CN116981773A

CN116981773A - 用于编辑靶标rna的多聚腺苷酸化信号序列的指导rna

Info

Publication number: CN116981773A
Application number: CN202180087262.4A
Authority: CN
Inventors: 新井理智; 万田茉莉子
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-10-31
Also published as: WO2022138929A1; EP4269585A1; US20240150754A1; JPWO2022138929A1

Abstract

本发明提供期待高效控制靶标RNA表达的、用于编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列的反义型指导RNA和编码其的核酸。本发明人对用于高效控制靶标RNA表达的技术进行了深入研究，结果发现了含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区的、用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA，从而完成了本发明。

Description

用于编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列的指导RNA

技术领域

本发明涉及用于募集ADAR、编辑多聚腺苷酸化信号序列的指导RNA。

背景技术

基因表达控制是对于维持细胞稳态、适应细胞内外的环境变化而言重要的功能。如中心法则的基本原理所示，遗传信息基本上按照DNA、mRNA、蛋白质的顺序传递。各阶段的表达、翻译控制对于决定最终的蛋白质的量很重要。

真核生物中，在核内转录并合成的信使RNA(messenger RNA：mRNA)的前体mRNA(pre-mRNA)经过被称为5’帽结构的添加、剪接、多聚A链向3’末端的添加(多聚腺苷酸化)的加工而合成成熟mRNA，从核中运输到细胞质。

mRNA的3’末端的多聚腺苷酸化需要存在于添加多聚腺苷酸(poly(A))的上游10～30个碱基处的多聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal：PAS)和存在于PAS的下游20～40个碱基处的GU序列的含有率高的区域。PAS为6个碱基保守的基序，作为代表例，已知有AAUAAA和其单碱基置换体AUUAAA。已知该过程是除了核酸内切酶的剪切多聚腺苷酸化特异性因子(cleavage-polyadenylation specificity factor：CPSF)、作为多聚A添加酶的多聚腺苷酸聚合酶(Polyadenylate polymerase：PAP)以外还有至少20种以上因子参与的反应(Mol.Cell，2009，Vol.33，p.365-376)。

关于与人类疾病的相关性，在由于β珠蛋白基因的突变、缺失而引起β珠蛋白产生障碍的β地中海贫血中，已鉴定出β珠蛋白的PAS的点突变(AATAAA→AATAAG)和5个碱基对的缺失(AATAAA→A-----)这2种突变，它们未被正常多聚腺苷酸化，因此，mRNA量减少(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，Vol.89，p.4324-4328)。可见，在人类疾病中，PAS序列也在多聚腺苷酸化控制中发挥着重要作用。

作为mRNA的多聚A链的作用，通常已知的是翻译效率的控制。mRNA通过结合于5’末端帽结构的真核生物翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E：eIF4E)与结合于多聚A链的多聚A结合蛋白(Poly(A)binding protein：Pab1p)的相互作用而形成环状结构(EMBO J.，1996，Vol.15，p.7168-7177)。通过该环状结构，翻译结束后与mRNA分离的核糖体容易再次被募集到mRNA的5’末端，认为可提高翻译效率(eLife，2017，Vol.6，p.e25237)。另外，即使是相同的mRNA，具有长的多聚A链的因子也显示高的翻译效率，因此表明了多聚A链长在翻译效率控制中的重要性(RNA，1998，Vol.4，p.1321-1331)。

作为mRNA的多聚A链的其它作用，已知参与mRNA的稳定性。真核生物中的mRNA分解途径广泛保守，一般认为脱腺苷酸化酶所引起的多聚A的去除是最初的阶段，是限速阶段。已知脱腺苷酸化酶存在多种，根据酶活性结构域的结构大致分为Asp-Glu-Asp-Asp(DEDD)和核酸外切酶-核酸内切酶-磷酸酶(Exonuclease-endonuclease-phosphatase，EEP)这两个家族。除去了多聚A链的mRNA接下来被作为脱帽酶的Decapping1/Decapping 2(DCP1/DCP2)复合体除去帽结构(Nature，1996，Vol.382，p.642-646，Nucleic Acids Research，2014，Vol.42，p.5217-5233)。之后，mRNA从5’末端起被核糖核酸外切酶(XRN)分解或从3’末端起接受外泌体所引起的分解(Gene，1990，Vol.95，p.85-90，Mol.Cell，2004，Vol.15，p.173-183，Cell，1997，Vol.91，p.457-466，Cell，2007，Vol.131，p.1340-1353)。

此前报道了使用针对PAS序列设计的反义寡核苷酸防止KCNH2基因的内含子9的多聚腺苷酸化的寡核苷酸(专利文献1)以及利用设计成HIVPAS的反义寡核苷酸来减少病毒的基因表达和病毒的产生量(非专利文献1)等。

利用反义核苷酸来抑制靶标RNA表达时，需要使反义核苷酸与靶标RNA以1：1结合而产生位阻，因此需要给予高用量的反义核苷酸。因此，需要能够高效抑制RNA表达的技术。

真核生物中，存在基于单碱基突变的被称为RNA编辑的机制。通常情况下，该机制可位点特异性且准确地进行编辑。关于RNA编辑，由腺苷(A)向肌苷(I)转换的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA：ADAR)是已知的。另外，作为ADAR亚型的ADAR2的改造体ADAR2dd具有由胞苷(C)向尿苷(U)转换的胞苷脱氨酶活性(Science，2019，Vol.365，p.382-386)。

ADAR为多结构域蛋白，在N末端具有双链RNA结合结构域，在C末端具有脱氨酶结构域。识别结构域识别特定的双链RNA(double strand RNA：dsRNA)序列和/或结构，脱氨酶结构域通过核酸碱基的脱氨基化反应而将处于靶标内的特定位置的腺苷(A)转换为肌苷(I)。由腺苷转换而成的肌苷通过细胞翻译机制被识别为鸟嘌呤。即，被转换为肌苷的腺苷处于mRNA或前体mRNA的编码区时，能够向蛋白质序列中导入突变。此前已知ADAR存在3种，在生物体内的表达分布不同。ADAR1和ADAR2在全身表达，特别地，ADAR2在神经细胞中表达。另一方面，据报道，ADAR3仅在神经细胞中表达，虽然在N末端侧具有富含精氨酸的单链RNA结合结构域，但是不具有RNA编辑活性，相反，抑制RNA编辑活性(RNA，2000，Vol.6，p.755-767)。

近年来，作为使用野生型ADAR和人工指导RNA的靶标RNA编辑技术，报道了几种用于编辑含有来源于GluR2的ADAR募集碱基序列的靶标RNA的指导RNA(国际公开第2016/097212号、国际公开第2017/050306号、国际公开第2017/010556号、国际公开第2019/111957号、Nucleic Acids Research，2017，Vol.45，p.2797-2808，Nature Methods，2019，Vol.16，p.239-242)。

另外，作为使用反义寡核苷酸的靶标RNA编辑技术，报道了使用与含有成为编辑靶标的腺苷的mRNA互补的35个碱基以上的反义寡核苷酸，与mRNA形成不完整螺旋结构的双链并募集ADAR，由此编辑靶标RNA的技术(国际公开第2017/220751号，国际公开第2018/041973号，国际公开第2018/134301号，Nat.Biotechnol.，2019，Vol.37，p.1059-1069，Protein Eng.Des.Sel.，2018，Vol.1，p.471-478，Chem.Commun.，2018，Vol.54，p.2377-2380)。另外，还报道了使用100个碱基以上的人工RNA、呈ADAR依赖性地编辑靶标RNA(Nat.Biotechnol.，2019，Vol.37，p.1059-1069)。

进而，还报道了几种使用蛋白质与RNA的连接系统将ADAR融合蛋白与指导RNA连接、从而将ADAR募集到靶标RNA并编辑靶标RNA的技术。例如，使用ADAR1脱氨酶结构域-MS2包被蛋白(MS2 coat protein：MCP)的融合蛋白与反义-MS2 RNA的连接系统的靶标RNA编辑技术(Protein Eng.Des.Sel.，2018，Vol.1，p.471-478，国际公开第2018/161032号)、使用λ噬菌体来源的BoxB序列与λN蛋白的连接系统的靶标RNA编辑技术(Nucleic AcidsResearch，2016，Vol.44，p.e157，国际公开第2017/050306号，国际公开第2019/071274号)等。

进而，还报道了几种使用RNA指向性Cas蛋白与ADAR的融合蛋白以及募集Cas蛋白的指导RNA的靶标RNA编辑技术。例如，报道了使用dCas13-ADAR融合蛋白的靶标RNA编辑技术(国际公开第2019/005884号、国际公开第2019/071048号)等。

此前，虽然存在使用针对PAS序列的反义核苷酸来诱导mRNA的表达抑制的例子，但是尚无编辑RNA上的PAS序列而进行表达抑制的报道。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/118118号

非专利文献

非专利文献1：Virus Res.，2012，Vol.169，p.63-71

发明内容

发明所要解决的问题

为了使用针对多聚腺苷酸化信号序列设计的反义核苷酸抑制靶标RNA的表达，需要使反义核苷酸与靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列以1：1结合，因此在靶标RNA的表达抑制的效率方面存在课题。因此，需要高效抑制靶标RNA表达的技术。本发明的课题在于，提供期待在高效控制靶标RNA表达中有用的、用于编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列的指导RNA和编码该指导RNA的核酸。

用于解决问题的方法

本发明人对用于高效控制靶标RNA表达的技术进行了深入研究，结果发现了用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA，该指导RNA含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的[1]～[14]。

[1]一种指导RNA，其是用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA，其中，该指导RNA含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区。

[2]根据[1]所述的指导RNA，其中，多聚腺苷酸化信号序列为由AAUAAA构成的碱基序列或由其改造序列构成的碱基序列。

[3]根据[2]所述的指导RNA，其中，多聚腺苷酸化信号序列为由AAUAAA构成的碱基序列。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的指导RNA，其中，与靶标RNA的一部分互补的反义区含有与靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中含有的腺苷形成碱基对的碱基。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的指导RNA，其中，ADAR为天然存在的ADAR、改造ADAR、或者ADAR或改造ADAR与其它因子的融合蛋白。

[6]一种编辑靶标RNA的系统，其含有[1]～[5]中任一项所述的指导RNA和ADAR。

[7]一种核酸，其编码[1]～[5]中任一项所述的指导RNA。

[8]一种表达载体，其含有编码[1]～[5]中任一项所述的指导RNA的核酸。

[9]根据[8]所述的表达载体，其还含有编码ADAR的核酸。

[10]一种宿主细胞，其被导入了[8]或[9]所述的表达载体。

[11]一种制造表达载体的方法，其包括培养[10]所述的宿主细胞的步骤。

[12]一种药物组合物，其含有[8]或[9]所述的表达载体和药学上可接受的赋形剂。

[13]一种药物组合物，其含有[8]或[9]所述的表达载体、含有编码ADAR的核酸的表达载体、和药学上可接受的赋形剂。

[14]一种编辑靶标RNA的方法，其包括将编码[1]～[5]中任一项所述的指导RNA的核酸导入到细胞或感染了细胞的病毒中的步骤。

发明效果

用于利用ADAR编辑靶标RNA、并且含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区的指导RNA可用于编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列而控制靶标RNA的表达。用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA通过与靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列结合并进行编辑，从而能够抑制该多聚腺苷酸化信号序列的功能，编辑后能够在细胞内再次利用，因此期待在高效控制靶标RNA表达中有用。

附图说明

图1示出相对于不表达ADAR2的条件的、各指导RNA的海肾荧光素酶的相对表达量。纵轴表示与对照相比的、海肾荧光素酶的相对表达量。横轴表示表达的各指导RNA(BoxB-ASR、ASR-Gq、U6-ASR-STL、BoxB-Con)。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明，但是本发明不受这些限定。在本说明书中使用的术语未进行具体定义的情况下，该术语以本领域技术人员通常所接受的含义来使用。

＜本发明的指导RNA＞

本发明提供一种指导RNA，其为用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA，该指导RNA含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区(以下也称为“本发明的指导RNA”)。本发明中，“用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA”是指：具有与该靶标RNA的一部分互补并与该靶标RNA的一部分形成双链的区域、将ADAR募集至靶标RNA的RNA分子。

1.靶标RNA

本发明中，“靶标RNA”是指成为利用本发明的指导RNA的编辑的靶标的RNA。本发明中，该靶标RNA的一部分中含有多聚腺苷酸化信号序列。一个方式中，靶标RNA为前体mRNA(pre-mRNA)，一个方式中，为mRNA，一个方式中，为病毒基因组RNA，一个方式中，为病毒反基因组RNA，一个方式中，为病毒来源的前基因组RNA(pgRNA)。靶标RNA可存在于真核细胞、哺乳动物细胞、病毒、原核细胞、细菌、噬菌体等所含的RNA内。

2.多聚腺苷酸化信号序列

本发明中，靶标RNA中含有多聚腺苷酸化信号序列。本发明中，“多聚腺苷酸化信号序列”是本领域技术人员公知的序列，是指存在于靶标RNA的多聚腺苷酸化(poly(A))位点的上游10～30个碱基处的、6个碱基保守的基序。本发明中，多聚腺苷酸化信号序列含有要转换为肌苷的腺苷。一个方式中，多聚腺苷酸化信号序列为由AAUAAA构成的碱基序列或由其改造序列构成的碱基序列。AAUAAA的改造序列是指：在由AAUAAA构成的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1或2个碱基、并且被CPSF(cleavage-polyadenylation specificityfactor，剪切多聚腺苷酸化特异性因子)识别的碱基序列。AAUAAA的改造序列包括天然存在的AAUAAA的改造序列或进行人工改造而得的AAUAAA的改造序列。一个方式中，多聚腺苷酸化信号序列是指由AAUAAA构成的碱基序列和由其改造序列构成的碱基序列。一个方式中，AAUAAA的改造序列为AUUAAA、AGUAAA、或UAUAAA(Gene&Development，2011，Vol.25，p.1770-1782)。一个方式中，多聚腺苷酸化信号序列为由AAUAAA、AUUAAA、AGUAAA、或UAUAAA构成的碱基序列，一个方式中，为由AAUAAA或AUUAAA构成的碱基序列，一个方式中，为由AAUAAA构成的碱基序列。

3.反义区

本发明的指导RNA含有反义区。本发明中，“反义区”是指：由具有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的碱基序列、并且与靶标RNA形成双链的序列构成的区域。一个方式中，反义区是指由含有与该靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列所含的腺苷形成碱基对的碱基、并且与靶标RNA形成双链的序列构成的区域。关于构成反义区的碱基序列的长度，一个方式中，为10个碱基～100个碱基、10个碱基～80个碱基、10个碱基～60个碱基、10个碱基～40个碱基，一个方式中，为15个碱基～40个碱基，一个方式中，为10个碱基～38个碱基，一个方式中，为15～38个碱基，一个方式中，为18～38个碱基。一个方式中，反义区可含有与该靶标RNA的一部分形成错配碱基对的碱基或形成摇摆碱基对的碱基。一个方式中，反义区可含有与靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列形成错配碱基对的碱基或形成摇摆碱基对的碱基。一个方式中，反义区可含有与靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列形成错配碱基对的碱基。

本说明书中，“错配碱基对”是指G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U碱基对。本说明书中，“摇摆碱基对”是指G-U、I-U、I-A、I-C碱基对。一个方式中，反义区为由具有与该靶标RNA的一部分中含有的腺苷形成错配碱基对的碱基、并且与靶标RNA形成双链的碱基序列构成的区域。一个方式中，反义区为由具有与该靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中含有的腺苷形成错配碱基对的碱基、并且与靶标RNA形成双链的碱基序列构成的区域。一个方式中，反义区为由具有作为与该靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中含有的腺苷形成错配碱基对的碱基的胞苷、并且与靶标RNA形成双链的碱基序列构成的区域。

构成反义区的碱基序列可由本领域技术人员考虑靶标RNA的序列、碱基长度、与靶标RNA形成的错配碱基的位置、脱靶效应等而适当地设计。为了提高腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase acting on RNA：ADAR)对靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列的腺苷的编辑效率(RNA、2001、Vol.7、p.846-858、Nat.Biotechnol.、2019、Vol.37、p.1059-1069)，构成反义区的碱基序列也可以以与该腺苷或胞苷形成错配碱基对或摇摆碱基对的方式进行设计。

本说明书中，“ASR”是指反义区(Antisense Region)。

4.用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA

作为用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA，各种形态的指导RNA是本领域技术人员公知的。本发明的指导RNA只要含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区，则可以使用本领域技术人员公知的、用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA。一个方式中，本发明的指导RNA含有以下的1)～5)中任一指导RNA来作为用于利用ADAR编辑靶标RNA序列的指导RNA：

1)由反义区构成的指导RNA(国际公开第2017/220751号、国际公开第2018/041973号、国际公开第2018/134301号、Nat.Biotechnol.、2019、Vol.37、p.1059-1069、ProteinEng.Des.Sel.、2018、Vol.1、p.471-478、Chem.Commun.、2018、Vol.54、p.2377-2380)；

2)由反义区、功能性区域和任选含有的接头序列构成的指导RNA(国际公开号WO2021/117729)；

3)含有反义区和募集ADAR的区域的指导RNA(国际公开第2016/097212号、国际公开第2017/050306号、国际公开第2017/010556号、国际公开第2019/111957号、NucleicAcids Research、2017、Vol.45、p.2797-2808、Nature Methods、2019、Vol.16、p.239-242、国际公开号WO2021/020550)；

4)含有反义区以及募集ADAR与dCas13蛋白的融合蛋白的区域的指导RNA(国际公开第2019/005884号、国际公开第2019/071048号)；或

5)含有反义区以及与ADAR与RNA连接蛋白的融合蛋白连接的区域的指导RNA(Protein Eng.Des.Sel.、2018、Vol.1、p.471-478、国际公开第2018/161032号、NucleicAcids Research、2016、Vol.44、p.e157、国际公开第2017/050306号、国际公开第2019/071274号)。

一个方式中，本发明的指导RNA为前述2)的由反义区、功能性区域和任选含有的接头序列构成的指导RNA。

本发明的指导RNA为前述1)的由反义区构成的指导RNA时，一个方式中，本发明的指导RNA为由＜本发明的指导RNA＞的3.反义区中记载的区域构成的指导RNA。

本发明的指导RNA为前述2)的由反义区、功能性区域和任选含有的接头序列构成的指导RNA时，一个方式中，本发明的指导RNA是功能性区域与反义区连接、实质上不含ADAR募集碱基序列的指导RNA。本发明中，“实质上不含”ADAR募集碱基序列(后述)是指：在指导RNA的同一分子内不含有ADAR募集碱基序列。

“功能性区域”是指由具有下述功能中的任意一种以上功能的碱基序列构成的区域，所述功能为指导RNA的稳定化、指导RNA在核中的局部存在、指导RNA在细胞质中的局部存在、靶标RNA与反义区的双链形成促进、基于反义区的非特异性双链形成抑制、由靶标RNA和反义区形成的复合物的稳定化等。一个方式中，本发明的指导RNA含有(a)由促进指导RNA的稳定化的碱基序列构成的区域、(b)由促进指导RNA在核中的局部存在的碱基序列构成的区域、(c)由促进指导RNA在细胞质中的局部存在的碱基序列构成的区域、(d)由促进靶标RNA与反义区的双链形成的碱基序列构成的区域、(e)由抑制基于反义区的非特异性双链形成的碱基序列构成的区域或(f)由促进由靶标RNA和反义区形成的复合物的稳定化的碱基序列构成的区域、或者由具有上述(a)～(f)中记载的功能中的任意2种以上功能的碱基序列构成的区域作为功能性区域。有时将功能性区域具有这些中的1种以上功能这一点统称为“具有功能”。另外，有时将具有(a)、(b)和(d)中记载的功能这一点统称为“具有snRNA序列的功能”。

本说明书中，“促进指导RNA的稳定化”是指赋予对RNA分解酶的耐性。该功能可通过利用公知的方法测定RNA分解酶存在下的指导RNA的残存量、向细胞中导入编码指导RNA的核酸后的转录抑制下的细胞内的指导RNA的残存量等来进行评价。“促进指导RNA在核中的局部存在”是指促进被导入到细胞中的指导RNA向核的迁移和局部存在。该功能可通过利用公知的方法检测指导RNA在细胞内的分布、量来进行评价。例如，可以通过原位杂交(insitu hybridization)(Mol.Ther.、2003、Vol.7、p.237-247)进行确认。“促进指导RNA在细胞质中的局部存在”是指促进被导入到细胞中的指导RNA停留在细胞质中。该功能可通过利用公知的方法检测指导RNA在细胞内的分布、量来进行评价。例如，可利用原位杂交(insitu hybridization)(Mol.Ther.、2003、Vol.7、p.237-247)进行确认。“促进靶标RNA与反义区的双链形成”是指提高靶标RNA与反义区的亲和性。该功能可利用公知的方法通过亲和分析来进行评价(BMC Biotech.、2008、Vol.8、article number 48)。“抑制基于反义区的非特异性双链形成”是指减少非特异性双链的形成(本说明书中也称为“脱靶效应”)。该功能可利用RNA测序等公知的方法来进行评价(Nat.Biotechnol.、2019、Vol.37、p.657-666)。“促进由靶标RNA和反义区形成的复合物的稳定化”是指维持含有由靶标RNA和反义区形成的双链的复合物的状态。该功能可通过利用公知的方法在分解DNA/RNA杂合链的RNA的RNA分解酶存在下测定由靶标RNA和反义区形成的双链的残存量来进行评价。例如，可通过在RNaseH存在下测定由靶标RNA和由DNA序列构成的指导RNA形成的双链的残存量来进行评价(Antiviral Chemistry&Chemotherapy、1996、Vol.7、p.86-93)。

一个方式中，由促进指导RNA的稳定化的碱基序列构成的区域为由形成热力学上稳定的高级结构的碱基序列构成的区域。热力学上稳定的高级结构只要为对核酸酶活性显示耐性的结构就没有特别限定。一个方式中，由促进指导RNA的稳定化的碱基序列构成的区域为由核内小分子RNA(snRNA：small nuclear RNA)序列构成的区域、由核糖体RNA(rRNA：ribosomal RNA)序列构成的区域、由形成双链体结构的碱基序列构成的区域、由形成三链体结构的碱基序列构成的区域、由形成四链体结构的碱基序列构成的区域、由形成茎环结构的碱基序列构成的区域等。一个方式中，由促进指导RNA的稳定化的碱基序列构成的区域为由snRNA序列构成的区域、由形成鸟嘌呤四链体(Gq：G-quadruplex)结构的碱基序列构成的区域、或由形成茎环结构的碱基序列构成的区域。一个方式中，由促进指导RNA在核中的局部存在的碱基序列构成的区域为由来源于小分子RNA(small RNA)的碱基序列构成的区域。一个方式中，由促进指导RNA在核中的局部存在的碱基序列构成的区域为由snRNA序列构成的区域。一个方式中，由促进指导RNA在细胞质中的局部存在的碱基序列构成的区域为由来源于small RNA的碱基序列构成的区域。一个方式中，由促进指导RNA在细胞质中的局部存在的碱基序列构成的区域为由促进指导RNA在核糖体中的局部存在的碱基序列构成的区域，一个方式中，为由rRNA序列构成的区域。一个方式中，由促进指导RNA在细胞质中的局部存在的碱基序列构成的区域为由转运RNA(tRNA：transfer RNA)序列构成的区域。一个方式中，由促进指导RNA在细胞质中的局部存在的碱基序列构成的区域是由作为来源于信号识别颗粒(Signal Recognition Particle：SRP)的RNA序列的7SL RNA序列构成的区域。一个方式中，由促进靶标RNA与反义区的双链形成的碱基序列构成的区域为由在热力学上和立体结构上促进双链和含有双链的复合物的形成的碱基序列构成的区域(Nat.Biotechnol.、2019、Vol.37、p.657-666)。一个方式中，由促进靶标RNA与反义区的双链形成的碱基序列构成的区域为由snRNA序列构成的区域、或由形成茎环结构的碱基序列构成的区域、或者它们的任意组合。一个方式中，由促进靶标RNA与反义区的双链形成的碱基序列构成的区域为由U6 snRNA序列构成的区域、由U1 snRNA序列构成的区域、由U7snRNA序列构成的区域、或由形成茎环结构的碱基序列构成的区域、或者它们的任意组合。一个方式中，由抑制基于反义区的非特异性双链形成的碱基序列构成的区域为由在热力学上和立体结构上减轻脱靶效应的碱基序列构成的区域。一个方式中，由抑制基于反义区的非特异性双链形成的碱基序列构成的区域为由形成茎环结构的碱基序列构成的区域(Chem.Commun.、2018、Vol.54、p.2377-2380)。一个方式中，由促进由靶标RNA和反义区形成的复合物的稳定化的碱基序列构成的区域为由在热力学上和立体结构上使双链和含有双链的复合物稳定化、对核酸酶活性显示耐性的碱基序列构成的区域(AntiviralChemistry&Chemotherapy、1996、Vol.7、p.86-93)。一个方式中，由促进由靶标RNA和反义区形成的复合物的稳定化的碱基序列构成的区域为由形成茎环结构的碱基序列构成的区域。

一个方式中，本发明的指导RNA含有由snRNA序列构成的区域、由rRNA序列构成的区域、由形成鸟嘌呤四链体(Gq：G-quadruplex)结构的碱基序列构成的区域、由形成茎环结构的碱基序列构成的区域、由来源于SRP的RNA序列构成的区域、由长链非编码RNA(lncRNA：long non-coding RNA)序列构成的区域、由tRNA序列构成的区域、由核小体小分子RNA(snoRNA：small nucleolar RNA)序列构成的区域、或由miRNA序列构成的区域、或者它们的任意组合作为功能性区域。一个方式中，本发明的指导RNA含有由snRNA序列构成的区域、由rRNA序列构成的区域、由形成Gq结构的碱基序列构成的区域、或由形成茎环结构的碱基序列构成的区域、或者它们的任意组合作为功能性区域。

一个方式中，本发明的指导RNA含有由snRNA序列构成的区域作为功能性区域。一个方式中，本发明的指导RNA含有由snRNA序列构成的区域和由形成茎环结构的碱基序列构成的区域作为功能性区域。作为一个方式，可与由snRNA序列构成的区域组合使用的由形成茎环结构的碱基序列构成的区域为由人工茎环序列构成的区域。人工茎环序列是指人工制作的形成茎环结构的序列，可列举例如Gene Ther.、1997、Vol.4、p.45-54、Nat.Biotechnol.、2002、Vol.20、p.505-508或Mol.Ther.、2003、Vol.7、p.237-247中记载的含有编码U6的序列的表达盒(以下，也将这些文献记载的表达盒称为“U6盒”)中所含的人工茎环序列(本说明书中称为“STL序列”)。作为一个方式，可与由snRNA序列构成的区域组合使用的由形成茎环结构的碱基序列构成的区域为由STL序列构成的区域。一个方式中，本发明的指导RNA含有由snRNA序列构成的区域和由人工茎环序列构成的区域作为功能性区域。一个方式中，本发明的指导RNA含有由snRNA序列构成的区域和由STL序列构成的区域作为功能性区域。本发明中使用的由snRNA序列构成的区域为本领域技术人员周知的由snRNA的碱基序列构成的区域，只要具有snRNA序列的功能则可在天然的snRNA的碱基序列中局部性地含有改造，和/或只要具有snRNA序列的功能则可以为天然的snRNA的碱基序列的部分序列。例如，本发明的指导RNA含有由U1 snRNA序列构成的区域、由U2 snRNA序列构成的区域、由U4snRNA序列构成的区域、由U5 snRNA序列构成的区域、由U6 snRNA序列构成的区域、或由U7 snRNA序列构成的区域、或者它们的任意组合作为功能性区域。一个方式中，本发明的指导RNA含有由U6snRNA序列构成的区域作为功能性区域。本发明中使用的由U6 snRNA序列构成的区域为由U6 snRNA的碱基序列构成的区域，只要具有snRNA序列的功能则可在天然的U6 snRNA的碱基序列中局部性地含有改造，和/或只要具有snRNA序列的功能则可以为天然的U6 snRNA的部分序列。一个方式中，本发明中使用的由U6 snRNA序列构成的区域为由U6 snRNA的碱基序列的部分序列构成的区域，一个方式中为由U6 snRNA的碱基序列的转录起始点至第27位碱基的碱基序列构成的区域。本发明的指导RNA中，由U6 snRNA序列构成的区域只要具有snRNA序列的功能则可与由人工茎环序列构成的区域组合使用。使用由U6snRNA序列构成的区域和由人工茎环序列构成的区域时，在由U6 snRNA序列构成的区域与由人工茎环序列构成的区域之间插入反义区。一个方式中，本发明中使用的由U6 snRNA序列构成的区域由序列号3所示的碱基序列或在序列号3所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有snRNA序列的功能的碱基序列构成。一个方式中，本发明中使用的由人工茎环序列构成的区域为STL序列，一个方式中由序列号5所示的碱基序列或在序列号5所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成茎环结构的碱基序列构成。

一个方式中，本发明的指导RNA含有由形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列构成的区域或由形成茎环结构的碱基序列构成的区域、或者它们的组合作为功能性区域。一个方式中，本发明的指导RNA含有由形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列构成的区域作为功能性区域。一个方式中，本发明的指导RNA含有由形成茎环结构的碱基序列构成的区域作为功能性区域。

本发明中使用的由形成鸟嘌呤四链体结构(Gq结构)的碱基序列构成的区域含有Gq序列。Gq序列为含有4个连续的由鸟嘌呤构成的重复单元的序列，为4个鸟嘌呤形成平面上的四链体(Gq)结构的序列。只要维持Gq结构，则在由鸟嘌呤构成的重复单元彼此之间可以含有鸟嘌呤以外的碱基。一个方式中，Gq序列含有1、2、3或4个连续的由鸟嘌呤构成的重复单元，分别形成1、2、3或4层的Gq。一个方式中，Gq序列含有3个连续的由鸟嘌呤构成的重复单元，形成3层的Gq。将其称为“3层的鸟嘌呤四链体结构”(以下也称为“3Gq”)。一个方式中，本发明的指导RNA含有由形成3Gq的碱基序列构成的区域作为功能性区域，一个方式中，形成3Gq的碱基序列由序列号9所示的碱基序列或在序列号9所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且形成Gq结构的碱基序列构成。

茎环结构也称为发夹结构，在该技术领域中是周知的。作为形成茎环结构的碱基序列，可列举适配体序列(Int.J.Biochem.Mol.Biol.、2013、Vol.4、p.27-40、国际公开第2016/143700号)、来源于BoxB序列的序列、来源于MS2序列的序列、来源于PP7序列的序列(Integr.Biol.、2009、Vol.1、p.499-505、Nucleic Acids Research、2016、Vol.44、p.9555-9564)、人工茎环序列(例如U6盒中所含的人工茎环序列(STL序列)(Gene Ther.、1997、Vol.4、p.45-54、Nat.Biotechnol.、2002、Vol.20、p.505-508、Mol.Ther.、2003、Vol.7、p.237-247))等。一个方式中，本发明的指导RNA含有由形成茎环结构的碱基序列构成的区域作为功能性区域，该由形成茎环结构的碱基序列构成的区域为由来源于BoxB序列的序列构成的区域、由适配体序列构成的区域、由来源于MS2序列的序列构成的区域、由来源于PP7序列的序列构成的区域或由人工茎环序列(例如STL序列)构成的区域、或者它们的任意组合。一个方式中，本发明的指导RNA含有由来源于BoxB序列的序列构成的区域作为功能性区域。一个方式中，本发明的指导RNA含有由STL序列构成的区域作为功能性区域。一个方式中，本发明中使用的由来源于BoxB序列的序列构成的区域由序列号11所示的碱基序列或在序列号11所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3碱基且形成茎环结构的碱基序列构成。

本发明的指导RNA中的、前述2)的由反义区、功能性区域和任选含有的接头序列构成的指导RNA中，功能性区域与反义区连接。本说明书中,“连接”包括直接结合和通过接头结合。一个方式中，本发明的指导RNA中，至少1个功能性区域与反义区直接结合。另一个方式中，本发明的指导RNA中，至少1个功能性区域通过接头与反义区连接。本发明的指导RNA中连接、使用多个功能性区域时，功能性区域之间的连接可以为直接结合或通过接头的连接中的任一者。

使用接头时，一个方式中接头的长度为1～10个碱基，一个方式中为1～6个碱基、一个方式中为1～3个碱基，一个方式中为3～6个碱基，一个方式中为3个碱基，一个方式中为6个碱基。接头的碱基序列可由本领域技术人员基于构成指导RNA的序列适当地设计。例如，本发明中使用的接头的碱基序列可按照不与靶标RNA形成互补链的方式来进行设计。一个方式中，接头由碱基序列“UCU”、作为限制酶SalI位点序列的“GUCGAC”、或作为限制酶XbaI位点序列的“UCUAGA”构成。

作为一个方式，本发明的指导RNA含有由来源于BoxB序列的序列构成的区域作为功能性区域时，可以在由来源于BoxB序列的序列构成的区域与反义区之间使用通过接头的连接，一个方式中，该接头为碱基序列“UCU”。作为一个方式，本发明的指导RNA含有由U6snRNA序列构成的区域和任选含有的由形成茎环结构的碱基序列构成的区域作为功能性区域时，可以通过接头在功能性区域连接反义区，一个方式中，该接头为碱基序列“GUCGAC”或“UCUAGA”。

一个方式中，本发明的指导RNA含有至少1个功能性区域和与含有多聚腺苷酸化信号序列的该靶标RNA的一部分互补且与该靶标RNA形成双链的反义区，至少1个该功能性区域与该反义区连接，实质上不含ADAR募集碱基序列，该指导RNA具有以下特征：

(a-1)指导RNA由由U6 snRNA序列构成的功能性区域、反义区、任选含有的接头和由人工茎环序列构成的区域构成，由U6 snRNA序列构成的功能性区域、反义区和由形成人工茎环序列结构的碱基序列构成的功能性区域按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接；

(a-2)指导RNA由反义区、由形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列构成的功能性区域和任选含有的接头构成，反义区和由形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列构成的功能性区域按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接；或

(a-3)指导RNA由由形成茎环结构的碱基序列构成的功能性区域、反义区和任选含有的接头构成，由形成茎环结构的碱基序列构成的功能性区域和反义区按照该顺序从5’侧向3’侧进行了连接。

前述3)的含有反义区和募集ADAR的区域的指导RNA中，“募集ADAR的区域”是指由能够募集天然存在的或经改造的ADAR的碱基序列构成的区域。一个方式中，能够募集ADAR的碱基序列是指能够在同一分子内形成茎环结构、在该茎环结构上结合ADAR且使该ADAR被募集至靶标RNA的碱基序列。作为能够募集ADAR的碱基序列的例子，可列举基于GluR2的mRNA前体等来源于ADAR底物的茎环结构设计的碱基序列(国际公开第2016/097212号、国际公开第2017/050306号、德国专利第102015012522号、国际公开第2017/010556号、国际公开第2019/111957号、Nucleic Acids Research、2017、Vol.45、p.2797-2808、NatureMethods、2019、Vol.16、p.239-242)。含有募集ADAR的区域的指导RNA是本领域技术人员公知的，可以基于前述文献的记载来制作。

前述4)的含有反义区和募集ADAR与dCas13蛋白的融合蛋白的区域的指导RNA中，dCas13为改造Cas13蛋白，为不具有双链DNA切割活性的改造Cas13蛋白。“募集ADAR与dCas13蛋白的融合蛋白的区域”是指由能够募集天然存在的ADAR或改造ADAR与dCas13蛋白的融合蛋白的碱基序列构成的区域。一个方式中，募集ADAR与dCas13蛋白的融合蛋白的区域为能够募集dCas13的碱基序列。能够募集dCas13的碱基序列为本领域技术人员公知的序列，例如为国际公开第2019/005884号或国际公开第2019/071048号中记载的序列。一个方式中，募集ADAR与dCas13蛋白的融合蛋白的区域为由能够募集dCas13蛋白的碱基序列构成的区域，其序列是本领域技术人员公知的，含有该区域的指导RNA例如可以基于前述文献的记载而制作。

前述5)的含有反义区以及与ADAR与RNA连接蛋白的融合蛋白连接的区域的指导RNA中，“RNA连接蛋白”是指与特定RNA的亲和性高、在细胞内能够维持与该特定RNA连接的状态的蛋白。一个方式中，RNA连接蛋白为MS2包被蛋白(MS2 coat protein：MCP)或λN蛋白。“与ADAR与RNA连接蛋白的融合蛋白连接的区域”为由能够将天然存在的ADAR或改造ADAR与RNA连接蛋白的融合蛋白连接的碱基序列构成的区域。一个方式中，与ADAR与RNA连接蛋白的融合蛋白连接的区域为由与特定RNA连接蛋白的亲和性高、能够维持在细胞内与该融合蛋白连接的状态的RNA序列构成的区域。在RNA连接蛋白为MCP时，与ADAR与RNA连接蛋白的融合蛋白连接的区域为MS2 RNA，RNA连接蛋白为λN蛋白时，与ADAR与RNA连接蛋白的融合蛋白连接的区域为BoxB序列。MCP、MS2 RNA、λN蛋白或BoxB序列均是本领域技术人员公知的序列，为Protein Eng.Des.Sel.、2018、vol.1、p.471-478、国际公开第2018/161032号、Nucleic Acids Research、2016、Vol.44、p.e157、国际公开第2017/050306号、国际公开第2019/07127号中记载的序列。

本发明的指导RNA可以基于序列信息使用该领域中公知的标准多核苷酸合成法来合成。另外，若取得本发明的某一指导RNA，则也可以通过使用定点诱变法(CurrentProtocols in Molecular Biology edition、1987、John Wiley&Sons Section)等本领域技术人员公知的方法向规定位点导入突变而制作维持了向靶标RNA的募集功能和编辑靶标RNA的功能的本发明的指导RNA的改造体。本发明的指导RNA也可以使用进行了修饰的核酸来制造。本发明的指导RNA也可以使用编码本发明的指导RNA的核酸来制作。例如，本发明的指导RNA可以通过由含有编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体转录本发明的指导RNA来制作。

＜本发明中使用的ADAR＞

本发明中使用的ADAR包括天然存在的ADAR、改造ADAR、以及ADAR或改造ADAR与其它因子的融合蛋白。

一个方式中，本发明中使用的ADAR包括天然存在的ADAR，只要具有脱氨酶活性则也包括改造ADAR。脱氨酶活性可通过本领域技术人员公知的方法检测底物的脱氨基化来测定。例如，脱氨酶活性可通过检测腺苷向肌苷的转换来检测。本发明中使用的ADAR在一个方式中为来源于真核生物的ADAR，在一个方式中为来源于哺乳动物的ADAR，在另外一个方式中为人ADAR。本发明中使用的ADAR在一个方式中为ADAR1或ADAR2，在一个方式中为ADAR2。ADAR1包括两种剪接变体ADAR1 p110和ADAR1 p150，本发明中使用的ADAR在一个方式中为ADAR1 p110或ADAR1 p150。本发明中使用的ADAR在一个方式中为人ADAR1或人ADAR2，在一个方式中为人ADAR2。本发明中使用的ADAR在一个方式中为含有双链RNA结合区域(dsRBD：double-stranded-RNA binding domain)且具有脱氨酶活性的多肽(Trends inBiochemical Sciences、2001、Vol.26、p.376-384、RNA、2001、Vol.7、p.846-858)。本发明中使用的ADAR在一个方式中为含有脱氨酶结构域且能够将靶标RNA的腺苷转换为肌苷的多肽。本发明中使用的ADAR可以为ADAR或改造ADAR与其它因子的融合蛋白。

在一个方式中，本发明中使用的ADAR为由登录号[NP_001103.1]、登录号[NP_056648.1]或登录号[NP_001102.3]所示的氨基酸序列构成的多肽、或者由与这些氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列或在这些氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性的多肽。一个方式中，本发明中使用的ADAR为由序列号15所示的氨基酸序列(人ADAR2)构成的多肽、或者由与该序列的一致性为90％以上的氨基酸序列或在该序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列构成且具有腺苷脱氨酶活性的多肽。一个方式中，本发明中使用的ADAR为真核细胞中内源性存在的ADAR，在一个方式中，可以为外源性导入到真核细胞中的ADAR。ADAR向真核细胞的导入既可以直接导入ADAR多肽，也可以导入含有编码ADAR的核酸的表达载体。

本说明书中，“一致性”是指通过EMBOSS NEEDLE程序(J.Mol.Biol.、1970、Vol.48、p.443-453)检索使用以默认准备的参数得到的值Identity。上述参数如下所述。

空位开放罚分(Gap Open penalty)＝10

空位扩展罚分(Gap Extend penalty)＝0.5

矩阵(Matrix)＝EBLOSUM62

一个方式中，本发明中使用的ADAR为天然存在的ADAR或改造ADAR与其它因子的融合蛋白。在此，作为其它因子，在一个方式中可列举dCas13蛋白或RNA连接蛋白。一个方式中，本发明中使用的ADAR为天然存在的ADAR或改造ADAR与dCas13的融合蛋白。该融合蛋白为由本领域技术人员公知的氨基酸序列构成的蛋白，例如为国际公开第2019/005884号或国际公开第2019/071048号中记载的氨基酸序列所构成的蛋白。一个方式中，本发明中使用的ADAR为天然存在的ADAR或改造ADAR与RNA连接蛋白的融合蛋白。一个方式中，本发明中使用的ADAR为天然存在的ADAR或改造ADAR与MCP的融合蛋白、或天然存在的ADAR或改造ADAR与λN蛋白的融合蛋白。该融合蛋白为由本领域技术人员公知的氨基酸序列构成的蛋白，例如为Protein Eng.Des.Sel.、2018、vol.1、p.471-478、国际公开第2018/161032号、NucleicAcids Research、2016、Vol.44、p.e157、国际公开第2017/050306号、国际公开第2019/071274号中记载的氨基酸序列所构成的蛋白。

＜本发明的编辑靶标RNA的系统＞

本发明还提供含有本发明的指导RNA和ADAR的编辑靶标RNA的系统。含有本发明的指导RNA和ADAR的编辑靶标RNA序列的系统包括含有本发明的指导RNA和ADAR的用于编辑靶标RNA序列的试剂盒、或使用本发明的指导RNA和ADAR编辑靶标RNA序列的方法。本发明中，“编辑”是指将靶标RNA序列的碱基转换为其它碱基。本发明的编辑靶标RNA的系统可以在细胞内或细胞外使用。一个方式中，可以在真核细胞内使用该系统。一个方式中，可以在原核细胞内、细菌内、噬菌体内、病毒内等使用该系统。

＜编码本发明的指导RNA的核酸＞

本发明还提供编码本发明的指导RNA的核酸(本项中也称为“本发明的核酸”)。本发明的核酸为编码指导RNA的核酸，所述指导RNA用于利用ADAR编辑靶标RNA、并且含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的该靶标RNA的一部分互补的反义区。

一个方式中，本发明的核酸为编码指导RNA的核酸，所述指导RNA用于利用ADAR编辑靶标RNA，该指导RNA含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区，该多聚腺苷酸化信号序列为由AAUAAA或其改造序列构成的碱基序列。一个方式中，本发明的核酸为编码指导RNA的核酸，所述指导RNA用于利用ADAR编辑靶标RNA，该指导RNA含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区，该多聚腺苷酸化信号序列为由AAUAAA构成的碱基序列。一个方式中，本发明的核酸为编码指导RNA的核酸，所述指导RNA用于利用ADAR编辑靶标RNA，该指导RNA含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区，与该靶标RNA的一部分互补的反义区含有与靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中含有的腺苷形成碱基对的碱基。一个方式中，本发明的核酸为编码指导RNA的核酸，所述指导RNA用于利用ADAR编辑靶标RNA，该指导RNA含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区，该指导RNA募集天然存在的ADAR、改造ADAR、或者ADAR或改造ADAR与其它因子的融合蛋白。

本发明的核酸可以基于本说明书中记载的序列或公众可利用的序列信息使用该领域中公知的标准多核苷酸合成法来合成。另外，若取得某一本发明的核酸，则也可以通过使用定点诱变法(Current Protocols in Molecular Biology edition、1987、JohnWiley&Sons Section)等本领域技术人员公知的方法向规定位点导入突变而制作其它本发明的核酸。

＜含有编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体＞

本发明还提供含有编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体(也称为“本发明的表达载体”)。本发明的表达载体还提供含有编码本发明的指导RNA的核酸和编码ADAR的核酸的表达载体。编码本发明的指导RNA的核酸和编码ADAR的核酸可以搭载于同一表达载体，也可以搭载于不同的表达载体。一个方式中，本发明的表达载体为含有编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体和含有编码ADAR的核酸的表达载体的组合。一个方式中，本发明的表达载体为含有编码本发明的指导RNA的核酸和编码ADAR的核酸的表达载体。

1.本发明中使用的表达载体

作为本发明中使用的表达载体，只要是能够由编码本发明的指导RNA的核酸表达本发明的指导RNA的表达载体和/或能够表达ADAR的表达载体就没有特别限制。一个方式中，本发明中使用的表达载体为能够用于在人细胞中表达本发明的指导RNA和/或能够用于表达ADAR的表达载体。一个方式中，作为本发明中使用的表达载体的例子，可列举质粒载体、病毒载体(例如腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体)等。

2.启动子

本发明的表达载体可含有以可工作方式连接于编码本发明的指导RNA的核酸和/或编码ADAR的核酸的启动子。本说明书中，“以可工作方式连接”是指：至少1个启动子以能够在宿主细胞中表达核酸所编码的多肽或RNA的方式连接于核酸。作为本发明的表达载体中所含的启动子，没有特别限定，可使用与适合于表达编码本发明的指导RNA或ADAR的核酸的RNA聚合酶(例如RNA聚合酶II(polII)、RNA聚合酶III(polIII))对应的启动子。为了表达本发明的指导RNA，作为一个方式，可使用与polII或polIII对应的启动子，作为另一方式，可使用与polIII对应的启动子。为了表达ADAR，作为一个方式，可使用与polII对应的启动子。

作为与polII对应的启动子，可列举例如来源于CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)的启动子、SV40(simian virus 40，猴病毒40)启动子、RSV(respiratorysyncytialvirus，呼吸道合胞病毒)启动子、EF1α(Elongation factor 1α，延伸因子1α)启动子、CAG(CMV enhancer，chicken beta-Actin promoter，CMV增强子,鸡β-肌动蛋白)启动子、U1 snRNA启动子、U7 snRNA启动子等。作为与polIII对应的启动子，可列举例如人U6snRNA启动子(U6)(Nat.Biotechnol.、2002、vol.20、p.497-500)、高灵敏度U6启动子(Nucleic Acids Research、2003、vol.31、p.e100)、人H1启动子、5S rRNA启动子以及本领域技术人员公知的其它的病毒和真核细胞启动子，但是不限于这些。

本发明的表达载体可根据所使用的启动子、宿主细胞等还含有翻译起始密码子、翻译终止密码子、polIII的转录起始点所优选的嘌呤碱基(G或A)、polyA信号、用于polIII的连续T的终止子序列、增强子、非翻译区、剪接接合部等。

＜本发明的宿主细胞＞

本发明还提供通过导入编码本发明的指导RNA的核酸而进行了转化的宿主细胞(也称为“本发明的宿主细胞”)。一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了本发明的表达载体的宿主细胞。一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了作为质粒载体的本发明的表达载体的宿主细胞。一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了用于制造作为病毒载体的本发明的表达载体的质粒载体的宿主细胞。一个方式中，本发明的宿主细胞为被导入了作为病毒载体的本发明的表达载体的宿主细胞。

作为被导入本发明的表达载体的宿主细胞，没有特别限定，只要是可用于本发明的表达载体的产生的细胞则可以选择该领域中公知的细胞。作为在载体的复制中能够使用的宿主细胞，可列举例如本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞。作为在载体的复制中能够使用的宿主细胞，可列举例如动物细胞(例如CHO细胞、HEK293细胞等)、昆虫细胞(例如Sf9等)、细菌(大肠杆菌等)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)等)。作为一个方式，可以使用大肠杆菌作为宿主细胞。转化可以通过本领域技术人员公知的方法来实施(Green、M.R.and Sambrook、J.、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、4th Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2012)。

＜制造本发明的表达载体的方法＞

制造本发明的表达载体的方法包括制造核酸的方法，其包括培养被导入了含有本发明的核酸的表达载体的宿主细胞的步骤。一个方式中，制造本发明的表达载体的方法包括培养被导入了本发明的表达载体的宿主细胞并复制本发明的表达载体的步骤。本发明的表达载体为病毒载体时，制造本发明的表达载体的方法包括培养被导入了含有本发明的核酸的病毒载体质粒的宿主细胞、并纯化在宿主细胞内制作的病毒载体的步骤。病毒载体可利用本领域技术人员公知的方法来制作。

制造本发明的表达载体的方法可包括回收宿主细胞的培养液、得到裂解物(溶菌液)的步骤。裂解物例如可通过用碱溶解法或煮沸法对回收的培养液进行处理而得到。制造本发明的表达载体的方法可进一步包括从裂解物中纯化表达载体的步骤。从裂解物中纯化表达载体时，可使用离子交换色谱和/或疏水相互作用色谱。在本发明的表达载体为病毒载体的情况下，从裂解物中纯化病毒载体时，也可使用氯化铯密度梯度离心分离法、蔗糖梯度离心分离法、碘克沙醇(Iodixanol)密度梯度离心分离法、超滤法、渗滤法、亲和色谱法、离子交换色谱法、聚乙二醇沉淀法、硫酸铵沉淀法等。

＜本发明的药物组合物＞

本发明还提供含有本发明的指导RNA、编码本发明的指导RNA的核酸(本项中也称为“本发明的核酸”)或本发明的表达载体、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物(也称为“本发明的药物组合物”)。一个方式中，本发明的药物组合物为含有本发明的指导RNA和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一个方式中，本发明的药物组合物为含有本发明的指导RNA、ADAR和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一个方式中，本发明的药物组合物为含有本发明的核酸和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一个方式中，本发明的药物组合物为含有本发明的核酸、ADAR和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一个方式中，本发明的药物组合物为含有编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一个方式中，本发明的药物组合物为包含含有本发明的核酸和编码ADAR的核酸的表达载体、以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一个方式中，本发明的药物组合物为包含含有编码本发明的指导RNA的核酸的表达载体、含有编码ADAR的核酸的载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

本发明的药物组合物可以使用该领域中通常使用的赋形剂、即药剂用赋形剂、药剂用载体等利用通常使用的方法来制备。作为这些药物组合物的剂型的例子，可列举例如注射剂、点滴用剂等非经口剂，可以通过静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药等进行给药。在制剂化时，可以以药学上可接受的范围使用与这些剂型对应的赋形剂、载体、添加剂等。

本发明的指导RNA、本发明的核酸或本发明的表达载体、含有编码ADAR的核酸的表达载体或ADAR的给药量根据患者的症状程度、年龄、使用的制剂的剂型等而不同，例如可以设为0.001mg/kg～100mg/kg范围的给药量。

关于能够用本发明的药物组合物预防或治疗的疾病，作为一个方式，为通过编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中的1个以上腺苷而靶标RNA的转录控制带来有益变化的任意疾病。本发明的药物组合物可以作为通过编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中的1个以上腺苷而靶标RNA的转录控制带来有益变化的任意疾病的预防或治疗剂使用。

本发明包括：用于预防或治疗通过编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中的1个以上腺苷而靶标RNA的转录控制带来有益变化的任意疾病的药物组合物，其含有本发明的指导RNA、本发明的核酸、或本发明的表达载体。另外，本发明包括：预防或治疗通过编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中的1个以上腺苷而靶标RNA的转录控制带来有益变化的任意疾病的方法，其包括给药预防有效量或治疗有效量的本发明的指导RNA、本发明的核酸、或本发明的表达载体的步骤。另外，本发明包括：用于预防或治疗通过编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中的1个以上腺苷而靶标RNA的转录控制带来有益变化的任意疾病的、本发明的指导RNA、本发明的核酸、或本发明的表达载体。另外，本发明包括：本发明的指导RNA、本发明的核酸、或本发明的表达载体在制造用于预防或治疗通过编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中的1个以上腺苷而靶标RNA的转录控制带来有益变化的任意疾病的药物组合物中的应用。

＜本发明的编辑靶标RNA的方法＞

本发明还提供使用本发明的指导RNA的、编辑靶标RNA的方法(也称为“本发明的编辑方法”)。一个方式中，本发明的编辑方法包括下述方法：本发明的指导RNA的反义区与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分形成双链，ADAR被募集至本发明的指导RNA，所募集的ADAR将靶标RNA序列的多聚腺苷酸化信号序列的腺苷转换为肌苷。在此，要转换为肌苷的、靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列上的腺苷可以与反义区形成错配碱基对。

本发明的编辑方法包括(i)将本发明的指导RNA、编码本发明的指导RNA的核酸、或本发明的表达载体导入到具有靶标RNA的细胞或感染了具有靶标RNA的细胞的病毒等中的步骤。一个方式中，本发明的编辑方法还包括(ii)将ADAR、编码ADAR的核酸、或含有编码ADAR的核酸的表达载体导入到该细胞或感染了该细胞的病毒中等的步骤。步骤(i)和(ii)可以同时进行也可以分开进行。一个方式中，进行导入的细胞为真核细胞或原核生物等，一个方式中，该细胞为哺乳动物细胞或细菌等。一个方式中，感染了进行导入的细胞的病毒包括噬菌体。一个方式中，靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列的腺苷被转换为肌苷。

实施例

在没有特别声明的情况下，以下的实施例中记载的步骤可按照公知方法来实施。另外，只要没有特别声明则使用市售的试剂盒或试剂等的部分按照所附带的规程来进行实验。

＜实施例1制作含有反义区和功能性区域(U6 snRNA序列和STL序列)的指导RNA表达质粒＞

构建将pSUPER.neo载体(Oligoengine公司、产品目录编号VEC-PBS-0004)的H1RNA聚合酶III启动子(以下称为“H1启动子”)置换为人U6 RNA聚合酶III(hU6)启动子序列(序列号1)的载体(以下称为“pSUPER.neo-U6载体”)。关于含有hU6启动子序列的片段，以具有hU6启动子的pBAsi-hU6 Neo DNA(宝生物公司、产品目录编号3227)为模板，以在5’侧添加EcoRI限制酶位点且在3’侧添加BglII限制酶位点的方式使用Tks Gflex^TM DNA聚合酶(宝生物公司、产品目录编号R060A)利用标准PCR法进行扩增。将得到的hU6启动子片段使用限制酶EcoRI位点(5’侧)和BglII位点(3’侧)插入到pSUPER.neo载体中。用构建的pSUPER.neo-U6载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物公司、产品目录编号9057、以下称为“DH5α大肠杆菌株”)，进行液体培养。将培养液离心，回收菌体，用NucleoBond(注册商标)Xtra Midi Plus EF(宝生物公司、产品目录编号U0422B)进行质粒提取纯化，由此扩增pSUPER.neo-U6载体。

如下所述地构建添加了反义区和功能性区域U6 snRNA序列(以下有时称为“U6”)的指导RNA的表达质粒。在pSUPER.neo-U6载体的hU6启动子下游，使用限制酶BglII位点(5’侧)和HindIII位点(3’侧)插入编码作为指导RNA的U6-ASR-STL的DNA序列(序列号2)。在制作要插入的DNA序列时，使用使以形成限制酶切断末端的方式合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(下述)进行退火的方法。

正向寡核苷酸：编码5’-GATC-指导RNA的DNA序列-3’

反向寡核苷酸：编码5’-AGCTT-指导RNA的DNA序列的反向互补序列-3’

所插入的DNA序列中，在5’侧含有polIII的转录起始点所优选的嘌呤碱基(G或A)，在3’侧含有polIII的终止子序列。将制作的指导RNA表达质粒称为pSUPERneo_U6_gRNA。在此，ASR为与psiCHECK-2载体(普洛麦格公司、产品目录编号C8021)的海肾荧光素酶(Renilla Luciferase：Rluc)mRNA的后部所附带的人工PAS序列(NCBI登录号AY535007.1的1688～1736)中存在的含有AATAAA(PAS)的部分互补的、由33个碱基构成的反义碱基序列，由序列号2所示的DNA序列中第35位碱基至第67位碱基的序列所编码的RNA序列(也称为ASR)构成。U6由序列号3所示的RNA序列构成，编码U6的核酸由序列号4所示的DNA序列构成。STL由序列号5所示的RNA序列构成，编码STL的核酸由序列号6所示的DNA序列构成。

将本指导RNA的概要示于表1。对于构建的pSUPERneo_U6_gRNA质粒，使用DH5α大肠杆菌株(宝生物公司、产品目录编号9057)与上述同样地扩增。

＜实施例2制作含有反义区和功能性区域(Gq序列或来源于BoxB序列的序列)的指导RNA表达质粒＞

如下所述地制作含有反义区和功能性区域(Gq序列或来源于BoxB序列的序列)的指导RNA的表达质粒。在pSUPER.neo载体的H1启动子下游，使用限制酶BglII(5’末端侧)和HindIII(3’末端侧)分别插入编码作为指导RNA的ASR-Gq或BoxB-ASR的DNA序列(分别为序列号7和序列号8)。插入的编码指导RNA的DNA序列中，在5’末端侧含有polIII的转录起始点所优选的嘌呤碱基(G或A)，在3’末端侧含有polIII的终止子序列。Gq序列(以下也称为Gq)由序列号9所示的RNA序列构成，编码Gq的核酸由序列号10所示的DNA序列构成。来源于BoxB序列的序列(以下也称为BoxB)由序列号11所示的RNA序列构成，编码BoxB的核酸由序列号12所示的DNA序列构成。使用与实施例1同样的方法制作所插入的DNA序列。将得到的指导RNA表达质粒统称为pSUPERneo_H1_gRNA。使用DH5α大肠杆菌株通过与实施例1同样的方法将构建的质粒扩增。关于比较对照所使用的指导RNA(称为BoxB-Con)的表达质粒，使用在编码靶向SV40PAS序列的ASR序列(序列号13所示的DNA序列的第30位碱基至第64位碱基的序列所编码的RNA序列。也称为Con-ASR)的DNA序列中添加有编码BoxB的DNA序列的DNA序列(序列号13)，通过与上述同样的方法制作。插入的DNA序列中，在5’侧含有polIII的转录起始点所优选的嘌呤碱基(G或A)，在3’侧含有polIII的终止子序列。

将实施例1和2中制作的各指导RNA和编码其的DNA序列的概要示于表1。表1中，“5’末端”表示添加于ASR的5’末端侧的功能性碱基序列，“3’末端”表示添加于ASR的3’末端侧的功能性序列。“接头”表示连接ASR与各功能性碱基序列的序列。

[表1]

＜实施例3制作用于检测细胞内靶标RNA的编辑活性的表达质粒＞

通过以下方法制作作为用于检测细胞内的靶标RNA的编辑活性的质粒使用的、搭载有Rluc基因的psiCHECK-2_Rluc-bGHpolyA载体。在psiCHECK-2载体所搭载的Rluc基因PAS序列的3’末端侧整合有人工PAS序列的牛生长激素(bovine Growth Hormone，以下记作bGH)PAS序列。人工合成在5’末端侧添加有限制酶NotI位点且在3’末端侧添加有SacII位点的DNA序列(序列号14)，将其使用NotI和SacII插入。将构建的载体称为psiCHECK-2_Rluc-bGHpolyA载体，将该载体使用DH5α大肠杆菌株通过与实施例1同样的方法进行扩增。

＜实施例4作为RNA编辑酶的ADAR2表达质粒的制作＞

作为ADAR2表达质粒的pAAV-CMV-ADAR2质粒如下制作：在pAAV-CMV载体(宝生物公司、产品目录编号6230)的CMV来源启动子下游，使用限制酶EcoRI(5’末端侧)和BglII(3’末端侧)插入编码ADAR2(序列号15)的DNA序列(序列号16)，从而制作。序列号16中，在翻译起始密码子上游含有Kozak序列(序列号16的第13位碱基至第15位碱基的“ACC”)，在ADAR2基因下游含有终止密码子。构建的pAAV-CMV-ADAR2质粒使用DH5α大肠杆菌株通过与实施例1同样的方法进行扩增。

＜实施例5转染和桑格测序＞

将人胎肾来源细胞株HEK293细胞悬浮于添加了5％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM，高糖，GlutaMAXtm补充剂，丙酮酸盐；ThermoFisher Scientific公司、产品目录编号10569-010)，以2.0×10⁴个细胞/100μL播种于96孔板，在5％CO₂存在下在37℃的条件下培养一晚。

将下述(1)～(4)分别以1：40：30：9的重量比以总量100ng/孔的方式混合，使用Lipofectamine ^TM3000转染试剂(ThermoFisher Scientific公司、产品目录编号L3000015)转染于播种后培养一晚而得的HEK293细胞。

(1)实施例3中制作的用于检测细胞内靶标RNA编辑活性的表达质粒(psiCHECK-2_Rluc-bGHpolyA载体)

(2)实施例4中制作的ADAR2表达质粒(pAAV-CMV-ADAR2)或作为用于校正转染量的质粒的pBluescript II KS(-)噬菌粒试剂盒(安捷伦科技公司、产品目录编号212208)(也称为pBSKS)

(3)实施例1和2中制作的指导RNA表达质粒(pSUPERneo_U6_gRNA和pSUPERneo_H1_gRNA)、和

(4)作为载体质粒的pHelper Vector(宝生物公司、产品目录编号6230)。

转染后，将细胞在5％CO₂存在下、37℃的条件下培养3天后回收细胞，供于实施例6中记载的基于桑格测序的RNA编辑效率的研究。

回收经转染的细胞，从细胞中，使用QIAshredder(QIAGEN公司、产品目录编号79656)、RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司、产品目录编号74106)、无RNase的DNase套装(RNase-free DNase Set)(QIAGEN公司、产品目录编号79254)，按照附带规程提取总RNA并纯化。对于得到的RNA，使用SuperScript(注册商标)VILO^TM cDNA合成试剂盒(ThermoFisherScientific公司、产品目录编号11754-250)按照附带规程进行逆转录反应，得到cDNA。以cDNA为模板，使用用于扩增含有编辑点的片段的下述引物和PrimeSTAR(注册商标)GXL DNA聚合酶(宝生物公司、产品目录编号R050A)，按照附带规程进行PCR反应。将表2的实验中使用的引物记载于以下。

正向引物：AGCGGGAATGGCTCATATCG(序列号17)

反向引物：GGCACCTTCCAGGGTCAAG(序列号18)

测序引物：GGAGAAGGGCGAGGTTAGAC(序列号19)

PCR扩增片段使用ExoSAP-IT^TM Express PCR清除剂(Thermofisher Scientific公司、产品目录编号75001.200.UL)按照附带规程进行纯化，与测序引物一起供于利用3730xl(エックスエル)DNA分析仪(Applied Biosystems公司)的桑格测序反应。

将转染实验中得到的结果中作为代表性的编辑位置的AATAAA的序列的第4位碱基A的位置的编辑效率示于表2。

表中的ADAR2的列示出ADAR2表达质粒的转染的有无，ADAR2+表示添加了pAAV-CMV-ADAR2的细胞(以下也称为“ADAR2+细胞”)，ADAR2-表示添加了pBSKS的细胞(以下也称为“ADAR2-细胞”)。RNA编辑率(％)的列示出利用QSVanalyzer软件(Bioinformatics、2009、Vol.25、p3244-3250)对桑格测序反应中得到的波形数据文件(后缀：.ab1)进行分析而得的、鸟嘌呤(G)的信号强度的比例(G/(G+A)×100)。

[表2]

如表2所示，对于作为比较对照用指导RNA的BoxB-Con而言，不论有无ADAR的转染，RNA编辑率都大致恒定(2.5vs 2.3)。对于作为在靶向PAS序列的反义区中添加有功能性序列的指导RNA的BoxB-ASR、ASR-Gq和U6-ASR-STL而言，在ADAR2的转染条件下观察到RNA编辑率的上升。

＜实施例6通过转染和定量PCR研究靶标RNA的mRNA量＞

将psiCHECK-2载体、实施例4中制作的ADAR2表达质粒(pAAV-CMV-ADAR2)、实施例1和2中制作的指导RNA表达质粒(pSUPERneo_U6_gRNA、pSUPERneo_H1_gRNA)、以及载体质粒pHelper Vector分别以1：40：30：9的重量比以总量100ng/孔的方式混合。使用Lipofectamine ^TM3000转染试剂转染于播种后培养一晚而得的HEK293细胞。转染后，在5％CO₂存在下、在37℃的条件下培养3天后，回收细胞，供于定量PCR的研究。由经转染的细胞，使用TaqMan(注册商标)基因表达Cells-to-CT^TM试剂盒(ThermoFisher Scientific公司、产品目录编号AM1728)进行定量PCR。将细胞用PBS洗涤后，使用将裂解缓冲液和DNaseI混合而得的溶液50μl，制作细胞溶解液，使用制作的细胞溶解液22.5μl，按照规程合成cDNA。之后，使用人18S(ThermoFisher Scientific公司、产品目录编号Hs999999901_s1)或下述所示的Rluc的引物和探针进行定量PCR。

Rluc的正向引物：CTTCTTAGCTCCCTCGACAATAG(序列号20)

Rluc的反向引物：TCCAGATTGTCCGCAACTAC(序列号21)

Rluc的探针：CCAGCGACGATCTGCCTAAGATGTT(序列号22)

使用Delta-Delta Ct法进行分析。将管家基因18S作为内源性对照用于样品间的校正。图1的纵轴为ADAR2表达下的相对表达量，将独立2次试验的试验结果用各自的图来示出。由图1确认到，与作为比较对照用指导RNA的BoxB-Con相比，在靶向PAS序列的ASR区域添加有功能性序列的指导RNA的情况下，作为靶标的Rluc的mRNA的表达比率下降。

产业上的可利用性

本发明的指导RNA、编码本发明的指导RNA的核酸、和含有本发明的表达载体的药物组合物对于抑制靶标RNA的表达有用。

序列表自由文本

以下序列表中的数字标题＜223＞中记载“人工序列”的说明。序列号1-2、4、6-8、10、12-14和16-22为合成DNA序列，序列号3、5、9和11为合成RNA序列，序列号15为蛋白质序列。

序列表

<110> 安斯泰来制药株式会社

<120> 用于编辑靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列的指导RNA

<130> A21020A00

<150> JP 2020-216787

<151> 2020-12-25

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 241

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hU6

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

c 241

<210> 2

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U6-ASR-STL

<400> 2

ggtgctcgct tcggcagcac atatactagt cgaccagatg taatgaaaat aaagatattt 60

tatcgcgtct agagcggact tcggtccgct ttttt 95

<210> 3

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U6的RNA

<400> 3

gugcucgcuu cggcagcaca uauacua 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U6的DNA

<400> 4

gtgctcgctt cggcagcaca tatacta 27

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STL的RNA

<400> 5

gcggacuucg guccgcuuuu 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STL的DNA

<400> 6

gcggacttcg gtccgctttt 20

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASR-Gq

<400> 7

gggcagatgt aatgaaaata aagatatttt atcgcggggt ttgggtttgg gtttgggttt 60

tttttt 66

<210> 8

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BoxB-ASR

<400> 8

gggagagggc cctgaagagg gcccttttct cagatgtaat gaaaataaag atattttatc 60

gcgttttttt 70

<210> 9

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gq的RNA

<400> 9

ggguuugggu uuggguuugg guuu 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gq的DNA

<400> 10

gggtttgggt ttgggtttgg gttt 24

<210> 11

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BoxB的RNA

<400> 11

agagggcccu gaagagggcc cuuu 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BoxB的DNA

<400> 12

agagggccct gaagagggcc cttt 24

<210> 13

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照的DNA

<400> 13

gggagagggc cctgaagagg gcccttttct gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat 60

cgcatttttt t 71

<210> 14

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

gcggccgctg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgctg tgccttctag 60

ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 120

tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 180

ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 240

caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggtgttggtt ttttgtgtga ggatctaaat 300

gagtcttcgg acctcgcggg ggccgcttaa gcggtggtta gggtttgtct gacgcggggg 360

gagggggaag gaacgaaaca ctctcattcg gaggcggctc ggggtttggt cttggtggcc 420

acgggcacgc agaagagcgc cgcgatcctc ttaagcaccc ccccgccctc cgtggaggcg 480

ggggtttggt cggcgggtgg taactggcgg gccgctgact cgggcgggtc gcgcgcccca 540

gagtgtgacc ttttcggtct gctcgcagac ccccgggcgg cgccgccgcg g 591

<210> 15

<211> 701

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hADAR的氨基酸

<400> 15

Met Asp Ile Glu Asp Glu Glu Asn Met Ser Ser Ser Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Lys Glu Asn Arg Asn Leu Asp Asn Val Ser Pro Lys Asp Gly Ser Thr

20 25 30

Pro Gly Pro Gly Glu Gly Ser Gln Leu Ser Asn Gly Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Pro Gly Arg Lys Arg Pro Leu Glu Glu Gly Ser Asn Gly His Ser Lys

50 55 60

Tyr Arg Leu Lys Lys Arg Arg Lys Thr Pro Gly Pro Val Leu Pro Lys

65 70 75 80

Asn Ala Leu Met Gln Leu Asn Glu Ile Lys Pro Gly Leu Gln Tyr Thr

85 90 95

Leu Leu Ser Gln Thr Gly Pro Val His Ala Pro Leu Phe Val Met Ser

100 105 110

Val Glu Val Asn Gly Gln Val Phe Glu Gly Ser Gly Pro Thr Lys Lys

115 120 125

Lys Ala Lys Leu His Ala Ala Glu Lys Ala Leu Arg Ser Phe Val Gln

130 135 140

Phe Pro Asn Ala Ser Glu Ala His Leu Ala Met Gly Arg Thr Leu Ser

145 150 155 160

Val Asn Thr Asp Phe Thr Ser Asp Gln Ala Asp Phe Pro Asp Thr Leu

165 170 175

Phe Asn Gly Phe Glu Thr Pro Asp Lys Ala Glu Pro Pro Phe Tyr Val

180 185 190

Gly Ser Asn Gly Asp Asp Ser Phe Ser Ser Ser Gly Asp Leu Ser Leu

195 200 205

Ser Ala Ser Pro Val Pro Ala Ser Leu Ala Gln Pro Pro Leu Pro Val

210 215 220

Leu Pro Pro Phe Pro Pro Pro Ser Gly Lys Asn Pro Val Met Ile Leu

225 230 235 240

Asn Glu Leu Arg Pro Gly Leu Lys Tyr Asp Phe Leu Ser Glu Ser Gly

245 250 255

Glu Ser His Ala Lys Ser Phe Val Met Ser Val Val Val Asp Gly Gln

260 265 270

Phe Phe Glu Gly Ser Gly Arg Asn Lys Lys Leu Ala Lys Ala Arg Ala

275 280 285

Ala Gln Ser Ala Leu Ala Ala Ile Phe Asn Leu His Leu Asp Gln Thr

290 295 300

Pro Ser Arg Gln Pro Ile Pro Ser Glu Gly Leu Gln Leu His Leu Pro

305 310 315 320

Gln Val Leu Ala Asp Ala Val Ser Arg Leu Val Leu Gly Lys Phe Gly

325 330 335

Asp Leu Thr Asp Asn Phe Ser Ser Pro His Ala Arg Arg Lys Val Leu

340 345 350

Ala Gly Val Val Met Thr Thr Gly Thr Asp Val Lys Asp Ala Lys Val

355 360 365

Ile Ser Val Ser Thr Gly Thr Lys Cys Ile Asn Gly Glu Tyr Met Ser

370 375 380

Asp Arg Gly Leu Ala Leu Asn Asp Cys His Ala Glu Ile Ile Ser Arg

385 390 395 400

Arg Ser Leu Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Gln Leu Glu Leu Tyr Leu Asn

405 410 415

Asn Lys Asp Asp Gln Lys Arg Ser Ile Phe Gln Lys Ser Glu Arg Gly

420 425 430

Gly Phe Arg Leu Lys Glu Asn Val Gln Phe His Leu Tyr Ile Ser Thr

435 440 445

Ser Pro Cys Gly Asp Ala Arg Ile Phe Ser Pro His Glu Pro Ile Leu

450 455 460

Glu Glu Pro Ala Asp Arg His Pro Asn Arg Lys Ala Arg Gly Gln Leu

465 470 475 480

Arg Thr Lys Ile Glu Ser Gly Glu Gly Thr Ile Pro Val Arg Ser Asn

485 490 495

Ala Ser Ile Gln Thr Trp Asp Gly Val Leu Gln Gly Glu Arg Leu Leu

500 505 510

Thr Met Ser Cys Ser Asp Lys Ile Ala Arg Trp Asn Val Val Gly Ile

515 520 525

Gln Gly Ser Leu Leu Ser Ile Phe Val Glu Pro Ile Tyr Phe Ser Ser

530 535 540

Ile Ile Leu Gly Ser Leu Tyr His Gly Asp His Leu Ser Arg Ala Met

545 550 555 560

Tyr Gln Arg Ile Ser Asn Ile Glu Asp Leu Pro Pro Leu Tyr Thr Leu

565 570 575

Asn Lys Pro Leu Leu Ser Gly Ile Ser Asn Ala Glu Ala Arg Gln Pro

580 585 590

Gly Lys Ala Pro Asn Phe Ser Val Asn Trp Thr Val Gly Asp Ser Ala

595 600 605

Ile Glu Val Ile Asn Ala Thr Thr Gly Lys Asp Glu Leu Gly Arg Ala

610 615 620

Ser Arg Leu Cys Lys His Ala Leu Tyr Cys Arg Trp Met Arg Val His

625 630 635 640

Gly Lys Val Pro Ser His Leu Leu Arg Ser Lys Ile Thr Lys Pro Asn

645 650 655

Val Tyr His Glu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Glu Tyr Gln Ala Ala Lys

660 665 670

Ala Arg Leu Phe Thr Ala Phe Ile Lys Ala Gly Leu Gly Ala Trp Val

675 680 685

Glu Lys Pro Thr Glu Gln Asp Gln Phe Ser Leu Thr Pro

690 695 700

<210> 16

<211> 2127

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hADAR2的DNA

<400> 16

gaattcgccg ccaccatgga tatagaagat gaagaaaaca tgagttccag cagcactgat 60

gtgaaggaaa accgcaatct ggacaacgtg tcccccaagg atggcagcac acctgggcct 120

ggcgagggct ctcagctctc caatgggggt ggtggtggcc ccggcagaaa gcggcccctg 180

gaggagggca gcaatggcca ctccaagtac cgcctgaaga aaaggaggaa aacaccaggg 240

cccgtcctcc ccaagaacgc cctgatgcag ctgaatgaga tcaagcctgg tttgcagtac 300

acactcctgt cccagactgg gcccgtgcac gcgcctttgt ttgtcatgtc tgtggaggtg 360

aatggccagg tttttgaggg ctctggtccc acaaagaaaa aggcaaaact ccatgctgct 420

gagaaggcct tgaggtcttt cgttcagttt cctaatgcct ctgaggccca cctggccatg 480

gggaggaccc tgtctgtcaa cacggacttc acatctgacc aggccgactt ccctgacacg 540

ctcttcaatg gttttgaaac tcctgacaag gcggagcctc ccttttacgt gggctccaat 600

ggggatgact ccttcagttc cagcggggac ctcagcttgt ctgcttcccc ggtgcctgcc 660

agcctagccc agcctcctct ccctgtctta ccaccattcc cacccccgag tgggaagaat 720

cccgtgatga tcttgaacga actgcgccca ggactcaagt atgactttct ctccgagagc 780

ggggagagcc atgccaagag cttcgtcatg tctgtggtcg tggatggtca gttctttgaa 840

ggctcgggga gaaacaagaa gcttgccaag gcccgggctg cgcagtctgc cctggccgcc 900

atttttaact tgcacttgga tcagacgcca tctcgccagc ctattcccag tgagggtctt 960

cagctgcatt taccgcaggt tttagctgac gctgtctcac gcctggtcct gggtaagttt 1020

ggtgacctga ccgacaactt ctcctcccct cacgctcgca gaaaagtgct ggctggagtc 1080

gtcatgacaa caggcacaga tgttaaagat gccaaggtga taagtgtttc tacaggaaca 1140

aaatgtatta atggtgaata catgagtgat cgtggccttg cattaaatga ctgccatgca 1200

gaaataatat ctcggagatc cttgctcaga tttctttata cacaacttga gctttactta 1260

aataacaaag atgatcaaaa aagatccatc tttcagaaat cagagcgagg ggggtttagg 1320

ctgaaggaga atgtccagtt tcatctgtac atcagcacct ctccctgtgg agatgccaga 1380

atcttctcac cacatgagcc aatcctggaa gaaccagcag atagacaccc aaatcgtaaa 1440

gcaagaggac agctacggac caaaatagag tctggtgagg ggacgattcc agtgcgctcc 1500

aatgcgagca tccaaacgtg ggacggggtg ctgcaagggg agcggctgct caccatgtcc 1560

tgcagtgaca agattgcacg ctggaacgtg gtgggcatcc agggatccct gctcagcatt 1620

ttcgtggagc ccatttactt ctcgagcatc atcctgggca gcctttacca cggggaccac 1680

ctttccaggg ccatgtacca gcggatctcc aacatagagg acctgccacc tctctacacc 1740

ctcaacaagc ctttgctcag tggcatcagc aatgcagaag cacggcagcc agggaaggcc 1800

cccaacttca gtgtcaactg gacggtaggc gactccgcta ttgaggtcat caacgccacg 1860

actgggaagg atgagctggg ccgcgcgtcc cgcctgtgta agcacgcgtt gtactgtcgc 1920

tggatgcgtg tgcacggcaa ggttccctcc cacttactac gctccaagat taccaagccc 1980

aacgtgtacc atgagtccaa gctggcggca aaggagtacc aggccgccaa ggcgcgtctg 2040

ttcacagcct tcatcaaggc ggggctgggg gcctgggtgg agaagcccac cgagcaggac 2100

cagttctcac tcacgccctg aagatcc 2127

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 17

agcgggaatg gctcatatcg 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 18

ggcaccttcc agggtcaag 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 19

ggagaagggc gaggttagac 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物(Rluc)

<400> 20

cttcttagct ccctcgacaa tag 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物(Rluc)

<400> 21

tccagattgt ccgcaactac 20

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 22

ccagcgacga tctgcctaag atgtt 25

Claims

1.一种指导RNA，其是用于利用ADAR编辑靶标RNA的指导RNA，其中，该指导RNA含有与含有多聚腺苷酸化信号序列的靶标RNA的一部分互补的反义区。

2.根据权利要求1所述的指导RNA，其中，多聚腺苷酸化信号序列为由AAUAAA构成的碱基序列或由其改造序列构成的碱基序列。

3.根据权利要求2所述的指导RNA，其中，多聚腺苷酸化信号序列为由AAUAAA构成的碱基序列。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的指导RNA，其中，与靶标RNA的一部分互补的反义区含有与靶标RNA的多聚腺苷酸化信号序列中含有的腺苷形成碱基对的碱基。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的指导RNA，其中，ADAR为天然存在的ADAR、改造ADAR、或者ADAR或改造ADAR与其它因子的融合蛋白。

6.一种编辑靶标RNA的系统，其含有权利要求1～5中任一项所述的指导RNA和ADAR。

7.一种核酸，其编码权利要求1～5中任一项所述的指导RNA。

8.一种表达载体，其含有编码权利要求1～5中任一项所述的指导RNA的核酸。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其还含有编码ADAR的核酸。

10.一种宿主细胞，其被导入了权利要求8或9所述的表达载体。

11.一种制造表达载体的方法，其包括培养权利要求10所述的宿主细胞的步骤。

12.一种药物组合物，其含有权利要求8或9所述的表达载体和药学上可接受的赋形剂。

13.一种药物组合物，其含有权利要求8或9所述的表达载体、含有编码ADAR的核酸的表达载体和药学上可接受的赋形剂。

14.一种编辑靶标RNA的方法，其包括将编码权利要求1～5中任一项所述的指导RNA的核酸导入到细胞或感染了细胞的病毒中的步骤。