ES2963746T3

ES2963746T3 - Proteínas de unión a antígeno de anti-neuropilina y métodos de uso de las mismas

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Publication number: ES2963746T3
Application number: ES17835532T
Authority: ES
Inventors: Daniel Hicklin; Cynthia Seidel-Dugan; William Winston; Jose-Andres Salmeron-Garcia; Nels Nielson; Heather Brodkin
Original assignee: Potenza Therapeutics Inc
Current assignee: Potenza Therapeutics Inc
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2024-04-01
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: CO2019007846A2; IL267097A; AR110659A1; TW201829466A; JP2020511947A; WO2018119171A1; EP3558365A1; US20180186886A1; MA47113A; US20190119389A1; KR20190099254A; EP3558365B1; PH12019501405A1; JOP20190134A1; SG10201913855TA; AU2017379062A1; US11186644B2; MX2019007554A; US20220098312A1; CA3046313A1

Abstract

En el presente documento se proporcionan proteínas de unión a antígenos (ABP) que se unen selectivamente a NRP-1 y sus isoformas y homólogos, y composiciones que comprenden las ABP. También se proporcionan métodos para usar los ABP, tales como métodos terapéuticos y de diagnóstico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a antígeno de anti-neuropilina y métodos de uso de las mismas

CAMPO

En la presente se proporcionan proteínas de unión a antígeno (ABP) con especificidad de unión a NRP-1 como se define en las reivindicaciones y composiciones que comprenden dichas ABP, incluyendo composiciones farmacéuticas, composiciones de diagnóstico y kits. También se proporcionan métodos para elaborar dichas ABP de NRP-1 y métodos para usar ABP de NRP-1, por ejemplo, con propósitos terapéuticos, de diagnóstico y de investigación.

ANTECEDENTES

Múltiples estudios han demostrado que los tumores son capaces de establecer un microambiente inmunosupresor para escapar a la vigilancia inmunitaria y promover el desarrollo tumoral. Las células T reguladoras (Tregs) son un componente importante del medio inmunosupresor en el entorno tumoral y actúan amortiguando la inmunidad de las células T frente a los antígenos asociados altumor. Las Tregs son, por tanto, un obstáculo importante a la hora de montar una respuesta inmune antitumoral eficaz. La depleción de las Tregs en modelos murinos de cáncer inhibe el crecimiento tumoral; sin embargo, los trastornos autoinmunes e inflamatorios acompañantes asociados a una depleción completa de las Tregs pueden limitar la utilidad clínica de este enfoque. Las estrategias que se dirigen específicamente a las Tregs, en el microambiente tumoral inflamatorio, pueden ser una alternativa viable. Estudios recientes en varios laboratorios han identificado la neuropilina 1 (NRP-1) como un objetivo candidato para modular la actividad de las Tregs en los tumores sin afectar a las Tregs en la periferia (consultar, por ejemplo, Chaudhary y Elkord, Vaccines (2016) Sep;4(3): 28; Bos et al., J Exp Med (2013) 210 (11):2435-66; Teng et al., Cancer Res. (2010) 70 (20):7800-.

La NRP-1 es una proteína transmembrana multifuncional de 130 kDa con un gran dominio extracelular que contiene dos dominios CUB N-terminales (a1 y a2), dos dominios de homología del factor de coagulación V/VIII (b1 y b2) y un único dominio MAM (c). La cola citoplásmica es corta y no muestra ninguna actividad catalítica por sí misma. La NRP-1 es un receptor con múltiples ligandos y correceptores conocidos, como las semaforinas, el VEGF, el PlGF y las plexinas, entre otros (Appleton et al., Embo J. (2007) Nov 28; 26(23): 4902-4912).

La NRP-1 se expresa en las Tregs humanas y murinas, y esta expresión identifica un subconjunto de Tregs altamente supresor. Dentro del microambiente tumoral, la expresión de NRP-1 es necesaria para la estabilidad y función de las Tregs, pero no afecta a las Tregs fuera del entorno inflamatorio de los tumores. Estudios recientes han identificado el ligando semaforina 4A (Sema4a) expresado por células inmunitarias como un ligando adicional para NRP-1, y han demostrado que la interacción sema4a/NRP-1 es un importante mediador de la estabilidad de las Tregin vitroy en sitios inflamatoriosin vivo.Estos datos sugieren que NRP-1 es necesario para la estabilidad y la función del linaje de Treg (consultar, por ejemplo, Delgoffe et al., Nature (2013) Sep 12;501(7466):252-6.).

Varias líneas de evidencia apoyan la utilidad de dirigirse a la interacción de NRP-1 y sus proteínas asociadas, en particular dirigirse al eje NRP-1/Sema, en las Tregs como estrategia para modular el microambiente inmunosupresor que se encuentra en los tumores. Por ejemplo, los ratones con inactivación de NRP-1 dirigido a las Tregs muestran una reducción del crecimiento tumoral en varios modelos de tumores murinos, sin ningún otro fenotipo autoinmune. Además, los antagonistas de NRP-1 o Sema revierten la actividad supresora de las Treg y demuestran eficacia antitumoral de nuevo en ausencia de eventos adversos autoinmunes. Además, se ha propuesto que el eje NRP-1-VEGFA es una vía importante que regula la quimiotaxis de las Tregs en el microambiente tumoral, y un Ab antagonista que bloquee esta interacción en las Tregs podría inhibir la afluencia de estas células supresoras al tumor.

Hay evidencias emergentes que sugieren que NRP-1 se expresa en la superficie de las células inmunitarias en los tumores humanos. Se encuentran NRP-1 Tregs en los ganglios linfáticos de drenaje (DLN) de pacientes con cáncer de cuello uterino, y se observó un descenso significativo del porcentaje de Tregs en DLN en pacientes con respuesta patológica a la quimiorradiación preoperatoria. Además, se han observado que las Tregs de NRP-1+ en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en pacientes con melanoma y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello.

La WO 2007/056470 se refiere a antagonistas de la neuropilina. La WO 2014/058915 divulga terapias que afectan al eje neuropilina-1-semaforina. Liang et al., J. Mol. Biol. (2007), 366(3):815-829 divulga anticuerpos bloqueantes de la neuropilina-1. La WO 2012/006503 se refiere a anticuerpos anti-neuropilina. La WO 2008/143666 divulga estructuras cristalinas de fragmentos de neuropilina y complejos neuropilina-anticuerpo. Shin et al. Cancer Ther. (2014), 13(3): 651-661 describe un anticuerpo dirigido a tumores sólidos. Pan et al., Cancer Cell (2007), 11(1):53-67 describe el efecto de los anticuerpos monoclonales de neuropilina-1. Geretti et al., Angiogenesis (2008), 11(1):31-39 describe la estructura y los ligandos de la neuropilina.

Por tanto, hay una necesidad de terapias que puedan antagonizar NRP-1 sin inducir enfermedades autoinmunes. En la presente se proporcionan ABP que satisfacen esta necesidad.

SUMARIO

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a NRP-1 humana (hNRP-1; SEQ ID NO: 130), en donde el anticuerpo comprende las siguientes seis secuencias de CDR:

(a) una CDR-H3 de la SEQ ID NO:47, una CDR-H2 de la SEQ ID NO:27, una CDR-H1 de la SEQ ID NO: 12, una CDR-L3 de la SEQ ID NO:81, una CDR-L2 de la SEQ ID NO:71, y una CDR-L1 de la SEQ ID NO:63;

(b) una CDR-H3 de la SEQ ID NO:47, una CDR-H2 de la SEQ ID NO:28, una CDR-H1 de la SEQ ID NO: 13, una CDR-L3 de la SEQ ID NO:81, una CDR-L2 de la SEQ ID NO:71, y una CDR-L1 de la SEQ ID NO:63;

(c) una CDR-H3 de la SEQ ID NO:47, una CDR-H2 de la SEQ ID NO:29, una CDR-H1 de la SEQ ID NO: 14, una CDR-L3 de la SEQ ID NO:81, una CDR-L2 de la SEQ ID NO:71, y una CDR-L1 de la SEQ ID NO:63; o

(d) una CDR-H3 de la SEQ ID NO:47, una CDR-H2 de la SEQ ID NO:30, una CDR-H1 de la SEQ ID NO:14, una CDR-L3 de la SEQ ID NO:81, una CDR-L2 de la SEQ ID NO:71, y una CDR-L1 de la SEQ ID NO:63;

en donde el anticuerpo bloquea la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina 3A (SEMA3A) y en donde el anticuerpo bloquea las interacciones entre un polipéptido de NRP-1 y un polipéptido del factor A de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGFA).

La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo de la invención. La invención proporciona además un vector que comprende el polinucleótido de la invención.

La invención proporciona una célula huésped que comprende el polinucleótido de la invención o el vector de la invención; opcionalmente, en donde la célula huésped se selecciona entre una célula bacteriana, una célula fúngica y una célula de mamífero, o en donde la célula huésped se selecciona entre una célula de E. coli, una célula de Saccharomyces cerevisiae y una célula CHO.

La invención también proporciona un método de producción de un anticuerpo de la invención, que comprende expresar el anticuerpo en la célula huésped de la invención y aislar el anticuerpo expresado.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona el anticuerpo de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento; y/o para su uso en un método para tratar el cáncer o una infección vírica.

La invención también proporciona un kit que comprende el anticuerpo de la invención, e instrucciones para el uso del anticuerpo, opcionalmente en donde el anticuerpo está liofilizado, opcionalmente además en donde el kit comprende además un fluido para la reconstitución del anticuerpo liofilizado.

En una realización, el anticuerpo comprende una secuencia V<h>de la SEQ ID NO:92 y una secuencia V<l>de la SEQ ID NO: 104; una secuencia V<h>de la SEQ ID NO:93 y una secuencia V<l>de la SEQ ID NO:104; una secuencia V<h>de la SEQ ID NO:94 y una secuencia V<l>de la SEQ ID NO: 104; una secuencia V<h>de la SEQ ID NO:95 y una secuencia V<l>de la SEQ ID NO: 104; o una secuencia V<h>de la SEQ ID NO:96 y una secuencia V<l>de la<s>E<q>ID NO:104.

En otra realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 114 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 126; una cadena pesada de la SEQ ID NO:115 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 126; una cadena pesada de la SEQ ID NO: 116 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 126; una cadena pesada de la SEQ ID NO:117 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 126; o una cadena pesada de la SEQ ID NO:118 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126.

En una realización, las CDR-H3, CDR-H2, CDR-H1, CDR-L3, CDR-L2 y CDR-L1 se identifican de acuerdo con un esquema de numeración seleccionado entre el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia o el esquema de numeración IMGT. En otra realización, la CDR-H1 se identifica según se define tanto en el esquema de numeración de Chothia como en el de Kabat, incluyendo los límites de ambos esquemas de numeración. En otra realización, el anticuerpo realiza una o más de las siguientes acciones: (a) compite o compite de manera cruzada por la unión a NRP-1 con un anticuerpo seleccionado entre MAB8, MAB9, M<a>B10, M<a>B11 o MAB12, en donde MAB8 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 114 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126, MAB 9 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:115 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 126, MAB 10 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 116 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 126, MAB 11 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 117 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 126, y MAB 12 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:118 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126; (b) es específico para la NRP-1 de la superficie celular; (c) es capaz de unirse a un dominio extracelular del polipéptido de NRP-1; o (d) se une específicamente a uno o más residuos de NRP I seleccionados del grupo que consiste en Y297, T316, D320, E348, T349, K350, K351, K352, Y353, Y354, E412, T413, G414 e I415, en donde el anticuerpo es MAB 12 que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 118 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo seleccionado de MAB8, MAB9, MAB10, MAB1 1, MAB 12, cada uno como se proporciona en el Apéndice A de esta divulgación.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra realización, el anticuerpo se selecciona entre un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En una realización, el anticuerpo es multivalente. En otra realización, el anticuerpo comprende un fragmento de anticuerpo. En otra realización, el anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina. En otra realización, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de una clase seleccionada entre IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En otra realización, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de la clase IgG y una subclase seleccionada entre IgG4, IgG1, IgG2 o IgG3. En otra realización, la IgG es una IgG4. En otra realización, la IgG es una IgG1.

En una realización, el anticuerpo comprende un anticuerpo de cadena ligera común, un anticuerpo con una modificación botón en los agujeros, un scFv unido a una IgG, un Fab unido a una IgG, un diacuerpo, un anticuerpo biespecífico tetravalente, un DVD-IgMAB, un DARTT M, un DuoBody®, un CovX-Body, un anticuerpo Fcab, un TandAb®, un Fab en tándem, un ZybodyMAB, o combinaciones de los mismos.

En una realización, el anticuerpo bloquea la unión de la semaforina 3A (SEMA3A) a NRP-1 en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80% o por lo menos aproximadamente un 90%. En una realización, el anticuerpo reduce la unión de la semaforina 3A a NRP-1 en por lo menos aproximadamente un 50%. En una realización, el tejido es un tumor. En otra realización, la NRP-1 se expresa en la superficie de una célula objetivo.

En una realización, el anticuerpo comprende una secuencia polipeptídica que tiene un residuo de piroglutamato (pE) en su extremo N-terminal. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia V<h>en la que una Q N-terminal está sustituida por pE. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia V<h>en la que una E N-terminal está sustituida por pE. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia V<l>en la que una E N-terminal está sustituida por pE. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada en la que una Q N-terminal está sustituida por pE. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada en la que una E N-terminal está sustituida por pE. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia de cadena ligera en la que una E N-terminal está sustituida por pE.

En una realización, el anticuerpo se une específicamente a NRP-1 humano con una kD de menos de 20 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 nM, menos de 1 nM, menos de 0,5 nM, o menos de 0,2 nM. En otra realización, el anticuerpo se une específicamente a NRP-1 de humanos, ratones y monos cynomolgus. En una realización, el anticuerpo se une a un epítopo diferente en NRP-1 que el epítopo en NRP-1 al que se une SEC10. En una realización, el anticuerpo se une al dominio a1, a2, b1 o b2 de NRP-1. En otra realización, el anticuerpo se une a más de un dominio de NRP-1. En otra realización, el anticuerpo se une al dominio b2 de NRP-1. En otra realización, el anticuerpo se une al dominio b1 de NRP-1.

En otro aspecto se proporciona cualquiera de los anticuerpos de la invención para su uso como medicamento. En otra realización, el anticuerpo se proporciona para su uso en el tratamiento de un cáncer o infección vírica. En una realización, el cáncer se selecciona entre un tumor sólido y un tumor hematológico.

En otro aspecto se proporciona un kit que comprende cualquiera de los anticuerpos de la invención, e instrucciones para el uso del anticuerpo. En una realización, el kit comprende un anticuerpo liofilizado. En otra realización, el kit comprende un fluido para la reconstitución del anticuerpo liofilizado.

En otro aspecto se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo de la invención.

En otro aspecto se proporciona un vector que comprende el polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo de la invención.

En otro aspecto, se proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores o polinucleótidos de la invención. En una realización, la célula huésped se selecciona entre una célula bacteriana, una célula fúngica y una célula de mamífero. En otra realización, la célula huésped se selecciona entre una célula de E. coli, una célula de Saccharomyces cerevisiae y una célula CHO.

En otro aspecto se proporciona una reacción de expresión libre de células que comprende cualquiera de los vectores o polinucleótidos de la invención.

En otro aspecto se proporciona un método para producir un anticuerpo de la invención, que comprende expresar el anticuerpo en la célula huésped de la invención y aislar el anticuerpo expresado.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, el anticuerpo está presente en la composición en una cantidad eficaz para inhibir localmente la interacción de NRP-1:semaforina-4 en un tumor. En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 está presente en la composición en una cantidad eficaz para inhibir una interacción entre NRP-1 y un polipéptido de semaforina transmembrana cuando se administra a un sujeto humano. En otra realización, el anticuerpo anti-NRP-1 bloquea específicamente la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina transmembrana.

El anticuerpo anti-NRP-1 de la invención bloquea la interacción entre un polipéptido de NRP-1 y un polipéptido del factor A de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGFA). El anticuerpo anti-NRP1 de la invención bloquea la unión de NRP-1 a SEMA3A. En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 bloquea la unión a SEMA4. El anticuerpo de la invención bloquea la interacción entre un polipéptido de NRP-1 y SEMA3A. El anticuerpo de la invención bloquea la interacción entre un polipéptido de NRP-1 y VEGFA. En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 es capaz de inhibir la supresión de Treg en el sujeto humano. En otra realización, el anticuerpo anti-NRP-1 es capaz de disminuir la supervivencia y/o estabilidad de las Treg en el sujeto humano. En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 está presente en la composición en una cantidad eficaz para inhibir localmente la interacción de NRP-1:semaforina-4 en un tumor. En otra realización, el anticuerpo anti-NRP-1 está presente en la composición en una cantidad eficaz para prevenir el desarrollo de una manifestación autoinmune y/o inflamatoria no deseada. En una realización, el sujeto humano padece un cáncer. En una realización, la cantidad del anticuerpo en la composición farmacéutica es suficiente para (a) reducir la supresión de células T efectoras por células T reguladoras; (b) activar células T efectoras; (c) reducir el número de células T reguladoras en un tejido o sistémicamente; (d) inducir o potenciar la proliferación de células T efectoras; (e) inhibir la tasa de crecimiento tumoral; (f) inducir la regresión tumoral; o (g) combinaciones de los mismos, en un sujeto.

En una realización, la composición farmacéutica es para su uso como un medicamento. En una realización, la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de un cáncer o una infección vírica. En una realización, la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de un cáncer, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de cerebro, próstata, mama, colon, piel y pulmón. En una realización, la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, el anticuerpo en la composición farmacéutica es suficiente para (a) reducir la supresión de células T efectoras por células T reguladoras; (b) activar células T efectoras; (c) reducir el número de células T reguladoras en un tejido o sistémicamente; (d) inducir o potenciar la proliferación de células T efectoras; (e) inhibir la tasa de crecimiento tumoral; (f) inducir la regresión tumoral; o (g) combinaciones de los mismos, en un sujeto.

En otro aspecto se proporciona el anticuerpo o la composición farmacéutica de la invención para su uso como un medicamento; y/o para su uso en un método para tratar el cáncer o una infección vírica. En una realización, el método comprende inhibir una función o disminuir la estabilidad de una célula T reguladora (Treg) en un sujeto, que comprende exponer la Tregin vivoa un inhibidor del eje neuropilina-1 (NRP-1):semaforina en la Treg, en donde se administra al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo o composición farmacéutica de la invención. En una realización, el método comprende aumentar la función de las células efectoras T (Teff) o exponer las T fin vivoal anticuerpo de la invención, el método comprendiendo administrar a un sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la invención. En una realización, el sujeto tiene un cáncer. En una realización, el método induce o potencia una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado al cáncer. En una realización, el anticuerpo es capaz de (a) disminuir la supervivencia y/o estabilidad de las Treg en el sujeto humano; (b) unirse a un dominio extracelular del polipéptido de NRP-1; o (c) una combinación de los mismos.

En una realización, el método comprende además administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales. En una realización, el agente terapéutico adicional se selecciona entre radiación, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente citostático, un agente antihormonal, un inhibidor de VEGF, un agente inmunoestimulador, un agente antiangiogénico y combinaciones de los mismos. En una realización, el agente terapéutico adicional es un agente inmunoestimulador. En una realización, el agente inmunoestimulador comprende un agente que bloquea la señalización de un receptor inhibidor expresado por una célula inmunitaria o un ligando de la misma. En una realización, el receptor inhibidor expresado por una célula inmunitaria o ligando de la misma se selecciona entre PVRIG, VISTA, CCR4, CD27, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, Tim3, TIGIT, neuritina, BTLA, KIR y combinaciones de los mismos. En una realización, el agente inmunoestimulador comprende un agonista de un receptor estimulador expresado por una célula inmunitaria. En una realización, el receptor estimulador expresado por una célula inmunitaria se selecciona entre OX40, GITR, ICOS, CD28, CD37, CD40, 4-1BB y combinaciones de los mismos. En una realización, el agente inmunoestimulador comprende una citoquina. En otra realización, el agente inmunoestimulador comprende una vacuna contra un antígeno asociado al cáncer.

En otra realización, el método comprende modular una respuesta inmunitaria en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo de la invención. En una realización, el método comprende además administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales al sujeto. En una realización, el agente terapéutico adicional es (i) un agonista de un receptor estimulador de una célula inmunitaria o (ii) un antagonista de un receptor inhibidor de una célula inmunitaria, en donde el receptor de una célula inmunitaria se selecciona entre OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD28, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, GITR, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, ligando CD83, y combinaciones de los mismos. En otra realización, el agente terapéutico adicional es un virus oncolítico seleccionado entre el virus del herpes simple, el virus de la estomatitis vesicular, el adenovirus, el virus de la enfermedad de Newcastle, el virus vaccinia, un virus maraba y combinaciones de los mismos. En una realización, el agente terapéutico adicional se formula en la misma composición farmacéutica que el anticuerpo. En otra realización, el agente terapéutico adicional se formula en una composición farmacéutica distinta del anticuerpo.

En una realización, el agente terapéutico adicional se administra antes de administrar el anticuerpo. En otra realización, el agente terapéutico adicional se administra después de administrar el anticuerpo. En otra realización, el agente terapéutico adicional se administra simultáneamente con el anticuerpo. En una realización, el método no provoca sustancialmente trombocitopenia en el sujeto.

En otro aspecto se proporciona un anticuerpo anti-NRP-1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR-H3 que consiste en la SEQ ID NO:47, una CDR-H2 que consiste en la SEQ ID NO:30, y una CDR-H<1>que consiste en la SEQ ID NO: 14; y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR-L3 que consiste en la SEQ ID NO:81, una CDR-L2 que consiste en la SEQ ID NO:71, y una CDR-L1 que consiste en la SEQ ID NO:63, en donde el anticuerpo bloquea la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina 3A (SEMA3A) y en donde el anticuerpo bloquea las interacciones entre un polipéptido de NRP-1 y un polipéptido de factor de crecimiento de células endoteliales vasculares A (VEGFA). En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se selecciona de cualquiera de los siguientes (1) y (2):

(1) un anticuerpo anti-NRP-1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:96, y una región variable de cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 104; y

(2) un anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:96 en la que E del aminoácido número 1 está modificada a piroglutamato, y una región variable de cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 104.

En una realización es un método para producir un anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula o células huésped seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación para expresar un anticuerpo anti-NRP-1 humano tetravalente o un fragmento de unión a antígeno del mismo:

(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la realización (1) anterior y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo;

(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la realización (1) anterior y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo; y

(c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación de la realización (1) anterior y una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otra realización se proporciona (1) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo del aspecto anterior, y (2) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo del aspecto anterior.

En otra realización se proporciona un vector de expresión que comprende: (a) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo del aspecto anterior, y/o (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo del aspecto anterior.

En otra realización se proporciona una célula huésped transformada con un vector de expresión seleccionado del grupo que consiste en (a) a (b):

(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo del aspecto anterior, y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo; y

(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo del aspecto anterior y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo del aspecto anterior.

En otra realización se proporciona un anticuerpo anti-NRP-1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con el aspecto anterior, que se selecciona del grupo que consiste en (1) a (4):

(1) un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:118, y una cadena ligera que consiste en la s Eq ID NO:126;

(2) un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:118 en la que E del aminoácido número 1 está modificada a piroglutamato, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126;

(3) un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 1 a 453 de la SEQ ID<n>O:118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126; y

(4) un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 1 a 453 de la SEQ ID NO: 118 en la que E del número de aminoácidos 1 está modificada a piroglutamato, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 126.

En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 humano se usa para prevenir o tratar el cáncer. En otra realización, el anticuerpo anti-NRP-1 humano es para la fabricación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar el cáncer.

Un polinucleótido puede comprender:

(1) una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de acuerdo con la realización (1) anterior, y

(2) una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-NRP-1 humano de acuerdo con la realización (1) anterior.

Un vector de expresión puede comprender:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (1) anterior, y

(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (1) anterior.

Una célula huésped transformada con un vector de expresión puede seleccionarse del grupo que consiste en (a) a (b):

(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (1) anterior y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo; y

(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (1) anterior y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo.

Un método para producir un anticuerpo anti-NRP-1 humano, que comprende el cultivo de célula o células huésped seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación para expresar un anticuerpo anti-NRP-1 humano:

(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (1) anterior y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo; (b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (1) anterior y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo; y

(c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (1) anterior y una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo.

En una realización se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización anterior y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra realización se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (1) anterior, el anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (2) anterior, el anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (3) anterior, y/o el anticuerpo anti-NRP-1 humano de la realización (4) anterior, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica para tratar el cáncer. En otra realización, la composición se administra en combinación con radiación, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente citostático, un agente antihormonal, un inhibidor de VEGF, un agente inmunoestimulador, un agente antiangiogénico, o combinaciones de los mismos.

En otra realización se proporciona el anticuerpo anti-NRP-1 humano del aspecto anterior para su uso en un método para prevenir o tratar el cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-NRP-1 humano. En una realización, el método comprende además administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales. En una realización, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en radiación, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente citostático, un agente antihormonal, un inhibidor de VEGF, un agente inmunoestimulador, un agente antiangiogénico, y combinaciones de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

LasFiguras 1A y 1Bson dos gráficos que muestran la inhibición del crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores CT26 tratados con una versión murina de los MAB 2, 3, 4, 5, 7, 12, 13, 14 y 15, así como un control de IgG y el anticuerpo anti-NRP-1 SEC 10 como comparador. Los ratones fueron tratados con monoterapia de MAB (Figura 1A) o en combinación con un anticuerpo PD-1 (Figura 1B). Los tiempos de tratamiento con anticuerpos (días) se muestran con flechas. LaFigura 1Ces un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores CT26 tratados con monoterapia y terapia combinada según se describe en la presente. Se proporcionan: i) una versión murina de MAB12, ii) un inhibidor de PD-1, y iii) una combinación de MAB12 y el inhibidor de PD-1. Los tiempos de tratamiento con anticuerpos (días) se muestran con flechas.

LaFigura 2son tres gráficos que muestran la inhibición del crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores MC38 tratados con una versión murina de los MAB 2, 3, 4, 5, 7, 12, 13, 14 y 15, así como un control de IgG y SEC10 como comparador. Los ratones fueron tratados con monoterapia de MAB (Figura 2A) o en combinación con un anticuerpo PD-L1 (Figura 2B). Los tiempos de tratamiento con anticuerpos (días) se muestran con flechas. En la Figura 2C se muestra la eficacia antitumoral de mMAB12 solo o en combinación con el anticuerpo PD-L1 en el modelo de tumor de colon singénico de ratón MC38.

LaFigura 3son dos gráficos que muestran datos de agrupamiento de epítopos para los anticuerpos anti-NRP-1 MAB 12 y SEC10. El panel superior muestra los datos de agrupamiento para MAB 12 y SEC10 con 5 pg/ml de MAB 12 inmovilizado en sensores AHC de Fc antihumano. El panel inferior muestra datos de agrupamiento para MAB 12 y SEC 10 con 5 pg/ml de SEC 10 inmovilizado en los sensores. La proteína NRP 1 se une al anticuerpo inmovilizado y se evalúa la unión del segundo anticuerpo. Las trazas muestran que MAB12 y SEC10 son capaces de unirse simultáneamente a NRP1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

1. Definiciones

A menos que se defina de otro modo, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica usada en la presente tengan el significado comúnmente entendido por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente por claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sobre lo que se entiende de manera general en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en la presente son generalmente bien conocidos y empleados comúnmente usando metodologías convencionales por los expertos en la técnica como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4a ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado se llevan a cabo generalmente de acuerdo con los protocolos y condiciones definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario.

Como se usan en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se pretende que los términos "incluye", "como" y similares expresen inclusión sin limitación, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Como se usa en la presente, el término "que comprende" también incluye específicamente las realizaciones "que consisten en" y "que consisten esencialmente en" los elementos mencionados, a menos que se indique específicamente lo contrario.

El término "aproximadamente" indica y abarca un valor indicado y un intervalo por encima y por debajo de dicho valor. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" indica el valor designado ± 10%, ± 5% o ± 1%. En ciertas realizaciones, cuando sea aplicable, el término "aproximadamente" indica el valor o valores designados ± una desviación estándar de dicho valor o valores.

El término "inmunoglobulina" se refiere a una clase de proteínas estructuralmente relacionadas que generalmente comprenden dos pares de cadenas polipeptídicas: un par de cadenas ligeras (L) y un par de cadenas pesadas (H). En una "inmunoglobulina intacta", las cuatro cadenas están interconectadas por enlaces disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas está bien caracterizada. Consultar, por ejemplo, Paul, Fundamental Immunology<7>a ed., Ch. 5 (2013) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. Brevemente, cada cadena pesada comprende típicamente una región variable de cadena pesada (Vh) y una región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de cadena pesada comprende típicamente tres dominios, abreviados Cm, Ch<2>, y Ch<3>. Cada cadena ligera comprende típicamente una región variable de cadena ligera (Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende típicamente un dominio, abreviado C<l>.

El término "proteína de unión a antígeno" (ABP) se refiere a una proteína que comprende uno o más dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a un antígeno o epítopo. El dominio de unión a antígeno puede unirse al antígeno o epítopo con especificidad y afinidad similares a las de los anticuerpos naturales. La ABP puede comprender un anticuerpo. La ABP puede consistir en un anticuerpo. La ABP puede consistir esencialmente en un anticuerpo. La ABP puede comprender un andamiaje alternativo. La ABP puede consistir en un andamiaje alternativo. La ABP puede consistir esencialmente en un andamiaje alternativo. La ABP puede comprender un fragmento de anticuerpo. La ABP puede consistir en un fragmento de anticuerpo. La ABP puede consistir esencialmente en un fragmento de anticuerpo. Una "ABP NRP-1", "ABP anti-NRP-1" o "ABP específica de NRP-1" es una ABP, como se describe en la presente, que se une específicamente al antígeno de NRP-1. La ABP puede unirse al antígeno de NRP-1 extracelular de NRP-1. Una ABP de NRP-1 divulgada en la presente puede unirse aun epítopo de NRP-1 conservado entre proteínas NRP-1 de diferentes especies.

El término "anticuerpo" se usa en la presente en su sentido más amplio e incluye ciertos tipos de moléculas de inmunoglobulina que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a un antígeno o epítopo. Un anticuerpo incluye específicamente anticuerpos intactos (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas), fragmentos de anticuerpos y anticuerpos multiespecíficos. Un anticuerpo es un tipo de ABP.

El término "dominio de unión a antígeno" significa la porción de una ABP capaz de unirse específicamente a un antígeno o epítopo. Un ejemplo de dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno formado por un dímero Vh-Vl de un anticuerpo. Otro ejemplo de dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno formado por la diversificación de ciertos giros del décimo dominio de fibronectina tipo III de una adnectina.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en la presente indistintamente para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura de un anticuerpo de origen natural y que tiene cadenas pesadas que comprenden una región Fc. Por ejemplo, cuando se usa para referirse a una molécula de IgG, un "anticuerpo de longitud completa" es un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Un "anticuerpo anti-NRP-1 humano" es el anticuerpo intacto, tal como se proporciona en la presente, que se une específicamente a la NRP-1 humana.

El término "región Fc" significa la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que, en los anticuerpos de origen natural, interactúa con los receptores de Fc y con determinadas proteínas del sistema del complemento. En la técnica se conocen las estructuras de las regiones de Fc de diversas inmunoglobulinas y los sitios de glicosilación que contienen. Consultar Schroeder y Cavacini, J. Allergy Clin. Immunol., 2010, 125:S41-52. La región Fc puede ser una región Fc natural o una región Fc modificada como se describe en la técnica o en otra parte de la presente divulgación.

Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse a su vez en regiones de hipervariabilidad ("regiones hipervariables (HVR)"; también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR)) intercaladas con regiones más conservadas. Las regiones más conservadas se denominan regiones marco (FR). Cada Vh y Vl comprende generalmente tres CDR y cuatro FR, dispuestas en el siguiente orden (desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal): FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Las CDR participan en la unión al antígeno e influyen en la especificidad del antígeno y la afinidad de unión del anticuerpo. Consultar Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologicallnterest 5a ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.

La cadena ligera de cualquier especie vertebrada puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (k) y lambda (A), sobre la base de la secuencia de su dominio constante.

La cadena pesada de cualquier especie vertebrada puede asignarse a una de cinco clases (o isotipos) diferentes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Estas clases también se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente. Las clases de IgG e IgA se dividen a su vez en subclases sobre la base de las diferencias de secuencia y función. Los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

Los límites de la secuencia de aminoácidos de una CDR pueden determinarse por un experto en la técnica usando cualquiera de los esquemas de numeración conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al.,supra(esquema de numeración "Kabat"); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948 (esquema de numeración "Chothia"); MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 (esquema de numeración "Contact"); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 (esquema de numeración "IMGT"); y Honegge y Plückthun, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70 (esquema de numeración "AHo").

En la Tabla 1 se indican las posiciones de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 según se definen por los esquemas de Kabat y Chothia. En el caso de CDR-H1, la numeración de los residuos se realiza usando los esquemas de numeración de Kabat y Chothia.

Las CDR pueden asignarse, por ejemplo, usando software de numeración de anticuerpos, como Abnum, disponible de www.bioinf.org.uk/abs/abnum/, y descrito en Abhinandan and Martin, Immunology, 2008, 45:3832-3839.

Tabla 1. Residuos en las CDR de acuerdo con los es uemas de numeración de Kabat Chothia.

El "esquema de numeración EU" se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de cadena pesada de anticuerpo (por ejemplo, como se informa en Kabat et al.,supra).A menos que se indique lo contrario, el esquema de numeración EU se usa para referirse a residuos en regiones constantes de cadena pesada de anticuerpos descritas en la presente.

Un "fragmento de anticuerpo" o un "fragmento de unión a antígeno" comprende una porción de un anticuerpo intacto, como la región variable o de unión a antígeno de un anticuerpo intacto. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, por ejemplo, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')<2>, fragmentos Fab', fragmentos scFv(sFv) y fragmentos scFv-Fc.

Los fragmentos "Fv" comprenden un dímero enlazado no covalentemente de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera.

Los fragmentos "Fab" comprenden, además de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera, el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (Cm) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab pueden generarse, por ejemplo, mediante métodos recombinantes o por digestión con papaína de un anticuerpo de longitud completa.

Los fragmentos "F(ab')<2>" contienen dos fragmentos Fab' unidos, cerca de la región bisagra, por enlaces disulfuro. Los fragmentos F(ab')<2>pueden generarse, por ejemplo, mediante métodos recombinantes o mediante digestión con pepsina de un anticuerpo intacto. Los fragmentos F(ab') pueden disociarse, por ejemplo, mediante tratamiento con p-mercaptoetanol.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o "sFv" o "scFv" comprenden un dominio Vh y un dominio V<l>en una única cadena polipeptídica. La V<h>y la V<l>están generalmente enlazados por un conector peptídico. Consultar Plückthun A. (1994). Puede usarse cualquier conector adecuado. En algunas realizaciones, el conector es un (GGGGS)n (SEQ ID NO: l4o). En algunas realizaciones, n = 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Consultar Antibodies fromEscherichia coli.En Rosenberg M. & Moore G.P. (Eds.), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, Nueva York.

Los fragmentos "scFv-Fc" comprenden un scFv unido a un dominio Fc. Por ejemplo, un dominio Fc puede estar unido al extremo C-terminal del scFv. El dominio Fc puede seguir la Vh o la Vl, dependiendo de la orientación de los dominios variables en el scFv (es decir, V<h>-V<l>o V<l>-V<h>). Puede usarse cualquier dominio Fc adecuado conocido en la técnica o descrito en la presente. En algunos casos, el dominio Fc comprende un dominio Fc de IgG4.

El término "anticuerpo de dominio único" se refiere a una molécula en la que un dominio variable de un anticuerpo se une específicamente a un antígeno sin la presencia del otro dominio variable. Los anticuerpos de dominio único, y los fragmentos de los mismos, se describen en Arabi Ghahroudi et al., FEBS Letters, 1998, 414:521-526 y Muyldermans et al., Trends in Biochem. Sci., 2001,26:230-245. Los anticuerpos de dominio único también se conocen como sdAbs o nanocuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos comprende anticuerpos que son sustancialmente similares y que se unen al mismo epítopo o epítopos, excepto por las variantes que pueden surgir normalmente durante la producción del anticuerpo monoclonal. Tales variantes están generalmente presentes en cantidades mínimas. Un anticuerpo monoclonal se obtiene típicamente mediante un proceso que incluye la selección de un único anticuerpo a partir de una pluralidad de anticuerpos. Por ejemplo, el proceso de selección puede consistir en la selección de un clon único a partir de una pluralidad de clones, como un conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos, clones de levadura, clones bacterianos u otros clones de ADN recombinante. El anticuerpo seleccionado puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la objetivo ("maduración por afinidad"), para humanizar el anticuerpo, para mejorar su producción en cultivo celular y/o reducir su inmunogenicidad en un sujeto.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado generalmente es un anticuerpo humano (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una o más c Dr se sustituyen por residuos de una o más c Dr de un anticuerpo no humano (anticuerpo donante). El anticuerpo donante puede ser cualquier anticuerpo no humano adecuado, como un anticuerpo de ratón, rata, conejo, pollo o primate no humano que tenga una especificidad, afinidad o efecto biológico deseados. En algunos casos, los residuos seleccionados de la región marco del anticuerpo receptor se sustituyen por los residuos correspondientes de la región marco del anticuerpo donante. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Tales modificaciones pueden realizarse para refinar aún más la función del anticuerpo. Para detalles adicionales, consultar Jones et al., Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323-329; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596.

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana, o derivado de una fuente no humana que utiliza un repertorio de anticuerpos humanos o secuencias codificantes de anticuerpos humanos (por ejemplo, obtenidas de fuentes humanas o diseñadasde novo).Los anticuerpos humanos excluyen específicamente los anticuerpos humanizados.

Por "SEC10" se entiende un anticuerpo anti-NRP-1 previamente en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos, con y sin bevacizumab. Consultar, por ejemplo, "A Study of MNRP1685A in Patients with Locally Advanced or Metastatic Solid Tumors", clinicaltrials.gov Identificador NCT00747734.

Por"SEC3" se entiende el anticuerpo pan-anti-NRP-1 expuesto en la SEQ ID NO: 144, también descrito, por ejemplo, en Appleton, et. al., The EMBO Journal (2007) 26, 4902-4912.

Por "MAB59941" se entiende un anticuerpo anti-Neuropilina-1 de ratón disponible en R&D Systems, Clon N° 761704.

Una "ABP aislado" o "ácido nucleico aislado" es una ABP o ácido nucleico que ha sido separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes del entorno natural pueden incluir enzimas, hormonas y otros materiales proteínicos o no proteínicos. Una ABP aislada puede purificarse hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna, por ejemplo mediante el uso de un secuenciador de vaso giratorio. Una ABP aislada puede purificarse hasta la homogeneidad mediante electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE) en condiciones reductoras o no reductoras, con detección mediante azul de Coomassie o tinción de plata. Una ABP aislada puede incluir una ABPin situdentro de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del entorno natural de la ABP no está presente. Una ABP aislada o un ácido nucleico aislado pueden prepararse mediante por lo menos un paso de purificación. Una ABP aislada o ácido nucleico aislado puede purificarse hasta por lo menos el 80%, 85%, 90%, 95% o 99% en peso. Una ABP aislada o ácido nucleico aislado puede purificarse hasta por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95% o 99% en volumen. Una ABP aislada o ácido nucleico aislado puede proporcionarse como una solución que comprende por lo menos un 85%, 90%, 95%, 98%, 99% a 100% de ABP o ácido nucleico en peso. Una ABP aislada o ácido nucleico aislado puede proporcionarse como una solución que comprende por lo menos el 85%, 90%, 95%, 98%, 99% a 100% de ABP o ácido nucleico en volumen.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, una ABP) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno o epítopo). A menos que se indique lo contrario, como se usa en la presente, "afinidad" se refiere a la afinidad de unión intrínseca, que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo, ABP y antígeno o epítopo). La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede representarse mediante la constante de equilibrio de disociación (K<d>). Los componentes cinéticos que contribuyen a la constante de equilibrio de disociación se describen con más detalle a continuación. La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la presente, como la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) (por ejemplo, BIACORE®) o la interferometría de biocapa (por ejemplo, FORTEBIO®).

Con respecto a la unión de una ABP a una molécula objetivo, los términos "unir", "unión específica", "se une específicamente a", "específico para", "se une selectivamente" y "selectivo para" un antígeno particular (por ejemplo, un polipéptido objetivo) o un epítopo en un antígeno particular significan una unión que es mensurablemente diferente de una interacción no específica o no selectiva (por ejemplo, con una molécula no objetivo). La unión específica puede medirse, por ejemplo, midiendo la unión a una molécula objetivo y comparándola con la unión a una molécula no objetivo. La unión específica también puede determinarse por competencia con una molécula de control que imite el epítopo reconocido en la molécula objetivo. En ese caso, la unión específica se indica si la unión de la ABP a la molécula objetivo es inhibida competitivamente por la molécula de control. La afinidad de una ABP de NRP-1 por una molécula no objetivo puede ser menor de aproximadamente el 50% de la afinidad por la NRP-1. La afinidad de una ABP de NRP-1 por una molécula no objetivo puede ser menor de aproximadamente el 40% de la afinidad por NRP-1. La afinidad de una ABP de NRP-1 por una molécula no objetivo puede ser menor de aproximadamente el 30% de la afinidad por NRP-1. La afinidad de una ABP de NRP-1 por una molécula no objetivo puede ser menor de aproximadamente el 20% de la afinidad por la NRP-1. La afinidad de una ABP de NRP-1 por una molécula no objetivo puede ser menor de aproximadamente el 10% de la afinidad por NRP-1. La afinidad de una ABP de NRP-1 por una molécula no objetivo puede ser menor de aproximadamente el 1% de la afinidad por NRP-1. La afinidad de una ABP de NRP-1 por una molécula no objetivo puede ser menor de aproximadamente el 0,1% de la afinidad por NRP-1.

El término "kd" (seg_1), como se usa en la presente, se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción ABP-antígeno particular. Este valor también se denomina valor koff.

El término "ka" (M'1 x seg'1), como se usa en la presente, se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción ABP-antígeno particular. Este valor también se denomina valor kon.

El término "K<d>" (M), como se usa en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción ABP-antígeno particular. Kd = kd/ka. La afinidad de una ABP puede describirse en términos de Kd para una interacción entre dicha ABP y su antígeno. Por claridad, como se sabe en la técnica, un valor de Kd menor indica una interacción de afinidad más alta, mientras que un valor de Kd mayor indica una interacción de afinidad más baja.

El término "Ka" (M‘1), como se usa en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción ABP-antígeno particular. K<a>=k jk a.

Una ABP "madurada por afinidad" es una ABP con una o más alteraciones (por ejemplo, en una o más CDR o FR) con respecto a una ABP original (es decir, una ABP de la que se deriva o a partir de la que se diseña la ABP alterada) que da como resultado una mejora en la afinidad de la ABP por su antígeno, en comparación con la ABP originnal que no posee la alteración o alteracione). Una ABP madurada por afinidad puede tener una afinidad nanomolar o picomolar por el antígeno objetivo. Las ABP maduradas por afinidad pueden producirse usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marksetal. (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) describen la maduración por afinidad mediante transposiciones de dominios Vh y Vl. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos marco se describe, por ejemplo, en Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91:3809-3813); Schier et al., Gene, 1995, 169:147-155; Yelton et al., J. Immunol., 1995, 155:1994-2004; Jackson et al., J. Immunol., 1995, 154:3310-33199; y Hawkins et al, J. Mol. Biol., 1992, 226:889-896.

Un "inmunoconjugado" es una ABP conjugada con una o más moléculas heterólogas, como un agente terapéutico o de diagnóstico.

Las "funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas mediadas por la región Fc de un anticuerpo, actividades que pueden variar dependiendo del isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen la unión a C1q para activar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la unión al receptor Fc para activar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).

Cuando se usa en la presente en el contexto de dos o más ABP, el término "compite con" o "compite de manera cruzada con" indica que los dos o más ABP compiten por unirse a un antígeno (por ejemplo, NRP-1). En un ensayo ejemplar, la NRP-1 se recubre sobre una superficie y se pone en contacto con una primera ABP de NRP-1, tras lo cual se añade una segunda ABP de NRP-1. En otro ensayo ejemplar, una primera a Bp de NRP-1 se recubre sobre una superficie y se pone en contacto con NRP-1, y después se añade una segunda ABP de NRP-1. Si la presencia de la primer ABP de NRP-1 reduce la unión de la segunda ABP de NRP-1, en cualquiera de los ensayos, entonces loa ABP compiten entre sí. El término "compite con" también incluye combinaciones de ABP en las que una ABP reduce la unión de otra ABP, pero en las que no se observa competencia cuando las ABP se añaden en el orden inverso. Sin embargo, la primera y la segundo ABP pueden inhibirse mutuamente, independientemente del orden en que se añadan. Una ABP puede reducir la unión de otra ABP a su antígeno en por lo menos un 25%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90% o por lo menos un 95%. Un experto en la técnica puede seleccionar las concentraciones de los anticuerpos usados en los ensayos de competición basándose en las afinidades de las ABP por NRP-1 y la valencia de las ABP. Los ensayos descritos en esta definición son ilustrativos, y un experto en la técnica puede utilizar cualquier ensayo adecuado para determinar si los anticuerpos compiten entre sí. Los ensayos adecuados se describen, por ejemplo, en Cox et al., "Immunoassay Methods", en Assay Guidance Manual [Internet], actualizada el 24 de diciembre de 2014 (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/; consultado el 29 de septiembre de 2015); Silman et al., Cytometry, 2001, 44:30-37; y Finco et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 2011, 54:351-358.

El término "epítopo" significa una porción de un antígeno que se une específicamente a una ABP. Los epítopos habitualmente consisten en residuos de aminoácidos accesibles en superficie y/o cadenas laterales de azúcar y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, puede perderse en presencia de solventes desnaturalizantes. Un epítopo puede comprender residuos de aminoácidos que intervienen directamente en la unión y otros residuos de aminoácidos que no intervienen directamente en la unión. El epítopo al que se une una ABP puede determinarse usando técnicas conocidas para la determinación de epítopos como, por ejemplo, pruebas de unión de ABP a variantes de NRP-1 con diferentes mutaciones puntuales, o a variantes quiméricas de NRP-1.

El porcentaje de "identidad" entre una secuencia polipeptídica y una secuencia de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro de la capacidad de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN (DNASTAR), CLUSTALW, CLUSTAL OMEGA, o MUSCLE. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para alinear las secuencias, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias comparadas.

Una "sustitución conservadora" o una "sustitución de aminoácidos conservadora " se refiere a la sustitución de un aminoácido por un aminoácido química o funcionalmente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos similares son bien conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, los grupos de aminoácidos proporcionados en las Tablas 2-4 se consideran, en algunas realizaciones, sustituciones conservadoras entre sí.

Tabla 2.Grupos seleccionados de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras entre sí, en ciertas realizaciones.

Tabla 3.Grupos seleccionados adicionales de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras entre sí, en ciertas realizaciones.

Tabla 4.Grupos seleccionados adicionales de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras entre sí en ciertas realizaciones.

Pueden encontrarse sustituciones conservadoras adicionales, por ejemplo, en Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties 2a ed. (1993) W. H. Freeman & Co., Nueva York, NY. Una ABP generada mediante una o más sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos en una ABP original se denomina "variante modificada conservadoramente".

El término "aminoácido" hace referencia a los veinte aminoácidos de origen natural más comunes. Entre los aminoácidos de origen natural se encuentran la alanina (Ala; A), la arginina (Arg; R), la asparagina (Asn; N), el ácido aspártico (Asp; D), la cisteína (Cys; C), el ácido glutámico (Glu; E), la glutamina (Gln; Q), la glicina (Gly; G), la histidina (His; H), la isoleucina (Ile; I), la leucina (Leu; L), la lisina (Lys; K), la metionina (Met; M), ka fenilalanina (Phe; F), la prolina (Pro; P), la serina (Ser; S), la treonina (Thr; T), el triptófano (Trp; W), la tirosina (Tyr; Y) y la valina (Val; V).

El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está enlazado. El término incluye el vector como estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que están operativamente enlazados. Tales vectores se denominan en la presente "vectores de expresión".

Los términos "célula huésped", "línea celular huésped" y "cultivo celular huésped" se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido un ácido nucleico exógeno, y a la progenie de tales células. Las células huésped incluyen "transformantes" (o "células transformadas") y "transfectantes" (o "células transfectadas"), cada una de las cuales incluye la célula transformada o transfectada primaria y la progenie derivada de la misma. Dicha progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, y puede contener mutaciones.

El término "que trata" (y variaciones del mismo, como "tratar" o "tratamiento") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural de una enfermedad o afección en un sujeto con necesidad de ello. El tratamiento puede realizarse tanto para profilaxis como durante el curso de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión o mejora del pronóstico.

Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una ABP o de una composición farmacéutica proporcionada en la presente que, cuando se administra a un sujeto, es eficaz para tratar una enfermedad o trastorno.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" significa un sujeto mamífero. Algunos sujetos ejemplares incluyen humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, camellos, cabras, conejos y ovejas. En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad o afección que puede tratarse con un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunos aspectos, la enfermedad o afección es un cáncer. En algunos aspectos, la enfermedad o afección es una infección vírica.

El término "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos o de diagnóstico (por ejemplo, kits) que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia combinada, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de tales productos terapéuticos o de diagnóstico.

El término "agente citotóxico", como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o causa la muerte o destrucción celular.

Un "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los agentes quimioterapéuticos incluyen "agentes antihormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer.

El término "agente citostático" se refiere a un compuesto o composición que detiene el crecimiento de una célulain vitrooin vivo.En algunas realizaciones, un agente citostático es un agente que reduce el porcentaje de células en fase S. En algunas realizaciones, un agente citostático reduce el porcentaje de células en fase S en por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 60% o por lo menos aproximadamente un 80%.

El término "tumor" se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásicos, ya sean malignos o benignos, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no se excluyen mutuamente como se mencionan en la presente. Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con algún grado de proliferación celular anormal. En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo celular es un cáncer. En algunos aspectos, el tumor es un tumor sólido. En algunos aspectos, el tumor es una enfermedad maligna hematológica.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación cuya forma permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz para tratar a un sujeto, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para el sujeto en las cantidades proporcionadas en la composición farmacéutica.

Los términos "modular" y "modulación" se refieren a reducir o inhibir o, alternativamente, activar o aumentar una variable mencionada.

Los términos "aumentar" y "activar" se refieren a un aumento del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces o más en una variable enumerada.

Los términos "reducir" e "inhibir" se refieren a una disminución del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces o más en una variable enumerada.

El término "agonizar" se refiere a la activación de la señalización del receptor para inducir una respuesta biológica asociada a la activación del receptor. Un "agonista" es una entidad que se une a un receptor y lo agoniza.

El término "antagonizar" se refiere a la inhibición de la señalización del receptor para inhibir una respuesta biológica asociada a la activación del receptor. Un "antagonista" es una entidad que se une a un receptor y lo antagoniza. En una realización, un antagonista bloquea el 100% de la unión de un ligando a su receptor; en otras realizaciones, un antagonista puede reducir la unión en un 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de la unión de un ligando a su receptor.

El término "una molécula de semaforina", como se usa en la presente en relación con agonistas del eje NRP-1: semaforina de las Tregs, abarca moléculas de semaforina transmembrana implicadas en la interacción con NRP-1 en las Tregs (por ejemplo, Sema3a, Sema4a), varias versiones de dichas moléculas inmovilizadas en superficie y en perlas, así como multímeros, derivados, mutantes, análogos y fragmentos de dichas moléculas que pueden usarse para potenciar una función o aumentar la estabilidad de las Tregs. Ejemplos no limitativos de tales moléculas agonistas de semaforina incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de semaforina derivadas de IgM que ensamblan complejos multiméricos incapaces de fijar el complemento, que reticulan NRP-1.

El término "eje de neuropilina-1 (NRP-1): semaforina de una célula T reguladora (Treg)", como se usa en la presente, se refiere a la vía de señalización iniciada por la semaforina (por ejemplo, una semaforina expresada por una célula como, por ejemplo, una célula T convencional, o una semaforina recombinante), la ligadura de NRP-1, y la señalización en sentido descendente posterior.

El término "célula T efectora" incluye las células T auxiliares (es decir, CD4+) y las células T citotóxicas (es decir, CD8+). Las células T efectoras CD4+ contribuyen al desarrollo de varios procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de las células B en células plasmáticas y células B de memoria, y la activación de células T citotóxicas y macrófagos. Las células T efectoras CD8+ destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales. Para más información sobre las células T efectoras, consultar Sedery Ahmed, Nature Immunol, 2003, 4:835-842.

El término "célula T reguladora" incluye células que regulan la tolerancia inmunológica, por ejemplo, suprimiendo las células T efectoras. En algunos aspectos, la célula T reguladora tiene un fenotipo CD4+CD25+Foxp3+. En algunos aspectos, la célula T reguladora tiene un fenotipo CD8+CD25+. Para información adicional sobre células T reguladoras que expresan NRP-1, consultar Nocentini et al., Br. J. Pharmacol., 2012, 165:2089-2099.

El término "célula dendrítica" se refiere a una célula presentadora de antígenos profesional capaz de activar una célula T ingenua y estimular el crecimiento y la diferenciación de una célula B.

2. Proteínas de unión a antígeno de NRP-1

2.1 Unión a NRP-1 y células objetivo

En la presente se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a hNRP-1 (SEQ ID NO: 130).

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se unen específicamente al dominio extracelular de NRP-1.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se unen específicamente al dominio extracelular de NRP-1 y al dominio extracelular de PD-1, PD-L1 o PD-L2, es decir, son anticuerpos biespecíficos.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es un fragmento de anticuerpo.

La NRP-1 puede expresarse en la superficie de cualquier célula objetivo adecuada. En algunas realizaciones, la célula objetivo es una célula T. En algunas realizaciones, la célula objetivo es una célula T efectora. En algunas realizaciones, la célula objetivo es una célula T reguladora. En algunas realizaciones, la célula objetivo es una célula asesina natural (NK). En algunas realizaciones, la célula objetivo es una célula T asesina natural (NKT). En algunas realizaciones, la célula objetivo es un macrófago. En otras realizaciones, la célula objetivo es una célula dendrítica. En una realización, la célula dendrítica es una célula dendrítica plasmacitoide.

En algunas realizaciones, la NRP-1 está asociada con otro receptor en la superficie de la célula. En algunas realizaciones, la NRP-1 forma parte de un complejo correceptor. En una realización, la NRP-1 está asociada con una plexina. En algunas realizaciones, la NRP-1 está asociada con un receptor de VEGF.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden una cadena ligera. En algunos aspectos, la cadena ligera es una cadena ligera kappa. En algunos aspectos, la cadena ligera es una cadena ligera lambda.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden una cadena pesada. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgA. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgD. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgE. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgM. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG1. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG2. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG3. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgG4. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgA1. En algunos aspectos, la cadena pesada es una IgA2.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten en un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten esencialmente en un fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fv. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento F(ab')<2>. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab'. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento scFv (sFv). En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento scFv-Fc. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de dominio único.

En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se deriva de un anticuerpo ilustrativo proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente no se deriva de un anticuerpo ilustrativo proporcionado en la presente y puede, por ejemplo, aislarsede novo deacuerdo con los métodos proporcionados en la presente para obtener fragmentos de anticuerpo.

El fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se une específicamente a hNRP-1. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se une específicamente a cNRP-1. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se une específicamente a mNRP-1. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se une específicamente a hNRP-1 y cNRP-1. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se une específicamente a hNRP-1 y mNRP-1. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se une específicamente a cNRP-1 y mNRP-1. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente se une específicamente a hNRP-1, cNRP-1 y mNRP-1.

En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente conserva la capacidad de antagonizar con NRP-1, según se mide por uno o más ensayos o efectos biológicos descritos en la presente. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente conserva la capacidad de impedir que NRP-1 interactúe con uno o más de sus ligandos, como se describe en la presente.

En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo proporcionado en la presente compite por la unión a NRP-1 con un anticuerpo seleccionado de MAB1, MAB2, MAB3, m Ab4, MAB5, MAB6, MAB7, MAB8, MAB9, MAB10, MAB11, MAB12, MAB13, MAB14, o MAB15, cada uno como se proporciona en el Apéndice A de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son específicos para la NRP-1 de la superficie celular.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente bloquean específicamente la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina transmembrana.

Los anticuerpos proporcionados en la presente bloquean la interacción entre un polipéptido de NRP-1 y un polipéptido del factor A de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGFA).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-NRP-1 bloquea la unión de SEMA4.

El anticuerpo proporcionado en la presente bloquea la interacción entre un polipéptido de NRP-1 y SEMA3A.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son capaces de inhibir la supresión de Treg en un sujeto humano.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente coestimulan una célula T efectora en combinación con la presentación de antígeno de una célula presentadora de antígeno.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente inhiben la supresión de una célula T efectora por una célula T reguladora.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente reducen el número de células T efectoras en un tejido o en la circulación sistémica.

En algunas realizaciones, un fragmento de un anticuerpo proporcionado en la presente se une al mismo epítopo de NRP-1 que dicho anticuerpo.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente son anticuerpos policlonales.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten en un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten esencialmente en un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten en un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten esencialmente en un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente comprenden un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten en un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente consisten esencialmente en un anticuerpo humano.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente están madurados por afinidad. En algunos aspectos, los anticuerpos madurados por afinidad son anticuerpos madurados por afinidad derivados de un anticuerpo ilustrativo proporcionado en la presente.

Las ABP pueden comprender un andamiaje alternativo, por ejemplo, consistir o consistir esencialmente en un andamiaje alternativo. Puede usarse cualquier andamiaje alternativo adecuado. El andamiaje alternativo puede seleccionarse entre una Adnectina™, un iMab, una Anticalina®, un EETI-II/AGRP, un dominio de Kunitz, un aptámero peptídico de tioredoxina, un Affibody®, un DARPin, una Affilina, una Tetranectina, un Fynomer y un Avímero.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente bloquea específicamente la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina transmembrana. En algunos aspectos, el anticuerpo inhibe la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina transmembrana en por lo menos aproximadamente un 50%. En algunos aspectos, el anticuerpo inhibe la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina transmembrana en por lo menos aproximadamente un 75%. En algunos aspectos, el anticuerpo inhibe la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina transmembrana en por lo menos aproximadamente un 90%. En algunos aspectos, el anticuerpo inhibe la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina transmembrana en por lo menos aproximadamente un 95%. En otras realizaciones, el polipéptido de semaforina es un polipéptido de SEMA4.

En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención compite con una ABP ilustrativa divulgada en la presente. En algunos aspectos, el anticuerpo que compite con la ABP ilustrativa divulgada en la presente se une al mismo epítopo que una ABP ilustrativa proporcionada en la presente.

Se sabe que cuando un anticuerpo se expresa en las células, el anticuerpo se modifica después de la traducción. Los ejemplos de modificación postraduccional incluyen la escisión de lisina en el extremo C terminal de la cadena pesada por una carboxipeptidasa; la modificación de glutamina o ácido glutámico en el extremo N terminal de la cadena pesada y la cadena ligera a ácido piroglutámico por piroglutamilación; glicosilación; oxidación; desamidación; y glicosilación, y se sabe que tales modificaciones postraduccionales se producen en varios anticuerpos (consultar Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447). En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que ha experimentado una modificación postraduccional. Ejemplos de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que ha experimentado modificación postraduccional incluyen un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo que han experimentado piroglutamilación en el extremo N terminal de la región variable de cadena pesada, piroglutamilación en el extremo N terminal de la región variable de cadena ligera, y/o deleción de lisina en el extremo C terminal de la cadena pesada. En la técnica se sabe que dicha modificación postraduccional debida a la piroglutamilación en el extremo N terminal y la deleción de lisina en el extremo C terminal no tiene ninguna influencia en la actividad del anticuerpo o fragmento del mismo (Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).

En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo anti-NRP-1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR-H3 que consiste en la SEQ ID NO:47, una CDR-H2 que consiste en la SEQ ID NO:30, y una CDR-H1 que consiste en la SEQ ID NO: 14; y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR-L3 que consiste en la SEQ ID NO:81, una CDR-L2 que consiste en la SEQ ID NO:71, y una CDR-L1 que consiste en la SEQ ID NO:63.

En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:96, y una región variable de cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:104.

En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 humano o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:96 en la que la E del aminoácido número 1 está modificado a piroglutamato, y una región variable de cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:104.

En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 humano comprende una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126.

En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 humano comprende una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 118 en la que la E del aminoácido número 1 está modificado a piroglutamato, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126.

En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 humano comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 1 a 453 de la SEQ ID NO:118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126.

En una realización, el anticuerpo anti-NRP-1 humano comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 1 a 453 de la SEQ ID NO:118 en la que la E del número de aminoácidos 1 está modificado a piroglutamato, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126.

2.2 Antagonismo de NRP-1

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente antagonizan con NRP-1 tras unirse.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado la activación de una célula T efectora. En algunos aspectos, la célula T efectora es una célula T CD8+. En algunos aspectos, la célula T efectora es una célula T CD4+.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado la activación de una célula NK. En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado la activación de una célula NKT. En algunas realizaciones, la célula NKT es una célula secretora de IL-17.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado una reducción de la actividad inhibidora de una célula T reguladora hacia una célula T efectora.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado un aumento de la secreción de IL-2, IL-6, GM-CSF, TNF, LT-a, y/o IFN-y por una célula objetivo.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente aumenta la proliferación, supervivencia y/o función de una célula T efectora. En algunos aspectos, la célula T efectora es una célula T efectora CD4+. En algunos aspectos, la célula T efectora es una célula T efectora CD8+.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente anula la supresión de una célula T efectora por una célula T reguladora. En algunos aspectos, la célula T reguladora es una célula T reguladora CD4+CD25+Foxp3+. En algunos aspectos, la célula T reguladora es una célula T reguladora CD8+CD25+.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado una mejora de una respuesta inmunitaria.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado la prevención de un tumor. En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado el retraso de la aparición de un tumor. En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado una reducción del tamaño de un tumor. En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado la eliminación de un tumor. En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado una reducción en el número de metástasis.

En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado la prevención de una enfermedad vírica. En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado el retraso de la aparición de una enfermedad vírica. En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado una reducción de la carga vírica en un sujeto. En algunas realizaciones, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente da como resultado la eliminación de una infección vírica.

2.3 Afinidad y cinética de las proteínas de unión a antígeno para NRP-1, potencia

En algunas realizaciones, la afinidad de un anticuerpo proporcionado en la presente por NRP-1, indicada por K<d>, es menor de aproximadamente 10'5 M, menor de aproximadamente 10'6 M, menor de aproximadamente 10'7 M, menor de aproximadamente 10'8 M, menor de aproximadamente 10'9 M, menor de aproximadamente 10'1° M, menor de aproximadamente 1°'11 M, o menor de aproximadamente 1°'12 M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 1°'7 M y 1°'12 M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 1°'7 M y 1°'11 M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 1°'7 M y 10'1° M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 1°'7 M y 1°'9 M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 1°'7 M y 1°'8 M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 1°'8 M y 1°'12 M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 1° M'8 y 1°'11 M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 10‘9 M y 1°’11 M. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo está entre aproximadamente 10‘1° M y 1°’11 M.

2.3.1 Variantes de glicosilación

En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente puede alterarse para aumentar, disminuir o eliminar el grado en que está glicosilado. La glicosilación de los polipéptidos está típicamente "ligada a N" o "ligada a O".

La glicosilación "ligada a N" se refiere a la unión de una fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación.

La glicosilación "ligada a O" se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina otreonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición o deleción de sitios de glicosilación ligados a N a una ABP proporcionada en la presente puede lograrse alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que se creen o eliminen una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente. La adición o deleción de sitios de glicosilación ligados a O puede lograrse mediante la adición, deleción o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina en o hacia (según sea el caso) la secuencia de una ABP.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende un motivo de glicosilación que es diferente de una ABP de origen natural. Cualquier motivo de glicosilación de origen natural adecuado puede modificarse en los anticuerpos proporcionados en la presente. Las propiedades estructurales y de glicosilación de las inmunoglobulinas, por ejemplo, son conocidas en la técnica y se resumen, por ejemplo, en Schroeder y Cavacini, J. Allergy Clin. Immunol., 2010, 125:S41-52.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc de IgG1 con modificación del oligosacárido unido a la asparagina 297 (Asn 297). Los anticuerpos IgG1 de origen natural producidos por células de mamífero comprenden típicamente un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente está unido por un enlace N a Asn 297 del dominio Ch<2>de la región Fc. Consultar Wright et al., TIbTe CH, 1997, 15:26-32. El oligosacárido unido a Asn 297 puede incluir varios carbohidratos como manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario.

En algunas realizaciones, el oligosacárido unido a Asn 297 se modifica para crear anticuerpos que tengan ADCC alterada. En algunas realizaciones, el oligosacárido se altera para mejorar la ADCC. En algunas realizaciones, el oligosacárido se altera para reducir la ADCC.

En algunos aspectos, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende un dominio de IgG1 con contenido reducido de fucosa en la posición Asn 297 en comparación con un dominio de IgG1 de origen natural. Se sabe que tales dominios Fc tienen ADCC mejorada. Consultar Shields et al., J. Biol. Chem., 2002, 277:26733-26740. En algunos aspectos, tales anticuerpos no comprenden ninguna fucosa en la posición Asn 297. La cantidad de fucosa puede determinarse usando cualquier método adecuado, por ejemplo como se describe en la WO 2008/077546.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende un oligosacárido bisecado, como un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo que está bisecado por GlcNAc. Tales variantes de ABP pueden tener fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Ejemplos de tales variantes de ABP se describen, por ejemplo, en la WO 2003/011878; Patente de Estados Unidos N°. 6,602,684; y Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2005/0123546.

Otras variantes de glicosilación ilustrativas que pueden incorporarse a los anticuerpos proporcionados en la presente se describen, por ejemplo, en Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 2003/0157108, 2004/0093621, 2003/0157108, 2003/0115614, 2002/0164328, 2004/0093621, 2004/0132140, 2004/0110704, 2004/0110282, 2004/0109865; Publicaciones de Patente Internacional N° 2000/61739, 2001/29246, 2003/085119, 2003/084570, 2005/035586, 2005/035778; 2005/053742, 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol., 2004, 336: 1239-1249; y Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 2004, 87: 614-622.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Tales variantes de ABP pueden tener una función CDC mejorada. Ejemplos de tales variantes ABP se describen, por ejemplo, en la WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.

Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir ABP defucosiladas se incluyen las células CHO Lec13, que son deficientes en la fucosilación de proteínas (consultar Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys., 1986, 249:533-545; Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2003/0157108; WO 2004/056312), y líneas celulares inactivadas, como las células CHO inactivadas del gen alfa-1,6-fucosiltransferasa o FUT8 (consultar Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng., 2004, 87: 614-622; Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 2006, 94:680-688; y WO 2003/085107).

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es un anticuerpo aglicosilado. Una ABP aglicosilada puede producirse usando cualquier método conocido en la técnica o descrito en la presente. Una ABP aglicosilada puede producirse modificando la ABP para eliminar todos los sitios de glicosilación. Los sitios de glicosilación pueden eliminarse sólo de la región Fc de la ABP. Una ABP aglicosilada puede producirse expresando la ABP en un organismo que no sea capaz de glicosilación, como E.coli,o expresando la ABP en una mezcla de reacción libre de células.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente tiene una región constante con función efectora reducida en comparación con un anticuerpo de IgG1 nativo. En algunas realizaciones, la afinidad de una región constante de una región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente por el receptor Fc es menor que la afinidad de una región constante de IgG1 nativa por dicho receptor de Fc.

2.4 Dominios de NRP-1

La NRP-1 tiene una forma transmembrana y una forma truncada. La forma transmembrana es la siguiente. Tras un corto tramo de señal de secreción, la NRP-1 consiste en cuatro dominios diferentes: dos repeticiones del dominio CUB (a1/a2), dos repeticiones del dominio FV/VIII (b1/b2), un dominio MAM (c) y un cuarto dominio (d) que contiene la transmembrana y una región citoplasmática relativamente corta de 40 a 43 aminoácidos. Los primeros dominios de CUB presentan una homología significativa con el factor del complemento C1s/C1r, la proteína morfogenética ósea 1(BMP1) y las proteínas tolloides. El segundo dominio FV/VIII comparte la homología con el factor de coagulación FV/VIII, uno del receptor tipo tirosina quinasa DDR, y discoidina-1. El tercer dominio MAM es la abreviatura de meprin, A5 ( nombre anterior de NRP), y proteína receptora tirosina fosfatasa mu y kappa. Una ABP descrita en la presente puede unirse al dominio a1. Una ABP descrita en la presente puede unirse al dominio a2. Una ABP descrita en la presente puede unirse al dominio b1. Una ABP descrita en la presente puede unirse al dominio b2. Una ABP descrita en la presente puede unirse a más de un dominio.

1.1. Variantes de la secuencia de aminoácidos de la región Fc

En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc con una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con una región Fc de origen natural. En algunos aspectos, tales sustituciones, inserciones o deleciones producen anticuerpos con estabilidad, glicosilación u otras características alteradas. En algunos aspectos, tales sustituciones, inserciones o deleciones producen anticuerpos aglicosilados.

En algunos aspectos, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente se modifica para producir un anticuerpo con afinidad alterada por un receptor Fc, o un anticuerpo que es más inmunológicamente inerte. En algunas realizaciones, las variantes de anticuerpos proporcionadas en la presente poseen algunas funciones efectoras, pero no todas. Tales anticuerpos pueden ser útiles, por ejemplo, cuando la semivida del anticuerpo es importantein vivo,pero cuando ciertas funciones efectoras (por ejemplo, activación del complemento y ADCC) son innecesarias o nocivas.

En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente es una región Fc de IgG4 humana que comprende una o más de las mutaciones estabilizadoras de bisagra S228P y L235E. Consultar Aalberse et al., Immunology, 2002, 105:9-19. En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente es una región Fc de IgG4 humana que comprende las mutaciones estabilizadoras de bisagra S228P. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 comprende una o más de las siguientes mutaciones: E233P, F234V, y L235A. Consultar Armour et al. Immunol, 2003, 40:585-593. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 comprende una deleción en la posición G236.

En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente es una región Fc de IgG1 humana que comprende una o más mutaciones para reducir la unión al receptor Fc. En algunos aspectos, la una o más mutaciones están en residuos seleccionados de S228 (por ejemplo, S228A), L234 (por ejemplo, L234A), L235 (por ejemplo, L235A), D265 (por ejemplo, D265A), y N297 (por ejemplo, N297A). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende una mutación PVA236. PVA236 significa que la secuencia de aminoácidos ELLG, desde la posición de aminoácidos 233 a 236 de IgG1 o EFLG de IgG4, se sustituye por PVA. Consultar Patente de Estados Unidos N° 9.150.641.

En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente se modifica como se describe en Armour et al., Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; WO 1999/058572; y/o Solicitud de Patente del REino Unido N° 98099518.

En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente es una región Fc de IgG2 humana que comprende una o más de las mutaciones A330S y P331S.

En algunas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente tiene una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas de 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329. Consultar Patente de Estados Unidos N°. 6,737,056. Tales mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina. Consultar Patente de Estados Unidos N°. 7,332,581. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una alanina en la posición 265 del aminoácido. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una alanina en la posición 297 del aminoácido.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, tal como una sustitución en una o más de las posiciones 298, 333 y 334 de la región Fc. En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 239, 332 y 330, como se describe en Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006,103:4005-4010.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una o más alteraciones que mejoran o disminuyen la unión a C1q y/o c Dc . Consultar Patente de Estados Unidos N°6.194.551; WO 99/51642; e Idusogie et al., J. Immunol., 2000, 164:4178-4184.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una o más alteraciones para aumentar la semivida. Las ABP con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn) se describen, por ejemplo, en Hinton et al., J. Immunol., 2006, 176:346-356; y la Patente de Estados Unidos N°. 7,361,740. Tales variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, y 434 de una IgG.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente comprende una o más variantes de la región Fc como se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 7,371,8265,648,260, y 5,624,821; Duncan y Winter, Nature, 1988, 322:738-740; y WO 94/29351.

1.2. Piroglutamato

Como se sabe en la técnica, tanto el glutamato (E) como la glutamina (Q) en los extremos N-terminales de las proteínas recombinantes pueden ciclizarse espontáneamente para formar piroglutamato (pE)in vitroein vivo.Consultar Liu et al., J. Biol. Chem., 2011, 286:11211-11217.

En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden una secuencia polipeptídica que tiene un residuo pE en la posición N-terminal. En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden una secuencia polipeptídica en la que el residuo N-terminal se ha convertido de Q a pE. En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden una secuencia polipeptídica en la que el residuo N-terminal se ha convertido de E a pE.

En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden secuencias Vh que tienen un residuo pE en la posición N-terminal. En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan anticuerpos que comprenden una secuencia V<h>en la que el residuo N-terminal se ha convertido de Q a pE.

En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden secuencias V<h>que tienen un residuo pE en la posición N-terminal. En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden una secuencia V<h>en la que el residuo N-terminal se ha convertido de E a pE. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia Vh seleccionada de las s Eq ID NO:92-96, en la que el residuo N-terminal E se ha convertido en pE. En algunas realizaciones, se proporciona en la presente una composición que comprende un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende una secuencia Vh seleccionada de las SEQ ID NO:92-96, en la que por lo menos aproximadamente el 20%, por lo menos aproximadamente el 40%, por lo menos aproximadamente el 60%, por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos aproximadamente el 90%, por lo menos aproximadamente el 95%, o por lo menos aproximadamente el 99% de los residuos N-terminales de dicha secuencia V<h>en dicha composición se han convertido de E a pE.

En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden secuencias V<l>que tienen un residuo pE en la posición N-terminal. En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden una secuencia V<l>en la que el residuo N-terminal se ha convertido de E a pE.

En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden secuencias de cadena pesada que tienen un residuo pE en la posición N-terminal. En algunas realizaciones, se proporcionan anticuerpos que comprenden una secuencia de cadena pesada en la que el residuo N-terminal se ha convertido de Q a pE.

En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden secuencias de cadena pesada que tienen un residuo pE en la posición N-terminal. En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden una secuencia de cadena pesada en la que el residuo N-terminal se ha convertido de E a pE. En algunas realizaciones, se proporciona en la presente un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de las SEQ ID NO: 114-118, en donde el residuo N-terminal E se ha convertido en pE. En algunas realizaciones, se proporciona en la presente una composición que comprende un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada seleccionada de las SEQ ID NO: 114-118, en la que por lo menos aproximadamente el 20%, por lo menos aproximadamente el 40%, por lo menos aproximadamente el 60%, por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos aproximadamente el 90%, por lo menos aproximadamente el 95%, o por lo menos aproximadamente el 99% de los residuos N-terminales de dicha cadena pesada en dicha composición se han convertido de E a pE.

En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden secuencias de cadena ligera que tienen un residuo pE en la posición N-terminal. En algunas realizaciones, se proporcionan en la presente anticuerpos que comprenden una secuencia de cadena ligera en la que el residuo N-terminal se ha convertido de E a pE.

1.3. Variantes de la proteína de unión a antígeno manipuladas con cisteína

En ciertas realizaciones, en la presente se proporcionan anticuerpos manipulados con cisteína, también conocidos como "tioMAbs", en los que uno o más residuos del anticuerpo se sustituyen por residuos de cisteína. En ciertas realizaciones, los residuos sustituidos se producen en sitios del anticuerpo accesibles mediante solventes. Mediante la sustitución de tales residuos con cisteína, se introducen grupos tiol reactivos en los sitios accesibles al solvente del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo con otras fracciones, como fracciones de fármaco o fracciones de conector-fármaco, por ejemplo, para crear un inmunoconjugado.

En ciertas realizaciones, uno o más de los siguientes residuos pueden sustituirse por cisteína: V205 de la cadena ligera; A118 de la región Fc de la cadena pesada; y S400 de la región Fc de la cadena pesada. Las ABP manipuladas con cisteína pueden generarse como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 7,521,541.

2. Métodos de elaboración de proteínas de unión a antígeno de NRP-1

2.1. Preparación del antígeno de NRP-1

El antígeno de NRP-1 usado para el aislamiento de los anticuerpos proporcionados en la presente puede ser NRP-1 intacto o un fragmento de NRP-1. El antígeno de NRP-1 puede estar, por ejemplo, en forma de proteína aislada o de proteína expresada en la superficie de una célula.

En algunas realizaciones, el antígeno de NRP-1 es una variante de origen no natural de NRP-1, como una proteína NRP-1 que tiene una secuencia de aminoácidos o una modificación postraduccional que no se produce en la naturaleza.

En algunas realizaciones, el antígeno de NRP-1 se trunca eliminando, por ejemplo, secuencias intracelulares o de membrana, o secuencias señal. En algunas realizaciones, el antígeno de NRP-1 se fusiona en su extremo C terminal con un dominio Fc de IgG1 humano o una etiqueta de polihistidina.

2.2. Métodos de elaboración de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse, por ejemplo, usando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 1975, 256:495-497, y/o por métodos de ADN recombinante (consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse, por ejemplo, usando bibliotecas basadas en fagos o levaduras. Consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 8.258.082 y 8.691.730.

En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado para proporcionar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarsein vitro.A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Consultar Goding J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 3a ed. (1986) Academic Press, San Diego, CA.

Las células de hibridoma se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma útiles son las que se fusionan eficientemente, soportan la producción estable de alto nivel de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a las condiciones del medio, como la presencia o ausencia de medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, como las derivadas de tumores de ratón MOP-21 y MC-11 (disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA), y las células SP-2 o X63-Ag8-653 (disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, MD). También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de ratón-heteromieloma humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Consultar, por ejemplo, Kozbor, J. Immunol., 1984, 133:3001.

Después de la identificación de células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad biológica deseadas, los clones seleccionados pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse por métodos estándar. Consultar Goding,supra.Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarsein vivocomo tumores de ascitis en un animal.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Por tanto, las células de hibridoma pueden servir como fuente útil de ADN que codifica anticuerpos con las propiedades deseadas. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped como bacterias (por ejemplo,E. coli),levaduras (por ejemplo,Saccharomyces o Pichia sp.),células COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen anticuerpos, para producir los anticuerpos monoclonales.

En otro aspecto se proporciona un método para producir un anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar célula o células huésped seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación para que expresen un anticuerpo anti-NRP-1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo: (a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención o el fragmento de unión a antígeno del mismo y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención o el fragmento de unión a antígeno del mismo y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo; y (c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención o el fragmento de unión a antígeno del mismo y una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otro aspecto se proporciona un método para producir un anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención, que comprende cultivar célula o células huésped seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación para que expresen un anticuerpo anti-NRP-1 humano: (a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo; (b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo; y (c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención y una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo.

2.3. Métodos de elaboración de anticuerpos quiméricos

Métodos ilustrativos de elaboración de anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81:6851-6855. En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico se elabora usando técnicas recombinantes para combinar una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, como un mono) con una región constante humana.

2.4. Métodos de elaboración de anticuerpos humanizados

Los anticuerpos humanizados pueden generarse sustituyendo la mayoría o la totalidad de las partes estructurales de un anticuerpo monoclonal no humano por las secuencias correspondientes de anticuerpos humanos. En consecuencia, se genera una molécula híbrida en la que sólo la variable específica del antígeno, o CDR, está compuesta por una secuencia no humana. Los métodos para obtener anticuerpos humanizados incluyen los descritos, por ejemplo, en Wintery Milstein, Nature, 1991, 349:293-299; Raderetal., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:8910-8915; Steinberger et al., J. Biol. Chem, 2000, 275:36073-36078; Queen etal. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86: 10029 10033; y las Patentes de Estados Unidos N° 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, y 6,180,370.

2.5. Métodos de elaboración de anticuerpos humanos

Los anticuerpos humanos pueden generarse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo mediante animales transgénicos no humanos (por ejemplo, ratones humanizados). Consultar, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90:2551; Jakobovits et al., Nature, 1993, 362:255-258; Bruggermann et al., Year in Immuno., 1993, 7:33; y Patentes de Estados Unidos N° 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas de fagos (consultar, por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 1991, 227:381-388; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597; y Patentes de Estados Unidos N° 5,565,332 y 5,573,905). Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadas in vitro (consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.567.610 y 5.229.275). Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas basadas en levaduras (consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8.691.730).

2.6. Métodos de elaboración de fragmentos de anticuerpos

Los fragmentos de anticuerpos proporcionados en la presente pueden elaborarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo los métodos descritos en la presente o los conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen técnicas recombinantes y digestión proteolítica de anticuerpos completos. Los métodos ilustrativos de elaboración de fragmentos de anticuerpos se describen, por ejemplo, en Hudson et al., Nat. Med., 2003, 9:129-134. Los métodos de elaboración de anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; y las Patentes de Estados Unidos N° 5.571.894 y 5.587.458.

2.7. Métodos de elaboración de andamiajes alternativos

Los andamiajes alternativos pueden elaborarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo los métodos ilustrativos descritos en la presente o los conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos de preparación de Adnectins™ se describen en Emanuel et al., mAbs, 2011, 3:38-48. Los métodos de preparación de iMabs se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2003/0215914. Los métodos de preparación de anticalinas® se describen en Vogt y Skerra, Chem. Biochem, 2004, 5: 191-199. Los métodos de preparación de dominios de Kunitz se describen en Wagner etal, Biochem. &Biophys. Res. Comm., 1992,186:118-1145. Los métodos de preparación de aptámeros peptídicos de tiorredoxina se describen en Geyer y Brent, Meth. Enzymol, 2000, 328: 171-208. Los métodos de preparación de aficuerpos se proporcionan en Fernandez, Curr. Opinion in Biotech, 2004, 15:364-373. Los métodos de preparación de DARPins se proporcionan en Zahnd et al, J. Mol. Biol., 2007, 369:1015-1028. Los métodos de preparación de Affilins se proporcionan en Ebersbach et al., J. Mol. Biol., 2007, 372:172-185. Los métodos de preparación de tetranectinas se proporcionan en Graversen et al, J. Biol. Chem., 2000, 275:37390-37396. Los métodos de preparación de Avímeros se proporcionan en Silverman et al., Nature Biotech, 2005, 23: 1556 1561. Los métodos de preparación de Fynomers se proporcionan en Silacci et al., J. Biol. Chem., 2014, 289: 14392 14398.

Información adicional sobre andamiajes alternativos se proporciona en Binz et al., Nat. Biotechnol., 2005 23:1257-1268; y Skerra, CurrentOpin. in Biotech., 2007 18:295-304.

2.8. Métodos de elaboración de variantes

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es una variante madurada por afinidad de un anticuerpo original, que puede generarse, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en la presentación en fagos. Brevemente, uno o más residuos de CDR pueden mutarse y los anticuerpos variantes, o porciones de los mismos, mostrarse en fagos y seleccionarse para afinidad. Tales alteraciones pueden elaborarse en "puntos calientes" de CDR, o residuos codificados por codones que experimentan mutaciones a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (consultar Chowdhury, Methods Mol. Biol., 2008, 207:179-196), y/o residuos que entran en contacto con el antígeno.

Puede usarse cualquier método adecuado para introducir variabilidad en una secuencia o secuencias polinucleotídicas que codifican una ABP, incluyendo la PCR propensa a errores, la transposición de cadenas y la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, como la mutagénesis dirigida por trinucleótidos (TRIM). En algunos aspectos, se aleatorizan varios residuos CDR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos CDR implicados en la unión al antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis o modelado de barrido de alanina. Las CDR-H3 y CDR-L3, en particular, son a menudo el objetivo de la mutación.

La introducción de diversidad en las regiones variables y/o CDR puede usarse para producir una biblioteca secundaria. A continuación, la biblioteca secundaria se selecciona para identificar variantes de ABP con afinidad mejorada. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección a partir de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology, 2001, 178:1-37.

2.9. Vectores, células huésped y métodos recombinantes

También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos de NRP-1, vectores que comprenden los ácidos nucleicos y células huésped que comprenden los vectores y los ácidos nucleicos, así como técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos.

Para la producción recombinante de una ABP, el ácido o ácidos nucleicos que lo codifican pueden aislarse e insertarse en un vector replicable para su clonación (es decir, amplificación del ADN) o expresión adicionales. El ácido nucleico puede producirse mediante recombinación homóloga, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.204.244.

En otro aspecto se proporciona un vector de expresión que comprende (a) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención o el fragmento de unión a antígeno del mismo y (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención o el fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otro aspecto se proporciona un vector de expresión que comprende (a) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención y (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-NRP-1 humano de la invención.

En la técnica se conocen muchos vectores diferentes. Los componentes de los vectores generalmente incluyen uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción, por ejemplo como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5,534,615.

A continuación se proporcionan ejemplos ilustrativos de células huésped adecuadas. No se pretende que estas células huésped sean limitativas, y puede usarse cualquier célula huésped adecuada para producir los anticuerpos proporcionados en la presente.

Las células huésped adecuadas incluyen cualquier célula procariota (por ejemplo, bacteriana), eucariota inferior (por ejemplo, levadura) o eucariota superior (por ejemplo, mamífero). Las procariotas adecuadas incluyen eubacterias, como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae comoEscherichia (E. coli), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (S. typhimurium), Serratia (S. marcescans), Shigella, Bacilli (B. subtilisyB. licheniformis), Pseudomonas (P. aeruginosa)yStreptomyces.Un huésped útil para la clonación deE. coliesE. coli294, aunque también son adecuadas otras cepas comoE. coliB,E. coliX1776 yE. coliW3110.

Además de las procariotas, también son huéspedes adecuados los microbios eucariotas, como los hongos filamentosos o las levaduras, para la clonación o expresión de los vectores que codifican NRP-1 ABP.Saccharomyces cerevisiae,o levadura de panadería común, es un microorganismo huésped eucariota inferior usado comúnmente. Sin embargo, existen otros géneros, especies y cepas útiles, comoSchizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thermotoleransyK. marxianus), Yarrowia, Pichia pastoris, Candida (C. albicans), Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces (S. occidentalis)y hongos filamentosos como, por ejemplo,Penicillium, TolypocladiumyAspergillus (A. nidulansyA. niger).

Las células huésped usadas para producir las ABP de NRP-1 descritas en la presente pueden cultivarse en varios medios. Los medios disponibles comercialmente como, por ejemplo, F10 de Ham, Medio Esencial Mínimo (MEM), RPMI-1640 y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, pueden usarse cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz., 1979, 58:44; Barnes et al., Anal. Biochem., 1980, 102:255; y las Patentes de Estados Unidos N° 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, y 5,122,469; o WO 90/03430 y WO 87/00195.

Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos, oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes habitualmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario en las concentraciones adecuadas que conozcan los expertos en la técnica.

Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Cuando se usan técnicas recombinantes, la ABP puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si la ABP se produce intracelularmente, como primer paso se eliminan los restos particulados, ya sean células huésped o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Por ejemplo, Carter et al. (Bio/Technology, 1992, 10: 163-167) describen un procedimiento para aislar las ABP que se secretan al espacio periplásmico de E.coli.Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares pueden eliminarse por centrifugación.

La ABP puede producirse en un sistema libre de células. El sistema libre de células puede ser un sistema de transcripción y traducciónin vitrocomo el descrito en Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225. El sistema libre de células puede utilizar un extracto libre de células de una célula eucariota o de una célula procariota. En algunos aspectos, la célula procariota es E.coli.La expresión sin células de la ABP puede ser útil, por ejemplo, cuando la ABP se acumula en una célula como un agregado insoluble, o cuando los rendimientos de la expresión periplásmica son bajos.

Cuando la ABP se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se concentran generalmente primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon® o Millipore® Pellcon®. En cualquiera de los pasos anteriores puede incluirse un inhibidor de la proteasas, como el PMSf , para inhibir la proteólisis, y antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de ABP preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una técnica de purificación particularmente útil. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en la ABP. Puede usarse proteína A para purificarlas ABP que comprenden cadenas pesadas<y>1,<y>2 o<y>4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 1983, 62: 1-13). La proteína G es útil para todos los isotipos de ratón y para la y3 humana (Guss et al., EMBOJ., 1986, 5: 1567-1575).

La matriz a la que se une el ligando de afinidad a menudo es agarosa, pero hay disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como el vidrio de poro controlado o el poli(estirenodivinil)benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden conseguir con la agarosa. Cuando la ABP comprende un dominio Ch<3>, la resina BakerBond ABX® es útil para la purificación.

También hay disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas, como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparina Sepharose®, el cromatoenfoque, el SDS-PAGE y la precipitación con sulfato de amonio, que pueden ser aplicadas por un experto en la técnica.

Tras cualquier paso o pasos preliminares de purificación, la mezcla que comprende la ABP de interés y los contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 4,5, generalmente realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,25 M de sal).

3. Ensayos

Para identificar y caracterizar los anticuerpos de NRP-1 proporcionados en la presente pueden usarse una variedad de ensayos conocidos en la técnica.

3.1. Ensayos de unión, competición y mapeo de epítopos

La actividad específica de unión a antígeno de los anticuerpos proporcionados en la presente puede evaluarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo el uso de SPR, BLI, RIA, KinExA, citometría de flujo y MSD-SET. Además, la actividad de unión a antígeno puede evaluarse mediante ensayos ELISA y transferencia western.

Los ensayos para medir la competencia entre dos anticuerpos, o un anticuerpo y otra molécula (por ejemplo, uno o más ligandos de NRP-1) se describen en otras partes de esta divulgación y, por ejemplo, en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual capítulo 14, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Los ensayos para mapear los epítopos a los que se unen los anticuerpos proporcionados en la presente se describen, por ejemplo, en Morris "Epitope Mapping Protocols," en Methods in Molecular Biology vol. 66, 1996, Humana Press, Totowa, N.J.. En algunas realizaciones, el epítopo se determina por competición peptídica. En algunas realizaciones, el epítopo se determina mediante espectrometría de masas. En algunas realizaciones, el epítopo se determina por cristalografía.

3.2. Ensayos de antagonismo de NRP-1

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se seleccionan para identificar o caracterizar anticuerpos con actividad antagonista contra NRP-1. Para identificar o caracterizar tales anticuerpos puede usarse cualquier ensayo adecuado. En algunos aspectos, el ensayo mide la cantidad de una citoquina secretada por una célula T efectora después de poner en contacto la célula T efectora con un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunos aspectos, la citoquina se selecciona entre IL-2, IL-6, LT-a, TNF, GM-CSF, IFNy, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, la citoquina se selecciona entre sCD40L, VEGF, TGF-a, RANTES, PDGF-AB/BB, PDGF-AA, MIP-ip, MIP-1a, MDC (CCL22), MCP-3, MCP-1, IP-10, IL-17A, IL-2Ra, IL-15, IL-13, IL-12 (p70), IL-12 (p40), IL-10, IL-9, IL-8, IL-7, IL-5, IL-4, IL-3, IL-2, IL-2Ra, IL-1RA, IL-1p, IL-1a, IFNy, IFNa2, GRO, GM-CSF, G-CSF, fractalkina, ligando Flt-3, FGF-2, eotaxina, EGF, y combinaciones de las mismas.

En algunas realizaciones, las células efectoras se coestimulan con un agonista de CD3, para promover la secreción de citoquinas por la célula efectora. En algunos aspectos, el agonista de CD3 se proporciona a un nivel submáximo.

En algunos aspectos, tales ensayos pueden medir la proliferación de una célula T efectora después de poner en contacto la célula T efectora con un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunos aspectos, la proliferación de la célula T efectora se mide por dilución de un colorante (por ejemplo, éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína; CFSE), por captación de timidina tritiada, por ensayos de viabilidad celular luminiscente, o por otros ensayos conocidos en la técnica.

En algunos aspectos, tales ensayos pueden medir la diferenciación, la producción de citoquinas, la viabilidad (por ejemplo, la supervivencia), la proliferación o la actividad supresora de una célula T reguladora después de entrar en contacto con la célula T reguladora con un anticuerpo proporcionado en la presente.

En algunos aspectos, tales ensayos pueden medir la actividad citotóxica de una célula NK después de poner en contacto la célula n K con un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunos aspectos, la actividad citotóxica de la célula NK se mide usando un ensayo de citotoxicidad que cuantifica la muerte mediada por NK de células objetivo (por ejemplo, una línea celular K562). Consultar Jang et al., Ann. Clin. Lab. Sci., 2012, 42:42-49.

En algunos aspectos, tales ensayos pueden medir la cantidad de granzima B. En algunos aspectos, tales ensayos pueden medir la cantidad de perforina.

3.3. Ensayos de funciones efectoras

La función efectora después del tratamiento con los anticuerpos proporcionados en la presente puede evaluarse usando una variedad de ensayosin vitroein vivoconocidos en la técnica, incluyendo los descritos en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 1991, 9:457-492; Patentes de Estados Unidos N° 5,500,362, 5,821,337; Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1986, 83:7059-7063; Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1985, 82:1499-1502; Bruggemann et al., J. Exp. Med., 1987, 166:1351-1361; Clynes etal., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA, 1998, 95:652-656; WO 2006/029879; WO 2005/100402; Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 1996, 202:163-171; Cragg et al., Blood, 2003, 101:1045-1052; Cragg et al. Blood, 2004, 103:2738-2743; y Petkova et al., Int'l. Immunol., 2006, 18:1759-1769.

4. Composiciones farmacéuticas

Los anticuerpos proporcionados en la presente pueden formularse en cualquier composición farmacéutica apropiada y administrarse por cualquier vía de administración adecuada. Las vías de administración adecuadas incluyen, entre otras, las vías intraarterial, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, nasal, parenteral, pulmonar y subcutánea.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-NRP-1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en la presente y excipientes farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende varios tipos de anticuerpos anti-NRP-1 humanos de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por ejemplo, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que no experimenta modificación postraduccional y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo derivado de la modificación postraduccional del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo.

En una realización, la composición farmacéutica comprende por lo menos dos tipos de anticuerpos anti-NRP-1 humanos seleccionados de (1) a (4): (1) un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ<i>D NO:126, (2) un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:118 en la que la E del aminoácido número 1 está modificada a piroglutamato, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126, (3) un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números 1 a 453 de la SEQ ID NO:118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126; y (4) un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números 1 a 453 de la SEQ ID NO:118 en la que la E del número de aminoácidos 1 se modifica a piroglutamato, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126.

En una realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126, un anticuerpo anti-NRP-1 humano que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 1 a 453 de la SEQ ID NO:118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede comprender uno o más excipientes farmacéuticos. Puede usarse cualquier excipiente farmacéutico adecuado, y un experto en la técnica es capaz de seleccionar excipientes farmacéuticos adecuados. Por consiguiente, los excipientes farmacéuticos proporcionados a continuación son ilustrativos y no limitativos. Excipientes farmacéuticos adicionales incluyen, por ejemplo, los descritos en el Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. (Eds.) 6th Ed. (2009).

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un agente antiespumante. Puede usarse cualquier agente antiespumante adecuado. En algunos aspectos, el agente antiespumante se selecciona entre un alcohol, un éter, un aceite, una cera, una silicona, un surfactante y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el agente antiespumante se selecciona entre un aceite mineral, un aceite vegetal, bisestearamida de etileno, una cera de parafina, una cera de éster, una cera de alcohol graso, un alcohol graso de cadena larga, un jabón de ácido graso, un éster de ácido graso, un glicol de silicona, una fluorosilicona, un copolímero de polietilenglicol y polipropilenglicol, polidimetilsiloxano - dióxido de silicio, éter, alcohol octílico, alcohol caprílico, trioleato de sorbitán, alcohol etílico, 2-etilhexanol, dimeticona, alcohol oleílico, simeticona y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un cosolvente. Ejemplos ilustrativos de cosolventes incluyen etanol, poli(etilenglicol)glicol, butilenglicol, dimetilacetamida, glicerina, propilenglicol y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un tampón. Ejemplos ilustrativos de tampones incluyen acetato, borato, carbonato, lactato, malato, fosfato, citrato, hidróxido, dietanolamina, monoetanolamina, glicina, metionina, goma guar, glutamato monosódico y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un portador o carga. Ejemplos ilustrativos de portadores o cargas incluyen lactosa, maltodextrina, manitol, sorbitol, quitosano, ácido esteárico, goma xantana, goma guar y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un surfactante. Ejemplos ilustrativos de surfactantes incluyen d-alfa tocoferol, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, docusato sódico, behenato de glicerilo, monooleato de glicerilo, ácido láurico, hidroxiestearato de macrogol 15, alcohol miristílico, fosfolípidos, éteres alquílicos polioxietilénicos, ésteres de ácidos grasos polioxietilénicos de sorbitán, estearatos polioxietilénicos, polioxilglicéridos, lauril sulfato sódico, ésteres de sorbitán, succinato de polietilen(glicol) de vitamina E y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un agente antiaglomerante. Ejemplos ilustrativos de agentes antiaglomerantes incluyen fosfato de calcio (tribásico), hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, óxido de magnesio y combinaciones de los mismos.

Otros excipientes que pueden usarse con las composiciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo, albúmina, antioxidantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, polímeros bioabsorbibles, agentes quelantes, agentes de liberación controlada, diluyentes, agentes dispersantes, potenciadores de la disolución, agentes emulsionantes, agentes gelificantes, bases de pomadas, potenciadores de la penetración, conservantes, agentes solubilizantes, solventes, agentes estabilizantes, azúcares y combinaciones de los mismos. Ejemplos específicos de cada uno de estos agentes se describen, por ejemplo, en el Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. (Eds.) 6a Ed. (2009), The Pharmaceutical Press.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un solvente. En algunos aspectos, el solvente es solución salina, como una solución salina isotónica estéril o una solución de dextrosa. En algunos aspectos, el solvente es agua para inyección.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas están en forma de particulados, como una micropartícula o nanopartícula. Las micropartículas y nanopartículas pueden estar formadas por cualquier material adecuado, como un polímero o un lípido. En algunos aspectos, las micropartículas o nanopartículas son micelas, liposomas o polimersomas.

Además, en la presente se proporcionan composiciones farmacéuticas y formas de dosificación anhidras que comprenden un anticuerpo, ya que el agua puede facilitar la degradación de algunas ABP.

Las composiciones farmacéuticas anhidras y las formas de dosificación proporcionadas en la presente pueden prepararse usando ingredientes anhidros o con bajo contenido de humedad y en condiciones de baja humedad. Las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que comprenden lactosa y por lo menos un ingrediente activo que comprende una amina primaria o secundaria pueden ser anhidras si se espera un contacto sustancial con la humedad durante la fabricación, envasado y/o almacenamiento.

Una composición farmacéutica anhidra debe prepararse y almacenarse de tal manera que se mantenga su naturaleza anhidra. Por consiguiente, las composiciones anhidras pueden envasarse usando materiales conocidos para evitar la exposición al agua, de tal manera que puedan incluirse en kits de formulación adecuados. Los ejemplos de envases adecuados incluyen, entre otros, láminas herméticamente selladas, plásticos, recipientes de dosis unitarias (por ejemplo, viales), blísteres y envases en tiras.

4.1. Formas de dosificación parenterales

En ciertas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se formulan como formas de dosificación parenteral. Las formas de dosificación parenteral pueden administrarse a los sujetos por varias vías que incluyen, pero no se limitan a, subcutánea, intravenosa (incluyendo infusiones e inyecciones en bolo), intramuscular e intraarterial. Como su administración típicamente evita las defensas naturales de los sujetos contra los contaminantes, las formas de dosificación parenteral típicamente son estériles o esterilizables antes de su administración a un sujeto. Ejemplos de formas de dosificación parenteral incluyen, pero no se limitan a, soluciones listas para inyección, productos secos (por ejemplo, liofilizados) listos para ser disueltos o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable para inyección, suspensiones listas para inyección y emulsiones.

Los vehículos adecuados que pueden usarse para proporcionar formas de dosificación parenteral son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: agua para inyección USP; vehículos acuosos como, pero no limitados a, inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro sódico, e inyección de Ringer lactada; vehículos miscibles en agua como, pero no limitados a, alcohol etílico, polietilenglicol y polipropilenglicol; y vehículos no acuosos como, pero no limitados a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.

También pueden incorporarse a las formas farmacéuticas parenterales excipientes que aumenten la solubilidad de una o más de las ABP divulgadas en la presente.

En algunas realizaciones, la forma de dosificación parenteral está liofilizada. Formulaciones liofilizadas ejemplares se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6,267,958 y 6,171,586; y la WO 2006/044908.

5. Dosificación y formas de dosificación unitarias

En agentes terapéuticos humanos, el médico determinará la posología que considere más adecuada de acuerdo con un tratamiento preventivo o curativo y de acuerdo con la edad, peso, estado y otros factores propios del sujeto a tratar.

En ciertas realizaciones, una composición proporcionada en la presente es una composición farmacéutica o una forma de dosificación unitaria. Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación unitaria proporcionadas en la presente comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos profilácticos o terapéuticos.

La cantidad de anticuerpo o composición que será eficaz en la prevención o el tratamiento de un trastorno o de uno o más de sus síntomas variará en función de la naturaleza y gravedad de la enfermedad o afección, y de la vía por la que se administre la ABP. La frecuencia y la dosificación también variarán de acuerdo con factores específicos de cada sujeto dependiendo de la terapia específica (por ejemplo, agentes terapéuticos o profilácticos) administrada, la gravedad del trastorno, enfermedad o afección, la vía de administración, así como la edad, el cuerpo, el peso, la respuesta y el historial médico del sujeto. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de ensayoin vitroo de modelos animales.

En ciertas realizaciones, las dosis ejemplares de una composición incluyen cantidades de miligramos o microgramos del anticuerpo por kilogramo de peso del sujeto o de la muestra (por ejemplo, aproximadamente 10 microgramos por kilogramo a aproximadamente 50 miligramos por kilogramo, aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 25 miligramos por kilogramo, o aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 10 miligramos por kilogramo). En ciertas realizaciones, la dosificación del anticuerpo proporcionado en la presente, basada en el peso del anticuerpo, administrada para prevenir, tratar, controlar o mejorar un trastorno, o uno o más síntomas del mismo en un sujeto es de 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, o más del peso corporal de un sujeto. En algunos casos, puede ser necesario usar dosis del anticuerpo fuera de los intervalos descritos en la presente, como será evidente para los expertos en la técnica. Además, cabe señalar que el practicante clínico o el médico tratante sabrá cómo y cuándo interrumpir, ajustar o finalizar el tratamiento en función de la respuesta del sujeto.

Pueden ser aplicables diferentes cantidades terapéuticamente eficaces para diferentes enfermedades y afecciones, como sabrán fácilmente los expertos en la técnica. De manera similar, las cantidades suficientes para prevenir, controlar, tratar o mejorar dichos trastornos, pero insuficientes para provocar, o suficientes para reducir, los efectos adversos asociados con los anticuerpos proporcionados en la presente también se incluyen en las cantidades de dosificación y los programas de frecuencia de dosis proporcionados en la presente. Además, cuando a un sujeto se le administran múltiples dosis de una composición proporcionada en la presente, no es necesario que todas las dosis sean iguales. Por ejemplo, la dosis administrada al sujeto puede aumentarse para mejorar el efecto profiláctico o terapéutico de la composición o puede disminuirse para reducir uno o más efectos secundarios que esté experimentando un sujeto en particular.

En ciertas realizaciones, el tratamiento o la prevención pueden iniciarse con una o más dosis de carga de un anticuerpo o composición proporcionados en la presente, seguidas de una o más dosis de mantenimiento.

En ciertas realizaciones, puede administrarse una dosis de un anticuerpo o composición proporcionados en la presente para alcanzar una concentración en estado estacionario del anticuerpo en la sangre o el suero del sujeto. La concentración en estado estacionario puede determinarse por medición de acuerdo con las técnicas disponibles para los expertos o puede basarse en las características físicas del sujeto, como la altura, el peso y la edad.

En ciertas realizaciones, repetirse la administración de la misma composición puede y las administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o 6 meses. En otras realizaciones, puede repetirse la administración de la misma composición y la composición puede administrarse una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. En ciertas realizaciones, la primera dosis administrada al paciente puede ser una "dosis de carga". Una dosis de carga puede ser una dosis más alta que las dosis posteriores.

Como se analiza con más detalle en otra parte de esta divulgación, un anticuerpo proporcionado en la presente puede administrarse opcionalmente con uno o más agentes adicionales útiles para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno. La cantidad eficaz de tales agentes adicionales puede depender de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores conocidos en la técnica o descritos en la presente.

6. Aplicaciones terapéuticas

Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos de la invención se administran a un mamífero, generalmente un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable como las conocidas en la técnica y las analizadas anteriormente. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden administrarse a un humano por vía intravenosa en forma de bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal o intratumoral. Los anticuerpos también se administran adecuadamente por vía peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos tanto locales como sistémicos. La vía intraperitoneal puede ser particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovarios.

Los anticuerpos proporcionados en la presente pueden ser útiles para el tratamiento de cualquier enfermedad o afección en la que esté implicado la NRP-1. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección que puede beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-NRP-1. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un tumor. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un cáncer.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se proporcionan para su uso como medicamento. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en la presente se proporcionan para su uso en la fabricación o preparación de un medicamento. En algunas realizaciones, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad o afección que puede beneficiarse de un anticuerpo anti-NRP-1. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un tumor. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un cáncer. En algunos casos, la enfermedad o afección es una infección vírica.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo al sujeto. En algunos aspectos, la enfermedad o afección es un cáncer. En algunos aspectos, la enfermedad o afección es una infección vírica.

Con los anticuerpos proporcionados en la presente puede tratarse cualquier cáncer adecuado. Los cánceres adecuados ilustrativos incluyen, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de células basales, tumor cerebral, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cáncer de mama, tumor bronquial, carcinoma de origen primario desconocido, tumor cardíaco, cáncer de cuello uterino, cordoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, carcinoma ductal, tumor embrionario, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, histiocitoma fibroso, sarcoma de Ewing, cáncer ocular, tumor de células germinales, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, histiocitosis, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, tumor de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de hígado, carcinoma lobulillar in situ, cáncer de pulmón, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer escamoso metastásico de cuello con primario oculto, carcinoma del tracto medio con afectación del genNUT,cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, neoplasia mielodisplásica/mieloproliferativa, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, papilomatosis, paraganglioma, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitomas, tumor hipofisario, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, tumor rabdoide, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, tumor de médula espinal, cáncer de estómago, linfoma de células T, tumor teratoide, cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de vagina, cáncer de vulva y tumor de Wilms.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método de antagonismo de NRP-1 en una célula objetivo de un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto. En algunos aspectos, el antagonismo de NRP-1 por un anticuerpo proporcionado en la presente produce un aumento de la secreción de IL-2, LT-a, IL-6, TNF, GM-CSF, IFNy o combinaciones de los mismos por una célula objetivo.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para aumentar la proliferación, supervivencia y/o función de una célula T efectora en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto. En algunos aspectos, la célula T efectora es una célula T efectora CD4+. En algunos aspectos, la célula T efectora es una célula T efectora CD8+.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método de anular la supresión de una célula T efectora por una célula T reguladora en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto. En algunos aspectos, la célula T reguladora es una célula T reguladora CD4+CD25+Foxp3+. En algunos aspectos, la célula T reguladora es una célula T reguladora CD8+CD25+.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para aumentar la actividad de una célula asesina natural (NK), una célula T asesina natural (NKT), un macrófago o una célula dendrítica (por ejemplo, una célula dendrítica plasmacitoide) en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer sin reducción concomitante de plaquetas. En algunos aspectos, el método no da como resultado una cantidad sustancial de trombocitopenia en el sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para mejorar una respuesta inmune en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para retrasar la aparición de un tumor en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para prevenir la aparición de un tumor en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para retrasar la aparición de un cáncer en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para prevenir la aparición de un cáncer en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para reducir el número de metástasis en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para reducir el título viral de un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para ampliar el periodo de supervivencia global, el tiempo medio de supervivencia o la supervivencia libre de progresión en un sujeto con necesidad de ello mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto.

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es para su uso en un método para tratar a un sujeto que se ha vuelto resistente a un estándar de atención terapéutica mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo proporcionado en la presente al sujeto. En algunas realizaciones, e estándar de atención terapéutica al que el sujeto se ha vuelto resistente es un inhibidor de PD-1. En otras realizaciones, el estándar de atención terapéutica al que se ha vuelto resistente el sujeto es un inhibidor de PD-L1. En otras realizaciones, el estándar de atención terapéutica al que se ha vuelto resistente el sujeto es un inhibidor de CTLA-4.

7. Terapias de combinación

En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente se administra con por lo menos un agente terapéutico adicional. Con un anticuerpo proporcionado en la presente puede administrarse cualquier agente terapéutico adicional adecuado. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional se selecciona entre radiación, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente citostático, un agente antihormonal, un inhibidor de EGFR, un agente inmunoestimulador, un agente antiangiogénico y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional comprende un agente inmunoestimulador.

En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es un agente que bloquea la señalización de un receptor inhibidor de una célula inmunitaria, o un ligando del mismo. En algunos aspectos, el receptor o ligando inhibidor se selecciona entre PVRIG, VISTA, CCR4, CD27, CTLA-4, PD-1, PD-L1, lAg -3, Tim3, TIGIT, neuritina, BTLA, KIR, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el agente se selecciona entre un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, pembrolizumab o nivolumab), y un anticuerpo anti-PD-L1 (por ejemplo, atezolizumab), un anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, ipilimumab), y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el agente es pembrolizumab. En algunos aspectos, el agente es nivolumab. En algunos aspectos, el agente es atezolizumab.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 se selecciona entre un anticuerpo, un peptidomimético y una molécula pequeña. En algunos aspectos, el agente terapéutico adicional que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 se selecciona entre pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, BMS-936559, sulfamonometoxina 1 y sulfametoxina 2. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 es cualquier agente terapéutico conocido en la técnica por tener dicha actividad, por ejemplo como se describe en Weinmann et al., Chem Med Chem, 2016, 14:1576 (DOI: 10.1002/cmdc.201500566). En algunas realizaciones, el agente que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 se formula en la misma composición farmacéutica que un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el agente que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 se formula en una composición farmacéutica diferente de un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el agente que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 se administra antes de la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el agente que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 se administra después de la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el agente que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 se administra simultáneamente con un anticuerpo proporcionado en la presente, pero el agente y el anticuerpo se administran en composiciones farmacéuticas separadas.

En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es un agente que, cuando se administra solo y a su dosificación recomendada, da como resultado una cierta cantidad de trombocitopenia en el sujeto. En algunos aspectos, dicho agente puede administrarse en combinación con un anticuerpo proporcionado en la presente a una dosificación reducida. Dicha terapia de combinación puede administrarse de manera segura sin que se produzca un deterioro sustancial de las plaquetas o trombocitopenia.

En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es un agonista de un receptor coestimulador de una célula inmunitaria. En algunos aspectos, el receptor coestimulador se selecciona entre OX40, ICOS, CD28, CD37, GITR, CD40 y 4-1BB, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agonista es un anticuerpo.

En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es una citoquina. En algunos aspectos, la citoquina se selecciona entre IL-2, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 y combinaciones de las mismas.

En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es un virus oncolítico. En algunos aspectos, el virus oncolítico se selecciona entre un virus del herpes simple, un virus de la estomatitis vesicular, un adenovirus, un virus de la enfermedad de Newcastle, un virus vaccinia y un virus maraba.

En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es una célula T con un receptor de antígeno quimérico (célula CAR-T). En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es un anticuerpo bi- o multiespecífico dirigido a células T. En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es un anticuerpo anti-TGF-p. En algunas realizaciones, el agente inmunoestimulador es una trampa de TGF-p.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es una vacuna contra un antígeno tumoral. La vacuna puede dirigirse a cualquier antígeno adecuado, siempre que esté presente en un tumortratado con los métodos proporcionados en la presente. En algunos aspectos, el antígeno tumoral es un antígeno tumoral que está sobreexpresado en comparación con sus niveles de expresión en el tejido normal. En algunos aspectos, el antígeno tumoral se selecciona entre el antígeno testicular del cáncer, el antígeno de diferenciación, NY-ESO-1, MAGE-A1, MART, y combinaciones de los mismos.

Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos adicionales incluyen un taxano (por ejemplo, paclitaxel o docetaxel); un agente de platino (por ejemplo, carboplatino, oxaliplatino y/o cisplatino); un inhibidor de la topoisomerasa (por ejemplo, irinotecán, topotecán, etopósido y/o mitoxantrona); ácido folínico (por ejemplo, leucovorina); o un inhibidor metabólico de nucleósidos (por ejemplo, fluorouracilo, capecitabina y/o gemcitabina). En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es ácido folínico, 5-fluorouracilo y/u oxaliplatino. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es 5-fluorouracilo e irinotecán. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un taxano y un agente de platino. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es paclitaxel y carboplatino. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es pemetrexato. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es una terapia dirigida, como un agente dirigido a EGFR, RAF o MEK.

El agente terapéutico adicional puede administrarse por cualquier medio adecuado. En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se incluyen en la misma composición farmacéutica. En algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se incluyen en diferentes composiciones farmacéuticas.

En las realizaciones en las que un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se incluyen en diferentes composiciones farmacéuticas, la administración del anticuerpo puede tener lugar antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico adicional. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y del agente terapéutico adicional se produce con aproximadamente un mes de diferencia. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce con una semana de diferencia. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce con un día de diferencia. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce en un plazo de aproximadamente doce horas entre sí. En algunos aspectos, la administración de un anticuerpo proporcionado en la presente y el agente terapéutico adicional se produce con una diferencia de aproximadamente una hora.

<8>. Kits

También se proporcionan kits que comprenden los anticuerpos proporcionados en la presente. Los kits pueden usarse para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de una enfermedad o de un trastorno, como se describe en la presente.

En algunas realizaciones, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y bolsas de solución IV. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, por sí sola o combinada con otra composición, es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar una enfermedad o trastorno. El recipiente puede tener un puerto de acceso estéril. Por ejemplo, si el recipiente es una bolsa de solución intravenosa o un vial, puede tener un puerto que pueda ser perforado por una aguja. Por lo menos un agente activo de la composición es un anticuerpo proporcionado en la presente. La etiqueta o el prospecto indican que la composición se usa para tratar la afección seleccionada.

En algunas realizaciones, el kit comprende (a) un primer recipiente con una primera composición contenida en el mismo, en donde la primera composición comprende un anticuerpo proporcionado en la presente; y (b) un segundo recipiente con una segunda composición contenida en el mismo, en donde la segunda composición comprende un agente terapéutico adicional. El kit en esta realización de la invención puede comprender además un prospecto que indique que las composiciones pueden usarse para tratar una afección particular.

Alternativa o adicionalmente, el kit puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, el excipiente es un tampón. El kit puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo filtros, agujas y jeringuillas.

EJEMPLOS

Lo siguiente son ejemplos. Se entiende que pueden ponerse en práctica otras realizaciones, dada la descripción general que se proporciona en la presente.

Ejemplo 1. Selección de anticuerpos

Materiales y métodos

Los antígenos se biotinilaron usando el kit de biotinilación EZ-Link Sulfo-NHS de Pierce. Se obtuvieron F(ab')<2>de cabra antihumano kappa-FITC (LC-FITC), ExtrAvidina-PE (EA-PE) y Estreptavidina-AF633 (SA-633) de Southern Biotech, Sigma y Molecular Probes, respectivamente. Las microperlas de estreptavidina y las columnas de separación MACS LC se adquirieron de Miltenyi Biotec. El IgG-PE antihumano de cabra (Human-PE) se obtuvo de Southern Biotech.

Descubrimiento ingenuo

Se propagaron ocho bibliotecas de levaduras sintéticas humanas ingenuas de ~10<9>de diversidad cada una como se ha descrito anteriormente (consultar, por ejemplo, Y. Xu et al, Addressing polyspecificity of antibodies selected from an in vitro yeast presentation system: a FACS-based, high-throughput selection and analytical tool. PEDS 26.10, 663-70 (2013); WO2009036379; WO2010105256; y WO2012009568). Para las dos primeras rondas de selección, se llevó a cabo una técnica de clasificación de perlas magnéticas utilizando el sistema Miltenyi MACS, como se ha descrito anteriormente (consultar, por ejemplo, Siegel et al, High efficiency recovery and epitopespecific sorting of an scFv yeast display library." J Immunol Methods 286(1-2), 141-153 (2004)). Brevemente, las células de levadura (~<1 0 10>células/biblioteca) se incubaron con 5 ml de antígeno biotinilado 100 nM durante 30 min a 30° C en tampón de lavado (solución salina tamponada con fosfato [PBS]/0,1% de albúmina sérica bovina [BSA]). Después de lavar una vez con 40 ml de tampón de lavado enfriado con hielo, se volvió a suspender el sedimento celular en 20 ml de tampón de lavado y se añadieron microperlas de estreptavidina (500 pl) a la levadura y se incubaron durante 15 min a 4° C. A continuación, se sedimentaron las levaduras, se volvieron a suspender en<2 0>ml de tampón de lavado y se cargaron en una columna Miltenyi LS. Después de cargar los 20 ml, la columna se lavó 3 veces con 3 ml de tampón de lavado. A continuación, se retiró la columna del campo magnético y las levaduras se eluyeron con 5 ml de medio de cultivo y se cultivaron durante la noche. Las siguientes rondas de selección se realizaron usando citometría de flujo. Se sedimentaron aproximadamente 2x10<7>levaduras, se lavaron tres veces con tampón de lavado y se incubaron a 30° C con concentraciones decrecientes de antígeno biotinilado (100 a 1 nM) en condiciones de equilibrio, con antígenos biotinilados 100 nM de diferentes especies para obtener una reactividad cruzada entre especies, o con un reactivo de depleción de la poliespecificidad (PSR) para eliminar los anticuerpos no específicos de la selección. Para la depleción de PSR, las bibliotecas se incubaron con una dilución 1:10 de reactivo PSR biotinilado como se ha descrito anteriormente (consultar, por ejemplo, Y. Xu et al, Addressing polyspecificity of antibodies selected from an in vitro yeast presentation system: a FACS-based, high-throughput selection and analytical tool. PEDS 26.10, 663-70 (2013)). Luego, las levaduras se lavaron dos veces con tampón de lavado y se tiñeron con LC-FITC (diluido 1:100) y o con reactivos secundarios SA-633 (diluido 1:500) o EAPE (diluido 1:50) durante 15 min a 4° C. Después de lavar dos veces con tampón de lavado, los sedimentos celulares se volvieron a suspender en 0,3 ml de tampón de lavado y se transfirieron a tubos de clasificación tapados con colador. La clasificación se realizó usando un clasificador FACS ARIA (BD Biosciences) y se determinaron las puertas de clasificación para seleccionar los anticuerpos con las características deseadas. Se repitieron las rondas de selección hasta obtener una población con todas las características deseadas. Tras la última ronda de selección, se sembraron las levaduras y se recogieron colonias individuales para su caracterización.

Optimización de anticuerpos

La optimización de los anticuerpos se realizó mediante un protocolo de diversificación de cadenas ligeras y, posteriormente, introduciendo diversidades en las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera, como se describe a continuación. Para cada anticuerpo se usó una combinación de algunos de estos enfoques.

Protocolo de diversificación por lotes de cadenas ligeras: Los plásmidos de cadena pesada de un resultado de selección ingenuo se extrajeron de la levadura mediante aplastar y agarrar, se propagaron en E.coli y se purificaron posteriormente, y se transformaron en una biblioteca de cadenas ligeras con una diversidad de 5x 106. Las selecciones se realizaron con una ronda de MACS y cuatro rondas de FACS empleando las mismas condiciones que el descubrimiento ingenuo.

Selección de CDRH1 y CDRH2: La CDRH3 de un único anticuerpo se recombinó en una biblioteca prefabricada con variantes de CDRH1 y CDRH2 de una diversidad de 1 x 10<8>y se realizaron selecciones con una ronda de MACS y cuatro rondas de FACs como se describe en el descubrimiento ingenuo. En cada ronda de FACS se examinaron las bibliotecas para determinar la unión a PSR, la reactividad cruzada entre especies y la presión de afinidad, y se realizó la clasificación para obtener una población con las características deseadas.

Selección de mutantes de V<h>: La región variable de la cadena pesada (V<h>) se mutagenizó mediante PCR propensa a errores. A continuación, se creó la biblioteca transformando esta V<h>mutagenizada y el vector de expresión de la cadena pesada en levaduras que ya contenían el plásmido de la cadena ligera del progenitor. Las selecciones se realizaron de manera similar a los ciclos anteriores usando clasificación FACS durante dos rondas. En cada ronda FACS se examinaron las bibliotecas para determinar la unión a PSR, la reactividad cruzada entre especies y la presión de afinidad, y se realizó la clasificación para obtener una población con las características deseadas.

Producción y purificación de anticuerpos

Los clones de levadura se cultivaron hasta la saturación y luego se indujeron durante 48 h a 30° C con agitación. Después de la inducción, las células de levadura se sedimentarony los sobrenadantes se recogieron para la purificación. Las IgG se purificaron usando una columna de proteína A y se eluyeron con ácido acético, pH 2,0. Los fragmentos Fab se generaron mediante digestión con papaína y se purificaron sobre KappaSelect® (GE Healthcare LifeSciences).

Mediciones de K<d>ForteBio

Se realizaron mediciones de afinidad de ForteBio en un Octet RED384 generalmente como se ha descrito anteriormente (consultar, por ejemplo, Estep et al, High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs 5(2), 270-278 (2013)). Brevemente, las mediciones de afinidad de ForteBio se realizaron cargando IgG en línea en sensores AHQ. Los sensores se equilibraron fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 minutos y luego se monitorizaron en línea durante 60 segundos para establecer el valor de referencia. Los sensores con las IgGs cargadas se expusieron a<10 0>nM de antígeno durante 3 minutos, y después se transfirieron a tampón de ensayo durante 3 minutos para la medición fuera de línea. Para la evaluación de la afinidad monovalente se usaron Fabs en lugar de IgGs. Para esta evaluación, el antígeno de fusión Fc no biotinilado se cargó en línea en los sensores AHQ. Los sensores se equilibraron fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 minutos y luego se monitorizaron en línea durante 60 segundos para establecer el valor de referencia. Los sensores con el antígeno cargado se expusieron a 200 nM de Fab durante 3 minutos, y después se transfirieron al tampón de ensayo durante 3 minutos para la medición de la velocidad sin conexión. Todas las cinéticas se analizaron usando el modelo de unión<1>:<1>.

Agrupamiento de epítopos ForteBio/bloqueo de ligandos

El agrupamiento de epítopos/bloqueo de ligandos se realizó mediante un ensayo estándar de bloqueo cruzado en formato sándwich. Se cargó IgG antiobjetivo de control en sensores AHQ y se bloquearon los sitios de unión de Fc no ocupados del sensor con un anticuerpo de IgG1 humano irrelevante. A continuación, los sensores se expusieron a<10 0>nM de antígeno objetivo seguido de un segundo anticuerpo o ligando antidobjetivo La unión adicional del segundo anticuerpo o ligando tras la asociación con el antígeno indica un epítopo desocupado (no competidor), mientras que la ausencia de unión indica el bloqueo del epítopo (competidor o bloqueo de ligando).

Cromatografía de exclusión por tamaño

Se usó una columna TSKgel® SuperSW mAb HTP (22855) para el análisis SEC rápido de mAbs producidos en mamíferos a 0,4 ml/min con un tiempo de ciclo de<6>min/ejecución. Como fase móvil se usó fosfato sódico 200 mM y cloruro sódico 250 mM.

Fluorimetría dinámica de barrido

Se añaden 10 pl de Sypro Orange 20x a 20 pl de solución de mAb o Fab de 0,2-1mg/ml. Se usa un instrumento de RT-PCR (BioRad CFX96 RT PCR) para aumentar la temperatura de la placa de la muestra de 40 a 95 C en incrementos de 0,5C, con 2 minutos de equilibrio a cada temperatura. Se usa el negativo de la primera derivada de los datos brutos para extraer la Tm.

Ejemplo 2. Caracterización de anticuerpos

Mediciones de Kd ForteBio: Launión cuantitativa de anticuerpos a NRP-1 monomérica recombinante humana, de ratón o de mono cynomolgus se midió usando interferometría de bicapa (BLI) usando FORTEBIO®. Las mediciones de afinidad de anticuerpos seleccionados se realizaron generalmente como se describe en Estep et al., Mabs, 2013, 5:270-278. Las mediciones de afinidad de FORTEBIO se realizaron cargando IgG (IgG1 humana N297A) en línea en sensores AHQ. Los sensores se equilibraron fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 minutos y luego se monitorizaron en línea durante 60 segundos para establecer el valor de referencia. Los sensores con las IgG cargadas se expusieron a una única concentración de antígeno (100 nM) durante 3 minutos. Después se transfirieron a tampón de ensayo durante 3 minutos para la medición de la velocidad de desconexión. La cinética se analizó usando el modelo de unión 1:1. En la Tabla 5 se muestra un resumen de las mediciones de K<d>para anticuerpos que se unen a una concentración única de NRP-1 humana, de mono cynomolgus y de ratón.

Se realizaron mediciones de K<d>adicionales con ocho anticuerpos (S228P de IgG4 humana) usando cinética multiconcentración. Las afinidades de unión para NRP-1-His humana, NRP-1-His de mono cynomolgus y NRP-1-His de ratón se midieron usando un instrumento Octet QKe (ForteBio). Se usó una estrategia de captura de anticuerpos en sensores seguida de asociación/disociación de proteínas NRP-1 monoméricas para evitar efectos de avidez en el ensayo. El análisis BLI se realizó a 30° C usando tampón cinético 1X (ForteBio) como tampón de ensayo. Los biosensores de captura de Fc de IgG antihumana (AHC) (ForteBio) se remojaron previamente en tampón de ensayo durante más de 5 minutos. El anticuerpo de prueba (5 pg/ml) se capturó en el sensor durante 250 segundos. A continuación, los sensores se sumergieron en tampón de ensayo durante 60 segundos para establecer una valor de referencia antes de medir la unión a cada proteína NRP-1. A continuación, los sensores se sumergieron en concentraciones variables de NRP-1-His humana (93,3 a 0,7 nM, diluciones de 2 veces en tampón de ensayo), NRP-1-His de mono cynomolgus (93,3 a 1,5 nM, diluciones de 2 veces en tampón de ensayo) o NRP-1-His de ratón (93,3 a 1,5 nM, diluciones de 2 veces en tampón de ensayo) durante 250 segundos para medir la asociación. A continuación, se midió la disociación de NRP-1 sumergiendo los sensores en tampón de ensayo durante 600 segundos. La agitación en todos los pasos fue de 1000 rpm. Los parámetros cinéticos se generaron con el software de análisis de datos Octet versión 8.2.0.7 usando sustracción de referencia ("unión" del anticuerpo al tampón), corrección entre pasos basada en la disociación, modelo de unión 1 a 1 y ajuste global (Rmax no enlazado por sensores). Los valores de Kd se muestran en la Tabla<6>.

Mediciones de Kd MSD-SET:Las mediciones de afinidad de equilibrio en solución de anticuerpos seleccionados que se unen a NRP-1 humana se realizaron en general como se ha descrito previamente. Consultar Estep et al.,supra.Brevemente, las valoraciones de equilibrio en solución (SET) se realizaron en PBS 0,1% de BSA libre de IgG (PBSF) con antígeno mantenido constante a 10-100 pM e incubado con diluciones en serie de 3 a 5 veces de Fab o mAbs comenzando a 10pM-10nM. Los anticuerpos (20 nM en PBS) se recubrieron en placas MSD-ECL de unión estándar durante toda la noche a 4° C o a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, las placas se bloquearon con BSA durante 30 min con agitación a 700 rpm, seguido de tres lavados con tampón de lavado (PBSF 0,05% de Tween® 20). Se aplicaron muestras SET y se incubaron en las placas durante 150s con agitación a 700 rpm seguido de un lavado. El antígeno capturado en una placa se detectó con 250ng/ml de estreptavidina marcada con sulfotag en PBSF mediante incubación en la placa durante 3 min. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y luego se leyeron en el instrumento MSD Sector Imager 2400 usando 1x tampón de lectura T con surfactante. El porcentaje de antígeno libre se representó gráficamente como una función del anticuerpo titulado en Prism y se ajustó a una ecuación cuadrática para extraer la K<d>. Para mejorar el rendimiento, se usaron robots de manipulación de líquidos en todos los experimentos MSD-SET, incluida la preparación de muestras SET.

Tabla 5.Afinidades de unión de anticuer os - Cinética de concentración única

Tabla 6.Afinidades de unión de anticuer os - Cinética de concentración múlti le

Ejemplo 3. Eficacia antitumoral de nueve MABs anti-NRP-1 solos y en combinación con un anticuerpo de PD-1 o PD-L1.

Se evaluó la eficacia antitumoral de nueve anticuerpos optimizados usando ratones inmunocompetentes. El ensayo se realizó con un panel de versiones murinas de los MAB 2, 3, 4, 5, 7, 12, 13, 14 y 15, así como un control de IgG y SEC10 (SEQ ID NOS 141-142) como comparador. Los anticuerpos se probaron como anticuerpos de IgG2a quiméricos de ratón que contenían la mutación N297A que suprime las funciones efectoras de ADCC y CDC. La eficacia antitumoral se midió usando el modelo de tumor singénico CT26 de colon de ratón cultivado en ratones BALB/c hembra. Se implantaron 3x10<5>células CT26 de ratón por vía subcutánea el Día 1. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente sobre la base del peso corporal y los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal a la dosis indicada el mismo día de la implantación de las células tumorales. Los anticuerpos anti-NRP-1 se administraron como monoterapia a 500 pg/dosis o en combinación con un inhibidor del punto de control inmunitario anti-PD-1 que se usó a 200 pg/dosis. La Figura 1A muestra el efecto de la monoterapia de anticuerpos en el modelo CT26, y la Figura 1B muestra el efecto de la combinación de anticuerpos anti-NRP-1 con anti-PD-1. Las flechas negras a lo largo del eje horizontal indican los días de tratamiento de los anticuerpos. Se muestra el volumen tumoral medio de 10 ratones por grupo para cada grupo de tratamiento.

La Figura 1C muestra un subconjunto de datos de las Figuras 1A y 1B que comparan mMAB12 solo y en combinación con un anticuerpo contra el punto de control PD-1 en el modelo de tumor singénico CT26 de colon de ratón. mMAB12 a 500|jg/animal inhibió el crecimiento tumoral en un 61,6% de TGI (inhibición del crecimiento tumoral) en comparación con los ratones tratados con anticuerpos de control. Este efecto fue estadísticamente significativo mediante la prueba t de Student (p<0,05). El anticuerpo de punto de control anti-PD-1 administrado a 200jg/animal fue menos eficaz que mMAB12 (37,8% de TGI, p<0,05). Sin embargo, la combinación de mMAB12 con el anticuerpo de PD-1 dio lugar a una eficacia antitumoral aditiva (79,0% TGI, p<0,001) en comparación con los tratamientos en monoterapia. El efecto de la combinación fue estadísticamente significativo en comparación con PD-1 y mMAB12 (p<0,05 en ambos casos). No se observaron efectos tóxicos adversos en los ratones tratados, que aumentaron de peso a lo largo del tratamiento, salvo un ratón que expiró en el grupo de mMAB12 que no estaba relacionado con el tratamiento.

Se evaluaron los mismos nueve anticuerpos en un segundo modelo tumoral, el modelo singénico MC38 de colon de ratón. Se implantaron 5x10<5>células MC38 de ratón por vía subcutánea en ratones C57Bl/6 hembra. Los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de 60 mm<3>a 90 mm<3>seguido del inicio del tratamiento el día 1. Los anticuerpos anti-NRP-1 se administraron como monoterapia a 500 jg/dosis o en combinación con un inhibidor del punto de control inmunitario anti-PD-LI que se usó a 250 jg/dosis. El anticuerpo anti-PD-LI actúa en la misma vía del punto de control inmunitario que el anticuerpo PD-1. La Figura 2A muestra el efecto monoterapéutico de los anticuerpos en el modelo MC38, y la Figura 2B muestra el efecto de la combinación de anticuerpos anti-NRP-1 con anti-PD-L1. Las flechas negras a lo largo del eje horizontal indican los días de tratamiento. Se muestra el volumen tumoral medio de 10 ratones por grupo para cada grupo de tratamiento.

En la Figura 2C se muestra la eficacia antitumoral del mMAB12 en el modelo de tumor de colon singénico de ratón MC38. El mMAB12 a 500jg/animal inhibió el crecimiento tumoral en un 77,3% TGI (p<0,05) en comparación con los ratones tratados con anticuerpos de control. El modelo MC38 es muy sensible al bloqueo con anticuerpos contra PD-1. Por lo tanto, se usó un anticuerpo contra PD-L1 a 250jg/animal que funciona en la misma vía de punto de control inmunitario que el anticuerpo de PD-1 para demostrar los posibles beneficios de la combinación. Como se esperaba, la monoterapia con PD-L1 bloqueó el crecimiento tumoral en un 77,5% de TGI (p<0,05). Sin embargo, la combinación de mMAB12 con el anticuerpo de PD-L1 no demostró beneficios antitumorales adicionales (76,2% de TGI). Al igual que en el modelo CT26, los ratones tratados no mostraron ninguna toxicidad adversa y todos ganaron peso durante el tratamiento. Se seleccionaron cuatro anticuerpos (MABs 2, 5, 12 y 13) basándose en su eficacia en los estudios CT26 y MC38 y se volvieron a probar en el modelo MC38 en las mismas condiciones (solos y en combinación con anti-PD-L1). Los resultados de la repetición del estudio MC38 confirmaron los resultados anteriores de eficacia y tolerabilidad.

Ejemplo 4. Evaluación del bloqueo de ligandos de NRP-1

Los estudios cuantitativos de bloqueo del ligando, que miden la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de SEMA3A humano recombinante y VEGFA humano a la NRP-1 humana recombinante, se midieron mediante un ELISA de bloqueo. Para medir la capacidad del anticuerpo de bloquear la interacción SEMA3A/NRP-1, la placa de ensayo se recubrió con SEMA3A humano a 2,5jg/ml en PBS, durante una noche a 4° C. La NRP-1 humana biotinilada (500ng/ml en 1% de BSA/PBS) se incubó con el anticuerpo de prueba (30-0,002jg/ml, dilución cuádruple en 1% de BSA/PBS) antes de añadirlo a la placa de ensayo y, a continuación, se usó estreptavidina conjugada con HRP (1:200 en 1% de BSA/PBS) para la detección de la NRP-1 unida a SEMA3A. Brevemente, para medir la capacidad del anticuerpo para bloquear la interacción VEGFA/NRP-1, la placa de ensayo se recubrió con NRP-1 humana a 2,5jg/ml en PBS, durante la noche a 4° C. El anticuerpo de prueba (30-0,002jg/ml, dilución cuádruple en 1% de BSA/PBS) se incubó con VEGFA (125ng/ml) antes de añadirlo a la placa de ensayo, se añadió el anticuerpo anti-VEGFA biotinilado (0,2jg/ml en 1% de BSA/PBS) y, a continuación, se usó estreptavidina conjugada con<h>R<p>(1:200 en 1% de BSA/PBS) para la detección de Ve GFa unido a NRP-1. En la Tabla 7 se muestran los valores de IC<50>para 15 anticuerpos de prueba de formato IgG1 que bloquean la unión SEMA3A/VEGFA.

T l 7.V l r I r n l n ni r f rm I 1

continuación

Se convirtieron ocho MAB al formato IgG4 S228P y se repitió el ensayo. En la Tabla<8>se muestra un resumen de las medias.

T l .M i r n l n ni r f rm I 4

Ejemplo 5. Agrupamiento de epítopos de MAB12 frente a SEC10

El agrupamiento de epítopos para MAB12 y SEC10 se midió mediante interferometría de biocapa (BLI) utilizando un instrumento Octet® QKe (ForteBio®). Se inmovilizaron MAB12 o SEC10 a 5|jg/ml en sensores AHC de Fc antihumanos durante 300 segundos. A continuación, los sensores se sumergieron en tampón cinético para determinar el valor de referencia. A continuación, se sumergieron los sensores en IgG humana a 200jg/ml durante 400 segundos para saturar todos los sitios de unión de Fc de IgG en los sensores. Tras la determinación del valor de referencia, los sensores se expusieron a 100 nM de NRP-1-HIS humana durante 300 segundos para permitir la unión del antígeno. Por último, los sensores se transfirieron a pocillos que contenían 20jg/m l de MAB 12 o SEC 10 durante 300 segundos para analizar la unión del anticuerpo. Si el anticuerpo de prueba mostraba una unión clara en el último paso, se consideraba no competidor (grupo de epítopo diferente), y si el anticuerpo de prueba no mostraba una unión clara, se consideraba competidor (mismo grupo de epítopo).

Los resultados se muestran en la Figura 3. La captura de MAB 12 y su posterior unión a NRP-1 no impide que SEC10 también se una a NRP-1 (panel superior). De manera similar, la captura de SEC10 y su posterior unión a NRP-1 no impide que MAB12 también se una a NRP-1 (panel inferior). El autoagrupamiento (por ejemplo, capturar MAB 12, unir NRP-1, comprobar la unión de MAB 12) sirvió como control positivo para el agrupamiento. Estos datos demuestran que MAB12 y SEC 10 pueden unirse simultáneamente a NRP-1 y, por lo tanto, deben unirse a epítopos diferentes.

Ejemplo 6. Unión de anticuerpos anti-NRP-1 a dominios NRP-1

Para comprender el dominio de unión aproximado de los anticuerpos que se unen al NRP-1 humana, se midió mediante BLI la capacidad de los anticuerpos de unirse a fragmentos de NRP-1 que contenían diferentes dominios de la región extracelular de la NRP-1 usando un instrumento Octet® QKe (ForteBio®). Las proteínas de fusión NRP-1-Fc humanas recombinantes consistían en dominios a<1>, ala<2>, a<1>a<2>b<1>, a<2>blb<2>o ala<2>blb<2>, y las diferencias en la unión del anticuerpo a cada proteína permitieron determinar a qué dominio primario se une el anticuerpo. El análisis BLI se realizó a 29° C o 30° C usando tampón cinético 1X (ForteBio) como tampón de ensayo. Brevemente, los anticuerpos (5jg/ml) se capturaron en biosensores de Fc de IgG antihumana (AHC) durante 250 segundos. A continuación, los sensores se sumergieron en tampón de ensayo<( 1 00>segundos) para alcanzar un valor de referencia antes de medir la unión a cada proteína NRP-1. A continuación, se realizó un paso de inactivación usando Fc de IgG humana (150nM, 250nM o 500nM, dependiendo del experimento) durante 250 segundos. A continuación, se sumergieron los sensores en cada proteína NRP-1 a 500nM durante 300 segundos, seguido de la disociación de cada proteína NRP-1 en tampón de ensayo durante 900 o 1000 segundos. La agitación se realizó a 900 rpm o 1000 rpm para todos los pasos, dependiendo del experimento.

La Tabla 9 muestra los resultados de los ensayos descritos anteriormente. El dominio de unión de cada anticuerpo se muestra en la columna del extremo derecho.

Tabla 9.Es ecificidad de unión al dominio de NRP1

Ejemplo 7: Análisis mutacional para la determinación de epítopos

Para identificar el epítopo de unión de MAB12 al dominio b1 de NRP1 humano, se realizaron mutaciones puntuales en el dominio b1 de NRP1 humana. Se usaron sustituciones de alanina o residuos específicos de NRP2 (MAB12 no se une a NRP2). Las proteínas se expresaron en células HEK293, se secretaron como proteína soluble, se purificaron en resina Ni-NTA y se caracterizaron por SDS-PAGE. La unión se evaluó mediante interferometría de biocapa (BLI) usando la plataforma Octet. El MAB12 se capturó en sensores de Fc antihumanos, se lavó y se expuso al dominio de NRP1 b1 humana monomérica de tipo salvaje o a l aNRP1 b1 mutante monomérica. Los residuos considerados parte del epítopo de unión mostraron una unión reducida (por ejemplo, una Kd más de 5 veces inferior a la de la unión a NRP1 b1 humana de tipo salvaje) o ninguna unión. Las mutaciones puntuales P317A, D320A, T349A, K352G, Y353A, Y354A y T413A produjeron una unión reducida, mientras que K351N y E412H no produjeron ninguna unión.

Ejemplo 8: Determinación de la estructura de MAB12 formando complejo con NRP1

El epítopo de unión también se identificó mediante estudios cristalográficos. Se formó un complejo de Fab de MAB12 con NRP1 b1 humana, se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se concentró a 10mg/ml. Los cristales se cultivaron en PEG200 al 42%, HEPES pH 7. Los datos de rayos X se recogieron en los Argonne National Laboratories (GM/CA CAT 23ID-D) y se procesaron usando CCP4 y Phenix. Los residuos de NRP1 b1 dentro de una distancia de contacto de 3,8Á de la cadena pesada y ligera se consideraron parte del epítopo de unión e incluyen Y297, T316, D320, E348, T349, K350, K351, K352, Y353, Y354, E412, T413, G414 e I415.

Ejemplo 9: Análisis de las modificaciones de aminoácidos de MAB12

El análisis de las modificaciones de aminoácidos del MAB12 purificado sugirió que la deleción de la lisina en el extremo C terminal de la cadena pesada se produjo en la mayoría de los anticuerpos purificados y que la piroglutamilación del ácido glutámico en el extremo N terminal de la cadena ligera se produjo en algunos de los anticuerpos purificados.

APÉNDICE A: TABLA DE REFERENCIA DE SECUENCIAS

continuación

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente a NRP-1 humana (hNRP-1; SEQ ID NO: 130), en donde el anticuerpo comprende las siguientes seis secuencias de CDR:

(d) una CDR-H3 de la SEQ ID NO:47, una CDR-H2 de la SEQ ID NO:30, una CDR-H1 de la SEQ ID NO: 14, una CDR-L3 de la SEQ ID NO:81, una CDR-L2 de la SEQ ID NO:71, y una CDR-L1 de la SEQ ID NO:63;

en donde el anticuerpo bloquea la unión de NRP-1 a un polipéptido de semaforina 3A (SEMA3A) y en donde el anticuerpo bloquea las interacciones entre un polipéptido de NRP-1 y un polipéptido de factor A de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGFA).

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde:

(a) el anticuerpo de (a) comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:92 y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 104;

(b) el anticuerpo de (b) comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:93 y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 104;

(c) el anticuerpo de (c) comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:94 y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 104;

(d) el anticuerpo de (d) comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:95 y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 104; o

(e) el anticuerpo de (d) comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO:96 y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 104.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde:

(a) el anticuerpo de (a) comprende (i) una cadena pesada de la SEQ ID NO:114 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126;

(b) el anticuerpo de (b) comprende (i) una cadena pesada de la SEQ ID NO:115 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126;

(c) el anticuerpo de (c) comprende (i) una cadena pesada de la SEQ ID NO:116 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126;

(d) el anticuerpo de (d) comprende (i) una cadena pesada de la SEQ ID NO:117 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126; o

(e) el anticuerpo de (d) comprende (i) una cadena pesada de la SEQ ID NO:118 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo realiza una o más de las siguientes acciones:

(a) compite o compite de manera cruzada por la unión a NRP-1 con un anticuerpo seleccionado entre MAB8,<m>A<b>9, MAB10, MAB11 o MAB12, en donde MAB8 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:114 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126, MAB 9 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:115 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126, MAB 10 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:116 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126, MAB 11 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:117 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126, y MAB 12 comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:118 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126;

(b) es específico para la NRP-1 de la superficie celular;

(c) es capaz de unirse a un dominio extracelular del polipéptido de NRP-1; o

(d) se une específicamente a uno o más residuos de<n>R<p>1 seleccionados del grupo que consiste en Y297, T316, D320, E348, T349, K350, K351, K352, Y353, Y354, E412, T413, G414 e I415, en donde el anticuerpo es MAB 12 que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:118 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:126.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo tiene una o más de las siguientes características:

(a) es un anticuerpo monoclonal;

(b) se selecciona entre un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico;

(c) es multivalente;

(d) es un fragmento de unión a antígeno; opcionalmente en donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona entre los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv (sFv) y scFv-Fc;

(e) comprende una región constante de inmunoglobulina;

opcionalmente, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de una clase seleccionada entre IgA, IgD, IgE, IgG o IgM;

en donde además, opcionalmente, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de la clase IgG y una subclase seleccionada entre IgG4, IgG1, IgG2 o IgG3;

(f) comprende un anticuerpo de cadena ligera común, un anticuerpo con una modificación botón en los agujeros, un scFv unido a una IgG, un Fab unido a una IgG, un diacuerpo, un anticuerpo biespecífico tetravalente, un DVD-IgMAB, un DARTT M, un CovX-Cuerpo, un anticuerpo Fcab, un Fab en tándem, o combinaciones de los mismos; y/o

(g) reduce la unión de la semaforina 3A a la NRP-1 en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80% o por lo menos aproximadamente un 90%;

opcionalmente, el anticuerpo reduce la unión de la semaforina 3A a la NRP-1 en por lo menos aproximadamente un 50%.

6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la NRP-1 se expresa en la superficie de una célula objetivo.

7. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo

(a) comprende una secuencia polipeptídica que tiene un residuo de piroglutamato (pE) en su extremo N-terminal (b) comprende una secuencia Vh en la que una Q N-terminal está sustituida por pE

(c) comprende una secuencia V<l>en la que una E N-terminal está sustituida por pE

(d) comprende una secuencia de cadena pesada en la que una Q N-terminal está sustituida por pE; y/o

(e) comprende una secuencia de cadena ligera en la que una E N-terminal está sustituida por pE.

8. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:96, y una región variable de cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 104;

(b) una región variable de cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:96 en la que la E del aminoácido número 1 se modifica a piroglutamato, y una región variable de cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:104;

(c) una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126; (d) una cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO:118 en la que la E del número de aminoácidos 1 está modificado a piroglutamato, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126;

(e) una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 1 a 453 de la SEQ ID NO:118, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 126; y/o

(f) una cadena pesada que consiste en la secuencia de los números de aminoácidos 1 a 453 de la SEQ ID NO:118 en la que la E del número de aminoácidos 1 se modifica a piroglutamato, y una cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO:126.

9. El anticuerpo de la reivindicación 1-8, en donde el anticuerpo tiene una o más de las siguientes características:

a) se une específicamente a la NRP-1 humana con una ko de menos de 20 nM, de menos de 10 nM, de menos de 5 nM, de menos de 2 nM, de menos de 1 nM, de menos de 0,5 nM o de menos de 0,2 nM;

b) se une específicamente a la NRP-1 de humanos, ratones y monos cynomolgus;

c) se une a un epítopo de NRP-1 diferente del epítopo de NRP-1 al que se une SEC10; y/o

d) se une al dominio b1 de NRP-1.

10. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 10.

12. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 10 o el vector de la reivindicación 11;

opcionalmente, en donde la célula huésped se selecciona entre una célula bacteriana, una célula fúngica y una célula de mamífero

o en donde la célula huésped se selecciona entre una célula de E. coli, una célula de Saccharomyces cerevisiae y una célula CHO.

13. Un método para producir un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende expresar el anticuerpo en la célula huésped de la reivindicación 12 y aislar el anticuerpo expresado.

14. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso como medicamento; y/o para su uso en un método de tratamiento del cáncer o de una infección vírica.

16. El anticuerpo o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde:

(a) el método comprende inhibir una función o disminuir la estabilidad de una célula T reguladora (Treg) en un sujeto, el método comprendiendo exponer la Tregin vivoa un inhibidor del eje neuropilina-1 (NRP-1):semaforina en la Treg;

(b) el método comprende aumentar la función de las células efectoras T (Teff) o exponer la T fin vivoal anticuerpo; o

(c) el método comprende modular una respuesta inmunitaria en un sujeto;

además, opcionalmente

(i) en donde el método de (a) o (b) induce o potencia una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado al cáncer; y/ o

(ii) en donde el método de (a), (b) o (c) no provoca sustancialmente trombocitopenia en el sujeto.

17. El anticuerpo o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en donde el método comprende además administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales; opcionalmente en donde el agente terapéutico adicional:

(i) para el método de (a) y (b) se selecciona entre radiación, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente citostático, un agente antihormonal, un inhibidor de VEGF, un agente inmunoestimulador, un agente antiangiogénico y combinaciones de los mismos; o

(ii) para el método de (a) (b) o (c) es un agente que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1, opcionalmente en donde el agente terapéutico adicional es un agente que inhibe la interacción entre PD-1 y PD-L1 y se selecciona entre pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, BMS-936559, sulfamonometoxina 1 y sulfametoxol 2.

18. Un kit que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, e instrucciones para el uso del anticuerpo, opcionalmente en donde el anticuerpo está liofilizado, además opcionalmente en donde el kit comprende además un fluido para la reconstitución del anticuerpo liofilizado.