CN105237637B - 抗人神经纤毛蛋白1的单域抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

抗人神经纤毛蛋白1的单域抗体及其制备方法，属于基因工程和抗体工程技术领域。制备方法：克隆抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因，并将其导入载体，构建重组载体；将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的重组工程菌；将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗人神经纤毛蛋白1单域抗体。以抗人神经纤毛蛋白1单克隆抗体杂交瘤细胞株A6为模板，RT‑PCR克隆获取该抗体的重链可变区基因(V_H)；将其导入质粒载体pET‑22b(+)，构建重组载体pET‑22b(+)‑V_H；将重组载体导入表达菌株E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导人神经纤毛蛋白蛋白1单域抗体的表达，然后纯化与鉴定。

Description

抗人神经纤毛蛋白1的单域抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程和抗体工程技术领域，涉及一种抗人神经纤毛蛋白1的抗体，尤其是涉及一种抗人神经纤毛蛋白1的单域抗体及其制备方法。

背景技术

目前已有多种单克隆抗体应用于一些恶性肿瘤的临床治疗，但是抗体药物在治疗应用中仍然存在不少局限。首先，完整抗体本身分子量比较大，不易穿透达到实体瘤内部。其次，单克隆抗体的免疫原性强，在治疗过程中存在毒副作用，如鼠源性的单抗在人体内反复使用可诱发人抗鼠抗体(Human anti-murine antibody，HAMA)反应。再者，完整抗体Fc段的存在可使其与体内具有Fc受体的非特异组织细胞结合，影响其靶向效果。另外，单克隆抗体规模化生产耗时长，抗血清规模化生产不能保证市场需求而且质量不稳定。因此，研究相关特异性强、免疫原性低、可规模化生产的抗体具有重要意义(1.甄永苏，绍荣光主编.抗体工程药物[M].北京：化学工业出版社，2002.)。而小型化抗体能克服上述不足，目前已经成功构建的小分子抗体主要有以下几种形式：抗原结合片段(antigen binding fragment，Fab)、单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)、单域抗体(single-domainantibody，sdAb)等。(2.Holliger P,Hudson PJ.Engineered antibody fragments andthe rise of single domains[J].Nat Biotechnol,2005,23(9):1126-1136；3.Zhang JB,Li QG,Nguyen TD,et al.A pentavalent single-domain antibody approach to tumorantigen discovery and the development of novel proteomics reagents[J].J MolBiol,2004,341:161–169；4.Hudson PJ,Kortt AA.High avidity scFv multimers,diabodies and triabodies[J].J Immunol Methods,1999,231:177–190；5.TodorovskaA,Roovers RC,Dolezal O,et al.Design and application of diabodies,triabodiesand tetrabodies for cancer targeting[J].J Immunol Methods,2001,248:47–66.)其中单域抗体仅由重链可变区(V_H)或轻链可变区(V_L)构成，分子量约为完整抗体的1/12，具有结构单一、免疫原性低、穿透力强、特异性和亲和力高、稳定性好、易克隆、高表达、便于纯化等诸多优点。因此，单域抗体适合进行商品化大规模生产，可作为生物传感器诊断用靶标试剂，可用于构建免疫融合物进行靶向治疗，应用于临床可减少治疗过程中的毒副作用。总之，单域抗体作为一种小型化的基因工程抗体，独特的理化和生物学特性使其在基础研究、药物开发和疾病诊断治疗等领域具有广阔的应用前景。

神经纤毛蛋白1(Neuropilin-1，简称NRP-1)是细胞表面的I型跨膜糖蛋白，其相对分子质量为130kDa，由位于染色体10p12的基因编码。NRP-1基因的开放阅读框由17个外显子和16个内含子组成(6.Rossignol M,Gagnon ML,Klagsbrun M.Genomic organizationof human neuropilin-1and neuropilin-2genes:identification and distribution ofsplice variants and soluble isoforms[J].Genomics,2000,70:211-222.)。NRP-1在脊椎动物中高度保守，由胞内区、跨膜区和胞外区三部分组成，其中胞外段包括860个氨基酸，由3个不同的结构域组成，分别称为a1a2结构域、b1b2结构域和c结构域。a1a2结构域位于第27个到第264个氨基酸，又称为CUB结构域，b1b2结构域位于第274个到第583个氨基酸，其与凝血因子V和VIII的结构相似且同源，c结构域位于第650个到803个氨基酸，其中部含有MAM结构域。NRP-1胞外段的3个结构域能与不同的分子结合，介导不同的信号传导。近年来的研究表明，作为多功能共受体的NRP-1参与血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胎盘生长因子、血小板衍生生长因子等多种生长因子的信号传递，在血管生成、发育以及肿瘤的生长、转移等过程中起着重要作用，与肿瘤的进展和预后等密切相关，提示NRP-1可作为恶性肿瘤诊断和预后的靶点。(7.S.Rizzolio andL.Tamagnone.Multifaceted role of neuropilins in cancer[J].Current MedicinalChemistry,2011,18:3563–3575；8.Camille Grandclement and ChristopheBorg.Neuropilins:A New Target for Cancer Therapy[J].Cancers,2011,3:1899–1928；9.Adrian M Jubb,Laura A Strickland,Scot D Liu,et al.Neuropilin-1expression incancer and development[J].J Pathol,2012,226:50–60.)另一方面，越来越多的研究人员采用不同的方法和技术手段靶向NRP-1进行了肿瘤的治疗研究。如针对NRP-1的siRNA，多肽，可溶性NRPs拮抗剂，以及单克隆抗体等。这些临床前研究结果显示，阻断NRP-1能通过抑制血管生成以及在某些肿瘤模型中通过直接抑制肿瘤细胞增殖的方式抑制肿瘤的生长。表明NRP-1能作为一个重要的有效靶点用于抗血管生成和抗肿瘤治疗研究以及潜在的临床应用(10.Pan Q,Chanthery Y,Liang WC,et al.Blocking neuropilin-1function has anadditive effect with anti-VEGF to inhibit tumor growth[J].Cancer Cell,2007,11:53-67；11.Grandclement C,Borg C.Neuropilins:a new target for cancer therapy[J].Cancers,2011,3:1899-928.)。

基于抗体针对肿瘤相关靶点的靶向策略在肿瘤的诊断和治疗中发挥着重要作用。美国genentech公司制备了针对NRP-1的高亲和性单克隆抗体anti-NRP1A(靶向NRP-1a1a2结构域)和anti-NRP1B(靶向NRP-1b1b2结构域)，研究报道表明，这两种抗NRP-1单抗抑制VEGF刺激引起的HUVEC细胞迁移和肿瘤模型中肿瘤的形成。(12.Liang W-C,Dennis MS,Stawicki S,et al.Function blocking antibodies to neuropilin-1generated from adesigned human synthetic antibody phage library[J].Journal of MolecularBiology,2007,366:815-29.)然后，他们发现抗NRP-1单抗能阻断VEGF与NRP-1的结合，而且能与抗VEGF治疗协同抑制肿瘤的生长。(10.Pan Q,Chanthery Y,Liang WC,etal.Blocking neuropilin-1function has an additive effect with anti-VEGF toinhibit tumor growth[J].Cancer Cell,2007,11:53-67.)在此基础上，genentech公司开发了一种完全人源化的NRP-1单抗MNRP1685A，且通过采用单独的MNRP1685A或与贝伐单抗(+紫杉醇)联合应用治疗进展期实体瘤的方案完成了I期临床试验。(11.Grandclement C,Borg C.Neuropilins:a new target for cancer therapy[J].Cancers,2011,3:1899-928.)鉴于NRP-1在恶性肿瘤发生发展过程中的重要作用，本申请人也自主通过基因工程技术结合杂交瘤的方法筛选获得了能与人NRP-1b1b2结构域高亲和特异性结合的鼠抗人NRP-1单克隆抗体，一系列的研究数据表明，该单抗在多种肿瘤模型中发挥抑制肿瘤细胞生长、粘附、迁移、侵袭、肿瘤血管生成以及移植瘤生长等多种抗肿瘤效应(13.Li X,Luo F,WangS,et al.Monoclonal antibody against NRP-1b1b2[J].Hybridoma,2011,30:369-373；14.Chen L,Miao W,Tang X,et al.Inhibitory effect of neuropilin-1monoclonalantibody(NRP-1MAb)on glioma tumor in mice[J].Journal of BiomedicalNanotechnology,2013,9:551-558；15.Zeng F,Luo F,Lv S,et al.A monoclonalantibody targeting neuropilin-1inhibits adhesion of MCF7breast cancer cellsto fibronectin by suppressing the FAK/p130cas signaling pathway[J].AnticancerDrugs,2014,25:663-672.)。

因此，基于上述单域抗体的独特优势和抗人NRP-1抗体的研究开发现状，制备抗人NRP-1的单域抗体具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一目的在于提供抗人神经纤毛蛋白1单域抗体。

本发明的另一目的在于提供抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的制备方法。

所述抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)为：

所述抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的基因序列(SEQ ID NO.4)为：

其中，第13～351位核苷酸为抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因(即重链可变区基因，V_H)，共339bp；第352～357位核苷酸为Xho I酶切位点，共6bp；第358～375位核苷酸为6×His标签基因，共18bp。

所述抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的制备方法包括以下步骤：

1)克隆抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因(即重链可变区基因，V_H)，并将其导入载体，构建重组载体；

2)将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的重组工程菌；

3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗人神经纤毛蛋白1单域抗体。

在步骤1)中，所述克隆抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因的模板来自本实验室筛选得到的抗人神经纤毛蛋白1单克隆抗体的杂交瘤细胞株A6，所述杂交瘤细胞株A6已于2015年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO:C2015186；

所述克隆抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因(即重链可变区基因)的引物为：

5′端引物：5′-CATGCCATGGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′

3′端引物：5′-CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3′；

所述载体可为pET-22b(+)质粒。

在步骤2)中，所述宿主细菌可为E.coli BL21(DE3)。

在步骤3)中，所述纯化可采用亲和层析。

本发明以抗人神经纤毛蛋白1单克隆抗体杂交瘤细胞株A6为模板，RT-PCR克隆获取该抗体的重链可变区基因(V_H)；将其导入质粒载体pET-22b(+)，构建重组载体pET-22b(+)-V_H；将重组载体导入表达菌株E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导人神经纤毛蛋白蛋白1单域抗体的表达，然后对其进行纯化与鉴定。基于单域抗体的独特优势和抗人神经纤毛蛋白1抗体的研究开发现状，制备抗人神经纤毛蛋白1单域抗体具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因(即重链可变区基因，V_H)的PCR产物电泳图。在图1中，1为DNA分子量标记(DNA Marker)，2为重链可变区基因(V_H)的PCR产物；1500、1000、700、500、300、100为DNA分子量标记的大小(单位：bp)。

图2为纯化后的抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的SDS-PAGE电泳图。在图2中，1为纯化后的抗人神经纤毛蛋白1单域抗体，2为蛋白分子量标记(Protein Marker)，116.0、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4为蛋白分子量大小(单位：kDa)。

图3为抗人神经纤毛蛋白1单域抗体原核表达后的SDS-PAGE电泳图。在图3中，1为未经IPTG诱导的空载体菌蛋白，2为经IPTG诱导后的菌蛋白，3为经IPTG诱导菌的超声破碎沉淀，4为经IPTG诱导菌的超声破碎上清液，5为蛋白分子量标记(Protein Marker)，116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4为蛋白分子量大小(单位：kDa)；A为目标蛋白条带。

图4为抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的生物学活性鉴定结果。在图4中，横坐标为抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的稀释度，纵坐标为波长为490nm处的吸光值(OD_490nm)，标记◆为包被融合蛋白NRP-1b1b2；■为包被人胃癌细胞BGC-823总蛋白提取物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1：抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因(即重链可变区基因，V_H)的克隆

(1)所用细胞和鼠源性抗人神经纤毛蛋白1单克隆抗体

抗人神经纤毛蛋白1单克隆抗体杂交瘤细胞株由厦门大学医学院抗癌研究中心研制。上述细胞常规培养在10％胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640培养基中，于37℃，5％CO₂培养。

(2)引物设计

由于要扩增的抗体可变区基因序列，其CDR序列是未知的，故本发明使用的引物采用国际上推广的引物序列。

在V_H引物的5'端加入酶切位点Nco I：CATGCCATGG(含保护性碱基CATG)，在V_H引物的3'端加入酶切位点Xho I：CCGCTCGAG(含保护性碱基CCG)。

扩增重链可变区的引物为：

V_H5'端引物(SEQ ID NO.1)：5′-CATGCCATGGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′(注：S＝G,C；M＝A,C；R＝A,G；W＝A,T)

V_H3'端引物(SEQ ID NO.2)：5′-CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3′

(3)V_H基因的克隆

取状态良好的杂交瘤细胞株，采用(Invitrogen)试剂，按照说明书上的方法提取总RNA，以总RNA为模板，以Oligo(dT)20(TOYOBO)为随机引物，逆转录成cDNA。以Oligo(dT)20为随机引物进行逆转录(RT-PCR)的方案如下：

RT-PCR反应体系：5×AMV缓冲液4.0μL；dNTP(10mmol/L)1.0μL；Oligo(dT)20随机引物(20μmol/L)2.0μL；RNase抑制剂0.5μL；总RNA 5.0μL；AMV逆转录酶1.0μL；DEPC水6.5μL；总体积20μL。

反应条件：50℃，60min；75℃，15min。反应产物于-20℃保存备用。

然后，以RT-PCR扩增的cDNA为模板，常规PCR扩增V_H基因。

扩增体系：10×PCR缓冲液2.5μL；dNTP(10mmol/L)0.5μL；5'端引物(20μmol/L)1.0μL；3'端(20μmol/L)1.0μL；cDNA 1.0μL；Taq聚合酶0.5μL；双蒸水18.5μL；总体积25.0μL。

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后观察分析结果(参见图1)。并用胶纯化回收试剂盒(OMEGA)回收V_H基因产物。

实施例2：抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因的表达载体构建

用胶纯化回收试剂盒(OMEGA)纯化V_H基因产物，然后V_H基因产物以及pET-22b(+)质粒(Novagen)分别用限制性内切酶Nco I和Xho I(NEB)消化，胶回收。在T4DNA连接酶(NEB)的催化下，将抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因(V_H基因)克隆至质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pET-22b(+)-V_H，转化E.coli BL21(DE3)，PCR筛选阳性克隆并送上海英骏生物技术有限公司测序。

实施例3：抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因的原核表达和纯化

挑选测序正确的含有pET-22b(+)-V_H重组质粒的E.coli BL21(DE3)单菌落，37℃振荡培养过夜，按1∶100稀释到LB培养液中，振荡培养至OD_600nm值约0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG(Sigma)诱导表达4h。收集菌体进行SDS-PAGE电泳，经过染色、脱色，发现E.coli BL21(DE3)的表达产物在16kDa处有明显的条带，与预期的目的蛋白带大小一致，表明抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因获得了表达(参见图2)。

SDS-PAGE电泳结果还显示，抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因的原核表达产物绝大部分出现在超声沉淀中，说明融合蛋白主要以包涵体的形式存在(参见图3)。包涵体经处理后，过Ni²⁺亲和柱，用洗脱液洗下亲和蛋白，胶上几乎只出现1条蛋白质条带，说明经亲和层析纯化到较高纯度含6×His的融合蛋白。经凝胶成像(Quantity One-4.6)分析显示其纯度达到90％以上。采用逐步透析法对纯化的蛋白进行复性，复性蛋白回收率约为50％，通过紫外分光光度计扫描，根据公式蛋白质浓度＝1.45OD_280nm-0.74OD_260nm，测得纯化后的蛋白样品浓度为0.75mg/mL。

实施例4：抗人神经纤毛蛋白1单域抗体(sdAb)的活性鉴定

采用ELISA测定抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的生物学活性。分别将本实验室制备的融合蛋白NRP-1b1b2和人胃癌细胞BGC-823总蛋白提取物包被于96孔板，100μL/孔，4℃过夜。用1％的明胶封闭2h，用PBST洗板5次，每孔加入倍比稀释的融合蛋白(即抗人神经纤毛蛋白1单域抗体)100μL。同时以pET-22b(+)空载体诱导表达产物为阴性对照，37℃放置1h，用PBST洗涤液洗5次后，加入鼠抗6×His抗体(Sigma)，37℃放置1h，用PBST洗涤液洗3次，再加HRP标记的羊抗鼠IgG(Sigma)，37℃放置45min，再用PBST洗5次，加入OPD底物溶液，37℃避光放置15min，加终止液(2M H₂SO₄溶液)终止反应，酶标仪读取波长490nm处的吸光值(即OD_490nm)(参见图4)。

本发明以抗人神经纤毛蛋白1单克隆抗体杂交瘤细胞株A6为模板，RT-PCR克隆获取该抗体的重链可变区基因(V_H)；将其导入质粒载体pET-22b(+)，构建重组载体pET-22b(+)-V_H；将重组载体导入表达菌株E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导人神经纤毛蛋白蛋白1单域抗体的表达，然后对其进行纯化与鉴定。本发明所述抗人神经纤毛蛋白1单域抗体具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。基于单域抗体的独特优势和抗人神经纤毛蛋白1抗体的研究开发现状，制备抗人神经纤毛蛋白1单域抗体具有广阔的应用前景。

Claims (6)

1.抗人神经纤毛蛋白1单域抗体，其特征在于其氨基酸序列为：

2.抗人神经纤毛蛋白1单域抗体，其特征在于其基因序列为：

其中，第13～351位核苷酸为抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因(即重链可变区基因，V_H)，共339bp；第352～357位核苷酸为Xho I酶切位点，共6bp；第358～375位核苷酸为6×His标签基因，共18bp。

3.如权利要求1或2所述抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)克隆抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因，即重链可变区基因，V_H，并将其导入载体，构建重组载体；

所述克隆抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因的模板来自抗人神经纤毛蛋白1单克隆抗体的杂交瘤细胞株A6，所述杂交瘤细胞株A6已于2015年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO:C2015186；

所述克隆抗人神经纤毛蛋白1单域抗体基因，即重链可变区基因的引物为：

5′端引物：5′-CATGCCATGGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′

3′端引物：5′-CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3′；

2)将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的重组工程菌；

3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗人神经纤毛蛋白1单域抗体。

4.如权利要求3所述抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述载体为pET-22b(+)质粒。

5.如权利要求3所述抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述宿主细菌为E.coli BL21(DE3)。

6.如权利要求3所述抗人神经纤毛蛋白1单域抗体的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述纯化采用亲和层析。