CN105384818B - 抗人Delta like 4单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗人Delta like 4单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明利用杂交瘤技术，以重组人Delta like 4（rhDll4）为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得高亲和力和生物学活性的抗人Delta like 4单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体的特征在于：可以与rhDll4特异性结合；可以阻断rhDll4对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的抑制。本发明具体地公开了抗人Delta like 4单克隆抗体的筛选、其制备方法及其重链可变区和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列，包括对应于互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸和氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的可与人新生血管内皮顶端细胞表面的Delta like 4(Dll4)特异结合的高亲和力单克隆抗体，以及抗Dll4单克隆抗体可变区序列及其制备方法。
背景技术
1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。单克隆抗体的这些特征使它成为未来治疗学上研究的热点。
肿瘤的生长和迁移需要有宿主的血管延伸至肿瘤组织内部。由于Notch信号在血管发育和生成中发挥着重要的调节作用，因此，Notch信号通路的原件可以成为治疗肿瘤血管生成的靶标。在很多肿瘤血管中都可以观察到Dll4的高表达，研究表明，Dll4被鉴定为有效的抗肿瘤血管生成的重要靶标。
近年的研究发现，Dll4/Notch参与肿瘤血管的生成和肿瘤干细胞的更新。通过对给予抗Dll4抗体或Dll4-Fc等融合蛋白，可以阻断Dll4/Notch信号的传导，可以抑制多种实体瘤在小鼠体内的生长。在这些肿瘤组织内部，虽然肿瘤血管的密度增加，但是这些新生成的血管缺乏与成熟的血管丛有效的融合，不能为肿瘤组织提供血流，因此可以有效地抑制肿瘤的生长。有研究表明，抗Dll4单克隆抗体甚至可以杀伤对抗VEGF-A抗体拮抗的肿瘤。Dll4/Notch参与一系列癌症干细胞的分化、增殖、更新和维持癌症干细胞的表型，如，乳腺癌、胚胎脑癌、胶质瘤、肝癌和前列腺癌。Hoey等联合使用抗人Dll4单克隆抗体和抗鼠Dll4单克隆抗体对荷瘤NOD/SCID小鼠进行治疗发现，通过降低小鼠瘤组织内部肿瘤干细胞的比例，抑制肿瘤组织的生长，降低肿瘤细胞的转移和延迟肿瘤的复发。
本发明以重组人Dll4(rhDll4)胞外区为抗原，通过杂交瘤技术筛选制备了高亲和力的抗Dll4特异性单克隆抗体，并通过体内外实验证明了其高效生物学活性。
发明内容
发明目的
本发明提供一种具有促进无功能血管生成以及抗肿瘤药效的抗Dll4特异性单克隆抗体。本发明单克隆抗体的特征为特异性结合Dll4胞外区，阻断Dll4-Notch信号通路。
技术方案
本发明提供了一种抗Dll4单克隆抗体，及其相关蛋白质和核苷酸序列。
本发明提供了一种抗人Dll4单克隆抗体，以Dll4胞外区段为抗原，通过杂交瘤技术，筛选制备高亲和力的抗Dll4特异性单克隆抗体，具有潜在医学和药学价值。
本发明提供制备上述单克隆抗体的制备方法。
本发明同时提供一种DNA分子，该DNA分子含有SEQ ID NO:1，17，33或49所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO:9，25，41或57所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。
本发明提供一种抗Dll4单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，重链可变区具有SEQ ID NO:2，18，34或50所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO:10，26，42或58所示的氨基酸序列。
本发明提供了抗Dll4单克隆抗体的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸和核苷酸序列。
附图说明
图1是Western Blot鉴定抗Dll4单克隆抗体MMGZ01、MMAH06、MMZL03和MMCE08图。
图2是抗原抗体亲和力拟和曲线图，分别展示抗Dll4单克隆抗体MMGZ01、MMAH06、MMZL03和MMCE08与抗原Dll4的结合测试实验(Biacore)。
图3是柱形图，描述抗Dll4单克隆抗体MMGZ01、MMAH06、MMZL03和MMCE08阻断Dll4对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例1：抗Dll4单克隆抗体的制备：
(1)免疫小鼠
本单克隆抗体的筛选制备是以重组人Dll4(购自北京义翘神州)为免疫原，用PBS溶解重组抗原，与quick antibody佐剂等体积混合，免疫6周龄BALB/c小鼠，免疫流程参照Quick Antibody说明书进行。21天后以同样方式加强免疫一针。第35天按常规方法进行抗原冲击免疫。各次免疫一周后，采用毛细管取血法眼眶取血500μl。全血室温静止1h后，于4℃、4000rpm离心15min，收集上层血清，并用间接ELISA测定小鼠效价。检测结果显示免疫小鼠血清效价为1:200000。
(2)细胞融合
收集骨髓瘤细胞及脾脏细胞，充分混合，离心共沉淀，在37℃水浴条件下，融合剂为PEG(MW1450，sigma)进行细胞融合。融合时间3分钟后加入新鲜无血清培养基终止融合。并用HAT培养液重悬细胞。将细胞加入已铺有滋养细胞的96孔板中。置37℃，5％CO2培养箱中培养。融合后7天后，改用含有HT培养液全换液。24h后吸取细胞培养上清，间接ELISA检测筛选阳性克隆。
(3)克隆筛选
第14天取出上清液，用间接ELISA法测定抗体表达情况。在克隆化前24h制备饲养细胞，将ELISA检测阳性孔中的细胞轻轻吹起，并将悬浮的细胞转入24孔板的一个孔，补加1ml DMEM完全培养基，并把24孔板置于37℃培养箱中培养。当24孔板中的细胞长到25％～50％汇合度时，将孔内杂交瘤细胞轻轻吹起，稀释至10个/ml。将细胞悬液移种至己铺有饲养细胞的96孔培养板内，每孔100μl，即平均1个细胞/孔。将培养板置入5％CO237℃恒温培养箱中培养。培养7～10天后，观察孔内细胞的生长情况，对只有单克隆生长的细胞培养孔做好标记，同时做好记录，期间要注意换液，不能使孔内培养基变黄。待克隆细胞生长至1/3～1/2培养孔底面积时，取培养上清进行检测。用同样方法对阳性孔进行共3次克隆化，直至达到100％孔均为抗体阳性克隆为止，最后得到4株抗Dll4单克隆细胞株。
实施例2：抗Dll4单克隆抗体可变区基因的扩增
分别收集107个对数生长期的4种杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，溶于20～50μl无RNA酶水，-70℃保存。以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链。
扩增重链可变区5′端引物：
1.ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC
2.ctt ccg gaa ttc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG
扩增重链可变区3′端引物：
gga aga tct CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT CA
扩增Kappa轻链可变区5′端引物：
gg gag ctc GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA
扩增Kappa轻链可变区3′端引物：
ggt gca tgc GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC
上述引物中：R＝A、G；Y＝C、T；M＝A、C；K＝G、T；S＝C、G；W＝A、T；V＝A、C、G；N＝A、C、G。
用上述引物和cDNA分别进行PCR扩增得到VL和VH片段。完成PCR反应后，在1％琼脂糖电泳鉴定扩增产物。胶回收目的条带，连接至载体中，并转化至大肠杆菌DH5α，均匀涂布于Amp+(100μg/ml)抗性琼脂板上。选取阳性克隆，送由生工生物测序。将测序得抗体轻重链可变区基因载入IMGT-VQUEST数据库(http://www.imgt.org/)，分析VH与VL的CDR区及FR区，并保存VH与VL的氨基酸序列。所述的4株单克隆抗体VH氨基酸序列如SEQ ID NO：2，18，34或50所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：10，26，42或58所示。
实施例3：抗Dll4单克隆抗体的制备
提前一周用0.5ml石蜡油注射小鼠腹腔。致敏一周后，将生长旺盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，PBS重悬，分别腹腔注射106个对数生长期的4种抗Dll4杂交瘤细胞至小鼠腹腔内。一周后，分别抽取小鼠腹水。
4℃5000g离心20min，去除腹水内细胞及其它沉淀物质，然后使用0.22μm滤膜过滤。参照GE公司Hi-Trap Protein A柱说明书进行纯化。纯化后通过western blotting对4株抗Dll4单克隆抗体进行鉴定，并且分别命名为MMGZ01、MMAH06、MMZL03和MMCE08，结果如图1所示。
实施例4：抗Dll4单克隆抗体的SPR实验
该实验中抗Dll4单克隆抗体与Dll4抗原的结合使用Biacore X100作为SPR-依赖的生物传感器来检测二者之间的相互作用：将NTA传感器芯片模块嵌入BIAcore系统，往流动室内注入Ni2+活化芯片，然后往流动室内注入含有His标签蛋白，使之被捕获至芯片上，再往流动池内注入配体蛋白，监测目标蛋白与配体之间的结合过程。最后用EDTA洗脱再生芯片。获得结合-解离曲线，用SPR评估软件分析计算获得平衡解离常数。每次实验检测一株抗体，MMGZ01、MMAH06、MMZL03和MMCE08依次进行，实验结果如图2以及表1所示。
| 抗体 | MMGZ01 | MMAH06 | MMZL03 | MMCE08 |
| 亲和力数值 | 0.365pM | 3.6pM | 0.145pM | 6.2pM |
表1：4株抗Dll4单克隆抗体亲和力比较
实施例5：抗Dll4单克隆抗体阻断Dll4对HUVEC细胞增殖的抑制
往96孔板中加入100μl已用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL的rhDll4，4℃包被过夜。次日，PBS洗两遍，往每孔中加入4000个人脐静脉内皮细胞，和不同浓度的MMGZ01、MMAH06、MMZL03和MMCE08，每个浓度3个复孔。同时准备一块没有包被Dll4的96孔板。37℃，5％CO2中培养72h，MTT法检测细胞的增殖，结果如图3所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国药科大学
<120> 抗人Delta like 4单克隆抗体及其应用
<130> 2015
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
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<213> Mus musculus
<400> 38
Glu Glu Ser Glu Pro Lys Glu Glu Lys Pro Pro Ser Leu Pro Pro Thr
1 5 10 15
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 39
ataagttcca gctacttgca c 21
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 40
Ile Ser Ser Ser Tyr Leu His
1 5
<210> 41
<211> 333
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 41
gatattgtga tcacccagtc tccagcactc atggctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atcacctgcg aggaccctgt agacagcccc acagaggatg agaagtggta ccagcagaag 120
tcaggaatct cccccaaacc ctggatttat atgccgccgt atgatgagga gaccggagtc 180
cctgctcgct tcagtggcag tggatctggg acctcttact ctctcacaat caccagcatg 240
gaggctgaag atgctgccac ttattactgt caggccatca tcgatgctgc accaactgta 300
tccttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333
<210> 42
<211> 111
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 42
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Glu Asp Pro Val Asp Ser Pro Thr Glu
20 25 30
Asp Glu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Met Pro Pro Tyr Asp Glu Glu Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met
65 70 75 80
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Ile Ile Asp Ala
85 90 95
Ala Pro Thr Val Ser Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
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<211> 36
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 43
gaggaccctg tagacagccc cacagaggat gagaag 36
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 44
Glu Asp Pro Val Asp Ser Pro Thr Glu Asp Glu Lys
1 5 10
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<212> DNA
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<400> 45
atgccgccgt atgatgagga gacc 24
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 46
Met Pro Pro Tyr Asp Glu Glu Thr
1 5
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 47
caggccatca tcgatgctgc accaactgta tcc 33
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 48
Gln Ala Ile Ile Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 348
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 49
gaggtccagc tggaggagtc tgggactgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta catctttagt ggctactgga tgcagtggat aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggggct atttatcctg gagatggtga tactaggtac 180
actcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag tacagcctac 240
atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc cgggggtaac 300
ttcttctttg actactgggg cctaggcacc actctcgcag tctcctca 348
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 50
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asn Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115
<210> 51
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<212> DNA
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<400> 51
ggctactgga tgcag 15
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<212> PRT
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<400> 52
Gly Tyr Trp Met Gln
1 5
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<211> 51
<212> DNA
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<400> 53
gctatttatc ctggagatgg tgatactagg tacactcaga agttcaaggg c 51
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Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 55
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<400> 55
ggtaacttct tctttgacta c 21
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Gly Asn Phe Phe Phe Asp Tyr
1 5
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<212> DNA
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<400> 57
gatattgtga tcacccagtc tccagcactc atggctgcag gggagtctcc aaaggtcacc 60
atcacctgcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgattggta ccagcagaag 120
tcaggaatct cccccaaacc ctggatttat gctgcatctc caggggagaa gggagtccct 180
gctcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttactctc tcacaatcac cagcatggag 240
gctgaagatg ctgccactta ttactgtgtc accatcacct gcagtgtcag ctcattcggt 300
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<400> 58
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Gly Glu Ser
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Pro Lys Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
20 25 30
Arg Ala Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
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Ile Tyr Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val
85 90 95
Ser Ser Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<400> 59
ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacgg gctgat 36
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<213> Mus musculus
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Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
1 5 10
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<211> 21
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gctgcatctc caggggagaa g 21
<210> 62
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<400> 62
Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys
1 5
<210> 63
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<400> 63
gtcaccatca cctgcagtgt cagctca 27
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 64
Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser
1 5
Claims (3)
1.抗Delta like 4单克隆抗体，其特征在于所述的抗Delta like 4单克隆抗体的重链CDR分别由CDR1、CDR2和CDR3构成；其轻链CDR分别由CDR1、CDR2和CDR3构成；
重链CDR1域为SEQ ID NO: 52的氨基酸序列；
重链CDR2域为SEQ ID NO: 54的氨基酸序列；
重链CDR3域为SEQ ID NO: 56氨基酸序列；
轻链CDR1域为SEQ ID NO: 28的氨基酸序列；
轻链CDR2域为SEQ ID NO: 30的氨基酸序列；
轻链CDR3域为SEQ ID NO: 32的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗Delta like 4单克隆抗体，其特征在于重链可变区为SEQID NO: 50所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列。
3.一种如权利要求1或2所述的抗Delta like 4单克隆抗体在制备抗Delta like 4药物中的应用。
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