CN104404070A - 抑制小鼠MSTN表达的方法及相应MSTN shRNA片段 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抑制小鼠MSTN表达的载体及相应MSTN shRNA片段，包括分别与MSTN mRNA序列特异性结合在158位点的MSTN-mus-158、300位点的MSTN-mus-300、714位点的MSTN-mus-714和1022位点的MSTN-mus-1022。本发明设计的4条MSTN shRNA序列均有很好的抑制MSTN基因表达的活性，且4个MSTN shRNA过表达载体均具有很高的表达效率。

Description

抑制小鼠MSTN表达的方法及相应MSTN shRNA片段

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及4个过表达小鼠MSTN shRNA载体的构建及4条专用MSTN shRNA片段。

背景技术

肌肉生长抑制素(MSTN)是在骨骼肌中广泛表达的一类糖蛋白，其功能和表达量的变化可能会通过调节靶基因的表达，改变肌肉的纤维组成(红、白肌的比例)及造成肌肉重量的变化。该基囚的表达抑制有助于研究该基囚的功能。shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polIII启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。在细胞或活体组织中输送“短干涉RNA”(siRNA)的一种办法是将siRNA序列作为“短发夹”克隆进真核表达载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种抑制表达小鼠MSTN表达的载体及相应MSTN shRNA片段。

本发明提供一种抑制小鼠MSTN基因表达shRNA的载体：所述shRNA包括分别与MSTNmRNA序列特异性结合在158位点的MSTN-mus-158、300位点的MSTN-mus-300、714位点的MSTN-mus-714和1022位点的MSTN-mus-1022，它们都包含siRNA正义链，loop环，siRNA反义链和终止信号；

loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；

终止信号的碱基序列为TTTTTT；

正义链模板的5’端添加了CACC，与Bbs I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamH I酶切后形成的粘端互补；如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。

进一步的，所述MSTN-mus-158的正义链模板序列如SEQ ID NO：2所示，为

5-CACCGCTGGCCCAGTGGATCTAAATTTCAAGAGAATTTAGATCCACTGGGCCAGCTTTTTTG-3，

反义链模板序列如SEQ ID NO：3所示，为

5-GATCCAAAAAAGCTGGCCCAGTGGATCTAAATTCTCTTGAAATTTAGATCCACTGGGCCAGC-3：

进一步的，所述MSTN-mus-300的正义链模板序列如SEQ ID NO：4所示，为

5-CACCGCCTGGAAACAGCTCCTAACATTCAAGAGATGTTAGGAGCTGTTTCCAGGCTTTTTTG-3，

反义链模板序列如SEQ ID NO：5所示，为

5-GATCCAAAAAAGCCTGGAAACAGCTCCTAACATCTCTTGAATGTTAGGAGCTGTTTCCAGGC-3；

进一步的，所述MSTN-mus-714的正义链模板序列如SEQ ID NO：6所示，为

5-CACCGGCAGAGTATTGATGTGAAGATTCAAGAGATCTTCACATCAATACTCTGCCTTTTTTG-3，

反义链模板序列如SEQ ID NO：7所示，为

5-GATCCAAAAAAGGCAGAGTATTGATGTGAAGATCTCTTGAATCTTCACATCAATACTCTGCC-3；

进一步的，所述MSTN-mus-1022的正义链模板序列如SEQ ID NO：8所示，为

5-CACCGCCAATTACTGCTCAGGAGAGTTCAAGAGACTCTCCTGAGCAGTAATTGGCTTTTTTG-3，

反义链模板序列如SEQ ID NO：9所示，为

5-GATCCAAAAAAGCCAATTACTGCTCAGGAGAGTCTCTTGAACTCTCCTGAGCAGTAATTGGC-3。

进一步的，所述载体包括pGPU6、GFP和Neo。

将上述各对合成的序列，经单链退火形成双链的shRNA分子后，分别连接到pGPU6、GFP或Neo载体，构建4个干扰RNA质粒；通过荧光PCR及western blot分别从mRNA及蛋白水平分析各对shRNA的干扰效率。

本发明的有益效果在于：本发明设计的4条MSTN shRNA序列均有很好的抑制MSTN基因表达的活性，且4个MSTN shRNA过表达载体均具有很高的表达效率。

附图说明

图1为本发明重组载体酶切鉴定图

图2为本发明实施例重组载体的示意图；

图3为各组细胞总RNA电泳鉴定图；

图4为QRT-PCR检测shRNA干扰后的MSTN表达图；

图5为MSTN蛋白表达检测图；

图6为MSTN蛋白表达灰度分析图。

具体实施例

下文将结合附图详细描述本发明的实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合和相互结合从而达到更好的技术效果。

本发明根据GeneBank中小鼠MSTN mRNA 2682bp碱基序列(NM_010834.2)；人工设计合成并筛选到4条对小鼠MSTN基因有显著抑制作用的shRNA分子，该分子是由核苷酸序列组成的特定序列，且一条shRNA分子的上下游两条DNA互补单链组成，4条shRNA序列其特异性结合在MSTN mRNA序列分别在158位点、300位点、714位点及1022位点处，故分别命名为MSTN-mus-158、MSTN-mus-300、MSTN-mus-714、MSTN-mus-1022，以及用于做阴性对照的control序列。

一、MSTN shRNA的设计及合成

1)寡核苷酸的合成

shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5’端添加了CACC，与Bbs I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamH I酶切后形成的粘端互补；如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。

Target：

MSTN-mus-158(如SEQ ID NO：2-3所示)

                         5-GCTGGCCCAGTGGATCTAAAT-3

                         3-ATTTAGATCCACTGGGCCAGC-5

5-CACCGCTGGCCCAGTGGATCTAAATTTCAAGAGAATTTAGATCCACTGGGCCAGCTTTTTTG-3

5-GATCCAAAAAAGCTGGCCCAGTGGATCTAAATTCTCTTGAAATTTAGATCCACTGGGCCAGC-3

MSTN-mus-300(如SEQ ID NO：4-5所示)

                         5-GCCTGGAAACAGCTCCTAACA-3

                         3-TGTTAGGAGCTGTTTCCAGGC-5

5-CACCGCCTGGAAACAGCTCCTAACATTCAAGAGATGTTAGGAGCTGTTTCCAGGCTTTTTTG-3

5-GATCCAAAAAAGCCTGGAAACAGCTCCTAACATCTCTTGAATGTTAGGAGCTGTTTCCAGGC-3

MSTN-mus-714(如SEQ ID NO：6-7所示)

                         5-GGCAGAGTATTGATGTGAAGA-3

                         3-TCTTCACATCAATACTCTGCC-5

5-CACCGGCAGAGTATTGATGTGAAGATTCAAGAGATCTTCACATCAATACTCTGCCTTTTTTG-3

5-GATCCAAAAAAGGCAGAGTATTGATGTGAAGATCTCTTGAATCTTCACATCAATACTCTGCC-3

MSTN-mus-1022(如SEQ ID NO：8-9所示)

                         5-GCCAATTACTGCTCAGGAGAG-3

                         3-CTCTCCTGAGCAGTAATTGGC-5

5-CACCGCCAATTACTGCTCAGGAGAGTTCAAGAGACTCTCCTGAGCAGTAATTGGCTTTTTTG-3

5-GATCCAAAAAAGCCAATTACTGCTCAGGAGAGTCTCTTGAACTCTCCTGAGCAGTAATTGGC-3

Negative Control-S：(如SEQ ID NO：10所示)

5’-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3’

Negative Control-AS：(如SEQ ID NO：11所示)

5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3’

2)shRNA模板的退火

将DNA oligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100uM。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系。

在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火处理后得到浓度为10μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20nM，用于连接反应。

3)pGPU6/GFP/Neo载体的线性化

取2ug pGPU6/GFP/Neo载体，按照如下体系进行酶切处理：

37℃酶切1小时，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa)回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/ul。

4)pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA载体的构建

4.1按照如下体系进行载体的连接反应：

22℃ lhr，transform to JM 109 competent cells.

4.2每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50ug/ml Kanamycin的LB培养基中。

4.3使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamH I，Pst I分别酶切鉴定。阳性重组载体应该可以被BamH I切开，而不能被Pst I切开。鉴定结果如图1所示，图1中M为lamda/Ecol30IDNA mark；最左上侧1-5为MSTN-mus-158(1-5)质粒Pst I酶切结果，其右侧1-5为MSTN-mus-300(1-5)质粒Pst I酶切结果；其右侧1-5为MSTN-mus-158(1-5)质粒BamH I酶切结果，最右侧1-5为MSTN-mus-300(1-5)质粒BamH I酶切结果；最左下侧1-5为MSTN-mus-714(1-5)质粒Pst I酶切结果，其右侧1-5为MSTN-mus-1022(1-5)质粒Pst l酶切结果；其右侧1-5为MSTN-mus-714(1-5)质粒BamH I酶切结果，最右侧1-5为MSTN-mus-1022(1-5)质粒BamH I酶切结果。

酶切结果表明，所有质粒均为阳性重组载体，重组载体pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA载体结构图见图2所示，每组选择两个克隆进行测序鉴定(上海英骏生物技术有限公司)。

测序正确的菌株采用高纯度质粒中量抽提试剂盒(Axygen)抽提，所得质粒可以用于常规的分子生物学实验和细胞学实验。请重新转化至大肠杆菌DH5α中，然后用OMEGA公司去内毒素试剂盒制备质粒，用于细胞转染。

5)细胞培养及转染

5.1冻存细胞的复苏与培养

将上述质粒用ScaI大量酶切线性化后，QIAGEN纯化试剂盒胶回收线性化片段，产物终浓度为500ng/ul用于细胞转染。

从液氮中取出装有小鼠C2Cl2细胞(购自中国科学院细胞库)的冻存小管，立即投入37-40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在1-2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800-1000r/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入1mLDMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)，轻轻吹匀，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养。

5.2细胞转染

将小鼠C2Cl2细胞系细胞分为8组分别是正常饲养组、仅加脂质体lipefectaminTM-2000组、转阴性对照组(pGPU6/GFP/Neo)、阳性对照质粒(pGPU6/GFP/Neo-GAPDH)及4组实验组pGPU6/GFP/Neo-MSTN158、pGPU6/GFP/Neo-MSTN300、pGPU6/GFP/Neo-MSTN714、pGPU6/GFP/Neo-MSTN1022，每组3个重复。

转染前1天，向每孔含10％胎牛血清(购自GIBCO公司，货号：21640-079)的500μLDMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)的24孔板中分别接种0.5-2×105个猪PK15细胞，使细胞在转染前达到90-95％的汇合；用50μL的不加血清的DMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)分别稀释0.8μg步骤1中的待转染各组DNA，并温和的混匀；使用前将脂质体温和摇匀，将2μL lipefectaminTM-2000加入50μL的无血清、无抗生素的DMEM培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)并轻轻混匀，于室温孵育5min；5min后，分别将50μL的各组DNA稀释液加入50μL的脂质体稀释液，轻轻混匀并于室温放置20min；将100μL的DNA脂质体混合物加入到准备好的孔内，轻轻来回晃动培养板，将其置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养，于4-6h后用含10％血清(购自GIBCO公司，货号：21640-079)的DMEM高糖培养基继续培养。各组细胞转染后36h观察荧光确定转染效率，并提取总RNA用于后续试验。

5.3各转染细胞组MSTN表达水平的测定

5.3.1细胞总RNA提取及cDNA的制备

按照试剂盒(购自北京天跟公司，货号：DP430)操作说明，提取上述各组细胞总RNA；凝胶电泳鉴定总RNA质量后，电泳结果如图3所示，各泳道代表细胞分别为1为转染MSTN-mus-158细胞组总RNA；2为转染MSTN-mus-300细胞组总RNA；3为转染MSTN-mus-714细胞组总RNA；4为转染MSTN-mus-1022细胞组总RNA；5为转染pGPU6/GFP/Neo细胞组总RNA；6为正常细胞组总RNA。按照TOYOBO反转录试剂盒(购自TOYOBO公司，货号：FSK-100)，将提取的总RNA反转录成cDNA。

5.3.2荧光定量PCR检测

以1)中制备的cDNA为模板，梯度稀释模板验证选定最佳模板浓度，以小鼠GAPDH基因为内参(引物为表1中mGAPDH-L1和mGAPDH-R1)，进行实时荧光定量PCR测定MSTN(MSTN引物为表1所示的mMSTN-RTL1和mMSTN-RTR1)表达量，上样体系按照ABI定量试剂说明书上样，反应体系为20μl，10μL2×Mixturer(TAKARA，货号DRR041A)、1μL 20μM上游引物、1μL 20μM下游引物、1微升cDNA，加超纯水至20μL。PCR扩增程序：95℃5min；94℃20s，退火温度56℃，72℃1m，循环40次，最后72℃延伸5min。

如图4所示为QRT-PCR检测shRNA干扰后的MSTN表达的荧光定量检测结果，图中NC代表阴性对照，即转染pGPU6/GFP/Neo线性化片段细胞组，PC组为转染pGPU6/GFP/Neo-GAPDH细胞组，MSTN1022代表转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN1022细胞组，MSTN158代表转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN158细胞组，MSTN300代表转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN300细胞组，MSTN714代表转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714细胞组。各测定组中，以阴性对照(NC)为基准值1，阳性对照组(PC)MSTN表达是正常组的1.507倍，转染MSTN-mus-158组、转染MSTN-mus-300组、转染MSTN-mus-714组及转染MSTN-mus-1022 shRNA组MSTN表达效率分别是0.598、0.336、0.279及0.491倍，其中MSTN-mus-714 shRNA干扰效率最为明显。

二、shRNA干扰后MSTN表达蛋白检测

将制备的分别含不同MSTN shRNA的过表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA转染小鼠胎儿成纤维细胞系(C2Cl2)，G418筛选12天富集整合有外源基因的细胞，提取细胞总蛋白，检测各组细胞中MSTN蛋白表达量。

如图5和图6所示，NC：正常细胞对照组；1022：转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN1022细胞组；714：转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714细胞组；300：转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN300细胞组；158：转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN158细胞组。检测结果表明，各合成MSTN shRNA均能有效抑制MSTN表达，其中MSTN714 shRNA干扰效率最好。

检测结果表明本发明设计的4条MSTN shRNA序列均有很好的抑制MSTN基因表达的活性，且4个MSTN shRNA过表达载体均具有很高的表达效率。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims (3)

1.一种抑制小鼠MSTN基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述shRNA包括分别与MSTN mRNA序列特异性结合在158位点的MSTN-mus-158、300位点的MSTN-mus-300、714位点的MSTN-mus-714和1022位点的MSTN-mus-1022，它们都包含siRNA正义链，loop环，siRNA反义链和终止信号；

loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；

终止信号的碱基序列为TTTTTT；

正义链模板的5’端添加了CACC，与Bbs I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamH I酶切后形成的粘端互补；如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。

2.如权利要求1所述的抑制小鼠MSTN基因表达的shRNA的载体，其特征在于：

所述MSTN-mus-158的正义链模板序列如SEQ ID NO：2所示，反义链模板序列如SEQ IDNO：3所示；

所述MSTN-mus-300的正义链模板序列如SEQ ID NO：4所示，反义链模板序列如SEQ IDNO：5所示；

所述MSTN-mus-714的正义链模板序列如SEQ ID NO：6所示，反义链模板序列如SEQ IDNO：7所示；

所述MSTN-mus-1022的正义链模板序列如SEQ ID NO：8所示，反义链模板序列如SEQ IDNO：9所示。

3.如权利要求1或2任一项所述的抑制小鼠MSTN基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述载体包括pGPU6、GFP和Neo。