CN112391387B - 一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及RNA干扰领域，具体涉及一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用；具体而言，本发明提供了一种优化的siRNA，该siRNA成功在ZZ型半滑舌鳎雄鱼中对配子发生基因进行了干扰，具有广阔的应用前景。

Description

一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及RNA干扰领域，具体涉及一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用。
背景技术
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是比目鱼的一种，属于舌鳎科，舌鳎属，是东北亚地区重要的海水养殖鱼类。半滑舌鳎以其肉质鲜美，口感爽滑而深受消费者喜爱，成为海水养殖鱼类中的名贵品种。半滑舌鳎存在明显的雌、雄生长差异，雌鱼生长可比雄鱼大2-4倍，因此养殖中提高雌鱼比例对于产量提升具有重要意义。半滑舌鳎属于ZW性别决定类型，即理论上讲，ZW基因型将发育为雌鱼，ZZ型发育成雄鱼。然而在实际生产中，有相当一部分的ZW个体会性逆转为“伪雄鱼”，伪雄鱼性成熟后，只产生Z型精子，伪雄鱼(ZW，♂)与雌鱼(ZW，♀)后代中的ZW个体也更容易变为伪雄鱼，由于伪雄鱼生长和雄鱼相似，这极大限制了舌鳎产业的发展。
配子发生是进行性别控制的关键，如解决上面提到的伪雄鱼配子发生异常，或控制雌鱼Z型和W型卵子比例，均可实现性别的人工干预。鉴于此，通过基因组测序和甲基化组分析，筛选了一批半滑舌鳎配子发生相关基因，其中发现一个位于Z染色体上的neurl3与精子发生密切相关。neurl3在性腺中高表达，其中在雄鱼精巢中表达量最高，伪雄鱼精巢次之，雌鱼卵巢中基本检测不到表达。我们通过体内RNA干扰实验，在伪雄鱼中对neurl3实现了敲低，发现精子发生相关基因的转录水平发生了变化，然而，在我们更感兴趣的雄鱼中，却未能对neurl3实现成功敲降(Xu,W.,Li,H.,Dong,Z.,et al.Ubiquitin ligase geneneurl3 plays a role in spermatogenesis of half-smooth tongue sole(Cynoglossussemilaevis)by regulating testis protein ubiquitination.Gene.2016,592:215–220.)。
基因敲除是研究基因功能的有效工具，但由于半滑舌鳎性成熟周期较长(雄鱼1年，雌鱼2年)，获得纯合基因敲除个体的时间和人力成本则相应增加。因此，在现有基础下优化干扰技术，在半滑舌鳎发育早期建立有效的RNA干扰技术并进行长期应用，可有效缩短研究周期，尽快获得相关表型，对研究配子发生相关的功能基因具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用。
一方面，本发明提供了一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA，所述siRNA的正义链的序列为：5’gcgucuggguuucacaaau3’，所述siRNA的反义链的序列为：3’cgcagacccaaaguguuua5’。
“siRNA(小干扰RNA，短干扰RNA或沉默RNA)”是一种短的双链RNA，人工引入细胞以诱导特定基因mRNA的降解，从而阻止蛋白质翻译并导致RNA抑制基因表达的干扰。
进一步的，所述siRNA的末端还含有dTdT的结构，优选的，在siRNA的3’端含有dTdT的结构。
另一方面，本发明还提供了包含上述siRNA的生物制剂。
在一个实施方式中，所述生物制剂选自载体，优选的，所述载体包括病毒、脂质体。
另一方面，本发明还提供了上述siRNA或生物制剂在干扰半滑舌鳎配子发生基因中的应用。
本发明中的干扰表现为可以降低或敲低或抑制所述基因的表达。
在一个实施方式中，所述半滑舌鳎配子发生基因选自neurl3基因(基因ID:103398139)、tesk1基因(基因ID：KF939086.1)中的一种或任意几种。
在其他的实施方式中，所述siRNA或生物制剂还可以干扰精巢发育相关基因gsdf基因(基因ID：103390401)。
在优选的实施方式中，所述半滑舌鳎为ZZ型半滑舌鳎雄鱼。
另一方面，本发明还提供了一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的方法，所述方法包括利用上述siRNA或生物制剂对半滑舌鳎配子发生基因进行干扰的步骤。
在一个实施方式中，所述半滑舌鳎配子发生基因选自neurl3基因、tesk1基因中的一种或任意几种。
在其他的实施方式中，本发明还提供了一种干扰半滑舌鳎精巢发育相关基因gsdf基因的方法，所述方法包括利用上述siRNA或生物制剂对所述基因进行干扰的步骤。
在优选的实施方式中，所述半滑舌鳎为ZZ型半滑舌鳎雄鱼。
另一方面，本发明还提供了上述siRNA在制备用于干扰半滑舌鳎配子发生基因的试剂、组合物、生物制剂或试剂盒中的用途。
本发明通过对neurl3基因的siRNA的优化，成功在ZZ型半滑舌鳎雄鱼中对配子发生基因进行了干扰，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1.采用不同的siRNA对半滑舌鳎雄鱼进行干扰后的neurl3的表达量(*表示显著性差异，p<0.05)；其中，实验组1为本申请的siRNAs(si-neurl3，图中显示为优化siRNA)，实验组2为发明人前期实验中采用的针对neurl3的siRNA(图中显示为原siRNA)，对照组为siRNA(si-GFP)。
图2.对neurl3进行干扰后对其它雄性相关基因的表达影响(*表示显著性差异，gsdf,p<0.05)；其中，实验组为本申请的siRNAs(si-neurl3)，对照组为siRNA(si-GFP)。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
根据neurl3序列和前期的结果(Xu,W.,Li,H.,Dong,Z.,et al.Ubiquitin ligasegene neurl3 plays a role in spermatogenesis of half-smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis)by regulating testis proteinubiquitination.Gene.2016,592:215–220.)，我们重新设计了针对neurl3特异性的siRNAs(本发明中将其定义为si-neurl3)，并以绿色荧光蛋白的siRNA(si-GFP)作为阴性对照，见表1。同时，我们采用上述文章(Xu,W.,Li,H.,Dong,Z.,et al.Gene.2016,592:215–220.)中采用的siRNA(将其定义为si-neurl3-2)作为另一组实验组。
表1本申请设计的siRNA序列
Figure BDA0002804043650000041
选用ZZ型的半滑舌鳎雄鱼，进行体内RNAi实验，siRNA的剂量(0.05–0.25nmol/g)；具体操作包括：选取孵化后55天的舌鳎，通过手电筒腹侧照射可清楚分辨精巢位置，用微量注射器将siRNA注射至精巢位置。注射分对照组(si-GFP)和实验组1(si-neurl3)和实验组2(si-neurl3-2)，每隔1-2周进行加强，共进行8次注射(见表2)。
表2注射时间
Figure BDA0002804043650000051
取半滑舌鳎的性腺进行RNA提取，反转录后通过定量PCR检测neurl3(基因ID:103398139)、精子发生相关基因tesk1(基因ID：KF939086.1)、精巢发育相关基因gsdf(基因ID：103390401)的表达水平(引物见表3)。
表3用于定量PCR的检测引物
Figure BDA0002804043650000052
经过性别鉴定后，在对照组和实验组各选取5条雄鱼进行qPCR验证，与对照组相比，发现实验组1的个体neurl3表达量出现显著敲降，约为对照组的1/3(图1)；但是，实验组2的neurl3表达量并未出现显著敲降，这与前期的报道一样，实验组2的siRNA可以在伪雄鱼中对neurl3实现敲低，然而在ZZ型雄鱼中，却未能对neurl3实现成功敲低。这表明，本申请优化的siRNA在半滑舌鳎ZZ型雄鱼中可以成功实现对neurl3的干扰。
进一步检测精子发生相关基因tesk1和精巢发育相关基因gsdf的表达量，我们发现在实验组中tesk1和gsdf1的表达水平均显著下降(图2)。

Claims (12)

1.一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA，其特征在于：
所述siRNA的正义链的序列为：5’gcgucuggguuucacaaau3’，
所述siRNA的反义链的序列为：3’cgcagacccaaaguguuua5’。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的末端还含有dTdT的结构。
3.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的3’端含有dTdT的结构。
4.包含权利要求1-3任一所述的siRNA的生物制剂。
5.权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4所述的生物制剂在干扰半滑舌鳎配子发生基因中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述半滑舌鳎配子发生基因选自neurl3基因、tesk1基因中的一种或任意几种。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述半滑舌鳎为ZZ型半滑舌鳎雄鱼。
8.一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的方法，所述方法包括利用权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4所述的生物制剂对半滑舌鳎配子发生基因进行干扰的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述半滑舌鳎配子发生基因选自neurl3基因、tesk1基因中的一种或任意几种。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述半滑舌鳎为ZZ型半滑舌鳎雄鱼。
11.权利要求1-3任一所述的siRNA在制备用于干扰半滑舌鳎配子发生基因的试剂、组合物或生物制剂中的用途。
12.权利要求1-3任一所述的siRNA在制备用于干扰半滑舌鳎配子发生基因的试剂盒中的用途。
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Ubiquitin ligase gene neurl3 plays a role in spermatogenesis of half-smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis)by regulating testis protein ubiquitination;Wenteng Xu等;《Gene》;20160730;第215-220页 *

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