WO2017073536A1 - ｖＷＦに結合するＤＮＡアプタマー - Google Patents

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WO2017073536A1
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dna aptamer
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nucleic acid
dna
vwf
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一郎 平尾
路子 平尾
賢一郎 松永
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タグシクス・バイオ株式会社
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    • G01N2333/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C [AHF], factor VIII Ag [VWF]

Definitions

  • the present invention relates to a DNA aptamer that binds to vWF containing an artificial base, a pharmaceutical composition containing the DNA aptamer, a method for detecting vWF using the DNA aptamer, and the like.
  • Nucleic acid fragments that have binding activity to target molecules are called nucleic acid aptamers and are expected to be widely applied to medicine as nucleic acid drugs.
  • Nucleic acid aptamers can be generated by in-vitro selection (SELEX method) for selecting and isolating nucleic acid fragments that bind to a target molecule from a nucleic acid fragment library composed of random base sequences.
  • vWF is one of the blood coagulation factors present in the blood, and its genetic mutation is involved in von Willebrand disease, etc., and acquired thrombotic thrombocytopenia due to autoantibody production to vWF. It is known that purpura and the like are caused.
  • Some nucleic acid aptamers for vWF have been developed so far (Non-patent Documents 1 and 2).
  • conventional nucleic acid aptamers have only four types of bases compared to antibodies that are proteins consisting of 20 types of amino acids, so their variations are limited, binding ability, dissociation rate, and The performance such as stability was not satisfactory. Therefore, in order to use the nucleic acid aptamer in the medical field including treatment and diagnosis, it is important to improve these performances.
  • the present inventor targeting vWF, by carrying out two types of SELEX methods (predetermin method and random library method described in WO2013 / 073602) using artificial base pair technology developed by the present inventor, A DNA aptamer containing an artificial base that strongly binds to vWF was obtained. Further, as a result of further research on the obtained DNA aptamer, the binding ability (for example, K D which is 10 times or more lower) in terms of K D and / or k off compared to the conventional nucleic acid aptamer ARC1172. And / or k off ). Further, the obtained DNA aptamer had an excellent Tm value and / or nucleolytic enzyme resistance.
  • a DNA aptamer that binds to a vWF protein comprising the following base sequence (i) or (ii): (I) a nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 13 to 16, 19 and 20, or (ii) a nucleotide sequence represented by (i) wherein 7- (2-thienyl) -3H-imidazo [4,5 -b] A nucleotide sequence in which one or several nucleotides are added, deleted, and / or substituted at positions other than pyridine-3-yl.
  • the mini hairpin structure is The following nucleic acid regions (A) to (C) linked in order from the 5 ′ end to the 3 ′ end: (A) a first nucleic acid region consisting of 2 to 5 arbitrary nucleotides, (B) a second nucleic acid region comprising a base sequence of GNA or GNNA (where each N is independently G, T, A or C), and (C) complementary to the first nucleic acid region Consisting of a third nucleic acid region consisting of a typical base sequence, And, the first nucleic acid region and the third nucleic acid region are constituted by a stem portion and a loop portion consisting of the second nucleic acid region, which are base paired with each other, The DNA aptamer according to any one of (1) to (3).
  • a DNA aptamer that binds to the vWF protein comprising the following base sequence (i) or (ii): (I) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 or 21, or (ii) a nucleotide sequence represented by (i), wherein 7- (2-thienyl) -3H-imidazo [4,5-b] pyridine-3- A nucleotide sequence in which one or several nucleotides are added, deleted, and / or substituted at a position other than yl.
  • a DNA aptamer that binds to the vWF protein comprising the base sequence according to any one of (1) to (5).
  • a DNA aptamer that binds to the vWF protein comprising the following base sequence (I) or (II): (I) a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, 9 and 11, or (II) a nucleotide sequence represented by (I), wherein 7- (2-thienyl) -3H-imidazo [4,5 -b] A nucleotide sequence in which one or several nucleotides are added, deleted, and / or substituted at positions other than pyridine-3-yl.
  • the DNA aptamer according to (7), wherein the base sequence of (I) is the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 11.
  • the mini hairpin structure is The following nucleic acid regions (A) to (C) linked in order from the 5 ′ end to the 3 ′ end: (A) a first nucleic acid region consisting of 2 to 5 arbitrary nucleotides, (B) a second nucleic acid region comprising a base sequence of GNA or GNNA (where each N is independently G, T, A or C), and (C) complementary to the first nucleic acid region Consisting of a third nucleic acid region consisting of a typical base sequence, And, the first nucleic acid region and the third nucleic acid region are constituted by a stem portion and a loop portion consisting of the second nucleic acid region, which are base paired with each other, (7)
  • a DNA aptamer that binds to the vWF protein comprising the following base sequence (I) or (II): (I) In the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, or (II) In the base sequence shown in (I), other than 7- (2-thienyl) -3H-imidazo [4,5-b] pyridine-3-yl A nucleotide sequence in which one or several nucleotides are added, deleted, and / or substituted at the position. (12) A DNA aptamer that binds to a vWF protein, comprising the base sequence according to any one of (7) to (11). (13) A vWF protein detection agent comprising the DNA aptamer according to any one of (1) to (12).
  • a kit for detecting vWF protein comprising the DNA aptamer according to any one of (1) to (12).
  • a pharmaceutical composition comprising the DNA aptamer according to any one of (1) to (12).
  • Treatment and / or treatment of a disease selected from the group consisting of thrombosis, thrombotic thrombocytopenic purpura, intracranial embolism, cerebral embolism, carotid artery stenosis, thrombotic microangiopathy, and acute myocardial infarction The pharmaceutical composition according to (15), for prevention.
  • a method for detecting vWF protein comprising:
  • the present invention provides a DNA aptamer for vWF that is superior in binding ability, dissociation rate, and / or stability to conventional nucleic acid aptamers. Also provided are vWF detection methods, methods for assisting diagnosis of the presence or absence of diseases such as thrombosis using the DNA aptamer of the present invention, and pharmaceutical compositions for the treatment and / or prevention of diseases such as thrombosis. Is done.
  • Example 3 The predicted secondary structure of each DNA aptamer prepared in Example 3 is shown. Based on vWF1-DsDsDs (SEQ ID NO: 1) indicated by a, 3'-terminal Ds is replaced by A, vWF1-DsDsA (SEQ ID NO: 2) indicated by b, and intermediate part Ds is indicated by c vWF1-DsADs (SEQ ID NO: 3), vWF1-ADsDs (SEQ ID NO: 4) indicated by d in which Ds on the 5 ′ end side are replaced with A, and e in which Ds on the middle part and 3 ′ end side are replaced with A vWF1-DsAA (SEQ ID NO: 5) was prepared.
  • the artificial base Ds is indicated by a square, and the site where Ds is replaced by A is indicated by an arrowhead.
  • a bold line indicates a base capable of forming a Watson-Crick base pair
  • a normal line indicates that the base is linked via a phosphodiester bond.
  • the meanings of the bold line and the normal line are the same as those in FIGS. 1-2, 3, 6-1 and 6-2 below.
  • the predicted secondary structure of each DNA aptamer prepared in Example 3 is shown.
  • vWF1-DsDsDs SEQ ID NO: 1
  • vWF1-ADsA SEQ ID NO: 6
  • f Ds on the 5 ′ end side and 3 ′ end side are replaced with A
  • Ds on the 5 ′ end side and the middle part VWF1-AADs SEQ ID NO: 7
  • vWF1-AAA SEQ ID NO: 8
  • stem part VWF1-R1Ds SEQ ID NO: 9 indicated by i excluding the AT pair at the end of was prepared.
  • ARC1172 SEQ ID NO: 10
  • j which is an existing vWF-binding DNA aptamer
  • the artificial base Ds is indicated by a square, and the site where Ds is replaced by A is indicated by an arrowhead.
  • FIG. 2A shows the result of DNA aptamer staining with SYBR GOLD upon electrophoresis.
  • 2B is a graph showing the shift rate (binding rate) of each oligo as a relative shift rate, with the gel shift rate of ARC1172 (the ratio of the complex band when the band of the entire lane is 100%) being 1.0. It is.
  • the binding reaction was performed at 37 ° C and the electrophoresis was performed at 4 ° C.
  • the complex indicates a DNA aptamer bound to the vWF A1 domain, and the release indicates a free DNA aptamer.
  • a to j show the results when the aptamers shown by a to j in FIGS. 1-1 and 1-2, respectively.
  • Example 4 the secondary structure of the DNA aptamer used for measuring the binding activity by SPR is shown.
  • vWF1-DsDsDs (SEQ ID NO: 1) indicated by a, vWF1-AAA (SEQ ID NO: 8) indicated by h in which three Ds are replaced by A, and a part of stem region AT pair is replaced by GC pair k VWF1-DsDsDs-GC (SEQ ID NO: 11) and vWF1-DsDsDs-mhGC (SEQ ID NO: 12) indicated by l with a mini hairpin added to the 3 ′ end of vWF1-DsDsDs-GC were prepared.
  • the binding analysis result with respect to vWF * A1 domain protein by SPR of various DNA aptamers is shown.
  • B shows the result of vWF1-DsDsDs-GC
  • C shows the result of vWF1-DsDsDs-mhGC
  • D shows the result of vWF1-AAA
  • E shows the result of ARC1172.
  • A shows the standard absorbance of the DNA aptamer at each temperature
  • B shows the first derivative of the standardized absorbance of the DNA aptamer at each temperature
  • 2 shows the predicted secondary structure of the DNA aptamer prepared in Example 8.
  • vWF2-DsDsDs (SEQ ID NO: 13) indicated by m
  • Ds in the middle part was replaced with A
  • vWF2-DsADs (SEQ ID NO: 14) indicated by n
  • Ds on the middle part and 3 ′ end side were replaced with A vWF2-DsAA (SEQ ID NO: 15) indicated by o
  • vWF2-AADs (SEQ ID NO: 16) indicated by p in which Ds at the 5 ′ terminal side and the middle part were replaced with A were prepared.
  • the site where Ds is replaced by a square and Ds is replaced by A is indicated by an arrowhead. 2 shows the predicted secondary structure of the DNA aptamer prepared in Example 8.
  • vWF2-DsDsDs (SEQ ID NO: 13), vWF2-AAA (SEQ ID NO: 17) indicated by q with all Ds replaced with A, AT base pair in stem part is replaced with GC base pair, and 3 'end VWF2-DsDsDsDs-mhGC (SEQ ID NO: 18) indicated by r with the mini hairpin DNA added to it, and the loop part of the intermediate part of WF2-DsDsDs-mhGC (SEQ ID NO: 18) as the loop part sequence of the mini hairpin DNA (5'- VWF2-DsDsDs-2mhGC (SEQ ID NO: 21) indicated by s substituted with GAA-3 ′) was prepared.
  • ARC1172 SEQ ID NO: 10
  • j which is an existing vWF-binding DNA aptamer
  • Ds is a square
  • Ds is replaced by A
  • AT pair is replaced by GC pair with arrowhead
  • minihairpin added site is replaced with arrowheaded square.
  • a to C are the results of DNA aptamer staining with SYBR GOLD when electrophoresis was performed at 4 ° C./300 V, 25 ° C./40 W, and 37 ° C./40 W, respectively.
  • the complex indicates a DNA aptamer bound to the vWF A1 domain, and the release indicates a free DNA aptamer.
  • m to s show the results when the aptamers shown by m to s in FIGS. 6-1 and 6-2 are used.
  • j indicates the result when ARC1172 is used.
  • the binding analysis result with respect to vWF * A1 domain protein by SPR of various DNA aptamers is shown.
  • A shows the result of ARC1172
  • B shows the result of vWF2-DsDsDs
  • C shows the result of vWF2-DsDsDs-2mhGC.
  • the stability analysis result with respect to the nucleolytic enzyme in human serum of various DNA aptamers is shown. “C” at the left end of the lane indicates “control” and shows the result of only the serum not added with DNA aptamer. Unresolved bands are indicated by arrowheads.
  • A shows the result of vWF2-DsDsDs
  • B shows the result of vWF2-DsDsDs-mhGC
  • C shows the result of vWF2-DsDsDs-2mhGC
  • D shows the result of vWF2-AAA
  • E shows the result of ARC1172.
  • the measurement result of Tm value of various DNA aptamers is shown.
  • A shows the standard absorbance of the DNA aptamer at each temperature
  • B shows the first derivative of the standardized absorbance of the DNA aptamer at each temperature.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” refers to a biopolymer composed of nucleotides as structural units and linked by phosphodiester bonds.
  • natural nucleotide refers to a nucleotide that exists in nature and is composed of a deoxyribonucleotide having a natural base of any one of adenine, guanine, cytosine and thymine, and adenine, guanine, Examples thereof include RNA composed of ribonucleotides having a natural base of either cytosine or thymine, or a combination thereof.
  • non-natural nucleotide refers to a nucleotide that does not exist in nature, the base of which is an artificial base.
  • the phosphate group and sugar constituting the non-natural nucleotide in the present invention are structurally identical to the phosphate group and sugar of the natural nucleotide.
  • an “artificial base” or “base analog” is an artificially constructed chemical substance having properties similar to those of a natural base constituting a natural nucleotide, and is similar to a natural base. And a base analog (hereinafter referred to as “complementary artificial base”) that can form an artificial base pair.
  • “artificial base pairing” refers to base pairing formed by a pair of complementary artificial bases such as adenine and thymine, adenine and uracil, or guanine and cytosine, which are natural bases.
  • Artificial base pairing is based on chemical bonds via hydrogen bonds found in base pairing between natural bases, physical bonds via fitting based on the molecular structure between artificial bases, and hydrophobic interactions. Including stacking effect.
  • the “characteristics similar to natural bases” possessed by artificial bases include the ability to replicate or transcribe nucleic acids (including reverse transcription) by complementation by artificial base pairing.
  • Artificial bases like natural bases, have exclusive selectivity in artificial base pairing. Therefore, if a non-natural nucleotide having a pair of complementary artificial bases exists in a substrate nucleotide, even a nucleic acid molecule containing a non-natural nucleotide can be accurately detected in the same manner as a natural nucleotide due to complementarity between artificial bases. Can be duplicated and transcribed. Therefore, it is possible to amplify DNA molecules by a nucleic acid amplification method such as PCR while containing non-natural nucleotides.
  • the artificial base include Ds (7- (2-thienyl) -3H-imidazo [4,5-b] pyridine-3-yl; referred to herein as “Ds”), Pn (2-nitropyrrole -1-yl; referred to herein as “Pn”), Pa (2-formyl-1H-pyrrole-1-yl; referred to herein as “Pa”), P (2-amino-imidazo [1 , 2-a] -1,3,5-triazin-4 (8H) -one; referred to herein as “P”), Z (6-amino-5-nitro-2 (1H) -pyridone; "Z” in the specification), 5SICS (6-methylisoquinoline-1 (2H) -thione; referred to herein as "5SICS”), NaM (3-methoxynaphthalen-2-yl; referred to herein as "NaM And MMO2 (2-methoxy-4-methylphenyl; referred to herein as “MMO
  • An artificial base is a natural base that is structurally and / or close in nature to a complementary artificial base when the substrate does not contain a non-natural nucleotide having a complementary artificial base during replication or transcription.
  • base pairing can be performed.
  • the non-natural nucleotide in the template nucleic acid molecule is replaced with the natural nucleotide after replication or transcription.
  • Ds it is known that it is replaced with A or T.
  • modified base means a base that has been chemically chemically modified.
  • Modified bases include, for example, modified pyrimidines (eg, 5-hydroxycytosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil, 5- (3-indole-2-ethyl) uracil, 5- (4-hydroxyphenyl-2-ethyl) Uracil), modified purines (eg 6-methyladenine, 6-thioguanosine) and other heterocyclic bases.
  • modified pyrimidines eg, 5-hydroxycytosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil, 5- (3-indole-2-ethyl) uracil, 5- (4-hydroxyphenyl-2-ethyl) Uracil
  • modified purines eg 6-methyladenine, 6-thioguanosine
  • a “DNA aptamer” is an aptamer composed of DNA, and is based on a secondary structure of a single-stranded nucleic acid molecule through a hydrogen bond or the like, and a three-dimensional structure formed based on a tertiary structure.
  • the DNA aptamer can be a function inhibitor of the target molecule.
  • target molecule function refers to inhibition of biological functions such as catalytic function or gene expression control function (including control of transcription, translation, transport, etc.) and apoptosis control function of target molecule. Or to suppress.
  • target molecule refers to a substance that can be a binding target of a DNA aptamer.
  • vWF is exemplified as the target molecule.
  • vWF refers to a von Willebrand factor protein (also referred to herein as “vWF protein”).
  • vWF is one of the blood clotting factors present in the blood, and its genetic mutation is involved in various diseases such as von Willebrand disease, and acquired thrombotic platelets by the production of autoantibodies to vWF. It is known that reduced purpura and the like are caused.
  • the biological species from which vWF is derived is not limited. For example, mammals, for example, primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats and mice, livestock such as pigs, cows, horses, sheep, and goats. Examples include animals and pets such as dogs and cats, preferably human vWF.
  • vWF is, for example, (a) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, deleted, and / or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, Or (c) 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28
  • An amino acid sequence having vWF may consist of any of these amino acid sequences.
  • the identity value indicates a value calculated by default setting using software (for example, FASTA, DANASYS, and BLAST) that calculates identity between a plurality of sequences.
  • the A1 domain of vWF means a domain in vWF that has the ability to bind to the GPIb receptor on platelets.
  • the A1 domain of vWF includes, for example, (a) the amino acid sequence of positions 1238 to 1481 of SEQ ID NO: 28, and (b) the addition or deletion of one or several amino acids in the amino acid sequence of positions 1238 to 1481 of SEQ ID NO: 28 For example, 70% or more, 80% or more, preferably 90% or more, preferably 95% or more with respect to the lost and / or substituted amino acid sequence, or (c) the amino acid sequence of positions 1238 to 1481 of SEQ ID NO: 28, It includes amino acid sequences having 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity.
  • the A1 domain of vWF may consist of any of these amino acid sequences.
  • “several” means, for example, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2.
  • mini hairpin structure means that the following three nucleic acid regions of the first nucleic acid region, the second nucleic acid region, and the third nucleic acid region are in order from the 5 ′ end to the 3 ′ end. It has the structure connected to.
  • Mini-hairpin DNA can increase the thermal stability of a DNA aptamer by increasing its degradation resistance to nucleolytic enzymes and / or increasing the Tm value of the DNA aptamer.
  • the “first nucleic acid region” is a nucleic acid region consisting of 2 to 5 arbitrary nucleotides.
  • the nucleotide refers to a deoxyribonucleotide having a base of guanine (G), adenine (A), cytosine (C) or thymine (T).
  • the base of this nucleic acid region is preferably guanine or cytosine. This is because when the stem structure is formed with the third nucleic acid region described later, the Tm value increases as the GC content increases, and the stem structure can be stably retained. Therefore, it is most preferable that the entire base sequence of the first nucleic acid region is composed of G and / or C.
  • the “second nucleic acid region” is a nucleic acid region consisting of a 5′-GNA-3 ′ or 5′-GNNA-3 ′ base sequence.
  • Each N in the sequence independently consists of any of the natural bases (G, A, T, or C), for example T.
  • the “third nucleic acid region” is a nucleic acid region having a base sequence complementary to the first nucleic acid region. Therefore, the base sequence of the third nucleic acid region is determined by the base sequence of the first nucleic acid region, and the first nucleic acid region and the third nucleic acid region form a base pair in the molecule. As a result, the first nucleic acid region and the third nucleic acid region have completely stem-paired stem portions, and the second nucleic acid region existing between the first and third nucleic acid regions has a loop portion. As a whole, a mini hairpin type DNA consisting of 7 to 14 nucleotides is formed. As an example of the mini hairpin type DNA, DNA having a base sequence shown in CGCGTAGCG (SEQ ID NO: 26) can be mentioned.
  • DNA aptamer that binds to vWF comprising the following base sequence (i) or (ii): (I) any one of SEQ ID NOs: 13 to 16, 19 and 20, preferably a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 13, 14, 19 and 20, or (ii) a base sequence represented by (i) A nucleotide sequence in which one or several nucleotides are added, deleted, and / or substituted at a position other than Ds.
  • the base sequence (i) includes 1 to 5, for example, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 base pair, for example, a GC pair at its end. Terminal base pairs can increase the Tm value of DNA aptamers and improve thermal stability.
  • the base sequence of (i) is, in addition to or in place of these base pairs, a sequence that forms a mini hairpin structure (hereinafter, also referred to as “mini hairpin sequence”), for example, It may be included on the 3 ′ end side.
  • a sequence shown in SEQ ID NO: 18 in which a mini hairpin sequence is added to the sequence shown in SEQ ID NO: 19, and a mini hairpin in the sequence shown in SEQ ID NO: 20 examples include the sequence shown in SEQ ID NO: 21 with the sequence added.
  • the present invention provides the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 or 21, or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 or 21, with one or several nucleotides added or missing at positions other than Ds.
  • the present invention relates to a DNA aptamer that binds to vWF, including a deleted, substituted, and / or inserted nucleotide sequence.
  • the DNA aptamer of the present invention consists of the above base sequence (i) or (ii), or a base sequence obtained by adding a base pair and / or a mini hairpin sequence to the end of the base sequence.
  • the DNA aptamer of the present invention containing the base sequence (i) or (ii) binds to vWF, for example, the A1 domain of vWF.
  • DNA aptamers of the present invention comprising a nucleotide sequence of (i) or (ii) in terms of the dissociation constant K D and / or off-rate k off, may have the ability to bind to excellent vWF.
  • the K D refer to the dissociation constant is represented by k off (dissociation rate) / k on (association rate).
  • the DNA aptamer of the present invention containing the base sequence of (i) or (ii) is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 , 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 , 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 , preferably 5.0 ⁇ in the binding analysis with vWF by Biacore.
  • 10 -10, 3.0 ⁇ 10 -10 may have a 1.0 ⁇ 10 -10, or 8.0 ⁇ 10 -11 M or less for K D.
  • the DNA aptamer of the present invention containing the base sequence of (i) or (ii) is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 1 , preferably 9.0 ⁇ 10 ⁇ 2 , 8.0 ⁇ 10 ⁇ 2 , 7.0 ⁇ in Biacore binding analysis with vWF. It may have a k off of 10 ⁇ 2 , 6.0 ⁇ 10 ⁇ 2 , or 5.0 ⁇ 10 ⁇ 2 (1 / Ms) or less.
  • the present invention relates to a DNA aptamer that binds to vWF, comprising the following base sequence (I) or (II): (I) any one of SEQ ID NOS: 1-4, 9, and 11, preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 11, or (II) 1 or 1 at a position other than Ds in the nucleotide sequence represented by (I) A nucleotide sequence in which several nucleotides are added, deleted, and / or substituted.
  • the base sequence (I) includes 1 to 5, for example, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 base pair, for example, a GC pair at its end. Terminal base pairs can increase the Tm value of DNA aptamers and improve thermal stability.
  • the base sequence of (I) may contain a mini hairpin sequence in addition to these base pairs or in place of these base pairs, for example, on the 3 ′ end side.
  • sequence in which a mini hairpin sequence is added to the sequence (I) is the sequence shown in SEQ ID NO: 12 in which a mini hairpin sequence is added to the sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the present invention provides the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12, wherein one or several nucleotides are added, deleted, substituted, or substituted at positions other than Ds. And / or a DNA aptamer that binds to vWF, comprising an inserted base sequence.
  • the DNA aptamer of the present invention consists of the base sequence (I) or (II), or a base sequence in which a base pair and / or a mini hairpin sequence is added to the end of the base sequence.
  • the DNA aptamer of the present invention containing the base sequence (I) or (II) binds to vWF, for example, the A1 domain of vWF.
  • the DNA aptamer of the present invention containing the base sequence (I) or (II) can have an excellent ability to bind to vWF, particularly in terms of the dissociation rate k off .
  • the DNA aptamer of the present invention containing the base sequence of (I) or (II) is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 1 , 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 , preferably 5.0 ⁇ 10 ⁇ 3 , preferably by binding analysis with vWF by Biacore, It may have a k off of 4.0 ⁇ 10 ⁇ 3 , 3.0 ⁇ 10 ⁇ 3 , or 2.0 ⁇ 10 ⁇ 3 (1 / Ms) or less.
  • the DNA aptamer of the present invention containing the base sequence of (I) or (II) is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 , 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 , 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 , preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 , preferably by Biacore binding analysis with vWF 5.0 ⁇ 10 -9, 4.0 ⁇ 10 -9, may have a 3.0 ⁇ 10 -9, or 2.0 ⁇ 10 -9 M or less for K D.
  • the length of the DNA aptamer (hereinafter also simply referred to as “the DNA aptamer of the present invention”) containing the sequence (i) or (ii), or (I) or (II) is, for example, 150 mer or less, 140 mer or less, 130 mer or less, 120 mer or less, 110 mer or less, preferably 100 mer or less, 90 mer or less, 80 mer or less, 70 mer or less, 60 mer or less, or 50 mer or less.
  • the DNA aptamer of the present invention may optionally contain base analogs, other artificial bases, other modified bases, etc. in addition to Ds.
  • the DNA aptamer of the present invention includes other substances such as polyethylene glycol (PEG) (for example, PEG polymer of about 20 to about 60 kDa), amino acids, peptides, invertedindT, lipids, dyes, fluorescent substances, enzymes, radioactive substances, It may be modified by adding biotin or the like. These substances may be linked via a known linker as necessary. Examples of the linker in the present specification include a nucleotide linker, a peptide linker, and a linker containing a disulfide bond. It is known that the half-life of a DNA aptamer can generally be extended by linking PEG.
  • PEG polyethylene glycol
  • the method for producing the DNA aptamer of the present invention is not particularly limited. Any method known in the art may be used.
  • the DNA aptamer of the present invention can be chemically synthesized based on the above sequence according to a known solid phase synthesis method. See, for example, Current-Protocols-in-Nucleic-Acid-Chemistry, Volume 1, and Section 3 for the chemical synthesis of nucleic acids.
  • many life science manufacturers for example, Takara Bio Inc., Sigma-Aldrich® Corporation, etc.
  • the DNA aptamer may be prepared by ligating the fragments by intramolecular annealing, ligase ligation, or the like.
  • the DNA aptamer of the present invention after chemical synthesis is preferably purified by a method known in the art before use.
  • the purification method include a gel purification method, an affinity column purification method, and an HPLC method.
  • composition comprising a DNA aptamer
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a DNA aptamer of the invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also contain one or more other drugs as long as the DNA aptamer of the present invention does not lose the binding ability to vWF.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for delivering a drug to a lesion site, comprising a DNA aptamer and another drug.
  • Other agents may be conjugated to the DNA aptamer, thereby making it possible to efficiently deliver the agent to the lesion site using the ability of the DNA aptamer to bind to vWF.
  • the method for binding the DNA aptamer and the drug is not limited.
  • vWF-related diseases include thrombosis, thrombotic thrombocytopenic purpura, intracranial embolism, cerebral embolism, carotid artery stenosis, thrombotic microangiopathy, and acute myocardial infarction.
  • a therapeutic effect is expected by administering the pharmaceutical composition to a subject suffering from these diseases, and a prophylactic effect is expected by administering the pharmaceutical composition to a subject at risk of suffering from these diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a substance that is added in a range that facilitates formulation of a pharmaceutical composition ordinarily used in the field of pharmaceutical technology and application to a living body and does not inhibit or suppress its action.
  • Carriers include, for example, excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, flow control agents, lubricants, or stabilizers.
  • excipient examples include sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (specifically, but not limited to, glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, Including dextrin, maltodextrin, starch and cellulose), metal salts (eg, sodium phosphate or calcium phosphate, calcium sulfate, magnesium sulfate), citric acid, tartaric acid, glycine, low, medium, high molecular weight polyethylene glycol (PEG), Pluronics, or combinations thereof.
  • sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (specifically, but not limited to, glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, Including dextrin, mal
  • binder examples include starch paste using corn, wheat, rice, or potato starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and / or polyvinylpyrrolidone.
  • disintegrant examples include the starch, carboxymethyl starch, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid, sodium alginate or salts thereof.
  • filler examples include the sugar and / or calcium phosphate (for example, tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate).
  • emulsifier examples include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, and propylene glycol fatty acid ester.
  • Examples of the “flow additive modifier” and “lubricant” include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
  • antioxidants such as ascorbic acid and sulfite
  • saccharides such as trehalose and glucose
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain, in addition to the above-mentioned additives, a flavoring agent, a solubilizing agent (solubilizing agent), a suspending agent, a diluent, a surfactant, an absorption enhancer (for example, Quaternary ammonium salts, sodium lauryl sulfate, etc.), extenders, moisturizers, humectants (eg, glycerin, starch, etc.), adsorbents (eg, starch, lactose, kaolin, bentonite, colloidal silicic acid, etc.), disintegration Inhibitors (for example, sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil, etc.), coating agents, coloring agents, preservatives, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, buffering agents, isotonic agents, soothing agents, solubilizing agents Etc. can also be included.
  • a flavoring agent for example, a solubil
  • surfactant examples include lignosulfonic acid, naphthalene sulfonic acid, phenol sulfonic acid, alkali metal salt, alkaline earth metal salt and ammonium salt of dibutyl naphthalene sulfonic acid, alkyl aryl sulfonate, alkyl sulfate, alkyl sulfonate.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can include one or more of the above carriers in one pharmaceutical composition.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a form that does not inactivate the active ingredient and can exhibit its pharmacological effect in vivo after administration. Usually, it varies depending on the administration method and / or prescription conditions.
  • dosage forms suitable for oral administration include solid preparations (including tablets, pills, sublinguals, capsules, drops, troches), granules, powders, powders, liquids, and the like.
  • the solid preparation can be made into a dosage form known in the art, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet, if necessary. .
  • Parenteral administration is subdivided into systemic administration and local administration, and local administration is further subdivided into intra-tissue administration, transepidermal administration, transmucosal administration, and rectal administration.
  • the dosage form can be made suitable for.
  • dosage forms suitable for systemic or intra-tissue administration include injections that are liquids.
  • Suitable dosage forms for transepidermal or transmucosal administration include, for example, liquids (including coating agents, eye drops, nasal drops, and inhalants), suspensions (including emulsions and creams), and powders (points). Nasal and suction agents), pastes, gels, ointments, plasters and the like.
  • Examples of dosage forms suitable for rectal administration include suppositories.
  • each dosage form are not particularly limited as long as the dosage form is within the range of dosage forms known in the art for each dosage form.
  • the DNA aptamer of the present invention is dissolved in a pharmaceutically acceptable solvent, and if necessary, a pharmaceutically acceptable carrier is added, and manufactured by a method commonly used in the art. Can do.
  • Examples of the “pharmaceutically acceptable solvent” include water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters and the like. These are preferably adjusted to be isotonic with blood as necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a living body in a pharmaceutically effective amount for treating or preventing a target disease such as cancer.
  • the living body to be administered is a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered either systemically or locally. It can select suitably according to the kind of disease, onset location, or a progression degree. If the onset site is a local disease, local administration directly administered to and around the onset site by injection or the like is preferable. This is because a sufficient amount of the DNA aptamer of the present invention can be administered to a site (tissue or organ) to be treated, and other tissues are hardly affected. On the other hand, when the treatment site cannot be specified or the onset is a systemic disease, systemic administration by intravenous injection or the like is preferable, although there is no limitation. This is because the DNA aptamer of the present invention is distributed throughout the body through the bloodstream, so that it can be administered even to a lesion that cannot be detected by diagnosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any appropriate method that does not deactivate the active ingredient.
  • it may be parenteral (for example, injection, aerosol, application, eye drop, nose drop) or oral.
  • parenteral for example, injection, aerosol, application, eye drop, nose drop
  • oral Preferably, it is an injection.
  • the injection site is not particularly limited. Any site may be used as long as the DNA aptamer which is an active ingredient can bind to the target substance. Examples thereof include intravenous, intraarterial, intrahepatic, intramuscular, intraarticular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transpulmonary, transdermal, subcutaneous, intradermal, and intraperitoneal.
  • the present invention relates to a method for treating and / or preventing a disease, comprising administering the DNA aptamer of the present invention or the pharmaceutical composition described above to a subject.
  • the disease targeted for prevention and / or treatment of the pharmaceutical composition of the present invention is a vWF-related disease.
  • thrombosis examples include thrombosis, thrombotic thrombocytopenic purpura, intracranial embolism, cerebral embolism, carotid artery stenosis, thrombotic microangiopathy, and acute myocardial infarction.
  • animal species that can be “subjects” include, for example, mammals, primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats and mice, and livestock animals such as pigs, cows, horses, sheep, and goats. And pets such as dogs and cats, preferably humans.
  • the present invention relates to a vWF detection agent comprising the DNA aptamer of the present invention.
  • the vWF detection agent of the present invention is an agent for detecting vWF in vivo or in vitro using the binding ability of the DNA aptamer of the present invention to vWF.
  • a DNA aptamer with a fluorescent reagent in advance and administering it, the expression intensity of vWF can be determined in vivo and its localization can be examined. This may be able to assist in the diagnosis of the vWF-related disease.
  • the DNA aptamer of the present invention is useful in imaging and tissue staining.
  • the present invention relates to a composition for detecting vWF comprising the DNA aptamer of the present invention. Since the composition of the composition is the same as that of the pharmaceutical composition, the description is omitted here.
  • the present invention relates to a vWF detection kit containing the DNA aptamer of the present invention.
  • the kit of the present invention may contain a buffer, a labeling reagent, and / or instructions in addition to the DNA aptamer of the present invention.
  • the present invention relates to a method for detecting vWF.
  • the method includes contacting a sample obtained from a subject with the DNA aptamer of the present invention, and detecting vWF based on the binding of the sample and the DNA aptamer. This method may be able to assist in the diagnosis of the vWF-related disease.
  • Examples of the sample used in the present method include tissues and biological samples.
  • tissues include lesion sites such as brain, heart, liver, pancreas, lungs, bone marrow, lymph nodes, and spleen.
  • biopsy samples of these tissues can be used.
  • biological samples include, for example, blood, plasma, lymph, tissue fluid, urine, and cells such as peripheral blood cells, hair matrix cells, oral cells, nasal cells, intestinal cells, vaginal cells, mucosal cells, and sputum (alveoli Cell or pneumohepatic cell etc.), preferably blood or plasma.
  • the detection step of the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it utilizes the binding between the sample and the DNA aptamer, and a known method may be used.
  • a known method may be used.
  • an SPR method, a turbidimetric method, a colorimetric method, or a fluorescence method can be used.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the SPR method is a measurement method that utilizes this phenomenon, and can measure the adsorbate on the surface of the metal thin film that is the sensor portion with high sensitivity.
  • the DNA aptamer of the present invention is immobilized on the surface of the metal thin film in advance, the sample is allowed to pass through the surface of the metal thin film, and before and after the sample passing caused by the binding between the nucleic acid molecule and the target substance.
  • the target substance in the sample can be detected by detecting the difference in adsorbate on the metal surface.
  • a substitution method, an indirect competition method, and the like are known, and any of them may be used.
  • the turbidimetric method irradiates a solution with light and optically measures the attenuation of scattered light scattered by a substance suspended in the solution or transmitted light that has passed through the solution using a colorimeter or the like. It is a method of measuring the amount of substance in it.
  • the target substance in the sample can be quantitatively detected by measuring the absorbance before and after adding the DNA aptamer of the present invention to the sample.
  • the target substance can be detected by using it together with an antibody against the target substance.
  • a method using an ELISA sandwich method may be used. In this method, first, the DNA aptamer of the present invention is immobilized on a solid support, and then a sample is added to bind the target substance present in the sample and the DNA aptamer. Subsequently, after washing the sample, an anti-target substance antibody is added to bind to the target substance. After washing, the target substance in the sample can be detected by detecting the anti-target substance antibody using a secondary antibody with an appropriate label.
  • beads made of materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic materials
  • Insoluble carriers in the form of microplates, test tubes, sticks or test pieces can be used.
  • the present invention relates to a method for assisting diagnosis of the presence or absence of a vWF-related disease in a subject.
  • This method includes the step of administering the DNA aptamer of the present invention or the composition for detecting vWF of the present invention to a subject, and the step of detecting the DNA aptamer.
  • a DNA aptamer is detected at a high concentration at a specific site in a living body, it can be determined that a disease has occurred at that site.
  • a known method may be used, and for example, the above fluorescence method can be used.
  • Example 1 Selection of DNA aptamer that binds to vWF using Ds predetermin DNA library> A DNA library containing the artificial base Ds was prepared according to the predetermin method described in WO2013 / 073602. The library used in the predetermin method is designed to include an artificial base Ds at a specific fixed position in a random base sequence.
  • the DNA fragment total number of molecular species 300 pmol, about 2 ⁇ 10 14 molecules
  • the target protein vWF A1 domain U-Protein, V003
  • DNA binding to the target protein is selected and isolated using magnetic beads, and further, polyacrylamide gel electrophoresis is performed to cut out and isolate the DNA-vWF A1 domain complex, followed by PCR amplification.
  • a round selection operation was performed. The conditions for each selection are shown in Table 1. After 8 rounds of selection, the sequence was analyzed to obtain a DNA aptamer sequence containing the artificial base Ds.
  • Example 2 Sequencing of DNA aptamer> In order to accurately identify the position of the artificial base Ds, the following operation was performed and accurate sequencing was performed.
  • a single-stranded DNA library prepared by PCR amplification of DNA fragments obtained after 8 rounds with dDsTP and Diol1-dPxTP was added to a 100 nM / 1x binding solution (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mM MgCl 2 and diluted to a pH of 7.6), and 20 ⁇ l of the solution and a biotinylated probe (5 ⁇ M, 1 ⁇ l) were mixed.
  • annealing is performed (90 ° C for 3 minutes, slow cooling at -0.1 ° C / second, -55 ° C for 15 minutes), mixed with streptavidin magnetic beads (5 ⁇ L) substituted with 1x binding solution, and mixed at 55 ° C for 5 minutes.
  • streptavidin magnetic beads 5 ⁇ L
  • the biotinylated probe and the DNA fragment hybridized complementary to the probe were immobilized on the magnetic beads.
  • the solution was removed using a magnetic stand, excess DNA fragments not hybridized to the probe were removed, and the magnetic beads were washed 5 times with 150 ⁇ L of 1 ⁇ binding solution (55 ° C.). Thereafter, 20 ⁇ L of sterilized water was added to the magnetic beads after washing, and the solution was recovered immediately after heating at 75 ° C. for 5 minutes, thereby recovering the DNA fragment hybridized to the probe.
  • DNA sequencing was performed by the following two methods ((i) and (ii)) using the DNA fragment recovered using the probe as a template.
  • the DNA sequencing reaction was performed in a total volume of 20 ⁇ L using a commercially available BigDye® Terminator® v1.1® Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher® Scientific). Double-stranded DNA fragments (about 0.15 pmol) obtained by PCR amplification and purification using 5′- ACGACCGTTCTCTAATTTTGACGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 23) and 5′-ACCAAATTATTGCGATACAGACCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 24) as sequence primers , DdPa′TP or dPa′TP, or ddDsTP or dDsTP (500 pmol) were added to the reaction solution, and 25 cycles of PCR (96 ° C.
  • the artificial base template showed a pattern (gap) indicating artificial bases at three locations, whereas the sequence using natural substituted DNA as the template In the reaction sample, the peak of A is shown. Therefore, in addition to the two Ds positions (random regions 6th and 15th) indicated by the tag sequence, the 19th artificial base Ds is also present. I found out that
  • Example 3 Analysis of binding activity of DNA aptamer by gel shift assay>
  • 40-mer and 38-mer DNA aptamers with the primer region truncated were prepared.
  • the names and sequences of the prepared DNA aptamers are shown in Table 2, and the secondary structure predicted from the base sequence obtained by the selection is shown in FIG.
  • vWF1-DsDsDs (SEQ ID NO: 1), vWF1-DsDsA (SEQ ID NO: 2) in which Ds on the 3 ′ end side are replaced with A, vWF1-DsADs (SEQ ID NO: 3) in which Ds in the middle part is replaced with A, VWF1-ADsDs (SEQ ID NO: 4) in which Ds on the 5 ′ end side is replaced with A, vWF1-DsAA (SEQ ID NO: 5) in which Ds on the middle part and 3 ′ end side are replaced with A, 5 ′ end side and 3 ′ VWF1-ADsA (SEQ ID NO: 6) with Ds on the terminal side replaced with A, vWF1-AADs (SEQ ID NO: 7) with Ds on the 5 ′ terminal side and the middle part replaced with A, vWF1 with all Ds replaced with A -AAA (SEQ ID NO: 8), Ds on the 3 v
  • each DNA aptamer (100 nM) and vWF A1 domain (100 nM, U-Protein, V003) are suspended in 20 ⁇ L of a reaction solution (1 ⁇ PBS, 0.005% Nonidet P-40). And incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After that, 25% glycerol containing bromophenol blue was added to a final concentration of 5% glycerol, and 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis was performed at 4 ° C. Each DNA aptamer bound to the vWF A1 domain and the free state Each DNA aptamer was separated.
  • the DNA aptamer was stained with SYBR® Gold (Thermo® Fisher® Scientific) diluted 1/20000 in 1 ⁇ TBE solution, and detected by Bio Image Analyzer LAS-4000 (Fuji Film).
  • the gel shift rate was calculated as a percentage of the value obtained by dividing the amount of complex estimated from the band by the amount of free and complex.
  • Example 4 Analysis by Biacore of binding of DNA aptamer to vWF>
  • the binding ability of the obtained DNA aptamer was measured by surface plasmon resonance (SPR) using Biacore T200 manufactured by GE Healthcare.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the sequences of various DNA aptamers used for the analysis are shown in Table 2 above, and the predicted secondary structure is shown in FIG. Based on vWF1-DsDsDs (SEQ ID NO: 1), vWF1-AAA (SEQ ID NO: 8) in which three Ds are replaced with A, and vWF1-DsDsDs-GC (sequence in which a part of the AT pair in the stem region is replaced with a GC pair No.
  • vWF1-DsDsDs-mhGC (SEQ ID NO: 12) in which a mini hairpin was added to the 3 ′ end of vWF1-DsDsDs-GC was prepared.
  • ARC1172 (SEQ ID NO: 10) was used as a positive control.
  • Each of these DNA aptamers was prepared by chemical synthesis as a biotin-labeled nucleic acid having the base sequence shown in the figure and purified on a denaturing acrylamide gel.
  • Each nucleic acid fragment was prepared by mixing with a phosphate buffer (pH 7.4), heating at 95 ° C., and then gradually cooling to 25 ° C. to fold (reconstruct). Then, using a SA chip coated with streptavidin (GE Healthcare) as an SPR sensor chip, the DNA aptamer was irreversibly immobilized on the chip, and then analyzed for binding to the vWF-A1 domain.
  • the SPR measurement conditions were a running buffer (phosphate buffer containing 155 mM NaCl, 0.05% Nonidet P-40) and a set temperature of 37 ° C.
  • Each DNA aptamer was immobilized on the sensor chip by folding the DNA solution diluted with PBS solution to 25 nM (95 ° C, heat-denatured for 3 minutes, and gradually cooled to 25 ° C), and then the final concentration of 0.05 % Nonidet P-40 was added.
  • the DNA solution was immobilized on the SA chip by injecting 40 ⁇ L (equivalent to 8 minutes) at a flow rate of 5 ⁇ L / min.
  • the DNA aptamer non-specifically adsorbed on the SA chip was washed by injecting 50 ⁇ mM NaOH solution at a flow rate of 20 ⁇ L / min (5 ⁇ m, 5 times).
  • Interaction detection between immobilized DNA aptamer and vWF A1 domain was performed using 0 nM, 0.3125 nM, 0.625 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM and 20 nM vWF A1 domain solution (diluted with running buffer). ) was monitored by injection through Kinetic-Injection mode.
  • the measurement conditions are a flow rate of 100 ⁇ L / min and a protein injection time of 150 seconds.
  • Chip regeneration binding protein dissociation and DNA refolding was performed by injecting 50 ⁇ mM NaOH solution with 5 ⁇ L (corresponding to 15 seconds) and then running running buffer for 10 minutes.
  • the sensorgram of each DNA aptamer is obtained from the sensorgram of each DNA aptamer using the cell to which the DNA is not immobilized as a reference cell in order to subtract the response value due to the bulk effect and nonspecific adsorption to the sensor chip. deducted.
  • Tm value analysis of DNA aptamer The thermal stability (Tm value) of various DNA aptamers (vWF1-DsDsDs, vWF1-DsDsDs-GC, vWF1-DsDsDs-GCmh, vWF1-AAA final concentration: 2 ⁇ M) was measured. The change in absorbance of the DNA aptamer was measured with a UV-visible spectrophotometer UV-2450 (Shimadzu), and the Tm value, which is the melting temperature, was calculated from the first derivative. The results are shown in FIG.
  • vWF1-DsDsDs-GC and vWF1-DsDsDs-mhGC had a Tm value of 10 ° C. or more higher than that of ARC1172, which is an existing DNA aptamer, and was significantly superior in thermal stability to ARC1172.
  • Example 6 Selection of DNA aptamer that binds to vWF using random DNA library>
  • a DNA library containing the artificial base Ds was prepared.
  • the library used in the random library method is designed to include an artificial base Ds at a predetermined probability at a random position in a random base sequence.
  • the selection method was performed according to the method of Example 1. Briefly, DNA fragments (total number of molecular species 300 pmol, ie about 2 ⁇ 10 14 molecules) were used as the first round library, and the target protein vWF A1 domain (U-Protein, V003) was mixed.
  • DNA that binds to the target protein is selected and isolated using magnetic beads, and further PCR-amplified after selection and isolation by excising the DNA-vWF A1 domain complex by polyacrylamide gel electrophoresis, totaling 7 rounds The selection operation was performed. The conditions for each selection round are shown in Table 3. After 7 rounds of selection, the sequence was analyzed to obtain a DNA aptamer sequence containing the artificial base Ds.
  • sequence analysis of the DNA library obtained after 7 rounds 151,495 sequences were obtained as total sequences to be analyzed.
  • a sequence group of 100 clones or more was extracted, and clones having similar sequences were aggregated.
  • the highest sequence was a single sequence, accounting for 44% or more of the entire sequence. Accounted for%.
  • sequence group including the uppermost sequence three sites with a high appearance rate of only A or T were observed.
  • Example 7 Sequencing of DNA aptamer> In order to accurately identify the position of the artificial base Ds, the following operation was performed and accurate sequencing was performed.
  • the probe sequence of a DNA fragment consisting of 25 bases designed to be specific to the top sequence obtained in Example 6: 5′-CGTTGAGACCTGTTAGGTGCTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 25) was used. This probe was obtained by biochemically labeling the 5 ′ end and purchased from Thermo Fisher Fisher Scientific, which had been chemically synthesized and simply purified. The isolation of the target sequence from the library using the probe was performed in the same manner as in Example 2.
  • the sequencing analysis of DNA containing the artificial base Ds was performed in the same manner as in Example 2.
  • the artificial base template showed a pattern (gap) indicating artificial bases at three locations, whereas the sequence using natural substituted DNA as the template In the reaction sample, the peak of A is shown, and from this, it was found that the artificial base Ds is present in three places (random region 9th, 21st, 32nd).
  • Example 8 Analysis of binding activity of DNA aptamer by gel shift assay>
  • a DNA aptamer with the primer region truncated was prepared, and binding analysis was performed by gel shift assay.
  • the sequence of the DNA aptamer used in this example is shown in Table 4, and the expected secondary structure is shown in FIG.
  • vWF2-DsDsDs (SEQ ID NO: 13), vWF2-DsADs (SEQ ID NO: 14) with Ds in the middle part replaced with A, vWF2-DsAA (SEQ ID NO: with the Ds on the middle part and 3 'end side replaced with A) 15), vWF2-AADs (SEQ ID NO: 16) in which the Ds on the 5 ′ end side and the middle part are replaced with A (SEQ ID NO: 16), vWF2-AAA (SEQ ID NO: 17) in which all Ds are replaced with A, and AT base pairs in the stem part VWF2-DsDsDs-mhGC (SEQ ID NO: 18) was prepared by substituting GC base pairs and adding a mini hairpin DNA to the 3 ′ end.
  • the vWF2-DsDsDsDsDsDsDsDsDsDsDsDsDsDsDs was obtained by substituting the loop part of the middle part of WF2-DsDsDsDs-mhGC with the loop part sequence of mini hairpin DNA -2mhGC (SEQ ID NO: 21) was prepared.
  • An existing DNA aptamer ARC1172 (SEQ ID NO: 10) was also prepared. Each DNA aptamer was prepared according to a conventional method by chemical synthesis.
  • ARC1172 Compared with ARC1172 (j) used as a positive control, ARC1172 showed almost no binding by electrophoresis at 25 ° C to 37 ° C, whereas vWF2-DsDsDs containing artificial base Ds (m) , VWF2-DsADs (n), vWF2-DsDsDs-mhGC (r), and vWF2-DsDsDs-2mhGC (s) maintained binding even during electrophoresis at 25 ° C to 37 ° C.
  • Example 9 Analysis by Biacore of binding of DNA aptamer to vWF> The binding ability of the obtained DNA aptamer was measured by surface plasmon resonance (SPR) using Biacore T200 of GE Healthcare.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the DNA aptamer sequence used for the analysis is shown in Table 4 above, and the secondary structure predicted from the base sequence and the like obtained by selection is shown in FIG.
  • Each of these DNA aptamer mutants was prepared by chemically synthesizing a nucleic acid having the base sequence shown in the figure, and then purified on a denaturing acrylamide gel.
  • Each nucleic acid fragment was prepared by mixing with a phosphate buffer (pH 7.4), heating at 95 ° C., and then gradually cooling to 25 ° C. to fold (reconstruct).
  • SPR binding analysis was carried out in the same manner as in Examples except that the detection of the interaction between the DNA aptamer and the vWF A1 domain was performed at 0 nM, 0.078125 nM, 0.15625 nM, 0.3125 nM, 0.625 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, and 5 nM. Same as 4.
  • Example 10 Stability analysis of DNA aptamer in human serum> The stability of each DNA aptamer to nucleolytic enzymes contained in human serum was examined. Each DNA aptamer (vWF2-DsDsDs, vWF2-DsDsDs-mhGC, vWF2-DsDsDs-2mhGC, vWF2-AAA, ARC1172, final concentration 2 ⁇ M) was mixed so that the human serum concentration was 96%, and this solution was added to 37%. Incubated at 0 ° C.
  • Table 5 shows the remaining ratio (%) of each DNA aptamer at each time estimated from the intensity of the undegraded band when the time of 0 h is 100%.
  • vWF2-DsDsDs-mhGC and vWF2-DsDsDs-2mhGC the amount of remaining full-length DNA aptamer was significantly higher than that in vWF-DsDsDs, which showed improved stability against nucleolytic enzymes contained in serum. Suggests that. ARC1172 used as a positive control had a residual ratio of 20% after incubation at 37 ° C. for 72 hours, whereas vWF2-DsDsDs-2mhGC remained 75% even after 72 hours. From the above, it is shown that the DNA aptamer of the present invention has higher stability against nucleolytic enzymes than ARC1172, and the addition of a mini-hairpin sequence can greatly improve the stability against nucleolytic enzymes in serum. It was done.
  • Example 11 Thermal stability analysis of DNA aptamer> Thermal stability (Tm value) of each DNA aptamer (vWF2-DsDsDs, vWF2-DsADs, vWF2-DsAA, vWF2-AADs, vWF2-AAA, vWF2-DsDsDs-mhGC, vWF2-DsDsDs-2mhGC, final concentration 2 ⁇ M) It was measured. The change in absorbance of the DNA aptamer was measured with a UV-visible spectrophotometer UV-2450 (Shimadzu), and the Tm value, which is the melting temperature, was calculated from the first derivative.
  • vWF2-DsDsDs-mhGC Tm 75.5 ° C
  • replacing the AT base pair in the stem sequence with a GC base pair and adding a mini hairpin DNA to the 3 ′ end increases the Tm value by about 9 ° C.
  • Replacement with the sequence increased the Tm value by about 10 ° C.
  • a DNA aptamer having a stable structure even at a higher temperature could be produced.

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Abstract

本発明は、従来の核酸アプタマーよりも結合能、解離速度、及び／又は安定性が優れたvWFに対するアプタマーを提供することを目的とする。　本発明は、人工塩基を含むvWFに結合するDNAアプタマーにより上記課題を解決する。

Description

ｖＷＦに結合するＤＮＡアプタマー
　本発明は、人工塩基を含む、vWFに結合するDNAアプタマー、該DNAアプタマーを含む医薬組成物、及び該DNAアプタマーを用いてvWFを検出する方法等に関する。
　標的分子に対して結合活性を有する核酸断片は、核酸アプタマーと呼ばれ、核酸医薬品として医療への幅広い応用が期待されている。核酸アプタマーは、ランダムな塩基配列で構成される核酸断片ライブラリーの中から、標的分子に結合する核酸断片を選別及び単離するin vitroセレクション（SELEX法）によって作出することができる。
　一方、vWFは血中に存在する血液凝固因子の一つであり、その遺伝子変異はフォン・ウィルブランド病等に関与することや、vWFへの自己抗体の産生によって後天性の血栓性血小板減少性紫斑病等が引き起こされることが知られている。これまでにvWFに対する核酸アプタマーが幾つか開発されている（非特許文献１及び非特許文献２）。しかしながら、従来の核酸アプタマーは、20種類のアミノ酸から成るタンパク質である抗体と比較して、構成する塩基の種類が4種類しかないことから、そのバリエーションに限りがあり、結合能、解離速度、及び安定性等の性能について、十分満足できるものではなかった。そのため、核酸アプタマーを治療及び診断をはじめとする医療分野に用いるには、これらの性能を改善することが重要であった。
Sadler, J.E., 1998, Annu. Rev. Biochem., 67, pp. 395-424. Gilbert, J.C. et al, 2007, Circulation, 116, pp. 2678-2686.
　したがって、従来の核酸アプタマーよりも結合能、解離速度、及び／又は安定性が優れたvWFに対するアプタマーの開発が求められていた。
　本発明者は、vWFを標的として、本発明者が開発した人工塩基対技術を用いた2種類のSELEX法（WO2013/073602に記載のプレデターミン法及びランダムライブラリー法）を実施することにより、vWFに強く結合する、人工塩基を含むDNAアプタマーを得た。また、得られたDNAアプタマーについてさらなる研究を行った結果、従来の核酸アプタマーであるARC1172に比べて、KD及び／又はkoffの点で、優れた結合能（例えば、10倍以上低いKD及び／又はkoff）を示した。また、得られたDNAアプタマーは、優れたTm値及び／又は核酸分解酵素耐性を有していた。
　本発明は、上記知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
（１）以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：
　（i）配列番号13～16、19及び20のいずれかに示される塩基配列、又は
　（ii）（i）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（２）（i）の塩基配列が、配列番号13、14、19又は20に示される配列である、（１）に記載のDNAアプタマー。
（３）1～5個のGC対を塩基配列の末端に含む、（１）又は（２）に記載のDNAアプタマー。
（４）塩基配列の3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
　前記ミニヘアピン構造が、
　5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）～（C）の核酸領域：
　（A）2～5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
　（B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
　（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、
　かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
　（１）～（３）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（５）以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：
　（i）配列番号18若しくは21に示される塩基配列、又は
　（ii）（i）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載の塩基配列からなる、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー。
（７）以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：
　（I）配列番号1～4、9及び11のいずれかに示される塩基配列、又は
　（II）（I）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（８）（I）の塩基配列が、配列番号1又は11に示される配列である、（７）に記載のDNAアプタマー。
（９）1～5個のGC対を塩基配列の末端に含む、（７）又は（８）に記載のDNAアプタマー。
（１０）塩基配列の3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
　前記ミニヘアピン構造が、
　5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）～（C）の核酸領域：
　（A）2～5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
　（B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
　（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、
　かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
　（７）～（９）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１１）以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：
　（I）配列番号12に示される塩基配列、又は
　（II）（I）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（１２）（７）～（１１）のいずれかに記載の塩基配列からなる、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー。
（１３）（１）～（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含むvWFタンパク質検出剤。
（１４）（１）～（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含むvWFタンパク質検出用キット。
（１５）（１）～（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
（１６）血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、頭蓋内塞栓、脳塞栓症、頸動脈狭窄、血栓性微小血管症、及び急性心筋梗塞症からなる群から選択される疾患の治療及び／又は予防のための、（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）被験体から得られたサンプルを、（１）～（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、及び
　前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいてvWFタンパク質を検出する工程、
を含む、vWFタンパク質を検出する方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-214848号の開示内容を包含する。
　本発明により、従来の核酸アプタマーよりも結合能、解離速度、及び／又は安定性が優れたvWFに対するDNAアプタマーが提供される。また、本発明のDNAアプタマーにより、vWFの検出法、血栓症等の疾患の罹患の有無の診断を補助する方法、並びに血栓症等の疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物が提供される。
実施例3で調製した各DNAアプタマーの予測される二次構造を示す。aで示すvWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、3'末端側のDsをAに置換したbで示すvWF1-DsDsA（配列番号2）、中間部のDsをAに置換したcで示すvWF1-DsADs（配列番号3）、5'末端側のDsをAに置換したdで示すvWF1-ADsDs（配列番号4）、及び中間部と3'末端側のDsをAに置換したeで示すvWF1-DsAA（配列番号5）を調製した。人工塩基であるDsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。図中、太線はワトソンクリック塩基対を形成し得る塩基を、通常の線は塩基がホスホジエステル結合を介して連結されていることを示す。太線及び通常の線の意味は以下の図1-2、3、6-1、及び6-2について同様である。 実施例3で調製した各DNAアプタマーの予測される二次構造を示す。vWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、5'末端側と3'末端側のDsをAに置換したfで示すvWF1-ADsA（配列番号6）、5'末端側と中間部のDsをAに置換したgで示すvWF1-AADs（配列番号7）、全てのDsをAに置換したhで示すvWF1-AAA（配列番号8）、3'末端側のDsをAに置換し、ステム部分の末端のAT対を除いたiで示すvWF1-R1Ds（配列番号9）を調製した。また、陽性対照として既存のvWF結合性DNAアプタマーであるjで示すARC1172（配列番号10）も調製した。人工塩基であるDsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。 実施例3で調製した各DNAアプタマーのvWF A1ドメインに対するゲルシフトアッセイの結果を示す。図2Aは、電気泳動を行った際の、SYBR GOLDによるDNAアプタマーの染色結果を示す。図2Bは、ARC1172のゲルシフト率（レーン全体のバンドを100%としたときの、複合体のバンドの割合）を1.0として、各オリゴのシフト率（結合率）を相対シフト率としてグラフ化したものである。結合反応は37℃で、泳動は4℃で行った。複合体はvWF A1ドメインに結合したDNAアプタマーを、遊離は遊離状態のDNAアプタマーを示す。a～jは、それぞれ図1-1及び1-2のa～jによって示されるアプタマーを用いた際の結果を示す。 実施例4において、SPRによる結合活性測定に使用したDNAアプタマーの二次構造を示す。aで示すvWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、三つのDsをAに置換したhで示すvWF1-AAA（配列番号8）、ステム領域のAT対の一部をGC対に置換したkで示すvWF1-DsDsDs-GC（配列番号11）、vWF1-DsDsDs-GC の3'末端にミニヘアピンを付加したlで示すvWF1-DsDsDs-mhGC（配列番号12）を調製した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位及びAT対をGC対に置換した部位を矢頭で、ミニヘアピンを付加した部位を矢頭を付した四角で示す。 各種DNAアプタマーのSPRによるvWF A1ドメインタンパク質に対する結合解析結果を示す。AはvWF1-DsDsDsの、BはvWF1-DsDsDs-GCの、CはvWF1-DsDsDs-mhGCの、DはvWF1-AAAの、EはARC1172の結果を示す。 各種DNAアプタマーのTm値の測定結果を示す。Aは各温度におけるDNAアプタマーの標準吸光度を、Bは各温度におけるDNAアプタマーの標準化吸光度の一次導関数を示す。 実施例8で調製したDNAアプタマーの予測される二次構造を示す。mで示すvWF2-DsDsDs（配列番号13）を元に、中間部のDsをAに置換したnで示すvWF2-DsADs（配列番号14）、中間部及び3'末端側のDsをAに置換したoで示すvWF2-DsAA（配列番号15）、並びに5'末端側及び中間部のDsをAに置換したpで示すvWF2-AADs（配列番号16）を調製した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。 実施例8で調製したDNAアプタマーの予測される二次構造を示す。vWF2-DsDsDs（配列番号13）を元に、全てのDsをAに置換したqで示すvWF2-AAA（配列番号17）、ステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換し、かつ3'末端にミニヘアピンDNAを付加したrで示すvWF2-DsDsDs-mhGC（配列番号18）、さらにWF2-DsDsDs-mhGC（配列番号18）の中間部のループ部分をミニヘアピンDNAのループ部分配列（5′-GAA-3′）に置換したsで示すvWF2-DsDsDs-2mhGC（配列番号21）を調製した。また、陽性対照として既存のvWF結合性DNAアプタマーであるjで示すARC1172（配列番号10）も調製した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位及びAT対をGC対に置換した部位を矢頭で、ミニヘアピンを付加した部位及びミニヘアピンDNAのループ部分に置換した部位を矢頭を付した四角で示す。 各種DNAアプタマーのvWF A1ドメインに対するゲルシフトアッセイによる結合解析結果（異なる温度でのゲルシフトアッセイ）を示す。A～Cはそれぞれ、4℃/300V、25℃/40W、及び37℃/40Wで電気泳動を行った際の、SYBR GOLDによるDNAアプタマーの染色結果である。複合体はvWF A1ドメインに結合したDNAアプタマーを、遊離は遊離状態のDNAアプタマーを示す。m～sは、それぞれ図6-1及び6-2のm～sによって示されるアプタマーを用いた場合の結果を示す。jはARC1172を用いた場合の結果を示す。 各種DNAアプタマーのSPRによるvWF A1ドメインタンパク質に対する結合解析結果を示す。AはARC1172の、BはvWF2-DsDsDsの、CはvWF2-DsDsDs-2mhGCの結果を示す。 各種DNAアプタマーのヒト血清中における核酸分解酵素に対する安定性解析結果を示す。レーン左端のcはcontrolを指し、DNAアプタマーを加えていない血清のみの結果を示す。未分解のバンドを矢頭で示す。AはvWF2-DsDsDsの、BはvWF2-DsDsDs-mhGCの、CはvWF2-DsDsDs-2mhGCの、DはvWF2-AAAの、EはARC1172の結果を示す。 各種DNAアプタマーのTm値の測定結果を示す。Aは各温度におけるDNAアプタマーの標準吸光度を、Bは各温度におけるDNAアプタマーの標準化吸光度の一次導関数を示す。
１．定義
　本明細書で使用する一般的な用語の定義について以下で説明する。
　本明細書において「核酸」又は「核酸分子」とは、原則としてヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。
　本明細書において「天然型ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドであって、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの天然型塩基を有するデオキシリボヌクレオチドから構成されるDNA、及びアデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの天然塩基を有するリボヌクレオチドから構成されるRNA、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　本明細書において「非天然型ヌクレオチド」とは、その塩基が人工塩基で構成されている自然界に存在しないヌクレオチドをいう。本発明における非天然型ヌクレオチドを構成するリン酸基及び糖は、天然型ヌクレオチドのリン酸基及び糖と構造的に同一である。
　本明細書において「人工塩基」又は「塩基類似体」とは、天然型ヌクレオチドを構成する天然型塩基に類似の性質を有する人工的に構築された化学物質であって、天然型塩基と同様に、人工塩基対を形成することのできる相手となる塩基類似体（本明細書では、以降「相補的人工塩基」とする）を有する。本明細書において「人工塩基対合」とは、天然型塩基のアデニンとチミン、アデニンとウラシル、又はグアニンとシトシンのように、一対の相補的人工塩基が互いに形成する塩基対合をいう。人工塩基対合は、天然型塩基間の塩基対合に見られる水素結合を介した化学的結合、人工塩基間の分子構造に基づく嵌合を介した物理的結合、及び疎水性相互作用を介したスタッキング効果を含む。
　人工塩基が有する「天然型塩基に類似の性質」には、人工塩基対合による相補性によって核酸の複製又は転写（逆転写を含む）が可能な性質を含む。人工塩基は、天然型塩基と同様に、人工塩基対合において排他的選択性を有する。したがって、基質ヌクレオチドに一対の相補的人工塩基を有する非天然型ヌクレオチドが存在すれば、非天然型ヌクレオチドを含む核酸分子であっても、人工塩基間の相補性によって、天然型ヌクレオチドと同様に正確な複製や転写ができる。それ故、非天然型ヌクレオチドを含みながら、PCR等の核酸増幅法によるDNA分子の増幅等が可能となる。
　上記人工塩基の具体例として、Ds（7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl；本明細書では「Ds」とする）、Pn(2-nitropyrrole-1-yl；本明細書では「Pn」とする）、Pa（2-formyl-1H-pyrrole-1-yl；本明細書では「Pa」とする）、P(2-amino-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one；本明細書では「P」とする）、Z(6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone；本明細書では「Z」とする）、5SICS（6-methylisoquinoline-1(2H)-thione；本明細書では「5SICS」とする）、NaM（3-methoxynaphthalen-2-yl；本明細書では「NaM」とする）、及びMMO2（2-methoxy-4-methylphenyl；本明細書では「MMO2」とする）が挙げられる。これらの人工塩基において、Dsの相補的人工塩基には、Pn、及びPaが挙げられる。Pの相補的人工塩基には、Zが挙げられる。5SICSの相補的人工塩基には、NaM、及びMMO2が挙げられる。
　なお、人工塩基は、複製や転写の際、相補的人工塩基を有する非天然型ヌクレオチドが基質に含まれない場合には、相補的人工塩基と構造的に及び／又は性質的に近い天然型塩基と代替的に塩基対合することができる。この場合、鋳型となった核酸分子における非天然型ヌクレオチドは、複製又は転写後に天然型ヌクレオチドに置換されることとなる。例えば、Dsの場合、A又はTに置換されることが知られている。
　本明細書において、「修飾塩基」とは、人工的に化学修飾された塩基を意味する。修飾塩基として、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル、5-(3-インドール-2-エチル)ウラシル、5-(4-ヒドロキシフェニル-2-エチル)ウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。
　本明細書において、「DNAアプタマー」とは、DNAで構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的分子と強固、かつ特異的に結合するリガンド分子をいう。DNAアプタマーが標的分子の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つ場合には、DNAアプタマーは、標的分子の機能阻害剤となり得る。本明細書において「標的分子の機能阻害」とは、標的分子が有する触媒機能又は遺伝子発現制御機能（転写、翻訳、輸送等の制御を含む）、アポトーシス制御機能のような生物学的機能を阻害又は抑制することをいう。本明細書において「標的分子」とは、DNAアプタマーの結合対象となり得る物質をいい、本発明では標的分子としてvWFが挙げられる。
　本明細書において、「vWF」は、von Willebrand factor（フォン・ウィルブランド因子）タンパク質（本明細書では、「vWFタンパク質」とも表記する）を指す。vWFは血中に存在する血液凝固因子の一つであり、その遺伝子変異はフォン・ウィルブランド病等の様々な疾患に関与することや、vWFへの自己抗体の産生によって後天性の血栓性血小板減少性紫斑病等が引き起こされることが知られている。本発明において、vWFの由来となる生物種は問わないが、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトのvWFが挙げられる。
　vWFは、例えば、（a）配列番号28で示されるアミノ酸配列、（b）配列番号28で示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列、又は（c）配列番号28で示されるアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。vWFはこれらのアミノ酸配列のいずれかからなるものであってもよい。本明細書において、同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。
　本明細書において、vWFのA1ドメインとは、血小板上のGPIb受容体に対する結合能を有するvWF中のドメインを意味する。vWFのA1ドメインは、例えば、（a）配列番号28の1238位～1481位のアミノ酸配列、（b）配列番号28の1238位～1481位のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列、又は（c）配列番号28の1238位～1481位のアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。vWFのA1ドメインはこれらのアミノ酸配列のいずれかからなるものであってもよい。
　本明細書において、「数個」とは、例えば1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、又は1～2個を意味する。
　本明細書において、「ミニヘアピン構造」は、以下の第１核酸領域、第2核酸領域、及び第3核酸領域の3つのDNA核酸領域がそれぞれ5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された構造を有する。ミニヘアピン型DNAは、核酸分解酵素に対する分解耐性を高め、及び／又はDNAアプタマーのTm値を上げることでDNAアプタマーの熱安定性を増加させ得る。
　「第1核酸領域」とは、2～5個の任意のヌクレオチドからなる核酸領域である。前記ヌクレオチドは、グアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）又はチミン（T）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチドをいう。本核酸領域の塩基は、好ましくはグアニン又はシトシンである。これは、後述する第3核酸領域との間でステム構造を形成するにあたり、GC含量が多いほどTm値も増加し、前記ステム構造を安定的に保持することができるからである。したがって、第1核酸領域の全塩基配列がG及び／又はCで構成されていることがもっとも好ましい。
　「第2核酸領域」とは、5'‐GNA‐3'又は5'‐GNNA‐3'の塩基配列からなる核酸領域である。配列中の各Nは、独立に、天然型塩基（G、A、T、若しくはC）のいずれか、例えばTからなる。
　「第3核酸領域」とは、第1核酸領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸領域である。したがって、第3核酸領域の塩基配列は、第1核酸領域の塩基配列によって定まり、また第1核酸領域と第3核酸領域は、分子内で塩基対を形成する。その結果、第1核酸領域と第3核酸領域は、互いに完全に塩基対合したステム部分を、また第1核酸領域と第3核酸領域の間に存在する第2核酸領域は、ループ部分をそれぞれ構成し、全体として、7～14個のヌクレオチドからなるミニヘアピン型DNAが形成される。ミニヘアピン型DNAの例として、CGCGTAGCG（配列番号26）に示す塩基配列からなるDNAが挙げられる。
２．vWFに結合するDNAアプタマー
　一態様において、本発明は、以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFに結合するDNAアプタマーに関する：
　（i）配列番号13～16、19及び20のいずれか、好ましくは配列番号13、14、19及び20のいずれかに示される塩基配列、又は
　（ii）（i）に示される塩基配列において、Ds以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
　一実施形態において、（i）の塩基配列は、その末端に塩基対、例えばGC対を1～5個、例えば、1～4個、1～3個、1～2個、又は1個含む。末端の塩基対は、DNAアプタマーのTm値を上昇させ、熱安定性を向上させ得る。（i）の塩基配列は、これらの塩基対に加えて、又はこれらの塩基対に替えて、ミニヘアピン構造を形成する配列（以下、本明細書では「ミニヘアピン配列」とも称する）を、例えば3'末端側に含んでよい。
　（i）の配列にミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号19に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号18に示される配列、及び配列番号20に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号21に示される配列が挙げられる。
　したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号18若しくは21に示される塩基配列、又は配列番号18若しくは21に示される塩基配列において、Ds以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含む、vWFに結合するDNAアプタマーに関する。
　一実施形態において、本発明のDNAアプタマーは、上記（i）若しくは（ii）の塩基配列、又は該塩基配列の末端に塩基対及び／又はミニヘアピン配列を付加した塩基配列からなる。
　（i）又は（ii）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、vWF、例えばvWFのA1ドメインに結合する。
　（i）又は（ii）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、解離定数KD及び／又は解離速度koffの点で、優れたvWFへの結合能を有し得る。本明細書において、KDとは、koff（解離速度）／kon（結合速度）で表される解離定数を指す。KDの値が小さい程、標的への親和性が強く、また、koffの値が小さい程、標的と結合した後に解離しにくいことを意味する。
　（i）又は（ii）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、BiacoreによるvWFとの結合解析で、1.0×10-7、1.0×10-8、1.0×10-9、好ましくは5.0×10-10、3.0×10-10、1.0×10-10、又は8.0×10-11M以下のKDを有し得る。
　（i）又は（ii）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、BiacoreによるvWFとの結合解析で、1.0×10-1、好ましくは9.0×10-2、8.0×10-2、7.0×10-2、6.0×10-2、又は5.0×10-2（1/Ms）以下のkoffを有し得る。
　一態様において、本発明は、以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFに結合するDNAアプタマーに関する：
　（I）配列番号1～4、9及び11のいずれか、好ましくは配列番号1又は11に示される塩基配列、又は
　（II）（I）に示される塩基配列において、Ds以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
　一実施形態において、（I）の塩基配列は、その末端に塩基対、例えばGC対を1～5個、例えば、1～4個、1～3個、1～2個、又は1個含む。末端の塩基対は、DNAアプタマーのTm値を上昇させ、熱安定性を向上させ得る。（I）の塩基配列は、これらの塩基対に加えて、又はこれらの塩基対に替えて、ミニヘアピン配列を、例えば3'末端側に含んでよい。
　（I）の配列にミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号11に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号12に示される配列が挙げられる。
　したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号12に示される塩基配列、又は配列番号12に示される塩基配列において、Ds以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含む、vWFに結合するDNAアプタマーに関する。
　一実施形態において、本発明のDNAアプタマーは、（I）若しくは（II）の塩基配列、又は該塩基配列の末端に塩基対及び／又はミニヘアピン配列を付加した塩基配列からなる。
　（I）又は（II）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、vWF、例えばvWFのA1ドメインに結合する。
　（I）又は（II）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、特に解離速度koffの点で、優れたvWFへの結合能を有し得る。例えば、（I）又は（II）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、BiacoreによるvWFとの結合解析で、1.0×10-1、1.0×10-2、好ましくは5.0×10-3、4.0×10-3、3.0×10-3、又は2.0×10-3（1/Ms）以下のkoffを有し得る。
　また、（I）又は（II）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、BiacoreによるvWFとの結合解析で、1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8、好ましくは5.0×10-9、4.0×10-9、3.0×10-9、又は2.0×10-9M以下のKDを有し得る。
　（i）若しくは（ii）、又は（I）若しくは（II）の配列を含むDNAアプタマー（以下、単に「本発明のDNAアプタマー」とも記載する）の長さは、例えば、150mer以下、140mer以下、130mer以下、120mer以下、110mer以下、好ましくは100mer以下、90mer以下、80mer以下、70mer以下、60mer以下又は50mer以下である。
　本発明のDNAアプタマーは、Dsに加えて、任意に塩基類似体、他の人工塩基、又は他の修飾塩基等を含んでよい。
　本発明のDNAアプタマーは、他の物質、例えばポリエチレングリコール（PEG）（例えば、約20～約60kDaのPEG重合体）、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、脂質、色素、蛍光物質、酵素、放射性物質、ビオチン等を付加することにより修飾されていてもよい。これらの物質は、必要に応じて公知のリンカーを介して連結してもよい。本明細書におけるリンカーの例として、ヌクレオチドリンカー、ペプチドリンカー、及びジスルフィド結合を含むリンカー等が挙げられる。PEGを連結することにより、一般にDNAアプタマーの半減期を伸ばすことができることが知られている。
　本発明のDNAアプタマーの製造方法は特に限定しない。本分野で公知の方法を用いればよい。例えば、本発明のDNAアプタマーは、上記の配列に基づいて公知の固相合成法に従って化学合成することができる。核酸の化学合成法については、例えば、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Section 3を参照されたい。また、このような化学合成については、多くのライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ株式会社、Sigma-Aldrich Corporation等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。DNAアプタマーの配列に基づいて幾つかの断片を合成した後に、分子内アニールやリガーゼによるライゲーション等によって断片を連結することによりDNAアプタマーを作製してもよい。
　化学合成後の本発明のDNAアプタマーは、使用前に当該分野で公知の方法によって精製することが好ましい。精製方法としては、例えば、ゲル精製法、アフィニティーカラム精製法、HPLC法等が挙げられる。
３．DNAアプタマーを含む医薬組成物
　一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本発明のDNAアプタマーが有するvWFへの結合能を失わない範囲において、他の薬剤を一以上含有することもできる。
　一実施形態において、本発明は、DNAアプタマーと他の薬剤とを含む、薬剤を病変部位に送達するための医薬組成物に関する。他の薬剤はDNAアプタマーに結合させてもよく、それにより、DNAアプタマーのvWFへの結合能を利用して、薬剤を病変部位に効率的に送達することが可能となる。DNAアプタマーと薬剤の結合方法は限定されるものではない。
　本発明の医薬組成物の予防及び／又は治療の対象となる疾患は、vWFの遺伝子変異又は過剰発現等、及びvWFに対する自己抗体の生産等がその疾患の原因となり得る疾患（本明細書では、以下「vWF関連疾患」とも記載する）である。vWF関連疾患の例として、例えば、血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、頭蓋内塞栓、脳塞栓症、頸動脈狭窄、血栓性微小血管症、及び急性心筋梗塞症等が挙げられる。
　これらの疾患に罹患した被験体に医薬組成物を投与することにより治療効果が、これらの疾患に罹患するリスクがある被験体に医薬組成物を投与することにより予防効果が期待される。
　本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する医薬組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、潤滑沢剤、又は安定化剤が挙げられる。
　「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、或いはそれらの組み合わせが挙げられる。
　「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
　「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
　「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
　「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
　「安定化剤」としては、例えば、アスコルビン酸や亜硫酸塩等の酸化防止剤、トレハロースやブドウ糖等の糖類が挙げられる。
　このような担体は、必要に応じて適宜使用すればよい。本発明の医薬組成物は、上記の添加剤の他、必要に応じて矯味矯臭剤、溶解補助剤（可溶化剤）、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、吸収促進剤（例えば、第4級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等）、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉等）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等）、コーティング剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、溶解補助剤等を含むこともできる。
　「界面活性剤」としては、例えば、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩、アルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、脂肪アルコールスルフェート、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル、さらに、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコール／エチレンオキシドの縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸廃液、及びメチルセルロースが該当する。
　本実施形態の医薬組成物は、一医薬組成物中に上記担体を一以上包含することが可能である。
　本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。通常は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。
　例えば、経口投与に適した剤形としては、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。
　非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は、組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるが、医薬組成物も、それぞれの投与方法に適した剤形にすることができる。全身又は組織内投与に適した剤形としては、例えば、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、例えば、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、例えば、坐剤等を挙げることができる。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
　本発明の医薬組成物を製造するには、原則として当該分野で公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
　例えば、注射剤の場合には、本発明のDNAアプタマーを製薬上許容可能な溶媒に溶解し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加え、当該分野で慣用されている方法により製造することができる。
　「薬学的に許容可能な溶媒」としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、目的とする癌等の疾患の治療又は予防のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
　本発明の医薬組成物は、全身投与又は局所的投与のいずれにより投与されてもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明のDNAアプタマーを十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明のDNAアプタマーを全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
　本発明の医薬組成物は、有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
　注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。有効成分であるDNAアプタマーが標的物質に結合することができれば、いずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経肺、経皮、皮下、皮内、及び腹腔内等が挙げられる。
４．DNAアプタマーを用いる治療及び／又は予防方法
　一態様において、本発明は本発明のDNAアプタマー又は上記医薬組成物を被験体に投与することを含む、疾患の治療及び／又は予防方法に関する。
　本発明の医薬組成物の予防及び／又は治療の対象となる疾患は、vWF関連疾患である。例えば、血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、頭蓋内塞栓、脳塞栓症、頸動脈狭窄、血栓性微小血管症、及び急性心筋梗塞症等が挙げられる。
　本明細書において、「被験体」となり得る動物種は、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトである。
５．DNAアプタマーを含む検出剤
　一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含むvWF検出剤に関する。本発明のvWF検出剤は、本発明のDNAアプタマーのvWFへの結合能を利用して、in vivo又はin vitroにおいてvWFを検出するための薬剤である。例えば、DNAアプタマーをあらかじめ蛍光試薬等で標識し、これを投与することによって、生体内でvWFの発現強度を決定し、またその局在を調べることができる。これによって、上記vWF関連疾患の診断を補助することが可能となり得る。本発明のDNAアプタマーは、イメージング及び組織染色等において有用である。
　一実施形態において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含むvWF検出用組成物に関する。組成物の構成については上記医薬組成物と同様であるから、ここでは記載を省略する。
　一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含むvWF検出用キットに関する。本発明のキットは、本発明のDNAアプタマーに加えて、バッファー、標識試薬、及び／又は説明書等を含んでよい。
６．vWFの検出方法
　一態様において、本発明は、vWFを検出する方法に関する。本方法は、被験体から得られたサンプルを、本発明のDNAアプタマーと接触させる工程、及びサンプルとDNAアプタマーの結合に基づいてvWFを検出する工程を含む。本方法によって、上記vWF関連疾患の診断を補助することが可能となり得る。
　本方法において用いるサンプルとしては、組織及び生体試料が挙げられる。組織の例として、病変部位、例えば、脳、心臓、肝臓、膵臓、肺、骨髄、リンパ節、及び脾臓等が挙げられ、例えばこれらの組織の生検サンプルを用いることができる。生体試料の例として、例えば、血液、血漿、リンパ液、組織液、尿、並びに細胞、例えば末梢血細胞、毛母細胞、口腔細胞、鼻腔細胞、腸管細胞、膣内細胞、粘膜細胞、及び喀痰（肺胞細胞又は気肝細胞等を含み得る）等、好ましくは血液又は血漿が挙げられる。
　本発明の検出方法の検出工程は、サンプルとDNAアプタマーの結合を利用するものであれば特に限定せず、公知の方法を用いればよい。例えば、SPR法、比濁法、比色法又は蛍光法を利用することができる。
　SPR（表面プラズモン共鳴）は、金属薄膜にレーザー光を照射すると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰する現象をいう。SPR法は、この現象を利用した測定方法で、センサ部である金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。本発明においては、例えば、予め本発明のDNAアプタマーを金属薄膜表面上に固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させ、当該核酸分子と標的物質との結合によって生じる試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することにより試料中の標的物質を検出することができる。SPR法には、置換法、間接競合法等が知られるがいずれを用いてもよい。
　比濁法は、溶液に光を照射し、溶液中に浮遊する物質によって散乱する散乱光の減衰又はその溶液を通過した透過光を、比色計等を用いて光学的に計測することにより溶液中の物質量を測定する方法である。本発明においては、試料中に本発明のDNAアプタマーを添加する前後の吸光度を計測することによって、試料中の標的物質を定量的に検出することができる。
　また、標的物質に対する抗体と併用することにより標的物質を検出することもできる。例えば、ELISA法のサンドイッチ法を応用した方法を用いてもよい。この方法では、まず、固相担体に本発明のDNAアプタマーを固定しておき、次に試料を加えて、試料中に存在する標的物質と前記DNAアプタマーとを結合させる。続いて、試料を洗い流した後、抗標的物質抗体を加えて標的物質に結合させる。洗浄後、適当な標識をした二次抗体を用いて抗標的物質抗体を検出することにより、試料中の標的物質を検出することができる。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
　一態様において、本発明は、被験体においてvWF関連疾患の罹患の有無の診断を補助する方法に関する。本方法は、被験体に本発明のDNAアプタマー又は本発明のvWF検出用組成を投与する工程、及びDNAアプタマーを検出する工程を含む。例えば、生体内で特定の部位でDNAアプタマーが高濃度で検出された場合には、その部位において疾患が生じていると判断することができる。検出工程は、公知の方法を用いればよく、例えば上記蛍光法を用いることができる。
＜実施例1：DsプレデターミンDNAライブラリーを用いたvWFに結合するDNAアプタマーの選抜＞
　WO2013/073602に記載のプレデターミン法に従って人工塩基Dsを含むDNAライブラリーの調製を行った。プレデターミン法で用いるライブラリーは、ランダムな塩基配列中の特定の固定された位置に人工塩基Dsを含むようにデザインされたものである。手短には、DNA断片（分子種総数は300 pmol、約2×1014分子）を1ラウンド目のライブラリーとして用い、標的タンパク質であるvWF A1ドメイン（U-Protein社、V003）を混合した後、磁気ビーズを用いて標的タンパク質に結合するDNAを選別及び単離し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いDNA-vWF A1ドメイン複合体を切り出すことにより選別及び単離後、PCR増幅を行い、計8ラウンドのセレクション操作を行った。各セレクションの条件は表1に示した。8ラウンドのセレクション終了後、配列の解析を行い、人工塩基Dsを含むDNAアプタマーの配列を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　8ラウンド後に得られたDNAライブラリーのシークエンス解析の結果、解析対象となる総配列として420526配列が得られた。WO2013/073602に記載の解析方法によって、100クローン以上の配列群の中から、人工塩基が残存していると推測される配列の抽出を行ったところ、計406086配列が抽出された。その配列数を集計したところ、最上位配列は単一配列で、全体の80%以上、類似配列を含めると全体の90%を占めていた。
＜実施例2：DNAアプタマーの配列決定＞
　人工塩基Dsの位置を正確に同定するため、以下の操作を行い、正確な配列決定を行った。
　実施例1で得られた最上位配列に特異的になるようにデザインした25塩基からなるDNA断片のプローブ配列：5'-ACTCCCTCGGTTGTTGGCGAAAGTTG-3'（配列番号22）を用いた。このプローブは5'末端をビオチン化標識したものをThermo Fisher Scientific社から化学合成及び簡易精製済みのものを購入して使用した。8ラウンド後に得られたDNA断片をdDsTPとDiol1-dPxTPでPCR増幅して調製した一本鎖DNAライブラリーを、100 nM / 1×結合溶液（20 mM Tris-HCl、0.5 M NaCl、10 mM MgCl2、pH 7.6）となるように溶液で希釈し、その溶液20 μlとビオチン化プローブ（5 μM、1 μl）を混合した。その後、アニーリング操作（90℃3分、－0.1℃／秒で徐冷、－55℃ 15分）を行い、1×結合溶液に置換したストレプトアビジン磁気ビーズ（5μL）と混合し、55℃で5分間インキュベートすることでビオチン化プローブ及びプローブに相補的にハイブリダイズしたDNA断片を磁気ビーズに固定化した。磁気スタンドを使用して溶液を取り除き、プローブにハイブリダイズしていない余剰のDNA断片を取り除いた後、磁気ビーズを150 μLの1×結合溶液（55℃）で5回洗浄した。その後、洗浄後の磁気ビーズに滅菌水20 μLを添加し、75℃で5分間加熱した後に直ぐに溶液を回収することで、プローブにハイブリダイズしたDNA断片を回収した。
　人工塩基Dsを含むDNAのシークエンシング解析では、通常のダイターミネーターによるシーケンス反応中に、人工塩基Dsに相補的な基質としてddPa'TP若しくはdPa'TP、又は人工塩基Dsの相補塩基であるPxに相補的な基質としてddDsTP若しくはdDsTPを加えると、シーケンスパターンが異なってくることから、シーケンスの鋳型に用いたDNA断片中の人工塩基Dsの有無、及び正確な位置を調べることができる。そこで、プローブを用いて回収したDNA断片を鋳型に用いて、以下の2種類の方法（（i）及び（ii））によってDNAシークエンシングを行った。
　（i）回収したDNA溶液10 μlを用いてdDsTP、Diol1-dPxTP存在下、AccuPrime Pfx DNA ポリメラーゼを用いた15サイクルのPCR増幅後、ゲル精製により回収した断片を20 μlの水に溶かし、その溶液を鋳型として、0.05 mM ddPa'TP存在下、0.05 mM dPa'TP存在下、又は0.05 mM ddDsTP存在下、0.05 mM dDsTP存在下でシーケンスした（この方法では、回収したDNAが人工塩基Dsを保持していれば、DsはPCR中も保持される）。
　（ii）回収したDNA溶液10 μlを用いて、0.05 mM dPa'TP存在下、AccuPrime Pfx DNA ポリメラーゼを用いた15サイクルのPCR増幅後、ゲル精製により回収した断片を20 μlの水に溶かし、その溶液を鋳型として、0.05 mM ddPa'TP存在下、0.05 mM dPa'TP存在下、又は0.05 mM ddDsTP存在下、0.05 mM dDsTP存在下でシーケンスした（この方法では、回収したDNAが人工塩基Dsを保持していれば、Dsの位置はPCR後にA若しくはTに置換される）。
　具体的には、DNAシークエンシング反応は、全量20 μLにて、市販のBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。シーケンスプライマーには、5'- ACGACCGTTCTCTAATTTTGACGTT-3'（配列番号23）、及び5'-ACCAAATTATTGCGATACAGACCCT-3'（配列番号24）を用いて、PCR増幅及び精製した2本鎖DNA断片（0.15 pmol程度）、ddPa'TP若しくはdPa'TP、又はddDsTP若しくはdDsTP（500pmol）を反応溶液中に加え、25サイクルのPCR（96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃ 4分）を行った。未反応のダイターミネーターを脱塩カラム処理にて除去し、残りの溶液を減圧下で乾燥した。残存物にBlue-Dextranを希釈したホルムアミド溶液を4 μl加えて、その一部をABI377DNAシーケンサーにより解析した。配列のピークパターンは、Applied Biosystems PRISMシークエンシング解析ソフトv3.2ソフトウェアを用いて解析した。
　シーケンスパターンを解析した結果、Px鎖側を鋳型としたシーケンス反応サンプルにおいて、人工塩基鋳型では3箇所に人工塩基を示すパターン（ギャップ）が現れたのに対して、天然置換DNAを鋳型としたシーケンス反応サンプルにおいてはAのピークが示されており、このことからタグ配列で示された2箇所のDsの位置（ランダム領域6番目と15番目）に加えて、19番目にも人工塩基Dsが存在することが分かった。
＜実施例3：DNAアプタマーのゲルシフトアッセイによる結合活性解析＞
　配列同定した人工塩基Dsを3箇所に含むDNAアプタマーのvWF A1ドメインタンパクに対する結合を調べるために、プライマー領域を切り詰めた40-mer及び38-merのDNAアプタマーを調製した。調製した各DNAアプタマーの名称及び配列を表2に、セレクションで得られた塩基配列等から予測される二次構造を図1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　vWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、3'末端側のDsをAに置換したvWF1-DsDsA（配列番号2）、中間部のDsをAに置換したvWF1-DsADs（配列番号3）、5'末端側のDsをAに置換したvWF1-ADsDs（配列番号4）、中間部と3'末端側のDsをAに置換したvWF1-DsAA（配列番号5）、5'末端側と3'末端側のDsをAに置換したvWF1-ADsA（配列番号6）、5'末端側と中間部のDsをAに置換したvWF1-AADs（配列番号7）、全てのDsをAに置換したvWF1-AAA（配列番号8）、3'末端側のDsをAに置換し、ステム部分の末端のAT対を除いたvWF1-R1Ds（配列番号9）を調製した。また、陽性対照として既存のvWF結合性DNAアプタマーであるARC1172（配列番号10）も調製し、解析に用いた。各DNAアプタマーは、化学合成により常法に従って調製した。
　合成したDNAアプタマーの結合能の解析はゲルシフトアッセイによって行った。具体的には、20μLの反応液（1×PBS、0.005% Nonidet P-40）中に、各DNAアプタマー（100 nM）、及びvWF A1ドメイン（100 nM、U-Protein社、V003）を懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。その後、ブロモフェノールブルーを含む25％グリセロールを終濃度5％グリセロールとなるように加え、4℃で8％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、vWF A1ドメインに結合した各DNAアプタマーと遊離状態の各DNAアプタマーとを分離した。その後、1×TBE溶液で1/20000に希釈したSYBR Gold（Thermo Fisher Scientific）を用いてDNAアプタマーを染色し、バイオイメージアナライザーLAS-4000（富士フィルム）によって検出した。ゲルシフト率は、バンドから推定される複合体の量を、遊離及び複合体の量で割った数値の百分率として算出した。
　結果を、図2に示す。ゲルシフトアッセイの結果、DsをAに置換したいずれのDNAアプタマー（vWF1-DsDsA（b）、vWF1-DsADs（c）、及びvWF1-ADsDs（d））においても結合の低下が認められたことから、3つの人工塩基Ds全てが結合に関与していることが示された。vWF1-ADsDs（d）においては結合の低下が小さかったことから、特に、5'側及び中間部のDsが強く結合に関与していることが示された。また、vWF1-DsDsDs（a）は、陽性対照とした既存のvWF結合性DNAアプタマーであるARC1172（j）よりも強い結合力を示した。
＜実施例4：DNAアプタマーのvWFに対する結合のBiacoreによる解析＞
　得られたDNAアプタマーの結合能をGEヘルスケア社のBiacoreT200を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定した。解析に用いた各種DNAアプタマーの配列を上記表2に、予測される二次構造を図3に示す。vWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、三つのDsをAに置換したvWF1-AAA（配列番号8）、ステム領域のAT対の一部をGC対に置換したvWF1-DsDsDs-GC（配列番号11）、vWF1-DsDsDs-GC の3'末端にミニヘアピンを付加したvWF1-DsDsDs-mhGC（配列番号12）を調製した。また、陽性対照として、ARC1172（配列番号10）を用いた。
　これら各DNAアプタマーは、それぞれ図中に示される塩基配列を有する核酸をビオチン標識されたものとして化学合成によって調製し、変性アクリルアミドゲルにて精製した。それぞれの核酸断片はリン酸緩衝液（pH 7.4）にて混合し、95℃で加熱後25℃まで徐冷することでフォールディング（再構築）させて調製した。そして、SPRのセンサーチップとしてストレプトアビジンがコートされたSAチップ（GEヘルスケア）を用い、DNAアプタマーをチップへ不可逆的に固定化後、vWF A1ドメインへの結合を解析した。なお、SPRの測定条件は、ランニングバッファー（155 mM NaClを含むリン酸バッファー、0.05% Nonidet P-40）、設定温度37℃で行った。各DNAアプタマーのセンサーチップへの固定化は、25 nMとなるようにPBS溶液で希釈したDNA溶液をフォールディング処理（95℃、3分間加熱変性後、25℃まで徐冷）した後、最終濃度0.05％となるようにNonidet P-40を加えた。そのDNA溶液を流速5μL/minで40 μL（8分間相当）インジェクションすることで、SAチップに固定化した。また、固定化後、流速20μL/minで、50 mM NaOH溶液をインジェクション(5 μL、5回)することにより、SAチップに非特異的に吸着されているDNAアプタマーを洗浄した。固定化されたDNAアプタマーとvWF A1ドメインとの相互作用検出は、0 nM、0.3125 nM、0.625 nM、1.25 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM及び20 nMのvWF A1ドメイン溶液（ランニングバッファーで希釈）をKinetic Injectioｎモードによってインジェクションすることでモニターした。測定条件は流速100 μL/min、タンパク質インジェクション時間は150秒である。チップの再生（結合タンパク質の解離及びDNAのリフォールディング）は50 mM NaOHの溶液を5 μL（15秒相当）インジェクション後、10分間ランニングバッファーを流すことで行った。各DNAアプタマーのセンサーグラムは、センサーチップに対するバルク効果や非特異的吸着によるレスポンス値を差し引くために、DNAを固定化していないセルをリファレンスのセルとして、そのレスポンス値を各DNAアプタマーのセンサーグラムから差し引いた。
　結果を図4に示す。本測定の結果、各DNAアプタマーのKD値は、1.03 nM（vWF1-DsDsDs）、1.08 nM（vWF1-DsDsDs-GC）、0.78 nM（vWF1-DsDsDs-GCmh）であったことから、ミニヘアピンDNAを3'末端に付加することで結合力が向上していることが示された。ミニヘアピンDNAを付加したDNAアプタマー(vWF1-DsDsDs-GCmh)のKD値は、従来型のARC1172のKD値と同程度であるが、koffの値は従来の核酸アプタマーよりも顕著に低かった（ARC1172：koff＝0.162（1/s）、vWF1-DsDsDs-GCmh：koff=0.00159（1/s））。
＜実施例5：DNAアプタマーのTm値分析＞
　各種DNAアプタマー（vWF1-DsDsDs、vWF1-DsDsDs-GC、vWF1-DsDsDs-GCmh、vWF1-AAA最終濃度：2 μM）の熱安定性（Tm値）を測定した。DNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV-2450（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。結果を図5に示す。vWF1-DsDsDsはTm = 65.7℃、vWF1-DsDsDs-GCはTm = 73.0℃、vWF1-DsDsDs-mhGCはTm = 74.7℃と、ステム部分のGC対の増加及びミニヘアピンDNAの付加により熱安定性が向上していることが示された。特に、vWF1-DsDsDs-GC及びvWF1-DsDsDs-mhGCは、既存のDNAアプタマーであるARC1172と比較してもTm値が10℃以上高く、熱安定性がARC1172より顕著に優れていた。一方で、DsをAに置換したvWF1-AAAはTm = 63.0℃と僅かに低下しており、Ds自体が熱安定性に関与していることが示された。
＜実施例6：ランダムDNAライブラリーを用いたvWFに結合するDNAアプタマーの選抜＞
　WO2013/073602に記載のランダムライブラリー法に従って、人工塩基Dsを含むDNAライブラリーの調製を行った。ランダムライブラリー法で用いるライブラリーは、ランダムな塩基配列中のランダムな位置に所定の確率で人工塩基Dsを含むようにデザインされたものである。セレクション方法は実施例1の方法に従って行った。手短には、DNA断片（分子種総数は300 pmol、すなわち約2×1014分子）を1ラウンド目のライブラリーとして用い、標的タンパク質であるvWF A1ドメイン（U-Protein社、V003）を混合した後、磁気ビーズを用いて標的タンパク質に結合するDNAを選別及び単離し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動によってDNA-vWF A1ドメイン複合体を切り出すことにより選別及び単離後、PCR増幅し、計7ラウンドのセレクション操作を行った。各セレクションラウンドの条件は表3に示した。7ラウンドのセレクション終了後、配列の解析を行い、人工塩基Dsを含むDNAアプタマー配列を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　7ラウンド後に得られたDNAライブラリーのシークエンス解析の結果、解析対象となる総配列として151,495配列が得られた。上記解析方法によって、100クローン以上の配列群を抽出し、類似配列をもつクローンを集計したところ、最上位配列は単一配列で、全体の44%以上を占め、類似配列を含めると全体の84%を占めていた。最上位配列を含む配列群にはA又はTのみの出現率が高い部位が3箇所認められた。
＜実施例7：DNAアプタマーの配列決定＞
　人工塩基Dsの位置を正確に同定するため、以下の操作を行い、正確な配列決定を行った。
　実施例6で得られた最上位配列に特異的になるようにデザインした25塩基からなるDNA断片のプローブ配列：5'-CGTTGAGACCTGTTAGGTGCTCTTC-3'（配列番号25）を用いた。このプローブは、5'末端をビオチン化標識したものをThermo Fisher Scientific社から化学合成及び簡易精製済みのものを購入して使用した。プローブを用いたライブラリーからの目的配列の単離操作は実施例2と同様に行った。
　人工塩基Dsを含むDNAのシークエンシング解析は、実施例2と同様の手法で行った。シーケンスパターンを解析した結果、Px鎖側を鋳型としたシーケンス反応サンプルにおいて、人工塩基鋳型では3箇所に人工塩基を示すパターン（ギャップ）が現れたのに対して、天然置換DNAを鋳型としたシーケンス反応サンプルにおいてはAのピークが示されており、このことから3箇所（ランダム領域9番目、21番目、32番目）に人工塩基Dsが存在することが分かった。
＜実施例8：DNAアプタマーのゲルシフトアッセイによる結合活性解析＞
　配列同定した人工塩基Dsを3箇所に含むDNAアプタマーのvWF A1ドメインタンパクに対する結合を調べるために、プライマー領域を切り詰めたDNAアプタマーを作製し、ゲルシフトアッセイによって結合解析を行った。本実施例に使用したDNAアプタマーの配列を表4に、予想される二次構造を図6に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　vWF2-DsDsDs（配列番号13）を元に、中間部のDsをAに置換したvWF2-DsADs（配列番号14）、中間部及び3'末端側のDsをAに置換したvWF2-DsAA（配列番号15）、5'末端側及び中間部のDsをAに置換したvWF2-AADs（配列番号16）、全てのDsをAに置換したvWF2-AAA（配列番号17）、ステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換し、かつ3'末端にミニヘアピンDNAを付加したvWF2-DsDsDs-mhGC（配列番号18）を調製した。また、WF2-DsDsDs-mhGC（配列番号18）を元に、WF2-DsDsDs-mhGCの中間部のループ部分をミニヘアピンDNAのループ部分配列（5′-GAA-3′）に置換したvWF2-DsDsDs-2mhGC（配列番号21）を調製した。また、既存のDNAアプタマーであるARC1172（配列番号10）も調製した。各DNAアプタマーは、化学合成により常法に従って調製した。
　ゲルシフトアッセイは、泳動を4℃/300V、25℃/40W、37℃/40Wの三つの条件で行う以外は、実施例3と同様に行った。
　結果を、図7に示す。ゲルシフトアッセイの結果、vWF2-DsDsDs（m）に対して、vWF2-DsADs（n）では結合の低下が認められず、vWF2-DsAA（o）及びvWF2-AADs（p）で結合の低下が認められたことから、3つの人工塩基Dsのうち5'側と3'側のDsが結合に関与していることが示された。特に、vWF2-DsAA（o）で大きな結合の低下が認められたことから、3'側のDsが結合に大きく関与していることが示された。また陽性対照として用いたARC1172（j）と比較すると、ARC1172は25℃～37℃での電気泳動では結合がほぼ見られなくなっているのに対して、人工塩基Dsを含むvWF2-DsDsDs（m）、vWF2-DsADs（n）、vWF2-DsDsDs-mhGC（r）、及びvWF2-DsDsDs-2mhGC（s）は、25℃～37℃の電気泳動でも結合を維持していた。
＜実施例9：DNAアプタマーのvWFに対する結合のBiacoreによる解析＞
　得られたDNAアプタマーの結合能をGEヘルスケア社のBiacoreT200を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。解析に用いたDNAアプタマーの配列は、上記表4に示し、セレクションで得られた塩基配列等から予測される二次構造を図6に示した。
　これら各DNAアプタマー変異体は、それぞれ図中に示される塩基配列を有する核酸を化学合成によって調製し、その後、変性アクリルアミドゲルにて精製した。それぞれの核酸断片はリン酸緩衝液（pH 7.4）にて混合し、95℃で加熱後25℃まで徐冷することでフォールディング（再構築）させて調製した。SPRによる結合解析は、DNAアプタマーとvWF A1ドメインとの相互作用検出を、0 nM、0.078125 nM、0.15625 nM、0.3125 nM、0.625 nM、1.25 nM、2.5 nM及び5 nMで行った以外は、実施例4と同様に行った。
　結果を図8に示す。本測定の結果、各DNAアプタマーのKD値は、326 pM（ARC1172）、74.9 pM（vWF2-DsDsDs)、61.3 pM（Bio-vWF2-DsDsDs-2mhGC）であった。ミニヘアピンDNAを3'末端に付加し、内部のステムループをミニヘアピンに置換し、かつステム領域のA-T塩基対をG-C塩基対に置換することで結合力が向上した。本実施例で得られた人工塩基Dsを含むDNAアプタマーは、陽性対照として用いた既存のvWF結合性DNAアプタマーARC1172と比較して、より高い結合能を有していた（図8）。
＜実施例10：DNAアプタマーのヒト血清中における安定性解析＞
　各DNAアプタマーのヒト血清中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性を調べた。各DNAアプタマー（vWF2-DsDsDs、vWF2-DsDsDs-mhGC、vWF2-DsDsDs-2mhGC、vWF2-AAA、ARC1172、最終濃度2 μＭ）を、ヒト血清濃度が96％となるように混合し、この溶液を37℃でインキュベートした。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、及び72時間後に混合溶液から10 μLを分取し、110μLの1×TBE、10M Urea溶液と混合して分解反応を止めた。反応後のサンプルを変性15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ゲルをSYBR GOLD（Thermo Fisher Scientific）で染色して1本鎖核酸を検出した。ヒト血清中の核酸分解酵素による分解産物のバンドパターンをバイオイメージャーLAS-4000（富士フィルム）で解析した。
　結果を図9に、0h時間を100%としたときの、未分解のバンドの濃さから推定される各DNAアプタマーの各時間における残存割合（%）を表5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　vWF2-DsDsDs-mhGC及びvWF2-DsDsDs-2mhGCでは、vWF-DsDsDsに比べて残存する完全長DNAアプタマーの量が顕著に多く、これは血清中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性が向上していたことを示唆している。陽性対照として用いたARC1172は37℃、72時間のインキュベートの後、その残存割合が20%であったのに対して、vWF2-DsDsDs-2mhGCでは72時間後でも75%が残存していた。以上より、本発明のDNAアプタマーはARC1172よりも核酸分解酵素に対する安定性が高く、ミニヘアピン配列を付加することにより、さらに血清中の核酸分解酵素に対する安定性を大幅に改善することができることが示された。
＜実施例11：DNAアプタマーの熱安定性解析＞
　各DNAアプタマー（vWF2-DsDsDs、vWF2-DsADs、vWF2-DsAA、vWF2-AADs、vWF2-AAA、vWF2-DsDsDs-mhGC、vWF2-DsDsDs-2mhGC、最終濃度2 μM）の熱安定性（Tm値）を測定した。DNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV-2450（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
　結果を図10に示す。vWF2-DsDsDsはTm = 66.8℃、vWF2-DsADsはTm = 63.5℃、vWF2-DsAAはTm = 62.0℃、vWF2-AADsはTm = 61.5℃、vWF2-AAAはTm = 60.0℃、 vWF2-DsDsDs-mhGCはTm = 75.5℃、vWF2-DsDsDs-2mhGCはTm = 76.5℃であった。以上の通り、ステム配列中のA-T塩基対をG-C塩基対に置換し、3'末端にミニヘアピンDNAを付加することによって、Tm値が約9℃上昇し、さらに内部のステムループ部分をミニヘアピン配列に置き換えることで、Tm値が約10℃上昇した。以上の通り、より高い温度でも安定な構造をとるDNAアプタマーを作製することができた。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (17)

  1. 　以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：　（i）配列番号13～16、19及び20のいずれかに示される塩基配列、又は
    　（ii）（i）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
  2. 　（i）の塩基配列が、配列番号13、14、19又は20に示される配列である、請求項１に記載のDNAアプタマー。
  3. 　1～5個のGC対を塩基配列の末端に含む、請求項１又は２に記載のDNAアプタマー。
  4. 　塩基配列の3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
    　前記ミニヘアピン構造が、
    　5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）～（C）の核酸領域：
    　（A）2～5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
    　（B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
    　（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
    からなり、
    　かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
    　請求項１～３のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
  5. 　以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：　（i）配列番号18若しくは21に示される塩基配列、又は
    　（ii）（i）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の塩基配列からなる、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー。
  7. 　以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：　（I）配列番号1～4、9及び11のいずれかに示される塩基配列、又は
    　（II）（I）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
  8. 　（I）の塩基配列が、配列番号1又は11に示される配列である、請求項７に記載のDNAアプタマー。
  9. 　1～5個のGC対を塩基配列の末端に含む、請求項７又は８に記載のDNAアプタマー。
  10. 　塩基配列の3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
    　前記ミニヘアピン構造が、
    　5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）～（C）の核酸領域：
    　（A）2～5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
    　（B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
    　（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
    からなり、
    　かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
    　請求項７～９のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
  11. 　以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：　（I）配列番号12に示される塩基配列、又は
    　（II）（I）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
  12. 　請求項７～１１のいずれか一項に記載の塩基配列からなる、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー。
  13. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含むvWFタンパク質検出剤。
  14. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含むvWFタンパク質検出用キット。
  15. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
  16. 　血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、頭蓋内塞栓、脳塞栓症、頸動脈狭窄、血栓性微小血管症、及び急性心筋梗塞症からなる群から選択される疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　被験体から得られたサンプルを、請求項１～１２のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、及び
    　前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいてvWFタンパク質を検出する工程、
    を含む、vWFタンパク質を検出する方法。
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