CN103952413A - 靶向ifnar2基因的rna干扰表达载体构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用。本发明的方法是将筛选得到的靶向IFNAR2基因的siRNA寡核苷酸片段插入到载体系统中，构建成靶向IFNAR2基因的RNA干扰质粒载体。实验表明，本发明构建的表达载体可以在ST细胞中高效表达特异的siRNA序列，且该序列能够结合IFNAR2基因的mRNA，使IFNAR2基因的表达量显著降低，达到抑制IFNAR2基因表达的目的。为进一步研究IFNAR2基因的生物学功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同时为研究IFNAR2受体在病毒感染中的作用奠定了基础。

Description

靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用。

背景技术

干扰素的抗病毒作用是干扰素分子结合到干扰素受体之后，向细胞核传播信号，2,5-腺苷酸合成酶和蛋白激酶被活化，最后阻断病毒蛋白的翻译和病毒RNA的合成。干扰素受体是干扰素连锁反应的初始蛋白。人的干扰素受体分Ⅰ型干扰素受体(该受体与干扰素α、β结合)及Ⅱ型干扰素受体(与干扰素γ结合产生特异的敏感性)。此外，已证实Ⅱ型干扰素受体对干扰素α、β也有一定的敏感性，干扰素α亚型和β亚型均对干扰素受体敏感。

IFN生物效应的发挥，需要跟相应的信号受体结合。根据IFN的分类，干扰素受体分为：结合I型干扰素的I型干扰素受体和结合II型干扰素受体。人I型干扰素受体基因定位于第21号染色体上，分布于细胞表面，至少含有两个亚单位，命名为α(IFNAR-1)和β(IFNAR-2)，它们属于II类细胞因子受体家族。IFN-α/β通过吸附细胞表面受体IFNAR-1和IFNAR-2发挥作用，蛋白酪氨酸激酶中的Tyk2和Jak1分别与IFNAR-1和IFNAR-2相关。

为了更好地解析IFNAR2基因的生物学功能和挖掘其在临床上的应用价值，进一步阐明IFNAR2基因的生物学功能成为必要。目前，运用RNA干扰的方法研究基因功能成为了基因功能研究中最重要的手段之一，但是针对IFNAR2基因干扰的研究尚未见任何指导。

RNA干扰(RNA interference，缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。RNAi所诱导的特异性基因沉默现象，是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。

RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。目前获得siRNA产物的方法主要包括以下五种：1)化学合成；2)体外转录；3)RNase III降解dsRNA；4)siRNA表达载体；5)PCR表达框。在以上方法中，化学合成、体外转录和RNase III降解dsRNA均是在体外制备得到siRNA，siRNA需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将siRNA转染进入细胞是成功的关键。siRNA表达载体可以在克隆菌株中大量扩增，还可以使用常规的质粒DNA转染方法，将siRNA表达载体转染入细胞，在细胞内加工生成siRNA。而且siRNA表达载体是唯一可以进行长期研究的方法，因该方法中克隆到的带抗生素标记的载体可以在细胞中持续表达，进而抑制靶基因的表达，持续时间久，并且可以做稳定细胞系的筛选。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供靶向IFNAR2基因的siRNA。本发明通过大量筛选和实验工作得到靶向IFNAR2基因的siRNA。

本发明的另一目的在于提供表达siRNA的表达载体。

本发明的另一目的在于提供上述表达载体的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述siRNA及表达载体在抑制IFNAR2基因表达中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：靶向IFNAR2基因的siRNA，其编码所述siRNA的DNA序列选自如下核苷酸序列：

siE1:5′-CTAACAGATGTGTGGATAA-3′(SEQ ID No.7)；

siE2:5′-CGAATAAAGGGAAACATCA-3′(SEQ ID No.8)；

siE3:5′-GATGAATCTTGCACTTTAA-3′(SEQ ID No.9)；

进而，根据上述siRNA的DNA序列设计合成shRNA，其是将上述siRNA的DNA序列与其互补序列用loop结构连接作为正义链，其互补序列作为反义链，形成双链结构；为了便于插入表达载体，还可以在该序列两端分别接上接头序列，最终形成诸如SEQ ID No.1和2，SEQ ID No.3和4，或SEQ ID No.5和6退火形成的双链shRNA；

进一步，本发明提供含有上述siRNA或shRNA的siRNA表达载体；在本发明优选的实施方式中，所述表达载体源自pSilencer4.1-CMV neo；构建得到表达载体为pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3。

本发明还提供构建上述siRNA表达载体的方法，其包括如下步骤：

(1)将上述siRNA的DNA序列和其互补序列用loop结构序列连接形成正义链，在正义链的两端引入接头序列；

(2)根据步骤(1)的正义链得到其反义链，并在其两端引入接头序列；

(3)将步骤(1)和(2)得到的序列在溶液中退火，形成shRNA；

(4)将shRNA插入线性化的siRNA表达载体中，得到表达siRNA的表达载体。

在本发明实施方式中，步骤(1)中所述的5′引入的接头序列为5′-GATCC-3′，3′引入的接头序列为5′-TTA-3′；步骤(2)中所述的5′引入的接头序列为5′-AGCTTAA-3′，3′引入的接头序列为G；所述loop结构序列为5′-TTCAAGAGA-3′。

转染上述载体进入ST细胞，分别从RNA和蛋白水平检测这些质粒载体干扰IFNAR2基因表达的干扰效率，结果表明，上述构建的表达载体可以在ST细胞中高效表达特异的siRNA序列，且该序列能够结合IFNAR2基因的mRNA，使IFNAR2基因的表达量显著降低，达到抑制IFNAR2基因表达的目的；从而可以将上述siRNA、shRNA或上述表达载体用于IFNAR2基因的表达。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明中所得到的三种干扰IFNAR2基因表达的干扰质粒载体(pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3)，具有在ST细胞(猪睾丸细胞)中特异性和高效性地干扰IFNAR2基因表达的能力，为进一步研究IFNAR2基因的生物学功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同时为研究IFNAR2受体在病毒感染中的作用奠定了基础。

附图说明

图1是用于构建IFNAR2基因的RNAi干扰质粒载体的质粒系统pSilencer4.1-CMV neo示意图(引自Ambion公司提供的技术手册AM5779)。

图2是siE1、siE2和siE3转化子的质粒提取检测的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M：DL5000DNA Marker；泳道1：siE1转化子的独立克隆子的质粒提取；泳道2：siE2转化子的独立克隆子的质粒提取；泳道3：siE3转化子的独立克隆子的质粒提取。

图3是将三种针对IFNAR2基因的干扰质粒载体或阴性对照载体分别转染ST细胞后48h，从RNA水平检测IFNAR2基因mRNA表达变化图；pSiCMVNC：表示转染阴性对照载体pSiCMVNC到ST细胞后，IFNAR2基因mRNA的相对表达量(设定为1，作为参考值)；pSiCMVE1：表示转染干扰质粒载体pSiCMVE1到ST细胞后，IFNAR2基因mRNA的表达量；pSiCMVE2：表示转染干扰质粒载体pSiCMVE2到ST细胞后，IFNAR2基因mRNA的表达量；pSiCMVE3：表示转染干扰质粒载体pSiCMVE3到ST细胞后，IFNAR2基因mRNA的表达量。

图4是将三种针对IFNAR2基因的干扰质粒载体或阴性对照载体分别转染ST细胞后48h，Western blot分析方法检测IFNAR2基因蛋白表达产物的变化图；pSiCMVNC：表示转染阴性对照载体pSiCMVNC到ST细胞后，IFNAR2基因的蛋白表达产物的表达情况；pSiCMVE1：表示转染干扰质粒载体pSiCMVE1到ST细胞后，IFNAR2基因的蛋白表达产物的表达情况；pSiCMVE2：表示转染干扰质粒载体pSiCMVE2到ST细胞后，IFNAR2基因的蛋白表达产物的表达情况；pSiCMVE3：表示转染干扰质粒载体pSiCMVE3到ST细胞后，IFNAR2基因的蛋白表达产物的表达情况；下行为在转染了不同载体时作为内参的β-actin的表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件，如Sambrook等编，《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，2002)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1针对IFNAR2基因的RNA干扰质粒载体的构建

一、表达IFNAR2基因的siRNA的寡核苷酸序列的设计与合成

根据IFNAR2基因的核苷酸序列(GenBank No：HQ665551)，设计筛选得到若干针对IFNAR2基因mRNA序列的siRNA的DNA序列，将它们分开以形成“发夹”结构的辅助序列(loop区)连接，形成“发夹”状siRNA的正义链，并在两端分别加上针对pSilencer4.1-CMV neo(购自Ambion公司，示意图如图1所示)的接头序列，正义链的互补序列作为反义链，并在反义链的两端分别加上针对pSilencer4.1-CMV neo的接头序列，两者退火形成带有针对pSilencer4.1-CMV neo的接头的shRNA。

进一步筛选得到三对siRNA序列，本发明将它们分别命名为siE1、siE2和siE3。进一步对它们进行序列加工，使之成为可以生成“发夹”状siRNA的寡核苷酸序列(分别见SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6中所示的核苷酸序列)；核苷酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2互补即可形成针对siE1的、具有干扰IFNAR2基因mRNA表达的siRNA寡核苷酸片段；核苷酸序列SEQ ID No.3和SEQ ID No.4互补即可形成针对siE2的、具有干扰IFNAR2基因mRNA表达的siRNA寡核苷酸片段；核苷酸序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6互补即可形成针对siE3的、具有干扰IFNAR2基因mRNA表达的siRNA寡核苷酸片段；

将这些设计好的寡核苷酸序列送交“上海生工生物工程技术服务有限公司”合成。

二、重组干扰片段系列pSilencer载体的构建

本发明中参考Ambion公司提供的pSilencer4.1-CMV neo使用技术手册，按如下流程构建重组片段的干扰pSilencer载体。

1.寡核苷酸片段工作液的制备

将上海生工生物工程技术服务有限公司合成的寡核苷酸片段干粉于12000g离心1分钟，添加适量灭菌双蒸水充分溶解后，用常规的TE缓冲液稀释，并用紫外分光计定量，使每种寡核苷酸溶液的浓度达到100pmol/μL，作为退火反应的工作液。

2.正向/反向寡核苷酸片段的退火

按如下成分和比例配制正向/反向寡核苷酸片段的退火反应体系，混匀后在90℃水浴加热3分钟，再在37℃水浴孵育1小时，反应结束后可以直接用于后续的连接反应，也可保存于-20℃备用。

反应体系如下：

3.连接反应

取第2步中的退火反应液，用无菌双蒸水稀释10倍后作为连接反应的插入片段溶液，与预先已用限制性内切酶BamH I和Hind III(购自TaKaRa公司)消化过的pSilencer4.1-CMV neo载体进行连接，16℃连接过夜。连接反应体系如下：

4.连接产物的转化和挑斑均按常规方法进行。对于挑斑的培养物直接进行质粒提取和琼脂糖凝胶电泳检测。在可以提出质粒的每种转化子中，随机挑取其中的两个独立克隆子送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序验证。

将表达siE1、siE2和siE3的寡核苷酸双链片段与预先已用限制性内切酶BamH I和Hind III消化过的pSilencer4.1-CMV neo载体分别进行连接和转化反应。对每种转化物随机挑取三个独立的克隆子，转化后进行质粒提取和琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。从图中可以看出，每种转化物的三个独立克隆子都成功的提取了质粒。从每种转化物的三个独立克隆子中随机挑选两个送交公司测序，经过比对分析，每种转化物的两个克隆子的序列完全相同，且都含有相应的寡核苷酸序列。将经过成功重组、并且表达siE1、siE2和siE3寡核苷酸序列的三种干扰质粒载体，分别命名为pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3，相应地把载体系统自带的不表达siRNA的阴性对照质粒命名为pSiCMVNC。

实施例2针对IFNAR2基因mRNA干扰质粒的干扰效率检测

一、ST细胞(猪睾丸细胞)培养、质粒转染及总RNA和总蛋白的提取

1.ST细胞株来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)，由本实验室按照常规方法进行传代培养和保存。

2.利用Promega公司的TransFast^TM Transfection Reagent转染试剂(Promega货号E2431)将三种具有干扰IFNAR2基因表达的干扰质粒载体转入ST细胞，具体转入步骤参照实际说明，简单描述如下：

(1)细胞接种：为了获得最好的转染效率，细胞密度应该为50～80％。在24孔细胞板中，最理想的条件是在转染前18～24h，每孔接种8×10⁴～2×10⁵个细胞；

(2)TransFast^TM Transfection Reagent/DNA复合物的制备(以下为24孔板转染的用量)：0.6μg DNA质粒稀释于30μL不含血清和抗菌素的DMEM细胞培养液中(购自Invitrogen公司)，轻轻混匀。1～2μL TransFast^TM TransfectionReagent转染试剂稀释于30μL DMEM细胞培养液中，轻轻混匀。各自在室温孵育5分钟后，将30μL TransFast^TM Transfection Reagent稀释液滴加到DNA稀释液中，一边滴加一边混匀。

(3)室温孵育30分钟；

(4)60μL TransFast^TM Transfection Reagent/DNA复合物加到每孔中并轻轻摇动使均匀混合，并放回细胞培养箱继续培养24～48小时。

3.ST细胞的总RNA提取

为了从RNA水平检测三种干扰质粒载体对IFNAR2基因的表达干扰的效果，首先需要提取转染目的质粒和对照质粒的ST细胞的总RNA。采用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取ST细胞的总RNA，具体实验方法参见试剂说明。

4.ST细胞的总蛋白提取

为了从蛋白质水平检测三种干扰质粒载体对于IFNAR2基因的表达干扰的效果，首先需要提取转染目的质粒和对照质粒的ST细胞的总蛋白。采用常规的方法提取ST细胞的总蛋白，用于后续的Western blot分析。

二、从RNA水平检测干扰质粒的干扰效率

利用实时荧光定量RT-PCR(Roche公司的LightCycler480型定量PCR仪)，比较分析分别转染阴性对照质粒和干扰质粒后，ST细胞中IFNAR2基因mRNA表达量的变化，结果如图3所示。从图中可以看到，在分别转染pSiCMVE1、pSiCMVE2或pSiCMVE3干扰质粒载体到ST细胞后相对于转染了阴性对照质粒pSiCMVNC而言，IFNAR2基因的mRNA表达量均受到了明显的抑制，抑制率在70％～80％，说明这三种干扰质粒载体均能够有效抑制ST细胞中IFNAR2基因的mRNA表达。

三、从蛋白水平检测干扰质粒的干扰效率

利用Western blot方法，比较分析分别转染阴性对照质粒和干扰质粒后，ST细胞中的IFNAR2基因的蛋白产物的表达量变化，结果如图4所示，在分别转染pSiCMVE1、pSiCMVE2或pSiCMVE3干扰质粒载体到ST细胞后，相对于转染了阴性对照质粒pSiCMVNC而言，IFNAR2基因的蛋白表达量均受到了明显的抑制，特别是干扰载体pSiCMVE1或pSiCMVE2的抑制效率明显；而作为阴性对照的β-actin的表达量并不随着是否转染干扰质粒载体而发生变化。

上述结果说明，本发明中涉及到的三种针对IFNAR2基因的干扰质粒载体pSiCMVE1、pSiCMVE2或pSiCMVE3均能够有效抑制INFAR2基因的表达，这为进一步研究IFNAR2基因的生物学功能提供了可靠和便捷的研究手段，同时为研究IFNAR2受体在病毒感染中的作用奠定了基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.靶向IFNAR2基因的siRNA，其特征在于：编码所述siRNA的DNA序列选自如下核苷酸序列：

siE1:5′-CTAACAGATGTGTGGATAA-3′；

siE2:5′-CGAATAAAGGGAAACATCA-3′；

siE3:5′-GATGAATCTTGCACTTTAA-3′。

2.针对IFNAR2基因的shRNA，其特征在于：编码所述shRNA的DNA序列为：SEQ ID No.1和2，SEQ ID No.3和4，或SEQ ID No.5和6退火形成的双链。

3.含有权利要求1所述的siRNA或权利要求2所述shRNA的siRNA表达载体。

4.根据权利要求3所述的siRNA表达载体，其特征在于：其源自pSilencer4.1-CMV neo。

5.根据权利要求4所述的siRNA表达载体，其特征在于：其为pSiCMVE1、pSiCMVE2或pSiCMVE3。

6.权利要求3～5任一项所述的siRNA表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的siRNA的DNA序列和其互补序列用loop结构序列连接形成正义链，在正义链的两端引入接头序列；

(2)根据步骤(1)的正义链得到其反义链，并在其两端引入接头序列；

(3)将步骤(1)和(2)得到的序列在溶液中退火，形成shRNA；

(4)将shRNA插入线性化的siRNA表达载体中，得到表达siRNA的表达载体。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的5′引入的接头序列为5′-GATCC-3′，3′引入的接头序列为5′-TTA-3′。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的5′引入的接头序列为5′-AGCTTAA-3′，3′引入的接头序列为G。

9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的loop结构序列为5′-TTCAAGAGA-3′。

10.权利要求1所述的siRNA、权利要求2所述的shRNA或权利要求3～5所述的siRNA表达载体在抑制IFNAR2基因表达中的应用。