural dos anticorpos heterodiméricos, a imunogenicidade é um risco potencial que deve ser avaliado.

[00111] O ensaio EpiScreen™ DC: células T foi utilizado para determinar o potencial relativo de imunogenicidade clínica do

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Anticorpo C. As células dendríticas derivadas de monócitos foram preparadas a partir das PBMCs de uma coorte de 50 doadores saudáveis, carregadas com Anticorpo C e induzidas a um fenótipo maduro para apresentar epítopos de células T a células T CD4 + purificadas autólogas. As respostas das células T foram medidas utilizando a proliferação de células T (absorção de [³H]-timidina) e a secreção de citocinas IL-2 (ELISpot).

[00112] Os ensaios EpiScreen™ célula T com um grupo de biológicos conhecidos (como infliximabe, adalimumabe e bevacizumabe) mostraram uma clara correlação entre a frequência de respostas de células T do doador no ensaio EpiScreen™ e o nível de imunogenicidade (respostas terapêuticas de anticorpos anti-proteína) observadas na clínica. Respostas de doadores de alta frequência foram observadas em ensaios EpiScreen™ para anticorpos imunogênicos como o alemtuzumabe, enquanto respostas de doadores com frequência relativamente baixa foram observadas para anticorpos não imunogênicos, como omalizumabe e trastuzumabe. Em geral, terapêuticos de proteína que induzem uma resposta positiva menor ou igual a 10% no ensaio EpiScreen™ estão associadas a um baixo risco de imunogenicidade na clínica.

[00113] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, a análise da frequência e magnitude das respostas de células T CD4 + indicou que o Anticorpo C induz respostas positivas modestas em 6-8% da coorte doadora e, portanto, mostra um baixo risco de imunogenicidade clínica.

Análise da função efetora imune do Anticorpo C in vitro [00114] Como terapia potencial no câncer com um anticorpo biespecífico em relação PD-L1 humano e TIM-3 humana, a função efetora imune produzida pelo anticorpo não é desejável. Anticorpo C é projetado para não ter função efetora imune. De modo a confirmar a

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42/54 ausência da função efetora imune, o Anticorpo C foi testado em ensaios de ligação de fase sólida padrão para ligação a receptores de Fcy humanos e C1q, e para indução de uma citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo. (ADCP) e resposta de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) em ensaios in vitro com base em células padrões.

[00115] Para o ensaio de ligação do receptor de Fcy humano da fase sólida, proteínas receptoras de Fcy recombinante (FcyR) utilizadas neste ensaio são FcyRI, FcyRlla, FcyRllb e FcyRllla (V). Proteína receptora foi diluída em PBS e revestida (50 ng/cavidade) em uma placa Meso Scale (MSD cat# L15XA-3). Após uma incubação durante a noite a 4°C, placas foram lavadas com PBS/Tween-20 a 0,05% (PBST) três vezes e bloqueadas durante 1-2 horas em temperatura ambiente com 150 μΙ_/ cavidade de 5% de MSD Blocker A (MSD cat# R93BA-1) em PBST. As placas foram em seguida lavadas três vezes com PBST e 30 μΙ_ de anticorpo de teste ou anticorpo de controle (Tabela 3), diluído em MSD Blocker A a 1%, foi adicionado a cada cavidade e deixado incubar durante duas horas. Após a incubação, as placas foram lavadas duas vezes com PBST e 30 μΙ de anticorpo secundário (MSD Cat#D20TF- 6) foi adicionado a cada cavidade e deixado incubar durante uma hora em temperatura ambiente com agitação. As placas foram em seguida lavadas com PBST e 150 pL de um tampão de leitura 1X (MSD cat # R92T C-1) foi adicionado a cada cavidade. As placas foram em seguida lidas no Imager Sector 2400.

[00116] Para o ensaio ELISA de ligação C1q, uma placa ELISA de poliestireno de 96 cavidades (Thermo Scientific Cat. 3855) foi revestida com anticorpos teste e controle (efetor de Rituximab-lgG1 nulo e outros anticorpo efetor nulo humano lgG1) em concentrações

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43/54 variando de 200-0,0305 pg/mL em PBS. Após uma incubação durante a noite a 4°C, as placas foram lavadas três vezes com PBST e depois bloqueadas com 300 pl de tampão de caseína (Thermo Fisher cat#37528) durante duas horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST e depois foi adicionado 0,5 μg/cavidade de C1q (Quidel Cat# A400), diluído em tampão de bloqueio de caseína. Após duas horas em temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes com PBST e 50 pl de anticorpo secundário (1:200, Abd Serotec Inc #2221-5004P) foi adicionado a cada cavidade. As placas foram incubadas durante uma hora em temperatura ambiente e depois lavadas três vezes com PBST. 100 μΙde 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB: KPL cat# 50-65-01/02), um substrato de HRP, foi em seguida adicionado a cada cavidade e as placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 20 minutos. A reação foi parada (KPL cat# 50-85-06) e a absorvência foi medida a 450 nM utilizando um leitor de microplacas.

[00117] Para o ensaio ADCC, células-alvo positivas PD-L1 e TIM-3 e células WÍI2S CD20 positivas foram semeadas em placas de base de 96 cavidades (Perkin Elmer, #600-5680) em uma densidade de 10000 células/cavidade em 50 pL de tampão de ensaio de ADCC (BSA a 0,5% em RPMI 1640). As células foram incubadas durante 30 minutos (todas as incubações com células foram realizadas a 37°C e 5% de CO2, a menos que de outra maneira declarado) seguido pela adição de 25 pL/cavidade de anticorpos de teste titulados diluídos em tampão de ensaio ADCC. Após uma incubação de 30 minutos com anticorpos de teste, 25 pl de células efetoras (células Jurkat positivas para FcvRIlIa com constructo repórter NFAT-luciferase) foram adicionados em uma proporção de 15:1 (efetor: alvo) e incubados durante 5-6 horas. A atividade de luciferase de células efetoras ativadas foi medida após uma incubação em temperatura ambiente de

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44/54 minutos com 100 μΙ_ de substrato Bright-Glo™ Luciferase (Promega, #G7940). A luminescência foi quantificada utilizando um leitor de placas de microtitulação e os dados foram analisados utilizando um modelo de quatro parâmetros para determinar os valores de EC50 para cada anticorpo.

[00118] Para o ensaio ADCP, células-alvo positivas para PD-L1 e TIM-3 e células WÍI2S positivas CD20 foram semeadas em placas de base plana de 96 cavidades (Perkin Elmer, #600-5680) em uma densidade de 10000 células/cavidade em 50 pL de tampão de ensaio de ADCP (0,5% de BSA em RPMI 1640). As células foram incubadas durante 30 minutos (todas as incubações com células foram realizadas a 37°C e 5% de CO2, a menos que de outra maneira declarado) seguido pela adição de 25 pL/cavidade de anticorpos de teste titulados diluídos em tampão de ensaio ADCP. Após uma incubação de 30 minutos com os anticorpos teste, 25 pL de células efetoras (células Jurkat positivas para FcyRlla com 0 constructo repórter NFAT-luciferase; Promega G9885) foram adicionadas em uma relação de 6:1 (efetor:alvo) e incubadas durante 5-6 horas. A atividade de luciferase de células efetoras ativadas foi medida após uma incubação em temperatura ambiente de 10 minutos com 100 de substrato Bright-Glo™ Luciferase (Promega, #G7940). A luminescência foi quantificada utilizando um leitor de placas de microtitulação e os dados foram analisados utilizando um modelo de quatro parâmetros para determinar os valores de EC50 para cada anticorpo.

[00119] Para 0 ensaio de CDC, células-alvo aderentes foram semeadas em placas de base plana branca de 96 cavidades (Perkin Elmer, #600-5680) a 25000 células/cavidades em 100 pL/cavidade de meio de crescimento celular. Após uma incubação durante a noite (todas as incubações com células foram realizadas a 37°C e 5% de

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CÜ2, a menos que de outra maneira declarado) o meio foi removido e 50 μΙ de tampão de ensaio CDC (RPMI 1640, 10% de FBS com 0,1% de BSA e 25 mM de HEPES) foi adicionado. As células de suspensão foram semeadas no dia do ensaio em uma densidade de 50000 células/cavidades em 50 μΙ_ de tampão de ensaio de CDC. Os anticorpos de teste e controle foram adicionados em duplicata às placas e incubados durante 30 minutos. Após a incubação, 50 μΙ de complemento humano (S1764; Sigma), diluídos em 5 mL de tampão de ensaio (1:5), foi em seguida adicionado a cada cavidade durante uma hora. Após a incubação, 16 pL/cavidade de reagente Alamar Blue (Invitrogen, DAL1100) foram adicionados a cada cavidade. As placas foram incubadas durante 22 horas e depois removidas da incubadora e permitidas equilibrar em temperatura ambiente durante 5 minutos. A fluorescência foi lida em Synergy Neo2 (excitação: 560 nm, emissão: 590 nm) e a lise de células CDC foi expressa em relação à lise celular completa induzida por Triton X 100.

[00120] Em experiências realizadas essencialmente como descrito neste ensaio, o Anticorpo C não demonstrou qualquer ligação específica a qualquer dos receptores de Fcy humanos testados, nem a C1q. Além disso, não houve resposta detectável em ensaios ADCC, ADCP ou CDC com base em células utilizando linhagens celulares relevantes de TIM-3 e PD-L1 para o Anticorpo C. Estes resultados demonstram que o Anticorpo C não tem função efetora imunitária detectável dentro dos limites de detecção dos ensaios realizados.

Farmacocinética em Macaco [00121] Os anticorpos da presente invenção podem ser testados quanto à estabilidade em macacos utilizando análise farmacocinética (PK) do soro em ensaios de ELISA.

[00122] Para caracterizar a PK de soro do Anticorpo C, as amostras de soro foram analisadas em três formatos diferentes de ensaio de

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46/54 imunoabsorção enzimática (ELISA). Um ELISA de Imunoglobulina (IgG) total foi empregado para quantificar a presença de estrutura total de IgG, independentemente da competência de ligação a TIM-3 ou PD-L1. O intervalo da curva padrão para o Anticorpo C foi de 125-8000 ng/mL, com um limite superior de quantificação (ULOQ) de 3000 ng/mL e um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 300 ng/mL. Além disso, um ELISA de captura de antígeno TIM-3 e um ELISA de captura de antígeno PD-L1 foram empregados para quantificar a presença de fármaco ativo no soro. Para o ELISA de captura de antígeno TIM-3, a faixa de ensaio para o Anticorpo C foi de 125-8000 ng/mL, com um ULOQ de 3000 ng/mL e um LLOQ de 300 ng/mL. Para o ELISA de captura de antígeno PD-L1, a faixa de curva padrão para o Anticorpo C foi 125-8000 ng/mL, com um limite superior de quantificação (ULOQ) de 3000 ng/mL e um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 300 ng/mL [00123] Em experiências realizadas e essencialmente como descrito neste ensaio, ensaios ELISA de captura de antígeno de IgG total e funcional para TIM-3 e PD-L1 foram quantitativamente similares em todos os níveis de dose, indicando estabilidade no Anticorpo C e retenção da capacidade de ligação funcional ao longo do tempo in vivo.

Sequências de aminoácidos e nucleotídeos

SEQ ID N^Q: 1 (PD-L1 humana)

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLD LAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNA ALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDP VTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVT STLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILG AILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET

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SEQ ID N^Q: 2 (TIM-3 humano)

MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNL

VPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGD

VSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIK

SEQ ID N^Q: 3 (HCVR de PD-L1 Ab no Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLE

WMGG11PIFGTAN YAQKFQG RVTITADKSTSTAYM ELSSLRS E DTAVY

YCARSPDYSPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID N^Q: 4 (LCVR de PD-L1 Ab no Anticorpo A, Anticorpo B e

Anticorpo C)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKL

LIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCQSYDS

SLSGSVFGGGIKLTVLG

SEQ ID N^Q: 5 (HCVR de TIM-3 Ab no Anticorpo A)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGL

EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARYARTAFDLWGQGTLVTVSS

SEQ ID N^Q: 6 (HCVR de TIM-3 Ab no Anticorpo B)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSFYFSWVRQAPGKGLE

WVSAISGNGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV

YYCARYYNTG FDLWGQGTLVTVSS

SEQ ID N^Q: 7 (HCVR de TIM-3 Ab no Anticorpo C)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGL

EWVSAISGNGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARYYNTG FDLWGQGTLVTVSS

SEQ ID N^Q: 8 (LCVR de TIM-3 Ab em Anticorpo A)

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEAIYGYLNWYQQKPGKAPKLLI

YAASSLPIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYGFPP TFGQGTKLEIK

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SEQ ID N^Q: 9 (LCVR de TIM-3 Ab em Anticorpo B)

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEAIYGYLNWYQQKPGKAPKLLI YAASSLPIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYGFPP TFGQGTKLEIK

SEQ ID N^Q: 10 (LCVR de TIM-3 Ab em Anticorpo C)

DIVMTQSPSSLSASVGDGVTITCQASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLI YYASSIVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQASSFPP TFGQGTKLEIK

SEQ ID N^Q: 11 (HC de PD-L1 Ab no Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLE WMGG11PIFGTAN YAQKFQG RVTITADKSTSTAYM ELSSLRS E DTAVY YCARSPDYSPYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID N^Q: 12 (LC de PD-L1 Ab no Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKL LIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCQSYDS SLSGSVFGGGIKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAAESELSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS

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SEQ ID N^Q: 13 (HC de TIM-3 Ab no Anticorpo A)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEW

VSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

ARYARTAFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGC

LVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLESSGLYSLWSVVTVPSSSL

GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK

PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA

KGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP

ENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH

YTQKSLSLSPGK

SEQ ID N^Q: 14 (HC de TIM-3 Ab no Anticorpo B)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSFYFSWVRQAPGKGLEWVS

AISGNGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYY

NTGFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAALGCLVTDYF

PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLESSGLYSLWSVVTVPSSSLGTQTYICN

VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL

MISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYP

PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG

SFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID N^Q: 15 (HC de TIM-3 Ab no Anticorpo C)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGL

EWVSAISGNGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARYYNTGFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPEAPSSKSTSGG

TAALGCLVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLESSGLYSLWSV

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP

EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYV

DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN

KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY

PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

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SEQ ID N^Q: 16 (LC de TIM-3 Ab no Anticorpo A)

DIVMTQSPSSLSASVGDGVTITCQASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLI

YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP

PTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPRE

AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLRSALTLSKADYEKH

KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID N^Q: 17 (LC de TIM-3 Ab no Anticorpo B)

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEAIYGYLNWYQQKPGKAPKLLI

YAASSLPIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYGFPP

TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPREA

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLRSALTLSKADYEKHK

VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID N^Q: 18 (LC de TIM-3 Ab em Anticorpo C)

DIVMTQSPSSLSASVGDGVTITCQASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLI

YYASSIVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQASSFPP

TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTARVGCLLNNFYPREA

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLRSALTLSKADYEKHK

VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID N^Q: 19 (região do domínio CH1 de PD-L1 Ab HC)

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV

HTFPAVLQSSGLYSLKS

SEQ ID N^Q: 20 (região do domínio CH2 de PD-L1 Ab HC)

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVS

SEQ ID N^Q: 21 (região do domínio CH2 de PD-L1 Ab HC)

SNKALPAPIEK

SEQ ID N^Q: 22 (região do domínio CH3 de PD-L1 Ab HC)

REPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

NYLTWPPVLDSDGSF

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SEQ ID N²: 23 (região do domínio CH1 de TIM-3 Ab HC)

EAPSSKSTSGGTAALGCLVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

ESSGLYSLWSVVTVPS

SEQ ID N²: 24 (região do domínio CH2 do TIM-3 Ab HC)

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVS

SEQ ID N²: 25 (região do domínio CH2 do TIM-3 Ab HC)

APIEKTISKAK

SEQ ID N²: 26 (região do domínio CH3 de TIM-3 Ab HC)

VYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFALVSKL

SEQ ID N²: 27 (região a partir da região constante de cadeia leve de

PD-L1 Ab)

ANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYA

AESE

SEQ ID N²: 28 (região a partir da região constante de cadeia leve de

TIM-3 Ab)

RVGCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLR

SALTL

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SEQ ID N^Q: 29 Sequência de DNA de PD-L1 LC para anticorpo C

CAGTCCGTCC	TGACTCAGCC	ACCTTCCGCT	AGCGGTACCC
CCGGCCAGAG	AGTGACAATC	TCATGCTCCG	GTTCCAGCTC
TAACATTGGC	TCTAACACTG	TCAATTGGTA	CCAGCAGCTG
CCAGGAACCG	CACCAAAGCT	GCTGATCTAT	GGAAACTCAA
ATAGGCCTAG	CGGGGTGCCA	GACCGGTTTA	GCGGATCTAA
AAGTGGGACT	TCAGCTTCCC	TGGCAATTTC	TGGACTGCAG
AGTGAGGACG	AAGCTGATTA	CTATTGCCAG	TCCTACGATA
GTTCACTGAG	CGGTTCCGTG	TTCGGCGGAG	GGATCAAGCT
GACAGTCCTG	GGCCAGCCCA	AGGTGAGTTC	TAGAGGATCC
ATCTGGGATA	AGCATGCTGT	TTTCTGTCTG	TCCCTAACAT
GCCCTGTGAT	TATCCGCAAA	CAACACACCC	AAGGGCAGAA
CTTTGTTACT	TAAACACCAT	CCTGTTTGCT	TCTTTCCTCA
GGCCGCTCCT	TCCGTGACTC	TGTTTCCCCC	TTCCAGCGAG
GAACTGCAGG	CCAATAAGGC	CACCCTGGTG	TGCCTGATTA
GCGACTTCTA	TCCTGGAGCT	GTGACAGTCG	CATGGAAGGC
CGATTCTAGT	CCAGTGAAAG	CAGGGGTCGA	GACCACAACT
CCCTCCAAGC	AGAGCAACAA	CAAGTACGCA	GCCGAGTCTG
AACTGAGTCT	GACCCCAGAA	CAGTGGAAGT	CCCACAGGAG
TTATTCATGC	CAGGTGACCC	ATGAGGGCTC	CACAGTGGAG
AAGACCGTGG	CCCCTGCTGA	GTGTAGC

SEQ ID N^Q: 30 Sequência de DNA de TIM-3 LC para Anticorpo C

GACATCGTGA	TGACCCAGTC	CCCTTCCAGC	CTGTCTGCCT
CCGTGGGCGA	CGGAGTGACC	ATCACATGCC	AGGCTAGCCA
GGATATCTAC	AACTATCTGA	ATTGGTACCA	GCAGAAGCCT
GGCAAGGCCC	CAAAGCTGCT	GATCTATTAC	GCTTCTTCCA
TCGTGTCTGG	AGTGCCATCC	AGGTTCAGCG	GATCTGGATC
CGGAACCGAC	TTTACCCTGA	CAATCAGCTC	TCTGCAGCCT
GAGGATTTCG	CCACATACTA	TTGCCAGCAG	GCTTCCTCTT
TCCCCCCTAC	CTTTGGCCAG	GGCACAAAGC	TGGAGATCAA
GAGAACCGTG	GCCGCTCCAT	CCGTGTTCAT	CTTTCCACCC
AGCGACGAGC	AGCTGAAGTC	TGGCACAGCT	AGGGTGGGCT
GTCTGCTGAA	CAACTTCTAC	CCCCGGGAGG	CCAAGGTGCA
GTGGAAGGTG	GATAACGCTC	TGCAGAGCGG	CAATTCTCAG
GAGTCCGTGA	CCGAGCAGGA	CAGCAAGGAT	TCTACATATT
CCCTGAGAAG	CGCCCTGACA	CTGAGCAAGG	CCGATTACGA
GAAGCACAAG	GTGTATGCTT	GCGAGGTGAC	CCATCAGGGC
CTGTCCAGCC	CAGTGACAAA	GTCTTTCAAT	CGCGGCGAGT

GT

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SEQ ID N^Q: 31 Sequência de DNA de PD-L1 HC para Anticorpo C

CAGGTCCAGC	TGGTGCAGAG	CGGAGCCGAA	GTGAAGAAAC
CCGGTAGCAG	CGTCAAAGTG	TCATGTAAAG	CCTCAGGGGG
AACATTCTCC	AGCTACGCCA	TCTCCTGGGT	GAGACAGGCT
CCAGGACAGG	GACTGGAGTG	GATGGGAGGA	ATCATCCCTA
TCTTCGGCAC	CGCCAACTAC	GCTCAGAAGT	TTCAGGGCCG
CGTGACCATC	ACAGCCGACA	AGAGCACCTC	TACAGCTTAT
ATGGAGCTGT	CTTCCCTGAG	AAGCGAGGAT	ACAGCCGTGT
ACTATTGCGC	TCGCTCCCCC	GACTACAGCC	CTTACTATTA
CTATGGCATG	GACGTGTGGG	GCCAGGGCAC	CACAGTGACC
GTGAGCTCTG	CTAGCACAAA	GGGCCCATCC	GTGTTCCCAC
TGGCTCCATC	CAGCAAGTCC	ACCAGCGGAG	GAACAGCCGC
TCTGGGCTGT	CTGGTGAAGG	ACTATTTCCC	AGAGCCAGTG
ACCGTGTCCT	GGAACAGCGG	CGCCCTGACC	TCTGGAGTGC
ACACATTTCC	CGCTGTGCTG	CAGTCTTCCG	GCCTGTACTC
TCTGAAGTCC	GTGGTGACCG	TGCCTAGCTC	TTCCCTGGGC
ACCCAGACAT	ATATCTGCAA	CGTGAATCAC	AAGCCTTCCA
ATACAAAGGT	GGACAAGAGG	GTGGAGCCAA	AGAGCTGTGA
TAAGACCCAT	ACATGCCCCC	CTTGTCCTGC	TCCAGAGGCT
GCTGGAGGAC	CAAGCGTGTT	CCTGTTTCCA	CCCAAGCCCA
AGGACACCCT	GATGATCTCT	AGGACCCCTG	AGGTGACATG
CGTGGTGGTG	TCCGTGTCCC	ACGAGGACCC	AGAGGTGAAG
TTTAACTGGT	ACGTGGATGG	CGTGGAGGTG	CATAATGCTA
AGACCAAGCC	TAGGGAGGAG	CAGTACAACA	GCACCTATCG
GGTGGTGTCT	GTGCTGACAG	TGCTGCATCA	GGATTGGCTG
AACGGCAAGG	AGTATAAGTG	CAAGGTGTCT	AATAAGGCCC
TGCCCGCTCC	TATCGAGAAG	ACCATCTCCA	AGGCCAAGGG
CCAGCCTAGG	GAGCCACAGG	TGTACGTGCT	GCCTCCAAGC
CGGGACGAGC	TGACAAAGAA	CCAGGTGTCT	CTGCTGTGCC
TGGTGAAGGG	CTTCTATCCA	TCTGATATCG	CTGTGGAGTG
GGAGTCCAAT	GGCCAGCCCG	AGAACAATTA	CCTGACCTGG
CCCCCTGTGC	TGGACAGCGA	TGGCTCTTTC	TTTCTGTATT
CCAAGCTGAC	AGTGGATAAG	AGCCGGTGGC	AGCAGGGCAA
CGTGTTCTCC	TGTTCTGTGA	TGCACGAGGC	ACTGCACAAT
CATTACACCC	AGAAATCCCT	GTCACTGAGC	CCCGGCAAG

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SEQ ID N^Q: 32 Sequência de DNA de TIM-3 HC para Anticorpo C

GAGGTGCAGC	TGCTGGAGTC	TGGGGGGGGT	CTGGTGCAGC
CCGGGGGTAG	CCTGCGTCTG	TCTTGTGCCG	CCTCTGGGTT
1 AC 11 1 1 1 CO	AGCTACTATA	TGAGCTGGGT	GAGACAGGCT
CCTGGCAAGG	GCCTGGAGTG	GGTGTCTGCC	ATCAGCGGCA
ACGGCAAATC	TACCTACTAT	GCTGACTCCG	TGAAGGGCAG
ATTCACCATC	AGCCGCGATA	ACTCTAAGAA	TACACTGTAC
CTGCAGATGA	ACAGCCTGCG	CGCTGAGGAC	ACCGCCGTGT
ACTATTGCGC	CAGATATTAT	AACACAGGCT	TCGATCTGTG
GGGCCAGGGC	ACCCTGGTGA	CAGTGTCTTC	CGCTAGCACC
AAGGGCCCAA	GCGTGTTTCC	AGAGGCTCCA	AGCTCTAAGT
CCACCAGCGG	AGGAACAGCC	GCTCTGGGCT	GTCTGGTGAC
CGACTACTTC	CCAGAGCCCG	TGACAGTGTC	CTGGAACAGC
GGCGCTCTGA	CCTCTGGCGT	GCACACATTT	CCAGCCGTGC
TGGAGTCCAG	CGGCCTGTAC	TCCCTGTGGT	CCGTGGTGAC
CGTGCCCAGC	TCTTCCCTGG	GCACCCAGAC	ATATATCTGC
AACGTGAATC	ACAAGCCATC	CAATACAAAG	GTGGACAAGA
GGGTGGAGCC	CAAGAGCTGT	GATAAGACCC	ATACATGCCC
CCCTTGTCCT	GCTCCAGAGG	CTGCTGGAGG	ACCATCCGTG
TTCCTGTTTC	CACCCAAGCC	TAAGGACACC	CTGATGATCA
GCAGGACCCC	AGAGGTGACA	TGCGTGGTGG	TGTCCGTGTC
CCACGAGGAC	CCTGAGGTGA	AGTTCAACTG	GTACGTGGAT
GGCGTGGAGG	TGCATAATGC	TAAGACAAAG	CCCAGGGAGG
AGCAGTACAA	CAGCACCTAT	CGGGTGGTGT	CTGTGCTGAC
AGTGCTGCAT	CAGGATTGGC	TGAACGGCAA	GGAGTATAAG
TGCAAGGTGT	CTAATAAGGC	TCTGCCCGCC	CCTATCGAGA
AGACCATCTC	CAAGGCCAAG	GGCCAGCCTA	GAGAGCCACA
GGTGTACGTG	TATCCTCCAA	GCCGCGACGA	GCTGACCAAG
AACCAGGTGT	CTCTGACATG	TCTGGTGAAG	GGC Illi ACC
CTTCTGATAT	CGCTGTGGAG	TGGGAGTCCA	ATGGCCAGCC
AGAGAACAAT	TATAAGACCA	CACCCCCTGT	GCTGGACTCT
GATGGCTCCT	TCGCCCTGGT	GTCCAAGCTG	ACCGTGGATA
AGAGCAGGTG	GCAGCAGGGC	AACGTGTTCT	CCTGTTCTGT
GATGCACGAG	GCACTGCACA	ACCATTACAC	CCAGAAGTCC
CTGTCCCTGA	GCCCCGGCAA	A

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N^Q: 1) e TIM-3 humano (SEQ ID N^Q: 2), caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) uma primeira cadeia pesada (HC) compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 3, SEQ ID N^Q: 19 e SEQ ID N^Q: 22, (b) uma primeira cadeia leve (LC) compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 4 e SEQ ID N^Q: 27, (c) um segundo HC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 7, SEQ ID N^Q: 23 e SEQ ID N^Q: 26,

d) um segundo LC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 10 e SEQ ID N^Q: 28; e sendo que, a primeira LC forma uma ligação de dissulfeto de intercadeia com a primeira HC, a segunda LC forma uma ligação de dissulfeto de intercadeia com a segunda HC, e a primeira HC forma duas ligações de dissulfeto de intercadeia com a segunda HC, e o primeiro HC e o segundo HC são isotipo de IgG 1 humano.
2. Anticorpo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:

(a) o primeiro HC compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 20 e SEQ ID N^Q: 21, e (b) o segundo HC compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 24 e SEQ ID N^Q: 25.
3. Anticorpo que se liga a PD-L1 humana (SEQ ID N^Q: 1) e TIM-3 humana (SEQ ID N^Q: 2), caracterizado pelo fato de que compreende duas cadeias leves (LC) e duas cadeias pesadas (HC), sendo que:

(a) o primeiro LC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 12,

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2/6 (b) o primeiro HC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 11, (c) o segundo LC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 16, SEQ ID N²: 17, ou SEQ ID N²: 18, e (d) o segundo HC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 13, SEQ ID N²: 14 ou SEQ ID N²: 15.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o segundo LC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 16, e o segundo HC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 13.
5. Anticorpo, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o segundo LC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 17, e o segundo HC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 14.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o segundo LC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 18, e o segundo HC apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID N²: 15.
7. Célula de mamífero, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA compreendendo uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos apresentando as sequências de aminoácido da SEQ ID N²: 11, SEQ ID N²: 15, SEQ ID N²: 12, e SEQ ID N²: 18, na qual a célula é capaz de expressar o anticorpo, como definido na reivindicação 6.
8. Célula de mamífero, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, sendo que a primeira molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos apresentando a sequência de aminoácidos de SEQ ID N²: 11 e SEQ ID N²: 12, e sendo que a segunda molécula de DNA

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3/6 compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos apresentando a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 15 e SEQ ID N^Q: 18, sendo que a célula é capaz de expressar o anticorpo, como definido na reivindicação 6.
9. Processo para produzir um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula de mamífero, como definida na reivindicação 7 ou 8, sob condições tais que o anticorpo é expresso e recuperar o anticorpo expresso.
10. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo cultivo de uma célula de mamífero compreendendo uma molécula de DNA, que compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos apresentando as sequências de aminoácido de SEQ ID N^Q: 11, SEQ ID N^Q: 15, SEQ ID N^Q: 12 e SEQ ID N^Q: 18 em condições tais que o anticorpo é expresso, e pela recuperação do anticorpo expresso.
11. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é produzido por cultivo de uma célula de mamífero no qual compreende uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos apresentando a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 11 e SEQ ID N^Q: 12, e sendo que a segunda molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica codificando polipeptídeos apresentando a sequência de aminoácido de SEQ ID N^Q: 15 e SEQ ID N^Q: 18 sob condições tais que o anticorpo é expresso, e recuperação do anticorpo expresso.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 10 e 11, e um veículo, diluente ou excipiente aceitável.
13. Uso de uma quantidade eficaz do anticorpo, como

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4/6 definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratamento de câncer, em um paciente em necessidade do mesmo.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de esôfago, sarcoma de partes moles, colangiocarcinoma ou carcinoma hepatocelular.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de não pequenas células, câncer de pulmão de pequenas células ou mesotelioma.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o dito tratamento compreende ainda a administração simultânea, separada ou sequencial de um ou mais padrões de agentes de tratamento selecionados a partir do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossómica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, paclitaxel, partículas ligadas a proteínas para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracila e irinotecano), gencitabina, topotecano, irinotecano lipossômico, pemetrexedo e cetuximabe.
17. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das

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5/6 reivindicações 1 a 6, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.
19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, câncer de pulmão, cabeça e pescoço, fígado, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer dos rins, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer de mama, câncer dos ovários, câncer endometrial, câncer de esôfago, sarcoma de partes moles, colangiocarcinoma ou carcinoma hepatocelular.
20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de não pequenas células, câncer de pulmão de pequenas células ou mesotelioma.
21. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais padrões de agentes de tratamento selecionados a partir do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossômica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteína paclitaxel para suspensão injetável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracil e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracila e irinotecano), gencitabina, topotecano, irinotecano lipossômico, pemetrexed e cetuximabe, no tratamento do câncer.
22. Composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 10 e 11.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o câncer é melanoma, câncer de

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6/6 pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de bexiga, próstata, câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de esôfago, sarcoma de partes moles, colangiocarcinoma ou carcinoma hepatocelular.
24. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de não pequenas células, câncer de pulmão de pequenas células ou mesotelioma.
25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada pelo fato de que é administrada em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais padrões de agentes de tratamento selecionados a partir do grupo consistindo em cisplatina, carboplatina, dacarbazina, doxorrubicina lipossômica, docetaxel, ciclofosfamida e doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas ligadas a proteína paclitaxel para suspensão injectável, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluoruracila e oxaliplatina), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracila e irinotecano), gemcitabina, topotecano, irinotecano lipossômico, pemetrexedo e cetuximabe.
26. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.