CN110835372B - 一种靶向Frizzled7单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向Frizzled7单克隆抗体及其制备方法与应用。靶向Frizzled7单克隆抗体，记为SHH002，靶向Frizzled7单克隆抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No.5所示的CDR1，SEQ ID No.6所示的CDR2，和SEQ ID No.7所示的CDR3；所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No.8所示的CDR1’，SEQ ID No.9所示的CDR2’，和SEQ ID No.10所示的CDR3’。本发明还介绍了所述抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明抗体显示出了与抗原的超高亲和力(亲和力常数达到1×10‑12M)。

Description

一种靶向Frizzled7单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种靶向Frizzled7单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
Wnt信号通路是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路，其在动物胚胎的早期发育、器官形成和肿瘤的发生发展中，发挥至关重要的作用。Wnt蛋白家族与受体Frizzled(Fzd)的N端胞外结构区CRD(cysteine-rich domain)结合，与Dvl(disheveled)蛋白相互作用并激活下游信号通路。Fzd蛋白是一类具有七次跨膜分子结构的Wnt受体家族，该家族中有10个成员蛋白，Frizzled-7(Fzd7)为成员之一。研究表明Wnt受体Fzd7异常表达于不同种类的癌症中(包括三阴性乳腺癌(TNBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌(HCC)等)(Polakis P,2012,EMBO J,31:2737-46；King TD et al,2012,J Cell Biochem,113:13-8)；Fzd7通过激活经典Wnt通路(Wnt/β-catenin)来诱导肿瘤的发生和转移。
Wnt通路参与肿瘤的侵袭和转移，且对肿瘤血管生成也有调节作用，对Fzd7进行基因敲除可以显著抑制肿瘤细胞增殖、移植瘤生长及血管新生。Wnt信号和肿瘤干细胞行为也存在密切联系，Fzd7就是肿瘤干细胞标记物之一，且这些肿瘤干细胞中Fzd7的上调与肿瘤化疗耐受以及病人的低生存率显著相关(Barker N et al.,2009,Nature,457:608-11)。另外Fzd7的“context-specific functions”暗示了选择性靶向Fzd7可以在不影响正常组织稳态的前提下治疗癌症。综上，Fzd7是多种肿瘤的潜在治疗靶点(Kahn M,2014,Nat RevDrug Discov,13:513-32)。
目前靶向Fzd7方法主要有RNA干扰、小分子抑制剂、小干扰肽、可溶性重组Fzd7蛋白以及抗Fzd7单抗。Fzd7shRNA可以有效抑制TNBC细胞的增殖侵袭及肿瘤生长；小干扰肽RHPDs或小分子抑制剂FJ9干扰Fzd7和分散蛋白(Dvl)的结合来阻断Wnt信号，并有效抑制小鼠移植瘤的生长(Nambotin SB et al.,2011,J Hepatol,54:288-99；Fujii N et al.,2007,Cancer Res,67:573-9)；使用Fzd7的胞外区重组蛋白(sFzd7)与细胞表面Fzd7竞争性结合Wnt3配体来阻断Wnt/β-catenin信号也并抑制肿瘤发生发展(Wei W et al.,2011,MolCancer,10:16)；以上几种方法目前仍处于临床前研究阶段。相比之下，更利于临床转化的方法是利用抗体来特异性靶向Fzd7，OncoMed公司已经开发出了一种靶向Fzd7 CRD结构域的单抗OMP-18R5(vantictumab)，目前正处于晚期非小细胞肺癌(NSCLC)、晚期HER2(人表皮生长因子受体2)阴性乳腺癌以及晚期胰腺癌的Ⅰ期临床试验中(Flanagan DJ et al.,2019,Cancer Res,79:970-81；Gurney A et al.,2012,Proc Natl Acad Sci USA,109:11717-22)。OMP-18R5还与Fzd受体家族中的Fzd1、Fzd2、Fzd5和Fzd8有交叉反应，预示OMP-18R5可能被用于多种癌症的治疗，但是对靶标蛋白特异性的缺失可能会导致脱靶效应而影响抗体的功效。
Wnt蛋白家族与Fzd的N端胞外结构区CRD(cysteine-rich domain)特异性结合，与Dvl蛋白相互作用并激活下游信号通路。Fzd的CRD在与配体结合中发挥至关重要的作用，Fzd受体家族该区域序列不管在种属间还是跨种属都高度保守。Fzd7的CRD区序列与Fzd家族其他成员均有超过40％的同源性，特别是与Fzd1和Fzd2，同源性达到近80％(Janda,CYet al.,2012,Science,337:59-63)。选择Fzd7 CRD段为抗原筛选得到的抗体，可以阻断Fzd与其配体结合的关键位点，但其也有可以与Fzd家族其他成员结合的几率，尤其是Fzd1/2，因此该类抗体在治疗过程中会出现脱靶风险(OMP-18R5即是以Fzd7 CRD段蛋白为抗原筛选得到的抗体)。若筛选到仅特异性靶向某一Fzd受体的抗体，不仅可以降低脱靶效应增强抗肿瘤活性，还可以作为强大的工具来研究各Fzd受体的“context-specific roles”，进而来阐明Wnt信号通路及其作用机制。
相较于抗体Fab片段、单链抗体(scFv)以及纳米抗体(Nanobody)，IgG样全长抗体(Full-length Antiody)具有完整的抗体结构，性质稳定，体内半衰期长，除了可以阻断靶标信号通路还可以发挥Fc片段介导的ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)、CDC(补体依赖的细胞毒性作用)等免疫效应。2014-2018上市的43个抗体类药物中仅有1个人源Fab片段和1个纳米抗体，除了少数Fc融合蛋白和抗体偶联药物(ADC)外，几乎均为全长抗体，显示出了全长抗体卓越的临床和药物价值。在常用的抗体筛选技术中，杂交瘤技术筛选获得的鼠源全长抗体具有较高的亲和力。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种靶向Frizzled7单克隆抗体及其制备方法与应用。
本发明使用杂交瘤技术筛选Frizzled7(Fzd7)抗体。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种靶向Frizzled7单克隆抗体，记为靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002，所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002也可以表述为抗Fzd7鼠源抗体SHH002。
所述靶向Frizzled7单克隆抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No.5所示的CDR1，SEQ ID No.6所示的CDR2，和SEQID No.7所示的CDR3；
所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No.8所示的CDR1’，SEQ IDNo.9所示的CDR2’，和SEQ ID No.10所示的CDR3’。
所述靶向Frizzled7单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述靶向Frizzled7单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明的抗Fzd7鼠源抗体SHH002可与Fzd7特异性结合，并表现出与重组人Fzd7蛋白的高亲和力，生物膜层干涉技术(BLI)检测其亲和力常数KD小于1×10-12M。
本发明提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)所述靶向Frizzled7单克隆抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
本发明提供一种核苷酸，所述核苷酸编码：所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002。
本发明提供一种可以稳定表达所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002的杂交瘤细胞株，分类命名为表达抗Fzd7鼠源抗体SHH002的杂交瘤细胞株FL253-1，该细胞株已经进行了保藏，保藏日期为2019年10月30日，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:C2019279，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明提供一种ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002。
本发明提供一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
本发明提供所述靶向Frizzled7单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
用Fzd7胞外CRD区蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得可表达鼠源单克隆抗体SHH002的杂交瘤细胞株，利用此细胞株制备所述抗体。
本发明还对靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002的纯度、亲和力进行了验证。
所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002经SEC-HPLC(分子排阻高效液相)检测，纯度大于95％；经BLI(生物膜层干涉技术)检测，具有与重组人Fzd7蛋白的高亲和力(KD值均小于1×10-12M)，具有潜在的肿瘤靶向性，是未来抗肿瘤治疗新的候选药物。
附图说明
图1为Western blot验证抗Fzd7鼠源抗体SHH002与免疫原rhFzd7结合的结果图。图1A：免疫原重组蛋白rhFzd7 SDS-PAGE电泳后转印至NC膜，并进行立春红染色，泳道1-5为rhFzd7蛋白。图1B：对NC膜不同泳道进行抗体孵育，泳道1-4分别用1#、2#、3#、11#腹水进行孵育，泳道5用小鼠血清孵育(作为阳性对照)，随后用羊抗鼠-HRP标签二抗进行孵育，最后DAB避光显色。四株腹水均检测到目标条带，其中腹水1#、2#、3#效果较好。箭头所指条带为目的条带所在位置，下部条带疑为蛋白降解结合条带(蛋白立春红染色后图片在该位置也有明显条带)。
图2为SDS-PAGE电泳对纯化后抗体1#、2#、3#检测结果。泳道1-7为非还原样品，泳道8-10为还原样品。泳道1-3：1#、2#、3#抗体；泳道4：IPI阳性对照抗体；泳道5：Blank；泳道6：N/A质控；泳道7：Control BSA；泳道8-10：1#、2#、3#抗体；泳道11：IPI阳性对照抗体；泳道12：Blank；泳道13：Control BSA。
图3为间接ELISA法测定抗Fzd7鼠源抗体SHH002亲和力的反应曲线图。图3A：1#抗体与rhFzd7的反应曲线图；图3B：2#抗体与rhFzd7的反应曲线图；3#抗体与rhFzd7的反应曲线图。测得的抗体亲和力分别为1#抗体：4.06×10-11M；2#抗体：9.74×10-11M；3#抗体：7.59×10-11M。
图4为Fortebio仪器测得的抗原(rhFzd7)抗体(SHH002)结合解离动力学过程拟合曲线图。600s到1000s表示结合，1000s到1580s表示解离，图中的2条曲线从上到下分别表示抗体与750nM、300nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲线，绿色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。
图5为抗Fzd7鼠源抗体SHH002 SEC-HPLC(分子排阻色谱)检测结果。图5A：IPI阳性对照抗体的SEC-HPLC色谱图，参比品出峰时间11.2min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过；图5B：鼠源抗体SHH002的SEC-HPLC色谱图，参比品出峰时间9.5min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过。
图6为PCR扩增SHH002重轻链V区基因的核酸电泳检测图。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，泳道1-5分别对应不同引物PCR结果；泳道1：SHH002重链可变区PCR结果，泳道2-5：SHH002轻链可变区PCR结果，目的抗体基因为330bp位置。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：抗Fzd7鼠源抗体SHH002杂交瘤细胞的制备
1、免疫动物：本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，由上海第一人民医院(松江)动物实验中心提供，免疫佐剂购自Sigma公司，免疫原为重组人Fzd7胞外CRD区蛋白(rhFzd7)。采用常规免疫方法对BALB/c小鼠进行免疫。初免后每隔四周免疫一次，共免疫三次。使用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清的抗体效价，选取免疫效价检测值最高的小鼠追加免疫一次，三天后取该鼠的脾脏进行细胞融合。
2、细胞融合：
1)骨髓瘤细胞(Sp2/0)的准备：于融合前两周复苏Sp2/0，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中传代培养。培养过程在培养液中加入8-氮鸟嘌吟，连续处理3次，使Sp2/0细胞对HAT培养液更加敏感。融合前一天传代一次，使融合当天的骨髓瘤细胞处于对数生长期。
2)饲养细胞的准备：细胞融合前一天，取3-4周龄健康BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，调整细胞浓度至l-5×105个/mL，按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中。
3)脾细胞的准备：取三天前加强免疫的小鼠，无菌摘取脾脏，收集脾细胞悬液，脾细胞计数后备用。
4)细胞的融合：将Sp2/0细胞和免疫脾细胞悬液混匀，使用聚乙二醇融合细胞，然后转入96孔细胞培养板中，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养。
5)杂交瘤细胞的筛选：融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，待细胞长到孔底的1/4-1/3时吸出上清进行间接ELISA检测。以P/N≥2.5作为阳性判断标准，用未免疫小鼠血清作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照。对检测为阳性的细胞进行扩大培养，同时进行克隆化培养。
6)杂交瘤细胞的克隆化培养：克隆化培养采用有限稀释法，待细胞长到孔底的l/4-1/3时，对细胞上清进行间接ELISA检测。选择克隆数少、OD450nm值高的阳性孔，将其再次克隆。经3-4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，及时扩大培养并冻存。
实施例2：鼠源抗Fzd7抗体的制备与鉴定
1、腹水收集：杂交瘤细胞扩大培养后，进行小鼠的腹腔注射，7-10天后小鼠腹腔明显肿大，此时采集腹水。4℃，5000g离心20min，去除腹水中细胞碎片与油脂(Western blot检测四株腹水与抗原的结合，图1结果显示1#、2#、3#腹水与抗原rhFzd7结合较好)，然后加入等体积甘油保存于-20℃。
2、鼠源抗Fzd7抗体的纯化：采用Protein G亲和层析柱纯化抗体。
具体步骤如下：
1)用10倍柱体积水清洗Protein G亲和层析柱。
2)用10倍柱体积20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)冲洗Protein G亲和层析柱。
3)将所需纯化样品泵入层析柱。
4)用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5，pH 2.7)洗脱，收集洗脱峰；并用1M Tris缓冲液(pH 9.0)中和收集物。
5)用SDS-PAGE电泳初步鉴定抗体(图2)。结果显示：非还原条件下在150KD处出现目的条带，主带明显；还原条件下在50KD和25KD出分别出现目的条带(重链和轻链)；说明1#、2#、3#抗体重轻链表达正确且装配完全。
3、鼠源抗Fzd7抗体的特征分析
1)免疫球蛋白亚型鉴定：
采用武汉三鹰生物技术有限公司的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，鉴定1#、2#、3#细胞株分泌抗体亚型。结果为：1#抗体重链亚型为IgG2b，轻链亚型为Kappa；2#抗体重链亚型为IgG1，轻链亚型为Kappa；3#抗体重链亚型为IgG2a，轻链亚型为Kappa。
2)间接ELISA法检测鼠源抗Fzd7抗体的亲和力：
A.将rhFzd7以1、0.5、0.25μg/mL的浓度包被酶标板；B.应用间接ELISA方法测定不同抗原包被浓度的抗体效价；C.以单抗浓度对数值为横坐标，OD450为纵坐标，绘制反应曲线；D.取各曲线上部趋于平坦段的OD值为OD-100，查出OD-50对应的单抗摩尔浓度(mol/L)，[Ab1]、[Ab0.5]、[Ab0.25]，根据公式：
K1＝1/(2×[Ab0.5]－[Ab1])
K2＝1/(2×[Ab0.25]－[Ab0.5])
K3＝1/(2×[Ab0.25]－[Ab1])
计算得到三个K值，取平均数即为抗体亲和力常数。间接ELISA测得的抗体亲和力分别为1#抗体：4.06×10-11M；2#抗体：9.74×10-11M；3#抗体：7.59×10-11M。ELISA法测得的反应曲线如图3所示。
3)挑选亲和力最高的1#抗体(即为SHH002)，用BLI法进一步验证其亲和力：
A.使用仪器：蛋白质相互作用仪Fortebio Octet Red96。
B.溶液配制：KB buffer：0.1％BSA，0.05％Tween 20以pH 7.2的PBS溶解；抗体工作溶液：Biotin标记的SHH002抗体用KB buffer配制成10μg/mL；抗原工作溶液：rhFzd7用KBbuffer配制成300nM和750nM。
C.操作流程：打开Fortebio仪器及相关软件，选择Advance Kientics实验模式。首先利用Anti-Biotin Sensor捕获与Biotin偶联的抗体SHH002，然后利用捕获的抗体结合不同浓度的抗原rhFzd7，接着在缓冲液中进行解离，最后通过仪器算法计算出抗原抗体结合的亲和动力学常数KD。
实验结果显示SHH002与rhFzd7的结合常数ka(1/Ms)＝2.85×104，解离常数kd(1/s)<1×10-7，亲和力常数KD<1×10-12M，结合解离动力学过程拟合曲线图如图4所示。对比间接ELISA的结果，SHH002与抗原的亲和力常数小了至少一个数量级，说明用BLI法测得的SHH002的亲和力更高；分析其原因可能为BLI法中是将抗体偶联在芯片上去捕捉流动相中的抗原，相比间接ELISA法中将抗原包被在酶标板上去捕捉抗体，更效的规避了抗体与抗原结合的空间位阻。
本实施例中表达1#抗体(SHH002)的杂交瘤细胞株，分类命名为表达抗Fzd7鼠源抗体SHH002的杂交瘤细胞株FL253-1，该细胞株已经进行了保藏，保藏日期为2019年10月30日，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:C2019279，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例3：1#杂交瘤细胞株重轻链V区基因的克隆和测序
1、抗Fzd7单抗SHH002重轻链V区基因提取、扩增及初步鉴定
1)提取总RNA：收集对数生长期杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒(上海生工生物)提取总RNA，溶于20-50μL无RNA酶水，-70℃保存。
2)cDNA合成：以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链(逆转录试剂盒购自上海生工生物)。
3)PCR扩增抗体重轻链V区基因：
A.聚合酶：PrimerSTAR高保真聚合酶
B.引物：根据杂交瘤细胞株抗体重轻链V区上下游基因序列设计的简并引物，重链V区两条上游引物VH F1、VH F2和下游引物VH R以及轻链V区上游引物VL F和下游引物VL R序列分别为：
VH F1：ctt ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tc
VH F2：ctt ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tcw gg
VH R：gga aga tct ata gac aga tgg ggg tgt cgt ttt ggc
VL F：gg gag ctc gay att gtg mts acm car wct mca
VL R：ggt gca tgc gga tac agt tgg tgc agc atc
(简并密码子说明：r＝a，g；y＝c，t；m＝a，c；s＝c，g；w＝a，t)
C.按表1配置PCR反应体系来扩增抗体重轻链V区基因(30个总体系，27个反应体系PCR)
表1PCR反应体系及反应条件
Figure BDA0002262894490000091
D.PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，目的条带大小均为330bp左右的条带(如图6)。
E.胶回收DNA产物3’端加腺嘌呤(A)
2、抗Fzd7单克隆抗体重轻链V区基因测序及分析
1)将1所得PCR产物链接至pMD18-T载体并将链接产物转化至感受态DH5α细胞，挑选阳性克隆进行测序。
2)测序结果显示成功获得1#杂交瘤细胞株抗体V区基因。利用IMGT-VQUEST数据库分析抗SHH002抗体重轻链V区基因。
靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQID No.5所示的CDR1，SEQ ID No.6所示的CDR2，和SEQ ID No.7所示的CDR3；轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No.8所示的CDR1’，SEQ ID No.9所示的CDR2’，和SEQID No.10所示的CDR3’。靶向Frizzled7单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述靶向Frizzled7单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
实施例4：抗Fzd7鼠源抗体SHH002的鉴定
使用SEC-HPLC(分子排阻色谱)方法进一步验证抗Fzd7鼠源抗体SHH002的纯度(使用IPI阳性蛋白作为对照)。抗体纯化样品中的高分子聚合物质、单体物质和低分子量物质因在分子排阻色谱柱中的保留时间不同，通过对色谱图中不同时间出峰的各物质进行积分，并依据峰面积的占比确定各物质的含量。实验步骤如下：
1)使用仪器：Agilent HPLC 1100(购自日本安捷伦)
2)分子排阻色谱柱：TSKgelG3000SWXL(7.8×300，购自日本东曹株式会社)
3)柱温：20℃
4)进样量：5μL
5)检测器参数：检测波长280nm，带宽16nm，参比波长360nm，带宽100nm，峰宽(响应时间)>0.1min(2s)；狭缝4nm；负吸光度基线100mAU。
6)系统适应性标准：参比品蛋白出峰时间11.2min，峰型对称，基线平稳，则视为系统适应性通过。
结果显示抗Fzd7鼠源抗体SHH002的单体峰含量均大于90％，如图5所示。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海健康医学院
<120> 一种靶向Frizzled7单克隆抗体及其制备方法与应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 345
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
caggtgaagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctacacga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gaagtggtta taccaattac 180
aatcagaaat tcaaggacaa ggccacagtg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactga acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aagaaggggc 300
tattttgact actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 307
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
gacattgagc tcacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat gattatggca atacttttat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 240
cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccctac 300
acgttcg 307
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Arg Arg Gly Tyr Phe Asp
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Glu Ser Val Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Phe Met His
1 5 10
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Leu Ala Ser Asn
1
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro
1 5

Claims (9)

1.一种靶向Frizzled7单克隆抗体，其特征在于，所述靶向Frizzled7单克隆抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR： SEQ ID No. 5所示的CDR1，SEQ ID No. 6所示的CDR2，和SEQ ID No. 7所示的CDR3；
所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No. 8所示的CDR1’，SEQ IDNo. 9所示的CDR2’，和SEQ ID No. 10所示的CDR3’。
2.根据权利要求1所述靶向Frizzled7单克隆抗体，其特征在于，所述靶向Frizzled7单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.根据权利要求1所述靶向Frizzled7单克隆抗体，其特征在于，所述靶向Frizzled7单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
4.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1-3任一项所述抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
5.一种核苷酸，所述核苷酸编码如权利要求1所述靶向Frizzled7单克隆抗体。
6.一种可以稳定表达如权利要求1所述靶向Frizzled7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为表达抗Fzd7鼠源抗体SHH002的杂交瘤细胞株FL253-1，该细胞株已经进行了保藏，保藏日期为2019年10月30日，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO:C2019279，保藏地址为中国 武汉 武汉大学。
7.一种ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：如权利要求1所述靶向Frizzled7单克隆抗体。
8.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a) 如权利要求1所述靶向Frizzled7单克隆抗体和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或酶。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-3中任一项所述的抗体、权利要求4所述的重组蛋白或权利要求8所述免疫偶联物；以及药学上可以接受的载体。
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