CN114672491B - 玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在调控植物抗寒性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及涉及基因工程技术领域，尤其涉及玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在调控植物抗寒性中的应用。本发明发现当敲除植物中玉米ZmTIP4家族基因时，植物的抗寒性能显著提升，借此，玉米ZmTIP4家族基因在调控植物抗寒性中可以发挥关键作用，可以通过敲除玉米ZmTIP4家族基因直接获得抗寒能力提高的植株。本发明提供的玉米ZmTIP4家族基因及其编码蛋白为培育耐低温植物新品种提供了资源，同时为研究植物应答低温胁迫的机制和抵御不利环境的分子机理奠定一定的理论基础。

Description

玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在调控植物抗寒性中的 应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在调控植物抗寒性中的应用。

背景技术

环境胁迫(Environmental stress)指环境因素的量接近或超过有机体、种群或群落的一个或多个忍耐极限时造成的胁迫作用。低温胁迫是对植物耐寒性的检验，植物耐寒性是对低温环境长期适应中通过本身的遗传变异和自然选择获得的一种适应性。低温胁迫包括植物0℃以下的低温伤害(冻害)和0℃以上的低温伤害(冷害)。冻害的机理有3点：①细胞内结冻；②原生质脱水；③生物膜体系破坏。冷害的原发反应是生物膜发生相变，液晶态变为凝胶态，原生质环流停止，植物体内乙烯增加，光呼吸速率下降。低温胁迫不仅影响植物的生长发育、地理分布，还严重影响作物的产量。因此，研究植物响应干寒胁迫的生理生化变化和分子机理，寻找调控植物响应干寒的关键基因是目前的重点之一。

植物的水通道蛋白(AQP)对于维持植物水分平衡具有重要的意义，水通道蛋白不仅是水选择性通道蛋白，同时还具有许多其他生理生化功能，是一类多功能蛋白。植物水通道蛋白在长途和跨膜水分运输、除水以外的物质运输、细胞渗透调节、细胞的伸长与分化、气孔运动等生理过程中都扮演着重要角色。近年来发现植物水通道蛋白能够参与逆境胁迫，尤其是低温胁迫，本发明构建了液泡膜水通道蛋白ZmTIP4-1的玉米突变体株系，其具有耐低温的表型。

玉米(Zea mays L)属于禾本科玉蜀黍属植物，是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物。利用CRISPR-Cas9技术可以把目标基因进行敲除，得到该基因功能缺失突变体，并使其后代表现出稳定遗传的抗逆能力。目前可以通过农杆菌去侵染，将含有CRISPR-Cas9质粒的农杆菌侵染玉米愈伤组织,再生出具有抗性的转基因植株。选择低拷贝转基因株系进行逆境表型检测，获得具有高效抗逆的转基因玉米，为农业生产提供优良品种资源。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在调控植物抗寒性中的应用。通过敲除植株玉米ZmTIP4家族基因可以有效提高植株的抗寒性。

第一方面，本发明提供玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在调控植物抗寒性中的应用。

本发明进一步提供玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在抗寒植物育种或抗寒转基因植物制备中的应用。

进一步地，所述玉米ZmTIP4家族基因的编码蛋白包括如SEQ ID NO.1-4所示的氨基酸序列的一种或多种。

进一步地，所述玉米ZmTIP4家族基因包括如SEQ ID NO.5-8所示核苷酸序列的一种或多种。

其中，玉米ZmTIP4家族基因ZmTIP4-1、ZmTIP4-2、ZmTIP4-3和ZmTIP4-4的氨基酸序列依次为SEQ ID NO.1-4所示，核苷酸序列依次为SEQ ID NO.5-8所示。

进一步地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为玉米。

第二方面本发明提供一种用于编辑玉米ZmTIP4家族基因的gRNA，所述gRNA包括如下序列：

5’-GGCGACTTCTTCAGGGGCGTCCT-3’。

本发明进一步提供一种调控植物抗寒性的方法，包括：

调控植物中玉米ZmTIP4家族基因的表达水平，所述玉米ZmTIP4家族基因包括如SEQ ID NO.5-8所示核苷酸序列的一种或多种。

进一步地，通过降低所述植物中所述玉米ZmTIP4家族基因的编码基因的表达水平，提高所述植物的抗寒能力；或，通过将敲除了所述玉米ZmTIP4家族基因的株系与其他株系杂交，培育抗寒株系。

进一步地，所述降低所述植物中所述玉米ZmTIP4家族基因的表达水平，具体为：利用所述gRNA，通过CRISP-Cas9技术敲除述植物中所述玉米中的所述玉米ZmTIP4家族基因。

本发明具备如下有益效果：

本发明经实验证明ZmTIP4基因的纯合敲除株系，相比野生型对照植株，对低温逆境胁迫的耐受性显著提高。本发明对玉米的耐冷的分子机制的研究具有重要意义；另外，该基因在培育耐冷植物品种中具有重要功能，从而为培育抗逆境作物新品种提供了重要的可能性，对农业生产具有重大意义。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的ZmTIP4-1基因的CRISPR/Cas9敲除突变体鉴定结果；

图2为本发明实施例2提供的ZmTIP4-1敲除突变的耐低温表型；

图3为本发明实施例2提供的ZmTIP4-1敲除突变的离子渗漏率测定及渗透势测定；

图4为本发明实施例2提供的ZmTIP4家族基因表达受冷诱导的情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,21)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中的主要试剂为：各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD购自NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收的试剂盒购买自上海捷瑞生物工程公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及Glucose、BSA、LBMedium等购自Sigma、Bio-Rad等公司；实时定量PCR所用的试剂购自于TaKaRa，实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例中所使用的引物由华大公司合成，并进行相关测序。

实施例1一种构建抗寒的CRISPR/Cas9玉米敲除突变体的方法：

本实施例中所涉及的ZmTIP4基因来源于玉米B73自交系，其在玉米基因组中的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，由4103个核苷酸组成，为所述ZmTIP4基因在玉米基因组中序列，其中从第855位碱基到第2570位碱基为内含子序列；所述ZmTIP4基因的cDNA序列如序列表中SEQ ID NO.12所示，由750个核苷酸组成；SEQ ID NO.1为DNA序列，SEQ ID NO.5所示为蛋白质序列。

构建方法具体如下：

1、重组表达载体pBUE411-ZmTIP4-1的构建

利用CRSIPR-P2.0网站设计ZmTIP4-1基因最优的guide RNA序列，设计引物F引物由GGCG加guide RNA组成，R引物由AAAC加上guide RNA的反向互补序列组成。将小分子单链F和R引物退火形成双链后再连接到Bsa1酶切好的PUBE411的载体上，将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pBUE411载体的酶切位点Bsa1间插入guide RNA的DNA片段NO.4：5’-GGCGACTTCTTCAGGGGCGTCCT-3’(SEQ ID NO.9)。

2、ZmTIP4-1基因敲除玉米的获得及鉴定

ZmTIP4-1转基因拟南芥及转入pBUE411-ZmTIP4-1空载体的玉米植株的获得将步骤一构建的重组表达载体pBUE411-ZmTIP4-1通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由载体引物F和自身R引物组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有pBUE411-ZmTIP4-1(PCR目的条带大小为300左右)的农杆菌GV3101命名为pBUE411-ZmTIP4-1。

采用用农杆菌花序侵染的方法将上述所得的重组农杆菌pBUE411-ZmTIP4(转化玉米野生型(B73生态型)。转化侵染玉米愈伤组织(使用bar抗性进行筛选，过程由中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心完成)。

3、ZmTIP4-1的CRISPR/Cas9敲除株系鉴定

pBUE411载体能够在T0代得到纯合稳定敲除株系，然后通过自交F2代得到去除CRISPR/Cas9背景的纯合敲除株系。

三、ZmTIP4-1 CRISPR株系测序鉴定

提取玉米野生型(B73生态型)和敲除植株(103，106，112)的总DNA，利用PCR检测材料中ZmTIP4-1基因的DNA序列差异。具体如下：

PCR扩增方法如下：

其中，扩增ZmTIP4基因的引物序列为：

ZmTIP4-1-F1：5’-atggggaagctgacgctggg-3’(SEQ ID NO.10)；

ZmTIP4-1-R1：5’-tcatgggtcctgctggggca-3’(SEQ ID NO.11)。

上述引物的反应条件如下:

(1)反应体系的建立

PCR反应体系

(2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad PCR仪进行实验。

(3)反应程序的设定：

PCR反应程序

使用1％琼脂糖凝胶157V电压电泳检测条带大小为750bp左右，送测序公司进行测序。

PCR检测测序结果如图1所示，ZmTIP4-1基因的存在一种敲除形式，在ATG下游60bp处缺失两个碱基均导致移码突变。

实施例2 ZmTIP4基因敲除株系低温处理试验

低温胁迫能够造成叶片损伤。同时也能造成叶片脱水皱缩，将在23℃正常光照条件下生长的14天玉米幼苗(包含萌发出土3-4天)放置4℃培养箱进行处理3天，将处理后的ZmTIP4-1 CRISPR/Cas9敲除株系103，106和112及同批野生型(B73生态型)放置23℃恢复24h，然后进行表型观察和图片采集(如图2所示)。可以看到相对于野生型玉米植株，在低温处理后103，106和112耐受低温胁迫的能力明显提高，将ZmTIP4-1基因敲除后能够明显提高玉米耐受低温胁迫的能力(此实验通过三次以上低温处理验证)。

植株离子渗漏测定实验：

植物在受到低温胁迫后，低温能够对植物体细胞造成损伤，使其细胞膜对离子的选择透过性丧失或部分丧失，因此测定离子渗漏能够反应植物对于低温胁迫等多种逆境胁迫的耐受性。

本实施例将玉米幼苗地上部分放入15ml离心管中，加入10ml去离子水，使植株完全浸没水面以下，23℃摇床120rpm 1h，使用粒子渗漏检测仪进行测定记为S0，然后将所有样品放置100℃水浴1h，23℃摇床120rpm 1h，然后再次对样品进行测定记为S1(注意：在测定每个样品前都要对仪器探头进行涮洗然后测定涮洗液(去离子水)的值记为S2及S3最终粒子渗漏率的计算公式为：

Ion leakage(％)＝S0-S2/S1-S3。

本实验至少测定三棵同一株系的玉米幼苗取平均值(三次实验，*表示差异显著，P<0.05)。

如图3所示103，106和112离子渗漏率明显低于野生型(B73生态型)证明其在低温胁迫处理下耐受低温胁迫能力较野生型明显提高。

本发明进一步通过对低温处理前的B73的转录组数据进行分析发现ZmTIP4家族基因表达均受低温诱导，并进行了qRT-PCR的验证，得到如图4所示结果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在调控植物抗寒性中的应用

<130> KHP201118199.2

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4103

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

atgaagaata acgtgcgtgc ctcatataaa tgtatagatc gagcactgat gagttgttga 60

tggttgctac actagctgtg tggatcgatc ggaggccgac atggcgtgag cccccaaaag 120

gcacaagtgc taggtcctgt atatatatat atatatatgc aagaagcaat gtatggaaaa 180

gatgtgtgct ttgcatgaca ctgaacgaag aagaagaagt agaaccggcc gggccgtgcg 240

gcgtacgtgc gcacaattag ttcctatcag tctcagcgga gaattacagc gcgaggcgta 300

atttcatttc ccgtacctgc agctagctag ccttgcattg cttattgcca gcaatgtacg 360

taatcaccgg cagcaaaaga agcagtaaat aagtacggct cgatgctttt ttgactagtt 420

gccacgtgat tgtgatgtga tgttatccta acttttttca gttcatatga ctattcttaa 480

gtaaaatata gcacagttag tcgcgaacca aacatggaga cctataatct gctagtaggc 540

tctgatccat cccgtgcttt ttggccacta tatatagaga gagactaacg ctagctagct 600

agcttgcttg ctctctaaca cgcacagaca cagtcacaca gcgttgcgcg ccaaggagag 660

agcttattgc aaattactct gtggaccgaa ccggtcggtc ggaataataa gcagcagaga 720

gagagagatg gggaagctga cgctggggca ccgcggcgag gcgtcagagc cggacttctt 780

caggggcgtc ctcggcgagc tcgtcctcac cttcctcttc gtcttcatcg gcgtcggagc 840

cgccatgacc gacggtacgt acgtatgagt cagctaccgt tattgcacgc acgcatgcat 900

cgtccagctg gtatatatcc tttctattcc atgcatggat ccaaatccac tggcagctgg 960

agtagctcca tccatgcaca tgtctcctta atcattttct ccaaattcaa aaaaaatgtg 1020

agttcacgaa cacgaagatg gcgcggcggg ccggccggcg ttagttcccc tccggcccct 1080

tcccttccgc cggacgcgcg ccttcctttt cttttcgcga aacggcgtgt ggttcctctt 1140

agcttgcttg tccgtctgta gcgttcgatt attcatcgat cggtttctca atcagagtac 1200

aaactgcatg cactcgaaac gtgccgatgt taaaacgatt atatttctag cagacagaca 1260

gataccgaga gatggatctc cagtagtaga atcaaactat actagacgac gtacctttaa 1320

attaaaacga ccatatatac tctctatttc gtcttagtta tcgatggata gtgtaaaatt 1380

gaactatcta atgacaacta aaaagaaata gaggaagtat atttctagca tttcataacg 1440

aacgtacttc caacaggatg tggtgaagat ttctctgaaa acgtgactac caaaatctgc 1500

tctttgttgc ctgaattaat gatcatgtcc aaagcctgaa ggcctaattg cagcgtatgg 1560

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gcactcaaaa attttattga tctaatttta actgtctata tcagttttat cctaaatcta 1680

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accttttaca actattatga caaatacttt tataacactc tctctttttt atttgtcgtg 1800

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attttgacgt agataatatt tatgtcgatc ccatcatcac ttatctaatt caaagtgttg 2160

tggctgcaag ttgagccaat cactgtggcc ctaaattaaa gctcgcggga gacgatgcca 2220

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gcaggaccca tgatcagcgt gtgcatcgtg cgttggatcg atcggagtgt gatttggttt 3240

gagctggcga cgcattgtgt ttgagattga tcgaggaccg aatacgtgta tgcatgctgt 3300

ctcggccggt ccggtctttc gtgtgtgtgc acagtagcac acgcggtata tagtgtcctc 3360

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gcacgctgct gcattcttcc gcctcacagg ctctcagccg ccgctgacgc gatgcccccg 3900

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gaccccgtgg tcgcgctcca cgccatccgc gcggcgccca cggcgtcctg cgcgctctcc 4080

ctttttcgcg cgatcccctc cca 4103

<210> 2

<211> 2316

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

cgtcccaccc ctcctgcatt tcaaaataat atctccctgc gcttttccta gccctttgtc 60

atccaaggat acaataaaca accggcgctt ttacaccccc gccaagaaca ggagcaacaa 120

caataaggct cctcgcaaca atccattctc atccatggcg aagctcatga acaagctggt 180

cgattcgttc gagcacgacg agatactgga cgtcggctgc gtgcgcgccg tgctggccga 240

gctcgtcctc accttcctct tcgtcttcac cggcgtctcc gccgccatgg ccgccggtac 300

gtcatacgac catgcgccca ccgcgcctct atcagaccgt ctcctctcca ctcgatcgcc 360

ctcctatttg ttatttatcc ctctgggctc tggccaggaa aagacaggtc cttttccccc 420

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tggatcctat ttatgttatg tttggtgtgc gctgtcggat ggctattgtt tcggtagtag 960

agagacgcgg gccatgcttg tctgcctcaa atcaacttgg gccgggctcg aatgggtgag 1020

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ccaccgggga ctggacaaac cactgggtct actggatcgg cccgctgctc ggcgggcccc 1860

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gtaaaacagg tcattctctg caagcatggt acatacattg gccaaggtaa ttagagaggc 2040

ttgctgtaaa gcagtaggat tgctggctgt agaaattgtt gatgggcttt ttttgggggt 2100

ttcctgccaa ggaattcttt cttttatata atctcaaaaa agtttttttt ttttggtatg 2160

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<210> 3

<211> 2413

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 3

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gctttcccct ccccgccagg aacaacaggg ctcctcgcaa taattcgtcc atccatggcg 180

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ggctgcgtgc gcgccgtgct ggccgagctc gtcctcacct tcctcttcgt cttcaccggc 300

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cctctccggc tcttcctatc cggtcttcta tgtccttgta tttttatttg attcctcact 420

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attgtatcta atcagctgct cagatttggt gatcaccaag tattgatttg cataacagtt 1380

gctggtgaag ttaccagtca aatactccct ccgttctttt ttttatttgt cgcagtttag 1440

ttcgaaaata aactagtgaa cgacaaatat tcaagaacaa aggtccacac catgatttaa 1500

gagatggact aaatcatgct tatctgctgt ggcagccgtg aactcactaa aacttgttta 1560

acgtcacttt ttccaccatg aattaagaac ggaagctaca ctagtccagc agcaacagca 1620

aagcttgcag tgctgaccaa aaatgtgaaa aatgcaggtg accccggtgc acgccctggg 1680

cgctggcatc agcccgatgc agggcctggt gatggaggtg atcctcacct tctcgctgct 1740

cttcgtcacc tacgccatga tcctggaccc gcggagccag gtccggacca tcggcccgct 1800

gctgacgggg ctcatagtcg gcgccaacag cctcgccggc ggcaacttca ccggcgcgtc 1860

catgaacccg gcgcggtcct tcggtcccgc catggccacc ggggtctgga ccaaccactg 1920

ggtctactgg atcggcccgc tgctcggcgg gtccctggcc ggcttcgtgt acgagtcgct 1980

gttcatggtg tacaagacgc acgagccgct gctcaatgga gacatctgac gaccgtcggg 2040

cccccagggc agtgagcacg gttcatgctt gttttctgta aaatagttcg ttacctacaa 2100

gcatgatgca tatattgacc aaggtaatta ataggagagg gttgctgtta ccctggtggg 2160

attgtgggat gtagaaattg ttgctgggct ttgctttttt ttttactttt cctcccaagg 2220

aattttttaa gaggctgggt tctgtaaagg atttgtttag gctattagtt agctatgtag 2280

tagaaaacta gagaatgcta tacgttggac gtgatttttt ttcacgtata ttgttgtacg 2340

atatggtatt ttttatcttc cggatgaaat tggatgtaca tagcataatt ttttttgaag 2400

cagtatttat gct 2413

<210> 4

<211> 1122

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 4

caaacagtct cgtgcgcttt tactacacca cgcttacgga tgtatccgtc tccccctccc 60

cacctatttt atggtgtgag cgtcagccgt cagcactcac caagatccaa cagacacttc 120

ttcaatccac tagctaagcg cgccatggca aagttcgctc ttggtcacca ccgcgaggcc 180

tccgacgccg gctgcgtccg tgccgtcctc gccgagctca tcctcacctt cctcttcgtc 240

ttcgccggcg ttggctccgc catggcaaca ggtacatacc gtatagtata atatataaca 300

catgcaccgt ggcaatcatg catgcacgca cgcagggaag ctggccggcg gcggcgggga 360

cacggtagtg ggcctgacgg cggtggcgct ggcgcacacg ctggtggtgg ccgtcatggt 420

gtcagcgggg ctgcacgtct ccggcggcca catcaacccg gccgtgacgc tgggcctcgc 480

cgccacgggc cgcatcacgc tgttccgctc cgcgctctac gtggccgccc agctgctcgg 540

ctccacgctc gcctgcctcc tcctcgcttt cctcgcagtt gccgacagcg gcgtgcccgt 600

gcacgcgctg ggcgccggcg tcggcgcgct ccggggcgtg ctcatggagg ccgtgctcac 660

cttctcgctg ctcttcgcgg tctacgccac cgtcgtcgac ccgcgccgcg ccgtcggcgg 720

catgggcccg ctgctggtgg gcctggtcgt cggcgccaac gtgctcgccg gcgggccctt 780

ctccggcgcg tccatgaacc ccgcgcgctc cttcggcccc gcgctcgtgg ctggggtgtg 840

ggccgaccac tgggtctact gggtcgggcc tcttatcggt gggccgctcg ctgggctggt 900

ctatgacggc ctcttcatgg cccagggcgg acacgaaccg cttcccaggg atgacaccga 960

cttctaggca gtaggtgtgt gttctcctga ataatttgaa ttgaaaacac atgtattgaa 1020

gcctctaatg tttcggtttc gattcgaatg gaatggaagc agcagtatca aataaagtct 1080

cggtgaggtc gtaattcact taaacatatg tttttaagac ct 1122

<210> 5

<211> 249

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 5

Met Gly Lys Leu Thr Leu Gly His Arg Gly Glu Ala Ser Glu Pro Asp

1 5 10 15

Phe Phe Arg Gly Val Leu Gly Glu Leu Val Leu Thr Phe Leu Phe Val

20 25 30

Phe Ile Gly Val Gly Ala Ala Met Thr Asp Gly Ala Thr Thr Lys Gly

35 40 45

Ser Thr Ala Gly Gly Asp Leu Thr Ala Val Ala Leu Gly Gln Ala Leu

50 55 60

Val Val Ala Val Ile Ala Thr Ala Gly Phe His Ile Ser Gly Gly His

65 70 75 80

Val Asn Pro Ala Val Thr Leu Ser Leu Ala Val Gly Gly His Val Thr

85 90 95

Leu Phe Arg Ser Ser Leu Tyr Ile Ala Ala Gln Met Leu Gly Ser Ser

100 105 110

Ala Ala Cys Phe Leu Leu Arg Trp Leu Thr Gly Gly Leu Ala Thr Pro

115 120 125

Val His Ala Leu Ala Glu Gly Val Gly Ala Leu Gln Gly Val Val Ala

130 135 140

Glu Ala Val Phe Thr Phe Ser Leu Leu Phe Val Ile Tyr Ala Thr Ile

145 150 155 160

Leu Asp Pro Arg Lys Leu Leu Pro Gly Ala Gly Pro Leu Leu Thr Gly

165 170 175

Leu Leu Val Gly Ala Asn Ser Val Ala Gly Ala Ala Leu Ser Gly Ala

180 185 190

Ser Met Asn Pro Ala Arg Ser Phe Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly Ile

195 200 205

Trp Thr His His Trp Val Tyr Trp Val Gly Pro Leu Ala Gly Gly Pro

210 215 220

Leu Ala Val Leu Val Tyr Glu Cys Cys Phe Ile Ala Ala Ala Pro Thr

225 230 235 240

His Ala Leu Leu Pro Gln Gln Asp Pro

245

<210> 6

<211> 255

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 6

Met Ala Lys Leu Met Asn Lys Leu Val Asp Ser Phe Glu His Asp Glu

1 5 10 15

Ile Leu Asp Val Gly Cys Val Arg Ala Val Leu Ala Glu Leu Val Leu

20 25 30

Thr Phe Leu Phe Val Phe Thr Gly Val Ser Ala Ala Met Ala Ala Gly

35 40 45

Ser Asp Gly Lys Pro Gly Asp Ala Met Pro Met Ala Thr Leu Ala Ala

50 55 60

Val Ala Ile Ala His Ala Leu Ala Ala Gly Val Leu Val Thr Ala Gly

65 70 75 80

Phe His Val Ser Gly Gly His Leu Asn Pro Ala Val Thr Val Gly Leu

85 90 95

Met Val Arg Gly His Ile Thr Lys Leu Arg Ala Val Leu Tyr Val Ala

100 105 110

Ala Gln Leu Leu Ala Ser Ser Ala Ala Cys Val Leu Leu Arg Phe Leu

115 120 125

Ser Gly Gly Met Val Thr Pro Val His Ala Leu Gly Arg Gly Ile Ser

130 135 140

Pro Met Gln Gly Leu Val Met Glu Val Ile Leu Thr Phe Ser Leu Leu

145 150 155 160

Phe Val Thr Tyr Ala Met Ile Leu Asp Pro Arg Ser Gln Val Arg Ala

165 170 175

Ile Gly Pro Leu Leu Thr Gly Leu Ile Val Gly Ala Asn Ser Leu Ala

180 185 190

Gly Gly Asn Phe Thr Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Arg Ser Phe Gly

195 200 205

Pro Ala Leu Ala Thr Gly Asp Trp Thr Asn His Trp Val Tyr Trp Ile

210 215 220

Gly Pro Leu Leu Gly Gly Pro Leu Ala Gly Phe Val Tyr Glu Ser Leu

225 230 235 240

Phe Leu Val Gln Lys Met His Glu Pro Leu Leu Asn Gly Glu Val

245 250 255

<210> 7

<211> 311

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 7

Met Ser His Ser Pro Leu Pro Pro Pro Val Phe Gln Asn Ile Ser Leu

1 5 10 15

Arg Phe Ser Glu Ser Phe Ser Leu Gln Gly Thr Glu Thr Thr Gly Ala

20 25 30

Phe Thr Pro Pro Ala Phe Pro Ser Pro Pro Gly Thr Thr Gly Leu Leu

35 40 45

Ala Ile Ile Arg Pro Ser Met Ala Lys Leu Val Asn Lys Leu Val Asp

50 55 60

Ser Phe Asp His His Glu Ala Pro Ala Pro Asp Val Gly Cys Val Arg

65 70 75 80

Ala Val Leu Ala Glu Leu Val Leu Thr Phe Leu Phe Val Phe Thr Gly

85 90 95

Val Ser Ala Ser Met Ala Ala Gly Ala Gly Gly Lys Pro Gly Glu Ala

100 105 110

Met Pro Met Ala Thr Leu Ala Ala Val Ala Ile Ala His Ala Leu Ala

115 120 125

Ala Gly Val Leu Val Thr Ala Gly Phe His Val Ser Gly Gly His Leu

130 135 140

Asn Pro Ala Val Thr Val Gly Ile Leu Val Arg Gly His Ile Thr Lys

145 150 155 160

Leu Arg Ala Leu Leu Tyr Val Ala Ala Gln Leu Leu Ala Ser Ser Leu

165 170 175

Ala Cys Ile Leu Leu Arg Tyr Leu Ser Gly Gly Met Val Thr Pro Val

180 185 190

His Ala Leu Gly Ala Gly Ile Ser Pro Met Gln Gly Leu Val Met Glu

195 200 205

Val Ile Leu Thr Phe Ser Leu Leu Phe Val Thr Tyr Ala Met Ile Leu

210 215 220

Asp Pro Arg Ser Gln Val Arg Thr Ile Gly Pro Leu Leu Thr Gly Leu

225 230 235 240

Ile Val Gly Ala Asn Ser Leu Ala Gly Gly Asn Phe Thr Gly Ala Ser

245 250 255

Met Asn Pro Ala Arg Ser Phe Gly Pro Ala Met Ala Thr Gly Val Trp

260 265 270

Thr Asn His Trp Val Tyr Trp Ile Gly Pro Leu Leu Gly Gly Ser Leu

275 280 285

Ala Gly Phe Val Tyr Glu Ser Leu Phe Met Val Tyr Lys Thr His Glu

290 295 300

Pro Leu Leu Asn Gly Asp Ile

305 310

<210> 8

<211> 287

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 8

Met Tyr Pro Ser Pro Pro Pro His Leu Phe Tyr Gly Val Ser Val Ser

1 5 10 15

Arg Gln His Ser Pro Arg Ser Asn Arg His Phe Phe Asn Pro Leu Ala

20 25 30

Lys Arg Ala Met Ala Lys Phe Ala Leu Gly His His Arg Glu Ala Ser

35 40 45

Asp Ala Gly Cys Val Arg Ala Val Leu Ala Glu Leu Ile Leu Thr Phe

50 55 60

Leu Phe Val Phe Ala Gly Val Gly Ser Ala Met Ala Thr Gly Lys Leu

65 70 75 80

Ala Gly Gly Gly Gly Asp Thr Val Val Gly Leu Thr Ala Val Ala Leu

85 90 95

Ala His Thr Leu Val Val Ala Val Met Val Ser Ala Gly Leu His Val

100 105 110

Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Thr

115 120 125

Gly Arg Ile Thr Leu Phe Arg Ser Ala Leu Tyr Val Ala Ala Gln Leu

130 135 140

Leu Gly Ser Thr Leu Ala Cys Leu Leu Leu Ala Phe Leu Ala Val Ala

145 150 155 160

Asp Ser Gly Val Pro Val His Ala Leu Gly Ala Gly Val Gly Ala Leu

165 170 175

Arg Gly Val Leu Met Glu Ala Val Leu Thr Phe Ser Leu Leu Phe Ala

180 185 190

Val Tyr Ala Thr Val Val Asp Pro Arg Arg Ala Val Gly Gly Met Gly

195 200 205

Pro Leu Leu Val Gly Leu Val Val Gly Ala Asn Val Leu Ala Gly Gly

210 215 220

Pro Phe Ser Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Arg Ser Phe Gly Pro Ala

225 230 235 240

Leu Val Ala Gly Val Trp Ala Asp His Trp Val Tyr Trp Val Gly Pro

245 250 255

Leu Ile Gly Gly Pro Leu Ala Gly Leu Val Tyr Asp Gly Leu Phe Met

260 265 270

Ala Gln Gly Gly His Glu Pro Leu Pro Arg Asp Asp Thr Asp Phe

275 280 285

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggcgacttct tcaggggcgt cct 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggggaagc tgacgctggg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcatgggtcc tgctggggca 20

<210> 12

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggggaagc tgacgctggg gcaccgcggc gaggcgtcag agccggactt cttcaggggc 60

gtcctcggcg agctcgtcct caccttcctc ttcgtcttca tcggcgtcgg agccgccatg 120

accgacggag cgacgacgaa gggtagcacc gctggaggcg atctgacggc ggtggcgctg 180

gggcaggcgc tggtggtggc ggtgatcgcg acggcggggt tccacatctc cggcggccac 240

gtcaacccgg ccgtgacgct gtcgctggcc gtcggcgggc acgtcacgct gttccgctcc 300

tccctgtaca tcgccgccca gatgctcggc tcctccgcgg cctgcttcct gctcaggtgg 360

ctcacgggcg ggctagccac gccggtgcac gcgctggcgg agggcgtggg cgcgctgcag 420

ggcgtggtgg cggaggccgt cttcaccttc agcctgctct tcgtcatcta cgccaccatc 480

ctggacccgc ggaagctgct cccgggcgcc ggcccgctgc tcactggcct cctcgtcggg 540

gccaactccg tcgccggcgc agccctgtcc ggcgcctcca tgaacccggc caggtccttc 600

gggcccgccg tcgcctcggg catctggacg caccactggg tgtactgggt cggcccgctc 660

gccggaggcc cgctcgccgt gctcgtctac gagtgctgct tcatagcggc cgctcccacg 720

cacgcccttc tgccccagca ggacccatga 750

Claims (6)

1.玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在负调控植物抗寒性中的应用；所述玉米ZmTIP4家族基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述植物为玉米;

所述负调控为通过降低玉米ZmTIP4家族基因的表达水平提高植物抗寒性。

2.玉米ZmTIP4家族基因或其编码蛋白在抗寒植物育种中的应用；所述玉米ZmTIP4家族基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述植物为玉米；

所述应用包括通过将敲除了所述玉米ZmTIP4家族基因的株系与其他株系杂交，培育抗寒株系。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述玉米ZmTIP4家族基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种用于编辑玉米ZmTIP4家族基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA的序列如下所示：

5’-GGCGACTTCTTCAGGGGCGTCCT-3’。

5.一种调控植物抗寒性的方法，其特征在于，包括：

通过降低植物中玉米ZmTIP4家族基因的编码基因的表达水平，提高所述植物的抗寒能力；所述玉米ZmTIP4家族基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述植物为玉米。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低所述植物中所述玉米ZmTIP4家族基因的编码基因的表达水平，具体为：利用权利要求4所述gRNA，通过CRISP-Cas9技术敲除植物中的所述玉米ZmTIP4家族基因。