CN101245345B - 山羊S6K1基因cDNA编码区核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从山羊肌肉细胞分离的编码S6K1蛋白的cDNA的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。本发明通过比对已知的人、大鼠、兔、牛S6K1基因cDNA的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛S6K1基因cDNA序列(GenBank登陆号AY396564)设计出了一对用于RT-PCR扩增羊S6K1基因cDNA编码区片段的引物并用这对引物通过RT-PCR方法扩增出了特异性片段，测序后得到了羊S6K1基因cDNA的编码区的1563bp的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。获得的这1563bp的核苷酸序列可进一步用于羊S6K1基因全长cDNA的克隆及用于通过RT-PCR或杂交的方法检测S6K1基因的组织表达特异性，也可用于重组表达得到蛋白后制备检测S6K1的抗体。

Description

山羊S6K1基因cDNA编码区核苷酸序列

技术领域 本发明涉及从山羊肌肉细胞分离的编码S6K1蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码S6K1蛋白质的cDNA编码区1563bp的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。

背景技术 S6K1是一个属于AGC激酶家族的Ser/Thr激酶，蛋白包含了5个主要的结构域，自N端始分别为NT(N-terminal domain)，catalytic domain，the linker region，autoinhibitory domain和CT(C-terminal domain)。哺乳动物中，目前已经清楚牛的S6K1基因cDNA编码区有1584个核苷酸组成，编码了527个氨基酸残基，兔、人和大鼠的S6K1基因编码区由1578个核苷酸组成，编码525个氨基酸残基。

S6K1是细胞生长和细胞周期进程的正调节器，在mTOR信号通路中它接受来自上游的mTOR(themammalian target of rapamycin)的刺激，至少可以在3个方面发生作用：1)对rpS6、eIF4B发生作用，促进占细胞内总mRNA的15％-20％的5′TOP mRMA的翻译，翻译合成核糖体蛋白、延伸因子eEF1A和eEF2及mRNA稳定蛋白PABP，进而调节细胞的形态大小、更新和存活；2)抑制IRS-1调节细胞对胰岛素的敏感性；3)激活CREM促进基因转录。有实验证明敲除了S6K1(S6K1^-/-)的小鼠，成活率显著降低，说明S6K1影响新生儿的存活率。

迄今，关于S6K1在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究已在人、鼠、牛等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见有关山羊细胞中S6K1的研究报道，也未见有山羊S6K1基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。

在各种情况下，有重要的原因研究和开发与山羊S6K1蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究清楚山羊的S6K1基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的质量等方面，由重组S6K1蛋白制备的抗体可以检测S6K1基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。

发明内容 本发明人已经努力从山羊的不同组织细胞中分离S6K1基因。作为结果，本发明人从山羊肌肉组织细胞分离了S6K1基因的cDNA编码区1563bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。本发明人通过比对已知的人、大鼠、兔、牛的S6K1基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛的S6K1基因(AY396564)cDNA编码区的序列，在不打破氨基酸编码的前提下设计上游引物(5’端从起始密码子开始)，下游引物5’端起始于牛S6K1基因的1563bp并加上终止密码子TGA，设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增山羊S6K1基因cDNA编码区片段的引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了山羊S6K1基因的cDNA编码区1563bp片段，序列分析表明与牛的序列(AY396564)同源性为99％(1550/1563)，且保持了正确的编码，推导出的由此序列编码的氨基酸序列与牛的相比有2个氨基酸的差别。这一cDNA片段称为“gS6K1”。

所以，本发明的目的是通过已知的不同物种的mTOR的核苷酸序列设计引物，然后通过RT-PCR方法克隆山羊S6K1基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码山羊S6K1蛋白的基因的cDNA的编码区1563bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。

附图的简要说明

从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变的明了。其中：

图1显示了牛S6K1基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号AY396564)。

图2显示了1563bp的山羊S6K1基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和由此推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3是显示从山羊肌肉组织分离的总RNA的RT-PCR的结果(1563bp的cDNA gS6K1)的电泳图。

图4是显示以质粒pMD19-T-gS6K1为模板，以P1、P2为引物进行PCR鉴定的电泳图。

图5是显示将质粒pMD19-T-gS6K1进行EcoR I酶切鉴定的电泳图。

图6显示了山羊S6K1基因cDNA的编码区核苷酸序列与牛(AY396564)的S6K1基因cDNA的序列的比较。

具体实施方式 为了从山羊组织细胞中分离S6K1基因，本发明人首先按照提取RNA的标准要求采集内蒙古白绒山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat，Capra hircus)的各类组织样本。即，现场宰杀内蒙古白绒山羊后立即采取肌肉、肝、肾、淋巴结、脾及睾丸等组织块(将组织块大小控制在30～50μg)，放入冷冻管后立即入液氮保存，带回实验室后置于-80℃冰箱保存备用。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取山羊肌肉组织、睾丸组织、肾组织、肝组织、淋巴结组织及脾脏组织的总RNA，最后根据文献报道的哺乳动物S6K1基因在各类组织中的表达情况和总RNA提取结果，选定以肌肉组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为模板，利用特异性引物P1、P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收，测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19-T-gS6K1。

为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19-T-gS6K1，将其转化E coli DH5α感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-gS6K1转化了的Ecoli DH5α细胞涂在含有氨苄青霉素的选择性平板上，并同时进行蓝、白菌落筛选。37℃培养16小时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步认定白色菌落为获得的重组菌落。

重组菌落和重组质粒pMD19-T-gS6K1的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先挑取划线培养的菌落用Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定，阳性的初步认定为重组质粒，其相应的菌落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒进一步进行EcoR I酶切鉴定。经过了PCR和酶切双重鉴定的质粒确定为重组质粒pMD19-T-gS6K1。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质粒和重组菌落。将含有重组质粒pMD19-T-gS6K1的Ecoli DH5α液体培养的样品送上海生工生物工程有限公司测序。作为结果，获得了1563bp的山羊S6K1基因cDNA编码区的核苷酸序列。

显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物P1和P2，可以利用RT-PCR方法扩增出山羊的S6K1基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测S6K1基因的组织表达特异性，也可进一步实现羊S6K1基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的S6K1蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的S6K1基因的表达情况等等。

在下面的实施例中进一步说明了本发明，但这并不限制本发明的范围。

实施例1：山羊S6K1基因的cDNA编码区1563bp片段的克隆

为了克隆来自山羊肌肉组织细胞的S6K1基因包含1563bp编码区的cDNA，根据图1公开的核苷酸序列(AY396564)，首先制备允许扩增1563bp的cDNA的PCR引物，即上游引物5′ATGAGGCGACGAAGGAGGC3′和下游引物5′CAGGTGCTCTGGTCGTTTG3′。然后在上游引物5′端加上BamH I酶切位点和保护性碱基GC，在下游引物5′端加上终止密码子TGA和EcoR I酶切位点和保护性碱基GC，即有上游引物P15′GC GGATCC ATGAGGCGACGAAGGAGGC 3′，下游引物P25′GC GAATTC TCA CAGGTGCTCTGGTCGTTTG 3′。

为了利用RT-PCR方法克隆S6K1基因的cDNA，从山羊肌肉组织分离总RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取山羊肌肉组织总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80℃冰箱保存备用。然后，利用TaKaRa的M-MLV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA第一链。

以上面得到的cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，利用TaKaRa LATaqDNA聚合酶进行PCR反应。PCR反应体系为10μl：模板cDNA1μl，2×GC bufferII(5mM Mg²⁺)5μl，dNTP(各2.5mM)1.6μl，P1(10pmol/μl)0.5μl，P2(10pmol/μl)0.5μl，LA Taq酶(5U/μl)0.2μl，ddH₂O1.2μl。反应循环为94℃4分钟；94℃1分钟，58℃1分钟，72℃，2分钟，35个循环；72℃10分钟。PCR反应结束后，取PCR产物10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5μg/ml的EB染色液中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照相。作为结果，得到了1563bp的特异性目的片段(参见：图3)。

为了将获得的1563bp的cDNA特异性目的片段连接到pMD19-T克隆载体上，首先将电泳分离的1563bp的cDNA特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段，紫外测定浓度后按照pMD19-T克隆载体说明书操作程序完成连接。为了检测连接反应是否成功和进一步扩增质粒pMD19-T-gS6K1，将其转化Ecoli DH5α感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-gS6K1转化了的Ecoli DH5α细胞涂在含有氨苄青霉素和X-gal的选择性平板上，并同时涂上IPTG进行诱导，实现蓝、白菌落筛选。涂布的平板37℃培养16小时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，得到了白色的重组菌落。

进一步的工作是对重组菌落和重组质粒进行鉴定(理论上将只有含有重组质粒的菌落才是真正的重组菌落)。首先将白色的重组菌落进行划线培养12小时，然后挑取菌落，用Kieser法提质粒。再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定。对阳性的菌落进行摇床振荡液体培养12小时，精提质粒，紫外检测浓度并进行1％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)检测，作为结果，得到了与预期结果大小相符的质粒。最后一步是对精提的质粒利用PCR反应和酶切反应进行二次鉴定。PCR反应以质粒为模板，以P1、P2为引物，反应体系为10μl:质粒DNA0.1μl，2×GC bufferII(5mMMg²⁺)5μl，dNTP(各2.5mM)1.6μl，P1(10pmol/μl)0.5μl，P2(10pmol/μl)0.5μl，LATaq酶(5U/μl)0.2μl，ddH₂O2.1μl。反应循环为94℃4分钟；94℃1分钟，58℃1分钟，72℃，2分钟，35个循环；72℃10分钟。PCR反应结束后，取PCR产物10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5μg/ml的EB染色液中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照像。作为结果，得到了1563bp的特异性目的片段(参见：图4)。酶切鉴定采用TaKaRaEcoR I单酶切，由于设计引物时加了一个EcoR I酶切位点，同时pMD19-T载体上也有一个EcoR I酶切位点，故根据克隆片段插入T载体的方向，切出的片段有可能是一段或两段。作为结果，两个克隆的单酶切分别得到了与预期结果大小相符的一个片段和两个片段(参见：图5)。

经过两次鉴定的重组质粒，与其相应的菌落即是重组菌落。将液体培养的重组菌落样品1ml送往上海生工生物工程有限公司用测序。作为结果，获得了1563bp的山羊S6K1基因的cDNA编码区1563bp片段的核苷酸序列(参见：图2)。

实施例2：山羊S6K1基因的cDNA的核苷酸序列

图2显示了实施例1中获得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，和由此推断的氨基酸序列(SEQ ID N0：2)。在图2中，显示的序列是S6K1基因的核苷酸序列，它包括了cDNA编码区的1563bp的核苷酸序列，编码形成分子量推断的58.6KDa的成熟蛋白质的521个氨基酸。

图6显示了山羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列与牛(AY396564)的S6K1基因cDNA的核苷酸序列的比较。表明：1)山羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列与牛的S6K1基因cDNA的核苷酸序列有99％的同源性。由山羊的这段核苷酸序列推导出的氨基酸序列与牛的S6K1蛋白相同位置片段的氨基酸序列相比(AAR01025)有2个氨基酸的差别，同源性99.6％(519/521)。

正如清楚说明的和如上说明，本发明提供利用RT-PCR法克隆山羊S6K1基因cDNA编码区的引物和编码山羊的S6K1蛋白质的包括1563bp的cDNA的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。此cDNA包括了1563bp的核苷酸序列，它编码含有521个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克隆到如pET或pcDNA3.1等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达出完整的S6K1蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的S6K1基因的表达情况等等。

1.山羊S6K1 cDNA的编码区片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

2.由cDNA编码区的核苷酸序列推断出的山羊S6K1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。

山羊S6K1基因cDNA编码区核苷酸序列.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>旭，日干

     吴，应积

     王，志钢

<120>山羊S6K1基因cDNA编码区核苷酸序列

<130>NO

<140>NO

<141>2007-02-02

<160>2

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>1563

<212>DNA

<213>Capra hircus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1563)

<400>1

<210>2

<211>521

<212>PRT

<213>Capra hircus

<400>2

Claims (2)

1.一种从山羊肌肉细胞分离的编码S6K1蛋白的cDNA编码区核苷酸，其特征在于：核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2.一种从山羊肌肉细胞分离的与权利要求1所述S6K1蛋白的cDNA核苷酸编码的多肽，其特征在于：氨基酸序列是与序列表中SEQ ID NO：1的cDNA序列对应的标注为SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

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