CN117143876A - 一种半滑舌鳎小rna及其应用 - Google Patents
一种半滑舌鳎小rna及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117143876A CN117143876A CN202311140769.9A CN202311140769A CN117143876A CN 117143876 A CN117143876 A CN 117143876A CN 202311140769 A CN202311140769 A CN 202311140769A CN 117143876 A CN117143876 A CN 117143876A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sirna
- gene
- rnf
- cynoglossus semilaevis
- interfering
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001014350 Cynoglossus semilaevis Species 0.000 title claims abstract description 30
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 title description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 241001595453 Symphurus nigrescens Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000032678 sex differentiation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 241001527050 Cynoglossus Species 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000269978 Pleuronectiformes Species 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000009364 mariculture Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及RNA干扰领域，具体涉及一种干扰半滑舌鳎rnf34基因的siRNA及其应用；具体而言，本发明提供了一种优化的siRNA，该siRNA成功干扰半滑舌鳎rnf34基因，对研究半滑舌鳎性别分化相关基因功能和开发性别控制技术具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及RNA干扰领域，具体涉及一种半滑舌鳎小RNA及其应用。
背景技术
半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)是比目鱼的一种，属于舌鳎科，舌鳎属，是东北亚地区重要的海水养殖鱼类。半滑舌鳎以其肉质鲜美，口感爽滑而深受消费者喜爱，成为海水养殖鱼类中的名贵品种。半滑舌鳎存在明显的雌、雄生长差异，雌鱼生长可比雄鱼大2-4倍，因此养殖中提高雌鱼比例对于产量提升具有重要意义。半滑舌鳎属于ZW性别决定类型，即理论上讲，ZW基因型将发育为雌鱼，ZZ型发育成雄鱼。然而在实际生产中，有相当一部分的ZW个体会性逆转为“伪雄鱼”，由于伪雄鱼生长和雄鱼相似，这极大限制了舌鳎产业的发展。
基因在性别分化过程中发挥重要作用，通过调控基因表达是实现性别控制的重要手段。尽管基因编辑技术在半滑舌鳎中已经成功应用，但显微注射后成活率低、获得纯合体周期长(性成熟周期：雄鱼1年，雌鱼2年)等困难限制了其应用，相比而言，体内RNA干扰省时、经济，更适合研究基因功能和实现基因调控，但如何高效筛选有效的小RNA是关键。我们前期通过转录组等分析，发现一个位于Z染色体上的rnf34基因与雄性分化密切相关，以rnf34为对象设计多对siRNA，首先通过半滑舌鳎精巢细胞系筛选敲降效果好的siRNA，进而在雄鱼活体中进行验证，获得较好的敲降效果。
该方法极大优化了筛选流程，在半滑舌鳎发育早期建立有效的RNA干扰技术，能有效缩短研究周期，尽快获得相关表型，对研究性别分化相关基因功能和开发性别控制技术具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种干扰半滑舌鳎rnf34基因的siRNA及其应用。
一方面，本发明提供了一种干扰半滑舌鳎rnf34基因的siRNA，
所述siRNA的正义链的序列为：5’gcacccagugcuggauauutt3’，
所述siRNA的反义链的序列为：5’aauauccagcacugggugctt3’。
“siRNA(小干扰RNA，短干扰RNA或沉默RNA)”是一种短的双链RNA，人工引入细胞以诱导特定基因mRNA的降解，从而阻止蛋白质翻译并导致RNA抑制基因表达的干扰。
进一步的，所述siRNA的末端还含有dTdT的结构，优选的，在siRNA的3’端含有dTdT的结构。
另一方面，本发明还提供了包含上述siRNA的生物制剂。
在一个实施方式中，所述生物制剂选自载体，优选的，所述载体包括病毒、脂质体。
另一方面，本发明还提供了上述siRNA或生物制剂在干扰半滑舌鳎rnf34基因中的应用。
本发明中的干扰表现为可以降低或敲低或抑制所述基因的表达。
上述rnf34基因记载在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/103398329)，Gene ID:103398329，转录本为NCBI Reference Sequence:XM_025053151.1。
另一方面，本发明还提供了一种干扰半滑舌鳎rnf34基因的方法，所述方法包括利用上述siRNA或生物制剂对半滑舌鳎rnf34基因进行干扰的步骤。
另一方面，本发明还提供了上述siRNA在制备用于干扰半滑舌鳎rnf34基因的试剂、组合物、生物制剂或试剂盒中的用途。
在一个实施方式中，上述siRNA干扰半滑舌鳎精巢中rnf34基因的表达。
附图说明
图1.不同siRNA转染半滑舌鳎精巢细胞系后rnf34的表达量(*表示显著性差异，p<0.05)。
图2.半滑舌鳎精巢注射rnf34si1后rnf34的表达量(**表示显著性差异，p<0.01)。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
根据序列和前期结果，设计了针对半滑舌鳎rnf34基因(Gene ID:103398329，转录本为NCBI Reference Sequence:XM_025053151.1)的三对特异性siRNAs(rnf34si1,rnf34si2,rnf34si3)，并以NC作为阴性对照，序列见表1。
表1.设计的siRNA序列
细胞系干扰步骤如下，复苏实验室建系成功的半滑舌鳎精巢细胞系后，在24℃培养箱中用配制10％胎牛血清(FBS)，5ng/ml bFGF，5ng/ml EGF，27.5μmol/L beta-巯基乙醇及5％三抗的L-15培养基进行培养，待细胞长满培养瓶，进行传代培养。密度达到80％～90％时铺到12孔细胞培养板中。采用CP Regent转染试剂盒对已铺板的半滑舌鳎精巢细胞系进行siRNA干扰转染实验，除了设置转染三对特异性siRNAs敲降组外也设置了转染NC组作为阴性对照组。转染60h后通过检测si-cy3转染细胞的细胞状态和荧光作为转染效率检验，转染效率达到80％收取细胞进行RNA提取，反转录后通过定量PCR检测rnf34的表达量。
对于体内RNAi实验，具体信息包括：选取孵化后90天的舌鳎(体长9.47±1.50cm，体宽2.49±0.51cm，体重5.13±1.87g)，用微量注射器将siRNA注射至精巢位置，注射分对照组(NC)和实验组(rnf34si1)，siRNA的剂量为0.025nmol/g)。注射后72小时取性腺进行RNA提取，反转录后通过定量PCR检测rnf34的表达量(检测引物见表2)。
表2.用于定量PCR的检测引物
细胞系干扰结果如图1所示，经比较精巢细胞系的干扰结果，rnf34si1组有明显敲降效果，而rnf34si2和rnf34si3则与NC相同，没有显著性差异。选择rnf34si1进一步注射精巢进行干扰，检测rnf34的表达量，发现其表达水平显著下降，结果如图2所示。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，在不脱离本发明精神和范围内，本领域技术人员都可以在此基础上做出各种改动与变型，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种干扰半滑舌鳎rnf34基因的siRNA，其特征在于，
所述siRNA的正义链的序列为：5’gcacccagugcuggauauutt3’，
所述siRNA的反义链的序列为：5’aauauccagcacugggugctt3’。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的末端还含有dTdT的结构。
3.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的3’端含有dTdT的结构。
4.包含权利要求1-3任一所述的siRNA的生物制剂。
5.权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4所述的生物制剂在干扰半滑舌鳎rnf34基因中的应用。
6.一种干扰半滑舌鳎rnf34基因的方法，所述方法包括利用权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4所述的生物制剂对半滑舌鳎rnf34基因进行干扰的步骤。
7.权利要求1-3任一所述的siRNA在制备用于干扰半滑舌鳎rnf34基因的试剂、组合物、生物制剂或试剂盒中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311140769.9A CN117143876A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 一种半滑舌鳎小rna及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311140769.9A CN117143876A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 一种半滑舌鳎小rna及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117143876A true CN117143876A (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=88883907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311140769.9A Pending CN117143876A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 一种半滑舌鳎小rna及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117143876A (zh) |
-
2023
- 2023-09-05 CN CN202311140769.9A patent/CN117143876A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111387105B (zh) | 一种全雄罗氏沼虾制种的方法 | |
| CN115820640B (zh) | 一种抑制鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA及其应用 | |
| CN109182562B (zh) | 与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA apla-mir-25-42及其检测引物、抑制物和应用 | |
| CN115948391A (zh) | 一种靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA、试剂盒及其应用 | |
| CN109402118B (zh) | 与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA apla-mir-145-4及其检测引物、抑制物和应用 | |
| CN113122539B (zh) | 一种驴Zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用 | |
| KR102320269B1 (ko) | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염력 향상 또는 억제를 위한 돼지 대식세포 분화 및 극성화 방법 | |
| CN117143876A (zh) | 一种半滑舌鳎小rna及其应用 | |
| CN102181482A (zh) | 一种快速调控水稻内源miRNA活性的方法 | |
| CN116004625B (zh) | 一种与羊被毛弯曲相关的环状rna及其应用 | |
| CN109536495B (zh) | 抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用 | |
| CN102433352B (zh) | 一种基于microRNA结构的肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体的构建方法及其功能验证 | |
| EP2955228B1 (en) | Small interference rna for inhibiting intracellular expression of ribosomal protein s3 | |
| CN108998454B (zh) | 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用 | |
| CN112391387B (zh) | 一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用 | |
| CN117431246B (zh) | 一种抑制鸡丙酮酸脱氢酶激酶1基因PDK1表达的siRNA及其应用 | |
| CN116218842B (zh) | 一种特异性敲降鸡TPM1基因表达的siRNA、试剂盒及其应用 | |
| CN105087586B (zh) | 一种抑制牛MEN1基因表达的siRNAs序列及其应用 | |
| CN112574996B (zh) | 一种长链非编码rna aagncr及其应用 | |
| CN115806986B (zh) | 一种奶山羊Zfy基因干扰片段与一种表达载体及其应用 | |
| CN115281151B (zh) | miR-34b/c基因抑制剂在调控施氏鲟早期性别分化中的应用 | |
| CN102174514A (zh) | 一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用 | |
| CN117264957B (zh) | 一种抑制鸡m6A阅读蛋白基因YTHDF2的siRNA及其应用 | |
| CN117448334A (zh) | 一种靶向鸡去甲基化酶基因FTO的siRNA及其应用 | |
| KR100943984B1 (ko) | 돼지 ＧＧＴＡ１ 유전자의 발현 억제를 위한 ｓｉＲＮＡ 및이를 포함하는 발현벡터 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |