MX2013000083A - Anticuerpos de anti-neuropilina y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-NRP1 y métodos para utilizar los mismos.

Description

ANTICUERPOS DE ANTI-NEUROPILINA Y MÉTODOS DE USO SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. Número de Serie 61/363,121, otorgada en julio 9, 2010, la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos de anti-neuropilina y métodos para utilizar los mismos.

ANTECEDENTES La neuropilina-1 (NRP1) es un receptor multi- funcional que contribuye al desarrollo de, los sistemas nervioso y vascular. NRP1 inicialmente se describió como un receptor que enlaza a ligando semaforina 3A, que. actúa con co-receptores plexina para regular guía de axón (He y Tessier-Lavigne, Cell (1997) 90:739-51). Posteriormente se mostró que NRP1 también liga miembros de la familia de ligandos de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor) para mediar ;el desarrollo vascular (Soker et al., Cell (1998) 92:735-45; Kawasaki et al., Desarrollo (1999) 126:4895-902). Además, varios estudios han propuesto un papel para NRP1 en; biología de tumor al regular funciones de células de tumor y/o vasculares (Bielenberg et al., Exp Cell Res (2006) 312:584-93).

Pan et al. , J Biol Chera (2007) 282:24049-56 mostró que un anticuerpo monoclonal que liga a NRP1 reduce la migración celular endotelial mediada por VEGF in vitro (ver también Publicación de PCT Número WO2007/056470) . Bloquear la interacción VEGF con NRP1 in vivo, reduce angiogénesis y remodelación vascular. El anticuerpo anti-NRPl frenó el crecimiento de tumor como un agente sencillo; se propone que esto se debe a reducción mediada por anticuerpo! anti-NRPl de brote o proliferación de vasos a través de un proceso dependiente de VEGF. El anticuerpo anti-NRPl mejora los efectos anti-angiogénicos y anti-tumor de bloqueo de VEGF con anticuerpo anti-VEGF. Los datos sugieren que al reducir remodelación vascular con anti-NRPl, probablemente los vasos retengan un fenotipo más inmaduro. Como vasos inmaduros se consideran más dependientes de VEGF, vasos sanguíneos con tumores tratados con anti-NRPl pueden hacerse más susceptibles a terapia anti-VEGF, de esta manera resultando en eficacia de combinación en modelos de tumor cuando se combinan ambas terapias (Pan et al., Cáncer Cell (2007) 11:53-67). Dado el papel de NRP1 en angiogénesis, son deseables herramientas adicionales para detectar la presencia de NRP1.

COMPENDIO La invención proporciona anticuerpos ¡ anti-NRPl y métodos para utilizar los mismos. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado ' que liga a neuropilina-1 (NRP1) , en donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de. aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En ciertas modalidades, el anticuerpo además comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID' O: 9; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

También se proporciona un anticuerpo' aislado que liga a neuropilina-1 (NRP1) , en donde el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que liga a neuropilina-1 (NRP1) , en donde el anticuerpo comprende (a) una secuencia VH que tiene al menos 95% identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia VL que tiene al menos 95% identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:'7; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) . En algunas modalidades , el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia VL de SEQ ID NO: 7. También se proporciona un anticuerpo aislado que liga a neuropilina-1 (NRP1) , en donde el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 2 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 7.

En ciertas modalidades, el anticuerpo de la invención -es un anticuerpo IgGl. En algunas modalidades el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que liga neuropilina, por ejemplo, un anticuerpo que carece de una porción Fe, una estructura F(ab' )2/ una Fab o una Fv. En otro aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende cualquiera de los anticuerpos de la invención.

La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-NRPl de la invención. En una modalidad, se proporciona un vector que comprende el ácido nucleico. En una m'pdalidad, se proporciona una célula hospedera que comprende; el vector o que comprende el ácido nucleico. En una modalidad, la célula hospedera es eucariótica. En una modalidad, la célula hospedera es una célula CHO. En una modalidad, un método para producir un anticuerpo anti-NRPl se proporciona, en donde el método comprende cultivar la célula hospedera bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo de manera tal que se: produce un anticuerpo. En algunas modalidades el método además comprende aislar el anticuerpo producido por los métodos.

En una aspecto, se proporciona un', método para detectar la presencia de NRPl en una muestra biológica, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo de la invención, bajo condiciones que permiten ligar el anticuerpo a NRPl, y detectar la presencia del anticuerpo ligado, por ejemplo, al detectarse un complejo se forma entre el anticuerpo y NRPl. De esta manera,' aquí se proporciona un anticuerpo de la invención para utilizar en detectar la presencia de NRPl en una muestra biológica. En algunas modalidades, la detección de la presencia de NRPl es por inmunohistoquímica .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 (que comprende de las figuras 1A-D) muestra resultados de inmunohistoquímica utilizando anticuerpo monoclonal anti-NRPl 7130. (1A: células HEK-293 transfectadas con NRPl humano y longitud integra (control positivo); IB: células HEK-293 transfretadas con; vector vacío (control negativo); 1C: sección de tejido dé riñon; ID: sección de tejido de placenta) . .

La figura 2 (que comprende de las Figuras 2A-C) muestran resultados de " inmunohistoquímica i utilizando anticuerpo anti-NRPl monoclonal 7130. (2A: sección de tejido de paciente con cáncer c.olorectal (CRC) ; 2B: sección de tejido de paciente con cáncer de mama (BC) ; 2C: sección de tejido de paciente con cáncer pulmonar de células pequeñas (NSCLC) (Non-Small Cell Lung Cáncer) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES DE LA INVENCIÓN I. DEFINICIONES Un "marco aceptor humano" para los presentes propósitos es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable-cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable-cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano, como se define a continuación. Un marco humano aceptor "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano puede comprender su misma secuencia de aminoácidos, o puede contener cambios de secuencias de aminoácidos. En algunas modalidades, el número de cambios de aminoácidos son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas modalidades, el marco humano aceptor • de VL es idéntico en secuencia a la secuencia ] de marco de inmunoglobulina humana de VL o secuencia de marco consenso humano .

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de enlace de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su socio de enlace (por ejemplo un antígeno) . A menos de que se indique de otra forma, como se emplea aquí, "afinidad de enlace" se refiere a la afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción 1 : 1 entre miembros de un par de enlace (por e emplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X para su socio Y puede en general ser representada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos aquí descritos. Modalidades ejemplares e ilustrativas específicas para medir afinidad de enlace, se describen a continuación.

Un anticuerpo "madurado de afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVRs) , en comparación con un anticuerpo precursor que no posee estas alteraciones, estas alteraciones resultan en una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno.

Los términos "anticuerpo anti-ne ropilina-l" , "anticuerpo anti-NRPl" y "un anticuerpo que liga a NRP1" se refieren a un anticuerpo que es capaz de ligar NRP1 con afinidad suficiente de manera tal que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para hacer blanco NRP1. En una modalidad, la extensión de enlace de un anticuerpo anti-NRPl con una proteína no-NRPl nó relacionada es menos que aproximadamente 10% del enlace de anticuerpo a NRP1 como se mide, por ejemplo, por un radio inmuno ensayo (RIA) . En ciertas modalidades, un anticuerpo que liga a NRP1 tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ , = 100 nM, < 10 nM, = 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, o < 0.001 nM (por ejemplo 10"8 M o menos, por ejemplo de 10~8 M a 10~13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10"13 M) . En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-NRPl liga a un epítopo de NRP1 que se conserva entre NRP1 de diferentes especies.

El término "anticuerpo" aquí' se utiliza en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitadas a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que exhiban la' actividad de enlace de antígeno deseado.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente a un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que liga el antígeno el cual liga el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen pero no están limitados a Fv, Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo scFv) ; y anticuerpos multi-específicos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que liga al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia, se refiere a un anticuerpo que bloquea el enlace del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia por 50% o más, y por el contrario el anticuerpo de réferencia bloquea el enlace del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia por 50% o más. Un ensayo de competencia ejemplar se proporciona aquí.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de región constante o dominio constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, y Ig , y varias de estas además pueden dividirse . en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgG!, IgG2, IgG3, IgG4, IgA!, y IgA2. Los dominios contantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan , d, e, Y/ y µ, respectivamente .

La expresión "agente citotóxico" como se emplea aquí, se refiere a una substancia que inhibe; o evita una función celular y/o provoca muerte o destrucción celular. Agentes citotóxicos incluyen, pero no están , limitados a isótopos radioactivos (por ejemplo, At2U, I131, I25, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu) ; agentes quimioterapéuticos o fármacos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides : (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes de intercalado) ; agentes inhibidores de crecimiento; enzimas y sus fragmentos tales como enzimas nucleolíticas ; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, fungal, planta o animal, incluyendo fragmentos y/o sus variantes; y los diversos agentes antitumor o agentes anticáncer descritos a continuación.

"Funciones Efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas que se atribuyen a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: enlace Clq y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) ; enlace receptor Fe; citotoxicidad mediada; por suero dependiente de anticuerpo (ADCC = Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity) ; fagocitosis; regulación 'a la baja de receptores de superficie celular (por ejemplo1 receptor de célula B) ; y activación de célula B.

Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región Fe" aquí se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene cuando menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. En una modalidad, una región Fe de cadena pesada IgG humana se extiende desde Cys226, o de Pro230, al extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede o no estar i presente.. A menos que se especifique de otra forma aquí, la numeración de los residuos aminoácidos en la ; región Fe o región constantes es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat et al., Secuences of Proteins of Inmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Marco" o "FR" se refiere a residuos de dominio variable diferentes a residuos de región hipervariable (HVR) . FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2 , FR3 , y FR . De acuerdo con esto, las secuencias HVR y FR, en general aparecen en la siguiente secuencia de VH (o VL) : FR1-H1 (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3,-H3 (L3) -FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud íntegra" "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se emplean aquí en forma intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura substancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tienen cadenas pesada que contienen la región Fe como se define aquí.

Las expresiones "célula hospedera", "línea celular hospedera" y "cultivo celular hospedero" se emplean en forma intercambiable y se refieren a las células en las cuales se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de estas células. Célula hospederas incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y su progenie derivada sin consideración al número de pasajes. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula precursora, pero puede contener mutaciones. La progenie mutante puede tener la misma función o actividad biológica como fue cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente, aquí se incluye.

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a, la de un anticuerpo que se produce por un humano o célulai de humano o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias de codificación de anticuerpo humano. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humano.

Un "marco consenso humano" es un1 marco que representa los residuos aminoácidos de ocurrencia más común en una selección de secuencias de marco VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of ¦ Immunológica1 Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols . 1-3. En una modalidad, para VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra . En una modalidad, para VH, el subgrupo es el subgrupo III como en kabat et al., supra . 1 Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende los residuos aminoácido de HVRs no humanos y residuos aminoácido de FR humanos . En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos de los HVRs (por ejemplo, CDRs) corresponden a aquellos de un anticuerpo no humano, y todos o sustancialmente todos los FRs corresponden a aquellos de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo no humano, :se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. ; La expresión "región hipervariable" o "HVR" , como se emplea aguí, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, anticuerpos de cuatro cadenas, nativos comprenden seis HVRs; tres en' VH (Hl, H2 , H3) , y tres en VL (Ll, L2, L3) . HVRs en general comprenden residuos aminoácido de los bucles hipervariables y/o de las "regiones de determinación de complementariedad" (CDRs = Complementarity Determining Regions) , esto último es de la más alta variabilidad de secuencia y/o involucrado en reconocimiento de antígeno. Una región HVR como se emplea aquí, comprende cualquier cantidad de residuos ubicados dentro de las posiciones 24-36 (para Ll) , 46-56 (para L2) , 89-97 (para L3), 26-35B (para Hl) , 47-65 (para H2) , y 93-102 (para H3) . Por lo tanto, una HVR incluye residuos en las posiciones descritas previamente: i A) 26-32 (Ll), 50-52 (L2), 91-96 (L3),; 26-32 (Hl) , 53-55 (H2), y 96-101 (H3) (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917. (1987) ; B) 24-34 de Lí, 50-56 de L2," 89-97 de L3 , 31-35B de Hl, 50-65 de H2 , y 95-102 de H3 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991).

C) Con excepción de CDR1 en VH, CDRs en general I comprenden residuos aminoácidos que forman los bucles hipervariables . CDRs también comprenden "residuos de determinación de especificidad" o "SDRs" que son residuos que contienen antígeno. SDRs están contenidos dentro de regiones de CDRs denominadas CDRs-abreviadas o a-CDRs. Ejemplares a-CDRs (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, y a-CDR-H3) ocurren en los residuos aminoácidos 31-34 de Ll, 50-55 de L2, 89-96 de L3 , 31-35B de Hl, 50-58 de H2 , y 95-102 de H3. (Ver Almagro and Fransson, Front. Biosci. , 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique de otra forma, residuos HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos FR) se enumeran aquí de acuerdo con Kabat et al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero no limitado a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Mamíferos incluyen pero no están limitados a animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos) , conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En ciertas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha separado de un componente de su ambiente natural . . En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica a más de 95% o 99% de pureza como se determina por ejemplo por vía electroforática (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF) , electroforesis capilar) o cromatográfico (por ejemplo, intercambio de iones o HPLC de fase inversa) . ; Para revisar métodos para para evaluación pureza de anticuerpo, ver por ejemplo, Flatman et.al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente en forma extracromosomal o en una ubicación cromosómal que es diferente de su ubicación cromosómal natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-NRPl" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o sus. fragmentos) incluyendo esas moléculas de ácido nucleico en un solo vector o vectores separados, y las moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedera .

La expresión "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, por ejemplo los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o ligan al mismo epitopo, excepto por anticuerpos variantes posibles, por ejemplo que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, estas variantes en general están presentes en cantidades menores. En contraste con preparaciones de anticuerpo policlonal, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada! anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en un antígeno. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no habrá de considerarse que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por una variedad de técnicas, incluyendo pero no limitadas al método de hibridoma, métodos de ADN recombinante , métodos de expresión en fago y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte de los sitios de inmunoglobulina humana, estos métodos y otros métodos ejemplares para producir anticuerpos monoclonales, se describen aquí. ! Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a una porción heteróloga (por ejemplo, una porción citotóxica) o radioetiqueta. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

"Anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con estructuras variantes. Por ejemplo, anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se enlazan por disulfuro. De extremo -N a -C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) , también denominada un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido por tres dominios constantes (CH1, CH2, y CH3) -. Similarmente , de extremo -N a -C cada cadena ligera tiene una región variable ,(VL) , también denominada un dominio ligero variable o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa ( ) y lambda (?) , Con base en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

La expresión "inserto de empaque" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos.

"Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el por ciento de residuos aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar ningunas sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos pueden lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la técnica, por ejemplo utilizando soporte lógico de computadora disponible al público, tales como soporte lógico BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos con destreza en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias^ incluyendo ¡ cualesquiera algoritmos requeridos para lograr máximo alineamiento sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los presentes propósitos, sin embargo valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2 tiene como autor Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A. (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, en donde está registrado bajo el Número de Registro de Derechos de Autor de los E.U.A. TXU510087. El programa , ALIGN-2 está disponible al público de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse del código fuente. El programa ALIGN-2 deberá compilarse para utilizar en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX digital, V4.0D. Todos los parámetros para comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varxan.

En situaciones en donde ALIGN-2 se, emplea para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el por ciento de identidad de secuencias de aminoácidos de una,' secuencia de aminoácidos determinada A a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que en forma alterna puede redactarse como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto por ciento de identidad de ¡ secuencia de. aminoácidos a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: ! 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos aminoácido calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento de programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácido en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A menos que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de identidad de secuencia de aminoácidos aquí empleados se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2.

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación, que está en forma tal que permita que la actividad biológica de un ingrediente activo áhí contenido sea efectiva y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto; al cual se administrará la formulación.

Un "portador farmacéutico aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica,; diferente a un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéutico aceptable, incluye pero no está limitado a un amortiguador, excipiente, estabilizante o conservador.

El término "neuropilina-1" o "NRP1" como se emplea aquí, se refiere a cualquier NRP1 nativa de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otra forma. El término abarca NRP1 sin procesar de "longitud íntegra", así como cualquier forma de NRP1 que resulta de procesar en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de NRP1, por ejemplo, variantes de combinación o variantes alélicas. La estructura básica de neuropilinas comprende cinco dominios: tres dominios extracelulares (ala2, blb2 y e), un dominio de transmembrana y un dominio citoplásmico . El dominio ala2 es un homólogo a componentes de complemento Clr y Cls (CUB) , que en general contienen cuatro residuos cisteína que forman dos puentes disulfuro. El dominio blb2 es homólogo a1 los factores de coagulación V y VIII. La porción central del dominio c se designa como MAM debido a su homología a meprina, A5 y el receptor de proteínas tirosina fosfatasa µ. Los dominios ala2 y blb2 son responsables para enlace de ligando,, en donde el dominio c es crítico para homodimerización o heterodimerización. Gu et al. (2002) J. '.Biol. Chem. 277:18069-76; He and Tessier'-Lavigne (1997) Cell |90:739-51.

La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada 'o ligera de anticuerpo que está involucrado en ligar al anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo en general tienen estructuras similares, con cada dominio que comprende cuatro regiones marco conservadas (FRs) y tres regiones hipervariables (HVRs) . (Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed. , .H. Freeman y Co., pág. 91 (2007).) Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de enlace de antígeno. Además, anticuerpos que ligan a un antígeno particular pueden aislarse utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que liga al antígeno para cribar una biblioteca de dominios complementarios VL o VH, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

El término "vector" como se emplea aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual se liga. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autoreplicante. así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedera en la cual se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a las cuales se ligan operativamente. Estos vectores aquí se refieren como "vectores de expresión" .

II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS La invención proporciona anticuerpos novedosos que ligan a NRP1. Anticuerpos de la invención son. útiles, por ejemplo para detectar la presencia de NRP1, por ejemplo en muestras biológicas .

A. Anticuerpos Anti-NRPl Ejemplares La invención proporciona anticuerpos anti-NRPl útiles por ejemplo para aplicaciones de diagnóstico. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-NRPl con las siguientes secuencias de cadenas pesadas: y ligeras: Cadena Pesada: QLVEESGGGLVTPGGTLTLTCTASGFTISNYHMS VRQAPGKGLEWIGIIYAVSAATWSA CDR1 CDR2 TWVKGRFTISKTLTTVDLKMTSLTAADTATYFCARVRAPGDSTYYDLWGPGTLVTVSSGQ CDR3 ; P APSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGL YSLSSWSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRWSTL PIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYT GPPREELSSRSVSLT C INGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCS VMHEALHNHYTQKSISRSPGK (SEQ ID N0:1) La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada es la siguiente: i QLVEESGGGLVTPGGTLTLTCTASGFTISNYHMSWVRQAPGKGLEWIGÍIYAVSAATWSA TWVKGRFTIS TLTTVDLKMTSLTAADTATYFCARVRAPGDSTYYDLWGPGTLVTVSS - (SEQ ID NO: 2) Las secuencias de aminoácidos de CDRs : de Kabat de la cadena pesada son las siguientes: CDR1 : NYHMS (SEQ ID NO: 3); CDR2 : IIYAVSAAT STWVKG (SEQ ID NO: 4) ; CDR3 : VRAPGDSTYYDL (SEQ ID NO: 5) .

Cadena Ligera: AWMTQTASPVSAWGGTVTINCQASQTIS NWLSWYQQKPGQPPKLLIYKASILA SGVP .

CDR1 1 CDR2 SRFSGSGSGTEFTLTISGVQCDDAATYYCLYGHYITTSAHNAFGGGTEVWKGDPV APTV CDR3 LIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCT YNLS STLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSWQSFNRGDC (SEQ ID N0:6) La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera es la siguiente: AVVMTQTASPVSAVVGGTVTINCQASQTISNNWLSWYQQKPGQPPKLLIYKASILASGVP SRFSGSGSGTEFTLTISGVQCDDAATYYCLYGHYITTSAHNAFGGGTEVWKGD (SEQ ID NO: 7) Las secuencias de aminoácidos de las CDRs de Kabat de la cadena ligera son las siguientes: CDR1: ' QASQTISNN LS (SEQ ID NO: 8); CDR2 : KASILAS (SEQ ID NO: 9); CDR3 : LYGHYITTSAHNA (SEQ ID NO: 10). ¡ En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-NRPl que comprende al menos una, dos, tres cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos ; SEQ ID NO: 4; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:8 (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos 'SEQ ID NO: 4; y (c) i HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5. En una modalidad, el anticuerpo comprende, HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5. En otra modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: ; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 5.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende' al menos una, al menos jdos, o todas las tres secuencias VL HVR seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia dé aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (b) HVR-L2 que comprende la .secuencia de aminoácidos de SEQ ID . NO: 9; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos, o todas las tres secuencias VH HVR seleccionadas de (i) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5; y (b) un dominio variable VL que comprende al menos una, al menos dos, o todas las tres secuencias VL HVR seleccionadas de (i) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y (c) HVR-L3 que comprende la , secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (b)': HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:4; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (d) HVR-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 10.

En otro aspecto, un anticuerpo ánti-N Pl que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, una secuencia VH que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 9,3%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) , inserciones, o deleciones respecto a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 2), pero un anticuerpo anti-NRPl que comprende esa secuencia retiene la capacidad para ligar a NRPl:. En ciertas modalidades, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, sustituciones, inserciones . o deleciones ocurren en regiones fuera de HVRs (es decir, en FRs) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-NRPl comprende las secuencias VH de SEQ ID NO: 2, incluyendo modificaciones post-traducción de esa secuencia. En una modalidad particular, la VH comprende uno, dos o tres HVRs seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la 'secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y (q) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-NRPl se proporciona, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%· identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En ciertas modalidades, una secuencia VL que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) , inserciones, o deleciones respecto a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 7), pero un anticuerpo anti-NRPl que comprende esas secuencia retiene ' la capacidad para ligar a NRP1. En ciertas modalidades, un total de 1 a 10 aminoácidos se ha sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 7. En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o deleciones ocurren en regiones fuera de HVRs (es decir en las FRs) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-NRPl comprende la secuencia VL en SEQ ID NO: 7, incluyendo las modificaciones post-traducción de esa secuencia. En una modalidad particular, VL comprende uno, dos b tres HVRs seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 8; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-NRPl se proporciona, en donde el anticuerpo comprende '¦ VH como en cualquiera de las modalidades anteriormente proporcionadas, y VL como cualquiera de las modalidades que se proporcionó anteriormente. En una modalidad, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 7, respectivamente, incluyendo modificaciones post-traducción de esas secuencias. ¡ En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que liga al mismo epítopo que un anticuerpo i anti-NRPl que aquí se proporciona. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un anticuerpo se proporciona que liga al mismo epítopo como un anticuerpo anti-NRPl que comprende un secuencias VH de SEQ ID NO: 2 y un secuencia VL de SEQ ID NO: 7.

En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-NRPl de acuerdo con las ; modalidades anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, i un anticuerpo anti-NRPl es un fragmento de anticuerpo, por e emplo, un Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo, o fragmento F(ab' )2- En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud íntegra, por ejemplo un anticuerpo IgGl intacto u, otra clase de anticuerpo o isotipo como se define aquí.

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-NRPl de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede incorporar cualquiera de las características, en forma sencilla o en combinación, como se describe en : las secciones 1-7 a continuación: i 1. Afinidad de Anticuerpo En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona tiene una constante dé disociación (Kd) de = 1 µ?, = 100 nM, < 10 nM, 1 nM, = 0.1 nM, < 0.01 nM, o = 0.001 nM (por ejemplo 10"8 M o menos, por ejemplo de 10"8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10"13 M) .

En una modalidad, Kd se mide por un ensayo de enlace de antígeno radio etiquetado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo. Afinidad de enlace de solución de Fabs para antígeno se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno etiquetado' (125I) en la presencia de una serie de titulación de antígeno sin etiquetar, después capturar el antígeno ligado con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer condiciones para el ensayo, placas de múltiples pozos MICROTITER* (Thermo Scientific) se revisten durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6),: y bloquean subsecuentemente con albúmina de suero bovino al; 2% (p/v) en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , 100 ?? o antígeno [125?] 26 ? se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con evaluación del anticuerpo anti^VEGF, Fab- 12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés después se incuba durante la noche;1 sin embargo, la incubación puede continuar por un más largo periodo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura . para Incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, por una hora) . La solución después se retira y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0.1% (TWEEN-20MR) en PBS . Cuando las placas se han secado, 150 µ?/???? de agente centellante (MICROSCINT -20^,- Packard) se agregan, y las placas se cuentan en un contador gama TOPCOUNTMR (Packard) por diez minutos. Concentraciones de cada Fab que dan menos que o igual a 20% de enlace máximo,, se eligen para utilizar en ensayos de enlace competitivo. I De acuerdo con otra modalidad, Kd se mide utilizando ensayos de resonancia plasmón de superficie utilizando BIACORE<S-2000 o un BIACORE e-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno, inmovilizado -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con hidrocloruro de W-etil-W - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8 , a 5 yg/ml (-0.2 µ?) antes de inyección a un gasto de flujo de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 : unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después dé la inyección de antígeno, etanolamina 1 M se inyecta para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones en serie dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con surfactante polisorbato 20 al 0.05% (TWEEN-20™) (PBST) a 25°C, a un gasto de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Constantes asociación (kon) y constantes de disociación (kQff) se calculan utilizando un modelo de enlace Langmuir simple uno-a-uno (BIACORE18 Soporte Lógico de Evaluación versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensorgramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio Kd) se calcula como la proporción k0ff/kon. Ver, por ¡ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) . Si la1 constante de afinidad excede 106 M"1 s"1 por el ensayo dé plasmón de superficie anterior, entonces la constante de afinidad puede determinarse al utilizar una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o decremento en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm paso de banda) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo pistón (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-AMINCOMR (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. 2. Fragmentos de anticuerpo En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona es un fragmento de anticuerpo. Fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, fragmentos Fab, Fab' , Fab' -SH, F (ab' , Fv, y scFv y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de ciertos i fragmentos de anticuerpo, ver Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003) . Para una revisión de fragmentos scFv, ver por ejemplo, Plückthün, en The Pharmacology de Antibodies monoclonals, vol . 113, Rosenburg y Moore eds : , (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); ver también O 93/16185; y las Patentes de los E.U.A. Números 5,571,894 y i 5,587,458. Para discusión de fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos epítopo de enlace a : receptor de recuperación y que tienen incrementada vida media in vivo, ver la Patente de los E.U.A. Número 5,869,046. ' Diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos I sitios de enlace antígeno que pueden ser ¡bivalente o i biespecíficos . Ver, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y ¡Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triacuerpos y tetracuerpos también se describen' en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., altham, MA; ver, por ejemplo, la Patente dé los E.U.A. Número 6,248,516 Bl) .

Fragmentos de anticuerpo pueden elaborarse por diversas técnicas, incluyendo pero no limitadas a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como producción por células hospederas recombinantes (por ejemplo1 E. coli o fago), como se describe aquí. | 3. Anticuerpos Quiméricos y Humanizados ¦ En ciertas modalidades, un anticuerpo ¡ que aquí se proporciona es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, én la Patente de los E.U.A. Número 4,816,567; y Morrisoh et al., Proc: Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, una rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un; mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "cambiado de clase" en donde la clase o subclase se ha cambiado de la del anticuerpo precursor. Anticuerpos quiméricos incluyen sus : fragmentos de enlace de antígeno.

En ciertas modalidades, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano es humanizado para reducir inmunogenicidad para los humanos, mientras que retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano precursor. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en donde HVRs, por ejemplo, CDRs, (o sus porciones) se derivan de un anticuerpo no humano, y FRs (o sus porciones) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá cuando menos una porción de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no; humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual los residuos HVRÍ se derivan) , por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de anticuerpo.

Anticuerpos humanizados y métodos para producirlos se realizan por ejemplo, en Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y además se describen, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); las Patentes de los E.U.A. Números 5,821,337, i 7,527,791, 6,982,321, y 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe injerto SDR (a-CDR) ) ; Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe "recubrimiento"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe "entremezclado FR"); y Osbourn et' al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cáncer, 83:252-260 i (2000) (que describe el "enfoque de selección guiada" a entremezclado FR) . i Regiones marco humanas que pueden emplearse para humanización incluyen pero no están limitadas a: regiones marco seleccionadas utilizando el método de "mejor ajuste" (ver, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones marco derivadas de la secuencia . consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular ; de regiones variables de cadena ligera o pesada (ver, por ejemplo, Cárter i et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones marco maduras humanas (somáticamente mutadas) o regiones marco de línea germinal humana (ver, pór ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco ¡derivadas de criba de biblioteca FR (ver, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chém. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)). 1 4. Anticuerpos Humanos En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona es un anticuerpo humano. Anticuerpos humanos pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la especialidad. Anticuerpos humanos se describen en general por Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol . 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) .

Anticuerpos humanos pueden ser preparados al administrar un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos, intactos o anticuerpos intactos con regiones variables ', humanas en respuesta a prueba antigénica. Estos animales típicamente contienen todo o una porción de los sitios de inmunoglobulina I humana que reemplazan los sitios de inmunoglobulina endógenos, o que están presentes extra cromosornalmente o integrados al azar en los cromosomas del animal . En estos ratones transgénicos , los sitios de inmunoglobulina endógenos i en general se han inactivado. Para revisión de \métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Ver también, por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. Números 6,075,181 y 6,150,584 que describen la tecnología XENOMOUSE ; Patente de los ' E.U.A. Número 5,770,429 que describen la tecnología HuMab® la Patente de los E.U.A. Número 041,870 que describen la tecnología K-M MOUSE®, y Publicación de la i Solicitud de Patente de los E.U.A. Número 2007/0061900, que describen la tecnología VelociMouse®) . Regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales además pueden ser modificadas por ejemplo, al' combinar con una región constante humana diferente. ! Anticuerpos humanos también pueden elaborarse por métodos basados en hibridoma. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos, se han descrito. (Ver, por ejemplo, Kozbor J. Immunol . , ,133: 3001 (1984)!; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc ., , New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: , 86 (1991)). Anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridoma dé células B humanas también se describen en Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionales incluyen aquellos descritos por ejemplo en la patente de los E.U.A. Número 7,189,826 (que describe producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandái Mianyixue, 26 (4 ): 265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano) . Tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe por Vollmers and Brandlein, Hístology and Histopathology, 20 (3 ): 927-937 (2005) y Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3) : 185-91 (2005).

Anticuerpos humanos también pueden generarse al aislar secuencias de dominio variable de clon Fv seleccionadas de bibliotecas de expresión fago, derivadas de humano. Estas secuencias de dominio variable pueden entonces combinarse con un dominio constante humano deseado. Técnicas para seleccionar anticuerpos humanos en bibliotecas de anticuerpo se describen a continuación. 5. Anticuerpos Derivados de Biblioteca.

Anticuerpos de la invención pueden ser aislados al cribar bibliotecas combinatorias por anticuerpos, con la o las actividades deseadas. Por ejemplo, una 'variedad de métodos se conocen en la técnica para generar bibliotecas de expresión en fago y cribar estas bibliotecas para anticuerpos que poseen las características de enlace deseadas. Esos métodos se revisan por ejemplo por Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien iet al., ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2001) y además se describen, por ejemplo por McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et a' l., J. Mol.

Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2) : 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34):; 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004) . .

En ciertos métodos de expresión en fago, repertorios de genes VH y VL se clonan por 1 separado por reacción de cadena polimerasa (PCR) y¡ recombinan aleatoriamente en bibliotecas fago, que entonces pueden cribarse por fago de enlace de antígeno como se1 describe por inter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (!l994) . Fagos típicamente exhiben fragmentos de anticuerpo, ; ya sea como fragmentos de cadena sencilla Fv (scFv) o como fragmentos Fab. Bibliotecas de fuentes inmunizadas ' proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin el requerimiento de construir hibridomas. En forma alterna, el repertorio sin tratamiento previo puede clonarse (por ejemplo, de humano) para proporcionar una fuente sencilla de anticuerpos a un amplio rango de antígenos no propios y I también propios sin ninguna inmunización como se; describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). í Finalmente, bibliotecas sin tratamiento previo también puéden hacerse sintéticamente al clonar segmentos de gen V sin rearreglar de células madre, y utilizar cebadores PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones altamente variables CDR3 y para lograr rearreglo in vi.tro como se describe por Hoogenboom and Winter, J. Mol. Bioi. , 227: 381- i 388 (1992) . Publicaciones de patente qué describen bibliotecas fago de anticuerpo humano incluyen por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 5,750,373, y las Publicaciones de Patente de los E.U.A. Números 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

Anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpo humano, aquí se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humanos. 6. Anticuerpos Multiespecifieos En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona es un anticuerpo multiespecifico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico . Anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de enlace para al menos dos sitios diferentes. En ciertas; modalidades, una de las especificidades de enlace es para NRP1 y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, t anticuerpos biespecíficos pueden ligar a dos epítopos diferentes de NRP1. Anticuerpos biespecíficos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos a; células que expresan NRP1. Anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra o¦ fragmentos de anticuerpo. ! i Técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen pero no están limitadas a co-expresión · recombinante de dos pares de cadena ligera-cadena ! pesada de inmunoglobulina que tienen diferentes especif cidades (ver, Milstein and Cuello^ Nature 305: 537 (1983)),! WO 93/08829, and Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) ) j e ingeniería de "botón en ojal" (knob-in-hole) (ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. Número 5,731,168).; Anticuerpos multiespecíficos también pueden elaborarse por efectos de dirección por ingeniería electroestática para producir moléculas heterodiméricas Fe de anticuerpo (WO 2009/089004A1) ; entrelazar dos o más anticuerpos o fragmentos (ver, por ejemplo, la Patente de los ¡E.U.A. Número 4,676,980, y Brennan et al., Science, 229: ' 81 (1985)); utilizando cremalleras leucina para producir anticuerpos biespecíficos (ver, por ejemplo, Kostelny jet al., J. Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992)) ; utilizando tecnología "diacuerpo" para producir fragmentos de¡ anticuerpo biespecíficos (ver, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)); !y utilizando dímeros Fv de cadena sencilla (sFv) (ver, por ej!emplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe por ejemplo en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticuerpos de ingeniería con tres1 o más sitios de enlace de antígeno funcionales, incluyendo i "anticuerpos Pulpo" también se incluyen aquí (ver, por ¦ ejemplo, US 2006/0025576A1) .

El anticuerpo o fragmento aquí también incluye "FAb de Acción Dual" o "DAF" que comprende un sitio! de enlace de antígeno que liga a NRP1 así como otro antigeno diferente (ver, US 2008/0069820, por ejemplo) . 7. Variantes de Anticuerpo En ciertas modalidades, variantes de ¡ secuencia de anticuerpo de los anticuerpos que aquí se proporcionan, se contemplan. Por ejemplo, puede ser conveniente el mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden prepararse al introducir modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que! codifica el anticuerpo o por síntesis de péptido. Éstas modificaciones incluyen por ejemplo deleciones de", y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción o sustitución puede hacerse para llegar a i la construcción final, siempre que la constricción final I posea las características deseadas, por ejemplo enlace de antígeno. i a) Variantes de Sustitución, Inserción y Deleción En ciertas modalidades, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácido. Sitios de interés para mutagénesis dé sustitución incluyen HVRs y FRs . Sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones I conservadoras" . Cambios más sustanciales se proporcionan en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ^ejemplares" y como se describe más á continuación con referencia a clases de cadenas laterales de aminoácidos. Sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un anticuerpo de interés y los productos cribarse por una actividad deseada , por ejemplo enlace de antígeno retenido/mejorado, disminuida inmunogenicidad o mejoradas ADCC o CDC.

TABLA 1 Aminoácidos pueden agruparse propiedades de cadena lateral común: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, i He; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, ¡Asn, Gln; i (3) acídico: Asp, Glu; 1 (4) básico: His, Lys, Arg; j (5) residuos que influencian orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Sustituciones no conservadoras involucrarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes1 resultantes seleccionadas para mayor estudio tendrán modificaciones (por ejemplo mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo incrementada afinidad, reducida inmunogenicidad) respecto al anticuerpo precursor y/o tendrán sustancialmente retenidas ciertas propiedades biológicas del anticuerpo precursor. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado de afinidad, que puede generarse convenientemente, por ejemplo utilizando técnicas de maduración de afinidad basadas en expresión en fago, tales como aquellas aquí descritas. Brevemente, uno o¦ más residuos HVR se mutan y los anticuerpos variantes se exhiben en fago y i criban para una actividad biológica particular jpor ejemplo, afinidád de enlace) . j Alteraciones (por ejemplo, sustituciones) pueden realizarse en HVRs, por ejemplo para mejorar la afinidad de anticuerpo. Estas alteraciones pueden hacerse1 en "puntos calientes" HVR, es decir residuos codificados por codones que se someten a mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (ver, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDRs (a-GDRs) , con la variante resultante VH o VL que se prueba para afinidad de enlace. Maduración de afinidad por construcción y reselección de bibliotecas secundarias, se ha descrito pór ejemplo en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ,' (2001)). En algunas modalidades de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para i maduración por- cualquiera de una variedad de 'métodos (por ejemplo PCR tendiente a error, entremezclado de cadena o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos) . Una biblioteca secundaria es entonces creada. La biblioteca después se criba para identificar cualesquiera variantes de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra enfoques dirigidos por HVR, en donde varios residuos HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a ¡ la vez) se aleatorizan. Residuos HVR involucrados en el enlace de antígeno pueden ser identificados específicamente, por ejemplo utilizando mutagénesis de barrido de! alaninas o modelado CDR-H3 y CDR-L3 en particular a menudo son objetivo. i En ciertas modalidades, sustituciones, inserciones o deleciones pueden ocurrir dentro de uno o más ;HVRs siempre que estas alteraciones no reduzcan sustancjialmente la capacidad del anticuerpo para ligar a ntígeno. Por ejemplo, alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones I conservadoras como aquí se proporciona) qué no reducen sustancialmente afinidad de enlace pueden elaborarse en HVRs. Estas alteraciones están fuera de los "puntos calientes" HVR o SDRs . En ciertas modalidades de las secuencias VH y VL variantes que aquí se proporcionan, cada HVR; ya sea está inalterado o no contiene más de una, dos o tres ! sustituciones de aminoácido.

Un método útil para identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden dirigirse para mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido, de alaninas" como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo > o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) se identifican y reemplazan por un aminoácido de carga neutra o negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo I con un antígeno se afecta. Mayores sustituciones pueden introducirse en las ubicaciones aminoácidos que demuestran ! sensibilidad funcional a la sustituciones iniciales. En forma ( alterna o adicional, una estructura de cristal de un complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos1 de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Estos residuos de contacto y residuos vecinos pueden dirigirse o eliminarse como candidatos para sustitución. Variantes pueden cribarse para determinar si contienen las propiedades deseadas .j Inserción de secuencia de aminoácidos incluye i fusiones terminales amino y/o carboxilo en el intervalo en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen 100 o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un pcjlipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo. b) Variantes de Glicosilación En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona se altera para incrementar o disminuir la extensión a la cual se glicosila el anticuerpo. Adición o deleción de sitios de glicosilación a un anticuerpo puede lograrse convenientemente al alterar la secuencia de ¡ aminoácidos tal que una o más sitios de glicosilación se crean o retiran. 1 Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato conectado puede ser alterado.! Anticuerpos nativos producidos por células de mamífero,; típicamente comprenden un oligosacárido ramificado de biantena que generalmente se conecta por un enlace N a Asn29¡7 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo mañosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc) , galactosa, y ácido siálico, así como una fucosa conectada a GlcNAc en el "tronco" de la éstructura de oligosacárido biantenaria. En algunas modalidades, modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención pueden realizarse a fin de crear 'variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

En una modalidad, se proporcionan ¡variantes de ¡ anticuerpo que tienen una estructura de. carbohidrato que carece de fucosa conectada (en forma directa o indirecta) en una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en ese anticuerpo puede ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de fucosa se determina al calcular la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena azúcar en Asn297, respecto a la suma de todas las glicoestructuras conectadas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, i híbridas y de alto contenido de mañosa) como ! se mide por i , espectrometría de masas MALDI-TOF como se ¡describe en WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo asparagina situado aproximadamente en la posición 297. en la región Fe (numeración Eu de los residuos región Fe) ; sin embargo, Asn297 también puede ubicarse a aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a menores variaciones de secuencia en anticuerpos . Éstas I variantes de fucosilación pueden tener función ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Patentes I de los E.U.A. Números US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/Ó093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Ejemplos de publicaciones relacionadas a variantes de anticuerpo "desfµs?3?^?3?" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108 ; O 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US '2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. ,336:1239-1249 t (2004); Yamane-Ohnuki et al. fiiotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lecl3 CHO deficientes en i fucosilación de proteína (Ripka et al. Arch. Blochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Solicitud de Patente de los E.U.A. Número 2003/0157108 Al, Presta, L; y Wp 2004/056312 Al, Adams et al., especialmente en el Ejemplo il) , y líneas de células con genes inoperativos tales como el gen alfa-1, 6-fucosiltransíerasa, FÜT8, células de genes inoperativos CHO (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotechi Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al . , Biotechnol. Bioeng'., 94(4): 680-688 (2006); y WO2003/085107) .

Variantes de anticuerpo además se proporcionan con oligosacáridos bisectados, por ejemplo en! donde un oligosacárido biantenarip conectado a la región Fe del anticuerpo se bisecta por GlcNAc. Éstas .variantes de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida' y/o función ADCC mejorada. Ejemplos de estas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de los E.U.A. Número 6,602,684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). Variantes de anticuerpo con al menos un residuo galactosa en el pligosacárido conectado a la región Fe también se proporcionan. Éstas i variantes de anticuerpo pueden tener función CDC mejorada. Éstas variantes de anticuerpo se describen por ejemplo en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S . ) ; y WO 1999/22764 (Raju, S.). ' c) Variantes de región Fe j En ciertas modalidades, una o más modificaciones de i aminoácido pueden introducirse en la región Fe de un i anticuerpo que aquí se proporciona, de esta manera generando i una variante de región Fe . La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo una región humana una región humana Fe IgGl , IgG2 , o IgG4 ) que comprende una modificación de aminoácidos ejemplo una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.

En ciertas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que le hacen un candidato, conveniente para aplicaciones en las que la vida media del' anticuerpo in vivo es importante, sin embargo ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o nocivas. Ensayos de citotoxicidad in vi tro y/o in ' vivo pueden conducirse para confirmar la reducción/agotamiento de actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, ensayos de enlace de receptor de Fe (FcR) pueden realizarse para , asegurar que el anticuerpo carece de enlace FcyR (por lo tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero retienen habilidad de enlace FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan sólo Fc(RIII, mientras que monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. Expresión FcR en células .hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 ; en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-492 (1991) . Ejemplos no limitantes de ensayos ih vitro para i estimar la actividad ADCC de una molécula dé interés se describen en la Patente de los E.U.A. Número 5,500,362 (ver, i por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proel Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (ver Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) .; En forma alterna, métodos de ensayos no radiactivos , pueden ser empleados (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™) para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) ; y ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96 (Promega, Madison, iWI) . Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC = Per.ipheral Blood Mononuclear Cells) y células Destructoras Naturales (NK = Natural Killer) . En forma alterna o adiciónalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo en un modelo de animal i tal como el descrito en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci .[ USA 95:652- i 656 (1998) . Ensayos de enlace Clq también pueden llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz! de ligar Clq y por lo tanto carece de actividad CDC. Ver, 'por ejemplo, ELISA de enlace Clq y C3c en WO 2006/029879 y WOl 2005/100402. Para estimar activación de complemento, puede realizarse un ensayo CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro1 et al., J.

Immunol. Methods 202:163 (1996) ;. Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)) . Enlace FcRn y determinaciones de vida I media/eliminación in vivo pueden también! realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica (ver, ¡por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12) : 1759-1769 (2006) ) . ; Anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de residuos de región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente de los E.U.A.

Número 6,737,056) . Estos mutantes Fe incluyen mutantes Fe con sustituciones en dos o más de posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante Fe así denominado "DANA" con sustitución de residuos 265 y 297 a alanina (Patente de los E.U.A. Número 7,332,581)1.

Ciertas variantes de anticuerpo con enlace disminuido o mejorado a FcRs se describen, (Ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. Número 6 ,737,056; WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (',2) : 6591-6604 (2001) ) .

En ciertas modalidades, una variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácido que mejoran ADCC, por ejemplo sustituciones en las i posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración de residuos EU) . ! En algunas modalidades, se hacen alteraciones en la región Fe que resultan en enlace Clq alterado (es decir, ya i sea mejorado o disminuido) y/o Citotoxicidad Dependiente de ! Complemento (CDC) , por ejemplo, como se describe en la Patente de los E.U.A. Número 6,194,551, WO| 99/51642, y Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)!.

Anticuerpos con vidas medias incrementadas y enlace mejorado al receptor Fe neonatal (FcRn) , que es responsable por la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se · describen en US2005/0014934A1 (Hintón et al.).

Aquellos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones que mejoran el enlace de la regi n Fe a FcRn. Estas variantes Fe incluyen aquellas con sustituciones en una o más de los residuos de región Fe : 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 3,62 , 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo sustitución de residuos de región Fe 434 (Patente de los E.U.A. Número 7,371,826).

Ver también Duncan & Winter, Na ture 322:738-40 (1988); Patente de los E.U.A. Número 5,648,260; Patente de los E.U.A. Número 5,624,821; y WO 94/29351 referentes a otros ejemplos de variantes de región Fe. ' d) Variantes de anticuerpo de ingeniería de cisteína En ciertas modalidades, puede ser conteniente crear anticuerpos de ingeniería de cisteína por ejemplo "tioMAbs" , en donde uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos cisteína. En modalidades particulares, los residuos sustituidos ocurren en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, grupos tiol reactivos de esta manera se ubican en sitios accesibles del anticuerpo y pueden emplearse para conjugar el anticuerpo con otras porciones, tales como porciones de fármacos o porciones de enlazador- fármaco, para crear un mmunoconj ugado , como se describe adicionalmente aquí. En ciertas modalidades, cualquiera uno o más de los siguientes residuos puede estar sustituido con cistéína: V205 (numeración Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de! la región Fe de cadena pesada. Anticuerpos de ingeniería; de cisteína pueden generarse como se describe por ejemplo en la Patente de los E.U.A. Número 7,521,541. e) Derivados de Anticuerpo En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona puede ser adicionalmente modificado 'para contener porciones no proteináceas adicionales que . se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Las porciones adecuadas para derivatización del anticuerpo incluyen pero no están limitadas a · polímeros solubles en agua.1 Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen pero no están limitados a polietilen glicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, ¡ poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero ¡de anhídrido etilen/maléico, poliaminoácidos (ya sea homppolímeros o copolímeros al azar) , y dextrano o poli (n-vinil pirrolidona) polietilen glicol, homopolímeros de propropileri glicol, co- ¡ polímeros de polipropilen óxido/etilen óxido, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , polivinil alcohol, y sus mezclas. Polietilen glicol propionaldehído; puede tener ventajas para fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, puede estar ramificado o sin ramificar. El número de polímeros conectados al anticuerpo puede variar y si más de un polímero se conecta pueden ser las mismas o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros empleados para derivatización ! puede determinarse con base en consideraciones incluyendo pero no limitadas a las propiedades o funciones1 particulares del anticuerpo a mejorar, ya sea que el 1 derivado de i anticuerpo se utilice en una terapia bajo condiciones definidas, etc. ¡ En otra modalidad, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y porción no proteínacea que pueden calentarse selectivamente por exposición a radiación. En una modalidad, la porción no proteínacea es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 1Í600-11605Í (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de orida e incluye I pero no está limitada a longitudes de onda qué no dañan a i células ordinarias, pero que calientan la ¡ porción no i proteínacea a una temperatura en la cual células próximas a la porción anticuerpo-no proteínacea, son exterminadas.

• B . Métodos y Composiciones Recombinantes Pueden producirse anticuerpos utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo como sé describe en la Patente de los E.U.A. Número 4,816,567. En uña modalidad, se proporciona ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-NRPl aquí descrito. Este ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que ¡ comprende la secuencia de aminoácidos VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo) . En una modalidad adicional, se proporcionan uno o más vectores '(por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden este ácido; nucleico. En una modalidad adicional, se proporciona una céljula hospedera que comprende este ácido nucleico. En una modalidad semejante, una célula hospedera comprende (por ejemplo se ha transformado con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un i primer vector que comprende un ácido nucleico :que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende '· la VL del i anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido i nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que I comprende la VH del anticuerpo. En una modalidad, la célula i hospedera es eucariótica, por ejemplo una célula | de Ovario de Hámster Chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20) . En una modalidad, un método para producir un anticuerpo anti-NRPl se proporciona, en donde el método comprende cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporcionó anteriormente, bajo condiciones adecuadas para expresión del anticuerpo y opcionalmente ¡recuperar el anticuerpo de la célula hospedera (o el medio :de cultivo de célula hospedera) . ; Para producción recombinante de un anticuerpo anti- ? NRP1, ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo como se describió anteriormente, se aisla e inserta en uno o más vectores para mayor clonación y/o expresión , en una célula hospedera. Este ácido nucleico puede aislarse fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas oligonucleótido qué son capaces de ligar específicamente genes que codifican' las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo) . ¡ Células hospederas convenientes para¡ clonación o expresión de vectores que codifican anticuerpo, incluyen células procarióticas o eucarióticas aquí descritas . Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos en bacterias, en particular cuando no se requiere glicosilacion y función efectora Fe. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo las Patentes de los E.U.A. Números 5,648,237, 5,789,199, y 5,840,523. (Ver también Charlton, Methods in Molecular Bíology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de expresión, el anticuerpo puede aislarse de I i la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y i puede ser adicionalmente purificado. i Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentos o levadura son hospederos convenientes de clonación o expresión para vectores que codifican anticuerpo, incluyendo cepas de levaduras y ¡ hongos cuyas rutas de glicosilacion se han "humanizado" resultando en la i producción de un anticuerpo con patrón de glicosilacion i parcial o totalmente humano. Ver, Gerngross, Nat. Biotech . 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) . 1 I Células hospederas convenientes para ! expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . ! Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas de baculovirus se han identificado . i que pueden emplearse en conjunto con células ¡dé insectos, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda . ¡ Cultivos de células de plantas tambiéin pueden ser í empleados como hospederos. Ver, por ejemplo, las Patentes de los E.Ü.A. Números 5,959,177, 6,040,498,1 .6,420,548, 7,125,978, y 6,417,429 (que describen | tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas) . " Células de vertebrados también pueden emplearse como hospederos. Por ejemplo, líneas celulares, de mamíferos que se adaptan para crecer en suspensión, pueden ser útiles.

Otros ejemplos de líneas de células hospederas, de mamíferos i útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7) ; líneas de riñon embriónico humano (293 o células 293 como se describe por ejemplo en Graham et al., J.

Gen Virol. 36:59 (1977)}; células de riñon de¡ hámster bebé i (BHK = Baby Hámster Kidney) ; células sertóli de ratón (células TM4 como se describe por ejemplo en Mather, Biol.

Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-7¿) ; células de I carcinoma cervical humano (HELA) ; células de ¡ riñon canino (MDCK) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A) ; células de i pulmón humano (W138) ; células de hígado humano (Hep G2) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562) ; células ] TRI como se í describe por ejemplo en Mather et al., Armáis ?.?. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. i Otras líneas celulares hospederas de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) incluyendo células DHFR" CHO I (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y línea celulares de mieloma tales como YO, NSO y¡Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares hospederas de mamífero para la producción de anticuerpos, ver, ! por ejemplo, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Voll 248 (B.K.C.

Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ) , pp. 255-268 (2003) .

C . Ensayos Anticuerpos anti-NRPl que aquí se! proporcionan pueden ser- identificados, cribados por o caracterizados por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de enlace y otros ensayos En un aspecto, un anticuerpo de la invención se prueba por su actividad de enlace de antígeno por ejemplo por métodos conocidos tales como ELISA, transferencia Western, etc.

En otro aspecto, pueden emplearse ensayos de competencia para identificar un anticuerpo qué compite con cualquiera de los anticuerpos de la invención ; para ligar a NRPl (por ejemplo, anticuerpo anti-NRPl 7130 descrito a I continuación)'. En ciertas modalidades, este anticuerpo de competencia liga al mismo epítopo (por ejemplo un epltopo j lineal o de conformación) que se enlaza por cualquiera de los anticuerpos de la invención (por ejemplo anticuerpo anti-NRPl ? 7130 descrito a continuación) . Métodos ejemplares detallados para mapear un epítopo al cual liga un anticuerpo, se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Erotocols" , en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) . ¡ En un ensayo de competencia ejemplar, NRPl inmovilizado se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo etiquetado que liga a NRP1 :(por ejemplo, anticuerpo anti-NRPl 7130 descrito a continuación) y un segundo anticuerpo no etiquetado 'que se prueba por su habilidad para competir con el primer anticuerpp para enlace a NRP1. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como un control, NRPl inmovilizado se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo etiquetado pero no el segundo anticuerpo no etiquetado. Después de incubación bajo condiciones que permiten ligar al primer anticuerpo a NRP1, anticuerpo no ligado 'en exceso se retira y la cantidad de etiqueta asociada con NRP1 inmovilizado se mide. Si la cantidad de etiqueta] asociada con NRP1 inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de i prueba respecto a la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo para ligar a NRP1. Ver Harlow and Lañe (1988) Antibodies : A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . j 2. Ensayos de Detección \ En un aspecto, se proporcionan nsayos para I identificar anticuerpos anti-NRPl útiles para detectar la presencia de NRP1, por ejemplo en ¡ensayos de inmunohistoquímica. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención se prueba para dicha actividad. b. Inmunoconjugados i La invención también proporciona inmunoconj ugados que comprenden un anticuerpo anti-NRPl aquí conjugado con uno o más agentes tales como isótopos radiactivos. j En una modalidad, un inmunoconjugado ' comprende un anticuerpo como se describe aquí, conjugado con un átomo radiactivo para formar un radioconjugado . Una' variedad de i isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconj ugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I1;25, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconj ugado se emplea para detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios gammagráficos , por ejemplo tc99m o 1123, o una etiqueta espín para formación de imagen por resonancia magnética nuclear (NMR = Nuclear i Magnetic Resonance) (también conocido como formación de imagen por resonancia magnética, mri = magnet'ic resonance i imaging) , tales como yodo-123 de nuevo, yodo-13Í, indio-111, flouro-19, carbono- 13, nitrógeno- 15 , oxígeno- 17·, gadolinio, manganeso o hierro. \ E . Métodos y Composiciones para Diagnóstico y Detección i En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-NRPl que aquí se proporcionan,' son útiles para detectar la presencia de NRP1 en una muestra biológica. El término "detectar" como se emplea aquí, abarca detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido de pacientes normales o con cáncer, tales como por ejemplo tejido normal o canceroso de mama, colon, pulmón, riñon, hueso, cerebro, estómago, páncreas, vejiga, ovarios, útero así como tejido de corazón, embriónico y de placenta.

En una modalidad, se proporciona anticuerpo anti-NRPl para utilizar en un método para diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método i para detectar la presencia de NRP1 en una muestra biológica. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-NRPl como se describe aquí bajo condiciones que permiten ligar el ! anticuerpo anti-NRPl a NRP1, y detectar si un complejo se i forma entre el anticuerpo anti-NRPl y NRP1. Este método. puede ser un método in vitro o in vivo. En una modalidad, un i anticuerpo anti-NRPl se emplea para seleccionar sujetos i elegibles para terapia con un anticuerpo anti-NRPl, por i ejemplo en donde NRPl es un biomarcador para ¡selección de pacientes. - ' En ciertas modalidades, se proporcionaíi anticuerpos anti-NRPl etiquetados. Etiquetas incluyen pero no están limitadas a etiquetas o porciones que se detectan directamente (tales como etiquetas fluorescentes, cromofóricas, densas en electrones, quimioluminiscentes y I I I í radiactivas) , así como porciones tales corho enzimas o ligandos que se detectan directamente, por ejemplo a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Etiquetas ejemplares incluyen pero no están limitadas a los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona,! luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferása bacteriana (Patente de los E.U.A. Número 4,737,456), luciferina, 2, 3-dihidroftalazindionas , peroxidasa de rábano picante (HRP) , ¡ fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfatasa dehidrogenas,a, . oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido ¡ de hidrógeno para oxidar un precursor decolorante tal! como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidiha, etiquetas espín, etiquetas de bacteriófago, radicales libres estables y semejantes. ¡ Se entiende que cualquiera de los métodos anteriores para diagnóstico y/o detección, pueden llevarse a cabo utilizando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-NRPl. i III. EJEMPLOS j Los siguientes son ejemplos de ¡ métodos y composiciones de la invención. Se entiende que diversas otras modalidades pueden practicarse, dada la descripción general que se proporcionó anteriormente . j Ejemplo 1 Generación de anticuerpos monoclonales de conejo an i-NRPl ! 20 pg de antígeno NRPl soluble humanó se inyectan en conejos blancos de Nueva Zelanda, utilizando antígeno: adyuvante completo de Freund 1:1, seguido por ¡refuerzo cada semana salteada con 100 g de antígeno NRPl soluble humano por conejo. El bazo de uno de los conejos se cortó y fusionó a células de mieloma de conejo utilizando técnicas estándar.

Los sobrenadantes de hibridoma resultantes se cribaron por ELISA utilizando antígeno NRPl soluble y los clones positivos fueron adicionalmente cribados por reactividad jen células de riñon embriónico humano HEK-293 transfectadas con NRPl humano i o vector vacío (control) . Clones candidatos fueron i explantados, subclonados por dilución limitante -y probados de nuevo por ELISA como con anterioridad. Anticuerpo anti-NRPl monoclonal 7130 se obtuvo y secuenció. Las secuencias de cadena pesada y ligera son las siguientes: ¡ Cadena Pesada : . i QLVEESGGGLVTPGGTLTLTCTASGFTISNYHMSWVRQAPGKGLEWIGIIYAVSAATWSA PKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTW SGTLTNGVRTFPSVRQSSGL YSLSSWSVTSSSQPVTC VAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDVSQDDPEVQFT YI EQVRTARPPLRÉQQFNSTIRWSTL VMHEALHNHYTQKSISRSPGK (SEQ ID NO: 1) Cadena Ligera: ¡ AWMTQTASPVSAWGGTVTINCQASQTIS NWLSWYQQKPGQPPK¿LIYKASII-ASGVP i CDR1 . CDR2 LIFP AADQVATGTV IVCVANKYFPDVTVTWE DGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLS STLTLTSTQYNSHKEYTC VTQGTTSWQSFNRGDC (SEQ ID NO: 6) Ejemplo 2 Inmunohistoquimica utilizando anticuerpo monoclonal i an i- RPl ¡ Se realizó inmunohistoquimica (IHC) eri secciones de i tejido recientemente cortadas siguiendo j rocedimiento i estándar. Secciones de tejido se incubaron cpn anticuerpo primario (anticuerpo anti-NRPl monoclonal 7130) a 1 µ9/p?1 seguido por lavados estándar y detección secundaria con anticuerpo de cabra biotinilada anti-conejo (Vector lab) y Vectastain'" ABC-HRP Elite. La especificidad del anticuerpo anti-NRPl se estimó utilizando células HEK-293 jtransfectadas con NRP1 humano y vector vacío. como control (ver Figuras 1A y IB) . Para estimar expresión, secciones ¡ enteras se calificaron en forma semicuantitativa en una escala de cero (sin expresión) a tres (muy fuerte señal) de acuerdo con la intensidad de deposición de cromágeno en =10|% de células neoplásticas o endotelio. Las Figuras 1C y ID muestran IHC de secciones de tejido de riñon normal y placenta normal, respectivamente, teñidas con anticuerpo anti-NRjPl monoclonal 7130.. La Figura 2A-C muestra IHC de secciones de tejido teñidas con anticuerpo anti-NRPl monoclonal 7130¡ de pacientes ¡ de cáncer colorectal, cáncer de mama y cáncer pulmonar de I células no pequeñas, respectivamente. ¡ Aunque la invención anterior se haj descrito en cierto detalle a manera de ilustración y 'ejemplo para propósitos de claridad y comprensión, las descripciones y ejemplos no habrán de considerarse como limitantes del alcance de la invención. Las descripciones i de toda la i literatura de patentes y científica aquí sé incorporan expresamente en su totalidad por \ referencia.

Claims (17)

i 72 REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que liga a j neuropilina-1 (NRP1) , en donde el anticuerpo comprende ( HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, (b) HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, y (c) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5. i

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende (a) i HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ | ID NO: 8; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos i de SEQ ID NO: 10. ¡ I

3. Un anticuerpo aislado que liga a |neuropilina-1 (NRP1) , en donde el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ que comprende la secuencia de aminoácidos HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10. i

4. Un anticuerpo aislado que liga a ¡neuropilina-1 (NRP1) , en donde el anticuerpo comprende (a) una' secuencia VH que tiene al menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (b) uná secuencia VL que tiene al menos una identidad de secuencia] de 95% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; o (c) juna secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b) .

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 2.

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende una I secuencia VL de SEQ ID NO: 7. >

7. Un anticuerpo aislado que liga a j neuropilina-1 (NRP1) , caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID NO: 2 y una secuencia VL de SEQ ID NO: 7. ;

8. El anticuerpo de conformidad con ¡cualquiera de las reivindicaciones 1-7, un anticuerpo IgGl.

9. El anticuerpo de de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque es un I fragmento de anticuerpo que liga a neuropilina. j

10. Un ácido nucleico aislado quej codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7. j

11. Una célula hospedera que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10.

12. Un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación i 11, de manera tal que se produce el anticuerpo, j

13. Un inmunoconjugado que comprende iel anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

14. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para utilizar en j detectar la presencia de NRPl en una muestra biológica. ¡

15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la detección de la presencia de NRPl es por inmunohistoquímica . ¡

16. Un método para detectar una muestra biológica, caracterizado en contacto la muestra biológica con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y i detectar la presencia del anticuerpo ligado. ¡ i

17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la presencia de NRPl s;e detecta por I inmunohistoquímica.