CN102433352B - 一种基于microRNA结构的肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体的构建方法及其功能验证 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于microRNA结构的能实现肝细胞选择性多靶点干扰的质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)的构建方法及其功能验证。所述质粒载体由具有肝细胞选择性的甲胎蛋白增强子/白蛋白启动子(AFP enhancer/albumin promoter)、多克隆位点区(Multiple Cloning Sites，MCS)、两个内含子区(intron)、多个靶基因的基于microRNA结构的短发卡RNA转录单位(microRNA30-based shRNA，shRNAmir)和质粒序列组成。在第二个内含子(intron 2)区域内，通过同尾酶结构的设计，串联多个相同或者不同的针对荧光素酶基因(Luciferase)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的shRNAmir转录单位，同时选择性的高效抑制肝细胞内Luciferase和EGFP的表达。该载体及其构建方法可以应用于肝细胞基因的功能研究和肝脏疾病基因治疗药物的研发，同时对于其他细胞/组织特异性干扰载体的构建具有重要的借鉴和参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及肝细胞选择性多基因靶点干扰的质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)构建方法及其应用，属于分子生物学领域。
技术背景
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的转录后基因沉默现象。RNAi现象最初发现于1998年Fire等对秀丽隐杆线虫的研究，此后陆续证实在真菌、果蝇、拟南芥及哺乳动物细胞中也存在RNAi。目前，RNAi技术已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛的领域里取得了令人瞩目的进展，使其在医学领域的应用有着广阔的前景。
病毒基因、人工转入基因或转座子等外源性基因进入到宿主细胞基因组内并进行转录时，通常会产生一些长的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)。宿主对这些dsRNA产生应答，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小干扰RNA(short interferingRNA，siRNA)，约21-23bp。siRNA双链在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，进一步反义链和胞内的一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。荷载有反义RNA链的RISC与胞内同源mRNA的同源区进行序列特异性的结合，因RISC具有核酸酶的功能，在结合部位开始切割mRNA，导致mRNA断裂降解，从而抑制宿主细胞基因的表达。
siRNA制备通常可以分为体外化学合成和体内载体表达有两种方法。体外化学合成的siRNA可以直接用于导入细胞抑制目的基因的表达，但化学合成的siRNA不稳定，容易被RNase降解，且siRNA合成价格较高，操作要求严格，因此其广泛应用受到限制。另一种方法是通过载体表达短发卡结构的RNA(short-hairpin RNA，shRNA)，所表达的shRNA在体内被Dicer酶剪切成siRNA从而发挥作用。相对来说，DNA载体在体内作用更稳定，且可以通过特定的抗药性筛选得到shRNA表达DNA整合于细胞基因组的稳定干扰细胞株，便于进一步研究特定基因的功能。
质粒DNA载体按照表达所使用的启动子类型和shRNA的结构可以分为三类。第一类是由广泛表达与各个细胞的RNA聚合酶Pol III启动子启动shRNA发卡结构的表达，通过多个碱基T来终止转录。第二类是由RNA聚合酶Pol II启动子启动shRNA发卡结构的表达，通过Poly(A)序列来终止。特定的Pol II启动子具有细胞/组织特异性，因此可以干扰特定类型细胞中的目的基因，而对其他细胞中的靶基因不起作用。第三类由RNA聚合酶Pol II启动子，启动基于microRNA结构的shRNA表达。相对于前两种shRNA表达质粒，这种方法能更好的模拟体内microRNA作用的过程，避免由于产生过多shRNA阻断体内microRNA的传递通路造成的毒性损伤。目前对此研究较多的是利用microRNA155和microRNA30的结构，将所设计的小RNA干扰序列插入microRNA骨架结构，在体内经Dicer酶切割、解旋酶解开双链，再结合到RISC复合物中抑制目标基因mRNA的表达。RNAi现象具有高度的特异性，只有与shRNA序列具有高度匹配的mRNA才能被降解，一个shRNA只能针对一个靶基因进行沉默，而且针对靶基因mRNA不同位点的shRNA干扰效率也不一样。为了确保RNAi的效率，或者是需要同时抑制多个靶基因时，多靶点RNA干扰载体的应用就显得非常重要。
目前对于多靶点shRNA表达载体的构建已有一些文献报道，例如中国专利号CN101245352A公开的技术方案是以pSilencer2.0-U6或pSilencer3.0-H1为基础，构建出能够同时表达多个shRNA的质粒载体pSilencer-U6/H1-(shRNA)n，但这种多靶点shRNA表达载体不具有细胞/组织特异性表达的特点，且一个载体中含有多个U6/H1启动子。瞬时的过量表达shRNA容易导致细胞内microRNA通路的阻断而引起细胞毒性作用。亦有人采用microRNA的结构构建多靶点shRNA表达载体(Hyun JungJunn，Dai-Wu Seol et al.Effective knockdown of multiple target genes byexpression the single transcript harbouring multi-cistronic shRNAs.Biochemical and Biophysical Research Communications 396(2010)861-865)，但这种载体采用了CMV启动子，该启动子在多种细胞中均能启动shRNA的转录，抑制靶基因的表达，不具有细胞/组织特异性，且易甲基化而失活，导致干扰效率降低。
因此，我们设计发明了一种基于microRNA结构的肝细胞选择性多靶点干扰的质粒载体。该载体能够选择性的高效抑制肝细胞中的单个/多个靶基因的表达，而对其他细胞不起作用。该载体及其构建方法可以应用于肝细胞基因的功能研究和肝脏疾病基因治疗药物的研发，同时对于其他细胞/组织特异性干扰载体的构建具有重要的借鉴和参考价值。
发明内容
发明目的
本发明的第一个目的是提供一种基于microRNA结构的肝细胞选择性多靶点干扰的质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)。
本发明的第二个目的是提供所述肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体的构建方法。
本发明的第三个目的是说明所述肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体在干扰Luciferase和EGFP报告基因中的验证应用。
在本发明的第一个方面，本发明提供一种基于microRNA结构的肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体的构建方法，所述质粒载体由具有肝细胞选择性的甲胎蛋白增强子/白蛋白启动子(AFP enhancer/albumin promoter)、多克隆位点区(Multiple Cloning Sites，MCS)、两个内含子区(intron)、多个靶基因的基于microRNA结构的短发卡RNA转录单位(microRNA30-basedshRNA，shRNAmir)和质粒序列组成，该载体的建立方法是在质粒的内含子区域内，通过同尾酶结构的设计，串联多个相同或者不同的针对靶基因(例如，荧光素酶基因(Luciferase)和绿色荧光蛋白基因(EGFP))的shRNAmir转录单位，因而可以同时选择性的高效抑制肝细胞内靶基因(例如Luciferase和EGFP)的表达。在一个实施方案中，所述质粒载体采用具体肝细胞选择性的启动子，具体地为甲胎蛋白增强子/白蛋白启动子。在一个实施方案中，所述甲胎蛋白增强子/白蛋白启动子的序列为：
GATCTTTTTGATGGCAGAGTTCAGTTTACCGGGTCACATTGTACCTGGGAAGATTCAAGGATTTATGGAAAAAGTCAACAACAGGAGTCAGAGCAGCCGGAAAAGCATGGACTCTGTACTTAGGACTGCGCTTTGAGCAATGGCACAGCAAGCTTTAACCCTGTTTGCAGTCAGCACACAAACTGTGGTTCAAAGCTCCACTTTATCTCTTCTTGTGGAATTCAGATATCAGATCAGTTTAAACCTTGCGGCCGCACTAGTGCTCAAATGGGAGACAAAGAGATTAAGCTCTTATGTAAAATTTGCTGTTTTACATAACTTTAATGAATGGACAAAGTCTTGTGCATGGGGGTGGGGGTGGGGTTAGAGGGGAACAGCTCCAGATGGCAAACATACGCAAGGGATTTAGTCAAACAACTTTTTGGCAAAGATGGTATGATTTTGTAATGGGGTAGGAACCAATGAAATGCGAGGTAAGTATGGTTAATAATCTACAGTTATTGGTTAAAGAAGTATATTAGAGCGAGTCTTTCTGCACACAGATCACCTTCCTATCAACCCCACTAGCCTCTGGCAAA(SEQ ID NO：5)
在一个实施方案中，本发明所采用的质粒载体是pLIVE质粒载体。在一个实施方案中，所述质粒的内含子区域是质粒的第二个内含子区域。在一个实施方案中，所述shRNAmir转录单位的序列选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4。在一个实施方案中，所述同尾酶可以是XbaI和Spe I。在一个实施方案中，申请人将包含构建的pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)载体的大肠杆菌(Escherichia coli)宿主菌株于2011年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏号为CGMCC No.5181。
本发明方法的一个优选技术方案是：
1.pLIVE质粒载体的改造
(1)去除Xba I、Spe I限制性内切酶位点：通过5’突出末端补平再自连的方法，将pLIVE质粒中的Xba I(2695)、Spe I(264)两个限制性内切酶位点去除。
(2)在Intron 2中引入新的Xba I和Spe I位点：利用载体中已有的XhoI(956)和Cla I(1172)位点，双酶切pLIVE质粒形成线性质粒，同时，通过PCR的方法，扩增Xho I和Cla I之间的质粒序列，并在下游引物的5’端加上Xba I和Spe I位点，将PCR产物经Xho I和Cla I双酶切后，与线性的pLIVE质粒相连接，即可得到在Intron 2中引入新的Xba I和Spe I位点的pLIVE质粒(pLIVE*)。
2.基于microRNA结构的shRNAmir干扰序列的设计
通过软件分析选择针对靶基因的干扰序列，合成97nt的基于microRNA30结构的干扰序列寡聚核苷酸单链。
针对Luciferase基因的97nt DNA Oligo(shLuc155mir)设计如下：
针对EGFP基因的97nt DNA Oligo(shEGFP131mir)设计如下：
针对EGFP基因的97nt DNA Oligo(shEGFP425mir)设计如下：
shNegmir：(阴性对照，negative control，其序列不针对任何特定基因的mRNA)
斜体序列为microRNA30的旁侧序列，下划线序列为microRNA30的茎环序列，粗体序列为针对特定基因的22nt的干扰序列(与加框序列互补配对)
3.肝细胞选择性单靶点干扰载体pLIVE-shLuc155mir的构建。
以合成的97nt寡聚核苷酸单链shLuc155mir为模板，通过PCR扩增、酶切、回收目的片段连接到MSCV-LMP质粒，经测序分析正确后，用带有Xba I和Spe I酶切位点的PCR引物扩增shLuc155mir片段，经双酶切后与线性的pLIVE*连接，构建单靶点干扰载体pLIVE-shRNAmir，并测序鉴定序列正确。
4.肝细胞选择性多靶点干扰载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)，pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)的构建。
将单靶点干扰载体pLIVE-shLuc155mir用Spe I酶切成线性质粒后，继续串联带有Xba I位点和Spe I位点的shLuc155mir，筛选出顺式插入的单克隆，由此构建出能够表达2个shLuc155mir的质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)。依次类推，通过串联插入shEGFP131mir/shEGFP425mir，可构建形成多靶点干扰载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)，即多靶点干扰载体pLIVE-(shRNAmir)n。多个shRNAmir可以设计成针对特定靶基因的相同位点，也可以设计成针对特定靶基因的不同位点以增强干扰效率，还可以设计成针对不同靶基因，从而实现对一个或者多个靶基因的特异性沉默。
5.肝细胞选择性多靶点干扰载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)和pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)的功能验证。
分别将肝细胞选择性单靶点pLIVE-shLuc155mir、肝细胞选择性双靶点干扰载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)与Luciferase报告基因质粒pGL3-CMV共转染人胚肾细胞系HEK293、人肝癌细胞系Huh7，检测对luciferase表达的干扰作用。比较单靶点干扰载体和双靶点干扰载体对luciferase表达的抑制效率差异。将多靶点干扰载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)分别与Luciferase报告基因质粒pGL3-CMV、EGFP报告基因质粒pEGFP-C1共转染人胚肾细胞系HEK293、鼠肝癌细胞系Hepa1-6。检测肝细胞选择性多靶点干扰载体同时对Luciferase和EGFP的干扰效果。
在本发明的另一个方面，本发明提供采用上述方法所构建的质粒载体。在一个实施方案中，所述质粒载体为pLIVE-shLuc155mir、pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)，或pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)(保藏号为CGMCC No.5181)。
在本发明的另一个方面，本发明提供上述质粒载体靶向肝细胞干扰靶基因的应用。在一个实施方案中，所述质粒载体是pLIVE-shLuc155mir、pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)，或pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)。在一个实施方案中，所述目的基因是Luciferase和EGFP报告基因。
本发明的有益效果
本发明公开的多靶点干扰质粒载体
pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)具有如下优点：
1.对于靶基因的干扰具有细胞选择性。所构建的肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)使用了肝细胞选择性的启动子组合(甲胎蛋白增强子/白蛋白启动子)，使得该载体只在肝细胞中表达shRNAmir，对报告基因Luciferase和EGFP的mRNA进行降解沉默，而在其他细胞中不起作用，有效减少了RNAi的非特异性作用。
2.单个质粒载体实现多个靶基因的高效沉默。肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)在细胞内能持续转录合成针对两个报告基因Luciferase和EGFP的shRNAmir，能够在体内同时发挥其对靶基因的mRNA降解作用。且该质粒载体是通过一个RNA聚合酶Pol II启动子转录产生多个shRNAmir，效率较高。
3.抑制靶基因的表达效果稳定，操作方便，质粒型载体可通过大肠杆菌规模化发酵制备，成本低廉。该载体及其构建方法可以应用于肝细胞基因的功能研究和肝脏疾病基因治疗药物的研发，同时对于其他细胞/组织特异性干扰载体的构建具有重要的借鉴和参考价值。
附图说明
图1、pLIVE质粒载体结构图。载体购自Mirus公司，其上带有肝细胞选择性的启动子甲胎蛋白增强子/白蛋白启动子(AFP enhancer/albuminpromoter)、多克隆位点区(MCS)、两个内含子区(intron)及质粒序列。
图2、pLIVE*质粒载体结构图。pLIVE质粒中的限制性内切酶位点Xba I和Spe I位点被去除，在Intron 2中的Cla I位点处引入新的Xba I和Spe I位点。
图3、MSCV-LMP质粒载体结构图。载体购自Open Biosystem公司。
图4、pLIVE-shLuc155mir肝细胞选择性单靶点干扰质粒载体构建流程图。
图5、pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体构建流程图。
图6、肝细胞选择性单靶点干扰质粒载体pLIVE-shLuc155mir、肝细胞选择性双靶点干扰质粒载体pLIVE-shLuc155mir-shLuc155mir分别与Luciferase表达质粒pGL3-CMV共转染人胚肾细胞系HEK293和人肝癌细胞系Huh7，转染后24小时检测细胞中荧光素酶的相对活性。
图7、肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)分别与Luciferase表达质粒pGL3-CMV、EGFP表达质粒pEGFP-C1共转染人胚肾细胞系HEK293和小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，转染48小时后检测细胞中荧光素酶的相对活性和绿色荧光蛋白EGFP的表达情况；
图8microRNA30-like DNA Oligo核酸序列。
具体实施方式
实施例1：基于microRNA结构的肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)的构建
1.pLIVE质粒(Mirus公司)的改造
(1)去除Xba I、Spe I限制性内切酶位点：
通过5’突出末端补平和自连的方法，除去pLIVE初始质粒中的XbaI和Spe I位点。首先将pLIVE初始质粒2μg用Spe I酶(购自Fermentas，Cat.#FD1254)切，使用琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物，回收线性的pLIVE质粒，使用Klenow Fragment(购自Fermentas，Cat.#EP0052)补平5’突出末端，再用T4连接酶(购自Fermentas，Cat.#EL0011)连接线性的质粒形成环状，连接后新产生的序列中不含有Spe I位点。将连接产物转化DH5α感受态细菌，挑取单克隆扩增后抽提质粒。取2μg质粒再次用Spe I酶切鉴定，如果Spe I不能将质粒切成线性，则说明初始质粒中Spe I位点去除成功。
将成功去除Spe I位点的pLIVE质粒，用同样的方法，使用Xba I酶(购自Fermentas，Cat.#FD0685)切、回收线性质粒、使用Klenow Fragment补平5’突出末端、T4连接酶连接线性的质粒形成环状、转化、挑单克隆鉴定，筛选成功除去Xba I位点的克隆。最终得到去除Xba I和Spe I的pLIVE质粒。
(2)在Intron 2中引入新的Xba I和Spe I位点：
microRNA分子通常位于基因组中的非编码区，因此设计将所要构建的shRNAmir插入到pLIVE质粒的内含子区。Intron 2中含有单一的酶切位点Cla I(1172)，设计PCR引物，在Cla I位点处引入新的Xba I和Spe I位点。
引物pLIVE933：
5’-CGGGATCCAGAGCTCACCGCGGACTCGAGTAACA-3’
引物pLIVE1171：
5’-CCATCGATACTAGTCATATGTCTAGAAGAAATAATAGTGGTTCCCAACT
CA-3’
引物pLIVE933结合与pLIVE质粒的933-966bp位置，带有Xho I位点，引物pLIVE1171结合与pLIVE质粒的1147-1171位置，并在5’端依次带有Cla I/Spe I/Nde I/Xba I位点。通过PCR的方法，从pLIVE质粒中扩增933-1171片段，PCR产物两端分别带有Xho I和Cla I位点，将PCR产物用这两种限制性内切酶双酶切，并连接到同样双酶切处理后的线性pLIVE质粒中(已除去原有的Xba I和Spe I酶切位点)，转化DH5α感受态细菌，挑单克隆，抽提质粒。将质粒分别用Xba I和Spe I酶切鉴定，看是否成功插入新的Xba I和Spe I位点，进一步测序鉴定序列，构建成功pLIVE*质粒。
2.肝细胞选择性单靶点干扰质粒载体pLIVE-shLuc155mir的构建
(1)干扰RNA序列shLuc155mir的设计：
根据干扰RNA设计的原则，借助Clontech公司等开发的设计干扰序列的网页工具，分析靶基因Luciferase的序列及其二级结构，确定针对Luciferase基因155-176bp位置的22nt特异性靶序列(CTTACGCTGAGTACTTCGAAAT)，并通过GenBank BLAST检索确保所选序列与其他非相关序列无同源性。根据选定的靶序列结构设计97nt的microRNA30-like DNA Oligo，包括正义链、反义链、茎环结构和microRNA30的旁侧序列：
TGCTGTTGACAGTGAGCGCTTACGCTGAGTACTTCGAAATTAGTGAAGCCACAGATGTAATTTCGAAGTACTCAGCGTAAGTGCCTACTGCCTCGGA(SEQ ID NO：1)
(2)穿梭载体MSCV-LMP-shLuc155mir的构建：
以97nt的microRNA30-like DNA oligo为模板，PCR扩增得到138bp的shLuc155mir，PCR引物两端分别带有Xho I和EcoR I酶切位点：
miR30-Xho I P1 ：
5’-CAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG-3’
miR30-EcoR I P2 ：
5’-CTAAAGTAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA-3’
将PCR扩增所得到的138bp shLuc155mir产物用Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物连接到用相同酶切后的线性MSCV-LMP质粒(OpenBiosystem公司)中，测序分析正确，即得到MSCV-LMP-shLuc155mir质粒。
(3)肝细胞选择性单靶点干扰质粒载体pLIVE-shLuc155mir的构建：
以MSCV-LMP-shLuc155mir为模板，通过带有Xba I和Spe I酶切位点的PCR引物扩增shLuc155mir片段，酶切后连接到经同样酶切后的线性pLIVE*质粒中，转化后挑单克隆筛选，测序鉴定，即可得到单靶点干扰质粒载体pLIVE-shLuc155mir。
shRNAmir-Xba I P1 ：
5’-GCTCTAGAGGGATTACTTCTTCAGGTT-3’
shRNAmir-Spe I P2 ：
5’-GGACTAGTGAGATAGCAAGGTATTCAGTT-3’
由于构建成功的pLIVE-shLuc155mir质粒载体在Intron 2内插入shLuc155mir片段，因此可以用PCR的方法通过扩增产物的大小判断是否含有插入shRNAmir片段，再进一步测序鉴定其正确性，构建完成。PCR引物如下：
Intron 2 P1：5’-AGCACCGACCACTATTC-3’
Intron 2 P2：5’-ACAGGGTGTTGGCTTT-3’
(4)单靶点干扰阴性对照质粒pLIVE-shNegmir的构建：
按相同方法可以制备单靶点干扰质粒载体的阴性对照pLIVE-shNegmir，其干扰序列(AGAGACCCTATCCGTGATTAGA)经Blast分析，不针对任何特定基因的mRNA。根据选定的靶序列结构设计97nt的microRNA30-like DNA Oligo，包括正义链、反义链、茎环结构和microRNA30的旁侧序列：
TGCTGTTGACAGTGAGCGAGAGACCCTATCCGTGATTAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTAATCACGGATAGGGTCTCGTGCCTACTGCCTCGGA(SEQ ID NO：4)
3.肝细胞选择性多靶点干扰载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)，pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)的构建。
本发明中应用了Xba I和Spe I这对同尾酶结构，同尾酶能产生相同粘性末端，酶切产物用连接酶连接后其连接产物不能再被原同尾酶识别切开，Xba I识别位点为T/CTAGA，Spe I识别位点为A/CTAGT，两者的酶切产物均含有相同的粘性末端CTAG，可以用连接酶进行连接，连接完成后的序列为TCTAGT，这一序列不能再被Xba I或Spe I识别切割。应用同尾酶的原理，本发明可以将多个shRNAmir串联至pLIVE*载体中，构建出多靶点干扰质粒载体pLIVE-(shRNAmir)n。
(1)肝细胞选择性双靶点干扰载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)的构建：
将构建成功的单靶点干扰质粒pLIVE-shLuc155mir使用限制性内切酶Spe I酶切，回收线性的质粒，使用碱性磷酸酶(购自Fermentas，Cat.#EF0654)处理线性质粒以减少载体自连，将带Xba I/Spe I粘性末端的shLuc155mir小片段与线性的pLIVE-shLuc155mir用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细菌，挑单克隆筛选，即可得到双靶点干扰质粒pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)，测序鉴定正确。
(2)针对Luciferase和EGFP两种靶基因的肝细胞选择性多靶点干扰载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)的构建：
以报告基因质粒pEGFP-C1(购自Clontech，Cat.#6084-1)中的EGFP报告基因为靶基因，根据干扰RNA设计的原则，借助Clontech公司等开发的设计干扰序列的网页工具，分析靶基因EGFP的序列及其二级结构，确定针对EGFP基因131-152bp位置的22nt特异性靶序列(AAGCTGACCCTGAAGTTCATCT)、针对EGFP基因425-446bp位置的22nt特异性靶序列(CACAAGCTGGAGTACAACTACA)，并通过GenBank BLAST检索确保所选序列与其他非相关序列无同源性。根据选定的靶序列结构设计97nt的microRNA30-like DNA Oligo，包括正义链、反义链、茎环结构和microRNA30的旁侧序列：
shEGPF131mir 97nt的DNA Oligo设计如下：
TGCTGTTGACAGTGAGCGAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTTAGTGAAGCCACAGATGTAAGATGAACTTCAGGGTCAGCTGTGCCTACTGCCTCGGA(SEQ ID NO：2)
shEGFP425mir 97nt的DNA Oligo设计如下：
TGCTGTTGACAGTGAGCGCACAAGCTGGAGTACAACTACATAGTGAAGCCACAGATGTATGTAGTTGTACTCCAGCTTGTATGCCTACTGCCTCGGA(SEQ ID NO：3)
按照上述单靶点干扰质粒载体构建的方法，获得带有Xba I/Spe I粘性末端的shEGFP131mir和shEGFP425mir。将构建成功的双靶点干扰质粒pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)使用Spe I酶切，回收线性的质粒，使用碱性磷酸酶处理线性质粒以减少载体自连，将带粘性末端的shEGFP131mir和shEGFP425mir依次串联连接到线性质粒中，转化DH5α感受态细菌，挑单克隆筛选，即可得到针对报告基因Luciferase和EGFP的肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)。测序鉴定正确。
使用相同方法可以制备得到阴性对照质粒pLIVE-(shNegmir)4
实施例2：针对报告基因Luciferase和EGFP的肝细胞选择性单靶点、双靶点、多靶点干扰质粒载体的功能鉴定
1.将构建的肝细胞选择性单靶点干扰质粒pLIVE-shLuc155mir，双靶点干扰质粒pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)转化大肠杆菌DH5α扩增，离心收集菌体，中量制备抽提纯化质粒，测定OD260质粒浓度，测序鉴定质粒序列正确。
2.将肝细胞选择性单靶点干扰质粒pLIVE-shLuc155mir，双靶点干扰质粒pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)分别与Luciferase表达质粒pGL3-CMV(购自Promega，Cat.#E1751，插入CMV启动子)按照3∶1比例，用脂质体lipofectamine 2000(购自Invitrogen，Cat.#11668-019)共转染人胚肾细胞系HEK293(购自中国科学院细胞库)和人肝癌细胞系Huh7(购自中国科学院细胞库)，pLIVE-shNegmir为阴性对照质粒，pRL-TK质粒(购自Promega，Cat.#E2241)作为转染效率对照质粒。转染后24小时使用PromegaDual-Glo Luciferase Assay system试剂盒检测相对荧光素酶活性。结果显示肝细胞选择性单靶点干扰质粒pLIVE-shLuc155mir、双靶点干扰质粒pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)只在人肝癌细胞系Huh7中起到沉默Luciferase表达的作用，在HEK293细胞中不起作用。双靶点干扰质粒pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir)的干扰效率要明显高于单靶点干扰质粒pLIVE-shLuc155mir，如图6所示。
3.将构建的肝细胞选择性多靶点干扰质粒pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)及其阴性对照质粒pLIVE-(shNegmir)4转化大肠杆菌DH5α扩增，离心收集菌体，中量制备抽提纯化质粒，测定OD260质粒浓度，测序鉴定质粒序列正确。将干扰质粒/对照质粒与Luciferase表达质粒pGL3-CMV、EGFP表达质粒pEGFP-C1按照5∶1比例，用脂质体lipofectamine 2000共转染人胚肾细胞系HEK293和小鼠肝癌细胞系Hepa1-6(购自中国科学院细胞库)，pRL-TK质粒作为转染效率对照质粒。转染48小时后使用Promega Dual-GloLuciferase Assay system试剂盒检测相对荧光素酶活性，用荧光显微镜观察EGFP绿色荧光蛋白的表达情况。肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)只在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6中起到沉默作用，且能同时降低Luciferase和EGFP的表达，在HEK293细胞中不起作用，阴性对照质粒pLIVE-(shNegmir)4没有干扰作用。如图7所显示。
申请人将包含上述构建的pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)载体的大肠杆菌(Escherichia coli)宿主菌株于2011年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏号为CGMCC No.5181。
Claims (4)
1.一种基于microRNA结构的肝细胞选择性多靶点干扰质粒载体的构建方法，所述质粒载体以pLIVE质粒为基础，由序列如SEQ ID NO:5所示的具有肝细胞选择性的甲胎蛋白增强子/白蛋白启动子、多克隆位点区、两个内含子区、多个靶基因的基于microRNA结构的短发卡RNA转录单位和质粒序列组成，所述载体的建立方法是在pLIVE质粒的第二个内含子区域内，通过同尾酶结构的设计，串联多个相同或者不同的针对靶基因的shRNAmir转录单位，因而可以同时选择性的高效抑制肝细胞内靶基因的表达，所述shRNAmir转录单位的序列是SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。
2.权利要求1所述的方法，其中所述同尾酶是Xba I和Spe I。
3.质粒载体，采用权利要求1-2中任一项的方法所构建。
4.包含权利要求3所述的质粒载体的大肠杆菌宿主菌株，其保藏号为CGMCC No.5181。
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