CN103160514A

CN103160514A - 人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列及其克隆方法

Info

Publication number: CN103160514A
Application number: CN2013100797211A
Authority: CN
Inventors: 谢鹏; 张亮; 杨德雨; 雷阳; 黄荣忠
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明公开了人EBLN-1基因的cDNA全长序列及其克隆方法。本发明通过5’RACE和3’RACE技术分别扩增了人EBLN-1基因cDNA的5’端片段和3’端片段并测序，再根据3’端序列、5’端序列及已知cDNA部分序列拼接出人EBLN-1基因的cDNA全长序列。并进行开放读码框和非翻译区分析，根据开放读码框推导得到编码EBLN-1蛋白的氨基酸序列。本发明提供的EBLN-1基因cDNA全长序列可以为后续通过表达重组蛋白用于制备相应抗体或进行结构生物学研究，通过RNA干扰和过表达研究EBLN-1基因功能，或进一步研究其非翻译区在该基因表达调控中的作用，并最终为阐明所述EBLN-1基因在人体中的生理作用及与疾病尤其是精神疾病的关系奠定基础。

Description

人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列及其克隆方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体的是涉及一种从人少突胶质瘤细胞分离的人内源性博尔纳样核蛋白序列1（endogenous Borna-like N element-1, EBLN-1）基因的cDNA全长序列及其克隆方法。

背景技术

博尔纳病病毒（Borna disease virus, BDV）是1885年在德国首先发现的一种非节段单股负链RNA病毒，具有严格的嗜神经性，其基因组编码6个病毒蛋白，核蛋白（N）为主要的感染标志物和致病蛋白。1996年德国科学家从抑郁症病人中成功分离出BDV，证明人体中亦存在BDV感染(Bode L, et al. Mol Psychiatry. 1996)。近年来国内外的大量流行病学调查研究均提示人类精神疾病包括抑郁症的发生与BDV感染可能存在相关性，因此在2008年的国际博尔纳病病毒研究会议上BDV作为“情感病毒”这一概念被提出。

2010年1月，日本科学家Masayuki Horie, Tomoyuki Honda在《Nature》发表文章，报道在包括人类、非人灵长类、啮齿类和象类在内的多种哺乳动物基因组中发现与博尔纳病毒N基因(编码核蛋白)相类似的片段，命名为内源性博尔纳样核蛋白序列（endogenous Borna-like N Element, EBLN)。文章的作者推断这可能是远古时期，博尔纳病病毒感染宿主后，其基因整合进入宿主的基因组，并被遗传保留下来，成为宿主基因组中的病毒“化石”。（Horie, et al.Nature 2010)这是首个报道的存在于哺乳动物中的内源性非逆转录病毒片断，为人们理解内源性病毒序列的形成和博尔纳病病毒在宿主遗传进化中的作用提供了新的视角。存在于人类基因组中的EBLN有四个，分别命名为EBLN-1、 EBLN-2、 EBLN-3、 EBLN-4，其中EBLN-1ID LOC340900）与BDV N核苷酸序列相似性最高，为58%，而EBLN-2因存在移码突变，开放读码框略短于EBLN-1。

2010年7月，Belyi等(Belyi VA, et al.PLoS Pathog. 2010)将非逆转录病毒家族中的单链RNA病毒的5666个基因与48种脊椎动物基因组进行了比对，发现在19种脊椎动物基因组内存在80个高保守性的内源性病毒DNA序列，而且所有这些序列都限于单分子负链RNA病毒目下的两个科：Bornaviruses and the Filoviruses。并且可能有如下机制：宿主对外源病毒致病性的抵御作用与EBLN的表达潜力有关联，例如BDV的易感宿主马、羊的基因组内不存在EBLN。提示EBLN对外源性病毒感染存在抵抗效应，体现出对宿主的保护作用，从而降低宿主对BDV的易感性。亦有研究报道一种黑冠鼠具有可遗传的天然对BDV的免疫力，此种特性与宿主内一种未知基因有关（Herzog S, Frese K, Rott R, et al. J Gen Virol. 1991），很有可能这种未知基因就是啮齿类动物中的EBLN。从另一方面来说，EBLN-1为BDV整合入人类基因组的片断，与BDV N基因有同源性，序列相似度58%，可能具有潜在相似的生物学特征，如果激活或高表达亦可能对人体产生有害作用而导致抑郁症等精神疾病。因此，EBLN-1基因可能是抑郁症的一个潜在易感基因，其编码蛋白或参与抑郁症的病理生理过程，对其进行深入系统的研究，对于进一步明确抑郁症的分子遗传学基础和寻找药物治疗靶标有着重要意义。

对于新基因的常用研究策略主要包括新基因的生物信息学及体内表达规律分析、功能获得与功能失活策略研究、基因编码产物相互作用蛋白的研究等方面，而这些都有赖于该基因结构模式的阐明，目前为止，EBLN-1基因的全长cDNA序列尚不清楚，严重滞后了对于EBLN-1的后续生理功能及病理作用研究。基于此，本发明应用利用5’-RACE和 3’-RACE 技术克隆人EBLN-1基因全长cDNA序列，并对其开放读码框和非翻译区结构以及编码氨基酸进行了初步分析预测，为深入开展EBLN-1基因后续研究提供了重要基础和客观依据。

发明内容

本发明旨在提供一种通过 5’-RACE和 3’-RACE技术克隆得到EBLN-1基因cDNA全长序列，还提供了所述EBLN-1基因cDNA的克隆方法。

本发明采用的技术方案是：给出一种人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该核苷酸序列对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

上述人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列的克隆方法，包括如下步骤：

（1）从人少突胶质瘤细胞株中提取总RNA。

（2）3’末端序列的扩增：

以步骤（1）中的总RNA为模板，使用3’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一条链；

以cDNA第一条链为模板，利用3’-外引物、3’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’RACE外引物、3’-内引物和3’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’RACE内引物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物Ⅰ，所述3’-外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，3’-内引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；

将PCR扩增产物Ⅰ克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列。

（3）5’末端序列的扩增：

使用5’-RACE cDNA扩增试剂盒对步骤（1）中的总RNA进行去磷酸化处理和“去帽子”反应，得到mRNA，所述mRNA的5’端连接5’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’RACE Adaptor引物，然后进行反转录反应，得到反转录产物；

以所述反转录产物为模板，利用5’-外引物、5’末端序列的扩增5’RACE外引物、5’-内引物和5’末端序列的扩增5’RACE内引物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物Ⅱ，所述5’-外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，5’-内引物核的苷酸序列为SEQ ID NO.5；

将PCR扩增产物Ⅱ克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的5’末端序列。

（4）根据所述人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列和5’末端序列，以及公开的人EBLN-1基因cDNA的部分序列拼接得到人EBLN-1基因的cDNA全长序列。

步骤（2）所述套式PCR扩增的扩增体系为：

3’第一轮PCR 反应体系50 μl包括如下成分：步骤（2）的反转录反应液 2 μl，1×cDNA 稀释缓冲液II 8 μl，10 μM的3’-外引物2 μl，10 μM 的3’ RACE外引物2 μl，10×LA PCR 缓冲液II 4 μl，25 mM的 MgCl₂ 3 μl，5 U/μl的TaKaRa LA Taq 0.25 μl，dH₂O 28.75 μl；反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，20 个循环；72℃ 10分钟。

3’第二轮PCR反应体系50 μl包括如下成分：3’第一轮PCR产物1μl，dNTP 8 μl，10×LA PCR缓冲液II 5 μl，25 mM 的MgCl₂ 5 μl，5 U/μl的TaKaRa LA Taq 0.5 μl，10 μM的3’-内引物 2μl，10 μM的3′RACE内引物 2 μl，dH₂O 26.5 μl；

反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，30 个循环；72℃ 10分钟。

步骤（3）所述套式PCR扩增的扩增体系为：

5’第一轮PCR 反应体系50 μl包括如下成分：步骤（3）的反转录反应液 2 μl， 1×cDNA 稀释缓冲液II 8 μl，10μM的5’-外引物2 μl，10μM的5’RACE外引物 2μl，10×LA PCR 缓冲液II 4μl，25 mM 的MgCl₂ 3μl，5 U/μl的T aKaRa LA Taq 0.25μl，dH₂O 28.75 μl；反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，20个循环；72℃ 10分钟；

5’第二轮PCR反应体系50μl包括如下成分：5’第一轮PCR 产物1μl，dNTP 8 μl，10×LA PCR缓冲液II 5μl，25 mM的 MgCl₂ 5μl，5 U/μl TaKaRa LA Taq 0.5μl， 10 μM的5’-内引物2μl，10 μM的5′RACE 内引物2μl，dH₂ O 26.5μl；反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，25个循环；72℃ 10分钟。

本发明的有益效果：本发明利用3’RACE及5’RACE技术首次从人少突胶质瘤细胞株中得到人EBLN-1基因的cDNA全长序列，初步分析了其开放读码框和非翻译区结构，并提供了由此推断的氨基酸序列，可以为后续通过表达重组蛋白用于制备相应抗体或进行结构生物学研究，通过RNA干扰和过表达研究EBLN-1基因功能，通过RT-PCR检测该基因的组织表达分布情况，或进一步研究其非翻译区在该基因表达调控中的作用，并最终为阐明所述EBLN-1基因在人体中的生理作用及与疾病尤其是精神疾病的关系奠定基础。

附图说明

图1为3’端阳性克隆子的验证电泳图；

图2为5’端阳性克隆子的验证电泳图；

图3为人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列图谱；

图1和图2中的M：DL2000Marker，1-6：分别为调取的阳性克隆子。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容，但不应将此理解为本发明的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

一、人少突胶质瘤细胞株中总RNA的提取

采用Trizol法对人少突胶质瘤细胞株（购自美国ATCC细胞库）进行细胞总RNA提取。取-80℃保存的细胞样品，加 1 ml Trizol，剧烈振荡 30 秒，确保完全溶解，室温放置 10分钟，4 度离心 10 分钟。加入 200ul 氯仿，颠倒混匀 15 秒，12000rpm，4℃ 离心 5 分钟。转移上清至一新离心管中，加入 200ul 氯仿和 200ul 水饱和酚，颠倒混匀 15 秒，12000rpm，4℃离心 5 分钟。转移上清至一新离心管中，加入 400ul 氯仿颠倒混匀 15 秒，12000rpm，4℃ 离心 5 分钟。转移上清至一新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，冰上沉淀 30 分钟。12000rpm，4℃ 离心 15 分钟，弃上清留沉淀，使用预冷的 70％乙醇洗涤，并除净乙醇后超净台内风吹干燥。RNA 干燥物溶于 50 ul DEPC 水中，充分溶解后取 1.5ul 紫外检测浓度和 260/280 值。根据浓度取 1ug RNA经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，完整性良好。

二、3’末端序列的获取

以前述所提取总RNA为模板，按3’-RACE cDNA快速扩增试剂盒（3’Full RACE Core Set，宝生物工程有限公司）操作说明使用3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一条链。反应条件：42℃, 60 min，70℃, 15 min。

为提高灵敏度和特异度，采用套式PCR方法扩增EBLN-1基因的cDNA 3’末端。首先利用EBLN-1 cDNA的已知部分序列作为模板设计基因特异性引物，3’-外引物：AGCAAAGCACAGATGATGACC（SEQ ID NO.2）和3’-内引物：CCGCTGTTGTGTTGGAGATT（SEQ ID NO.3），并与试剂盒中所提供的3’RACE外引物、3’RACE内引物作为套式PCR反应用的引物。扩增反应以cDNA第一条链为模板。3’ RACE外引物和3’ RACE内引物由3’-RACE cDNA快速扩增试剂盒提供。

3’第一轮PCR 反应体系50 μl：上述进行逆转录反应后的反转录反应液 2 μl， 1×cDNA稀释缓冲液II 8 μl，3’-外引物（10 μM）2 μl，3’ RACE外引物（10 μM）2 μl，10×LA PCR 缓冲液 II（Mg²⁺ Free）4 μl，MgCl₂（25 mM）3 μl，TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.25 μl，dH₂O 28.75 μl。反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，20 个循环；72℃ 10分钟。3’第二轮PCR反应体系50 μl：第一轮PCR 扩增产物1μl，dNTP（含A、G、C、T，各 2.5 mM）8 μl，10×LA PCR缓冲液 II（Mg²⁺ Free）5 μl，MgCl₂（25 mM）5 μl，TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5 μl，3’-内引物（10 μM）2μl，3′RACE 内引物（10 μM）2 μl，dH₂O 26.5 μl。反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，30 个循环；72℃ 10分钟。PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果，用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒切胶回收目的条带，按照pMD 19-T克隆载体操作说明书完成连接，并转化感受态细胞（DH10B），经氨苄青霉素抗性板筛选，菌落PCR鉴定（鉴定结果见图1），最后选择有阳性片段的单克隆菌液测序，得到EBLN-1基因的cDNA 3’末端序列。

三、5’末端序列的获取

按5’-RACE cDNA扩增试剂盒（5’-Full RACE Kit，宝生物工程有限公司）操作说明对前述所提取总RNA先后进行去磷酸化处理和 “去帽子” 反应，获得mRNA。去磷酸化处理反应体系为50 μl：提取的总RNA 2μl（1 μg/μl）, RNase Inhibitor 1μl (40U/μl), 10×碱性磷酸酶缓冲液(MgCl₂ Free) 5μl, 碱性磷酸酶(16U/μl) 0.6μl,去酶水41.4 μl，反应条件50℃ 1h，并对反应产物进行纯化。“去帽子” 反应体系10μl：经去磷酸化处理后的RNA 7μl，RNA酶抑制剂(40U/μl) 1μl，10×烟草酸焦磷酸缓冲液 1μl，烟草酸焦磷酸(0.5U/μl) 1μl，反应条件37℃，1h。

在mRNA的5’端连接5’RACE Adaptor引物，其后进行反转录反应。利用EBLN-1 cDNA的已知部分序列作为模板设计基因特异性引物5’-外引物（SEQ ID NO.4）和5’-内引物（SEQ ID NO.5），并与试剂盒中所提供的5’RACE 外引物、5’RACE 内引物用于套式PCR反应。

5’第一轮PCR 反应体系50 μl：上述进行反转录反应后的反转录反应液 2 μl， 1×cDNA 稀释缓冲液II 8 μl，5’-外引物（10 μM）2 μ l，5’RACE外引物（10 μM）2 μl，10×LA PCR 缓冲液II（Mg²⁺ Free）4 μl，MgCl₂（25 mM）3 μl，LA Taq（5 U/μl）0.25 μl，dH₂O 28.75 μl。反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，20个循环；72℃ 10分钟。5’第二轮PCR反应体系50 μl：Outer PCR 产物1μl，dNTP（含A、G、C、T，各 2.5 mM）8 μl，10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺ Free）5 μl，MgCl₂（25 mM）5 μl，TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5 μl，5’-内引物（10 μM）2μl，5′RACE内引物（10 μM）2 μl，dH₂ O 26.5 μl。反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，25个循环；72℃ 10分钟。PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果，用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒切胶回收目的条带，按照pMD 19-T克隆载体操作说明书完成连接，并转化感受态细胞（DH10B），经氨苄青霉素抗性板筛选，菌落PCR鉴定（鉴定结果见图2），最后选择有阳性片段的单克隆菌液测序，得到EBLN-1基因的cDNA 5’末端序列。

四、cDNA全长序列及分析

采用DNAMAN软件，根据所得到的人EBLN-1基因cDNA的3’端序列、5’端序列及已知的cDNA部分序列（GenBank id=NM_001199938.1）的重叠区域拼接出人EBLN-1基因的cDNA全长序列（SEQ ID NO.1）。并进行开放读码框分析，结果显示第337-1437 bp位置为其开放读码框，其序列见SEQ ID NO.6，读码框上游的5’UTR（非翻译区）区域长336 bp，读码框下游的3’UTR区域长69 bp。EBLN-1基因cDNA序列图谱见图3。根据开放读码框推导的编码EBLN-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

通过分析获得了EBLN-1基因的开放读码框和非翻译区，对明确抑郁症的分子遗传学基础和寻找药物治疗靶标有着重要意义。并根据开放读码框推导获得氨基酸序列，可以利用该开放阅读框的序列或者氨基酸序列，按照制备多克隆抗体或单克隆抗体的步骤制备抗EBLN-1的多克隆或单克隆抗体。也可以建立EBLN-1基因相应研究模型，通过RNA干扰和过表达进一步研究EBLN-1基因功能，或进一步研究其非翻译区在该基因表达调控中的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学

<120> 人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列及其克隆方法

<160> 7

<210> 1

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人

<400> SEQ ID NO.1

gaaaccttaa attttgtgct cgaaatgagt ggttgactct tctctctata ggcatagctc 60

tggtgttcac agttgacagg ggaaaggatt ttagtgcagc tgcacattta ggtgtagaag 120

catgaaaatc aaaattatgt tgtgtaatta aggagatttg gaaattcctt tactagacta 180

aaaaactgaa tattactaag aagtaaatga gatacagaag tcataatacg ttttattaat 240

aaatgtaatt taaaaatatt ttgttgtatt gccattctct atattttttt agtacagtac 300

aaaattgtgt gaaaatcaca gaaacaatca cccacaatgt cccgcccaag aaacaaccca 360

cagaccagca gcccacaaga cagtacaaag gatgggagca gcttccatta ctttcaaggg 420

agatttgagc tctctgggaa gagcagacag tatccagcag atgcattgga gccccaacct 480

ggtattggag atgttaaggt cattgaaaaa gcaactaagt ctatgctaga cccagcacag 540

agatctcatt tttaccttgt aaccccaagc ttagtatttt tgtgttttat attcgatgga 600

ttacacaagg cactactcag tgtcggtgtg agcaaaaggt ctaatattgt gattgggaat 660

gagaacaagg aaacaggtac tctctatgct agcaaatttg aagatgtttt gcctaccttc 720

actgcccttg agatgtcatc aattctgcgt cactgctgtg atctgatagg cattgctgcc 780

ggatcgagtg acccgatatg caccaacagc ctccaagtac agagacaatt caaggcaatg 840

atgatatcca ttggaagacc tttgcatagt gaaagtgctg atttattaat tagctataat 900

gcagggccag ctatagattg gatcaactca agaccatggg ttggaggatt aatgttcaca 960

tttctatttg gagaatttga atcccctgcg tgcgagctac ttgatcaagt taaagtagtt 1020

gccagcaaag cacagatgat gacctactac actgtgagaa tgttcctgga tcagtgtgtg 1080

gatggttcca ctgctttacc cgctgttgtg ttggagattc cagtttttga gcagaagaaa 1140

ccactggcta aaaaggtact tggagatttc tttgaatttg ggggtgtact tcgccaccct 1200

gttattgggg tgctatcacc acaaatgttc ccaaacctag caacagcagc aaactactgg 1260

gccaaaagaa ggaattccac attttctgga tttgaagccc ttgacattat accaggatca 1320

actattacat tccctgtact tcaaatggca tctgctcaga aaatctccag aggaagtgac 1380

atggatccat atacacttaa catccttcgc ggttatggga tttcgggatt tgaataacaa 1440

atacgtgaac taatccttat atatacatat aaaaagaaat tatgtgaaaa tcacattcta 1500

aaatagaaaa aaaaaaaa 1518

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.2

agcaaagcac agatgatgac c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.3

ccgctgttgt gttggagatt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.4

gtgccttgtg taatccatcg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.5

accttaacat ctccaatacc ag 22

<210> 6

<211> 1111

<212> DNA

<213> 人

<400> SEQ ID NO.6

atgtcccgcc caagaaacaa cccacagacc agcagcccac aagacagtac aaaggatggg 60

agcagcttcc attactttca agggagattt gagctctctg ggaagagcag acagtatcca 120

gcagatgcat tggagcccca acctggtatt ggagatgtta aggtcattga aaaagcaact 180

aagtctatgc tagacccagc acagagatct catttttacc ttgtaacccc aagcttagta 240

tttttgtgtt ttatattcga tggattacac aaggcactac tcagtgtcgg tgtgagcaaa 300

aggtctaata ttgtgattgg gaatgagaac aaggaaacag gtactctcta tgctagcaaa 360

tttgaagatg ttttgcctac cttcactgcc cttgagatgt catcaattct gcgtcactgc 420

tgtgatctga taggcattgc tgccggatcg agtgacccga tatgcaccaa cagcctccaa 480

gtacagagac aattcaaggc aatgatgata tccattggaa gacctttgca tagtgaaagt 540

gctgatttat taattagcta taatgcaggg ccagctatag attggatcaa ctcaagacca 600

tgggttggag gattaatgtt cacatttcta tttggagaat ttgaatcccc tgcgtgcgag 660

ctacttgatc aagttaaagt agttgccagc aaagcacaga tgatgaccta ctacactgtg 720

agaatgttcc tggatcagtg tgtggatggt tccactgctt tacccgctgt tgtgttggag 780

attccagttt ttgagcagaa gaaaccactg gctaaaaagg tacttggaga tttctttgaa 840

tttgggggtg tacttcgcca ccctgttatt ggggtgctat caccacaaat gttcccaaac 900

ctagcaacag cagcaaacta ctgggccaaa agaaggaatt ccacattttc tggatttgaa 960

gcccttgaca ttataccagg atcaactatt acattccctg tacttcaaat ggcatctgct 1020

cagaaaatct ccagaggaag tgacatggat ccatatacac ttaacatcct tcgcggttat 1080

gggatttcgg gatttgaata a 1111

<210> 7

<211> 366

<212> PRT

<213> 人

<400> SEQ ID NO.7

Met Ser Arg Pro Arg Asn Asn Pro Gln Thr Ser Ser Pro Gln Asp Ser

1 6 11 16

Thr Lys Asp Gly Ser Ser Phe His Tyr Phe Gln Gly Arg Phe Glu Leu

21 26 31

Ser Gly Lys Ser Arg Gln Tyr Pro Ala Asp Ala Leu Glu Pro Gln Pro

36 41 46

Gly Ile Gly Asp Val Lys Val Ile Glu Lys Ala Thr Lys Ser Met Leu

51 56 61

Asp Pro Ala Gln Arg Ser His Phe Tyr Leu Val Thr Pro Ser Leu Val

66 71 76

Phe Leu Cys Phe Ile Phe Asp Gly Leu His Lys Ala Leu Leu Ser Val

81 86 91 96

Gly Val Ser Lys Arg Ser Asn Ile Val Ile Gly Asn Glu Asn Lys Glu

101 106 111

Thr Gly Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe Glu Asp Val Leu Pro Thr Phe

116 121 126

Thr Ala Leu Glu Met Ser Ser Ile Leu Arg His Cys Cys Asp Leu Ile

131 136 141

Gly Ile Ala Ala Gly Ser Ser Asp Pro Ile Cys Thr Asn Ser Leu Gln

146 151 156

Val Gln Arg Gln Phe Lys Ala Met Met Ile Ser Ile Gly Arg Pro Leu

161 166 171 176

His Ser Glu Ser Ala Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asn Ala Gly Pro Ala

181 186 191

Ile Asp Trp Ile Asn Ser Arg Pro Trp Val Gly Gly Leu Met Phe Thr

196 201 206

Phe Leu Phe Gly Glu Phe Glu Ser Pro Ala Cys Glu Leu Leu Asp Gln

211 216 221

Val Lys Val Val Ala Ser Lys Ala Gln Met Met Thr Tyr Tyr Thr Val

226 231 236

Arg Met Phe Leu Asp Gln Cys Val Asp Gly Ser Thr Ala Leu Pro Ala

241 246 251 256

Val Val Leu Glu Ile Pro Val Phe Glu Gln Lys Lys Pro Leu Ala Lys

261 266 271

Lys Val Leu Gly Asp Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Leu Arg His Pro

276 281 286

Val Ile Gly Val Leu Ser Pro Gln Met Phe Pro Asn Leu Ala Thr Ala

291 296 301

Ala Asn Tyr Trp Ala Lys Arg Arg Asn Ser Thr Phe Ser Gly Phe Glu

306 311 316

Ala Leu Asp Ile Ile Pro Gly Ser Thr Ile Thr Phe Pro Val Leu Gln

321 326 331 336

Met Ala Ser Ala Gln Lys Ile Ser Arg Gly Ser Asp Met Asp Pro Tyr

341 346 351

Thr Leu Asn Ile Leu Arg Gly Tyr Gly Ile Ser Gly Phe Glu

356 361 366

Claims

1.一种人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列，其特征在于：该cDNA全长序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

3.一种权利要求1所述的人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列的克隆方法，包括如下步骤：

（1）从人少突胶质瘤细胞株中提取总RNA；

（2）3’末端序列的扩增：

将PCR扩增产物Ⅰ克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列；

（3）5’末端序列的扩增：

以所述反转录产物为模板，利用5’-外引物、5’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’RACE外引物、5’-内引物和5’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’RACE内引物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物Ⅱ，所述5’-外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，5’-内引物核的苷酸序列为SEQ ID NO.5；

将PCR扩增产物Ⅱ克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的5’末端序列；

4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：步骤（2）所述套式PCR扩增的扩增体系为：

3’第一轮PCR 反应体系50 μl包括如下成分：步骤（2）的反转录反应液 2 μl，1×cDNA 稀释缓冲液II 8 μl，10 μM的3’-外引物2 μl，10 μM 的3’ RACE外引物2 μl，10×LA PCR 缓冲液II 4 μl，25 mM的 MgCl₂ 3 μl，5 U/μl的TaKaRa LA Taq 0.25 μl，dH₂O 28.75 μl；

反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，20 个循环；72℃ 10分钟；

3’第二轮PCR反应体系50 μl包括如下成分：3’第一轮PCR产物1μl，dNTP 8 μl，10×LA PCR缓冲液II 5 μl，25 mM 的MgCl₂ 5 μl，5 U/μl的TaKaRa LA Taq 0.5 μl，10 μM的3’-内引物 2μl，10 μM的3’ RACE内引物 2 μl，dH₂O 26.5 μl；

5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：步骤（3）所述套式PCR扩增的扩增体系为：

5’第一轮PCR 反应体系50 μl包括如下成分：步骤（3）的反转录反应液 2 μl， 1×cDNA 稀释缓冲液II 8 μl，10μM的5’-外引物2 μl，10μM的5’RACE外引物 2μl，10×LA PCR 缓冲液II 4μl，25 mM 的MgCl₂ 3μl，5 U/μl的T aKaRa LA Taq 0.25μl，dH₂O 28.75 μl；

反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，20个循环；72℃ 10分钟；

5’第二轮PCR反应体系50μl包括如下成分：5’第一轮PCR 产物1μl，dNTP 8 μl，10×LA PCR缓冲液II 5μl，25 mM的 MgCl₂ 5μl，5 U/μl TaKaRa LA Taq 0.5μl， 10 μM的5’-内引物2μl，10 μM的5’ RACE 内引物2μl，dH₂ O 26.5μl；

反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，25个循环；72℃ 10分钟。