CN111088266B

CN111088266B - 一种肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及试剂盒

Info

Publication number: CN111088266B
Application number: CN202010215431.5A
Authority: CN
Inventors: 彭菲; 陈印平
Original assignee: Heyuan Biotechnology Tianjin Co ltd
Current assignee: Heyuan Biotechnology Tianjin Co ltd; Shanghai Airlines Intellectual Property Services Ltd
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-03-25
Also published as: CN111088266A

Abstract

本发明涉及一种肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及试剂盒，该抗体能够特异性的结合本发明的RRM2B蛋白，并且具有较好的结合能力以及特异性，适宜大规模推广使用。

Description

一种肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及试剂盒

技术领域

本发明涉及检测领域，具体的涉及一种用于肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及相应的试剂盒。

背景技术

核糖核苷酸还原酶（ribonueleotidereductase，RR）广泛分布于各种生物细胞中，其作用是参与核糖核苷酸还原成脱氧核糖核苷酸的过程，在核苷酸代谢过程中发挥着中心作用，是唯一使核糖核苷酸转变为脱氧核糖核苷酸的酶。而脱氧核糖核苷酸是DNA合成和修复的原材料，因此该酶是DNA通路中合成和修复的限速酶。RR全酶结构包括大亚基α和小亚基β，只有形成α2β2异四聚体结构才能具备活性。在人体中RR由3个亚基构成，包括1个大亚基[核糖核苷酸还原酶M1（ribonueleotidereductaseM1，RRM1）]和2个小亚基（RRM2和RRM2B）构成。由于RR对于DNA的合成发挥着关键的作用，因此它与恶性肿瘤生物学行为、转移潜能和肿瘤耐药的产生都有重要影响。

RRM2B 基因是位于 8q22.3 的核基因，编码 p53-诱导型核糖核苷酸还原酶（RNR）的小亚基（p53R2）。RNR 是一种还原酶，可以催化核糖核苷酸（NDP）还原生成相应脱氧核糖核苷酸（dNDP），是体内 dNTP 从头合成的限速酶和关键酶。RNR 包含酶活性中心(RRM1)和底物特异结合位点（RRM2 或 p53R2）；位于酶活性中心的自由基可以催化 NDP 还原为dNDP；dNTPs 在细胞内的平衡通过 RNR 酶的底物特异性结合位点的变构受到调控。

目前研究表明，RRM2B与多种肿瘤的发生和发展密切相关，在不同类型的肿瘤中发挥类似癌基因或抑癌基因的功能。特别是研究表明，RRM2B 在肝细胞癌中表达降低，并与患者的肝内转移呈负相关。因此通过检测RRM2B的表达量来诊断肝癌已经是可行的技术。而且已有研究表明，而 RRM2B 的表达与肝细胞癌的患者预后密切相关，RRM2B 表达水平高的患者其术后生存期比表达低的患者生存期长；COX 回归模型单因素和多因素分析结果显示，RRM2B 蛋白的表达水平是影响肝细胞癌预后的独立因素之一。因此，RRM2B 已经成为评估肝细胞癌预后的一项有效指标。CN201310606030.2中也公开了核糖核苷酸还原酶亚基M2B(Ribonucleoside-diphosphate reductasesubunit M2B，RRM2B)基因或其蛋白检测试剂用于制备诊断肝癌细胞转移的试剂盒。

但是由于常规的核酸检测需要复杂的仪器设备，在偏远山区或者普通社区并不适宜推广使用，而针对该基因的抗体检测技术却可以通过试纸条简单的实现检测，而且不需要任何仪器设备，方便快捷，适宜推广使用。因此，针对RRM2B的抗体研究变得尤为重要。虽然目前已有相应的抗体，但是抗体并非特异性针对相应的预后片段抗原所做的，而且抗体的结合活性也有待进一步的提高。。

发明内容

本发明提供一种RRM2B基因的编码序列如SEQ ID NO.：1所示；

一种RRM2B蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

在另一优选例中，所述的RRM2B蛋白用于制备检测试剂包括RRM2B的特异性抗体。

另外一方面，本发明提供一种特异性结合RRM2B蛋白的单克隆抗体。

具体的，该单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID.NO.3:

EVQLEESGTELARPGASVKLSCKASGYIFSMAWGTWIKQRPGQGLEWIGESYPGAPDTRYTQCKAGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGACFQLKSWGLGTTLAVSS.

轻链可变区序列氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4:

DIVITQSPALMAASPGEKVTITCDVCSSITTSYAKWYQQKSGISPKPWIYSYSNLDEGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCCCWTDSPAAFGAGTKLELK。

此外，本发明还提供一种肝癌细胞转移检测用的试剂盒，该试剂盒中含有RRM2B特定蛋白片段的单克隆抗体。

有益效果

本发明通过前期证明的能够用于肝癌细胞转移检测用的RRM2B蛋白密码子进行优化后进行了表达，进而制备相应的单克隆抗体，该抗体能够特异性的结合本发明的RRM2B蛋白，并且具有较好的结合能力以及特异性，适宜大规模推广使用。

附图说明

图1 A为密码子优化前序列参数，图1 B为密码子优化后的序列参数

图2 小鼠抗血清效价图

图3 单克隆抗体腹水效价图

图4 抗体亚型图

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1 RRM2B特定蛋白片段的表达

根据已经证实得与诊断和预后相关的RRM2B蛋白片段的的序列，通过特异性的优化手段进行密码子及GC含量的优化，如图1A和图1B所示，优化后的序列通过调整多种参数后，使得该基因能够表达量得到显著的提高，优化后的序列如SEQ ID NO:1所示；设计特异性引物，分别在引物的5’端加入保护性碱基和限制性内切酶，引物序列如下：

F:5'-CGCGGATCC ATGGGCGACCCGGAAAGGCCGG-3' (SEQ.ID.NO.3)：

R:5'-CCGGAATTCTTAAAAATCTGCATCCAAGG-3' (SEQ.ID.NO.4)：

以优化后的通过全基因合成的RRM2B基因片段为模板（上海生工合成），用上述特异性引物进行PCR扩增。

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10sec，56℃退火30sec， 65℃延伸1min05s，35个循环；68℃延伸7min，4℃保存。

PCR反应体系：2×PCR Buffer 12.5μL，2mM dNTPs 5μL，10mM R Primer 0.75μL，10mM F Primer 0.75μL，N DNA 1μL，dH₂O 5μL。

将扩增产物使用限制性内切酶BamHI和EcoRI和载体pColdI分别进行双酶切，酶切体系为9.5μL PCR产物或载体，0.5μL BamHI，0.5μL EcoRI，8.5μL dH₂O。 37℃条件下，反应1h。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用Takara 公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化。

采用Takara公司的连接试剂盒DNA Ligation Kit(Mighty Mix〉将酶切产物RRM2B基因片段、pColdI进行连接，制备重组原核表达载体pCold-RRM2B。 RRM2B、pColdI的mol数比约为3:1。16℃，连接1.5小时。将连接产物通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃过夜培养。选取菌落PCR和酶切鉴定均阳性的阳性质粒进行测序鉴定，经鉴定，所述序列与SEQ ID NO：1保持一致。

将测序正确的质粒pCold-RRM2B通过热激转化的方式转化入表达型的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。菌落PCR确定阳性菌，即含重组表达质粒 pCold-NS3的表达菌。将含重组表达质粒pCold-NS3的表达菌接种至自诱导表达培养基中诱导表达，所述自诱导培养基为Overnight ExpressTM Instant LB Media，诱导表达的步骤：取少量菌液接种至3mL含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。取过夜培养的菌液按照1:100的量加入到含Amp的自诱导培养基中，17℃条件下，诱导时间22h。表达产物用QIAGEN His标签蛋白纯化试剂盒进行重组蛋白的纯化，随后进行SDS-PAGE分析，结果显示，经过密码子优化的核酸使得该蛋白占总表达蛋白量的55.6％左右，表达量较高。配置纯化后的蛋白浓度为0.5mg/L备用。

同时，使用原始的RRM2B蛋白的核酸序列（参见Genbank ID：NM_015713.4）进行了对照实验，按照上述方法将原始的RRM2B蛋白的核酸序列转入表达型的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，最终测量结果为RRM2B蛋白量占总表达蛋白量的34.5％左右，明显低于本发明密码子优化后的核酸获得的蛋白产量，这也表明了本发明密码子优化后的核酸更利于在产业上应用，能够更高产RRM2B蛋白。

实施例2 单克隆抗体的制备

8 周龄 BALB / c 雌性小鼠 3 只，重组 RRM2B蛋白 100 μg /( 鼠·次) 。第 1次和第 2 次免疫分别用福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂乳化蛋白后进行皮下多点注射免疫，末次用纯蛋白液直接经尾静脉注射加强免疫，间隔 28 d，共 3 次。末次免疫后第 3天取出小鼠脾脏制成单细胞悬液立即用于融合。

融合前 10 － 14 d，释放冻存的骨髓瘤细胞 SP2 /0。将冻存细胞在 37 ℃温水浴中解冻后立即加入 RPMI1640 培养液，900 × g 离心 10 min，弃上清。用含20% FBS-ＲPMI 1640 培养液( 含 1 mmol / L L －谷氨酰胺，100 U/ml 青霉素，100 μg /ml 链霉素，1 mmol/

L 丙酮酸钠) 悬浮后，置于培养瓶中培养。每天对半换液，直至细胞处于对数生长期状态。

饲养细胞为小鼠腹腔渗出细胞，含有大单核细胞和巨噬细胞。融合前 3 d，将 4只 12 周龄昆明小鼠断颈处死，并置于 75% 酒精中浸泡消毒 5 min。将消毒后小鼠固定于解剖板上，腹部向上，剥离腹部皮肤露出腹膜。于小鼠肝区部的腹膜下注入 37 ℃ 温浴的10 ml RPMI 1640 培养液，反复冲洗，并吸出腹腔洗涤液，置于离心管中，900 × g 离心10 min，取沉淀细胞。用 20% FBS-HAT 选择性培养液调整细胞浓度为 2 × 105/ ml。接种于 96 孔板中，100 微升 / 孔，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

末次免疫 3 d 后，从 BALB /c 雌性小鼠眼眶取血，血液尽量放尽，以免影响融合。然后将小鼠置于 75%酒精中浸泡 5 min，开腹，取脾，用ＲPMI1640 培养液清洗，用弯曲的注射针头多点刺破脾膜，用挤压的方法使淋巴细胞从中逸出，收集细胞悬浮液。分离上述经重组蛋白免疫的 BALB /c 雌性小鼠抗血清，用 ELISA 方法测定免疫小鼠的抗血清效价。ELISA 检测如图2所示，用重组蛋白包板，免疫 BALB /c 雌性小鼠抗血清效价约为 1 ∶51200。

新鲜制备的脾细胞与 SP2 /0 骨髓瘤细胞以 10∶ 1 的比例混合，于 37 ℃温浴的 50% PEG 1500 溶液作用1 min 后，静置 1 min，用 RPMI 1640 培养液缓慢中和，离心弃去 PEG，然后将细胞悬浮于 20% FBS-HAT 选择性培养液中，置于 37 ℃ 、5% CO2培养箱中培养。于融合后第 3、6 天更换半量上述培养液，2周后杂交瘤细胞克隆长大后，逐步换成20% FBS-HT 培养液，再过 2 周改用 20% FBS-RPMI 1640 完全培养液，最后换成 20%NCS-RPMI 1640 完全培养液。观察 96 孔板中是否有克隆，选生长良好的克隆孔检测，阳性克隆孔扩大培养，从 96 孔板扩至 24 孔板，最后到培养瓶中。阳性克隆经过ELISA 法筛选后，将生长稳定的阳性细胞克隆以 20% NCS-RPMI 1640 完全培养液稀释后加入预置小鼠饲养细胞的 96 孔培养板中，稀释浓度为 0. 8 － 1 个细胞/孔，每隔两天半量换液，待单细胞亚克隆长大后，大约 10 d 左右，取培养上清进行ELISA 检测，取高阳性孔细胞转种于24 孔培养板进行扩大培养，之后同上进行第 2 次单克隆化，直至单克隆化阳性率达100％，得到本发明最终筛选的杂交瘤细胞株RRM2B－26。待单克隆化阳性率达 100% 的细胞处于对数生长期时，即可冻存细胞。取生长良好的细胞液，900 × g离心 10 min，去除培养上清，将细胞悬浮于 10%DMSO 的 20% NCS-RPMI 1640 培养液中，置于-80℃ 冰箱，第 2天转入液氮中保存。

实施例3 腹水的制备及其效价和亚型、特异性测定

（1）实施例2制备的单克隆细胞，经过体外连续30代传代培养和冻存6个月复苏培养，细胞上清中抗体效价基本不变。采用体内诱生法制备腹水，将采集的腹水梯度稀释后进行间接ELISA 检测，以腹水D450nm值为P，阴性对照 D450nm值为 N，以 P/N＞2.0为阳性。由图3可知，该单克隆抗体效价为1∶25600。

（2）单克隆抗体亚型与特异性鉴定结果

使用小鼠抗体分型试剂盒检测单克隆细胞培养上清和腹水中抗体亚型，结果见图4。由图4可知，单克隆抗体细胞株分泌的抗体为IgG1，轻链为 Lambda链。

（3）交叉反应率实验

将RRM2B蛋白、BSA、小鼠血清、RRM1和RRM2几种样品作系列稀释，进行间接竞争ELISA试验，绘制曲线方程并计算出各个药物半数抑制浓度IC50，比较各个组分与本发明单克隆抗体的交叉反应率（CR），判定抗体的特异性。交叉反应物浓度范围0.001～1000ng／mL。交叉反应率（％）＝IC50（RRM2B蛋白）／IC50（竞争物）×100％.结果见表1所示。对照抗体为商用RRM2B抗体，货号：HK5347，上海户实医药科技公司，亚型IgG。

表1 交叉反应率及抑制效果

由表1可知，本发明的单克隆抗体对RRM2B的抑制率为100％，与BSA、小鼠血清、RRM1和RRM2均无交叉反应，说明该抗体特异性良好，而商用抗体与本发明的RRM2B蛋白结合率较低，说明特异性较差。

实施例5 mAb序列的鉴定

收集实施例3中的筛选后的杂交瘤细胞，利用Thermo公司的Trizol提取杂交瘤细胞总RNA，按南京诺唯赞公司的HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)说明书的操作方案将mRNA逆转录为cDNA，-20°C冻存备用。逆转录反应体系为5 μL RNA（2500 ng），10 μL4×gDNA，10 μL 5×supermixⅡ，加ddH2O补足至50 μL，总反应体积为50 μL。

以cDNA为模板，通过NCBI数据库查找鼠源重链FR1区及铰链区基因序列，根据序列设计重链PCR引物，上游序列为：GCGCTCGAGCAGKTCCAGCTGAAGCAGTC，下游序列为：GCGACTAGTGCATTTGCATGGAGGACAG；同样通过NCBI数据库查找鼠源轻链FR1区及恒定区基因序列（NC000072.6），设计轻链PCR引物，上游序列为：GCGGAGCTCGATRTTGTGATGACCCARAC，下游序列为：GCGTCTAGACTCATTCCTGTTGAAGCTCT，分别PCR获得抗体的轻链和重链片段。按南京诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase说明书的操作方案进行PCR，PCR反应体系为：25 μL 2×Phanta，1 μL dNTP，4 μL 10 μM引物对，4 μL杂交瘤细胞cDNA，1μL DNA polymerase，15 μL dd H2O，总反应体积为50 μL。扩增条件为：预变性94℃，3 min；变性94℃，30 s；退火64℃，30 s；延伸72℃，5 min。按照OMEGA公司OMEGA Gel ExtractionKit说明书对PCR产物进行胶回收，进行测序分析，获得杂交瘤细胞的重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID.NO.3，轻链可变区序列氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4。

重链可变区氨基酸序列为SEQ.ID.NO.3:

轻链可变区序列氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4:

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。

序列表

<110> 北京岳昊科技发展有限公司

<120> 一种肝癌细胞转移检测用的单克隆抗体及试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atgggtgacc cggaacgtcc ggaagctgct ggtctggacc aggacgaacg ttcttcttct 60

gacaccaacg aatctgaaat caaatctaac gaagaaccgc tgctgcgtaa atcttctcgt 120

cgtttcgtta tcttcccgat ccagtacccg gacatctgga aaatgtacaa acaggctcag 180

gcttctttct ggaccgctga agaagttgac ctgtctaaag acctgccgca ctggaacaaa 240

ctgaaagctg acgaaaaata cttcatctct cacatcctgg ctttcttcgc tgcttctgac 300

ggtatcgtta acgaaaacct ggttgaacgt ttctctcagg aagttcaggt tccggaagct 360

cgttgcttct acggtttcca gatcctgatc gaaaacgttc actctgaaat gtactctctg 420

ctgatcgaca cctacatccg tgacccgaaa aaacgtgaat tcctgttcaa cgctatcgaa 480

accatgccgt acgttaaaaa aaaagctgac tgggctctgc gttggatcgc tgaccgtaaa 540

tctaccttcg gtgaacgtgt tgttgctttc gctgctgttg aaggtgtttt cttctctggt 600

tctttcgctg ctatcttctg gctgaaaaaa cgtggtctga tgccgggtct gaccttctct 660

aacgaactga tctctcgtga cgaaggtctg cactgcgact tcgcttgcct gatgttccag 720

tacctggtta acaaaccgtc tgaagaacgt gttcgtgaaa tcatcgttga cgctgttaaa 780

atcgaacagg aattcctgac cgaagctctg ccggttggtc tgatcggtat gaactgcatc 840

ctgatgaaac agtacatcga attcgttgct gaccgtctgc tggttgaact gggtttctct 900

aaagttttcc aggctgaaaa cccgttcgac ttcatggaaa acatctctct ggaaggtaaa 960

accaacttct tcgaaaaacg tgtttctgaa taccagcgtt tcgctgttat ggctgaaacc 1020

accgacaacg ttttcaccct ggacgctgac ttctaa 1056

<210> 2

<211> 351

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Met Gly Asp Pro Glu Arg Pro Glu Ala Ala Gly Leu Asp Gln Asp Glu

1 5 10 15

Arg Ser Ser Ser Asp Thr Asn Glu Ser Glu Ile Lys Ser Asn Glu Glu

20 25 30

Pro Leu Leu Arg Lys Ser Ser Arg Arg Phe Val Ile Phe Pro Ile Gln

35 40 45

Tyr Pro Asp Ile Trp Lys Met Tyr Lys Gln Ala Gln Ala Ser Phe Trp

50 55 60

Thr Ala Glu Glu Val Asp Leu Ser Lys Asp Leu Pro His Trp Asn Lys

65 70 75 80

Leu Lys Ala Asp Glu Lys Tyr Phe Ile Ser His Ile Leu Ala Phe Phe

85 90 95

Ala Ala Ser Asp Gly Ile Val Asn Glu Asn Leu Val Glu Arg Phe Ser

100 105 110

Gln Glu Val Gln Val Pro Glu Ala Arg Cys Phe Tyr Gly Phe Gln Ile

115 120 125

Leu Ile Glu Asn Val His Ser Glu Met Tyr Ser Leu Leu Ile Asp Thr

130 135 140

Tyr Ile Arg Asp Pro Lys Lys Arg Glu Phe Leu Phe Asn Ala Ile Glu

145 150 155 160

Thr Met Pro Tyr Val Lys Lys Lys Ala Asp Trp Ala Leu Arg Trp Ile

165 170 175

Ala Asp Arg Lys Ser Thr Phe Gly Glu Arg Val Val Ala Phe Ala Ala

180 185 190

Val Glu Gly Val Phe Phe Ser Gly Ser Phe Ala Ala Ile Phe Trp Leu

195 200 205

Lys Lys Arg Gly Leu Met Pro Gly Leu Thr Phe Ser Asn Glu Leu Ile

210 215 220

Ser Arg Asp Glu Gly Leu His Cys Asp Phe Ala Cys Leu Met Phe Gln

225 230 235 240

Tyr Leu Val Asn Lys Pro Ser Glu Glu Arg Val Arg Glu Ile Ile Val

245 250 255

Asp Ala Val Lys Ile Glu Gln Glu Phe Leu Thr Glu Ala Leu Pro Val

260 265 270

Gly Leu Ile Gly Met Asn Cys Ile Leu Met Lys Gln Tyr Ile Glu Phe

275 280 285

Val Ala Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Gly Phe Ser Lys Val Phe Gln

290 295 300

Ala Glu Asn Pro Phe Asp Phe Met Glu Asn Ile Ser Leu Glu Gly Lys

305 310 315 320

Thr Asn Phe Phe Glu Lys Arg Val Ser Glu Tyr Gln Arg Phe Ala Val

325 330 335

Met Ala Glu Thr Thr Asp Asn Val Phe Thr Leu Asp Ala Asp Phe

340 345 350

<210> 3

<211> 116

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Met Ala

20 25 30

Trp Gly Thr Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ser Tyr Pro Gly Ala Pro Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Cys Lys

50 55 60

Ala Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ala Cys Phe Gln Leu Lys Ser Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Asp Val Cys Ser Ser Ile Thr Thr Ser

20 25 30

Tyr Ala Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Tyr Ser Asn Leu Asp Glu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Cys Trp Thr Asp Ser Pro

85 90 95

Ala Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

Claims

1.一种单克隆抗体，其特征在于：其中该抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示，轻链可变区序列氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

2.权利要求1所述单克隆抗体的应用，其特征在于所述应用为制备肝癌细胞转移检测用的试剂盒。

3.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的单克隆抗体。

4.权利要求1所述单克隆抗体用于制备检测RRM2B蛋白的试剂盒中的应用。