CN101892236B - 靶向znf268基因的rna干扰表达载体构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了靶向ZNF268基因的RNA干扰表达载体构建方法及其应用，本发明方法是将筛选得到的靶向ZNF268基因的siRNA寡核苷酸片段插入到载体系统中，构建成靶向ZNF268基因的RNA干扰质粒载体。实验表明，本发明构建的表达载体可以在肿瘤细胞中高效表达特异的siRNA序列，且该序列能够结合ZNF268基因的mRNA，使ZNF268基因的表达量显著降低，达到抑制ZNF268基因表达的目的。

Description

靶向ZNF268基因的RNA干扰表达载体构建及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及针对ZNF268基因的小干扰RNA及其表达载体构建及应用。

背景技术

ZNF268基因是2001年被发现的一种典型的KRAB/C2H2型锌指蛋白类基因。众多相关的研究结果表明：1)ZNF268基因在生物体的分化发育过程中，甚至是许多疾病(包括白血病、肿瘤、炎症等)的发生发展过程中均发挥着关键的作用；2)由于ZNF268基因存在着可变剪接现象，并且其剪接异构体在白血病人血细胞中有特异性的表达方式，因此ZNF268基因剪接异构体可以在制备治疗或预防白血病的药物中得到应用，可以快速、准确判断是否有白血病的发生(CN101422617A；Zhao ZZ，et al.Oncol.Rep.2008，20，1243-8)。

为了更好地解析ZNF268基因的生物学功能和挖掘其在临床上潜在的应用价值，进一步阐明ZNF268基因的生物学功能成为必要。目前，运用RNA干扰的方法研究基因功能成为了基因功能研究中最重要的手段之一，但是针对ZNF268基因干扰的研究尚未见任何报导。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的一种生物学现象。RNAi的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。RNAi是在研究秀丽新小杆线虫(C.elegans)反义RNA(antisense RNA)的过程中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首次将双链dsRNA注入线虫，结果诱发了比正义链和反义链的单独注射都要强的基因沉默，他们将这种由dsRNA引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中。

RNA干扰是通过一类较稳定的中间介质实现的。长度为21-23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。基于对RNA干扰机制的认识，人们发展了多种RNAi技术。这些技术的核心思路就是通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(正义RNA链和反义RNA链)，从而诱导内源靶基因的降解，达到阻止基因表达的目的。siRNA目标位点的筛选是实现RNAi作用的关键，一般有以下几个原则：1)在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列，起始是AA；2)找2-4个小片段的RNA，通过SECs(siRNA expression cassettes，SECs)筛选最有效的siRNA；3)在19nt的RNA片断中不能含有连续4个T或A的区域；4)通过在线数据库BLAST序列比对，确定所选择片断的序列特异性；5)序列中GC％含量应该在30-50％之间(详见文献：Sui et al.PNAS，2002，99，5515-20)。而目前获得siRNA产物的方法主要包括以下五种：1)化学合成；2)体外转录；3)RNase III降解dsRNA；4)siRNA表达载体；5)PCR表达框。在以上方法中，化学合成、体外转录和RNase III降解dsRNA均是在体外制备得到siRNA，siRNA需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤；而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则是转染到细胞的DNA模板经过体内转录得到siRNA，siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，但是主要缺点在于PCR产物很难转染到细胞中，也不适于大规模制备。比之siNRA表达框架，siRNA表达载体可以在克隆菌株中大量扩增，便于大规模制备，并且可以使用常规的质粒DNA转染方法，将siRNA表达载体转入细胞里，在细胞内加工生成siRNA。相比其它四种方法，siRNA表达载体是唯一可以进行长期研究的方法，因为该方法中克隆到的带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续表达，进而抑制靶基因的表达，持续时间可达数周甚至更久。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供靶向ZNF268基因的siRNA；

本发明的第二个目的在于提供表达siRNA的表达载体；

本发明的第三个目的在于提供上述表达载体的构建方法；

本发明的目的还在于提供上述siRNA及表达载体在抑制ZNF268基因表达中的应用。

为实现上述目的，本发明通过大量筛选和实验工作得到靶向ZNF268基因的siRNA选自：

siE3：ACAGTTCATGGGATAGGAT；

siE5：ACCTGATATCATCTTCAAG；

siE7：ATATATAGATTTCACTAGT。

进而，根据上述siRNA设计合成shRNA，其是将上述siRNA与其互补序列用loop结构连接作为正义链，其互补序列作为反义链，形成双链结构。为了便于插入表达载体，还可以在该序列两端分别接上接头序列，最终形成诸如SEQ ID No.1和2，SEQ ID No.3和4，或SEQ ID No.5和6退火形成的双链shRNA。

进一步，本发明提供含有上述siRNA或shRNA的siRNA表达载体。在本发明优选的实施方式中，所述表达载体源自pSilencer 2.1-U6 neo。构建得到表达载体为pSiU6E3、pSiU6E5及pSiU6E7。

本发明还提供构建上述siRNA表达载体的方法，其包括如下步骤：

1)将上述siRNA和其互补序列用loop结构序列连接形成正义链，在正义链的两端引入连接头序列；

2)根据步骤1)的正义链得到其反义链，并在其两端引入接头序列；

3)将步骤1)和2)得到的序列在溶液中退火，形成shRNA；

4)将shRNA插入线性化的siRNA表达载体中，得到表达siRNA的表达载体。

在本发明实施方式中，步骤1)5’引入的接头序列为GATCC，3’引入的接头序列为TTTTTTGGAAA；步骤2)5’引入的接头序列为AGCTTTTCCAAAAAA，3’引入的接头序列为G。所述loop结构序列为CCACC。

转染上述载体进入HeLa细胞，分别从RNA和蛋白水平检测这些质粒载体干扰ZNF268基因表达的干扰效率，结果表明，上述构建的表达载体可以在肿瘤细胞中高效表达特异的siRNA序列，且该序列能够结合ZNF268基因的mRNA，使ZNF268基因的表达量显著降低，达到抑制ZNF268基因表达的目的。从而可以将上述siRNA、shRNA或上述表达载体用于抑制ZNF268基因的表达。

本发明中所得到的三种干扰ZNF268基因表达的干扰质粒载体(pSiU6E3、pSiU6E5和pSiU6E7)，具有在肿瘤细胞中特异性和高效性地干扰ZNF268基因表达的能力，为进一步研究ZNF268基因的生物学功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同时为将来针对ZNF268基因的相关基因治疗药物的开发提供了可能。

附图说明

图1用于构建ZNF268基因RNAi干扰质粒载体的质粒系统pSilencer2.1-U6 neo示意图(引自Ambion公司提供的技术手册AM5764/5770)；

图2SiE3、SiE5和SiE7转化子的质粒提取检测。M：1kb DNA Ladder^TM(购自MBI公司)；泳道1-3：SiE3转化子的三个独立克隆子的质粒提取；泳道4-6：SiE5转化子的三个独立克隆子的质粒提取；泳道7-9：SiE7转化子的三个独立克隆子的质粒提取。

图3将三种针对ZNF268基因的干扰质粒载体或阴性对照载体分别转染HeLa后48小时，从RNA水平检测ZNF268基因mRNA表达变化。NC：表示转染阴性对照载体pSiU6NC到HeLa细胞后，ZNF268基因mRNA的相对表达量(设定为1，作为参考值)；E3：表示转染干扰质粒载体pSiU6E3到HeLa后，ZNF268基因mRNA的表达量；E5：表示转染干扰质粒载体pSiU6E5到HeLa后，ZNF268基因mRNA的表达量；E7：表示转染干扰质粒载体pSiU6E7到HeLa后，ZNF268基因mRNA的表达量。

图4将三种针对ZNF268基因的干扰质粒载体或阴性对照载体分别转染HeLa后48小时，Western blot分析方法检测ZNF268基因蛋白表达产物的变化。NC：表示转染阴性对照载体pSiU6NC到HeLa细胞后，ZNF268基因的两种蛋白产物(ZNF268a和ZNF268b2)的表达情况；E3：表示转染干扰质粒载体pSiU6E3到HeLa后，ZNF268基因蛋白表达产物的表达情况；E5：表示转染干扰质粒载体pSiU6E5到HeLa后，ZNF268基因蛋白表达产物的表达情况；E7：表示转染干扰质粒载体pSiU6E7到HeLa后，ZNF268基因蛋白表达产物的表达情况。下图为在转染了不同载体时作为内参的beta-actin的表达情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明具体应用方法。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件，如Sambrook等编，《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor laboratory Press，2002)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1：针对ZNF268基因的RNA干扰质粒载体的构建

一、表达ZNF268基因siRNA的寡核苷酸序列的设计与合成

ZNF268基因mRNA有7个外显子区域，根据其核苷酸序列，设计筛选得到若干针对ZNF268基因mRNA序列的siRNA序列，将它们分开以形成“发夹”结构的辅助序列(loop区)连接，形成“发夹”状siRNA的正义链，并在两端分别加上针对pSilencer 2.1-U6 neo的接头序列，正义链的互补序列作为反义链，并在反义链的两端分别加上针对pSilencer 2.1-U6 neo的接头序列，两者退火形成带有针对pSilencer 2.1-U6 neo的接头的shRNA。

进一步筛选得到三对siRNA序列，由于它们分别位于ZNF268基因的第三号、第五号和第七号外显子上，所以本发明中将把它们分别命名为siE3、siE5和siE7。进一步对它们进行序列加工，使之成为可以生成“发夹”状siRNA的寡核苷酸序列(分别见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中所示的核苷酸序列)。核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2互补即可形成针对siE3的、具有干扰ZNF268基因mRNA表达的siRNA寡核苷酸片段；核苷酸序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4互补即可形成针对siE5的、具有干扰ZNF268基因mRNA表达的siRNA寡核苷酸片段；核苷酸序列SEQ ID NO.5和SEQID NO.6互补即可形成针对siE7的、具有干扰ZNF268基因mRNA表达的siRNA寡核苷酸片段。

将这些设计好的寡核苷酸序列送交“上海生工生物工程技术服务有限公司”合成。

二、重组干扰片段系列pSilencer载体的构建

本发明中参考Ambion公司提供的pSilencer 2.1-U6 neo使用技术手册，按如下流程构建重组干扰片段的pSilencer载体。

1.寡核苷酸片段工作液的制备

将上海生工生物工程技术服务有限公司合成的寡核苷酸片段干粉于12,000g离心1分钟，添加适量灭菌双蒸水充分溶解后，用常规的TE缓冲液稀释，并用紫外分光计定量，使每种寡核苷酸溶液的浓度达到1mg/mL左右，作为退火反应的工作液。

2.正向/反向寡核苷酸片段的退火

按如下成分和比例配制正向/反向寡核苷酸片段的退火反应体系，混匀后在90℃水浴加热3分钟，再在37℃水浴孵育1小时，反应结束后可以直接用于后续的连接反应，也可保存于-20℃备用。

反应体系如下：

正向寡核苷酸片段工作液    2μL

反向寡核苷酸片段工作液    2μL

TE缓冲液                  46μL

3.连接反应

取第2步中的退火反应液，用无菌双蒸水稀释10倍后作为连接反应的插入片段溶液，与预先已用限制性内切酶BamH I和Hind III(购自TaKaRa公司)消化过的pSilencer 2.1-U6 neo载体进行连接，16℃连接过夜。连接反应体系如下：

插入片段溶液              1μL

载体酶切产物              1μL

10×连接酶缓冲液          1μL

连接酶(3u/mL)             0.5μL

补无菌双蒸水              10μL

4.连接产物的转化和阳性克隆子鉴定

连接产物的转化和挑斑均按常规方法进行。对于挑斑的培养物直接进行质粒提取和琼脂糖凝胶电泳检测。在可以提出质粒的每种转化子中，随机挑取其中的两个独立克隆子送“华大基因”进行测序验证。

将表达siE3、siE5和siE7的寡核苷酸双链片段与预先已用限制性内切酶BamH I和Hind III消化过的pSilencer 2.1-U6 neo载体分别进行连接和转化反应。对每种转化物随机挑取三个独立的克隆子，活化后进行质粒提取和琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。从图中可以看出，每种转化物的三个独立克隆子都成功的提取了质粒。从每种转化物的三个独立克隆子中随机挑选两个送交公司测序，经过比对分析，每种转化物的两个克隆子的序列完全相同，且都含有相应的寡核苷酸序列。将经过成功重组、并且表达siE3、siE5和siE7寡核苷酸序列的三种干扰质粒载体，分别命名为pSiU6E3、pSiU6E5和pSiU6E7，相应地把载体系统自带的不表达siRNA的阴性对照质粒命名为pSiU6NC。

实施例2：针对ZNF268基因mRNA干扰质粒的干扰效率检测

一、HeLa细胞培养、质粒转染及总RNA和总蛋白的提取

1、HeLa细胞株来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)，由本实验室按照常规方法进行传代培养和保存。

2、利用Sofast阳离子聚合物转染试剂(购自中国厦门Sunma公司)将三种具有干扰ZNF268基因表达的干扰质粒载体转入HeLa细胞，具体转染步骤参照实际说明，简单描述如下：

1)细胞接种：为了获得最好的转染效率，细胞密度应该为50-80％。可以因细胞株的不同而变化，对最常用的细胞株细胞密度一般为60-70％。对于24孔板，最理想条件是在转染前18-24hrs，每孔接种8×10⁴-2.0X10⁵个细胞；

2)梭华-Sofast

/DNA复合物的制备(以下为24孔板转染的用量)：0.6μgDNA质粒稀释于30μl不含血清和抗菌素的DMEM细胞培养液中(购自Invitrogen公司)，轻轻混匀。1-2μl梭华-Sofast

转染试剂稀释于30μl DMEM细胞培养液中，轻轻混匀。各自在室温孵育5分钟后，将30μl梭华-Sofast

稀释液滴加到DNA稀释液中，一边滴加一边混匀。注意：两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要，切勿颠倒滴加顺序；

3)室温孵育15-20分钟；

4)60μl梭华-Sofast

/DNA复合物加到每孔中并轻轻摇动使均匀混合，并放回细胞培养箱继续培养24-48小时。

3、HeLa细胞的总RNA提取

为了从RNA水平检测三种干扰质粒载体对于ZNF268基因的表达干扰的效果，首先需要提取转染目的质粒和对照质粒的HeLa的总RNA。采用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取HeLa的总RNA，具体实验方法参见试剂说明。

4、HeLa细胞的总蛋白提取

为了从蛋白质水平检测三种干扰质粒载体对于ZNF268基因的表达干扰的效果，首先需要提取转染目的质粒和对照质粒的HeLa的总蛋白。采用常规方法提取HeLa的总蛋白，用于后续的Western blot分析。

二、从RNA水平检测干扰质粒的干扰效率

利用实时荧光定量RT-PCR方法(美国ABI公司7500型定量PCR仪)，比较分析分别转染阴性对照质粒和干扰质粒后，HeLa细胞中的ZNF268基因mRNA表达量的变化，结果如图3所示。从图中可以看到，在分别转染pSiU6E3、pSiU6E5或pSiU6E7干扰质粒载体到HeLa细胞后，相对于转染了阴性对照质粒pSiU6NC而言，ZNF268基因的mRNA表达量均受到了明显的抑制，抑制率均在80％以上，说明这三种干扰质粒载体均能够有效抑制HeLa细胞中ZNF268基因的mRNA表达。

三、从蛋白水平检测干扰质粒的干扰效率

利用western blot方法，比较分析分别转染阴性对照质粒和干扰质粒后，HeLa细胞中的ZNF268基因的蛋白产物的表达量变化，结果如图4所示，在分别转染pSiU6E3、pSiU6E5或pSiU6E7干扰质粒载体到HeLa细胞后，相对于转染了阴性对照质粒pSiU6NC而言，ZNF268基因的两种蛋白表达产物ZNF268a和ZNF268b2的表达量均受到了明显的抑制，特别是干扰载体pSiU6E5或pSiU6E7的抑制效率更加明显；而作为阴性对照的beta-actin的表达量并不随着是否转染干扰质粒载体而发生变化。

上述结果说明，本发明中涉及到的三种针对ZNF268基因的干扰质粒载体pSiU6E3、pSiU6E5或pSiU6E7均能够有效抑制ZNF268基因的表达，这为进一步研究ZNF268基因的生物学功能提供了可靠和便捷的研究手段，同时也为未来针对ZNF268基因的相关基因治疗药物的开发提供了可能。

Claims (7)

1.靶向ZNF268基因siRNA，其选自下述核苷酸序列：

siE3：ACAGTTCATGGGATAGGAT；

siE5：ACCTGATATCATCTTCAAG；

siE7：ATATATAGATTTCACTAGT。

2.针对ZNF268基因的shRNA，其为：SEQ ID No.1和2，SEQID No.3和4，或SEQ ID No.5和6退火形成的双链。

3.含有权利要求2所述shRNA的siRNA表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其源自pSilencer 2.1-U6neo。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其为pSiU6E3、pSiU6E5或pSiU6E7。

6.构建权利要求3所述siRNA表达载体的方法，其包括如下步骤：

1)将权利要求1所述siRNA和其互补序列用loop结构序列连接形成正义链，在正义链的两端引入连接头序列；

2)根据步骤1)的正义链得到其反义链，并在其两端引入接头序列；

3)将步骤1)和2)得到的序列在溶液中退火，形成shRNA；

4)将shRNA插入线性化的siRNA表达载体中，得到表达siRNA的表达载体；其中，

所述步骤1)5’引入的接头序列为GATCC，3’引入的接头序列为TTTTTTGGAAA；

所述步骤2)5’引入的接头序列为AGCTTTTCCAAAAAA，3’引入的接头序列为G；

所述loop结构序列为CCACC。

7.权利要求1所述的siRNA、权利要求2所述的shRNA或权利要求3～5任一所述的siRNA表达载体在抑制ZNF268基因表达中的应用。

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