JP6544750B2 - Dnaアプタマーの安定化法 - Google Patents
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Description
(1)既存のDNAアプタマーの標的分子結合能を強化、及び/又は該アプタマーを安定化する塩基配列の設計方法であって、一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含むDNAアプタマーにおいて、一組のステム構造及びループ構造で構成されるヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換することを含み、前記ミニヘアピン構造が、5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下の(A)〜(C)の核酸領域:(A)2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、(B)gna又はgnna(ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである)の塩基配列からなる第2核酸領域、及び(C)第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、前記設計方法。
(2)前記DNAアプタマーが、一以上の塩基類似体及び/又は修飾塩基を含む、(1)に記載の方法。
(3)前記塩基類似体が、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylである、(2)に記載の方法。
(4)ミニヘアピンを構成するステム構造以外のステム構造中のGC対を増加させることを含む、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記一以上のステム構造の一つがDNAアプタマーの末端を構成する場合に、該DNAアプタマーの末端においてGC対を1対〜5対増加させることを含む、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記DNAアプタマーの一方の末端に、(1)に規定されるミニヘアピン構造を付加することを含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載の方法に従ってDNAアプタマーの塩基配列を設計する工程、及び設計された塩基配列に基づきDNAアプタマーを生産する工程を含む、標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーの製造方法。
(8)DNAアプタマーの塩基配列を設計する工程、及び設計された塩基配列に基づきDNAアプタマーを生産する工程を含む製造法によって得られる標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーであって、前記設計工程が、一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含むDNAアプタマーにおいて、一組のステム構造及びループ構造で構成されるヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換することを含み、前記ミニヘアピン構造が、5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下の(A)〜(C)の核酸領域:(A)2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、(B)gna又はgnna(ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである)の塩基配列からなる第2核酸領域、及び(C)第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、前記DNAアプタマー。
(9)一以上の塩基類似体及び/又は修飾塩基を含む、(8)に記載のDNAアプタマー。
(10)前記塩基類似体が、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylである、(9)に記載のDNAアプタマー。
(11)前記設計工程が、ミニヘアピンを構成するステム構造以外のステム構造中のGC対を増加させることを含む、(8)〜(10)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(12)前記一以上のステム構造の一つがDNAアプタマーの末端を構成する場合に、前記設計工程が、該DNAアプタマーの末端においてGC対を1対〜5対増加させることを含む、(8)〜(11)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(13)前記設計工程が、前記DNAアプタマーの一方の末端に、(8)に規定されるミニヘアピン構造を付加することを含む、(8)〜(12)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(14)一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有するDNAアプタマーであって、該DNAアプタマーの非末端部に存在し、一組のステム構造及びループ構造で構成される一以上のヘアピン構造が、5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下の(A)〜(C)の核酸領域:(A)2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、(B)gna又はgnna(ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである)の塩基配列からなる第2核酸領域、及び(C)第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、前記DNAアプタマー。
(15)前記一以上のステム構造における総GC含量が75%以上である、(14)に記載のDNAアプタマー。
(16)(14)に規定されるヘアピン構造を一方の末端にさらに含む、(14)又は(15)に記載のDNAアプタマー。
(17)配列番号6及び8〜11のいずれかに示される塩基配列からなる、IFN-γ用DNAアプタマー。
(18)配列番号19〜22のいずれかに示される塩基配列からなる、VEGF用DNAアプタマー。
(19)配列番号14〜16のいずれかに示される塩基配列からなる、vWF用DNAアプタマー。
(20)(8)〜(19)のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
本明細書で使用する一般的な用語の定義について以下で説明する。
2.DNAアプタマーの設計方法
第1の実施形態において、本発明は、既存のDNAアプタマーの標的分子結合能を強化、及び/又は該アプタマーを安定化する塩基配列の設計方法に関する。本発明は、特にDNAアプタマーの二次構造レベルの情報に基づいて、結合能の強化及び/又は安定化を可能にする方法に関する。本発明に従う塩基配列の設計方法は、必須の工程として、第1工程を含む。また、本発明に従う塩基配列の設計方法は、第2工程、第3工程、及び第4工程、の1つ以上を任意の工程として含む。これらの任意の工程が含まれる場合、各工程の順序は制限しない。ただし、第3工程及び第4工程の両方が含まれる場合には、第4工程は第3工程の後に行われる。本発明の塩基配列の設計方法を構成する各工程を、以下に説明する。
2−1.第1工程
本明細書において、「第1工程」とは、一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含む既存のDNAアプタマーにおいて、一組のステム構造及びループ構造で構成されるヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換する工程である。
2−2.第2工程
本明細書において、「第2工程」とは、既存のDNAアプタマーがステム構造を二つ以上有する場合に、一以上のステム構造中のGC対を増加させる工程である。本工程は、ステム構造中の一以上のAT対をGC対に置換すること、及び/又はステム構造中にGC対を追加することにより行うことができる。第2の工程の対象ステム構造の部位は、ミニヘアピン構造を構成するステム構造でない限り、特に制限しない。増加させるGC対の数は、例えば10対以下、好ましくは5対以下、4対以下、3対以下、2対以下、又は1対である。例えば、置換の場合、ステム構造中の全てのAT対をGC対に置換してもよいし、ステム構造中のAT対を、例えば10対以下、好ましくは5対以下、4対以下、3対以下、2対以下、又は1対、GC対に置換してもよい。同様に、ステム構造中にGC対を追加する場合には、ステム構造中にGC対を、例えば10対以下、好ましくは5対以下、4対以下、3対以下、2対以下、又は1対、付加してもよい。GC対を付加する部位は、ステム構造の末端でもよいし、ステム構造の内部であってもよい。
(i)バルジ構造がG又はCの塩基を含む場合
この場合には、バルジ構造を構成する塩基に対して塩基対合を形成するように、他方の鎖にG又はCを付加することにより、ステム構造中のGC対を増加させることができる。バルジ構造を構成する塩基と同数の塩基を他方の鎖に付加してもよく、この場合、塩基の付加後、ステム構造を構成する塩基対は完全に対合し、バルジ構造はなくなる。バルジ構造を構成する塩基よりも少ない数の塩基を他方の鎖に付加してもよく、この場合、塩基の付加後、ステム構造を構成する塩基対は部分的に塩基対合し、バルジ構造が残る。G又はCの付加数は、バルジ構造を構成する塩基の数より少ない限り特に限定しないが、例えば10以下、好ましくは5以下、4以下、3以下、2以下、又は1以下である。
(ii)バルジ構造がA又はTの塩基を含む場合
この場合には、バルジ構造を構成するA又はTをG又はCに置換した後に、この塩基に対して塩基対合を形成するように、他方の鎖にG又はCを付加することにより、ステム構造中のGC対を増加させることができる。バルジ構造を構成するA又はTをG又はCに置換した後に、上記(i)に従ってG又はCを付加する。バルジ構造を構成する全てのA又はTの塩基に対して置換・付加を行ってもよいし、一部のA又はTの塩基に対して置換・付加を行ってもよい。
(iii)インターナルループ構造を形成するヌクレオチドの数が、一方の鎖ともう一方の鎖において等しい場合
この場合には、ステム構造中に存在するのインターナルループを構成している塩基を、双方の鎖から同数、例えばそれぞれ10塩基以下、好ましくは5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、又は1塩基ずつ、GC対に置換することにより、ステム構造中のGC対を増加させることができる。インターナルループを構成する塩基の全てをGC対に置換してもよいし、一部の塩基をGC対に置換してもよい。一部の塩基を置換する場合には、インターナルループ構造の末端、すなわちインターナルループがステム構造と接している部分においてGC対への置換を行うことが好ましい。インターナルループ構造の内部、すなわちインターナルループがステム構造と接していない部分においてGC対へ置換を行う場合には、ステム構造内に、さらにバルジ構造及び/又はインターナルループ構造が形成され得る。この場合、新たに形成されたバルジ構造及び/又はインターナルループ構造に対して、(i)〜(iv)に従って置換及び/又は付加を行うことによりさらにステム構造中のGC対を増加させてもよい。
(iv)インターナルループ構造を形成するヌクレオチドの数が、一方の鎖ともう一方の鎖において異なる場合
(iii)の場合と同様に、ステム構造中に存在する塩基対合を形成していない塩基を、双方の鎖から同数、例えばそれぞれ10塩基以下、好ましくは5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、又は1塩基ずつ、GC対に置換することにより、ステム構造中のGC対を増加させることができる。置換を行う部位については、(iii)の場合と同様であるため記載を省略する。ただし、(iv)の場合、塩基対合を形成していない塩基を、双方の鎖から同数ずつGC対へ置換する数を増やすと、最終的に一方の鎖にバルジ構造が生じる。この場合、形成された構造に対して、上記(i)又は(ii)にしたがって、置換及び/又は付加を行うことによりさらにステム構造中のGC対を増加させてもよい。
2−3.第3工程
本明細書において、「第3工程」とは、DNAアプタマーの少なくとも一方の末端がステム構造を構成している場合に、DNAアプタマーの末端においてGC対を増加させる工程である。GC対の付加数は、DNAアプタマーの標的分子への結合性が低下しない限り制限しないが、例えば5対以下、好ましくは3対以下、2対以下、又は1対である。
2−4.第4工程
本明細書において、「第4工程」とは、DNAアプタマーの一方の末端に、ミニヘアピン構造を付加する工程である。5'末端及び3'末端のどちらの末端にミニヘアピン構造を付加するかは特に制限はないが、3'末端にミニヘアピン構造を付加することが好ましい。
2−5.効果
本発明の塩基配列の設計方法によれば、既存のDNAアプタマーの標的分子結合能を強化、及び/又は該アプタマーを安定化することが可能となる。
3.標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーの製造方法
第2の実施形態において、本発明は、第1の実施形態に記載の塩基配列の設計方法に基づいてDNAアプタマーの塩基配列を設計する工程、及び設計された塩基配列に基づきDNAアプタマーを生産する工程を含む、標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーの製造方法に関する。設計工程は第1の実施形態に記載の通りであるからここでは記載を省略する。
4.DNAアプタマー
第3の実施形態において、本発明は、一以上のステム構造及びループ構造を有するDNAアプタマーであって、該DNAアプタマーの非末端部に存在するヘアピン構造が、ミニヘアピン構造であるDNAアプタマーに関する。本発明のDNAアプタマーは、第2の実施形態に記載の製造方法によって得てもよい。
5.IFN-γ用DNAアプタマー
本発明の第4の実施形態は、インターフェロン-γ(本明細書では、「IFN-γ」と略称する)用DNAアプタマーである。本発明のIFN-γ用DNAアプタマーは、上記第3の実施形態で記載したDNAアプタマーの構成を有する。
6.VEGF用DNAアプタマー
本発明の第5の実施形態は、血管内皮細胞増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor:本明細書では、「VEGF」と略称する)用DNAアプタマーである。
7.vWF用DNAアプタマー
本発明の第6の実施形態は、ヴォン・ヴィレブランド因子(von Willebrand factor:本明細書では、「vWF」と略称する)用DNAアプタマー、特にvWFのA1ドメイン用DNAアプタマーである。
8.医薬組成物
本発明の第7の実施形態は、医薬組成物である。
8−1.構成
本発明の医薬組成物は、前記実施形態3〜6のいずれかに記載のDNAアプタマーを有効成分として少なくとも一つ含有する。また、本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する医薬組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、前記標的物質機能抑制剤の効果を維持するために、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、潤滑沢剤又は界面活性剤が挙げられる。
8−2.製造方法
本発明の医薬組成物を製造するには、原則として当該分野で公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co.,Easton,Pa.)に記載の方法を参照することができる。
8−3.投与方法
本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患等の治療又は予防のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
9.標的物質検出方法
本発明の第8の実施形態は、前記実施形態3〜6のいずれかに記載のDNAアプタマーを用いた標的物質の検出方法である。
9−1.構成
第3〜6の実施形態いずれかに記載のDNAアプタマーは、その標的物質と極めて強固に、かつ特異的に結合し得るため、DNAアプタマーのその性質を利用して試料中に存在する標的物質を検出することができる。
ミニヘアピン構造(GCGNNACGC(配列番号23)又はGCGNAGC(配列番号24)(N=A、T、G、C)等の配列からなる短いDNA断片)の導入、及びステム配列中のA-T塩基対のG-C塩基対への置換によるDNAアプタマーの安定性への効果を調べるために、まずヒトIFN-γ用DNAアプタマーについて、各種核酸断片を設計して調製した。本実施例において調製したアプタマーの配列とその二次構造は図6に示した。
[実施例2:各種IFN-γ用アプタマーのヒトIFN-γに対する結合活性解析]
実施例1で調製した各種核酸のヒトIFN-γへの結合を調べるために、人工塩基Dsを含むAptamer 49を用いた競合実験を行った。20μLの反応液(1×PBS、0.005% Nonidet P-40)中で、[γ-32P]ATPにより標識したAptamer 49 (最終濃度200nM)、実施例1で調製したアプタマー(最終濃度200nM)、及びヒトIFN-γ(最終濃度200nM、Peprotech社)が含まれるように調製し、37℃で30分間インキュベートした。その後、ブロモフェノールブルーを含む25%グリセロールを終濃度5%グリセロールとなるように加え、10%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってヒトIFN-γに結合した標識化Aptamer 49と遊離状態の標識化Aptamer 49とを分離し、ゲルを乾燥させ、バイオイメージアナライザーFLA-7000(富士フィルム)によって可視化して、放射活性を測定した。ゲルシフト率、阻害率、相対結合率は、以下の通り算出した。ゲルシフト率は、複合体の放射活性を、遊離および複合体の放射活性の総和で割った数値の百分率として算出した。阻害率は、各競合アプタマー存在下でのゲルシフト率を競合アプタマー非存在下でのゲルシフト率で割った値の百分率を100から引いた値として算出した。相対結合率は、各アプタマーの阻害率をAptamer 49の阻害率で割ることにより算出した。
<結果>
各種アプタマー変異体のAptamer 49に対する結合阻害比率を図7に示した。コントロールとなるAptamer 49の結合阻害比率を1.00とした場合、ミニヘアピン構造を含むアプタマー変異体の相対結合率はそれぞれ、0.05(Aptamer 49A)、1.29(Aptamer 58)、0.26(Aptamer 58GC)、1.53(Aptamer 57GCmh)、1.40(Aptamer 57mh)であった。コントロールとなるAptamer 49と比べ、ミニヘアピンを含むAptamer 58、Aptamer 57mh、及びAptamer 57GCmhは有意に結合力が高いことがわかった。なかでも3'末端にミニヘアピンを付加し、内部のヘアピン部分をミニヘアピンに置換し、さらにステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換したAptamer 57GCmhは特に結合力が高かった。
[実施例3:各種IFN-γ用アプタマーの核酸分解酵素などに対する安定性解析]
<方法>
血清中に含まれる核酸分解酵素は核酸の生物学的応用において問題となるDNA分解の主な原因の一つであるため、ミニヘアピン構造を含むDNAアプタマーのヒト血清中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性を調べた。
<結果>
結果を図9に示す。コントロールのDNAアプタマー(Aptamer 49)は、ヒト血清存在下6時間後で全長産物に相当するバンドは55%まで分解された。そして、24時間後には全長産物に相当するバンドは14%まで分解されて、さらに72時間後には9%まで分解された。一方、ミニヘアピンDNAを含むDNAアプタマー(Aptamer 58、Aptamer 57mh、Aptamer 57GCmh)はヒト血清存在下72時間後でもまだ全量のうちの30%以上が全長産物の状態で保持されていることがバンドパターンから確認できた。なかでも、3’末端にミニヘアピンを付加し、内部のヘアピン部分をミニヘアピンDNAに置換し、さらにステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換したAptamer 57GCmhは、ヒト血清存在下72時間後でも80%以上が全長を維持しており、ミニヘアピンDNAの付加等によりヒト血清中に含まれる核酸分解酵素などに対する安定性が顕著に上昇することがわかった。
[実施例4:各種IFN-γ用アプタマーの熱安定性解析]
<方法>
各種DNAアプタマー(Aptamer 49、Aptamer 49A、Aptamer 58、Aptamer 58GC、Aptamer 57mh、Aptamer 57GCmh、最終濃度2μM)の熱安定性を、Tm値の測定により検討した。温度上昇変化(0.5℃/min)におけるDNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV−2450(島津)により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
<結果>
結果を図10に示す。コントロールのDNAアプタマー(Aptamer 49)のTm値は、37.8℃であったのに対して、人工塩基を含まないDNAアプタマー(Aptamer 49A)のTm値は、33.4℃であった。ミニヘアピン構造を含むDsアプタマー変異体のTm値はそれぞれ、43.9℃(Aptamer 58)、72.0℃(Aptamer 58GC)、51.1℃(Aptamer 57mh)、64.2℃(Aptamer 57GCmh)であった。ミニヘアピンDNAをDNAアプタマーに付加することでTm値が顕著に上昇しており、熱安定性が向上していることがわかった。また、ステム配列中のA-T塩基対をG-C塩基対に置換することでさらにTm値が上昇することがわかった。
[実施例5:各種Dsアプタマー培養細胞でのIFN-γ刺激応答抑制効果の解析]
本実施例では、調製した各種のDNAアプタマーの存在下で、IFN-γ刺激応答によるSTAT−1のリン酸化の程度を解析することにより、IFN-γとIFN-γ受容体との相互作用に対する、各種アプタマーの阻害効果を調べた。
<方法>
1)細胞培養
MDA-MB-231細胞の培養は、10%ウシ胎児血清(FBS、Atlanta Biologicals社)を含むDMEM培地(Dulbecco’s Minimal Essential Medium、Corning cellgro社)に、抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン)とL-glutamineの100倍溶液(Gibco社)を添加したものを用いて行った。
2)IFN-γによる刺激処理
IFN-γによる刺激の前処理として、106 /mLのMDA-MB-231細胞を含む10%FBS含有DMEM培地をポリスチレン製のラウンドチューブ(Falcon社)に入れて、37度で15分間インキュベートした。その後、1200gで5分間遠心することで細胞を回収した後、リコンビナントタンパク質のヒトIFN-γ(Peprotech社)を2 ng/mL含むDMEM培地に再懸濁し、37度で10分間インキュベートして、IFN-γによる刺激を行った。その後、遠心して細胞を回収した後、PBSで一回洗浄することで刺激を終結し、FACS解析用の細胞とした。
3)アプタマー存在下でのIFN-γによる刺激処理
上記2)同様、刺激の前処理として、106 /mLのMDA-MB-231細胞を含む10%FBS含有DMEM培地をポリスチレン製のラウンドチューブ(Falcon社)に入れて、37度で15分間インキュベートした。その後、1200gで5分間遠心することで細胞を回収した後、アプタマーを含む血清含有培地で細胞を再懸濁して一晩室温又は37℃でインキュベートした後、翌朝IFNγを添加して、37度で10分間インキュベートすることで刺激を行った。その後、遠心して細胞を回収した後、PBSで一回洗浄することで刺激を終結し、FACS解析用の細胞とした。
4)FACS解析用の細胞の調製
IFN-γによる刺激処理を行い、PBSで洗浄した上述の細胞を、1mLの2%パラホルムアルデヒド溶液(Electron Microscopy Science社)に懸濁し、10分間室温でインキュベートした後に、遠心により細胞を回収した。回収した細胞は、冷却した90%メタノール、1 mlに再懸濁し、4度遮光条件下で、30分間から60分間、もしくは一晩インキュベートした。遠心して回収した細胞は、0.5 mLのFACS解析用緩衝液(1×PBS pH 7.4、0.1%のアジ化ナトリウム及び0.1%のBSAを含む)で2回洗浄した後、7.5μLの抗リン酸化STAT-1抗体溶液(BD Phosflow PE mouse anti-Stat-1 pY701)を含む0.1mLのFACS解析用緩衝液中にて、4度遮光条件下30分間から60分間インキュベートし、0.5 mLのFACS解析用緩衝液で2回洗浄した。洗浄後の細胞を0.5mLのFACS解析用緩衝液に懸濁した後、フローサイトメトリーで解析した。
<結果>
MDA-MB-231細胞に2ng/mLの濃度で37℃、10分間IFN-γを反応させ、抗リン酸化STAT-1抗体を用いてFACS解析したところ、IFN-γによる刺激応答によって抗リン酸化STAT-1抗体による蛍光強度の明らかな増加を確認した(図11)。
[実施例6:天然塩基からなるIFN-γ用アプタマーのヒトIFN-γに対する結合活性解析]
本実施例では、人工塩基を含まない天然塩基のみで構成されるDNAアプタマーに対してもミニヘアピンDNAの付加及びステム構造へのGC対の付加によって結合活性が向上するかどうかを調べた。
<方法>
図14に示される塩基配列を有する核酸を化学合成によって調製した。
<結果>
各種アプタマー変異体のAptamer 49に対する結合阻害比率は図15に示した。コントロールとなるAptamer 49Aの結合阻害比率を1.00とした場合、ミニヘアピン構造を含むアプタマー変異体の結合阻害比率(相対結合率)はそれぞれ、3.00(Aptamer 57AGCmh)、3.09(Aptamer 57Amh)であった。コントロールとなるAptamer49Aと比べ、ミニヘアピンを含むAptamer 57AGCmh 、Aptamer 57Amhは有意に結合力が向上していることがわかった。
[実施例7:天然塩基からなるIFN-γ用アプタマーの熱安定性解析]
<方法>
各種天然塩基DNAアプタマー(Aptamer 49A、Aptamer 57Amh、Aptamer 57AGCmh、最終濃度2 μM)の熱安定性を、Tm値の測定により検討した。温度上昇変化(0.5℃/min)におけるDNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV−2450(島津)により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
<結果>
結果を図16に示す。コントロールのDNAアプタマー(Aptamer 49A)のTm値は、33.4℃であったのに対して、ミニヘアピン構造を含む天然塩基からなるアプタマー変異体のTm値はそれぞれ、45.4℃(Aptamer 57Amh)、61.6℃(Aptamer 57AGCmh)であった。ミニヘアピンDNAをDNAアプタマーに付加することでTm値が顕著に上昇しており、熱安定性が向上していることがわかった。この結果により、ミニヘアピン付加及びGC付加は、人工塩基Dsの有無に関係無くDNAアプタマーの熱安定性を向上させるものであることがわかった。
[実施例8:vWF用アプタマーのvWF A1ドメインに対する結合活性解析]
IFN-γ以外のタンパクに対するDNAアプタマーに対してもミニヘアピンDNAを付加することで結合活性が向上するかどうかを調べた。
<方法>
図17に示される塩基配列を有する核酸を化学合成によって調製した。
<結果>
各種アプタマー変異体の標識化ARC1172(wt)に対する結合阻害比率は図18に示した。コントロールとなる非標識化ARC1172(wt)の結合阻害比率を1.00とした場合、3'末端inverted dT付加、及びミニヘアピンDNA付加アプタマー変異体の結合阻害比率(相対結合率)はそれぞれ、1.12(ARC1172(wt)-iT)、1.37(ARC1172-F)、1.43(ARC1172-F-iT)、1.61(ARC1172-G)であった。コントロールとなるARC1172と比べ、ヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換し、さらにミニヘアピンDNAを3’末端に付加したARC1172-Gが最も結合活性が向上していることがわかった。この結果から、天然塩基から構成される従来のDNAアプタマーに対して、ミニヘアピンDNAを付加することで結合力を向上させることができることがわかった。
[実施例9:vWF用アプタマーの核酸分解酵素などに対する安定性解析]
本実施例では、天然塩基のみからなるDNAアプタマーに対して、ミニヘアピンDNAを付加したDNAアプタマーのヒト血清中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性を調べた。また、従来の核酸安定化技術である3'末端へのinverted dT付加と比較検討した。
<方法>
ミニヘアピンDNAを含むDNAアプタマーと含まないDNAアプタマー(ARC1172(wt)、ARC1172(wt)-iT、ARC1172-F、ARC1172-F-iT、ARC1172-G、最終濃度2 μM)を、ヒト血清濃度が96%となるように混合し、この溶液を37℃でインキュベートした。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、72時間後に混合溶液から10μLを分取し、110μLの1×TBE、10M Urea溶液と混合して分解反応を止めた。反応後のサンプルを変性15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ゲルをSYBR GOLDで染めることで1本鎖核酸を検出した。ヒト血清中の核酸分解酵素による分解産物のバンドパターンをバイオイメージャー LAS-4000(富士フィルム)で解析し、未分解のアプタマーに相当するバンドの濃さから、残存DNA量を推定した。
<結果>
結果を図19に示す。コントロールのDNAアプタマー(ARC1172(wt))は、ヒト血清存在下24時間後では全長産物に相当するバンドは38%まで分解された。そして、72時間後には全長産物に相当するバンドは19%まで分解された。また、従来の核酸安定化技術であるinverted dT付加したDNAアプタマー(ARC1172(wt)-iT)は、ARC1172(wt)と比較すると、ヒト血清中における核酸分解酵素に対する安定性は向上しているものの、ヒト血清存在下24時間後では全長産物に相当するバンドは47%まで分解され、72時間後には全長産物に相当するバンドは27%まで分解された。一方、ミニヘアピンDNAを3'末端及び内部に付与したDNAアプタマー(ARC1172-G)はヒト血清存在下24時間後で70%、72時間後でもまだ全量のうちの42%が全長産物の状態で保持されていることがバンドパターンから確認できた。これにより、ミニヘアピンDNAの付加によりヒト血清中に含まれる核酸分解酵素などに対する安定性が顕著に上昇することがわかった。また、3'末端へのミニヘアピンDNA付加によるヒト血清中に含まれる核酸分解酵素などに対する安定性向上効果は、従来の核酸安定化技術である3'末端へのinverted dT付加よりも高いことが分かった。
[実施例10:vWF用アプタマーの熱安定性解析]
<方法>
各種DNAアプタマー(ARC1172(wt)、ARC1172(wt)-iT、ARC1172-F、ARC1172-F-iT、ARC1172-G、最終濃度2 μM)の熱安定性を、Tm値の測定により検討した。温度上昇変化(0.5℃/min)におけるDNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV−2450(島津)により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
<結果>
結果を図20に示す。コントロールのDNAアプタマー(ARC1172(wt))のTm値は、63.8℃であったのに対して、従来の核酸安定化技術である3'末端へのinverted dT付加を行ったDNAアプタマー(ARC1172(wt)-iT)のTm値は63.2℃であった。ミニヘアピン構造を含むDsアプタマー変異体のTm値はそれぞれ、64.3℃(ARC1172-F)、64.4℃(ARC1172-F-iT)、61.9℃(ARC1172-G)であった。ミニヘアピンDNAをDNAアプタマーに付加することでTm値には大きな変化はみられず、ミニヘアピンDNA付加による熱安定性の大きな減少はないことがわかった。
[実施例11:VEGF用アプタマーのデザインと調製]
ミニヘアピン構造及びGC対の付加等のVEGF結合DNAアプタマーの特性に与える影響を調べるため、図21に示す各種Anti-VEGF165 DNA aptamer変異体をデザインして、調製した。
[実施例12:VEGF用アプタマーのターゲットタンパク質への結合活性解析]
<方法>
実施例11で調製した各種アプタマーのヒト由来VEGF165タンパク質への結合活性を比較するために、競合実験による結合活性解析を行った。スケールは20μLで行い、0.005%のNonidetP-40を含むリン酸緩衝液(pH 7.4)中で、[γ−32P]ATPにより標識したAptamer 47 (最終濃度100nM)、非標識の各種改変体(最終濃度100nM)、VEGF165タンパク質(ぺプロテック、最終濃度100nM)を混合し、37℃で30分間インキュベートした。その後、5μlの25%グリセロールを添加してすぐ、10%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてVEGF165 タンパク質に結合した標識Aptamer 47と遊離したAptamer 47とを分離し、ゲルを乾燥させ、バイオイメージアナライザーによって可視化し、放射活性を測定した。ゲルシフト率、阻害率、相対結合率は、実施例2に従って算出した。
<結果>
結果を、図22に示した。図22に示したとおり、Aptamer 47をAに置換したアプタマー(Aptamer 47A)は、結合阻害を全く示さなかったのに対し、Aptamer 47のステム領域を一塩基対伸ばしたAptamer 49は相対結合率が1.53となり、有意に結合力が向上していることがわかった。Aptamer 49のステム領域中のA-T塩基対を2か所G-C塩基対に置換したAptamer 49GCは相対結合率が1.50であった。一方、ミニヘアピンを含むAptamer 58mh、 Aptamer 58GCmhについては、それぞれ相対結合率が1.58、1.59となり、Aptamer 49と同様にAptamer 47よりも結合力が向上していることを確認できた。
[実施例13:VEGF用アプタマーのヒト血清中での安定性解析]
<方法>
本実施例では、実施例11で調製したDNAアプタマーの各種変異体を用いて、ヒト血清中での安定性を調べた。
<結果>
結果を図23に示す。ミニヘアピン構造を含まないアプタマー(Aptamer 47、Aptamer 49、Aptamer 49GC)は、24時間後ですでに全長産物に相当するバンドは50%以下であったのに対し、ミニヘアピン構造を含むアプタマー(Aptamer 58mh, Aptamer 58GCmh)は72時間後でも、全長産物に相当するバンドが、50%以上が保持されていた。この結果より、ミニヘアピン構造がアプタマーのヒト血清中の核酸分解酵素による分解に対して安定化することがわかった。
[実施例14:VEGF用アプタマーの溶液中での熱安定性解析]
<方法>
各種変異体(Aptamer 47, Aptamer 47A, Aptamer 49, Aptamer 58mh, Aptamer 49GC, Aptamer 58GCmh、最終濃度2μM、リン酸緩衝液pH 7.4中)の熱安定性を、Tm値の測定により検討した。温度上昇変化(0.5℃/min)におけるDNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV−2450(島津)により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
<結果>
結果を図24に示す。コントロールのDNAアプタマー(Aptamer 47)のTm値は、69.5℃であったのに対して、G-C塩基対の置換がない各種変異体のTm値は、60.0℃(Aptamer 47A)、67.7℃(Aptamer 49)、65.6℃(Aptamer 58mh)であり、ミニヘアピン構造及びG-C塩基対の付加でTm値自身には大きな変化はみられなかった。G-C塩基対置換したAptamer 49GC, Aptamer 58GCmhについては、融解曲線が2段階になり、それぞれのTm値はAptamer 49GCでは、54.6℃と78.7℃、Aptamer 58GCmhでは62.6℃と80.8℃であった。さらに詳細に、G-C塩基対延長、置換及びミニヘアピン構造付加による影響を調べるために、図24の下段に、50度までの融解曲線を拡大して表示した。吸光度の変化は、G-C塩基対延長(Aptamer 49)、ミニヘアピン構造付加(Aptamer 58mh)により抑えられ、構造が安定化されていること、さらにはG-C塩基対置換(Aptamer 49GC、Aptamer 58GCmh)によりさらに安定化されていることが確認できた。
Claims (12)
- 既存のDNAアプタマーの標的分子結合能を強化、及び/又は該アプタマーを安定化する塩基配列の設計方法であって、
一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含むDNAアプタマーにおいて、一組のステム構造及びループ構造で構成されるヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換することを含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の(A)〜(C)の核酸領域:
(A)2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
(B)gna又はgnna(ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである)の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
(C)第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成され、
前記塩基類似体が、Ds(7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine)、Pn(2-nitropyrrole-1-yl)、Pa(2-formyl-1H-pyrrole-1-yl)、P(2-amino-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one)、Z(6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone)、5SICS(6-methylisoquinoline-1(2H)-thione)、NaM(3-methoxynaphthalen-2-yl)、及びMMO2(2-methoxy-4-methylphenyl)からなる群から選択される、前記設計方法。 - 前記DNAアプタマーが、一以上の塩基類似体及び/又は修飾塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記塩基類似体が、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylである、請求項2に記載の方法。
- ミニヘアピンを構成するステム構造以外のステム構造中のGC対を増加させることを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一以上のステム構造の一つがDNAアプタマーの末端を構成する場合に、該DNAアプタマーの末端においてGC対を1対〜5対増加させることを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- GC対を増加させたステム構造を除く前記一以上のステム構造の一つがDNAアプタマーの末端を構成する場合に、該DNAアプタマーの末端においてGC対を1対〜5対増加させることをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記DNAアプタマーの一方の末端に、請求項1に規定されるミニヘアピン構造を付加することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法に従ってDNAアプタマーの塩基配列を設計する工程、及び
設計された塩基配列に基づきDNAアプタマーを生産する工程
を含む、標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーの製造方法。 - 配列番号6及び8〜11のいずれかに示される塩基配列からなる、IFN-γ用DNAアプタマー。
- 配列番号19〜22のいずれかに示される塩基配列からなる、VEGF用DNAアプタマー。
- 配列番号14〜16のいずれかに示される塩基配列からなる、vWF用DNAアプタマー。
- 請求項9〜11のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
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