CN101851619B - 一种修饰的小干扰核酸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其特征在于，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。本发明增加了修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，并且降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。

Description

一种修饰的小干扰核酸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种修饰的小干扰核酸及其制备方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNA干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，被称为小干扰核酸(siRNA)。双链siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)。在RNA干扰过程中，双链siRNA中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。

但是，由于小干扰核酸(siRNA)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此人们对合成的siRNA进行化学修饰，以增加siRNA的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。

目前，由于人们对siRNA在血清中的降解过程和机制缺乏足够的了解，只能依靠各自的经验随机地选择siRNA分子中的多个核苷酸进行化学修饰。这种修饰策略虽然能很好地提高siRNA分子的血清稳定性，但由于缺乏理论的指导，通常在siRNA分子中引入了过量的修饰，增加了修饰后的siRNA的潜在细胞毒性，并在很多情况下降低了siRNA的生物学活性，因而制约了修饰后的siRNA在体内的应用。

另外，在siRNA中盲目地在核苷酸中引入大量修饰的做法，也限制了一些具有较好稳定效果，但细胞毒性相对较大的修饰方法在体内研究中的应用。

因此，设计具有针对性的修饰方案，通过最少的修饰来实现最优的稳定性目的是目前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的siRNA的修饰方案中存在盲目地引入大量的修饰从而导致得到的修饰的小干扰核酸细胞毒性大问题，提供一种血清稳定的、具有良好生物活性的且细胞毒性较低的修饰的小干扰核酸。

本发明提供了一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其中，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。

本发明通过对CA/UG位点进行特异性的修饰，从而在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其中，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。

本发明的发明人对小干扰核酸分子在体内的降解过程进行了细致的研究，发现在CA/UG位点中仅引入少量修饰的情况下，即可提高修饰的小干扰核酸分子的稳定性，大大降低了由于随机地引入大量的修饰而导致的潜在细胞毒性较高，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。

根据本发明，所述的“第一片段”是指具有与基因编码链的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“第二片段”是指具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片段。所述“互补”是指两个核苷酸在杂交条件下能够配对，例如，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)之间能够配对，以及胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)之间的配对。

根据本发明，所述小干扰核酸分子的标靶可以为各种基因，例如，可以将在细胞内的功能有待分析的基因作为标靶，也可以将需要抑制其表达的基因作为标靶，例如，可以以与疾病或紊乱相关的基因作为标靶，如癌基因、病毒基因、细胞膜表面受体基因、细胞核受体基因或细胞信号传导通路上的基因等。本领域的技术人员根据其标靶基因，能够设计得到小干扰核酸分子(siRNA)，例如，将目的基因的靶标序列或目的基因在NCBI Genbank中的序列号输入各种小干扰核酸设计程序，如Insert Design Tool for the shRNAVectors(Ambion)、shRNA Explorer(Gene Link)、siDirect(Yuki Naito et al.University of Tokyo)、SiRNA at Whitehead(Whitehead Institute for BiomedicalResearch)，BLOCK-iT RNAi Designer(invitrogen)、RNAi Design(IDT)，RNAiExplorer(Gene Link)、siRNA Target Finder(Ambion)、或siSearch(StockholmBioinformatics Center)等，该设计程序将会根据设计者的要求和siRNA的设计原则，针对所提供的基因或序列设计siRNA。并且，有些程序能够对设计好的siRNA做全基因组或mRNA转录组的同源性分析，从而设计出对靶基因或靶序列特异的siRNA。上述提及的siRNA设计程序及其涉及的原则为本领域技术人员所公知，其全部内容在此一并引入作为参考。

根据本发明，所述修饰的小干扰核酸包括多个CA/UG位点，并且该多个CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。

此外，所述CA/UG位点中，只有反义链中的胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。在这种情况下，不但能够提高所述修饰的小干扰核酸的稳定性、维持其生物活性，还可以进一步减少在修饰的小干扰核酸分子中引入的修饰数量，从而进一步地降低修饰引起的小干扰核酸的潜在细胞毒性。

根据本发明的一个方面，所述修饰的小干扰核酸中，除了所述CA/UG位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。在这种情况下，不但能够提高所述修饰的小干扰核酸的稳定性、维持其生物活性，还可以使在修饰的小干扰核酸分子中引入的修饰数量最小化，从而进一步地降低修饰引起的小干扰核酸的潜在细胞毒性。

根据本发明的另一个方面，所述修饰的小干扰核酸中，所述第一片段还可以包括至少一个连续的UA序列，所述第二片段还可以包括至少一个连续的与所述第一片段的UA序列互补的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，并且，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使UA/UA位点被修饰的小干扰核酸的稳定性高于UA/UA位点未被修饰的小干扰核酸。本发明的发明人意外地发现，当所述修饰的小干扰核酸的含有CA/UG位点和UA/UA位点时，除了对CA/UG位点进行特异性的修饰以外，对UA/UA位点中的至少一个核苷酸进行特异性修饰，不但能够降低细胞的毒性，还能够进一步提高含有CA/UG位点和UA/UA位点的小干扰核苷酸的稳定性。

在本发明的一种实施方式中，本发明提供的修饰的小干扰核酸除了包括CG/CA位点以外，还可以多个UA/UA位点，并且该多个UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。在优选的情况下，所述UA/UA位点中，只有一个尿嘧啶核苷酸是经过修饰的。

在一个优选的实施方式中，本发明提供的修饰的小干扰核酸中，除了所述CA/UG位点和UA/UA位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。在这种情况下，不但能够提高所述修饰的小干扰核酸的稳定性、维持其生物活性，还可以使在修饰的小干扰核酸分子中引入的修饰数量最小化，从而进一步地降低修饰引起的小干扰核酸的潜在细胞毒性。

根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以为单链分子也可以为双链分子。

当所述修饰的小干扰核酸为单链分子时，所述第一片段和第二片段之间的互补区域形成双链区域。

当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，该修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，所述正义链可以为连续的核苷酸链，也可以为不连续的核苷酸链；所述反义链为连续的核苷酸链。

根据本发明的一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链，所述第一片段位于正义链，所述第二片段位于反义链。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核苷酸链；所述反义链为连续的核苷酸链；所述第一片段位于一个或多个正义链部分，所述第二片段位于反义链。

本发明中，术语“正义链”是指当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，具有与基因编码链的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“第二片段”是指指当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片段。并且，当所述修饰的小干扰核酸为双链分子且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链时，术语“正义链”和“第一片段”可以互换使用，术语“反义链”和“第二片段”可以互换使用。

本发明中，术语“正义链部分”是指当所述正义链为不连续的核苷酸时，用于组成正义链的一部分核苷酸链；在所述正义链中，该正义链的所有正义链部分的总长度与所述正义链的长度相等，并且，当所述正义链部分中包括UA/UA位点时，术语“正义链部分”与“第一片段”可以互换使用。

根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以由核糖核苷酸组成，也可以为包括核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。

根据本发明，术语“潜在细胞毒性”是指由于对核苷酸分子进行修饰而造成的对细胞的毒性作用。

本发明中，所述修饰的方式为本领域技术人员所公知，例如，本发明对所述小分子干扰核酸进行的化学修饰为以下的一种或几种：

(1)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的的修饰；

(3)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。

所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰(Phosphorthioate)和硼烷化磷酸盐修饰(Boranophosphate)。如图所示分别用硫和硼烷置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定小分子干扰核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。而硼烷化磷酸盐修饰的小干扰核酸的疏水性强，易于在血浆中形成水合蛋白，对人体的毒副作用低于硫代磷酸酯。

硫代磷酸修饰                硼烷化磷酸盐修饰

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中羟基(2′-OH)的修饰。在核糖的羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清核糖核酸酶不易识别小干扰核酸，增加了小干扰核酸的稳定性。使小干扰核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中羟基的修饰包括2′-氟修饰(2′-fluro modification)；2′-氧甲基修饰(2′-OME)；2′-甲氧乙基修饰(2′-MOE)；2，4′-二硝基苯酚修饰(2′-DNP modification)；锁核酸(LNA)；2′-氨基修饰(Amina modification)；2′-脱氧修饰(2′-Deoxy modification)等等。

2′-氟修饰                2′-氧甲基修饰

2′-甲氧乙基修饰            2，4′-二硝基苯酚修饰

锁核酸                      2′-氨基修饰

2′-脱氧修饰

所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，如在尿嘧啶的5位点引入溴或碘的5′-溴尿嘧啶(5′-bromo-uracil)和5′-碘尿嘧啶(5′-iodo-uracil)修饰是常使用的碱基修饰方法，其他还有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修饰，2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)修饰等。

5′-溴尿嘧啶             5′-碘尿嘧啶

N3-甲基脲嘧啶            2，6-二氨基嘌呤

优选情况下，所述修饰为对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰。进一步优选为，所述修饰为所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH被甲氧基或氟取代。上述修饰均可以增加所述小干扰核酸的血清稳定性，增强其对血清核酸酶水解的抵抗能力。

本发明还提供了一种修饰的小干扰核酸的制备方法，其中，该方法包括：根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰的小干扰核酸包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其中，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。优选情况下，使得到的修饰的小干扰核酸的CA/UG位点中，只有反义链中的胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。

根据本发明的一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法可以包括：根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰的小干扰核酸包括一个CA/UG位点，并且该一个CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。优选情况下，使得到的修饰的小干扰核酸的CA/UG位点中，只有反义链中的胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法可以包括：根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰的小干扰核酸包括多个CA/UG位点，并且该多个CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。优选情况下，使得到的修饰的小干扰核酸的CA/UG位点中，只有反义链中的胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。

在一种优选的情况下，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸中，除了所述CA/UG位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。

在另一种优选的情况下，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸的第一片段还包括至少一个连续的UA序列，修饰的小干扰核酸的第二片段还包括至少一个连续的与所述第一片段的UA序列互补的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，并且，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使UA/UA位点被修饰的小干扰核酸的稳定性高于UA/UA位点未被修饰的小干扰核酸。

根据本发明的一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸除了包括CA/UG位点以外，还包括一个UA/UA位点，并且，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使UA/UA位点被修饰的小干扰核酸的稳定性高于UA/UA位点未被修饰的小干扰核酸。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸除了包括CA/UG位点以外，还包括多个UA/UA位点，并且，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使UA/UA位点被修饰的小干扰核酸的稳定性高于UA/UA位点未被修饰的小干扰核酸。

本发明中，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸的结构为本领域技术人员所公知，可以为各种小干扰核酸的存在结构。

例如，根据本发明的一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸可以为发夹结构的单链分子，所述第一片段和第二片段之间的互补区域形成双链区域。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸可以包括正义链和反义链，所述正义链和反义链为连续的核苷酸链，所述第一片段位于正义链，所述第二片段位于反义链。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸可以包括正义链和反义链，所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核苷酸链；所述反义链为连续的核苷酸链；所述第一片段位于一个或多个正义链部分，所述第二片段位于反义链。

根据本发明的另一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法使得到的修饰的小干扰核酸可以为为包括核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。

本发明中，合成小干扰核酸的方法可以为各种常规的小干扰核酸的合成方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma)、广州锐博生物科技有限公司、或英俊生物技术有限公司(invitrogen)进行合成。

一般来说，用于合成小干扰核酸的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。

例如，具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的小干扰核酸化学合成的具体步骤如下：

(1)寡聚核糖核苷酸的合成：在自动DNA/RNA合成仪(例如，AppliedBiosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护

将连接有小干扰核酸的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出连接有小干扰核酸的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到小干扰核酸的粗产物。

(3)纯化分离

将得到的小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的小干扰核酸产物。

(4)脱盐

用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的小干扰核酸产物2-4次(每次2毫升)，除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有小干扰核酸的溶液。

上文中给出多种实施方式的目的仅为示例性地对本发明进行说明，而不是为了限制本发明的范围。

下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。

实施例1

选取下表1-55中的基因为靶基因，并委托上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma)合成表1-55中的siRNA。

实施例2

通过以下方法分别对表1-55中所示的siRNA进行血清稳定性检测、基因沉默效率检测和细胞毒性检测：

1.血清稳定性检测

将4μL浓度为20μM的未修饰的和不同化学修饰小干扰核酸加入到含有4μL胎牛血清和32μL 1×PBS溶液中，血清的终浓度为10％；在37℃条件下将反应体系孵育一定的时间后取样，一般为0，3和6小时；每次取10μL样本并进行液氮速冻，以立即中止血清核酸酶对siRNA的作用，然后将样本保存于-80℃条件下备用。

配置20％的聚丙烯酰胺凝胶，将3μL的上样缓冲液(30mM EDTA，36％甘油，0.06％溴酚蓝)与siRNA的降解样本进行混合，然后上样，在80mA的恒流条件下电泳。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)进行10分钟的染色后照相，结果如表1-55所示。

2.基因沉默效率检测

将在DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中(1×10⁵细胞/0.5ml培养基/孔)。待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50％左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基(Gibco公司)。然后将带有siRNA分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告质粒和pRL-TK(编码海肾萤光素酶)的对照质粒(Promega公司，Madison WI，USA)与化学合成的siRNA通过Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)进行细胞转染，每孔含0.17g重组质粒和0.017g pRL-TK对照质粒，siRNA的终浓度为13nM。每种siRNA平行转染三个复孔，以只转染同样量的两种报告基因质粒，不转染siRNA的三个复孔作为对照。4小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)。24小时后收获细胞，以10μl细胞裂解液细胞，利用双荧光素酶报告基因分析系统(Dual-Luciferase Assay System，Promega公司)和酶标仪(Novostar，BMG Labtechnologies GmbH，Germany)测定两种荧光酶的活性，以未转染siRNA的孔中的报告基因的表达量作为标准对照，通过以下公式计算得到siRNA对靶位点的沉默效率，结果如表2所示。每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复2次，结果如表1-55所示。

沉默效率＝(实验组Firefly荧光素酶的表达量/实验组Renilla荧光素酶表达量)/(对照组Firefly荧光素酶的表达量/对照组Renilla荧光素酶表达量)

3、修饰siRNA的细胞毒性检测

将在DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中(1×10⁵细胞/孔)；待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50％左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基(Gibco公司)；然后将化学合成的siRNA通过Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)进行细胞转染，siRNA的终浓度为13nM，每种siRNA平行转染三个复孔，无siRNA的三个转染复孔作为对照；4小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基(10％FBS，2mML-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)；24小时后吸去培养液，用PBS洗涤一次，每孔加1ml PBS和10μl MTT(噻唑蓝)染液，在37℃5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养4-6小时；每孔加0.1ml酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解；酶联免疫检测仪测定570nm处各孔A值，并按照以下公式计算细胞生长抑制率，结果如表1-55所示。

细胞生长抑制率(％)＝(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100％。

表1

表2

表3

表4

表5

表6

表7

表8

表9

表10

表11

表12

表13

表14

表15

表16

表17

表18

表19

表20

表21

表22

表23

表24

表25

表26

表27

表28

表29

表30

表31

表32

表33

表34

表35

表36

表37

表38

表39

表40

表41

表42

表43

表44

表45

表46

表47

表48

表49

表50

表51

表52

表53

表54

表55

在上表1-55中：

黑体字母表示的“A”、“U”、“G”或”C”字母表示经过修饰的核苷酸；

“+”表示经血清孵育后，siRNA主带完全消失，可见明显的降解条带；

“++”表示经血清孵育后，siRNA主带虽有降解但仍清晰可见，可见明显的降解条带；

“+++”表示经血清孵育后，siRNA主带清晰未见降解，未见明显的降解条带。

另外，从上表1-55中可以看出，与经过随机修饰的小干扰核酸相比，本发明提供的小干扰核酸在提高了稳定性的同时，还显著地降低了小干扰核酸的细胞毒性，并且对小干扰核酸的表达抑制效率基本没有影响，由此可见，本发明在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。

SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>一种修饰的小干扰核酸及其制备方法

<130>I10552PKU

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1500

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens BIC)

<400>1

gccgagcccg ggcccagcgc cgcctgcagc ctcgggaagg gagcggatag cggagccccg   60

agccgcccgc agagcaagcg cggggaacca aggagacgct cctggcactg cagataactt  120

gtctgcattt caagaacaac ctaccagaga ccttacctgt caccttggct ctcccaccca  180

atggagatgg ctctaatggt ggcacaaacc aggaagggga aatctgtggt ttaaattctt  240

tatgcctcat cctctgagtg ctgaaggctt gctgtaggct gtatgctgtt aatgctaatc  300

gtgatagggg tttttgcctc caactgactc ctacatatta gcattaacag tgtatgatgc  360

ctgttactag cattcacatg gaacaaattg ctgccgtggg aggatgacaa agaagcatga  420

gtcaccctgc tggataaact tagacttcag gctttatcat ttttcaatct gttaatcata  480

atctggtcac tgggatgttc aaccttaaac taagttttga aagtaaggtt atttaaaaga    540

tttatcagta gtatcctaaa tgcaaacatt ttcatttaaa tgtcaagccc atgtttgttt    600

ttatcattaa cagaaaatat attcatgtca ttcttaattg caggttttgg cttgttcatt    660

ataatgttca taaacacctt tgattcaact gttagaaatg tgggctaaac acaaatttct    720

ataatatttt tgtagttaaa aattagaagg actactaacc tccagttata tcatggattg    780

tctggcaacg ttttttaaaa gatttagaaa ctggtacttt cccccaggta acgattttct    840

gttcaggcaa cttcagttta aaattaatac ttttatttga ctcttaaagg gaaactgaaa    900

ggctatgaag ctgaattttt ttaatgaaat atttttaaca gttagcaggg taaataacat    960

ctgacagcta atgagatatt ttttccatac aagataaaaa gatttaatca aaaaatttca   1020

tatttgaaat gaagtcccaa atctaggttc aagttcaata gcttagccac ataatacggt   1080

tgtgcgagca gagaatctac ctttccactt ctaagcctgt ttcttcctcc atatggggat   1140

aatactttac aaggttgttg tgaggcttag atgagataga gaattattcc ataagataat   1200

caagtgctac attaatgtta tagttagatt aatccaagaa ctagtcaccc tactttatta   1260

gagaagagaa aagctaatga tttgatttgc agaatattta aggtttggat ttctatgcag   1320

tttttctaaa taaccatcac ttacaaatat gtaaccaaac gtaattgtta gtatatttaa   1380

tgtaaacttg ttttaacaac tcttctcaac attttgtcca ggttattcac tgtaaccaaa   1440

taaatctcat gagtctttag ttgatttaaa ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   1500

<210>2

<211>6047

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens kazrin)

<400>2

ggggtctcgg cgatcgctgc tcctcctcct ccttctcctc ctcttttttc tcctccgcct     60

cctccccccg ccgcctcgcc accgccgcgg ctagggctgg aggcgccgct gtcattcctg    120

tgccggagga accggcgctg ccggtgcctg ggggtcgggg cgcgggcgaa gccgggccgc    180

ggaggacaca acaggtagag ccgggggtgc ccggccgcgc gccccccgcg catcatgcag    240

ctctttgtca cctctctcgc ccccaggcca aaatcctgag catgatggaa gacaataagc    300

agctcgcgct ccgcatcgat ggggcggtcc agtcggccag ccaggaggtg accaacctgc    360

gagccgaact cacggccacc aaccggagac tggcggaact gagcggcggc ggcggccccg    420

gcccgggccc gggagccgcg gccagcgcct cggcggcggg ggactcggcg gcgacgaaca    480

tggagaaccc ccagcttgga gcgcaagtgc tcctgcggga agaagtgtcg cggctccagg    540

aggaagttca ccttctccgg cagatgaagg agatgttggc gaaggacctg gaggagtcgc    600

agggcggcaa gtcctctgag gtcctctcgg ccaccgagct cagggtccag ctggcccaga    660

aggagcagga gctagccaga gccaaagaag ccttgcaggc catgaaagct gatcggaagc    720

gcttaaaggg cgagaagaca gacctggtga gccagatgca gcagctgtat gccacactgg     780

agagccgcga ggagcagctc cgagacttca tccgcaacta tgagcagcac cgcaaggaga     840

gcgaggatgc ggtcaaagcg ctggccaagg agaaggacct gctggagcgt gagaagtggg     900

agctgcggcg ccaagccaag gaggccacag accacgccac ggcactgcgc tcccagctgg     960

acctcaagga caaccggatg aaggagctgg aggccgagct ggccatggcc aaacagtcct    1020

tagctacgct gaccaaggac gtccccaagc ggcattccct cgccatgccg ggcgagacgg    1080

tgctcaatgg caaccaggag tgggtggtgc aggcggacct cccgctgacc gcagccatcc    1140

ggcagagtca acagactctc taccactcac acccccctca ccctgcggac cggcaagcgg    1200

tcagggtgag cccctgccac tcccggcagc cctctgtcat ctccgacgca tctgccgccg    1260

aaggcgaccg gtcgtccaca ccgagcgaca tcaactcccc tcgacaccgg acacactccc    1320

tctgcaacgg cgacagtccc ggcccagttc agaagaacct gcacaaccct attgtacagt    1380

cactagagga tcttgaagac caaaaacgga aaaagaagaa agagaagatg ggattcggct    1440

ccatctcccg cgtcttcgcc agagggaagc agcggaagtc cctcgacccc ggcctctttg    1500

atgactcgga cagccagtgc agccccacgc ggcagagcct cagcctgtcg gaaggcgagg    1560

agcagatgga ccggctgcag caggtggagc tggtgaggac cacccctatg tcccactgga    1620

aggcgggcac cgtccaggcc tggctggagg tggtgatggc catgcctatg tacgtcaagg    1680

cctgcacgga gaacgtgaag agcgggaagg tgctgctgag cctgagtgac gaggacctgc    1740

agctgggcct tggggtgtgc agctccctgc accggcgcaa gctgcgcctg gccatcgagg    1800

actaccgtga tgccgaggca ggccgcagcc tgtccaaagc tgccgagctg gaccatcact    1860

gggtggccaa ggcctggctg aatgacattg gcctgtccca gtactcccag gcctttcaga    1920

accacctggt tgatgggcgg atgctgaatt ccctgatgaa gcgagacctg gagaagcacc    1980

tgaacgtgtc caagaagttc caccaggtca gcatcctgct ggggatcgag ctgctgtacc    2040

aagtgaactt cagcagggag gccctccagg agcgccgggc ccgctgcgag acgcagaaca    2100

ttgaccccgt ggtgtggacc aaccagcggg tgctcaagtg ggttcgagac atcgacctga    2160

aggagtacgc agacaacctg accaacagcg gcgtccatgg tgctgtgctg gtgctggagc    2220

ccacattcaa tgccgaggcc atggccactg ccctgggcat ccccagtggg aagcacatcc    2280

tccggagaca cctggcagag gagatgagcg ccgtcttcca cccagccaac tccacaggca    2340

tccgggaggc tgagcgtttt ggaacgcccc ctggcagggc ctccagcgtc acgcgggcag    2400

gaaaggagga gaacagcagc ggtctcaagt acaaggctgg ccggctgccc ctggggaaga    2460

taggaagggg cttcagcagc aaagatcccg atttccatga tgactatggc tctcttcaaa    2520

acgaagattg cggagacgat gacccccaga gcaggctgga acagtgccgt ctggaaggct    2580

acaacagcct ggaggtcacc aacgtgtaag gaactggtgg ctccaccaga cccaacgtga    2640

gagacccagg aaggaagaga agccagatgg ccccaggtgt cgttctcact gtacatagcg    2700

gccgcaggct gaggatgtcc cttgctcctg ggcaaaatcc cgatggactc tgcggtttca    2760

gctccacagc gcccaggaga gagaagacac cagcccacct gtcttgggtg ggccatggac    2820

tttcctgttc agctggagat gggcccagag gacctgtcac agtgtccggc cctgcctcca    2880

tccaggatac acaggctcca cctcagagtg accgtcactg tggagcagcc aagcagtccc    2940

tggagcctta aacggagctg ccaaggtggg aggaggccca cagttcccta aaacaccctt    3000

ccggcgggag caggggggac cccaacccca caccccagcg cccagtgcat tggcagagcc    3060

gggtgcagga agtgctgcct cttgccgaga cgtcggacag ggcgggggtt ggggaactct    3120

cggctacagc atcttaccct tgactgagaa cttgggtcct gacttggctc actgaatctc    3180

tcttgggaga atgcaaaatc cttccacctg aaaagctctg tgacacatgg gggtggacgt    3240

attgaagagc tgtttgccga tccacccagg agtggctacg ctgagtgggg agccggtgaa    3300

tgatccgtgc aggagtgggg cttagcagcc acatttctag gagatgcaga tatcctatca    3360

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tctctggcct gtggtttggc tttactgaga ttccaaaccc cactatctgc actccgtgac    3480

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aacccaacaa acctttgttg tgatgtccct gtcacctgaa acataggtga catagctcac    3600

caatgtccta accgagacac aaactccaca gagcaaaatc atttggtatt ggtggggaga    3660

accccagccc ttttcttgac ctgccactgt tatgctgtgt ggcttcttcc cagtggcctc    3720

acctctctgt gcctcgatgt cttcatctac gatacttctg gttccctccc agggacatcg    3780

tgaggattaa cacttgctaa tatctgtaac acaatttgta acctctcagg agacaatggg    3840

aagttatggg gtagctaatt tcccatttac aacacagaaa tgatatagag ctagttcgct    3900

ccaactcttt aggttgaagc agtgtgcaaa aggaagaaaa gaaatgttta atgttcagac    3960

ctgccaagag cctccaacag ggctcaagaa acatataaat cccatgagca cagccttgaa    4020

aaccagtttg actcaagcct tcgggcctca gttcattgac cagatgacag ccacgtgatg    4080

attagggaag gacggatgca ttgcgattct gcttacacat cgggttatca aagcgagtca    4140

cttgttggaa ccatgatgct cgacctcctt caaggccgtt tgcactgggg cttgagtttc    4200

caagattcac aacaggtgtc agcctctgag aaccctcaaa gcgtgtgttc ttcaacctgg    4260

caaattgttt cctctcatgg gggaagccga gctctgatga acttgagaat tacacctctc    4320

tcatgccgaa gaccgtggtg ttccccctaa tgacataaac gcagcctttc ttgctgtctg    4380

agaccaaatg tctagttggt agacaggtgg atgtttggcc tcctaagggc acacttctga    4440

tcctgggccc caggtggtga atctctggca tgtggcttgg ctttgttgag actccaaatt    4500

ccattatctt catgacattc ggcctcatcc atagggtcct gaagctgcag tccacagctc    4560

agaaaggaga ggtgagacct ccctccaacc tggtgccaca ggtctctccc aagccacatc    4620

cagcctggat gacctgggac cccagaaact gccgtttggg aggcagcaac agcaacgtgc    4680

ccaggcaggc agttattccc acagagtgag ccagaattgt agcagggcac ttgaatgcag    4740

agctgatgat ttgaaaccaa cgttcaccca acttgtcaga aatggcactt acatggttcg    4800

atcttgctgg agacaagtgg acaattgggg gtcactggca gagacagtat tgcccaaaat    4860

gttcacagca ggaggccagc aggcctgagg caacacgggc aaccgcgaat gcctcttttg    4920

gtttaaatta tgccatcaca accctctttc acccatgagg ctccccatcc ctgacagcca    4980

ggtgagcatt tggagctggt ttctcaacat gaggatgggt tggttgttaa attaacaacc    5040

tccacagtat cagattgagt gagctttgtc tgctggaaaa acctgaaacg tcaactctgc    5100

ttcaaggtcg gcaagaagaa cagaaggcgg agacttggca gagagactca agctgattgt    5160

cacaggctac agaggggcca gctccagaac agtgaccagc tacatcctgt ccaagcagcc    5220

cgagtgtggt cttggtccct gcagggcaat gtgggcatct ggacctgggg acgatgtgga    5280

tgcacttctt ggaaagctgt tgtagcttgt gcctgtgggt ggagaaggca cctgcctggt    5340

agactctcag ctttctgacc cccaggagcc tctgcgaggc ccctttgtcc ttggctgagc    5400

cggacctttc ttttggaaat ctgtctgtct gttggcatcg ctgttttcag accccaggct    5460

gcagaggagg ggagaagcca cacaacaatc tggacccaat aaagtggaga gaagggcgtc    5520

tctacacagc ccggccagcg tggagggccc caggacaggg acccaaaagc ttgacgtcac    5580

tgaacagggc tgggtactgg cagaacagga agatttggcc agaggtgacc tcagtgttcc    5640

ctccaggggc atccaggccc ctctgacctg gggagaagaa ggcccatgct caggcccacc    5700

tccctcttcc catcagagcc catgcgtcct gggcaccacc acttccactc tgcttttcga  5760

ggctccggag ggctcttcct gctgtgaaag gaaaggagaa gaaagcctgt gggcaatggc  5820

aacctctgag tctggcattc ttgccaatgg ctggccagcg aggagaatct cccgagccct  5880

gacacacaaa ggcattttgt ggctgcagag gaaatgggtt ggctctgaac aaagatgcag  5940

tttctagggc cgtggcccca aatcgcttcc ccgagagtga attttaacac tgtaacaata  6000

aatactactg cacagcactt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa                6047

<210>3

<211>2413

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens CDKN1B)

<400>3

cttcttcgtc agcctccctt ccaccgccat attgggccac taaaaaaagg gggctcgtct    60

tttcggggtg tttttctccc cctcccctgt ccccgcttgc tcacggctct gcgactccga   120

cgccggcaag gtttggagag cggctgggtt cgcgggaccc gcgggcttgc acccgcccag   180

actcggacgg gctttgccac cctctccgct tgcctggtcc cctctcctct ccgccctccc   240

gctcgccagt ccatttgatc agcggagact cggcggccgg gccggggctt ccccgcagcc   300

cctgcgcgct cctagagctc gggccgtggc tcgtcggggt ctgtgtcttt tggctccgag   360

ggcagtcgct gggcttccga gaggggttcg ggctgcgtag gggcgctttg ttttgttcgg   420

ttttgttttt ttgagagtgc gagagaggcg gtcgtgcaga cccgggagaa agatgtcaaa    480

cgtgcgagtg tctaacggga gccctagcct ggagcggatg gacgccaggc aggcggagca    540

ccccaagccc tcggcctgca ggaacctctt cggcccggtg gaccacgaag agttaacccg    600

ggacttggag aagcactgca gagacatgga agaggcgagc cagcgcaagt ggaatttcga    660

ttttcagaat cacaaacccc tagagggcaa gtacgagtgg caagaggtgg agaagggcag    720

cttgcccgag ttctactaca gacccccgcg gccccccaaa ggtgcctgca aggtgccggc    780

gcaggagagc caggatgtca gcgggagccg cccggcggcg cctttaattg gggctccggc    840

taactctgag gacacgcatt tggtggaccc aaagactgat ccgtcggaca gccagacggg    900

gttagcggag caatgcgcag gaataaggaa gcgacctgca accgacgatt cttctactca    960

aaacaaaaga gccaacagaa cagaagaaaa tgtttcagac ggttccccaa atgccggttc   1020

tgtggagcag acgcccaaga agcctggcct cagaagacgt caaacgtaaa cagctcgaat   1080

taagaatatg tttccttgtt tatcagatac atcactgctt gatgaagcaa ggaagatata   1140

catgaaaatt ttaaaaatac atatcgctga cttcatggaa tggacatcct gtataagcac   1200

tgaaaaacaa caacacaata acactaaaat tttaggcact cttaaatgat ctgcctctaa   1260

aagcgttgga tgtagcatta tgcaattagg tttttcctta tttgcttcat tgtactacct   1320

gtgtatatag tttttacctt ttatgtagca cataaacttt ggggaaggga gggcagggtg   1380

gggctgagga actgacgtgg agcggggtat gaagagcttg ctttgattta cagcaagtag    1440

ataaatattt gacttgcatg aagagaagca attttgggga agggtttgaa ttgttttctt    1500

taaagatgta atgtcccttt cagagacagc tgatacttca tttaaaaaaa tcacaaaaat    1560

ttgaacactg gctaaagata attgctattt atttttacaa gaagtttatt ctcatttggg    1620

agatctggtg atctcccaag ctatctaaag tttgttagat agctgcatgt ggctttttta    1680

aaaaagcaac agaaacctat cctcactgcc ctccccagtc tctcttaaag ttggaattta    1740

ccagttaatt actcagcaga atggtgatca ctccaggtag tttggggcaa aaatccgagg    1800

tgcttgggag ttttgaatgt taagaattga ccatctgctt ttattaaatt tgttgacaaa    1860

attttctcat tttcttttca cttcgggctg tgtaaacaca gtcaaaataa ttctaaatcc    1920

ctcgatattt ttaaagatct gtaagtaact tcacattaaa aaatgaaata ttttttaatt    1980

taaagcttac tctgtccatt tatccacagg aaagtgttat ttttcaagga aggttcatgt    2040

agagaaaagc acacttgtag gataagtgaa atggatacta catctttaaa cagtatttca    2100

ttgcctgtgt atggaaaaac catttgaagt gtacctgtgt acataactct gtaaaaacac    2160

tgaaaaatta tactaactta tttatgttaa aagatttttt ttaatctaga caatatacaa    2220

gccaaagtgg catgttttgt gcatttgtaa atgctgtgtt gggtagaata ggttttcccc    2280

tcttttgtta aataatatgg ctatgcttaa aaggttgcat actgagccaa gtataatttt    2340

ttgtaatgtg tgaaaaagat gccaattatt gttacacatt aagtaatcaa taaagaaaac    2400

ttccatagct att                                                     2413

<210>4

<211>600

<212>DNA

<213>黑猩猩(Pan troglodytes SOD2)

<400>4

atgaagcaca gcctccccga cctgccctac gactacggcg ccctggaacc tcacatcaac    60

gcgcagatca tgcagctgca ccacagcaag caccacgcgg cctacgtgaa taacctgaac   120

gtcaccgagg agaagtacca ggaggcgttg gccaagggag atgttacagc ccagatagct   180

cttcagcctg cactgaagtt caatggtggt ggtcatatca atcatagcat tttctggaca   240

aacctcagcc ctaacggtgg tggagaaccc aaaggggagt tgctggaagc catcaaacgt   300

gactttggtt cctttgacaa gtttaaggag aagctgacgg ctgcatctgt tggtgtccaa   360

ggctcaggtt ggggttggct tggtttcaat aaggaacggg gacacttaca aattgctgct   420

tgtccaaatc aggatccact gcaaggaaca acaggcctta ttccactgct ggggattgat   480

gtgtgggagc acgcttacta ccttcagtat aaaaatgtca ggcctgatta tctaaaagct   540

atttggaatg taatcaactg ggagaatgta actgaaagat acatggcttg caaaaagtaa   600

<210>5

<211>3233

<212>DNA

<213>恒河猴(Macaca mulatta calcium-sensing receptor)

<220>

<221>misc_feature

<222>(2570)..(2654)

<223>n is a，c，g，or t

<400>5

aaaacttctg ggagcctcca aactcctagc tgtcttgtcc ctcgccctgg agagaaggca   60

gaaccatggc attttattgc tgcttctggg tcctcttggc actcacctgg cacacctctg  120

cctatgggcc cgaccagcga gcccaaaaga aaggggacat tatacttggc gggctctttc  180

ctattcattt tggagtagca gctaaagatc aagatctcaa atcaaggccg gagtctgtgg  240

aatgcatcag gtataatttc cgtgggtttc gctggttaca ggctatgata tttgccatag  300

aggagataaa cagcagccca gcccttcttc ccaacttgac gctgggatac aggatatttg  360

acacttgcaa caccgtttct aaggccttgg aagccaccct gagttttgtt gctcaaaaca  420

aaattgattc tttgaacctt gatgagttct gcaactgctc agagcacatt ccctctacga  480

ttgctgtggt gggagcaact ggctcaggcg tctccacggc agtggcaaat ctgctggggc  540

tcttctacat tccccaggtc agttacgcct cctccagcag actccttagc aacaagaatc  600

aattcaagtc cttcctccga accatcccca atgatgagca ccaggccact gccatggcag  660

acatcattga gtatttccgc tggaactggg tgggcacaat tgcagctgat gatgactatg  720

ggcggccagg gattgagaag ttccgagagg aagctgagga aagggacatc tgcattgact     780

tcagtgaact catctcccag tactctgatg aggaagagat ccagcatgtg gtggaggtga     840

ttcaaaattc cacggccaaa gtaatcgtgg ttttctccag tggcccagac cttgagcccc     900

tcatcaagga gattgtccgg cgcaatatca caggcaagat ctggctggcc agtgaggcct     960

gggccagctc ctccctgatc gccatgcccg agtacttcca cgtggttgga ggcaccattg    1020

gatttgctct gaaggctggg cagatcccag gctttcggga attcctgaag aaggtccatc    1080

ccaggaagtc tgtccacaat ggttttgcca aggagttttg ggaagaaaca tttaactgcc    1140

acctccaaga aggtgccaaa ggacctttac ctgtggacac ctttctgaga ggtcacgaag    1200

aaagtggagg caggtttagc aacagttcga cagccttccg acccctctgt acaggggatg    1260

agaacatcag cagtgttgag accccttaca tagattacac acatttacgg atatcctaca    1320

atgtgtactt agcagtctac tccattgccc atgccttgca agatatatat acctgcttac    1380

ctgggagagg gctcttcacc aacggctcct gtgcagacat caagaaagtt gaggcgtggc    1440

aggtcctgaa gcacctacgg cacctaaact ttaccaacaa tatgggggag caggtgacct    1500

ttgatgagtg tggtgacctg gtggggaact attccatcat caactggcac ctctccccag    1560

aggatggctc catcgtgttt aaggaagtcg ggtattacaa cgtctatgcc aagaagggag    1620

aaagactctt catcaacgag gagaaaatcc tgtggagtgg gttctccagg gaggtgccct    1680

tctccaactg cagccgagac tgtctggcag ggaccaggaa agggatcatt gagggggagc    1740

ccacctgctg ctttgagtgt gtggagtgtc ctgatgggga gtacagcgat gagacagatg    1800

ccagtgcctg taacaagtgc ccagatgact tctggtccaa tgagaaccac acctcctgca    1860

ttgccaagga gatcgagttt ctgtcgtgga cagagccctt tgggattgca ctcaccctct    1920

ttgccgtgct gggcattttc ctgacagcct ttgtgctggg tgtgtttatc aagttccgca    1980

acacgcccat cgtcaaggcc acgaaccgag agctctccta ccttctcctc ttctccctgc    2040

tctgctgctt ctccagctcc ctgttcttca ttggggagcc ccaggactgg acttgccgcc    2100

tgcgccaacc ggcctttggc atcagcttcg tgctctgcat ctcgtgcatc ctggtgaaaa    2160

ccaaccgtgt cctcctggtg tttgaggcca agatccccac cagcttccac cgcaagtggt    2220

gggggctcaa cctgcagttt ctgctggttt tcctctgcac cttcatgcag attgtcatct    2280

gtgtgatctg gctctacacc gcgcccccct caagctaccg caaccacgag ctggaggatg    2340

agatcatctt catcacgtgc cacgagggct cactcatggc cctgggcttc ctgatcggct    2400

acacctgcct gctggctgcc atctgcttct tctttgcctt caagtcccgg aagctgccag    2460

agaacttcaa tgaagccaag ttcatcacct tcagcatgct catcttcttc attgtctgga    2520

tctccttcat tccagcctat gccagcacct acggcaagtt tgtctctgcn nnnnnnnnnn    2580

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    2640

nnnnnnnnnn nnnnccatcc cgcaacacca tcgaggaggt gcgttgcagc accgcagctc    2700

acgctttcaa ggtggctgcc cgggccacgc tgcgccgcag caacgtctcc cgcaagcggt    2760

ccagcagcct tgggggctcc actggatcca ccccctcctc ctccatcagc agcaagagca    2820

acagcgaaga cccattccca cagcccgaga ggcagaagca gcagcagccg ctgccaagat    2880

gcaagcagaa ggtcatcttc ggcagtggca cggtcacctt ctcactgagc ttcgatgagc    2940

ctcagaagaa cgccatggcc cacaggaatt ctacacacca gaactccctg gaggcccaga    3000

aaagcagcga tacgctggcc cgacaccagg cattactccc gctgcagtgc ggggaagcgg    3060

actcagatct gagcgtccaa gaaacaggtc tgcaaggacc agtgggtgga gaccaccggc    3120

cagaggtgga ggtccctgaa gagttgtccc cagcacttgt agtgtccagt tcacagagct    3180

ttgtcatcag cggtggagga agcactgtta cagaaaatgt actgcattca taa           3233

<210>6

<211>2694

<212>DNA

<213>犬(Canis BCL2-related)

<400>6

gggggggggg ggccggactc aactctactg tggagtcggg gccatccctc atttttctca      60

ctcaggagcg gctggctggc ggcggctggc tggcggcagg agctggcaat gtttggcctc     120

aagagaaacg cagtaatccg gactcaactc tactgtgggg gggccgggct gggggccggc     180

agcggcggcg cctcctcttc gggagggcgg cttttggctt cggggaggga ggccacgacc     240

agacgggagg gagggggagg ggaagccggt gcggtgattg gcggaagcgc cggcgcaagt    300

cccccgacca ctctggcgcc ggacgcccgg agggtcgcgc ggccctcacc cattggcgct    360

gagggcccca acgtcagcgc gacccccccg aggctgctgc tgctcgcgcc cccctgccgc    420

gcgtcgccgc ctgaagagat ggaaggcccg gccgccgacg ccatcatgtc gcccgaagag    480

gagctagacg ggtacgagcc ggaacctttg gggaagcggc cggcggtcct gcctctgctg    540

gagctggtgg gggaggccag cagtggcccc ggcatggacg gctcgctacc ctcgacgcca    600

cccccggcgg aggaggagga agatgagttg taccggcagt ccctggagat tatctctcgg    660

taccttcggg aacaggccac aggcgccaag gacgcgaaac cactgggcgg gtctcgggcg    720

gccagccgga aggcgttaga gaccctccag cgagtcgggg acggggtaca gcgcaaccac    780

gagacagcct tccaaggcat gcttcggaaa ctggacatca aaaacgaaga cgatgtcaaa    840

tcgttgtctc gagtgattgt ccatgttttc agtgacggag taacaaactg gggcaggatt    900

gtgactctta tttcctttgg tgcctttgtg gccaaacact tgaagagtat aaaccaagaa    960

agctgcatcg aaccattagc agaaagcatc acagatgttc tcgtaaggac gaaacgagac   1020

tggctagtca aacaaagagg ctgggatggg tttgtggagt tcttccatgt agaggaccta   1080

gaaggcggca tcagaaatgt gctgctggct tttgcaggtg ttgctggagt aggagctggt   1140

ttggcatatc taataagata gccttttaag tgcaataatt aacttttaaa caaccccagg   1200

caccaaaacc acatatgact gctgtgaaat caaatgtatt tatgaagttg gactttgagc    1260

tgtccaggct gtaacctcgg agagttctac tctagcaacg tagaaaagca agtggcaaga    1320

ggattatggc taacaggaat aaatacatgg gagaagtagt cccccttgaa gagtcactgt    1380

ctaaaagaag cagagctcag tttcagcaac aggcaaactt ggggaggcca tggaggagga    1440

cttttagatt tagtaaagtt ggtagggttg aagagactta attttcttgt ctagaacagg    1500

agagtggcca gtagccaggc tagtcataga gtccattaaa tatgtccact gaattcatta    1560

acttcccata tagtgttaaa agagaagcac taacaatggc attgatctgt atgaaatgga    1620

tttaagctac aggtgataga actatgacta gaagccgcag tactgtacaa cagtgtgaag    1680

gaaagctttt tctctgtaat tagctttccc aagtatactt cttgaaagtc caagtgctca    1740

ggacgtttta cctgttctac tttggcttgg tttgagtggt ttagtttatt agcctagtaa    1800

tggccaacaa tacttgactt agggtcaata attacaattg caaatgtggg aatagcctca    1860

atttttaagg caaaaacaaa ttataaatgt atttgtctgt aaaaattgtg tatattttta    1920

cagaaagtct atttctttga aatgtaaagg gatgaagagt ctcaaaatat attagttttt    1980

ttttcatgcc cgtttgaaat ttacaacttc tgtagttagg aatctatttc ttacagcttt    2040

tctaaatttt gtcctggtca gttctagatt gtatacagaa ccaattgatg taattgtatg    2100

caacttggtt gtagtggaac aattccaatt cataactatg cagacttttt aattttccta    2160

tctgattggt aagtattctt tagtggtttt gggtgttttg ttttgtttta aacctgggat    2220

tgagaagttg atgaatggaa attcatcctt taacttcatt acatgtgggt ttacaataat  2280

tgagtcaagg tgaagtttga agtttggggg cagggggcgt gtgtgggttg ataacttaaa  2340

aaaataatgg gctctgattg ggcagctact catttgagtt ccttccattt gacctaattt  2400

aactggtgaa atttaaattg agtttatgag ctcatcttca aaacttttgc tagaagattt  2460

tcagctgttc caaatgggac ttactaacag tatgtatata aaaagatcac atcagtggat  2520

gagagacatt tgatcccttg tttgcttaat aaattgtaaa atgatggctt ggaaaagcag  2580

gcttatagtc taaccatggt gctattatta ggcttgcttg ttaaacacag gtctaagcct  2640

agtatatcaa taaaacaaat acttatttca tttgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa        2694

<210>7

<211>3863

<212>DNA

<213>大鼠(Rattus norvegicus kazrin)

<400>7

ctgcgccgga ggagccggcg cttgccggtg cctgggggtc ggggcgcggg gaaacccggg    60

ccgctggggt gacccaacag gtagagccgg ggccacggcc ggccacgcgc cccccgcgtg   120

catcatgcag ctctttgtca cctctctcgc ccccaggcca aaatcctgag catgatggaa   180

gacaataagc agctcgcgct ccgcatcgat ggggcggtcc agtcggccag ccaggaggtg   240

accaacctgc gagccgaact cacggccacc aaccggagac tggcggaatt gagcggcgga   300

ggcggcggcc ccggctcggg cccgggagct gcgaccagcg cctcggcagc agcggtgacg    360

gtggctgact cggcggtggc gaccatggag aaccatcagc acggagctca agtgctcctg    420

cgggaggaag tggtccagct tcaggaggaa gtccaccttc tccgacagat gaaggaaatg    480

ctggcaaagg acctagagga gtcacagggc ggcaaatgct ccgaggtgct gtcggccact    540

gaactccggg tgcagctggt acagaaggag caggagctgg ccagagccag ggaagccttg    600

caagccatga aagctgaccg gaagcgctta aagggcgaga agaccgacct ggtgagccag    660

atgcagcagt tgtacgccac gctggagagc cgcgaggagc agttgcgaga cttcatccgc    720

aactatgaac aacaccgcaa ggagagtgag gatgctgtca aagcgctggc caaggagaaa    780

gacctgctgg agcgagagaa gtgggagctc cgacggcagg ccaaggaggc cacggaccat    840

gctgcggccc tgcgctccca gctggacctc aaggacaacc gcatgaagga gctggaggcc    900

gagctagcca tggccaagca gtccttagcc acactgacca aggatgttcc caagaggcat    960

tcactcgcca tgcccggcga gacggtgctc aatggcaacc aggaatgggt ggtgcaggct   1020

gacctcccac tgactgccgc catccggcag agccaacaga ctctctacca ctcccaccct   1080

ccccaccctg cagaccgaca agcggtcagg gtgagcccct gccactcaag acagccttcc   1140

gtcatctctg atgcttccgc tgctgaaggt gaccggtcat ctacaccgag cgacatcaac   1200

tccccaagac accggacaca ctccctctgc aacggcgaca gtcccggccc agttcagaag   1260

agcctacaca accctattgt acagtcacta gaggatcttg aagaccaaaa acggaaaaag    1320

aagaaagaga agatgggatt tggctccatc tctcgagtct tcgccagagg gaaacaacgg    1380

aagtccctcg acccgggcct ctttgatggt accgcccctg attattacat agaggaagac    1440

gcggactggt gataacccac cgccctccgc ccgttgtcca cgggcgtgtc tgtgtgtgga    1500

tgagccttgg agagtgtgcg agagtgtgcg tgcgcgtggg gatgcggagc ctgtgtgtgg    1560

ggtgtgtgtg cacggaggca ctcgccctcg tgggtgcgtg tagccaagcg cctggaacag    1620

acagaaacac aaatgtgacc cccaaccccc ctccgcgtcg tcacctctgt aatcgctgta    1680

cataccacaa accgtgtgtg actctgtcaa ccccgttgtc tctgagcgat acacttgtgt    1740

ttgtttctct cgtttgtttt gtttttcgat gttttttggg ggggggggtt gtttgtttgt    1800

ttctgtttaa atccgtcgtg tttttgtttt taatttgccc ctttctcctc cctcctccct    1860

ttttatgaaa cttgaacact tgaaggactg ctgtgtattt gtaaataaca aaagtagtgt    1920

gcactttgtg cttgtaaagt ccctggtcca gccgctactc ctacagccca cgtcgccaag    1980

gacgcgcggt ctgtgtttca tgtcccctcc ttcttcggtg tgaacgtgtg ggaccagacc    2040

ttgttctcgg ggtgtgcccg agtcacttta accacaaaaa cacccccgcc atcgtcgtca    2100

gggtaaggtc actctgcaga gacccgtgag cccatccaag actttttggc tgggccacag    2160

tgtttataag ggggtcatat gggctctttt taatggcctg cctgttttta aattgtgttg    2220

ctgtttcttt ctttatggag caaaaagaga gaaagaaaac ttgcatttaa tttatttgca    2280

caaatgcaga aagcgtattc tatctaaatt attacgtaaa tattggaatg tatatttttc    2340

cacggggtgg gcgggaggcg ggcgtttctg ctgacttgtc tattctgtgt tcatgccgct    2400

gcagacactg tgcaaggtag aattcaggtg gctagagctg gggacctcag acgaccagct    2460

tgcttcttct ttttttctct tttctgtccc cccccccccg gctgctgtcc ctgcatgaga    2520

ggactcccac cttctgctct ggcctttctc tctagatatt ctctctcttt atatatatat    2580

ctatatattt atttatctga catacagatc atgacttcgg tgagcagaga acactaacag    2640

tcaaattccc cttctcttgg acctgtcttt ggaaccatgt tgattgagac aagggaaggt    2700

tagcctgggg cacatctgtg gggtctaacc agacatctgg gcttgagtca gtgggtaaga    2760

ggctcctggt ggcacataca caatgcctct ctatccttag cttattccaa acatagggca    2820

agccagtgtc aacaaagatg atgcccacct tctgggaggg gctgttgggg gcagtatcta    2880

gcaggcaagc cctttgccct ctttcgtcca gttgacttct ttgcccacac atggactttc    2940

tcataatccc tggatccctg tcctctgatt atatcagcga ctcaagcaga ctaagcccaa    3000

aagggctggc aggtgcctgt gcctgtttgt gggggtagca ctgtccctat ggggcctcac    3060

ctggggcatg gagaacccac aagtttccag ccagtaccac cccacccccg aactcagttt    3120

cctctttctc tcctccccat ccccttttaa ctgatcctaa accactaata actcagccca    3180

caccccttat ggccactgct gtgctccctc taacagaaac attctcaact cttgaaagat    3240

ttttcagtac cggatggaaa atctggaatg tataggatct tgtgtccaaa gtctctaaaa  3300

aaacaagcca aaaagcccct caccaggtca cctcttccct cccgacctgg cccagaggcc  3360

ggagagagag caggcaggga caccagatgg gccttcctgg gtacacaaca accctttcgg  3420

ctcagctgat taacccagcc tggtggtgag ggagagaggc cagagctggc atcagaggga  3480

ggtcttagaa aacactaccc ccaccccatg aattttcggg ttttcttttc ctttcttttt  3540

tttatggttc ccccacacac acccttcctt ttaacttaca agaaaataag gttgcaacca  3600

ctcccggtta atggcttagt cactcctctt cgtttcagtt ttttggaaat taggagatta  3660

tcctgtgagt tactaaggat ggtttatttt cgagaaccac atcagatagg gaatgagtta  3720

tgggtaactc tagatgaaaa tgacccttcc cccccccccg ggagaggttt ctcgaaggca  3780

tggatgcaaa atataaaata ttaaaaaaaa gtctaaataa agcttatttt aaaataaaaa  3840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agg                                          3863

<210>8

<211>903

<212>DNA

<213>大鼠(Rattus Birc5)

<400>8

gatcatgggt gctacggcgc tgcccccgat ctggcagatg taccttaagg accaccggat    60

ctacaccttc aagaactggc ccttcctgga ggattgctcc tgcaccccag agcggatggc   120

ggaggctggc ttcatccact gccctaccga gaatgagcct gatttggccc agtgtttttt    180

ctgctttaag gaactggaag gctgggaacc ggatgacaac cctatagagg agcataggaa    240

gcactcccct ggctgcgcct tccttacagt caagaagcag gtggaagaac tgaccgtcag    300

cgagtttttg aaactggaca aacaaagagc caagaacaaa attgcaaagg agaccaacaa    360

caaacagaaa gagttcgagg agacccggag gaccgtccgg cagtccattg agcagctggc    420

tgccttacgc tgagcctttg ctgggcaacc tggacctgag tgacatgcca cggctaagcc    480

acttgtccca gctttccagg cctgcctggc cgccttggtg tcttacagga gaccgtgaca    540

tttcgaaact ggacgtcaga tgatttgggg ttttgcttta aaggggctca gcctgcgtgg    600

ccacctctct ttggttttgt ggctttgctc tattgtgacc tggacttaag cactgaggaa    660

gggagtggat gagggacagg attctctgac aggatctatg ggtggggagg ggggtgaagg    720

gagggttgtg caaggccttt ctggtcttga tgtttccatg cctggcagct gtcgcagccc    780

atgtgtaggt gttggtttat atatgtttgt gctgataatt cttcttctgt ccttctgatg    840

agtcctccta ccatggggta atggaataaa ataacttaac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    900

aaa                                                                  903

<210>9

<211>8229

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus Pten)

<400>9

gcggcaggat acgcgcttgg gcgtcgggac gcggctgcgc tcagctctct cctctcggaa     60

gctgcagcca tgatggaagt ttgagagttg agccgctgtg aggccaggcc cggcgcaggc    120

gagggagatg agagacggcg gcggccacgg cccagagccc ctctcagcgc ctgtgagcag    180

ccgcgggggc agcgccctcg gggagccggc cgggcggcgg cggcggcagc ggcggcgggc    240

ctcgcctcct cgtcgtctgt tctaaccggg cagcttctga gcagcttcgg agagagacgg    300

tggaagaagc cgtgggctcg agcgggagcc ggcgcaggct cggcggctgc acctcccgct    360

cctggagcgg gggggagaag cggcggcggc ggccgcggct ccggggaggg ggtcggagtc    420

gcctgtcacc attgccaggg ctgggaacgc cggagagttg ctctctcccc ttctcctgcc    480

tccaacacgg cggcggcggc ggcggcacgt ccagggaccc gggccggtgt taagcctccc    540

gtccgccgcc gccgcacccc ccctggcccg ggctccggag gccgccggag gaggcagccg    600

ctgcgaggat tatccgtctt ctccccattc cgctgcctcg gctgccaggc ctctggctgc    660

tgaggagaag caggcccagt ctctgcaacc atccagcagc cgccgcagca gccattaccc    720

ggctgcggtc cagggccaag cggcagcaga gcgaggggca tcagcgaccg ccaagtccag    780

agccatttcc atcctgcaga agaagcctcg ccaccagcag cttctgccat ctctctcctc    840

ctttttcttc agccacaggc tcccagacat gacagccatc atcaaagaga tcgttagcag    900

aaacaaaagg agatatcaag aggatggatt cgacttagac ttgacctata tttatccaaa    960

tattattgct atgggatttc ctgcagaaag acttgaaggt gtatacagga acaatattga    1020

tgatgtagta aggtttttgg attcaaagca taaaaaccat tacaagatat acaatctatg    1080

tgctgagaga cattatgaca ccgccaaatt taactgcaga gttgcacagt atccttttga    1140

agaccataac ccaccacagc tagaacttat caaacccttc tgtgaagatc ttgaccaatg    1200

gctaagtgaa gatgacaatc atgttgcagc aattcactgt aaagctggaa agggacggac    1260

tggtgtaatg atttgtgcat atttattgca tcggggcaaa tttttaaagg cacaagaggc    1320

cctagatttt tatggggaag taaggaccag agacaaaaag ggagtcacaa ttcccagtca    1380

gaggcgctat gtatattatt atagctacct gctaaaaaat cacctggatt acagacccgt    1440

ggcactgctg tttcacaaga tgatgtttga aactattcca atgttcagtg gcggaacttg    1500

caatcctcag tttgtggtct gccagctaaa ggtgaagata tattcctcca attcaggacc    1560

cacgcggcgg gaggacaagt tcatgtactt tgagttccct cagccattgc ctgtgtgtgg    1620

tgatatcaaa gtagagttct tccacaaaca gaacaagatg ctcaaaaagg acaaaatgtt    1680

tcacttttgg gtaaatacgt tcttcatacc aggaccagag gaaacctcag aaaaagtgga    1740

aaatggaagt ctttgtgatc aggaaatcga tagcatttgc agtatagagc gtgcagataa    1800

tgacaaggag tatcttgtac tcaccctaac aaaaaacgat cttgacaaag caaacaaaga    1860

caaggccaac cgatacttct ctccaaattt taaggtgaaa ctatacttta caaaaacagt    1920

agaggagcca tcaaatccag aggctagcag ttcaacttct gtgactccag atgttagtga    1980

caatgaacct gatcattata gatattctga caccactgac tctgatccag agaatgaacc    2040

ttttgatgaa gatcagcatt cacaaattac aaaagtctga tttttttttt cttatcaaga    2100

gggataaaat accatgaaaa aaaaaaaact tgaataaact gaaatggacc tttttttttt    2160

tttttttttt ttaaatggca ataggacatt gtgtcagatt gcagttatag gaacaattct    2220

cttctcctga ccaatcttgt tttaccctat acatccacag ggttttgaca cttgttgtcc    2280

agttaaaaaa aggttgtgta gctgtgtcat gtatatacct ttttgtgtca aaaggacatt    2340

taaaattcaa ttaggataaa taaaagatgg cactttccca ttttattcca gttttataaa    2400

aagtggagac aggctgatgt gtatacgcag gagtttttcc tttattttct gtcaccagct    2460

gaagtggctg aagagctctg attcccgggt tcacgtccta cccctttgca cttgtggcaa    2520

cagataagtt tgcagttggc taaggaagtt tctgcagggt tttgttagat tctaatgcat    2580

gcacttgggt tgggaatgga gggaatgctc agaaaggaat gtttctacct gggctctgga    2640

ccatacacca tctccagctc cttagatgca cctttcttta gcatgctcca cttactaatc    2700

tggacatccg agagattggc tgctgtcctg ctgtttgttt gtgcatttta aagagcatat    2760

tggtgctaga caaggcagct agagtgagta tatttgtagt ggggtacagg aatgaaccat    2820

ctacagcatc ttaagaatcc acaaaggaag ggatataaaa aaagtggtca tagatagata    2880

aaagacacag cagcaatgac ttaaccatac aaatgtggag gctttcaaca aaggatgggc    2940

tggaaacaga aaatttgaca atgatttatt cagtatgctt tctcagttgt aatgactgct    3000

ccatctccta tgtaatcaag gccagtgcta agagtcagat gctattagtc cctacatcag    3060

tcaacacctt acctttattt ttattaattt tcaatcatat acctactgtg gatgcttcat    3120

gtgctggctg ccagtttgtt tttctcctta aatattttat aattcttcac aggaaatttc    3180

aacttgagat tcaacagtaa gcaggttttg tttttttttt ttcctagaga ttgatgatgc    3240

gcgtcctcag tccagtggct gtcagacgtt cagccccttt gaccttacac attctattac    3300

aatgagtttt gcagttttgc acattttttt taaatgtcat taactgttag ggaattttac    3360

ttgaatactg aatacatata atgtgtatat taaaaaagtc attgtttgtg ttaaaaaaga    3420

aattagagtt gcagtaaatt tacagcactg cacgaataat aaggcattga agtttttcag    3480

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gtgcagtgtt gagtcacttc gttatagtgg tagagttggg attagggctt caattttact    3600

tcttaaatat cattctatgt ttgatatgcc cagactgcat acaatttaaa gcaagagtac    3660

aactactatc gtaatggtaa tgtgaagatg ctattacaaa ggatctcctc ccaacccctc    3720

gggaatttgg tgtctttcaa attatatctt gaccttgaca tttgaatatc cagccattat    3780

tagatttctt aatggtgtga agtcccattt tcaataactt attggtgctg aaattgttca    3840

ctagctgtgg tctgacctag ttaatttaca agtacagatt gcataggacc cactagagaa    3900

gcatttatag tttgatggta agtagattag gcagaacgcc atctaaaata ttcttagaaa    3960

ataatgttga tgtattttcc atacctcatc agtttcactc aaccaataaa gtttttaaaa    4020

ttgtaacaaa gctcttagga tttacacatt tatatttaaa cattgataca tgaatattga    4080

ctgactgttg ataaagtcag agacaacttt tcctgagatc tcaccatgga aatctgtaca    4140

cccccttgtc tttcctaaaa gctgaaagtg gctgactaaa atgcaaagca gctgttgatg    4200

ttttgaagat agtgataaac actgttcttt gttagttttg ggcacagcat gctaaactat    4260

aacttgtatt gttccaatat gtaacacaga gggccaggtc atgaataatg acattacaat    4320

gggctgttgc actgttaata tttttccttt ggaatgtgaa ggtctgaatg agggttttga    4380

ttttgaatgt ttcagtgttt ttgagaagcc ttgcttacat tttatggtgt agtcattgga    4440

aatggaaaaa tggcattata tatatattat atatatataa atatatatat tatacatact    4500

ctccttactt tatttcagtt accatcccca tagaatttga caagaattgc tatgactgaa    4560

agggttttga gtcctaattc aaactttctt tatgacagta ttcacgatta gcctgaagtg    4620

cattctgtag gtgatctctc ccgtgtttct ggaatgcttt cttagactct tggatgtgca    4680

gcagcttatg tgtctgaaat gacttgaagg catcaccttt aagaaggctt acagttgggc    4740

cccgtacatc ccaagtcctc tgtaattcct cttggacatt tttgccataa ttgtaaaagg    4800

gtagttgaat taaatagcgt caccattctt tgctgtggca caggttataa acttaagtgg    4860

agtttaccgg cagcatcaaa tgtttcagct ttaaaaataa aagtaggtta caagttacat    4920

gtttagtttt agaaaatttg tgcaatatgt tcataacgat ggctgtggtt gccacaaagt    4980

gcctcgttta cctttaaata ctgttaatgt gtcgtgcatg cagacggaag gggtggatct    5040

gtgcactaaa cggggggctt ttactctagt attcggcaga gttgccttct acctgccagc    5100

tcaaaagttc gatctgtttt catatagaat atatatacta aaaccatcca gtctgtaaaa    5160

cagccttacc ccgattcagc ctcttcagat actcttgtgc tgtgcagcag tggctctgtg    5220

tgtaaatgct atgcactgag gatacacaaa tatgacgtgt acaggataat gcctcatacc    5280

aatcagatgt ccatttgtta ctgtgtttgt taacaaccct ttatctctta gtgttataaa    5340

ctccacttaa aactgattaa agtctcattc ttgtcattgt gtgggtgttt tattaaatga    5400

gagtatttat aattcaaatt gcttaaatcc attaaaatgt tcagtaatgg gcagccacat    5460

atgattacaa agttcctgtg catttttcta tttttccccc tccttgctat ccttccaagc    5520

aaagcatctt tctgtcatct tggtagacac atacctgtct actcatggtt aagaagagca    5580

ctttaagcct tagtcatcac ttaataagtt attccaggca cagtaaaaag ttcaaggttc    5640

ttggaaaacg gtgcttattt ctcttcttat aagccagatg tctgaagata gccctaaccc    5700

caagaacggg cttgatgtct caggtctgtt ctgtggcttt ctgttttttt taacactgca    5760

gttggccatc agcacatggg aggtttcatc gggacttgtc cagagtagta ggctcaaata    5820

tactatctcc tttctaatat tcttaaaggc taaggagtcc tttcaatata acagtaagat    5880

aacttgtgat gttttagaag taagcagacc attaatgtca atgtggagtc ttaatgttac    5940

atgaagttga tagtttctct gtgacccatt taaaaataca aaccgagtag catgcaatta    6000

tgtaaagaaa tatgaagatt atatgtagtc acacattttc tttagaattc ttagtttggt    6060

gaaaacttga atataaaggt attttgattt atatgacatt ttgatgatat ttgaaaaaaa    6120

ggaatttcct gacattttgc ttttagatca tgtcccccat tgtgctgtaa tttaagccaa    6180

cttggttcag tgaatgccat caccatttcc attgagaatt taaaactcac cagtgtttaa    6240

catgcaggct tctgagggct cccggagaat cagaccttaa gcccagttga tttacttcta    6300

acgtgaaact tcgagttcct gtatactttg ctagataatt tgtggtacat ctaaagctta    6360

gtcttaagtg gcttgtgtgt ggattttatt caacattctt gttgctaggg tagagagaaa    6420

tgttgctgag tagaaacaag agtacccagt tcaatgtggt acagagagca gtccctaaaa    6480

tctgtacaca gtgtaatgga ccactttagg agtcaagagg ctgatttttc ctatgaaatt    6540

acattgcaac aggaagcctt ctagtatagt tccttttact gttagaatat gtttttatgc    6600

atacgctata gctgctttcc catcttccaa caacaggtat caggatgtaa gcaagcttta    6660

aacagtgtga agatggcagg atagtgtcat cggtaacagt cctctgactc taaatgtagt    6720

tgctctgtaa cactttgtga atataacatc acaattctca tgtccttggg gggggggggc    6780

atacccagta ttagtatgtt ttagtgacta agcaatcatt tttctgttta ctcatgtaca    6840

ttttctcttt aaaactaaaa cctgtactgt gtatgtctcc aaagcctttt agcttagttt    6900

ttaggaaatg aacactgaat ggatcacttt ttagtgtagc aggtatggga tatgtgcatt    6960

atagagagac cttgtcagct ctctgggcct atttgaatgt ttattgttgg tgtgaggatg    7020

gtaggggaat cagtaaatac aagttacgtt ggtttagcag agcaagctca gtgtgggtat    7080

ttctctttga agcgtggtgc gtgacgcact gtgagtagag aatttggtca ccctttgagt    7140

cctcttgcat tttgcaaact tgctcagcaa atgcgtacct accttgcccc ctaggtaaaa    7200

gcaggaacta ctactgattt atctgtcact cagctgtctt tatatgtgtg cttctgtgac    7260

ttgtatcaca caagaatctt aaagatttca caaattgtta ccttttagct ctgaatgttg    7320

agtattctgg tgggctaaca acaagacaaa ctcttgacag tcatttgaga attttcatga    7380

aacatttagc tgaaaacatt ttataattta tgaaaaaaat gtgttacctt aaacttttac    7440

atatgtggga gacattaact gccatatttg agcatactga attttaaatt taaaataaag    7500

ctgcatattt ttaaatgaaa tgtttaacaa ggattcatat tttttgtttt ttaagattaa    7560

aaataattta tgtcttctca tgtggaacct catctgtcac aatggttaga ttatacagaa    7620

tggagcaagg cttgtagtgg tttagcttac agtaaaattc ttaatgttta gatgtgttta    7680

cttactggct gttatgtata cttttgagat tttccacctg ttctgtgtag ttttctaaat    7740

gatactccta cttaaaaaca gcattttagt atctattttc tgtctccatt aaatggtcct    7800

cattttctat tgagtttgga agtgtgcaca ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc    7860

acacgtgtgc gcgcccgtgc gtgtgtctat ttgtggagtt tgtatgggag aattagtttt  7920

gaaagtgcta gaatagagat gaaatttggt tcaagtaaaa ttttcccact gggattttac  7980

agtttattgt aataaaatgt taattttgga tgaccttgaa tattaatgaa tttgttagcc  8040

tcttgatgtg tgcattaatg agatatatca aagttgtata ttaaaccaaa gttggagttg  8100

tggaagtgtt tttatgaagt tccgtttggc taccaatgga cataagacta gaaatacctt  8160

cctgtggaga atatttttcc tttaaacaat taaaaaggtt cattattttt gaaaaaaaaa  8220

aaaaaaaaa                                                          8229

<210>10

<211>1329

<212>DNA

<213>曲霉菌(Aspergillus fumigatus Af293 asparaginase family protein)

<400>10

atgagtcaac cacagagagg tggaggtatc tctgccatct tcgtccatgt aggggcggga    60

tatcacggcc atggaaacga gagagcccac cttcaggtat gcgaaaacgc ttgtaaagcc   120

gcaatgggca ttttaaaaag cggtggatca gctctggatg ctgttgagat ggccatcatt   180

gtaatggagg atgacgagat tacaaatgct ggctatggaa gcaacctgac gattgaagga   240

gctgtcgaat gtgatgctac tattgtcgac caccatggca ggagcggcgc agctggagcc   300

gtctcgccgc gaatgctact tgaaacctct gcaaagcctt taacttgcca cagagtgcct   360

ccaagcttcc tcgttggtga gggtgcaacg gactttgctt atgagcaagg attggtcata    420

ctgcctcctg acgggctcat atcgcgcttt tcgaaagaga gatggcaccg ctggctgcag    480

gatctcgagg ctgctgaact agtcgaaaga aaacgggatc cttcacgttt ccgcatggaa    540

gaagatagag catccttcct tcgtcggcca atgctgaatc gtaatccagc ccgcctcatt    600

gacaatacgc gtttacgccc acatctaccc agctctccct tcaccggagt cgacttgctg    660

aacccccttc ctcgtctcca ggctcttgga agcagacaaa ccatagctcc tgcaccacca    720

gctatgcctt cgaaccaagg acacggcatg ggtcctgcaa ttggacaacc tatggctgtg    780

gcaggtggac aaagtatggc ttctgcacct gagcaaggta tggctgcctc ggccaacacc    840

catgcagatg gtgcgacttt ccgcgcgtgc cctacaaaag caccttgtgc acctgacact    900

tcgacgactg ctcacccggg cgctgcagac gaggatgaag atatgatcag cgatacagtc    960

ggggccatag ctgtagactg ttatggcaat attgcggcag gttcttcgtc tggcgggatt   1020

ggcgcgaagc atcgcggtcg aattgggcct gctgcgctgg tgggcatcgg cacctatgtg   1080

attcctgtgg atcccagcga tcccgaacaa gtatcagtcg cttcagttac atcgggcaca   1140

ggcgagcaca ttgctacaac tatggctgcg cagacgtcag ctgcaagact ctattactgt   1200

caaaagaagt gtaaggacgg tactttcgaa agtgtatccg aagacgaagc tatgaatgca   1260

atcatagcca ctgagttcat gggtgagtta ttgtattcca tattccttac gaccattgat   1320

agagaataa                                                           1329

Claims (11)

1.一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其特征在于，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸，所述修饰为小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2′-OH被甲氧基或氟取代，除了所述CA/UG位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。 

2.根据权利要求1所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸包括多个CA/UG位点，并且该多个CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。 

3.根据权利要求1所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述CA/UG位点中，只有胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。 

4.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述第一片段还包括至少一个连续的UA序列，所述第二片段还包括至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，并且，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使UA/UA位点被修饰的小干扰核酸的稳定性高于UA/UA位点未被修饰的小干扰核酸。 

5.根据权利要求4所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸包括多个UA/UA位点，并且该多个UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。 

6.根据权利要求4所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述UA/UA位点中，只有一个尿嘧啶核苷酸是经过修饰的。 

7.根据权利要求4所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸中，除了所述CA/UG位点和UA/UA位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。 

8.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，该修饰的小 干扰核酸为发夹结构的单链分子，所述第一片段和第二片段之间的互补区域形成双链区域。 

9.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，所述正义链和反义链为连续的核苷酸链，所述第一片段位于正义链，所述第二片段位于反义链。 

10.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链，所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核苷酸链；所述反义链为连续的核苷酸链；所述第一片段位于一个或多个正义链部分，所述第二片段位于反义链。 

11.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸为包括核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。