TW202136508A - 用於編輯目標rna之附加有功能性領域之反義型嚮導rna - Google Patents

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森家由香里
萬田茉莉子
後藤貴康
新井理智
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Abstract

本發明提供一種用於藉由ADAR編輯目標RNA之反義型嚮導RNA。 本發明之嚮導RNA係用於藉由ADAR編輯目標RNA之反義型嚮導RNA，且包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，上述嚮導RNA實質上不含ADAR募集鹼基序列。

Description

用於編輯目標RNA之附加有功能性領域之反義型嚮導RNA
本發明係關於一種用於誘導ADAR而進行目標RNA編輯之嚮導RNA、尤其是附加有功能性領域之反義型嚮導RNA。
於生物體內存在利用一鹼基突變之RNA編輯機制。尤其是藉由腺苷之去胺基化而轉化為肌苷之自A向I之RNA編輯最為多見，目標之RNA之數量亦高達400萬。作為以雙鏈RNA作為受質來進行自腺苷向肌苷之轉化之酶，已知有ADAR(Adenosine deaminases acting on RNA，作用於RNA之腺苷去胺酶)。ADAR存在基因不同之3個亞型(ADAR1、ADAR2、ADAR3)，ADAR於其N末端具有雙鏈RNA結合域，於C末端具有去胺酶域。ADAR2尤其是於中樞神經系統中以高效率編輯構成3-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異㗁唑丙酸(AMPA)型麩胺酸受體之次單元之GluR2(Nature, 1996, Vol. 379, p. 460 - 464)。自腺苷轉化來之肌苷由於為與鳥苷類似之結構，故於轉譯之階段會被識別為鳥苷，因此結果有對編碼領域導入胺基酸突變之情形。作為非編碼領域之ADAR之受質，亦報告有反轉錄轉座子(FEBS Letters, 2006, Vol. 580, p. 2301 - 2305)或微RNA(miRNA)前驅物，提示出ADAR於生物體內有可能承擔多種功能(Annu. Rev. Biochem., 2010, Vol. 79, p. 321 - 349)。
亦報告有人工地導入有突變之ADAR之改變體。例如報告有以下之ADAR之改變體，其藉由對ADAR導入突變，不僅可識別腺苷亦可識別胞苷，還可進行藉由胞苷之去胺基化而變成尿苷之自C向U之RNA編輯(Science, 2019, Vol. 365, p. 382 - 386)。
近年來，作為使用野生型ADAR及人工嚮導RNA之RNA編輯，報告有幾種包含來自GluR2之ADAR募集鹼基序列之用於編輯目標RNA之嚮導RNA(國際公開第2016/097212號、國際公開第2017/050306號、國際公開第2017/010556號、國際公開第2019/111957號、Nucleic Acids Research, 2017, Vol. 45, p. 2797 - 2808、Nature Methods, 2019, Vol. 16, p. 239 - 242)。
又，作為使用作為人工合成核酸之反義寡核苷酸作為嚮導RNA之RNA編輯技術，亦報告有如下技術：使用與包含編輯目標之腺苷之mRNA互補之35個鹼基以上之反義寡核苷酸，與mRNA形成不完全螺旋結構之雙鏈而募集ADAR，藉此編輯目標RNA(專利文獻1～3)。進而，亦報告有可使用100個鹼基以上之人工RNA而誘導利用ADAR之目標RNA之編輯(非專利文獻1)。此外，還報告利用ADAR1去胺酶域-MS2外殼蛋白(MCP)之融合蛋白與反義-MS2 RNA之偶聯系統來編輯目標RNA(非專利文獻2)。
如此，關於使用反義寡核苷酸之RNA編輯有若干報告。但是，為了使用編輯目標RNA之嚮導RNA作為醫藥品，需要於細胞內顯示一定之編輯效率，但關於編輯效率較高之RNA編輯技術並未得到充分研究。
另一方面，已知有核小RNA(snRNA：small nuclear RNA)、核糖體RNA(rRNA：ribosomal RNA)、具有鳥嘌呤四鏈體結構或莖環結構等高次結構之RNA等具有各種功能之RNA序列，關於其中幾種RNA序列，亦報告有附加於嚮導RNA等RNA或反義寡核苷酸。
於真核生物中，snRNA由核糖核蛋白(RNP)介導而作用於前驅物信使RNA(pre-mRNA)之剪接、加工。尤其是5種snRNP(U1、U2、U4、U5、U6)構成與剪接相關之剪接體，snRNA於真核生物之幾乎所有細胞中大量且穩定地表現(Biological Chemistry, 2018, Vol. 399, p. 1265 - 1276)。
U6 snRNA於全部之人類細胞中穩定且大量地表現，於核內形成核糖核蛋白U6 snRNP。U6 snRNP構成剪接體，控制RNA前驅物中之剪接。U6 snRNA基因上游之轉錄起始要素作為使任意之RNA(核糖核酸酶、反義核糖核酸、RNA適體等)表現之強力聚合酶III(polIII)型啟動子為大眾所知(非專利文獻3)。據非專利文獻3～5報告，由編碼U6之序列所製作之小RNA(small RNA)表現盒(以下，將非專利文獻3～5中所記載之包含編碼U6之序列之表現盒稱為「U6盒」)係U6序列之高次結構發揮功能，而使所插入之RNA局部存在在核內。U6盒為了使小RNA穩定且強力地表現，於聚(U)終止子序列之正前包含人工莖環序列。包含由RNA序列UNCG形成之四環之人工莖環序列呈現熱力學上最穩定之莖環結構(Nucleic Acids Research, 1991, Vol. 19, p. 5901 - 5905)。提示穩定之莖環結構顯示對於3'-5'外切核酸酶活性之耐受性，使U6盒之轉錄產物穩定化(非專利文獻3～5)。
U1 snRNA包含與剪接供體序列(外顯子之3'與內含子之5'之接合)互補之序列及呈三葉草樣結構之序列。已知將U1 snRNA之剪接供體序列置換為目標基因之反義序列後所得之嵌合體U1 snRNA可誘導外顯子跳躍(Mol. Ther., 2010, Vol. 18, p. 1675 - 1682、Proc. Nat. Acad. Sci., 2002, Vol. 99, p. 9456 - 9461)。U1 snRNA基因上游400個鹼基之序列包含polII型啟動子，亦用於嵌合體U1 snRNA之轉錄(Mol. Ther., 2004, Vol. 10, p. 191 - 199)。
U7 snRNA負責組織蛋白pre-mRNA之加工。U7 snRNA包含組織蛋白3之pre-mRNA之互補序列、Sm蛋白結合位點、及莖環序列。藉由施加突變，Sm蛋白結合位點會具有與形成剪接體之D1、D2蛋白之結合能力而不是具有原本之與Lsm蛋白之結合能力(Cell. Mol. Life Sci., 2004, Vol. 61, p. 2560 - 2570)。據報告，由目標基因之反義序列、突變Sm蛋白結合位點、及莖環序列所構成之突變嵌合體U7 snRNA可誘導外顯子跳躍(Nat. Med., 2014, Vol. 20, p. 992 - 1000)。U7 snRNA基因上游270個鹼基之序列包含聚合酶II(polII)型啟動子，亦用於突變嵌合體U7 snRNA之轉錄(Science, 2004, Vol. 306, p. 1796 - 1799)。
核糖體係於細胞內合成蛋白質之胞器，由2個次單元所構成。真核生物之大次單元包含28S、5.8S、及5S之rRNA以及各種蛋白質，於核小體中集合後向細胞質輸送。5S rRNA呈包含5個螺旋及5個環之二級結構。據非專利文獻5中報告，若使用包含5S rRNA序列之反義序列之表現盒，自5S基因上游之polIII型啟動子轉錄與5S rRNA連結之反義序列，則局部存在在細胞質(以下，將非專利文獻5中所記載之包含5S rRNA之表現盒稱為「5S盒」)。5S盒與U6盒同樣地，於終止子序列之正前具有人工莖環序列。
鳥嘌呤四鏈體(Gq：G-quadruplex)結構係於生物體內之環境中作為熱力學上穩定之DNA或RNA高次結構為大眾所知之包含鳥嘌呤之重複序列。高次結構之形成需要一價陽離子。Gq原本作為視為端粒之序列被報告(Cell, 1989, Vol. 59, p. 871 - 880)。作為Gq之功能，已知有轉錄轉譯、表觀基因組控制等(EMBO Reports, 2015, Vol. 16, p. 910 - 922)。據報告，藉由對於Cas9之嚮導RNA，於其3'末端附加Gq，而使得基因組編輯效率提高(非專利文獻6)。又，據報告，藉由對反義寡核苷酸附加Gq，使得利用RNA分解酶抑制基因表現之效率提昇(專利文獻4)。
已知作為小RNA中所確認到之核酸之高次結構之莖環結構有助於轉譯調節功能(Cell. Mol. Life Sci., 2006, Vol. 63, p. 901 - 908)。來自λ噬菌體之BoxB序列呈莖環結構，顯示與λN蛋白強力之親和力(Biol. Cell., 2008, Vol. 100, p. 125 – 138、J. Am. Chem. Soc., 2002, Vol. 124, p. 10966 - 10967)。據報告，為了利用該性質使嚮導RNA募集ADAR，而對嚮導RNA附加BoxB序列，使λN蛋白與ADAR融合(非專利文獻7)。又，於專利文獻5中，記載有為了使基於GluR2之序列所設計之嚮導RNA穩定化，可對嚮導RNA之3'末端附加BoxB序列，但於非專利文獻8中，記載有藉由對嚮導RNA附加BoxB序列所得之穩定化之效果微小。
如上所述，報告有具有各種功能之RNA序列，但未報告為了有助於編輯目標RNA之嚮導RNA之編輯活性而附加具有功能之RNA序列。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2017/220751號 [專利文獻2]國際公開第2018/041973號 [專利文獻3]國際公開第2018/134301號 [專利文獻4]國際公開第2017/188898號 [專利文獻5]國際公開第2017/050306號 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Nat. Biotechnol., 2019, Vol. 37, p. 1059 - 1069 [非專利文獻2] Protein Eng. Des. Sel., 2018, Vol. 1, p. 471 - 478 [非專利文獻3] Gene Ther., 1997, Vol. 4, p. 45 - 54 [非專利文獻4] Nat. Biotechnol., 2002, Vol. 20, p. 505 - 508 [非專利文獻5] Mol. Ther., 2003, Vol. 7, p. 237 - 247 [非專利文獻6] Chem. Commun., 2018, Vol. 54, p. 2377 - 2380 [非專利文獻7] Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, p. e157 [非專利文獻8] Nucleic Acids Research, 2017, Vol. 45, p. 2797 - 2808
[發明所欲解決之問題]
本發明提供一種用於藉由ADAR編輯目標RNA之反義型嚮導RNA及編碼該反義型嚮導RNA之核酸。 [解決問題之技術手段]
本發明人等對用於誘導ADAR而進行目標RNA編輯之嚮導RNA進行了努力研究，結果發現，包含連結有至少1個功能性領域之反義領域且實質上不含ADAR募集鹼基序列之嚮導RNA於細胞內顯示較高之編輯效率，從而完成了本發明。 即，本發明係關於以下之[1]～[23]。 [1]一種嚮導RNA，係用於藉由ADAR編輯目標RNA者，且包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，上述嚮導RNA實質上不含ADAR募集鹼基序列。 [2]如[1]所記載之嚮導RNA，其中至少1個功能性領域直接結合於反義領域或經由連接子連結於反義領域。 [3]如[1]或[2]所記載之嚮導RNA，其中反義領域具有會與目標RNA形成錯配鹼基對之鹼基。 [4]如[1]至[3]中任一項所記載之嚮導RNA，其中功能性領域係包含具有如下功能中之任一種以上功能之鹼基序列的領域，該等功能包括：嚮導RNA之穩定化、使嚮導RNA局部存在於核、使嚮導RNA局部存在於細胞質、促進目標RNA與反義領域形成雙鏈、抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈、及由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化。 [5]如[1]至[4]中任一項所記載之嚮導RNA，其中功能性領域係包含snRNA序列之領域、包含rRNA序列之領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之任一種之組合。 [6]如[5]所記載之嚮導RNA，其中功能性領域係包含snRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域。 [7]如[6]所記載之嚮導RNA，其中包含snRNA序列之領域係包含U6 snRNA序列之領域、包含U1 snRNA序列之領域、或包含U7 snRNA序列之領域。 [8]如[5]所記載之嚮導RNA，其中功能性領域係包含rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域。 [9]如[8]所記載之嚮導RNA，其中包含rRNA序列之領域係包含5S rRNA序列之領域。 [10]如[5]所記載之嚮導RNA，其中功能性領域係包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之組合。 [11]如[1]至[5]中任一項所記載之嚮導RNA，其包括反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、任意包含之又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之又一功能性領域。 [12]如[1]至[5]中任一項所記載之嚮導RNA，其包括包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、任意包含之又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域及反義領域。 [13]一種編輯目標RNA之系統，其包含如[1]至[12]中任一項所記載之嚮導RNA及ADAR。 [14]一種核酸，其編碼如[1]至[12]中任一項所記載之嚮導RNA。 [15]一種表現載體，其包含編碼如[1]至[12]中任一項所記載之嚮導RNA之核酸。 [16]如[15]所記載之表現載體，其進而包含編碼ADAR之核酸。 [17]如[16]所記載之表現載體，其中ADAR為ADAR1或ADAR2。 [18]一種宿主細胞，其導入有如[15]至[17]中任一項所記載之表現載體。 [19]一種製造表現載體之方法，其包括培養如[18]所記載之宿主細胞之步驟。 [20]一種醫藥組合物，其含有如[15]至[17]中任一項所記載之表現載體及藥學上所容許之賦形劑。 [21]一種醫藥組合物，其含有如[15]所記載之表現載體、包含編碼ADAR之核酸之表現載體、及藥學上所容許之賦形劑。 [22]一種編輯目標RNA之方法，其包括將編碼如[1]至[12]中任一項所記載之嚮導RNA之核酸導入至細胞或病毒等之步驟。 [23]一種聚核苷酸，其係用於藉由ADAR編輯目標RNA者，且包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，上述聚核苷酸實質上不含ADAR募集鹼基序列。 [發明之效果]
附加有功能性領域之反義型嚮導RNA可用作用於編輯目標RNA之嚮導RNA。
以下詳細地進行說明本發明，但本發明並不限定於該等。於本說明書中所使用之用語未具體地定義之情形時，該用語係以業者一般所認知之含義使用。
＜本發明之嚮導RNA＞ 本發明提供一種嚮導RNA(以下，亦稱為「本發明之嚮導RNA」)，其係用於藉由ADAR編輯目標RNA者，且包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列。於本發明中，所謂「用於藉由ADAR編輯目標RNA之嚮導RNA」，係指具有與該目標RNA之一部分互補且與該目標RNA形成雙鏈之領域，將ADAR誘導至目標RNA之RNA分子。
1.目標RNA 於本發明中，所謂「目標RNA」，係指本發明之嚮導RNA所要編輯之目標RNA。該目標RNA之一部分包含會轉化為肌苷之腺苷或會轉化為尿苷之胞苷。於一形態中，目標RNA係包含腺苷，且藉由將該腺苷轉化為肌苷而可控制細胞功能及/或基因表現的任意RNA序列。於另一形態中，目標RNA係包含胞苷，且藉由將該胞苷轉換為尿苷而可控制細胞功能及/或基因表現的任意RNA序列。此處，所謂可控制細胞功能，係指藉由使具有目標RNA之細胞中之RNA之功能、轉譯、蛋白質之功能產生變化而可控制該細胞之功能。所謂可控制基因表現，係指可控制具有目標RNA之基因之表現。目標RNA可存在於包含外顯子(exon)、內含子(intron)、外顯子中之編碼領域或各種非轉譯領域(例如，反轉錄轉座子、微RNA(miRNA：microRNA)、轉移RNA(tRNA：transfer RNA)、核糖體RNA(rRNA：ribosomal RNA)等)之RNA內。目標RNA可存在於真核細胞、哺乳動物細胞、病毒、原核細胞、細菌、噬菌體等中所含之RNA內。
2.反義領域 本發明之嚮導RNA包含反義領域。於本發明中，所謂「反義領域」，係指包含具有與目標RNA之一部分互補之鹼基序列，且與目標RNA形成雙鏈之序列的領域。關於構成反義領域之鹼基序列之長度，於一形態中，為10個鹼基～100個鹼基、10個鹼基～80個鹼基、10個鹼基～60個鹼基、10個鹼基～40個鹼基，於一形態中，為15個鹼基～40個鹼基，於一形態中，為10個鹼基～38鹼基，於一形態中，為15～38個鹼基，於一形態中，為18～38個鹼基。於一形態中，反義領域亦可包含會與目標RNA形成錯配鹼基對之鹼基或會形成擺動鹼基對之鹼基。於一形態中，反義領域亦可包含會與目標RNA形成錯配鹼基對之鹼基。
於本說明書中，所謂「錯配鹼基對」，係指G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U鹼基對。於本說明書中，所謂「擺動鹼基對」，係指G-U、I-U、I-A、I-C鹼基對。於一形態中，反義領域係包含具有會與該目標RNA之一部分所含之腺苷或胞苷形成錯配鹼基對之鹼基，且會與目標RNA形成雙鏈之鹼基序列之領域。於一形態中，反義領域係包含具有會與該目標RNA之一部分所含之腺苷形成錯配鹼基對之鹼基，且會與目標RNA形成雙鏈之鹼基序列之領域。於一形態中，反義領域係包含具有作為會與該目標RNA之一部分所含之腺苷形成錯配鹼基對之鹼基之胞苷，且會與目標RNA形成雙鏈之鹼基序列之領域。
關於構成反義領域之鹼基序列，業者可考慮目標RNA之序列、鹼基長、會與目標RNA形成之錯配鹼基之位置、脫靶效應等而適宜設計。關於構成反義領域之鹼基序列，為了提高藉由ADAR編輯目標RNA之腺苷或胞苷之效率，亦可以與該腺苷或胞苷形成錯配鹼基對或擺動鹼基對之方式進行設計(RNA, 2001, Vol. 7, p. 846 - 858、Nat. Biotechnol., 2019, Vol. 37, p. 1059 - 1069)。
於本說明書中，「ASR」意指反義領域(Antisense Region)。
3.功能性領域 本發明之嚮導RNA包含至少1個功能性領域。於本發明中，所謂「功能性領域」，係指包含具有如下功能中之任一種以上之功能之鹼基序列的領域，即，嚮導RNA之穩定化、使嚮導RNA局部存在於核、使嚮導RNA局部存在於細胞質、促進促進目標RNA與反義領域形成雙鏈、抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈、由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化等功能。於一形態中，功能性領域係包含具有如下功能中之任一種以上之功能之鹼基序列的領域，即，包括嚮導RNA之穩定化、使嚮導RNA局部存在於核、使嚮導RNA局部存在於細胞質、促進促進目標RNA與反義領域形成雙鏈、抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈、及由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化的功能。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包括(a)包含促進嚮導RNA之穩定化之鹼基序列之領域、(b)包含促進嚮導RNA局部存在於核之鹼基序列之領域、(c)包含促進嚮導RNA局部存在於細胞質之鹼基序列之領域、(d)包含促進目標RNA與反義領域形成雙鏈之鹼基序列之領域、(e)包含抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈之鹼基序列之領域、或(f)包含促進由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化之鹼基序列之領域、或者包含具有上述(a)～(f)中所記載之功能中之任意兩種以上之功能之鹼基序列之領域作為功能性領域。有時將功能性領域具有該等中之一種以上之功能統稱為「具有功能」。又，有時將具有(a)、(b)、及(d)中所記載之功能統稱為「具有snRNA序列之功能」。有時將具有(a)及(c)中所記載之功能統稱為「具有rRNA序列之功能」。
於本說明書中，所謂「促進嚮導RNA之穩定化」，係指對RNA分解酶賦予耐受性。該功能可利用公知方法，藉由對RNA分解酶存在下之嚮導RNA之殘存量、向細胞導入編碼嚮導RNA之核酸後於轉錄抑制下之細胞內之嚮導RNA之殘存量等進行測定來評價。例如可利用實施例10中所記載之方法進行評價。所謂「促進嚮導RNA局部存在於核」，係指促進導入至細胞之嚮導RNA向核移動及局部存在。該功能可利用公知方法，藉由對嚮導RNA於細胞內之分佈或量進行檢測來評價。例如，可藉由原位雜交(in situ hybridization)(Mol. Ther., 2003, Vol. 7, p. 237 - 247)進行確認。所謂「促進嚮導RNA局部存在於細胞質」，係指促進導入至細胞之嚮導RNA停留於細胞質。該功能可利用公知方法，藉由對嚮導RNA於細胞內之分佈或量進行檢測來評價。例如，可藉由原位雜交(in situ hybridization)(Mol. Ther., 2003, Vol. 7, p. 237 - 247)進行確認。所謂「促進目標RNA與反義領域形成雙鏈」，係指提高目標RNA與反義領域之親和性。該功能可利用公知方法，藉由親和分析進行評價(BMC Botech., 2008, Vol. 8, article number 48)。所謂「抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈」，係指減少非特異性雙鏈形成(以下，亦稱為「脫靶效應」)。該功能可藉由RNA定序等公知之方法進行評價(Nat. Biotechnol., 2019, Vol. 37, p. 657 - 666)。所謂「促進由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化」，係指包含由目標RNA與反義領域所形成之雙鏈之複合體之狀態得到維持。該功能可利用公知之方法，藉由於會分解DNA/RNA雜交鏈之RNA之RNA分解酶存在下，測定由目標RNA與反義領域所形成之雙鏈之殘存量來評價。例如，可藉由對RNaseH之存在下之由目標RNA及包含DNA序列之嚮導RNA所形成之雙鏈的殘存量進行測定來評價(Antiviral Chemistry ＆ Chemotherapy, 1996, Vol. 7, p. 86 - 93)。
於一形態中，包含促進嚮導RNA之穩定化之鹼基序列之領域係包含形成熱力學上穩定化之高次結構之鹼基序列之領域。熱力學上穩定化之高次結構只要為對核酸酶活性顯示耐受性之結構，則並無特別限定。於一形態中，包含促進嚮導RNA之穩定化之鹼基序列之領域係包含核小RNA(snRNA：small nuclear RNA)序列之領域、包含核糖體RNA(rRNA：ribosomal RNA)序列之領域、包含形成雙鏈結構之鹼基序列之領域、包含形成三鏈結構之鹼基序列之領域、包含形成四鏈體結構之鹼基序列之領域、包含形成莖環結構之鹼基序列之領域等。於一形態中，包含促進嚮導RNA之穩定化之鹼基序列之領域係包含snRNA序列之領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體(Gq：G-quadruplex)結構之鹼基序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域。
於一形態中，包含促進嚮導RNA局部存在於核之鹼基序列之領域係包含來自小RNA(small RNA)之鹼基序列之領域。於一形態中，包含促進嚮導RNA局部存在於核之鹼基序列之領域係包含snRNA序列之領域。
於一形態中，包含促進嚮導RNA局部存在於細胞質之鹼基序列之領域係包含來自小RNA之鹼基序列之領域。於一形態中，包含促進嚮導RNA局部存在於細胞質之鹼基序列之領域係包含促進嚮導RNA局部存在於核糖體之鹼基序列之領域，於一形態中，係包含rRNA序列之領域。於一形態中，包含促進嚮導RNA局部存在於細胞質之鹼基序列之領域係包含轉移RNA(tRNA：transfer RNA)序列之領域。於一形態中，包含促進嚮導RNA局部存在於細胞質之鹼基序列之領域係包含作為來自訊號識別粒子(Signal Recognition Particle：SRP)之RNA序列之7SL RNA序列之領域。
於一形態中，包含促進目標RNA與反義領域形成雙鏈之鹼基序列之領域係包含熱力學上及立體結構上促進雙鏈及包含雙鏈之複合體之形成之鹼基序列之領域(Nat. Biotechnol., 2019, Vol. 37, p. 657 - 666)。於一形態中，包含促進目標RNA與反義領域形成雙鏈之鹼基序列之領域係包含snRNA序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之任一種之組合。於一形態中，包含促進目標RNA與反義領域形成雙鏈之鹼基序列之領域係包含U6 snRNA序列之領域、包含U1 snRNA序列之領域、包含U7 snRNA序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之任一種之組合。
於一形態中，包含抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈之鹼基序列之領域係包含熱力學上及立體結構上減輕脫靶效應之鹼基序列之領域。於一形態中，包含抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈之鹼基序列之領域係包含形成莖環結構之鹼基序列之領域(Chem. Commun., 2018, Vol. 54, p. 2377 - 2380)。
於一形態中，包含促進由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化之鹼基序列之領域係包含熱力學上及立體結構上雙鏈及包含雙鏈之複合體穩定化且對核酸酶活性顯示耐受性之鹼基序列之領域(Antiviral Chemistry ＆ Chemotherapy, 1996, Vol. 7, p. 86 - 93)。於一形態中，包含促進由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化之鹼基序列之領域係包含形成莖環結構之鹼基序列之領域。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含snRNA序列之領域、包含rRNA序列之領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體(Gq：G-quadruplex)結構之鹼基序列之領域、包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、包含來自SRP之RNA序列之領域、包含長鏈非編碼RNA(lncRNA：long non-coding RNA)序列之領域、包含tRNA序列之領域、包含核仁小RNA(snoRNA：small nucleolar RNA)序列之領域、或包含miRNA序列之領域、或者該等之任一種之組合作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含snRNA序列之領域、包含rRNA序列之領域、包含形成Gq結構之鹼基序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之任一種之組合作為功能性領域。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含snRNA序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含snRNA序列之領域及包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域。作為一形態，可與包含snRNA序列之領域組合使用之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域係包含人工莖環序列之領域。所謂人工莖環序列，係指人工製作之形成莖環結構之序列，例如可列舉U6盒或5S盒中所含之人工莖環序列(本說明書中，稱為「STL序列」)(Gene Ther., 1997, Vol. 4, p. 45 - 54、Nat. Biotechnol., 2002, Vol. 20, p. 505 - 508、Mol. Ther., 2003, Vol. 7, p. 237 - 247)。作為一形態，可與包含snRNA序列之領域組合使用之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域係包含STL序列之領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含snRNA序列之領域及包含人工莖環序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含snRNA序列之領域及包含STL序列之領域作為功能性領域。
本發明中所使用之包含snRNA序列之領域係由業者所周知之snRNA之鹼基序列所構成之領域，只要具有snRNA序列之功能，則亦可於天然之snRNA之鹼基序列中部分包含改變，及/或只要具有snRNA序列之功能，則亦可為天然之snRNA之鹼基序列之部分序列。例如，本發明之嚮導RNA包括包含U1 snRNA序列、U2 snRNA序列、U4 snRNA序列、U5 snRNA序列、U6 snRNA序列、U7 snRNA序列、U11 snRNA序列、U12 snRNA序列、U4atac snRNA序列、或U6atac snRNA序列之領域、或者該等之任一種之組合作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U1 snRNA序列、U2 snRNA序列、U4 snRNA序列、U5 snRNA序列、 U6 snRNA序列、或U7 snRNA序列之領域、或者該等之任一種之組合作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U6 snRNA序列之領域、包含U1 snRNA序列之領域、或包含U7 snRNA序列之領域作為功能性領域。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U6 snRNA序列之領域、包含U1 snRNA序列之領域、或包含U7 snRNA序列之領域、及包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U6 snRNA序列之領域及包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U6 snRNA序列之領域及包含人工莖環序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U6 snRNA序列之領域及包含STL序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U1 snRNA序列之領域及包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U1 snRNA序列之領域及包含人工莖環序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U1 snRNA序列之領域及包含STL序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U7 snRNA序列之領域及包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U7 snRNA序列之領域及包含人工莖環序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含U7 snRNA序列之領域及包含STL序列之領域作為功能性領域。
本發明中所使用之包含U6 snRNA序列之領域係由U6 snRNA之鹼基序列所構成之領域，只要具有snRNA序列之功能，則亦可於天然之U6 snRNA之鹼基序列中部分包含改變，及/或只要具有snRNA序列之功能，則亦可為天然之U6 snRNA之部分序列。於一形態中，本發明中所使用之包含U6 snRNA序列之領域係包含U6 snRNA之鹼基序列之部分序列之領域，於一形態中，係包含U6 snRNA之鹼基序列之轉錄起始點至第27鹼基之鹼基序列之領域。本發明之嚮導RNA中，包含U6 snRNA序列之領域只要具有snRNA序列之功能，則亦可與包含人工莖環序列之領域組合使用。於使用包含U6 snRNA序列之領域及包含人工莖環序列之領域之情形時，於包含U6 snRNA序列之領域與包含人工莖環序列之領域之間插入反義領域。於一形態中，本發明中所使用之包含U6 snRNA序列之領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號1所表示之鹼基序列、或於序列編號1所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3鹼基所得之鹼基序列，且具有snRNA序列之功能。關於本發明中所使用之包含人工莖環序列之領域，於一形態中，係包含STL序列之領域，於一形態中，係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號2所表示之鹼基序列、或於序列編號2所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3鹼基所得之鹼基序列，且形成莖環結構。
本發明中所使用之包含U1 snRNA序列之領域係由U1 snRNA之鹼基序列所構成的領域，只要具有snRNA序列之功能，則亦可於天然之U1 snRNA之鹼基序列中局部地包含改變，及/或只要具有snRNA序列之功能，則亦可為天然之U1 snRNA之部分序列。本發明之嚮導RNA中，包含U1 snRNA序列之領域只要具有snRNA序列之功能，則亦可使反義領域連結於U1 snRNA序列而使用，或者亦可將反義領域插入至U1 snRNA序列而使用。於將反義領域插入至U1 snRNA序列之情形時，將U1 snRNA序列分為任意2個領域，於其間插入反義領域。反義領域向U1 snRNA序列之插入可利用反義領域置換U1 snRNA序列之一部分來進行。於一形態中，可將U1 snRNA序列之鹼基序列之自轉錄起始點起第3個鹼基至第10個鹼基為止的鹼基序列置換為反義領域。關於反義領域向U1 snRNA序列之插入，於一形態中，可於U1 snRNA序列之自轉錄起始點起第3個鹼基處插入反義領域，該U1 snRNA序列包含U1 snRNA序列之鹼基序列之自轉錄起始點起第3個鹼基至第10個鹼基之8個鹼基缺失後所得的鹼基序列。於一形態中，本發明中所使用之包含U1 snRNA序列之領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號3所表示之鹼基序列、或於序列編號3所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～20個鹼基所得之鹼基序列，且具有snRNA序列之功能。於一形態中，係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係於序列編號3所表示之鹼基序列中自轉錄起始點起第3個鹼基至第10個鹼基之8個鹼基缺失後所得之鹼基序列，且具有snRNA序列之功能。
本發明中所使用之包含U7 snRNA序列之領域係由U7 snRNA之鹼基序列所構成之領域，只要具有snRNA序列之功能，則亦可於天然之snRNA之鹼基序列中部分包含改變，及/或只要具有snRNA序列之功能，則亦可為天然之U7 snRNA之部分序列。於一形態中，本發明中所使用之包含U7 snRNA序列之領域係包含U7 snRNA之鹼基序列之部分序列之領域。於一形態中，本發明中所使用之包含U7 snRNA序列之領域係包含U7 snRNA之鹼基序列之部分序列之領域，於一形態中，係包含含有Sm蛋白結合位點(Sm OPT序列)及U7 snRNA之莖環序列之U7 snRNA序列之領域。本發明之嚮導RNA中，包含U7 snRNA序列之領域只要具有snRNA序列之功能，則可將反義領域連結於U7 snRNA序列而使用，或者亦可將反義領域插入至U7 snRNA序列而使用。本發明中所使用之包含U7 snRNA序列之領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號4所表示之鹼基序列、或於序列編號4所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～10鹼基所得之鹼基序列，且具有snRNA序列之功能。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含rRNA序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含rRNA序列之領域及包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域。
本發明中所使用之包含rRNA序列之領域係由業者所周知之rRNA之鹼基序列所構成之領域，只要具有rRNA序列之功能，則亦可於天然之rRNA之鹼基序列中部分包含改變。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含真核生物之rRNA序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含28S rRNA序列、18S rRNA序列、5.8S rRNA序列、5S rRNA序列、線粒體12S rRNA序列、或線粒體16S rRNA序列之領域、或者該等之任一種之組合作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含5S rRNA序列之領域作為功能性領域。
本發明中所使用之包含5S rRNA序列之領域係由5S rRNA之鹼基序列所構成之領域，只要具有rRNA序列之功能，則亦可於天然之5S rRNA之鹼基序列中部分包含改變。本發明之嚮導RNA中，包含5S rRNA序列之領域只要具有rRNA序列之功能，則亦可與包含人工莖環序列之領域組合使用。於使用包含5S rRNA序列之領域及包含人工莖環序列之領域之情形時，於包含5S rRNA序列之領域與包含人工莖環序列之領域之間插入反義領域。於一形態中，本發明中所使用之包含5S rRNA序列之領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號5所表示之鹼基序列、或於序列編號5所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～10鹼基所得之鹼基序列，且具有rRNA序列之功能。於一形態中，本發明中所使用之包含人工莖環序列之領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號2所表示之鹼基序列、或於序列編號2所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3鹼基所得之鹼基序列，且形成莖環結構。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之組合作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域。
本發明中所使用之包含形成鳥嘌呤四鏈體結構(Gq結構)之鹼基序列之領域包含Gq序列。所謂Gq序列，係含有4個連續之包含鳥嘌呤之重複單元，且4個鳥嘌呤形成平面上之四鏈體(Gq)結構之序列。於包含鳥嘌呤之重複單元彼此之間，只要維持Gq結構，則可包含鳥嘌呤以外之鹼基。於一形態中，Gq序列含有1、2、3、或4個連續之包含鳥嘌呤之重複單元，且分別形成1、2、3、或4層之Gq。於一形態中，Gq序列含有3個連續之包含鳥嘌呤之重複單元，且形成3層之Gq。將其稱為「3層之鳥嘌呤四鏈體結構」(以下，亦稱為「3Gq」)。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含形成3Gq之鹼基序列之領域作為功能性領域，於一形態中，包含形成3Gq之鹼基序列之領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號6所表示之鹼基序列、或於序列編號6所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3鹼基所得之鹼基序列，且形成Gq結構。
莖環結構亦稱為髮夾結構，於該技術領域中為周知。作為形成莖環結構之鹼基序列，可列舉：適體序列(Int. J. Biochem. Mol. Biol., 2013, Vol. 4, p. 27 - 40、國際公開第2016/143700號)、來自BoxB序列之序列、來自MS2序列之序列、來自PP7序列之序列(Integr. Biol., 2009, Vol. 1, p. 499 - 505、Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, p. 9555 - 9564)、人工莖環序列(例如U6盒或5S盒中所含之人工莖環序列(STL序列)(Gene Ther., 1997, Vol. 4, p. 45 - 54、Nat. Biotechnol., 2002, Vol. 20, p. 505 - 508、Mol. Ther., 2003, Vol. 7, p. 237 - 247))等。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域，該包含形成莖環結構之鹼基序列之領域係包含來自BoxB序列之序列、適體序列、來自MS2序列之序列、來自PP7序列之序列、或人工莖環序列(例如STL序列)之領域、或者該等之任一種之組合。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含來自BoxB序列之序列之領域作為功能性領域。於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含STL序列之領域作為功能性領域。
於一形態中，本發明中所使用之包含來自BoxB序列之序列之領域包含如下鹼基序列，該鹼基序列係序列編號7所表示之鹼基序列、或於序列編號7所表示之鹼基序列缺失、置換、插入及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且形成莖環結構。
於一形態中，本發明中所使用之包含人工莖環序列之領域係包含U6盒或5S盒中所含之人工莖環序列(STL序列)之領域，於一形態中，係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號2所表示之鹼基序列、或於序列編號2所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且形成莖環結構。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包括包含來自SRP之RNA序列之領域作為功能性領域，於一形態中，該包含來自SRP之RNA序列之領域係包含7SL RNA序列、6S RNA序列、或4.5S RNA序列之領域。
關於本發明之嚮導RNA，於一形態中，可包含相同之功能性領域至少2個，於另一形態中，亦可包含2個以上之不同之功能性領域至少各1個。
4.功能性領域之連結 本發明之嚮導RNA中，功能性領域連結於反義領域。於本說明書中，所謂「連結」，包括直接結合及經由連接子結合。於一形態中，本發明之嚮導RNA中，至少1個功能性領域直接結合於反義領域。於另一形態中，本發明之嚮導RNA中，至少1個功能性領域經由連接子連結於反義領域。本發明之嚮導RNA中，於將複數個功能性領域連結而使用之情形時，功能性領域間之連結可為直接結合或經由連接子之連結之任一種。
於使用連接子之情形時，於一形態中，連接子之長度為1～10個鹼基，於一形態中為1～6個鹼基，於一形態中為1～3個鹼基，於一形態中為3～6個鹼基，於一形態中為3個鹼基，於一形態中為6個鹼基。連接子之鹼基序列可基於構成嚮導RNA之序列由業者適宜設計。例如，本發明中所使用之連接子之鹼基序列亦可以不與目標RNA形成互補鏈之方式設計。於一形態中，連接子包含鹼基序列「UCU」、作為限制酶SalI位點序列之「GUCGAC」、或作為限制酶XbaI位點序列之「UCUAGA」。
作為一形態，於本發明之嚮導RNA包括包含來自BoxB序列之序列之領域作為功能性領域之情形時，可於包含來自BoxB序列之序列之領域與反義領域之間、及包含來自BoxB序列之序列之領域與其他功能性領域之間使用經由連接子之連結，於一形態中，該連接子為鹼基序列「UCU」。作為一形態，於本發明之嚮導RNA包括包含U6 snRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域之情形、或者本發明之嚮導RNA包括包含5S rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域作為功能性領域之情形時，可經由連接子將反義領域連結於功能性領域，於一形態中，該連接子為鹼基序列「GUCGAC」或「UCUAGA」。
5.用於編輯目標RNA之嚮導RNA 本發明之嚮導RNA係實質上不含ADAR募集鹼基序列之嚮導RNA。所謂「ADAR募集鹼基序列」，係指可於同一分子內形成莖環結構，使ADAR結合於該莖環結構，從而將該ADAR募集於目標RNA之鹼基序列。作為ADAR募集鹼基序列之例，可列舉基於GluR2之mRNA前驅物等來自ADAR之基質之莖環結構所設計之鹼基序列(國際公開第2016/097212號、國際公開第2017/050306號、德國專利第102015012522號、國際公開第2017/010556號、國際公開第2019/111957號、Nucleic Acids Research, 2017, Vol. 45, p. 2797 - 2808、Nature Methods, 2019, Vol. 16, p. 239 - 242)。於本發明中，所謂「實質上不含」ADAR募集鹼基序列，係指於嚮導RNA之同一分子內不含ADAR募集鹼基序列。
於一形態中，本發明之嚮導RNA係以下之任一種嚮導RNA： 一種嚮導RNA，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域直接結合於該反義領域，上述嚮導RNA實質上不含ADAR募集鹼基序列；或者 一種嚮導RNA，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域經由連接子連結於該反義領域，上述嚮導RNA實質上不含ADAR募集鹼基序列。
於一形態中，本發明之嚮導RNA係以下之任一種嚮導RNA： 一種嚮導RNA，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，上述嚮導RNA實質上不含ADAR募集鹼基序列，且該反義領域具有會與該目標RNA形成錯配鹼基對之鹼基。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，上述嚮導RNA實質上不含ADAR募集鹼基序列，且具有以下之特徵： (1)功能性領域係包含具有包括嚮導RNA之穩定化、使嚮導RNA局部存在於核、使嚮導RNA局部存在於細胞質、促進目標RNA與反義領域形成雙鏈、抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈、及由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化之功能中的任一種以上之功能之鹼基序列之領域； (2)功能性領域係包含snRNA序列之領域、包含rRNA序列之領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之任一種之組合； (3)功能性領域係包含snRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (4)功能性領域係選自包含U6 snRNA序列之領域、包含U1 snRNA序列之領域、及包含U7 snRNA序列之領域中之包含snRNA序列之領域、以及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (5)功能性領域係包含U6 snRNA序列之領域及包含人工莖環序列之領域； (6)功能性領域係包含作為U6 snRNA序列之鹼基序列之部分序列且具有snRNA序列之功能之鹼基序列之領域及包含人工莖環序列之領域； (7)功能性領域係包含作為U6 snRNA序列之鹼基序列之自轉錄起始點起至第27個鹼基為止之部分序列且具有snRNA序列之功能之鹼基序列之領域及包含人工莖環序列之領域； (8)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號1所表示之鹼基序列、或於序列編號1所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且具有snRNA序列之功能；以及包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號2所表示之鹼基序列、或於序列編號2所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且形成莖環結構； (9)功能性領域係包含U1 snRNA序列之領域； (10)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號3所表示之鹼基序列、或於序列編號3所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～20個鹼基所得之鹼基序列，且具有snRNA序列之功能； (11)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係於序列編號3所表示之鹼基序列中自轉錄起始點起第3個鹼基至第10個鹼基之8個鹼基缺失後所得之鹼基序列，且具有snRNA序列之功能； (12)功能性領域係包含U7 snRNA序列之領域； (13)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係包含Sm蛋白結合位點(Sm OPT序列)及U7 snRNA之莖環序列之U7 snRNA之鹼基序列之部分序列，且具有snRNA序列之功能； (14)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號4所表示之鹼基序列、或於序列編號4所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～10個鹼基所得之鹼基序列，且具有snRNA序列之功能； (15)功能性領域係包含rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (16)功能性領域係包含5S rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (17)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號5所表示之鹼基序列、或於序列編號5所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～10個鹼基所得之鹼基序列，且具有rRNA序列之功能；以及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (18)功能性領域係包含5S rRNA序列之領域及包含人工莖環序列之領域； (19)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號5所表示之鹼基序列、或於序列編號5所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且具有rRNA序列之功能；以及包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號2所表示之鹼基序列、或於序列編號2所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且形成莖環結構； (20)功能性領域係包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之組合； (21)功能性領域係包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域； (22)功能性領域係包含形成3層之鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域； (23)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號6所表示之鹼基序列、或於序列編號6所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且形成鳥嘌呤四鏈體結構； (24)功能性領域係包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (25)功能性領域係包含來自BoxB序列之序列之領域； (26)功能性領域係包含如下鹼基序列之領域，該鹼基序列係序列編號7所表示之鹼基序列、或於序列編號7所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且形成莖環結構； (27)功能性領域係包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域及包含形成莖環結構之鹼基序列之領域的組合； (28)功能性領域係包含形成3層之鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域及包含來自BoxB序列之序列之領域的組合。
具有上述(1)～(28)之任一特徵之本發明之嚮導RNA中，至少1個該功能性領域可直接結合於該反義領域，亦可經由連接子連結於該反義領域。
於一形態中，本發明之嚮導RNA包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，且上述嚮導RNA實質上不含ADAR募集鹼基序列，且具有以下之特徵： (a-1)嚮導RNA包括包含U6 snRNA序列之功能性領域、反義領域、任意包含之連接子、及包含人工莖環序列之領域，且自5'側至3'側依序連結有包含U6 snRNA序列之功能性領域、反義領域、及包含人工莖環序列之領域； (a-2)嚮導RNA包括包含作為自U6 snRNA序列之鹼基序列之轉錄起始點起至第27鹼基為止之部分序列且具有snRNA序列之功能之鹼基序列之功能性領域、反義領域、任意包含之連接子、及包含人工莖環序列之領域，且自5'側至3'側依序連結有包含為U6 snRNA序列之鹼基序列之自轉錄起始點起至第27個鹼基為止之部分序列且具有snRNA序列之功能之鹼基序列的功能性領域、反義領域、及包含人工莖環序列之領域； (a-3)嚮導RNA包括包含U1 snRNA序列之功能性領域、及反義領域，且反義領域插入至U1 snRNA序列之鹼基序列； (a-4)嚮導RNA包括包含U1 snRNA序列之鹼基序列之自轉錄起始點起第3個鹼基至第10個鹼基之8個鹼基缺失且具有snRNA序列之功能之鹼基序列的功能性領域、及反義領域，且反義領域插入至U1 snRNA序列之鹼基序列之自轉錄起始點起第3個鹼基處； (a-5)嚮導RNA包括包含U7 snRNA序列之功能性領域、及反義領域，且自5'側至3'側依序連結有反義領域及包含U7 snRNA序列之功能性領域； (a-6)嚮導RNA包括包含作為包含Sm蛋白結合位點(Sm OPT序列)及U7 snRNA之莖環序列之U7 snRNA序列之鹼基序列之部分序列且具有snRNA序列之功能之鹼基序列之功能性領域、以及反義領域，且自5'側至3'側依序連結有反義領域及包含U7 snRNA序列之鹼基序列之部分序列之功能性領域； (a-7)嚮導RNA包括包含5S rRNA序列之功能性領域、反義領域、任意包含之連接子、及包含人工莖環序列之領域，且自5'側至3'側依序連結有包含5S rRNA序列之功能性領域、反義領域、及包含人工莖環序列之領域； (a-8)嚮導RNA包括反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有反義領域及包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域； (a-9)嚮導RNA包括包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域及反義領域； (a-10)嚮導RNA包括反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、及又一功能性領域； (a-11)嚮導RNA包括反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有又一功能性領域、反義領域、及包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域； (a-12)嚮導RNA包括反義領域、包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有反義領域及包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域； (a-13)嚮導RNA包括包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域及反義領域； (a-14)嚮導RNA包括包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、及又一功能性領域； (a-15)嚮導RNA包括包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、及包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域； (a-16)嚮導RNA包括包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、及包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域； (a-17)嚮導RNA包括反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、及包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域；或者 (a-18)嚮導RNA包含包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、及反義領域。
＜本發明中所使用之ADAR＞ 本發明中所使用之ADAR中，包含天然存在之ADAR，且只要具有去胺酶活性，則亦包含其改變體。去胺酶活性可利用業者所公知之方法藉由檢測基質之去胺基化而測定。例如，去胺酶活性可藉由檢測腺苷向肌苷之轉換或胞苷向尿苷之轉換而進行測定。具體而言，去胺酶活性可利用實施例7或8中所記載之方法進行測定。本發明中所使用之ADAR於一形態中為來自真核生物之ADAR，於一形態中為來自哺乳動物之ADAR，於又一形態中為人類ADAR。本發明中所使用之ADAR於一形態中為ADAR1或ADAR2，於一形態中為ADAR2。ADAR1中包含2種剪接變異體ADAR1 p110及ADAR1 p150，本發明中所使用之ADAR於一形態中為ADAR1 p110或ADAR1 p150。本發明中所使用之ADAR於一形態中為人類ADAR1或人類ADAR2，於一形態中為人類ADAR2。本發明中所使用之ADAR於一形態中為包含雙鏈RNA結合領域(dsRBD：double-stranded-RNA binding domain)且具有去胺酶酶活性之多肽(Trends in Biochemical Sciences, 2001, Vol. 26, p. 376 - 384、RNA, 2001, Vol. 7, p. 846 - 858)。於一形態中，本發明中所使用之ADAR係包含去胺酶域，且可將目標RNA之腺苷轉換為肌苷之多肽。於另一形態中，本發明中所使用之ADAR係包含去胺酶域，且可將目標RNA之胞苷轉換為尿苷之多肽。於又一形態中，本發明中所使用之ADAR係包含去胺酶域，且可將目標RNA之腺苷轉換為肌苷及將胞苷轉換為尿苷之多肽。本發明中所使用之ADAR亦可為與其他因子之融合蛋白。本發明中所使用之ADAR之改變體中包含具有腺苷去胺酶活性之改變體、具有胞苷去胺酶活性之改變體、具有識別腺苷及胞苷之兩者且分別轉換為肌苷及尿苷之去胺酶活性之改變體(Science, 2019, Vol. 365, p. 382 - 386)。本發明中所使用之ADAR及ADAR之改變體亦可為與其他因子之融合蛋白。
於一形態中，本發明中所使用之ADAR係包含登錄號[NP_001103.1]、登錄號[NP_056648.1]、或登錄號[NP_001102.3]所示之胺基酸序列之多肽、或者包含與該等胺基酸序列之同一性為90%以上之胺基酸序列、或於該等胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加1～10個胺基酸之胺基酸序列，且具有腺苷去胺酶活性之多肽。於一形態中，本發明中所使用之ADAR係包含序列編號9所表示之胺基酸序列(人類ADAR2)之多肽、或者包含與該序列之同一性為90%以上之胺基酸序列、或於該序列中缺失、置換、插入及/或附加1～10個胺基酸之胺基酸序列，且具有腺苷去胺酶活性之多肽。本發明中所使用之ADAR於一形態中為內源性地存在於真核細胞中之ADAR，於一形態中，亦可為外源性地導入至真核細胞之ADAR。ADAR向真核細胞之導入可直接導入ADAR多肽，亦可導入包含編碼ADAR之核酸之表現載體。
於本說明書中，所謂「同一性」，意指藉由EMBOSS NEEDLE program(J. Mol. Biol., 1970, Vol. 48, p. 443 - 453)檢索使用由預設值準備之參數所獲得之值Identity。上述之參數如下所述。 Gap Open penalty＝10 Gap Extend penalty＝0.5 Matrix＝EBLOSUM62
＜本發明之編輯目標RNA之系統＞ 又，本發明提供一種編輯目標RNA之系統，其包含本發明之嚮導RNA及ADAR。所謂包含本發明之嚮導RNA及ADAR之編輯目標RNA序列之系統，包括用於編輯目標RNA序列之套組、或編輯目標RNA序列之方法，上述用於編輯目標RNA序列之套組包含本發明之嚮導RNA及ADAR，上述編輯目標RNA序列之方法係使用本發明之嚮導RNA及ADAR來編輯目標RNA序列。於一形態中，本發明之編輯目標RNA之系統係包含嚮導RNA、以及ADAR之系統，該嚮導RNA包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列；於一形態中，本發明之編輯目標RNA之系統係包含嚮導RNA、以及ADAR1或ADAR2之系統，該嚮導RNA包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列。 本發明之編輯目標RNA之系統可於細胞內使用亦可於細胞外使用。於一形態中，可於真核細胞內使用該系統。於一形態中，可於原核細胞內、細菌內、噬菌體內、病毒內等使用該系統。
＜編碼本發明之嚮導RNA之核酸＞ 又，本發明提供一種編碼本發明之嚮導RNA之核酸(於本項中，亦稱為「本發明之核酸」)。本發明之核酸係編碼嚮導RNA之核酸，該嚮導RNA包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列。於一形態中，本發明之核酸係編碼嚮導RNA之核酸，該嚮導RNA包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列，作為編碼該功能性領域之核酸，包含以下所示之核酸： (1)包含選自以下之「編碼功能性領域之核酸」所示之序列編號中之1個序列編號所表示之鹼基序列的核酸； (2)包含如下鹼基序列之核酸，該鹼基序列係於以下「編碼功能性領域之核酸」所示之序列編號12所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入、及/或附加1～20個鹼基所得之鹼基序列，且具有作為該功能性領域之功能； (3)包含如下鹼基序列之核酸，該鹼基序列係於以下「編碼功能性領域之核酸」所示之序列編號13或序列編號14所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入、及/或附加1～10個鹼基所得之鹼基序列，且具有作為該功能性領域之功能； (4)包含如下鹼基序列之核酸，該鹼基序列係於以下「編碼功能性領域之核酸」所示之序列編號10、序列編號11、序列編號15、或序列編號16所表示之鹼基序列中缺失、置換、插入、及/或附加1～3個鹼基所得之鹼基序列，且編碼具有作為該功能性領域之功能之領域；或者 (5)(1)～(3)中所含之核酸之任一種之組合： 編碼功能性領域之核酸 編碼U6 snRNA之核酸：序列編號10 編碼STL之核酸：序列編號11 編碼U1 snRNA之核酸：序列編號12 編碼U7 snRNA之核酸：序列編號13 編碼5S rRNA之核酸：序列編號14 編碼3Gq之核酸：序列編號15 編碼BoxB之核酸：序列編號16
本發明之核酸具有去氧核糖核酸連結之結構，例如為DNA，於一形態中為DNA。於一形態中，本發明之核酸係組入至表現載體之核酸。於一形態中，本發明之核酸係組入至質粒載體之核酸。於一形態中，本發明之核酸係組入至病毒載體之核酸。
編碼成本發明之核酸之嚮導RNA之具體形態與上述＜本發明之嚮導RNA＞之項中所記載之本發明之嚮導RNA之形態相同。以下表示具體例。於一形態中，本發明之核酸係編碼以下之任一種嚮導RNA之核酸： 一種嚮導RNA，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域直接結合於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列； 一種嚮導RNA，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域經由連接子連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列；或者 一種嚮導RNA，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列，且該反義領域具有會與目標RNA形成錯配鹼基對之鹼基。
於一形態中，本發明之核酸係編碼嚮導RNA之核酸，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列，且該嚮導RNA具有以下之特徵： (1)功能性領域係包含具有包括嚮導RNA之穩定化、使嚮導RNA局部存在於核、使嚮導RNA局部存在於細胞質、促進目標RNA與反義領域形成雙鏈、抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈、及由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化之功能中的任一種以上之功能之鹼基序列之領域； (2)功能性領域係包含snRNA序列之領域、包含rRNA序列之領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之任一種之組合； (3)功能性領域係包含snRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (4)功能性領域係選自包含U6 snRNA序列之領域、包含U1 snRNA序列之領域、及包含U7 snRNA序列之領域中之包含snRNA序列之領域、以及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (5)功能性領域係包含rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (6)功能性領域係包含5S rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (7)功能性領域係包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之組合； (8)嚮導RNA包括反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、任意包含之又一功能性領域、及任意包含之連接子，且反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之又一功能性領域依序自5'側連結至3'側； (9)嚮導RNA包括包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、任意包含之又一功能性領域、及任意包含之連接子，且包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域及反義領域依序自5'側連結至3'側。
＜編碼本發明中所使用之ADAR之核酸＞ 編碼本發明中所使用之ADAR之核酸係編碼上述＜本發明中所使用之ADAR＞中所記載之ADAR之核酸。於一形態中，編碼本發明中所使用之ADAR之核酸係包含編碼登錄號[NP_001103.1]、登錄號[NP_056648.1]、或登錄號[NP_001102.3]所示之胺基酸序列之鹼基序列之核酸、或者包含與該等至少1個序列之同一性為90%以上之鹼基序列或於該等至少1個序列中缺失、置換、插入及/或附加1～10鹼基所得之鹼基序列，且編碼具有腺苷去胺酶活性之多肽之核酸。於一形態中，編碼本發明中所使用之ADAR之核酸係包含序列編號8所表示之鹼基序列之核酸、或者包含與該序列之同一性為90%以上之鹼基序列或於該序列中缺失、置換、插入及/或附加1～10鹼基所得之鹼基序列，且編碼具有腺苷去胺酶活性之多肽之核酸。
＜包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸之表現載體＞ 又，本發明提供一種包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸之表現載體(亦稱為「本發明之表現載體」)。又，本發明提供一種包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸及編碼ADAR之核酸之表現載體。編碼本發明之嚮導RNA之核酸及編碼ADAR之核酸可搭載於同一表現載體，亦可搭載於不同之表現載體。於一形態中，本發明之表現載體係包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸之表現載體及包含編碼ADAR之核酸之表現載體之組合。於一形態中，本發明之表現載體係包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸及編碼ADAR之核酸之表現載體。
1.本發明中所使用之表現載體 作為本發明中所使用之表現載體，只要為由編碼本發明之嚮導RNA之核酸可使本發明之嚮導RNA表現之表現載體、及/或可使ADAR表現之表現載體，則並無特別限制。於一形態中，本發明中所使用之表現載體係可用於在人類細胞中使本發明之嚮導RNA表現及/或使ADAR表現之表現載體。於一形態中，作為本發明中所使用之表現載體之例，可列舉：質粒載體、病毒載體(例如，腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺相關病毒載體)等。
2.啟動子 本發明之表現載體亦可包含可作動地連結於編碼本發明之嚮導RNA之核酸及/或編碼ADAR之核酸之啟動子。於本說明書中，所謂「可作動地連結」，意指以編碼成核酸之多肽或RNA可於宿主細胞中表現之方式，至少1個啟動子連結於核酸。作為本發明之表現載體中所含之啟動子，並無特別限定，可使用與適於使編碼本發明之嚮導RNA或ADAR之核酸表現之RNA聚合酶(例如，RNA聚合酶II(polII)、RNA聚合酶III(polIII))對應之啟動子。為了使本發明之嚮導RNA表現，作為一形態，可使用與polII或polIII對應之啟動子，作為另一形態，可使用與polIII對應之啟動子。為了使ADAR表現，作為一形態，可使用與polII對應之啟動子。
作為與polII對應之啟動子，例如可列舉：來自CMV(cytomegalovirus，細胞巨大病毒)之啟動子、SV40(simian virus 40，猴病毒40)啟動子、RSV(respiratory syncytial virus，呼吸道融合細胞病毒)啟動子、EF1α(Elongation factor 1α，延長因子1α)啟動子、CAG啟動子、U1 snRNA啟動子、U7 snRNA啟動子等。作為與polIII對應之啟動子，例如可列舉：人類U6 snRNA啟動子(U6)(Nat. Biotechnol., 2002, vol. 20, p. 497 - 500)、高感度U6啟動子(Nucleic Acids Research, 2003, vol. 31, p. e100)、人類H1啟動子、5S rRNA啟動子、以及業者所公知之其他病毒及真核細胞啟動子，但並不限定於該等。
本發明之表現載體亦可根據所使用之啟動子或宿主細胞等，進而包含轉譯起始密碼子、轉譯終止密碼子、作為polIII之轉錄起始點而言較佳之嘌呤鹼基(G或A)、polyA訊號、用於polIII之連續T之終止子序列、強化子、非轉譯領域、剪接接合部等。
＜本發明之宿主細胞＞ 又，本發明提供一種藉由導入編碼本發明之嚮導RNA之核酸而轉形之宿主細胞(亦稱為「本發明之宿主細胞」)。於一形態中，本發明之宿主細胞係導入有本發明之表現載體之宿主細胞。於一形態中，本發明之宿主細胞係導入有作為質粒載體之本發明之表現載體之宿主細胞。於一形態中，本發明之宿主細胞係導入有用於製造作為病毒載體之本發明之表現載體之質粒載體之宿主細胞。於一形態中，本發明之宿主細胞係導入有作為病毒載體之本發明之表現載體之宿主細胞。
作為供本發明之表現載體導入之宿主細胞，並無特別限定，只要為可用於產生編碼本發明之嚮導RNA之核酸或本發明之表現載體之細胞，則可選擇該領域中公知之細胞。作為可用於載體之複製之宿主細胞，例如可列舉本發明之技術領域中通常所使用之天然細胞或人工樹立之細胞等各種細胞。作為可用於載體之複製之宿主細胞，例如可列舉：動物細胞(例如CHO細胞、HEK293細胞等)、昆蟲細胞(例如Sf9等)、細菌(大腸桿菌等)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)等)。作為一形態，可使用大腸桿菌作為宿主細胞。轉形可利用業者所公知之方法實施(Green, M. R. and Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)。
＜製造編碼本發明之嚮導RNA之核酸及本發明之表現載體之方法＞ 編碼本發明之嚮導RNA之核酸(本項中亦稱為「本發明之核酸」)可基於本說明書中所記載之序列或可適當利用之序列資訊，使用該領域中公知之標準之聚核苷酸合成法進行合成。又，若取得一本發明之核酸，則藉由使用定點突變誘發法(Current Protocols in Molecular Biology edition, 1987, John Wiley ＆ Sons Section)等業者所公知之方法，對特定之部位導入突變，亦可製作另一本發明之核酸。
製造本發明之核酸及本發明之表現載體之方法包含製造核酸之方法，該製造核酸之方法包括培養導入有本發明之核酸或包含本發明之核酸之表現載體之宿主細胞之步驟。於一形態中，製造本發明之核酸之方法包括培養導入有本發明之核酸之宿主細胞，複製本發明之核酸之步驟。於一形態中，製造本發明之核酸之方法包括培養導入有包含本發明之核酸之表現載體之宿主細胞，複製本發明之表現載體之步驟。於本發明之表現載體為病毒載體之情形時，製造本發明之表現載體之方法包括培養導入有包含本發明之核酸之病毒載體質粒之宿主細胞，純化宿主細胞內所製作之病毒載體之步驟。病毒載體可藉由業者所公知之方法製作。
製造本發明之核酸及本發明之表現載體之方法亦可包括回收宿主細胞之培養液而獲得溶菌液(lysate)之步驟。溶菌液例如可藉由將所回收之培養液利用鹼溶解法或煮沸法進行處理而獲得。製造本發明之核酸之方法亦可進而包括自溶菌液純化核酸或表現載體之步驟。自溶菌液純化核酸或表現載體可使用離子交換層析法及/或疏水相互作用層析法。於本發明之表現載體為病毒載體之情形時，自溶菌液純化病毒載體亦可使用氯化銫密度梯度離心分離法、蔗糖梯度離心分離法、碘克沙醇(Iodixanol)密度梯度離心分離法、超濾法、透濾法、親和層析法、離子交換層析法、聚乙二醇沈澱法或硫酸銨沈澱法等。
＜製造本發明之嚮導RNA之方法＞ 本發明之嚮導RNA可基於序列資訊，使用該領域中公知之標準聚核苷酸合成法來合成。又，若取得本發明之一嚮導RNA，則藉由使用定點突變誘發法(Current Protocols in Molecular Biology edition, 1987, John Wiley ＆ Sons Section)等業者所公知之方法，向特定部位導入突變，亦可製作維持了向目標RNA之誘導功能及編輯目標RNA之功能的本發明之嚮導RNA之改變體。本發明之嚮導RNA亦可使用經修飾之核酸來製造。本發明之嚮導RNA亦可使用編碼本發明之嚮導RNA之核酸來製作。例如，本發明之嚮導RNA可藉由自包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸之表現載體轉錄本發明之嚮導RNA來製作。
＜本發明之聚核苷酸＞ 又，本發明提供一種聚核苷酸(以下，亦稱為「本發明之聚核苷酸」)，其係用於藉由ADAR編輯目標RNA者，且包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列。
本說明書中所使用之「聚核苷酸」包含未經修飾之核苷酸(DNA或RNA)及經修飾之核苷酸。作為本發明中所使用之經修飾之核苷酸之例，包括核糖之2'-OH基經修飾之核苷酸、核苷間之磷酸二酯鍵經修飾之核苷酸、核糖經轉化之核苷酸、嘌呤殘基或嘧啶殘基經修飾之核苷酸、包含經分子內交聯之核糖之核苷酸等。核糖之2'-OH基經修飾之核苷酸可列舉包含2'-O-甲基核糖、2'-氟核糖等之核苷酸。核苷間之磷酸二酯鍵經修飾之核苷酸可列舉包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯等之核苷酸、或胜肽核酸(PNA：Peptide nucleic acid)。核糖經轉化之核苷酸包含嗎啉基核酸(PMO：Morpholino nucleic acid)等。嘌呤殘基或嘧啶殘基經修飾之核苷酸包括5-甲基-脫氧胞苷-磷酸(5-Me-dCMP)、2-胺基-脫氧腺苷-磷酸(2-amino-dAMP)、包含C5-修飾嘧啶之核苷酸。包含經分子內交聯之核糖之核苷酸包含鎖核酸(LNA：Locked nucleic acid)等。本發明之聚核苷酸可基於所使用之鹼基序列及修飾之種類並藉由該領域中公知之方法來製作。
本發明之聚核苷酸之具體形態與上述＜本發明之嚮導RNA＞及＜編碼本發明之嚮導RNA之核酸＞之項中所記載之本發明之嚮導RNA之形態相同。以下表示具體例。
於一形態中，本發明之聚核苷酸係以下之任一種聚核苷酸： 一種聚核苷酸，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域直接結合於該反義領域，上述聚核苷酸實質上不含ADAR募集鹼基序列； 一種聚核苷酸，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域經由連接子連結於該反義領域，上述聚核苷酸實質上不含ADAR募集鹼基序列；或者 一種聚核苷酸，其包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，上述聚核苷酸實質上不含ADAR募集鹼基序列，且該反義領域具有與目標RNA形成錯配鹼基對之鹼基。
於一形態中，本發明之聚核苷酸包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且與該目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，實質上不含ADAR募集鹼基序列，且具有以下之特徵： (1)功能性領域係包含具有如下功能中之任一種以上功能之鹼基序列之領域，該等功能包括嚮導RNA之穩定化、使嚮導RNA局部存在於核、使嚮導RNA局部存在於細胞質、促進目標RNA與反義領域形成雙鏈、抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈、及由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定； (2)功能性領域係包含snRNA序列之領域、包含rRNA序列之領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者該等之任一種之組合； (3)功能性領域係包含snRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (4)功能性領域係選自包含U6 snRNA序列之領域、包含U1 snRNA序列之領域、及包含U7 snRNA序列之領域中之包含snRNA序列之領域、以及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (5)功能性領域係包含rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (6)功能性領域係包含5S rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域； (7)功能性領域係包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者其等之組合； (8)嚮導RNA包括反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、任意包含之又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之又一功能性領域； (9)嚮導RNA包括包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、任意包含之又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域及反義領域。
＜本發明之醫藥組合物＞ 又，本發明提供一種含有本發明之嚮導RNA、編碼本發明之嚮導RNA之核酸(本項中亦稱為「本發明之核酸」)、本發明之表現載體、或本發明之聚核苷酸、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物(亦稱為「本發明之醫藥組合物」)。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有本發明之嚮導RNA及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有本發明之嚮導RNA、ADAR、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有本發明之核酸、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有本發明之核酸、ADAR、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸之表現載體、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸及編碼ADAR之核酸之表現載體、以及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸之表現載體、包含編碼ADAR之核酸之表現載體、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有本發明之聚核苷酸、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有本發明之聚核苷酸、ADAR、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。
於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸及編碼人類ADAR1或人類ADAR2之核酸之表現載體、以及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸之表現載體、包含編碼人類ADAR1或人類ADAR2之核酸之表現載體、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有表現載體、以及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物，該表現載體含有編碼本發明之嚮導RNA之核酸及包含如下鹼基序列之核酸，該鹼基序列係編碼序列編號9所表示之胺基酸序列之多肽之鹼基序列、或包含與該胺基酸序列之同一性為90%以上之胺基酸序列，且編碼具有腺苷去胺酶活性之多肽之鹼基序列。於一形態中，本發明之醫藥組合物係含有包含編碼本發明之嚮導RNA之核酸之表現載體、含有包含如下鹼基序列之核酸之表現載體、及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物，該鹼基序列係編碼序列編號9所表示之胺基酸序列之多肽之鹼基序列、或包含與該胺基酸序列之同一性為90%以上之胺基酸序列，且編碼具有腺苷去胺酶活性之多肽之鹼基序列。
本發明之醫藥組合物可使用該領域中通常所使用之賦形劑、即藥劑用賦形劑或藥劑用載體等，藉由通常所使用之方法進行製備。作為該等醫藥組合物之劑型之例，例如可列舉注射劑、點滴用劑等非經口劑，可藉由靜脈內投予、皮下投予、皮內投予、肌肉內投予等進行投予。於製劑化時，可於藥學上所容許之範圍內，使用與該等劑型對應之賦形劑、載體、添加劑等。
本發明之嚮導RNA、本發明之核酸、本發明之表現載體、本發明之聚核苷酸、包含編碼ADAR之核酸之表現載體、或ADAR之投予量可根據目標RNA所存在之細胞、患者之症狀之程度或年齡、所使用之製劑之劑型等適宜調整投予量。例如可設為0.001 mg/kg～100 mg/kg之範圍之投予量。
關於可利用本發明之醫藥組合物來預防或治療之疾病，作為一形態，係遺傳性疾病，作為一形態，係目標RNA中之1個以上之腺苷或胞苷之編輯帶來有益之變化之任意之疾病，作為一形態，係目標RNA中之1個以上之腺苷向肌苷之轉換帶來有益之變化之任意之疾病。本發明之醫藥組合物可用作目標RNA中之1個以上之腺苷或胞苷之編輯帶來有益之變化之任意之疾病之預防或治療劑。作為一形態，本發明之醫藥組合物可用作目標RNA中之1個以上之腺苷向肌苷之轉換帶來有益之變化之任意之疾病之預防或治療劑。
本發明包括包含本發明之嚮導RNA、本發明之核酸、本發明之表現載體、或本發明之聚核苷酸的目標RNA中之1個以上之腺苷或胞苷之編輯帶來有益之變化之任意之疾病之預防或治療用醫藥組合物。又，本發明包括包含投予本發明之嚮導RNA、本發明之核酸、本發明之表現載體、或本發明之聚核苷酸之預防有效量或治療有效量之步驟的預防或治療目標RNA中之1個以上之腺苷或胞苷之編輯帶來有益之變化之任意之疾病之方法。又，本發明包括用於預防或治療目標RNA中之1個以上之腺苷或胞苷之編輯帶來有益之變化之任意之疾病的本發明之嚮導RNA、本發明之核酸、本發明之表現載體、或本發明之聚核苷酸。又，本發明包括目標RNA中之1個以上之腺苷或胞苷之編輯帶來有益之變化之任意之疾病之預防或治療用醫藥組合物之製造中的本發明之嚮導RNA、本發明之核酸、本發明之表現載體、或本發明之聚核苷酸之用途。
＜本發明之編輯目標RNA之方法＞ 又，本發明提供一種編輯使用本發明之嚮導RNA之目標RNA之方法(亦稱為「本發明之編輯方法」)。於一形態中，本發明之編輯方法包含如下方法：本發明之嚮導RNA之反義領域與目標RNA形成雙鏈，使ADAR募集於所形成之雙鏈RNA，從而所募集之ADAR將目標RNA序列之腺苷轉換為肌苷。此處，轉換為肌苷之目標RNA上之腺苷亦可與反義領域形成錯配鹼基對。於一形態中，本發明之編輯方法包含如下方法：本發明之嚮導RNA之反義領域與目標RNA形成雙鏈，使ADAR募集於所形成之雙鏈RNA，從而所募集之ADAR將目標RNA序列之胞苷轉換為尿苷。此處，轉換為尿苷之目標RNA上之胞苷亦可與反義領域形成錯配鹼基對。
本發明之編輯方法包括(i)將本發明之嚮導RNA、編碼本發明之嚮導RNA之核酸、本發明之表現載體、或本發明之聚核苷酸導入至具有目標RNA之細胞或病毒等之步驟。於一形態中，本發明之編輯方法進而包括(ii)將包含編碼ADAR、ADAR之核酸、或編碼ADAR之核酸之表現載體導入至該細胞之步驟。步驟(i)及(ii)可同時進行亦可分別進行。於一形態中，所導入之細胞係真核細胞或原核生物等，於一形態中，該細胞係哺乳動物細胞或細菌等。於一形態中，所導入之病毒包含噬菌體。於一形態中，將目標RNA之腺苷轉換為肌苷，於另一形態中，將目標RNA之胞苷轉換為尿苷。進而，於目標RNA位於編碼領域之情形時，亦可包括於轉譯時將肌苷讀取為鳥苷之步驟。 [實施例]
於無特別說明之情形時，以下之實施例中所記載之步驟可依據公知之方法實施。又，關於使用市售之套組或試劑等之部分，只要無特別說明，則依據隨附之操作說明進行實驗。
實施例1 附加有U6 snRNA序列作為功能性領域之嚮導RNA表現質粒之製作 構建將pSUPER.neo載體(Oligoengine公司，目錄編號VEC-PBS-0004)之H1 RNA聚合酶III啟動子(以下，稱為H1啟動子)置換為人類U6 snRNA聚合酶III(hU6)啟動子序列(序列編號17)所得之載體(以下，稱為pSUPER.neo-U6載體)。包含hU6啟動子序列之片段係將具有hU6啟動子之pBAsi-hU6 Neo DNA(塔卡拉生物公司，目錄編號3227)作為模板，以對5'側附加EcoRI及對3'側附加BglII之各限制酶位點之方式，使用標準之PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)法進行擴增。反應中使用DNA聚合酶Gflex(塔卡拉生物公司，目錄編號R060A)。使用限制酶EcoRI位點(5'側)及BglII位點(3'側)將所獲得之hU6啟動子片段插入至pSUPER.neo載體。利用所構建之pSUPER.neo-U6載體將E.coli DH5α感受態細胞(塔卡拉生物公司，目錄編號9057，以下稱為「DH5α大腸桿菌株」)進行轉形，並進行液體培養。將培養液進行離心而回收菌體，利用NucleoBond(註冊商標)Xtra Midi Plus EF(塔卡拉生物公司，目錄編號U0422B)進行質粒提取純化，從而獲得經擴增之pSUPER.neo-U6載體。
以如下方式構建附加有U6 snRNA序列(以下，有時稱為「U6」)作為功能性領域之嚮導RNA表現質粒。使用限制酶BglII位點(5'側)及HindIII位點(3'側)，將編碼嚮導RNA U6-ASR-STL之DNA序列(序列編號18)插入至pSUPER.neo-U6載體之hU6啟動子下游。 於製作所插入之DNA序列時，使用將以形成限制酶切斷末端之方式合成之正向寡核苷酸及反向寡核苷酸(下述)進行退火之方法。 正向寡核苷酸：編碼5'-GATCT-嚮導RNA之DNA序列-3' 反向寡核苷酸：編碼5'-AGCTT-嚮導RNA之DNA序列之反互補序列-3' 對於所插入之DNA序列，於5'側包含作為polIII之轉錄起始點而言較佳之嘌呤鹼基(G或A)，於3'側包含polIII之終止子序列。 將所製作之嚮導RNA表現質粒稱為pSUPERneo_U6_gRNA。
此處，ASR表示包含與實施例4中所使用之檢測用報道mRNA(Rluc-W104X)之一部分互補之24鹼基之反義鹼基序列，包含序列編號18所表示之DNA序列中編碼為第37鹼基至第60鹼基之序列之RNA序列。U6包含序列編號1所表示之RNA序列，編碼U6之核酸包含序列編號10所表示之DNA序列。STL包含序列編號2所表示之RNA序列，編碼STL之核酸包含序列編號11所表示之DNA序列。 將嚮導RNA之概要示於表1。表1中，「5'-」表示附加於ASR之5'側之功能性領域，「-3'」表示附加於ASR之3'側之功能性領域。「連接子」表示將ASR與各功能性領域連結之序列。 使用DH5α大腸桿菌株(塔卡拉生物公司，目錄編號9057)，以與上述相同之方式使所構建之pSUPERneo_U6_gRNA質粒增殖。
實施例2 附加有U1 snRNA序列或U7 snRNA序列或5S rRNA序列作為功能性領域之嚮導RNA表現質粒之製作 以如下方式製作附加有U1 snRNA序列、U7 snRNA序列、或5S rRNA序列(以下，有時分別稱為「U1」、「U7」、「5S」)作為功能性領域之嚮導RNA表現質粒。使用pSUPER.neo載體之H1啟動子上游之限制酶EcoRI位點(5'側)及HindIII位點(3'側)，插入各啟動子序列及編碼嚮導RNA之DNA序列。於人類U1 snRNA啟動子序列(序列編號19)、人類U7 snRNA啟動子序列(序列編號20)、或5S rRNA啟動子序列(序列編號21)之正下方，分別連結有下述之編碼嚮導RNA之DNA序列。 ＜嚮導RNA之名稱及編碼嚮導RNA之DNA序列編號＞ ASR-U1：序列編號22 ASR-U7：序列編號23 5S-ASR-STL：序列編號24 對於ASR-U1及5S-ASR-STL，於3'側包含聚T序列。
U1包含序列編號3所表示之RNA序列，編碼U1之核酸包含序列編號12所表示之DNA序列。ASR-U1(序列編號22)包含將序列編號12中第3鹼基至第10鹼基置換為ASR所得之鹼基序列。 U7包含序列編號4所表示之RNA序列，編碼U7之核酸包含序列編號13所表示之DNA序列。 5S包含序列編號5所表示之RNA序列，編碼5S之核酸包含序列編號14所表示之DNA序列。 將編碼各嚮導RNA之DNA序列之概要示於表1。
於製作所插入之DNA序列時，藉由DNA合成(FASMAC公司)製作。將所獲得之質粒分別稱為pSUPERneo_U1_gRNA、pSUPERneo_U7_gRNA、pSUPERneo_5S_gRNA。 所構建之質粒係使用DH5α大腸桿菌株(塔卡拉生物公司，目錄編號9057)，利用與實施例1相同之方法增殖。
實施例3 附加有Gq序列及/或來自BoxB序列之序列作為功能性領域之嚮導RNA表現質粒之製作 以如下方式製作附加有Gq序列(實施例中，有時亦將形成3Gq之序列稱為Gq序列)及/或來自BoxB序列之序列作為功能性領域之嚮導RNA之表現質粒。使用限制酶BglII位點(5'側)及HindIII位點(3'側)，將8種編碼嚮導RNA之DNA序列(參照後述之＜嚮導RNA之名稱及編碼嚮導RNA之DNA序列編號＞)分別插入至pSUPER.neo載體之H1啟動子下游。 ＜嚮導RNA之名稱及編碼嚮導RNA之DNA序列編號＞ ASR-Gq：序列編號25 Gq-ASR：序列編號26 ASR-BoxB：序列編號27 BoxB-ASR：序列編號28 Gq-ASR-BoxB：序列編號29 BoxB-ASR-Gq：序列編號30 ASR-Gq-BoxB：序列編號31 Gq-BoxB-ASR：序列編號32 對於所插入之DNA序列，於5'側包含作為polIII之轉錄起始點而言較佳之嘌呤鹼基(G或A)，於3'側包含polIII之終止子序列。
Gq包含序列編號6所表示之RNA序列，編碼Gq之核酸包含序列編號15所表示之DNA序列。BoxB包含序列編號7所表示之RNA序列，編碼BoxB之核酸包含序列編號16所表示之DNA序列。將各嚮導RNA之概要示於表1。
所插入之DNA序列係使用與實施例1相同之方法製作。將所獲得之嚮導RNA表現質粒統稱為pSUPERneo_H1_gRNA。 所構建之質粒係使用DH5α大腸桿菌株(塔卡拉生物公司，目錄編號9057)利用與實施例1相同之方法增殖。
再者，作為成為比較對照之嚮導RNA，使用不含功能性領域且僅編碼ASR之DNA序列(序列編號33)，以與上述相同之方式製作。對於所插入之DNA序列，於5'側包含作為polIII之轉錄起始點而言較佳之嘌呤鹼基(G或A)，於3'側包含polIII之終止子序列。
[表1]
功能性領域 嚮導RNA名 5'- 連接子 ASR 連接子 -3'
比較對照 無 ASR - - ASR(24) - -
實施例1 snRNA U6 U6-ASR-STL U6 GUCGAC UCUAGA STL
實施例2 U1 ASR-U1 AU - - U1
實施例2 U7 ASR-U7 - - - U7
實施例2 rRNA 5S 5S-ASR-STL 5S GUCGAC UCUAGA STL
實施例3 Gq ASR-Gq - - - Gq
實施例3 Gq-ASR Gq - - -
實施例3 BoxB ASR-BoxB - - UCU BoxB
實施例3 BoxB-ASR BoxB UCU - -
實施例3 Gq/BoxB Gq-ASR-BoxB Gq - UCU BoxB
實施例3 BoxB-ASR-Gq BoxB UCU - Gq
實施例3 ASR-Gq-BoxB - - - Gq-UCU- BoxB
實施例3 Gq-BoxB-ASR Gq-BoxB UCU - -
實施例4 細胞內目標RNA之編輯活性檢測用報道表現質粒之製作 作為用於細胞內目標RNA編輯活性檢測之報道mRNA，使用海腎螢光素酶(Renilla Luciferase：Rluc)mRNA。細胞內目標RNA編輯活性檢測用報道Rluc mRNA(Rluc-W104X)係基於搭載在psiCHECK-2載體(Promega公司，目錄編號C8021)之Rluc基因所編碼之Rluc mRNA序列來設計。具體而言，Rluc-W104X係以如下方式設計而成：將編碼Rluc之第104位胺基酸即Trp之UGG之第311位G置換為A，代替Trp而編碼轉譯終止密碼子(UAG)。Rluc-W104X表現質粒係使用限制酶DraIII位點(5'側)及AatII位點(3'側)將包含突變點G311A之DNA序列(序列編號34)置換為psiCHECK-2載體(Promega公司，目錄編號C8021)而製作。將所獲得之質粒稱為psiCHECK-2_Rluc-W104X。使用DH5α大腸桿菌株(塔卡拉生物公司，目錄編號9057)，利用與實施例1相同之方法使所構建之psiCHECK-2_Rluc-W104X載體增殖。
實施例5 ADAR2表現質粒之製作 使用限制酶EcoRI位點(5'側)及BglII位點(3'側)，將編碼ADAR2(序列編號9)之DNA序列(序列編號8)插入至pAAV-CMV載體(塔卡拉生物公司，目錄編號6230)之來自CMV之啟動子下游之限制酶EcoRI位點(5'側)及BamHI位點(3'側)，而製作ADAR2表現質粒。將所獲得之質粒稱為pAAV-CMV-ADAR2。對於所插入之DNA序列，於轉譯起始密碼子上游配置Kozak序列(序列編號8之第13個鹼基至第15個鹼基之「ACC」)，於ADAR2基因下游配置終止密碼子。使用DH5α大腸桿菌株(塔卡拉生物公司，目錄編號9057)，利用與實施例1相同之方法使所構建之pAAV-CMV-ADAR2質粒增殖。
實施例6 轉染 實驗1(表2中顯示結果之用以利用螢光素酶分析及桑格定序來研究RNA編輯效率的轉染) 使來自人類胚胎腎臟之細胞株HEK293細胞懸浮於添加有5%胎牛血清(FBS)之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM；ThermoFisher Scientific公司，目錄編號10569-010)，以2.0×104 細胞/100 μL接種於96孔板，於5%CO2 存在下以37℃培養一晩。
將實施例4中所製作之細胞內目標RNA編輯活性檢測用報道表現質粒(psiCHECK-2_Rluc-W104X)、實施例5中所製作之ADAR2表現質粒(pAAV-CMV-ADAR2)、實施例1、2、或3中所製作之嚮導RNA表現質粒(pSUPERneo_U6_gRNA、pSUPERneo_U1_gRNA、pSUPERneo_U7_gRNA、pSUPERneo_5S_gRNA、及pSUPERneo_H1_gRNA)、及載體質粒分別以1：40：30：9之重量比且以總量成為100 ng/孔之方式加以混合。作為載體質粒，使用pHelper載體(塔卡拉生物公司，目錄編號6230)。
利用LipofectamineTM 3000轉染試劑(ThermoFisher Scientific公司，目錄編號L3000015)對接種後培養一晩之HEK293細胞進行轉染。成為比較對照之嚮導RNA表現質粒亦以相同之方式轉染。 轉染後，於相同條件下進行培養，將培養3天之細胞供於實施例7中所記載之利用螢光素酶分析所得之RNA編輯活性及實施例8中所記載之利用桑格定序所得之RNA編輯效率的研究。
實驗2(表3中顯示結果之用以利用螢光素酶分析及桑格定序來研究RNA編輯效率的轉染) 將細胞內目標RNA編輯活性檢測用報道表現質粒(psiCHECK-2_Rluc-W104X)、ADAR2表現質粒(pAAV-CMV-ADAR2)、實施例1及3中所製作之嚮導RNA表現質粒(pSUPERneo_U6_gRNA及pSUPERneo_H1_gRNA)、及載體質粒分別以1：20：15：4之重量比且以總量成為100 ng/孔之方式進行混合，使用與實驗1相同之方法進行向EK293細胞之轉染。作為載體質粒，使用pHelper載體(塔卡拉生物公司，目錄編號6230)。
實施例7 利用螢光素酶分析檢測RNA編輯活性 於實施例6中所轉染之細胞之各孔中，使用Dual-Glo(註冊商標)螢光素酶檢測系統(Luciferase Assay System)(Promega公司，目錄編號E2940)及EnVision(PerkinElmer公司)，依據隨附操作說明測定用於修正轉染效率之螢火蟲螢光素酶發光強度(Fluc)、及用於評價編輯活性之海腎螢光素酶發光強度(Rluc)。
表2中表示實施例6之實驗1之轉染實驗中所獲得之結果。 表2中，為了修正樣品間之轉染效率而算出Rluc/Fluc值，以相對值表示將成為比較對照之ASR之Rluc/Fluc值設為1之情形之各嚮導RNA樣品之Rluc/Fluc值。表示獨立試行4次之算術平均。
[表2]
功能性領域 嚮導RNA名 Rluc/Fluc值之相對值 RNA編輯效率(%)
無(比較對照) ASR 1 N.D.
snRNA U6 U6-ASR-STL 3.06 28.5
U1 ASR-U1 2.04 23.0
U7 ASR-U7 2.60 32.9
rRNA 5S 5S-ASR-STL 6.76 52.6
Gq ASR-Gq 2.97 29.5
Gq-ASR 0.91 N.D.
BoxB ASR-BoxB 0.54 N.D.
BoxB-ASR 4.42 33.8
Gq/BoxB Gq-ASR-BoxB 0.41 N.D.
BoxB-ASR-Gq 0.68 N.D.
ASR-Gq-BoxB 2.82 23.6
Gq-BoxB-ASR 0.58 N.D.
「N.D.」表示檢測極限以下。
表3中表示實施例6之實驗2之轉染實驗中所獲得之結果。 表3中，為了修正樣品間之轉染效率而算出Rluc/Fluc值，表示3孔之算術平均值及標準偏差值以及以相對值表示將成為比較對照之ASR之Rluc/Fluc值設為1之情形之各嚮導RNA樣品之Rluc/Fluc值。
[表3]
功能性領域 嚮導RNA名 Rluc/Fluc值 RNA編輯效率(%)
相對值 算術平均值 標準偏差值
無(比較對照) ASR 1 0.026 0.0010 11.2
snRNA U6 U6-ASR-STL 6.96 0.181 0.0119 71.3
Gq ASR-Gq 6.23 0.162 0.0040 58.7
Gq-ASR 2.42 0.063 0.0017 34.2
BoxB ASR-BoxB 1.58 0.041 0.0023 20.2
BoxB-ASR 4.96 0.129 0.0102 47.2
Gq/BoxB Gq-ASR-BoxB 0.65 0.017 0.0011 12.9
BoxB-ASR-Gq 1.15 0.030 0.0029 17.0
ASR-Gq-BoxB 6.69 0.174 0.0039 68.4
若藉由ADAR蛋白及嚮導RNA於細胞內誘導目標RNA之自A向I之編輯，則突變導入之轉譯終止密碼子(UIG)於自mRNA轉譯時成為Trp，海腎螢光素酶之發光恢復。即，Rluc值越高，表示RNA編輯活性越高。
根據表2，於反義領域連結有snRNA或5S rRNA之嚮導RNA、於反義領域3'側僅連結有Gq之嚮導RNA、於反義領域5'側僅連結有BoxB之嚮導RNA、於反義領域3'側連結有Gq及BoxB之嚮導RNA的Rluc/Fluc值之相對值相對於成為比較對照之包含反義領域之嚮導RNA(ASR)顯示2.0以上。
根據表3，除了於反義領域5'側連結有Gq及於3'側連結有BoxB之嚮導RNA以外之全部嚮導RNA顯示較成為比較對照之ASR高之Rluc/Fluc值。尤其是，於反義領域連結有U6之嚮導RNA、於反義領域3'側僅連結有Gq之嚮導RNA、於反義領域5'側僅連結有BoxB之嚮導RNA、於反義領域3'側連接有Gq及BoxB之嚮導RNA的Rluc/Fluc值之相對值相對於成為比較對照之ASR顯示5.0以上。
實施例8 利用桑格定序研究RNA編輯效率 回收實施例6中所轉染之細胞，使用QIAshredder(QIAGEN公司，目錄編號79656)、RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，目錄編號74106)、RNase-free DNase Set(QIAGEN公司，目錄編號79254)，依據隨附操作說明，自所回收之細胞提取總RNA並進行純化。針對經純化之RNA，使用Recombinant DNase I(RNase-free)(塔卡拉生物公司，目錄編號2270A)，依據隨附操作說明再次進行DNA消化處理。針對所獲得之RNA，使用SuperScript(註冊商標)VILOTM cDNA合成套組(ThermoFisher Scientific公司，目錄編號11754-250)，依據隨附操作說明，進行反轉錄反應而獲得cDNA。將cDNA作為模板，使用擴增包含編輯點之片段之下述引子及PrimeSTAR(註冊商標)GXL DNA聚合酶(塔卡拉生物公司，目錄編號R050A)，依據隨附操作說明進行PCR反應。
＜表2之實驗中所使用之引子＞ 正向引子：ATGGCTTCCAAGGTGTACGACC(序列編號35) 反向引子：TTACTGCTCGTTCTTCAGCACG(序列編號36) ＜表3之實驗中所使用引子＞ 正向引子：CTCGCTGCAAGCAAATGAAC(序列編號37) 反向引子：TCGTCCCAGGACTCGATCAC(序列編號38)
PCR擴增片段係使用ExoSAP-ITTM 快速PCR產物純化試劑(Thermofisher Scientific公司，目錄編號75001.200.UL)，按照隨附操作說明進行純化，與PCR增殖所使用之正向引子一起供於利用3730xl DNA分析儀(Applied Biosystems公司)之桑格定序反應。 表2中表示實施例6之實驗1之轉染實驗中所獲得之結果。 對利用桑格定序反應所獲得之波形資料檔案(擴張子：.ab1)，藉由QSVanalyzer(Bioinformatics, 2009, Vol. 25, p3244 - 3250)加以解析，將鳥嘌呤(G)之訊號強度之比(G/(G＋A)×100)設為RNA編輯效率(%)。「N.D.」表示檢測極限以下。表示代表例之結果。 表3中表示實施例6之實驗2之轉染實驗中所獲得之結果。 表3中，對所獲得之波形資料檔案(擴張子：.ab1)，藉由QSVanalyzer加以解析。將未編輯Rluc-W104X之G之訊號強度修正為0且將A之訊號強度修正為1，將野生型Rluc之G之訊號強度修正為1且將A之訊號強度修正為0，將此時之G經修正之訊號強度之比(G/(G＋A)×100)設為RNA編輯效率(%)。表示代表例之結果。
根據表2，成為比較對照之ASR所誘導之RNA編輯效率為檢測極限以下。於相同條件下，於反義領域連結有snRNA或5S rRNA之嚮導RNA、於反義領域3'側僅連結有Gq之嚮導RNA、於反義領域5'側僅連結有BoxB之嚮導RNA、於反義領域3側連結有Gq及BoxB之嚮導RNA顯示23%以上之RNA編輯效率。 表3中所記載之包含連結有功能性領域之反義領域之本發明之嚮導RNA顯示較成為比較對照之ASR高之RNA編輯效率。尤其是，於反義領域連結有U6之嚮導RNA、於反義領域3'側僅連結有Gq之嚮導RNA、於反義領域5'側僅連結有BoxB之嚮導RNA、於反義領域3'側連結有Gq及BoxB之嚮導RNA顯示47%以上之RNA編輯效率。
實施例9 以螢火蟲螢光素酶(Fluc)mRNA為目標之RNA編輯效率之研究 確認本發明之嚮導RNA是否對不同之目標RNA均顯示較高之RNA編輯效率。 以與實施例1及3相同之方式製作以搭載於psiCHECK-2載體(Promega公司，目錄編號C8021)之螢火蟲螢光素酶(Fluc)之編碼領域內第167個A作為編輯目標之嚮導RNA表現質粒。編碼製作所使用之嚮導RNA之DNA序列如下所述。 ＜嚮導RNA之名稱及編碼嚮導RNA之DNA序列編號＞ U6-ASRf-STL：序列編號39 ASRf-Gq：序列編號40 Gq-ASRf：序列編號41 ASRf-BoxB：序列編號42 BoxB-ASRf：序列編號43 Gq-ASRf-BoxB：序列編號44 BoxB-ASRf-Gq：序列編號45 ASRf-Gq-BoxB：序列編號46 Gq-BoxB-ASRf：序列編號47 對於DNA序列，於5'側包含作為polIII之轉錄起始點而言較佳之嘌呤鹼基(G或A)，於3'側包含polIII之終止子序列。 將所獲得之質粒統稱為pSUPERneo_gRNAf。 ASRf表示包含與包含編輯目標之A之Fluc報道mRNA互補之24鹼基之反義鹼基序列，包含編碼為序列編號40所表示之DNA序列之第3個鹼基至第26鹼基之序列之RNA鹼基序列。 再者，成為比較對照之嚮導RNA表現質粒亦以相同之方式，使用不含功能性領域且僅編碼ASRf之DNA序列(序列編號48)而製作。
以與實施例6之實驗1相同之方式，將Fluc報道表現質粒(psiCHECK-2(Promega公司，C8021)、實施例5中所製作之ADAR2表現質粒(pAAV-CMV-ADAR2)、上述之嚮導RNA表現質粒(pSUPERneo_gRNAf)、及載體質粒分別以1：80：100：19之重量比且以總量成為100 ng/孔之方式進行混合，使用LipofectamineTM 3000轉染試劑(ThermoFisher Scientific公司，目錄編號L3000015)對HEK293細胞進行轉染。成為比較對照之嚮導RNA表現質粒亦以相同之方式進行轉染。作為載體質粒，使用pHelper載體(塔卡拉生物公司，目錄編號6230)。 以與實施例8(表2之情形)相同之方式進行PCR反應，使用序列引子進行桑格定序反應。根據桑格定序反應之波形資料檔案，與表2同樣地算出以Fluc報道mRNA為目標之RNA編輯效率。下述表示本試驗之PCR反應及桑格定序反應所使用之引子。 正向引子Fluc：ACCCGCTTAAAAGCTTGGC(序列編號49) 反向引子Fluc：CCACGGTAGGCTGAGAAATG(序列編號50) 序列引子：CATGCTGTTCAGCAGCTCGC(序列編號51) 將獨立試行3次之算術平均示於表4。
[表4]
功能性領域 嚮導RNA名 RNA編輯效率(%)
無(比較對照) ASRf 5.7
snRNA U6 U6-ASRf-STL 17.5
Gq ASRf-Gq 19.5
Gq-ASRf 7.3
BoxB ASRf-BoxB 8.9
BoxB-ASRf 5.1
Gq/BoxB Gq-ASRf-BoxB 4.2
BoxB-ASRf-Gq 18.2
ASRf-Gq-BoxB 9.2
Gq-BoxB-ASRf 2.5
於反義領域連結有U6之嚮導RNA、於反義領域5'側或3'側僅連結有Gq之嚮導RNA、於反義領域3'側僅連結有BoxB之嚮導RNA、於反義領域5'側連結有BoxB及於3'側連結有Gq之嚮導RNA、於反義領域3'側連結有Gq及BoxB之嚮導RNA顯示較成為比較對照之ASRf高之RNA編輯效率。尤其是，於反義領域連結有U6之嚮導RNA、於反義領域3'側僅連接有Gq之嚮導RNA、於反義領域5'側連結有BoxB及於3'側連結有Gq之嚮導RNA顯示17%以上之RNA編輯效率。
實施例10 嚮導RNA於細胞內之穩定性之研究 嚮導RNA於細胞內之穩定性可藉由轉錄抑制後之嚮導RNA之殘存量之比較進行評價。於嚮導RNA導入至細胞後成為目標之嚮導RNA之殘存量越多，意味著穩定性越高。
利用添加有5%FBS之DMEM培養HEK293細胞，以1×105 細胞/0.5 mL接種至24孔板，於5%CO2 存在下以37℃培養一晩。第二天，將實施例4中所製作之細胞內目標RNA編輯活性檢測用報道表現質粒(psiCHECK-2_Rluc-W104X)、實施例5中所製作之ADAR2表現質粒(pAAV-CMV-ADAR2)、以及實施例1及3中所製作之嚮導RNA表現質粒(pSUPERneo_H1_gRNA及pSUPERneo_U6_gRNA)、及載體質粒分別以1：40：30：9之重量比且以總量成為400 ng/孔之方式混合。作為載體質粒，使用pHelper載體(塔卡拉生物公司，目錄編號6230)。使用LipofectamineTM 3000轉染試劑(Thermo Fisher Scientific公司，目錄編號L3000015)對HEK293細胞進行轉染。
於轉染24小時後回收一部分孔之細胞，將放射菌素D添加前之狀態設為0小時。同時，未回收之孔置換為以5 μg/mL添加有放射菌素D(和光純藥公司，目錄編號010-21263)之DMEM。已知放射菌素D係結合於雙鏈DNA而抑制利用RNA聚合酶之轉錄。於放射菌素D添加後4小時及6小時回收細胞，使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，目錄編號217004)及RNase-free DNase Set(QIAGEN公司，目錄編號79254)，依據隨附操作說明，自所回收之細胞提取包含嚮導RNA之總RNA並進行純化。針對所獲得之RNA，使用Mir-X miRNA第一鏈合成套組(塔卡拉生物公司，目錄編號638315)，依據隨附操作說明，對小RNA進行聚A附加後，進行反轉錄反應而獲得cDNA。將cDNA作為模板，使用PrimeSTAR(註冊商標)GXL DNA聚合酶(塔卡拉生物公司，目錄編號R050A)，進行2種降落PCR反應。細胞中表現為內源性之U6 snRNA之PCR反應中使用Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green(註冊商標)套組(塔卡拉生物公司，目錄編號638314)所隨附之U6正向引子及U6反向引子。細胞內源性U6 snRNA量用於修正樣品間之嚮導RNA量。嚮導RNA之PCR反應中使用與ASR相同之序列(序列編號52)之引子及上述套組所隨附之mRQ 3'引子。降落PCR之反應條件包括：94℃、1分鐘之循環前熱改性階段、包含98℃、10秒之熱改性、65℃、15秒之退火、68℃、30秒之伸長反應之擴增階段、72℃、3分鐘之伸長反應階段。其中，擴增階段之第1循環至第5循環係每經過一循環退火溫度各降低1℃之降落方式，第6循環以後之退火溫度維持於60℃。細胞內源性U6 snRNA之PCR之增殖階段以總計23循環實施，嚮導RNA之PCR之增殖階段以總計20循環實施。
各PCR產物係使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，利用ChemiDocTM 觸控成像系統(BIO RAD公司)拍攝泳動結果。PCR條帶係利用Image Lab 6.1 Software for Windows(BIO RAD公司)定量。 表5中算出由以細胞內源性U6 snRNA作為模板之PCR條帶之訊號強度修正以嚮導RNA作為模板之PCR條帶之訊號強度所得之值(嚮導RNA/U6值)。嚮導RNA之殘存量係將放射菌素D添加前之值設為1，表示放射菌素D添加後4小時及6小時之嚮導RNA/U6值之相對值。表示獨立試行3次之算術平均。
[表5]
功能性領域 嚮導RNA名 嚮導RNA之殘存量
4小時 6小時
無(比較對照) ASR 0.36 0.40
snRNA U6 U6-ASR-STL 0.46 0.52
Gq ASR-Gq 0.48 0.59
BoxB BoxB-ASR 0.57 0.68
放射菌素D添加後之嚮導RNA之殘存量越多，意味著細胞內之該嚮導RNA之穩定性越高。 確認到表5中所示之本發明之嚮導RNA與成為比較對照之ASR相比，於放射菌素D添加後4小時及6小時顯示較高之嚮導RNA之殘存量，穩定性較高。 [產業上之可利用性]
本發明之嚮導RNA對編輯目標RNA有用，本發明之嚮導RNA、編碼本發明之嚮導RNA之核酸、本發明之表現載體、或本發明之包含多肽之醫藥組合物於可用於以遺傳性疾病為代表之可藉由編輯目標RNA來預防或治療之各種疾病之方面有用。 [序列表非關鍵文字]
序列編號1～7：合成RNA 序列編號10～52：合成DNA
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Claims (22)

  1. 一種嚮導RNA，其係用於藉由ADAR編輯目標RNA者，且包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且會與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，上述嚮導RNA實質上不含ADAR募集鹼基序列，且至少1個功能性領域直接結合於反義領域或經由連接子連結於反義領域。
  2. 如請求項1之嚮導RNA，其中反義領域具有與目標RNA形成錯配鹼基對之鹼基。
  3. 如請求項1或2之嚮導RNA，其中功能性領域係包含具有如下功能中之任一種以上功能之鹼基序列的領域，該等功能包括：嚮導RNA之穩定化、使嚮導RNA局部存在於核、使嚮導RNA局部存在於細胞質、促進目標RNA與反義領域形成雙鏈、抑制利用反義領域形成非特異性雙鏈、及由目標RNA與反義領域所形成之複合體之穩定化。
  4. 如請求項1或2之嚮導RNA，其中功能性領域係包含snRNA序列之領域、包含rRNA序列之領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域、或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者其等之任一者之組合。
  5. 如請求項4之嚮導RNA，其中功能性領域係包含snRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域。
  6. 如請求項5之嚮導RNA，其中包含snRNA序列之領域係包含U6 snRNA序列之領域、包含U1 snRNA序列之領域、或包含U7 snRNA序列之領域。
  7. 如請求項4之嚮導RNA，其中功能性領域係包含rRNA序列之領域及任意包含之包含形成莖環結構之鹼基序列之領域。
  8. 如請求項7之嚮導RNA，其中包含rRNA序列之領域係包含5S rRNA序列之領域。
  9. 如請求項4之嚮導RNA，其中功能性領域係包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之領域或包含形成莖環結構之鹼基序列之領域、或者其等之組合。
  10. 如請求項1或2之嚮導RNA，其包括反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、任意包含之又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有反義領域、包含形成鳥嘌呤四鏈體結構之鹼基序列之功能性領域、及任意包含之又一功能性領域。
  11. 如請求項1或2之嚮導RNA，其包括包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域、反義領域、任意包含之又一功能性領域、及任意包含之連接子，且自5'側至3'側依序連結有包含形成莖環結構之鹼基序列之功能性領域及反義領域。
  12. 一種編輯目標RNA之系統，其包含如請求項1至11中任一項之嚮導RNA及ADAR。
  13. 一種核酸，其編碼如請求項1至11中任一項之嚮導RNA。
  14. 一種表現載體，其包含編碼如請求項1至11中任一項之嚮導RNA之核酸。
  15. 如請求項14之表現載體，其進而包含編碼ADAR之核酸。
  16. 如請求項15之表現載體，其中ADAR為ADAR1或ADAR2。
  17. 一種宿主細胞，其導入有如請求項14至16中任一項之表現載體。
  18. 一種製造表現載體之方法，其包括培養如請求項17之宿主細胞之步驟。
  19. 一種醫藥組合物，其含有如請求項14至16中任一項之表現載體及藥學上所容許之賦形劑。
  20. 一種醫藥組合物，其含有如請求項14之表現載體、包含編碼ADAR之核酸之表現載體、及藥學上所容許之賦形劑。
  21. 一種編輯目標RNA之方法，其包括將編碼如請求項1至11中任一項之嚮導RNA之核酸導入至細胞或病毒等之步驟。
  22. 一種聚核苷酸，其係用於藉由ADAR編輯目標RNA者，且包含至少1個功能性領域及與該目標RNA之一部分互補且與目標RNA形成雙鏈之反義領域，至少1個該功能性領域連結於該反義領域，上述聚核苷酸實質上不含ADAR募集鹼基序列。
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