CN103739696B - 一种半滑舌鳎雌性特异csw3蛋白及其基因与应用 - Google Patents
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Abstract
一种半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白及其基因与应用，属于水产生物技术中的功能基因筛选与应用技术领域，半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；编码上述CSW3蛋白的CSW3基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的CSW3基因的体外重组半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白能够明显升高雌性相关基因foxl2的表达水平，具有刺激雌性相关基因表达的生物活性；同时具有降低雄性相关基因sox9和amh表达水平的生物活性。将CSW3基因重组表达产物作为饲料添加剂使用后能够刺激雌性性腺发育，提高雌鱼比例，因此，半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于水产生物技术中的功能基因筛选与应用技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白及其基因与应用。
背景技术
鉴于鱼类性别决定基因在鱼类性别决定机制基础和应用研究上的重要意义，美国、日本、德国、法国、加拿大等国家的科学家们分别以大马哈鱼、罗非鱼和青鳉等为材料开展了鱼类性别特异基因筛选和性别决定机理的研究。其中最为成功的是日本科学家以青鳉为材料发现了鱼类第一个性别决定基因DMY（Matsuda et al.,Nature,2002,417:559-563）。不过，后续研究发现，DMY只在青鳉和弓背青鳉中发现，而在其它鱼类中未见DMY雄性决定基因（Matsudaet al.,Zoolog Sci,2003:159-161;Kondo et al.,Curr Biol,2003:416-420;Volff et al.,Trends Genet,2003:19:196-199）。
半滑舌鳎（Cynoglossμs semilaevis）是我国特有的名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，主要分布于黄海、渤海（邓景耀等，海洋水产研究，1988，9：10-98），由于其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱。2002年，我国突破了半滑舌鳎人工育苗技术难关（柳学周等，海洋水产研究，2006，27：25-32），目前，半滑舌鳎已成为我国海水鱼类养殖的主导品种之一，年养殖产量达15-20亿元。不过，半滑舌鳎雌、雄个体生长速率上存在巨大差异，雌性比雄性生长快2-4倍。由于半滑舌鳎雄性个体生长缓慢、个体小，致使增加了半滑舌鳎的养殖成本、降低了养殖产量和效益，严重影响了半滑舌鳎苗种的推广，阻碍了养殖产业的发展。因此，开展半滑舌鳎性别控制技术研究、培育半滑舌鳎高雌性化苗种，对于提高半滑舌鳎的养殖产量和经济效益至关重要。而半滑舌鳎雌雄特异基因的筛选鉴定及其功能的分析研究是揭示半滑舌鳎性别决定机制的重要基础。另外，由于半滑舌鳎性别决定类型为ZW型，即雌性具有特异的W染色体（周丽青等，水产学报，2005：417-419）。而有关鱼类雌性特异或决定基因的筛选与克隆，特别是半滑舌鳎雌性特异基因的筛选与克隆目前国内外尚未见报道。因此，鱼类性别特异/决定基因，特别是半滑舌鳎雌性特异或决定基因的筛选与克隆以及性别决定分子机制的研究是目前国内外亟待攻克的重要科学问题，也是建立半滑舌鳎性别控制技术的重要理论基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白及其基因与应用，为半滑舌鳎性别控制和全雌苗种研制提供基因资源和技术方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明一个方面涉及半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白，其氨基酸序列为SEQID NO:1；
编码上述CSW3蛋白的CSW3基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明的另一个方面涉及用于重组表达CSW3蛋白的重组质粒，所述的重组质粒中插入了序列为SEQ ID NO:3的DNA片段。
本发明再一个方面涉及CSW3蛋白在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例中的应用。
本发明再一个方面涉及一种包含CSW3蛋白的饲料添加剂或饲料。
上述CSW3蛋白作为饲料添加剂，用于刺激半滑舌鳎雌性性腺发育。
本发明再一个方面涉及包含所述的CSW3蛋白的药物。
本发明的CSW3基因的体外重组半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白能够明显升高雌性相关基因foxl2的表达水平，具有刺激雌性相关基因表达的生物活性；同时具有降低雄性相关基因sox9和amh表达水平的生物活性。将CSW3基因重组表达产物作为饲料添加剂使用后能够刺激雌性性腺发育，提高雌鱼比例，因此，半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。
附图说明：
图1：半滑舌鳎雌雄鱼中CSW3基因的表达分析
图2：半滑舌鳎不同组织中CSW3基因的表达水平分析；
图3：半滑舌鳎不同发育时期雌鱼卵巢和雄鱼精巢中CSW3基因的表达水平分析；
图4：半滑舌鳎CSW3基因重组表达载体pET32a-CSW3的大肠杆菌培养总蛋白及纯化后重组CSW3蛋白电泳图；
其中图A为pET32a-CSW3的大肠杆菌培养总蛋白电泳图。1、pET32a-CSW3未经IPTG诱导的菌体上清电泳图，2、pET32a-CSW3未经IPTG诱导的菌体沉淀电泳图，3、pET32a-CSW3经IPTG诱导后菌体上清电泳图，4、pET32a-CSW3经IPTG诱导后菌体沉淀电泳图，M为康为世纪公司的广谱蛋白Marker。图B为重组CSW3蛋白纯化后电泳图。5、重组CSW3蛋白纯化后电泳图，M为康为世纪公司的广谱蛋白Marker。
图5：半滑舌鳎重组CSW3蛋白注射后foxl2基因在0小时，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时和96小时的表达分析；
图6：半滑舌鳎重组CSW3蛋白注射后sox9基因在0小时，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时和96小时的表达分析；
图7：半滑舌鳎重组CSW3蛋白注射后amh基因在0小时，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时和96小时的表达分析。
具体实施方式
下面结合附图实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
实施例1、半滑舌鳎雌性特异CSW3基因的克隆及其序列
对半滑舌鳎雌、雄鱼分别进行了全基因组测序，通过生物信息学分析，发现ZW雌性个体基因组中具有一个特异的CSW3基因，采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术，从半滑舌鳎卵巢中克隆到了雌性特异基因CSW3基因的cDNA，其全长序列为SEQ ID NO:2，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
半滑舌鳎雌性特异基因CSW3的cDNA序列全长为1674bp，包括414bp的开放阅读框（ORF区域），编码137个氨基酸，5′非编码区长173bp，3′非编码区长1090bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。
具体步骤如下：
1、半滑舌鳎雌性特异基因的筛选与克隆
本发明专利中的雌性特异基因序列来源于半滑舌鳎基因组测序项目，对半滑舌鳎雌性个体和雄性个体采用SOLEXA测序技术分别进行全基因组测序和组装，采用生物信息学方法对获得的雌鱼基因组序列和雄鱼基因组序列进行比对分析，从中筛选出半滑舌鳎雌性特异候选基因；对其中一个雌性特异候选基因CSW3基因设计引物（CSW3-JS：TGCTGGTAGGTTGACATACTGGAA，CSW3-JA：GAACAAAGGTAGGGCCAAACTG），对半滑舌鳎雌雄鱼基因组DNA分别进行PCR扩增，发现CSW3基因只在雌鱼基因组DNA中存在，而在雄鱼基因组中扩增不出来（图1）。
2、半滑舌鳎雌性特异基因的序列
采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术，采用CSW3基因的特异PCR引物（CSW3-5′GSP：AGGCCAGGACAAAAGATATACATGCTTCC，CSW3-3′GSP：GATCAAAGCCAGAGACATCGTTCCTGGAG），从半滑舌鳎卵巢中克隆到了雌性特异基因CSW3基因的全长cDNA，其全长序列为SEQ ID NO:2，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
cDNA序列获得采取cDNA末端扩增（RACE），方法按照SMARTerTM RACEcDNA Amplification Kit（Clontech），其具体操作条件如下：
3′RACE所用的体系以及反应条件：
50μl反应体系
5μl 10X BD Advantage 2 PCR Buffer
1 μl dNTP Mix(10mM)
5 μl μPM
1 μl GSP
2 μl 3'-RACE-Ready cDNA
1 μl50X BD Advantage 2 Polymerase Mix
35 μl PCR-grade water
反应条件如下：
94℃变性30秒，72℃延伸3分钟，5个循环后改为94℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸3分钟，5个循环后改为94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸3分钟，反应25个循环。
5′RACE所用体系及反应条件：
50μl反应体系
5μl 10X BD Advantage 2 PCR Bμffer
1 μl dNTP Mix(10mM)
5μl μPM
1μl GSP
2μl 5'-RACE-Ready cDNA
1μl 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix
35μl PCR-grade water
反应条件如下：
94℃变性30秒，72℃延伸3分钟，5个循环后改为94℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸3分钟，5个循环后改为94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸3分钟，反应25个循环。
将3′RACE和5′RACE的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒（Omega）进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体（Takara）连接，挑选阳性克隆提取质粒，3730DNA Analyzer（ABI）测序，测得的序列经CLUSTER分析拼接得到全长序列。
半滑舌鳎雌性特异基因CSW3的cDNA序列全长为1674bp，包括414bp的开放阅读框（ORF区域），编码137个氨基酸，5′非编码区长173bp，3′非编码区长1090bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。
实施例2半滑舌鳎雌性特异基因CSW3在不同组织及不同发育时期的表达模式
1、半滑舌鳎雌性特异CSW3基因在不同组织的表达模式：采用半定量和实时定量PCR技术分析了CSW3基因在半滑舌鳎不同组织（心、肝、鳃、皮、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢、精巢及伪雄鱼精巢）的表达情况，发现CSW3基因在雌鱼卵巢、肝脏、垂体中表达水平最高，鳃、脑、脾表达量次之，心、血、肠、伪雄鱼精巢重表达量最低，皮、肌肉和雄鱼精巢中几乎没有表达（图2）。雌鱼和伪雄鱼遗传性别的鉴定按照已报道的方法进行（Chen et al.,MarBiotechnol,2012,14:120-128）。实时定量PCR分析的具体步骤为：
（1）半滑舌鳎不同组织总RNA的提取及反转录：取250-500克重的半滑舌鳎雌鱼的心、肝、鳃、皮、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢、雄鱼精巢和伪雄鱼精巢组织，用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用常规方法通过M-MLV反转录酶（Takara）反转录成cDNA。
（2）实时荧光定量PCR反应条件
根据半滑舌鳎CSW3基因cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物CSW3-S（AGAAGGGAAGTCTTTATGGGAGC），CSW3-A（CATCCTCAGCATTGCGTTCAT），对半滑舌鳎雌鱼不同组织（心、肝、鳃、皮、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢）以及雄鱼精巢，伪雄鱼精巢中CSW3基因的表达进行分析。
实时荧光定量PCR反应体系以及反应条件：
20μl反应体系
10μl SYBR Taq
0.4μl primer F
0.4μl Primer R
0.4μl Rox RD II
0.5μl cDNA（600ng/μl）
8.3μl H2O
发现CSW3基因在卵巢中表达水平最高，在雄鱼精巢中几乎不表达，因此，CSW3基因是半滑舌鳎雌鱼特异表达基因。
2、半滑舌鳎雌性特异CSW3基因在半滑舌鳎不同发育时期的表达：采用实时定量PCR方法检测了半滑舌鳎雌性特异CSW3基因在半滑舌鳎雌鱼和雄鱼不同发育时期（4天、62天、131天、5月、8月、10月、1年、2年）鱼体或性腺中的表达情况，发现CSW3基因在雌鱼卵巢中检测到表达，其中62天的卵巢中有微弱表达，131天开始表达量逐渐增加，至一年表达量最高，两年时表达量稍有降低。在精巢中，各个阶段CSW3基因的表达水平都非常低，甚至几乎检测不到表达，且不同阶段无显著性差异（图3）。由此证明，CSW3基因在半滑舌鳎雌鱼性腺分化和发育过程中起着重要作用。
雌雄鱼遗传性别的鉴定按照已报道的方法进行（Chen et al.,Mar Biotechnol,2012,14:120-128）。CSW3基因在半滑舌鳎不同发育时期表达检测的具体步骤为：
（1）半滑舌鳎不同发育时期雌鱼、雄鱼鱼体或性腺总RNA的提取及反转录：取半滑舌鳎雌鱼/雄鱼4天、62天、131天、5月、8月、10月、1年、2年等不同发育时期的鱼苗或成鱼的卵巢/精巢，用RNA提取试剂盒提取Total RNA，M-MLV反转录酶（Takara）反转录成cDNA。
（2）实时荧光定量PCR反应条件：
对不同发育时期（4天、62天、131天、5月、8月、10月、1年、2年）雌鱼性腺的cDNA进行实时荧光定量PCR分析，反应体系及反应条件如下：
20μl反应体系
10μl SYBR Taq
0.4μl primer F
0.4μl Primer R
0.4μl Rox RD II
0.5μl cDNA（600ng/μl）
8.3μl H2O
结果表明CSW3基因随着鱼体的生长和雌性性腺发育，卵巢中CSW3基因在62天时有微弱表达，131天开始表达量逐渐增加，至一年表达量最高，两年时表达量稍有降低。在精巢中，各个阶段CSW3基因的表达水平都非常低，甚至几乎检测不到表达，且不同阶段无显著性差异。
3、半滑舌鳎鱼苗和成鱼的遗传性别鉴定：
从半滑舌鳎鱼苗或成鱼上采取0.1克的尾鳍组织，按照常规的酚/氯仿方法提取基因组DNA，随后采用中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林实验室建立的半滑舌鳎性别连锁微卫星标记和建立的遗传性别鉴定方法（Chen et al.，Mar Biotechnol，2012，14:120-128）进行半滑舌鳎鱼苗和成鱼的遗传性别鉴定。
实施例3、半滑舌鳎雌性特异CSW3基因重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的重组表达和表达产物的分离纯化
采用常规PCR技术，扩增了CSW3基因的开放阅读框ORF区域，其序列为SEQ ID NO:3，并将其克隆到pET32a（+）表达载体上，构建了CSW3基因原核表达载体pET32-CSW3。将该表达载体转化到大肠杆菌BL21中，进行了CSW3基因的体外重组表达，获得了重组表达产物，重组表达产物经过GE公司His-tag亲和层析柱纯化后，获得了纯化的重组CSW3蛋白，重组CSW3蛋白分子量为33kD左右。实现上述目标的具体方案如下：
1、CSW3基因重组表达载体的构建方法：
本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pET原核表达系统。
通过PCR技术，使用对pET32a-CSW3（+）载体序列和CSW3基因ORF区序列进行酶切位点分析，并设计带酶切位点特异引物PET-32-CSW3S和PET-32-CSW3A，序列如下：(PET-32-CSW3S:AGCGGATCCATGGAGAACGCTCACATGAA，PET-32-CSW3A:AGCAAGCTTCTACAATGTCTCCAGGAACG)。上游5′端含BamHI酶切位点，下游3′端含HindIII酶切位点。以卵巢cDNA为模板进行PCR反应，扩增CSW3基因编码区。将PCR产物纯化与pET32a（+）同时用HindIII和BamHI进行双酶切，琼脂糖电泳回收CSW3基因片段与表达载体质粒，按照连接酶说明书，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pET32a-CSW3，转化大肠杆菌TOP10感受态，将检测阳性克隆进行测序，测序正确的克隆提取质粒。再将pET32a-CSW3质粒转化表达感受态BL21（DE3）细菌，将15%（体积比）的甘油加到感受态细菌菌种中于-80℃冷冻保存作为保种菌。
2、重组蛋白的诱导表达与表达产物的分析
取5μl保种大肠杆菌菌株加入到1mL新鲜的TB培养基中（含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素），25℃，200r/min过夜培养，将1%（体积比）的过夜培养细菌接种到20mL新鲜的TB培养基中（含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素），25℃，250r/min培养至OD600达到0.6-0.8时，在实验组（pET32a-CSW3）菌液中加入IPTG诱导，使IPTG终浓度为0.5mM，对照组（pET32a-CSW3）菌液中不加IPTG，28℃，250r/min继续培养16小时，离心（4℃，12000r/min，5分钟）收集菌体，采用JY92-IIDN超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心后分别取上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE电泳检测，发现在CSW3基因重组表达载体pET32a-CSW3经IPTG诱导后的菌体上清中有1条分子量为33kD的蛋白带，而菌体沉淀和未经IPTG诱导的对照组中则无此条蛋白带（图4A）。
3.重组蛋白的分离纯化
将表达阳性的原菌液1：100（体积比）接种于1000mL TB培养基中，在37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，在25℃继续培养16小时，离心收集菌体，将菌体沉淀重悬于25ml pH7.9冰预冷的结合缓冲液（25mL结合缓冲液中含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑）中。超声破碎裂解细胞，离心（4℃，12000r/min，10分钟）收集上清，将上清用0.45μm的过滤器过滤，将过滤液收集备用。应用His Trap HP（GE公司）亲和层析柱进行分离纯化，具体操作如下：
首先，用5mL蒸馏水洗1mL柱子一次，随后5mL结合缓冲液（20mMNa3PO4，0.5M NaCl，20mM咪唑）洗柱子，再将收集的过滤液过柱子，流速为1-2mL/min，用5mL结合缓冲液洗柱子，再用5mL的洗脱缓冲液（20mMNa3PO4，0.5M NaCl，500mM咪唑）洗脱一次，最后用5mL的结合缓冲液再生柱子。
收集经过亲和层析后纯化的重组蛋白样品，采用Solarbio公司的透析带进行过夜透析处理后，在Thermo公司的冻干机Heto PowerDry LL3000上真空冷凝干燥，PBS溶解。12%SDS-PAGE电泳检测，观察到重组蛋白分子量为33kD左右（图4B），命名为CSW3蛋白。
4.蛋白浓度测定
采用北京天根生化科技有限公司的BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的蛋白进行定量分析，具体操作按照说明书进行。
四、半滑舌鳎CSW3重组表达产物生物活性的测定及其应用
将CSW3蛋白注射到100-200克重的半滑舌鳎雄鱼精巢，检测了重组CSW3蛋白对性腺foxl2、sox9、amh三种性别相关基因表达水平的影响，发现注射CSW3蛋白，雌性相关基因foxl2的表达水平在12、24、72小时都有升高趋势（图5）。与此相反，雄性相关基因sox9的表达水平在注射后24-96小时之间都有下降趋势（图6），雄性相关基因amh的表达水平在注射后12、48、72、96小时有下降趋势（图7）。
具体检测方法如下：
取100-200克重的一龄半滑舌鳎雄鱼40尾，其中4尾取性腺，检测其中的foxl2、sox9、amh三种性别相关基因表达水平作为0小时对照。取18尾鱼注射CSW3蛋白（15μl，1.5mg/mL），另18尾注射失活CSW3蛋白（沸水浴5min失活，注射量为15μl，1.5mg/mL）作为对照组。实验组与对照组分别在注射后6小时，12小时，24小时，48小时，72小时，96小时取性腺迅速投入液氮中，每个组在每个时间点采样3尾。根据NCBI中报道的半滑舌鳎性别相关基因Foxl2（GQ402462）、Sox9a（GQ402461）和Amh（JN100095）等序列设计定量PCR引物，各引物的序列如下：
Foxl2-S：GAGAGGAAGGGCAACTACTGGA
Foxl2-A：TGGTTGGAAGTGCGTGGG
Sox9a-S：CGATTCCCCTGCGTCCA
Sox9a-A:GCTTCAGTTCGGCTTTATTGG
Amh-S：GAGGATTGGCATTGAAAC
人工设计的引物序列Amh-A：GACAAGCAGAAGCGGAGT
结果表明，本发明的CSW3基因的体外重组蛋白CSW3蛋白能够明显升高雌性相关基因foxl2的表达水平，具有刺激雌性相关基因foxl2表达的生物活性，同时还有降低雄性相关基因sox9和amh表达水平的生物活性。因此，将CSW3重组表达产物CSW3蛋白作为饲料添加剂或药物使用后将具有刺激半滑舌鳎雌性性腺发育的作用，产生提高雌鱼比例的效果。因此，本发明筛选的半滑舌鳎雌性特异基因及其重组表达蛋白CSW3蛋白在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。
Claims (3)
1.一种半滑舌鳎雌性特异CSW3蛋白，其特征在于它的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
2.编码权利要求1所述CSW3蛋白的CSW3基因，其特征在于它的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种用于重组表达CSW3蛋白的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒中插入了序列为SEQ ID NO:3的DNA片段。
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