CN109182349B

CN109182349B - 一种翘嘴鳜tlr7基因及其应用

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Publication number: CN109182349B
Application number: CN201811071434.5A
Authority: CN
Inventors: 黄鹤忠; 路瑶; 叶金明; 肖攀; 李泽; 金锐铭; 董同瑚
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2038-09-14
Also published as: CN109182349A

Abstract

本发明公开了一种翘嘴鳜TLR7基因及其应用。本发明翘嘴鳜TLR7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该TLR7基因用于对翘嘴鳜病原感染初期的检测，具体为：根据翘嘴鳜体内TLR7‑Myd88依赖型抗病信号通路相关基因设计特异性扩增引物，其中，所述TLR7‑Myd88依赖型抗病信号通路相关基因包括TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7基因，在翘嘴鳜被感染病毒或细菌初期，采用qPCR检测方法对TLR7‑Myd88依赖型抗病信号通路相关基因mRNA表达量的显著应答反应进行检测和分析，将检测结果作为鱼体被病毒或细菌感染初期的辅助指标。本发明为翘嘴鳜受到病毒或细菌感染的早期诊断提供新思路，有利于鱼类病害的早期防治，提高鳜鱼养殖经济效益。

Description

一种翘嘴鳜TLR7基因及其应用

技术领域

本发明属于水产养殖、生物技术领域，尤其涉及一种翘嘴鳜TLR7基因及其在对翘嘴鳜被病原感染初期时进行检测方面的应用。

背景技术

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)，属于鲈形目(Perciformes)、鳜亚科(Sinipercinae)、鳜属(Siniperca)，是我国的名贵经济鱼类和重要淡水养殖品种。然而随着近年来人工养殖规模的不断扩大，翘嘴鳜的种质退化、抗病能力下降等现象比较普遍，导致病毒性等疾病的曝发日益猖獗，而且至今未有十分有效的防治方法，每年都造成严重的经济损失，严重制约了其养殖业的可持续发展。因此，对于翘嘴鳜被病原感染的早期检测诊断是防治其病害曝发的重要手段。

现有鱼类被感染病毒或细菌病原的检测诊断是根据鱼类的发病症状进行初步判断，然后解剖取病样组织提取病原，再将其提纯、鉴定后进行活体攻毒实验后验证是否是发病的病原，才能确诊鱼体是否感染了病毒或细菌等病原而引起发病症状；且由于可能是多种病原或未知病原引起的疾病，难以做出判断。不但耗时费力、操作困难，而且由于被感染病毒或细菌病原初期的鱼类无任何发病症状，因此现有的技术无法在鱼类被病毒或细菌病原感染初期对其做出正确的检测，错失了最佳病害防治时机，待到出现发病症状后再做出判断时，鱼类的免疫力已经降低，感染鱼类的病原已经增殖蔓延并引发了组织病变，此时鱼类病害防治的效果往往不理想。因此，发明一种鱼类病原感染早期检测的技术尤为重要。

开展与抗病相关基因的cDNA全长序列克隆，在此基础上利用实时荧光定量PCR技术(qPCR)定性和定量检测抗病相关基因的mRNA表达量，根据被感染病毒或细菌病原初期的鱼类会激活体内抗病相关基因大量表达的原理，通过检测并分析抗病相关基因表达量的变化规律，可作为诊断鱼类被病原感染的早期辅助指标，可为鱼类病害的早期防治方案提供依据，是提高鱼类病害防治效果的有效手段。其中，qPCR技术是分析基因表达谱的一种常用的方法技术，该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号在扩增反应中的循环累积实时监测整个PCR进程，最终通过特定数学原理对未知模板进行定量及定性分析，具有灵敏性高、特异性强、快速准确等特点，可以分析特定基因在不同时期或不同处理样本间的基因表达差异等，是一种强有力的检测基因表达的方法。

在抗病相关基因中，TLRs(Toll样受体)是细胞表面的、病原模式识别受体分子(PRRs)，能特异性识别各种微生物(病原体)的相关分子模式(PAMP)，并激活多种抗病信号通路基因的表达，进而产生免疫防御功能。TLR7是TLRs中最重要的一类，主要位于细胞内的细胞器中，如内质网、前溶酶体、溶酶体和核内体中，在鱼类中负责识别病毒双链RNA(dsRNA)和革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，参与鱼类抗病毒和抗菌免疫反应，并通过接头蛋白Myd88介导下游的免疫反应。目前大西洋鲑、大黄鱼、牙鲆等鱼类TLR7基因的克隆和表达已有报道，但未见翘嘴鳜TLR7的克隆以及相关通路基因表达研究的报道。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种翘嘴鳜TLR7基因，TLR7是TLR家族中最重要的成员之一，鱼类TLR7能识别病毒双链RNA(dsRNA)和G⁺细菌、G^-细菌的受体并激活表达，参与鱼类抗病原免疫反应。克隆重要的经济鱼类翘嘴鳜TLR7基因，对于丰富鱼类TLR7基因库，进一步研究鱼类TLR系统的抗病分子机制及其应用具有重要价值。

本发明的再一目的在于提供上述翘嘴鳜TLR7基因在对翘嘴鳜被病原感染初期时进行检测方面的应用，在本发明翘嘴鳜TLR7 cDNA克隆的基础上，通过qPCR技术检测被病毒或细菌感染的翘嘴鳜体内TLR7以及TLR7-Myd88通路相关基因(Myd88、IRAK1和IRF7)的表达量，可初步诊断翘嘴鳜是否受到病毒或细菌感染，为鱼类病害的早期防治提供较为可靠的依据，进而增加鱼类养殖的经济效益。

本发明是这样实现的，一种翘嘴鳜TLR7基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明进一步公开了一种翘嘴鳜TLR7蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明进一步公开了上述翘嘴鳜TLR7基因在翘嘴鳜病原感染初期检测中的应用。

优选地，该应用具体包括以下步骤：

(1)根据翘嘴鳜体内TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因设计特异性扩增引物，其中，所述TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因包括TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7基因；

(2)在翘嘴鳜被感染病毒或细菌初期，采用qPCR检测方法对TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因mRNA表达量的显著应答反应进行检测和分析，将检测结果作为鱼体被病毒或细菌感染初期的辅助指标。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明首次克隆了翘嘴鳜TLR7 cDNA全长序列，丰富了鱼类TLR7基因库，对于进一步研究鱼类抗病分子机制及其应用具有重要价值，为鱼类的病害防治和抗病选育等工作提供研发基础；

(2)本发明建立了翘嘴鳜TLR7-Myd88通路相关基因(TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7)的qPCR检测技术，基于发现的翘嘴鳜被病毒或细菌感染的数小时至数天内体内TLR7基因及其信号通路基因表达量极显著(P<0.01)变化的规律，作为翘嘴鳜被病原早期感染的辅助诊断技术，为翘嘴鳜受到病毒或细菌感染的早期诊断提供新思路，有利于鱼类病害的早期防治，提高鳜鱼养殖经济效益。

附图说明

图1是翘嘴鳜TLR7基因各阶段扩增后的凝胶电泳结果；其中，图1-A是翘嘴鳜TLR7基因cDNA 5’端RACE第二轮PCR琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为目的片段；图1-B是翘嘴鳜TLR7基因cDNA 3’端RACE第二轮PCR琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为目的片段；

图2是翘嘴鳜TLR7基因编码的氨基酸组成表；

图3是翘嘴鳜TLR7基因编码的蛋白质结构域SMART预测；

图4是病毒感染后的翘嘴鳜头肾中TLR7-Myd88依赖型通路相关基因的mRNA表达量变化，注：结果以means±SEM的形式显示；*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)，**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)；

图5是细菌感染后的翘嘴鳜头肾中TLR7-Myd88依赖型通路相关基因的mRNA表达量变化，注：结果以means±SEM的形式显示；*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)，**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)；

图6是细菌感染后在翘嘴鳜脾脏组织中TLR7-Myd88依赖型通路相关基因的mRNA表达量变化，注：结果以means±SEM的形式显示；*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)，**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一、翘嘴鳜TLR7 cDNA的克隆

TLR7基因cDNA扩增所用引物，如下表1所示：

表1 TLR7基因cDNA扩增所用引物的序列

引物名称	引物序列(5’-3’)	目的
			GSP-TLR7-1	CAGTCCACCTTCACCA	TLR7 5’-Race
GSP-TLR7-2	CTGCCGTTGCTGGTCACA	TLR7 5’-Race
			GSP-TLR7-3	ATGGCAGGGTTTTTGGGT	TLR7 5’-Race
3’CDS Primer A	AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC	TLR7 3’-Race
			GSP-TLR7-4	GAAAGTGCCTTGCAATTCAAAGTACCTA	TLR7 3’-Race
GSP-TLR7-5	GTATAAGCGGTCTGTGCTGGAGTGG	TLR7 3’-Race
			AUAP	GGCCACGCGTCGACTAGTAC	通用5’-Race
AAP	GGCCACGCGTCGACTAGTAC(G)<sub>16</sub>	通用5’-Race
			UPM	CTAATACGACTCACTATAGGGC	通用3’-Race

1、翘嘴鳜TLR75’端序列的扩增

(1)cDNA第一链的合成、纯化及加尾

用SUPERSCRIPT II RT酶、引物GSP-TLR7-1(表1)对已提取的总RNA进行TLR7第一链cDNA的合成。使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理。其中，反转录体系如下：

70℃孵育10分钟，立刻置于冰上1分钟以打开RNA二级结构，短暂离心收集液体，按照说明书继续添加如下体系：

轻轻混匀后离心，42℃孵育1分钟，再添加1μl SUPERSCRIPTII RT，混匀后42℃孵育50分钟后，70℃、15分钟停止反应，离心后置于37℃，添加RNase mix 1μl，反应30分钟，对其进行纯化后，采用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上poly(c)后，低温保存备用。

(2)cDNA 5’末端快速扩增

使用引物GSP-TLR7-2和试剂盒中带的桥连铆钉引物AAP(表1)对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增，根据说明书，按如下顺序添加5’-RACE反应体系：

PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃重新分析退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃终延伸7min。

使用引物GSP-TLR7-3和试剂盒中带的桥连通用扩增引物AUAP(表1)进行巢式PCR第二轮扩增，体系如下所示：

PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，59℃重新分析退火30s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃终延伸7min。

将第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶(1.2％)电泳，使用胶回收试剂盒(生工，上海)对目的条带(图1-A)进行切胶回收。回收纯化后的PCR产物，克隆到pMD18-T载体上(TaKaRa)，挑取阳性克隆，送测序，得到有效的目的片段。

2、翘嘴鳜TLR7 3’端序列的扩增

(1)cDNA第一链的合成、纯化

用SUPERSCRIPT II RT酶、引物3’CDS primer A(SMARTer^TMRACE cDNAAmplification Kit，Clontech)(表1)对提取的总RNA进行逆转录，所用引物为3’CDSprimer A，其他成分与条件5’端扩增相同。

(2)cDNA末端快速扩增

使用引物GSP-TLR7-4和UPM(表1)，以之前合成的cDNA为模板进行PCR第一轮扩增，根据说明书，按如下所示顺序添加3’-RACE反应体系(反应程序同5’扩增程序)：

将第一轮扩增的PCR产物稀释50倍，进行第二轮PCR扩增，除引物GSP-TLR7-5和UPM外，其他体系同第一轮扩增相同，反应程序同5’扩增程序。对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶(1.2％)电泳，对目的条带(图1-B)切胶回收，克隆到pMD18-T载体上(TaKaRa)，挑取阳性克隆，送测序。得到翘嘴鳜TLR7 cDNA完整系列，翘嘴鳜TLR7cDNA全长3408bp，包含116bp的5’非编码区(5’-UTR)，3156bp的开放阅读框，预测编码了1051个氨基酸，在136bp的3’非编码区(3’-UTR)中包含了一个终止密码子TAA、多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和polyA尾巴。如SEQ ID NO：1所示，该翘嘴鳜TLR7 cDNA的编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。采用在线软件ProtParam分析得到的翘嘴鳜TLR7蛋白质含有1051个氨基酸，分子量为121.28kDa，理化等电点为8.47，预测分子式为C₅₄₇₅H₈₆₀₃N₁₄₂₉O₁₅₇₇S₅₀。经Bioedit软件分析了翘嘴鳜TLR7基因的氨基酸组成比例，结果如图2所示，TLR7蛋白由20种氨基酸构成，其中亮氨酸所占比例最高，达到15.3％，其次为丝氨酸占9.2％；有116个氨基酸残基(Arg+Lys)带正电荷，105个氨基酸残基(Asp+Glu)带负电荷。采用SMART在线预测分析软件对TLR7蛋白结构域预测，预测显示该蛋白具有一个跨膜区、17个膜外区域LRR结构域和TIR家族特征结构域，如图3，符合Toll样受体家族的一般结构特征。

二、翘嘴鳜TLR7-Myd88通路相关基因(TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7)mRNA表达量的qPCR检测方法

1、所用基因及引物设计

根据上述一所得的翘嘴鳜TLR7 cDNA序列以及查阅GenBank数据库获得的翘嘴鳜Myd88、IRAK1和IRF7基因cDNA序列，设计并验证后获得各个基因的qPCR引物，β-actin为qPCR内参基因。各个基因引物如表2所示。

表2 qPCR所用基因及引物序列信息

2、样本总RNA的提取与质量检测

取翘嘴鳜各组织并立即在液氮中速冻，分别研磨各个组织至匀浆，使用AxyPrep总RNA小量制备试剂盒(AXYGEN，美国)提取总RNA，具体方法如下：

(1)取20～40mg组织，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。RNA丰富的组织(如肝脏)不超过30mg；RNA含量低的组织(如肌肉)不超过100mg；

(2)加入400μl Buffer R-Ⅰ，用装有21～25号针头的注射器反复抽吸8～10次，转入1.5ml离心管中。

(3)加入150μl Buffer R-Ⅱ，漩涡振荡15～30s，12,000×g离心5min。(建议在4℃下离心。)

(4)取上清至1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，混和均匀；

(5)将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，转移步骤4中的混合液到制备管中，6,000×g离心1min。(建议在4℃下离心。)

(6)弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入500μl Buffer W1A，12,000×g离心1min。(确认在Buffer W1A concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。)

(7)弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700μl Buffer W2，12,000×g离心1min；以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次(确认在Buffer W2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。)

(8)弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12,000×g离心1min。

(9)将制备管放入一干净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加70～100μl Buffer TE或RNase-free水。

(10)室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA。

对所提RNA质量和浓度进行检测后，选取达到质量要求的RNA样品-80℃保存备用，用于后续实验。

3、RNA质量检验

使用NANODROP 2000超微量紫外分光光度计检测所提RNA产物的质量及浓度，并进行琼脂糖电泳查看其完整性。若所抽提的RNA质量不达标则重复此步骤再次抽提直到得到质量合格的RNA样本。

4、cDNA第一链的合成

(1)cDNA第一链的合成、纯化及加尾

轻轻混匀后离心，42℃孵育1分钟，再添加1μl SUPERSCRIPT II RT，混匀后42℃孵育50分钟后，70℃、15分钟停止反应，离心后置于37℃，添加RNase mix 1μl，反应30分钟，对其进行纯化后，采用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上poly(c)后，低温保存备用。

5、引物特异性及扩増效率的鉴定预实验

在正式进行qPCR实验前，首先进行底物稀释浓度及标准曲线的制作，确定所有引物的特异性及扩增效率，以确保实验结果的准确性。因此，上机分析之前进行了普通PCR扩增并克隆测序、融解曲线及标准曲线的绘制等操作，确保所用引物对的特异性及扩增效率满足实时荧光定量实验的上机要求。

6、目的基因的qPCR检测

将提取的RNA并反转录的cDNA按比例稀释，用上述各对引物进行扩增，检测溶解曲线和扩增曲线并确定最佳反应条件后，使用

2×GreenStarTM qPCR PreMix(Bioneer，韩国)试剂盒，在荧光定量PCR仪上进行qPCR检测，反应条件为：95℃预变性10min，然后95℃15s，60℃30s，40个循环。

7、数据处理与分析

目的基因的表达量采用2^-ΔΔCt法，使用Excel 2007对实验数据进行处理分析，其中ΔΔCt＝[(Ct_{目的基因(实验组)}－Ct_{β-actin(实验组)})－(Ct_{目的基因(对照组)}－Ct_{β-actin(对照组)})]，采用SPSS17.0对所得数据进行方差分析检测其差异性，P<0.05表明有显著性差异，P<0.01表明有极显著性差异。

三、基于翘嘴鳜体内TLR7基因以及TLR7-Myd88通路相关基因(Myd88、IRAK1和IRF7)mRNA表达量的变化规律来判断被病原(病毒或细菌)感染的辅助检测方法

为了获得TLR7基因在翘嘴鳜分别受到不同病原(病毒或细菌)感染后的应答模式以及TLR7抗病信号通路相关基因(Myd88、IRAK1和IRF7)响应规律，在翘嘴鳜分别受到不同病原(病毒或细菌)感染后，采用qPCR的方法检测并分析翘嘴鳜相关基因的表达量变化。结果表明，在病原入侵鱼体的数小时以及数天后，TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因(TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7)表现出了显著的分子应答反应，因而可用于翘嘴鳜是否受到病毒或细菌感染的辅助诊断指标，这为翘嘴鳜受到病毒或细菌感染的早期诊断提供了新思路，有利于鱼类病害的早期防治。

实施例2

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是鳜鱼养殖生产中危害最严重的病毒和细菌病原，实验对引起翘嘴鳜暴发性死亡的病原(传染性脾肾坏死病毒和嗜水气单胞菌)进行了染毒实验，实时检测翘嘴鳜受到不同病原(病毒或细菌)感染后TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因(TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7)表达量的变化，是翘嘴鳜受到病毒或细菌感染的一种辅助检测方法。

实验方法：一共有100尾健康的翘嘴鳜，平均体重为42.63g，放在有水流系统的水族箱中进行了两周的适应后开始实验，养殖条件为不间断充气，水温26℃，每天喂食三次。在感染实验之前，随机选择10尾鱼检查体内传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和嗜水气单胞菌等常见的病原，确保不存在病原后，将实验鱼随机分为3组(病毒感染组，细菌感染组，对照组)，每组20尾。采用无菌注射器对实验鱼进行腹腔注射，病毒感染组分别注射6×10⁶GE/mLISKNV溶液(0.3ml/尾)，细菌感染组分别注射1.0×10⁵CFU/mL嗜水气单胞菌溶液(0.3mL/尾)，另以注射等体积的PBS缓冲液作为对照组。分别在注射后的3h、6h、12h、24h、48h和72h后，采集各组翘嘴鳜脾脏及头肾，放入标记后的EP管中，液氮保存并用于提取RNA。按照实施例1中的“翘嘴鳜TLR7-Myd88通路相关基因(TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7)mRNA表达量的qPCR检测方法”，获得结果如下：

(1)病毒感染翘嘴鳜后其体内TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因表达量的变化

分别对翘嘴鳜腹腔注射ISKNV后的3h、6h、12h、24h、48h、72h后，对头肾组织中的TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7基因表达情况进行测定。并与注射PBS缓冲液的对照组进行比较，所得的各个基因不同组织中不同时间点的相对表达量，结果如图4所示。

在翘嘴鳜头肾组织中，TLR7基因在3h就被极显著诱导，达到对照组的15.54倍(P<0.01)，尽管之后72h的表达量有所下降，但仍然显著高于对照组(P<0.01)。TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路中其它相关基因(Myd88、IRAK1)的表达量与TLR7基因的变化趋势完全相同，在病原感染后的3h至72h内其基因表达水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)地高于对照组；而IRF7基因的表达量除3h以外，均无显著增加。因此，通过检测翘嘴鳜头肾组织中TLR7、Myd88、IRAK1基因的表达水平，均可作为鱼体被病毒感染初期(3h至72h内)的辅助指标。

(2)细菌感染下的翘嘴鳜TLR7-Myd88依赖型信号通路相关基因的表达变化

分别对翘嘴鳜腹腔注射嗜水气单胞菌后的3h、6h、12h、24h、48h、72h后，同样对其脾脏、头肾组织中的TLR7、Myd88、IRAK1、IRF7基因表达情况进行测定，并与注射PBS缓冲液的对照组进行比较，所得的各个基因在LPS刺激后各组织中不同时间点的相对表达量，结果如图5、图6所示。

在翘嘴鳜脾脏组织中(图6)，TLR7基因呈现表达上下波动的趋势，在3h的表达量显著(P<0.05)上调，6h达到极显著性(P<0.01)上调水平，随后于24h下降至仅为对照组的0.76倍，48h和72h表达上升至对照组的1.3倍左右并保持稳定。从图6可以看出，Myd88基因在脾脏中的响应表达趋势与TLR7基本一致。IRAK1和IRF7基因表达的变化趋势基本相同，均于3h至24h极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)高于对照组，且IRAK1在48h仍然上调至对照组的3.21倍(P<0.01)；但除Myd88基因以外的其它3个基因在72h的表达量均接近对照组表达水平。因此，通过检测翘嘴鳜脾脏组织TLR7、Myd88、IRAK1基因的表达水平，可作为鱼体被细菌感染初期(3h至48h内)的辅助指标。

在翘嘴鳜头肾组织中(图5)，于细菌感染后的12h和72h，TLR7基因的表达量分别高于对照组的3.03倍和2.73倍(P<0.01)；Myd88基因的表达量分别在3h、12h和72h出现显著上调(P<0.05)；除48h外，IRAK1基因在3h至72h的表达量均显著高于对照组的2.5倍左右(P<0.05)，且于6h的表达量极显著高于对照组的10.53倍(P<0.01)；IRF7基因在3h的表达值有所上升，在之后的4个时间点又下降并维持在对照组的0.5倍以下范围内有小幅波动，在72h被极显著诱导至对照组的3.38倍(P<0.01)。因此，通过检测翘嘴鳜头肾组织TLR7、Myd88、IRAK1基因的表达水平，可作为鱼体被细菌感染初期(3h至72h内)的辅助指标。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种翘嘴鳜TLR7基因及其应用

<141> 2018-08-15

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3407

<212> DNA

<213> Siniperca chuatsi

<400> 1

tgcggcggct tgctgcgggg ttctttcttc ttggccgggc acactccttt cagtacttga 60

tccaacttga caacataact catagcagga cctcttttca atctctcacg tgaacaatgt 120

tcttccacct gatgtgtgtg gcactgctgg gctgctgtct ctccatatcg acagcaagca 180

tttcttaccc aaaaaccctg ccatgtgatg ttagtgtgac cagcaacggc agtgtggtga 240

aggtggactg cactgagaga agcctaaaag atatcccccc tggcatcccc agagacacta 300

ccaatctgac gctcaccatc aaccatattc ctaaattaaa ctccacctct tttcacggtc 360

tggagaacct gactgagatt gacatgaggt gcaactgtgt gcccatcaaa atcggcccca 420

aggaccgcat gtgcactgcc agtgtgacaa tagaggaaaa tacctttacc agcctgagga 480

atctgcgagc gctgtatcta gatgggaatc agctctacag tatacctaaa ggcctgcctt 540

caaatctgat cctgctgagt ttggaagtga atcacattta ttatatttcc aaagcaaacc 600

tctccgagat cagaaatgtt gagatgcttt acctcagtca aaattgctat tatcgtaacc 660

catgtaatgt ttcctatgat atagaggatg gtgcattttt acagcttaac aatttaacat 720

tgttatgtct taaatcaaat aacttatcct ttattccaca tcaattaccc acaagtctga 780

aggagttgta cctctacaac aataacattg aaaaagtcac tgatgaggat ttcaaaaacc 840

taactaacct tgagattcta gatattagtg gaaactgtcc tcggtgttac aatgctcctt 900

tcccatgcac accgtgtcca aataactcac cacttaatat cagcaagact gcttttaaaa 960

tgttgacaaa actaaagacg ctgcgcctgc acagtaactc tctgacttgt gtgccagctg 1020

agtggtttgc cagcaccaca gagcttagag tgcttgatct ctcatcaaac tttttagcag 1080

agagatagga gtcaccacct tcccacattt cctgggcaaa ctggaagaac tggacctttc 1140

atttaactat gaacttcaga ggtaccccca aacactgaga ctgagctgca atttctcctc 1200

cctcaaatcc cttagaattc tcagactaaa gggctttgtg tttcagcagc taaagccaga 1260

gagcattgct cctttaaaac ctcttacaaa cttggaggtt gtagatctgg gtacaaactt 1320

cattaaaatg acaaacctta gcattctgat ggagttaaaa agctttaaaa taatcagtct 1380

gtctgacaac aaaatatctt ccccctctga cggccaagat gctgttggtt tctctggagg 1440

agagcccttg tactggtctc ccatgtcggg tgctgctcag taccaaagta aggaagtgag 1500

agagattcat tacttcagat atgatgaata tgcacgcagc tgcaaataca aagataaaga 1560

acttggagtt gttacatcct ttgtcaaaag gcagtgcagt gagtttggca aaaccctgga 1620

tgtgagcaga aacaacatat tcttcctgca ttcaagattt ttaaatctta gagagctgag 1680

atgcctcaat ctgtctggga atgcaatgag ccaaagtctg aatggctctg aatttaccta 1740

tctgactaat ttacaatatc tggacttctc ctcaaatcgc ctggacctgc tctactccac 1800

tgcatttcaa gagctgaaaa atctggtcat cttggatata agtaacaaca accattattt 1860

tgagtctgag ggcttgactc acatgcttaa tttcactaga aatttgaaaa atctcaagat 1920

attgctgatg aatcacaaca agatctctac ttccactaac acagagctgg agagtcaatc 1980

tctagagagg ttagagttca gagataaccg gttagatatg ttgtggagag atggggacat 2040

cagatatgtc aattatttca agaaattact taatctgact gtccttgaca tctcttataa 2100

caacctcaat ttcattccac aggaagtgtt ccgtggtctg ccagacaaac tgtctgagct 2160

ctacatcaaa aacaacaaac taacatactt tgattgggag aagcttcaac ttctacattc 2220

tttgcaagtc ttagatctca gtggaaacag cttaactgat gttccatcca tactgtcaaa 2280

ctgtaccaaa tctctcaaga agctcatttt acataagaac caaatcctaa aactcacgcc 2340

agatttcctt aaggatgcct acattttaaa atatctggat cttagtttta accacataca 2400

gcacattgag aaatctagct ttccagatga tgttgttaat aagatggaca tgctgcttct 2460

gcacaaaaac agatttgtgt gcacttgcaa cgccacttgg tttatcaaat ggctcaacca 2520

aaccaaagtg accatcccca ggctggccac agatgtcacc tgtgccactc cgggggcaca 2580

aagaggtcat cccgtgatct cagtggacct gctggcctgc cagtacagct acctgtcaat 2640

catcctctac atcctcatga cttcccttgt cctcagcttc ctcaccctgt ccatctctag 2700

ccatctcttc ctgtgggacg tctggtacat ctaccacttc tgcagggcca agctcaaagg 2760

ctatgaccgc ctgtactccc aaagctctgt ctatgatgcc tttgtgatat atgacaagga 2820

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cgacaatctc tcccagagca ttcacaagag caagaggacc gtgttcattc tcaccggcaa 3000

atacattaaa agtggaaact tcaagacagc tttctacatg gctaaccaaa ggctaatgga 3060

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atacaacaac cttttcaaag agaccctgta agtgaaacaa tatgctgtaa cgcccagttc 3300

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tcatttaaat gtaagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 3407

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<212> PRT

<213> Siniperca chuatsi

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Ile Ser Thr Ala Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Thr Leu Pro Cys Asp Val

20 25 30

Ser Val Thr Ser Asn Gly Ser Val Val Lys Val Asp Cys Thr Glu Arg

35 40 45

Ser Leu Lys Asp Ile Pro Pro Gly Ile Pro Arg Asp Thr Thr Asn Leu

50 55 60

Thr Leu Thr Ile Asn His Ile Pro Lys Leu Asn Ser Thr Ser Phe His

65 70 75 80

Gly Leu Glu Asn Leu Thr Glu Ile Asp Met Arg Cys Asn Cys Val Pro

85 90 95

Ile Lys Ile Gly Pro Lys Asp Arg Met Cys Thr Ala Ser Val Thr Ile

100 105 110

Glu Glu Asn Thr Phe Thr Ser Leu Arg Asn Leu Arg Ala Leu Tyr Leu

115 120 125

Asp Gly Asn Gln Leu Tyr Ser Ile Pro Lys Gly Leu Pro Ser Asn Leu

130 135 140

Ile Leu Leu Ser Leu Glu Val Asn His Ile Tyr Tyr Ile Ser Lys Ala

145 150 155 160

Asn Leu Ser Glu Ile Arg Asn Val Glu Met Leu Tyr Leu Ser Gln Asn

165 170 175

Cys Tyr Tyr Arg Asn Pro Cys Asn Val Ser Tyr Asp Ile Glu Asp Gly

180 185 190

Ala Phe Leu Gln Leu Asn Asn Leu Thr Leu Leu Cys Leu Lys Ser Asn

195 200 205

Asn Leu Ser Phe Ile Pro His Gln Leu Pro Thr Ser Leu Lys Glu Leu

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Tyr Leu Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Lys Val Thr Asp Glu Asp Phe Lys

225 230 235 240

Asn Leu Thr Asn Leu Glu Ile Leu Asp Ile Ser Gly Asn Cys Pro Arg

245 250 255

Cys Tyr Asn Ala Pro Phe Pro Cys Thr Pro Cys Pro Asn Asn Ser Pro

260 265 270

Leu Asn Ile Ser Lys Thr Ala Phe Lys Met Leu Thr Lys Leu Lys Thr

275 280 285

Leu Arg Leu His Ser Asn Ser Leu Thr Cys Val Pro Ala Glu Trp Phe

290 295 300

Ala Ser Thr Thr Glu Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Ser Asn Phe Leu

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Ala Arg Glu Ile Gly Val Thr Thr Phe Pro His Phe Leu Gly Lys Leu

325 330 335

Glu Glu Leu Asp Leu Ser Phe Asn Tyr Glu Leu Gln Arg Tyr Pro Gln

340 345 350

Thr Leu Arg Leu Ser Cys Asn Phe Ser Ser Leu Lys Ser Leu Arg Ile

355 360 365

Leu Arg Leu Lys Gly Phe Val Phe Gln Gln Leu Lys Pro Glu Ser Ile

370 375 380

Ala Pro Leu Lys Pro Leu Thr Asn Leu Glu Val Val Asp Leu Gly Thr

385 390 395 400

Asn Phe Ile Lys Met Thr Asn Leu Ser Ile Leu Met Glu Leu Lys Ser

405 410 415

Phe Lys Ile Ile Ser Leu Ser Asp Asn Lys Ile Ser Ser Pro Ser Asp

420 425 430

Gly Gln Asp Ala Val Gly Phe Ser Gly Gly Glu Pro Leu Tyr Trp Ser

435 440 445

Pro Met Ser Gly Ala Ala Gln Tyr Gln Ser Lys Glu Val Arg Glu Ile

450 455 460

His Tyr Phe Arg Tyr Asp Glu Tyr Ala Arg Ser Cys Lys Tyr Lys Asp

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Phe Gly Lys Thr Leu Asp Val Ser Arg Asn Asn Ile Phe Phe Leu His

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Ser Arg Phe Leu Asn Leu Arg Glu Leu Arg Cys Leu Asn Leu Ser Gly

515 520 525

Asn Ala Met Ser Gln Ser Leu Asn Gly Ser Glu Phe Thr Tyr Leu Thr

530 535 540

Asn Leu Gln Tyr Leu Asp Phe Ser Ser Asn Arg Leu Asp Leu Leu Tyr

545 550 555 560

Ser Thr Ala Phe Gln Glu Leu Lys Asn Leu Val Ile Leu Asp Ile Ser

565 570 575

Asn Asn Asn His Tyr Phe Glu Ser Glu Gly Leu Thr His Met Leu Asn

580 585 590

Phe Thr Arg Asn Leu Lys Asn Leu Lys Ile Leu Leu Met Asn His Asn

595 600 605

Lys Ile Ser Thr Ser Thr Asn Thr Glu Leu Glu Ser Gln Ser Leu Glu

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Asp Ile Arg Tyr Val Asn Tyr Phe Lys Lys Leu Leu Asn Leu Thr Val

645 650 655

Leu Asp Ile Ser Tyr Asn Asn Leu Asn Phe Ile Pro Gln Glu Val Phe

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Arg Gly Leu Pro Asp Lys Leu Ser Glu Leu Tyr Ile Lys Asn Asn Lys

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Leu Thr Tyr Phe Asp Trp Glu Lys Leu Gln Leu Leu His Ser Leu Gln

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Ser Asn Cys Thr Lys Ser Leu Lys Lys Leu Ile Leu His Lys Asn Gln

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Ile Leu Lys Leu Thr Pro Asp Phe Leu Lys Asp Ala Tyr Ile Leu Lys

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Tyr Leu Asp Leu Ser Phe Asn His Ile Gln His Ile Glu Lys Ser Ser

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Asn Arg Phe Val Cys Thr Cys Asn Ala Thr Trp Phe Ile Lys Trp Leu

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Asn Gln Thr Lys Val Thr Ile Pro Arg Leu Ala Thr Asp Val Thr Cys

805 810 815

Ala Thr Pro Gly Ala Gln Arg Gly His Pro Val Ile Ser Val Asp Leu

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Leu Ala Cys Gln Tyr Ser Tyr Leu Ser Ile Ile Leu Tyr Ile Leu Met

835 840 845

Thr Ser Leu Val Leu Ser Phe Leu Thr Leu Ser Ile Ser Ser His Leu

850 855 860

Phe Leu Trp Asp Val Trp Tyr Ile Tyr His Phe Cys Arg Ala Lys Leu

865 870 875 880

Lys Gly Tyr Asp Arg Leu Tyr Ser Gln Ser Ser Val Tyr Asp Ala Phe

885 890 895

Val Ile Tyr Asp Lys Glu Asp Pro Glu Val Ser Glu Trp Val Met Lys

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Glu Met Cys Val His Leu Glu Asp Arg Gly Asp Arg Leu Leu Thr Leu

915 920 925

Cys Leu Glu Glu Arg Asp Trp Ile Pro Gly Cys Pro Leu Ile Asp Asn

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Leu Ser Gln Ser Ile His Lys Ser Lys Arg Thr Val Phe Ile Leu Thr

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Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Gly Asn Phe Lys Thr Ala Phe Tyr Met Ala

965 970 975

Asn Gln Arg Leu Met Asp Glu Lys Asn Asp Val Ile Val Leu Ile Phe

980 985 990

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Leu Tyr Lys Arg Ser Val Leu Glu Trp Pro Thr Asn Pro Gln Ala Gln

1010 1015 1020

Pro Tyr Phe Trp Phe Ser Leu Arg Ser Val Leu Val Thr Glu Ser His

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<212> DNA

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Claims

1.一种翘嘴鳜TLR7基因检测制剂在制备用于翘嘴鳜病原感染初期的检测试剂中的用途，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。