CN108350461B

CN108350461B - 结合vWF的DNA适配体

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Publication number: CN108350461B
Application number: CN201680063729.0A
Authority: CN
Inventors: 平尾一郎; 平尾路子; 松永贤一郎
Original assignee: Tagusicus Biological Co ltd
Current assignee: Tagusicus Biological Co ltd
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2036-10-25
Also published as: KR20230061569A; EP3369820A1; KR102640903B1; WO2017073536A1; US10760083B2; KR20180072722A; EP3369820A4; JPWO2017073536A1; HK1253955A1; CA3003576A1; CN108350461A; AU2016346270A1; US20180305695A1; SG11201803631YA; JP6721189B2; EP3369820B1; ES2903041T3

Abstract

本发明的目的在于提供一种针对vWF的适配体，其与现有核酸适配体相比具有更优异的结合能力、解离速率和/或稳定性。本发明通过结合vWF并含有人工碱基的DNA适配体来解决上述问题。

Description

结合vWF的DNA适配体

技术领域

本发明涉及含有人工碱基且结合vWF的DNA适配体、含有该DNA适配体的药物组合物以及使用该DNA适配体检测vWF的方法等。

背景技术

具有针对靶标分子结合活性的核酸片段称为核酸适配体，其被期待其能作为核酸药物而广泛地应用到医疗中。核酸适配体可以通过从由随机核苷酸序列构成的核酸片段文库中筛选和分离出结合靶标分子的核酸片段的体外筛选(SELEX方法)来制作。

另一方面，人们已经知道vWF是存在于血液中的凝血因子之一，其基因变异与血管性血友病等相关，针对vWF的自身抗体的产生会引发后天性血栓性血小板减少性紫癜等。目前，人们正在开发一些针对vWF的核酸适配体(非专利文献1和非专利文献2)。但是，现有的核酸适配体与由20种氨基酸组成的蛋白质抗体相比，构成的碱基种类只有4种，因此其变化有限，在结合能力、解离速率及稳定性等性能方面无法充分满足需要。因此，如果要将核酸适配体用于以治疗和诊断为代表的医疗领域，关键在于改善这些性能。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Sadler,J.E.,1998,Annu.Rev.Biochem.,67,pp.395-424.

非专利文献2：Gilbert,J.C.et al,2007,Circulation,116,pp.2678-2686.

发明内容

发明所要解决的问题

因此，需要开发一种针对vWF的适配体，其与现有的核酸适配体相比具有更高的结合能力、解离速率和/或稳定性。

解决问题的手段

本发明人以vWF为靶标，通过实施使用本发明人开发的人工碱基对技术的两种SELEX方法(WO2013/073602中记载的预测方法和随机文库方法)而获得紧密结合vWF并含有人工碱基的DNA适配体。此外，对获得的DNA适配体进行了进一步的研究，结果发现，与现有的核酸适配体ARC1172相比，在K_D和/或k_off方面表现出优异的结合能力(例如10倍以上的低K_D和/或k_off)。此外，获得的DNA适配体具有优异的Tm值和/或耐核酸酶的特性。

本发明基于上述见解而完成的，包括以下方案。

(1)一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其含有以下(i)或(ii)的核苷酸序列：

(i)SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一个所示的核苷酸序列；或者

(ii)在(i)所示的核苷酸序列中除7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个(1又は数個)核苷酸而成的核苷酸序列。

(2)根据(1)所述的DNA适配体，其中，(i)的核苷酸序列是SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的序列。

(3)根据(1)或(2)所述的DNA适配体，其在核苷酸序列的末端含有1～5个GC碱基对。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的DNA适配体，

其在核苷酸序列的3’末端还含有小发夹结构，

所述小发夹结构由从5’末端向3’末端依次连接的以下(A)～(C)的核酸区域组成：

(A)由2～5个任意核苷酸组成的第一核酸区域；

(B)由GNA或GNNA的核苷酸序列组成的第二核酸区域，其中，各个N独立地为G、T、A或C中的任一个；以及

(C)由与第一核酸区域互补的核苷酸序列组成的第三核酸区域，

并且，所述小发夹结构由茎部和环部构成，其中，所述茎部是第一核酸区域和第三核酸区域相互碱基配对而成的，所述环部由第二核酸区域组成。

(5)一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其含有以下(i)或(ii)的核苷酸序列：

(i)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；或者

(ii)在(i)所示的核苷酸序列中除7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。

(6)一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其由(1)～(5)中任一项所述的核苷酸序列构成。

(7)一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其含有以下(I)或(II)的核苷酸序列：

(I)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中任一个所示的核苷酸序列；或者

(8)根据(7)所述的DNA适配体，其中，(I)的核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:11所示的序列。

(9)根据(7)或(8)所述的DNA适配体，其在核苷酸序列的末端含有1～5个GC碱基对。

(10)根据(7)～(9)中任一项所述的DNA适配体，

其在核苷酸序列的3’末端还含有小发夹结构，

(A)由2～5个任意核苷酸组成的第一核酸区域；

(11)一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其含有以下(I)或(II)的核苷酸序列：

(I)SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；或者

(12)一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其由(7)～(11)中任一项所述的核苷酸序列构成。

(13)一种vWF蛋白检测试剂，其含有(1)～(12)中任一项所述的DNA适配体。

(14)一种vWF蛋白检测用试剂盒，其含有(1)～(12)中任一项所述的DNA适配体。

(15)一种药物组合物，其含有(1)～(12)中任一项所述的DNA适配体。

(16)根据(15)所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防的疾病选自于由以下疾病组成的组：血栓形成、血栓性血小板减少性紫癜、颅内栓塞、脑栓塞、颈动脉狭窄、血栓性微血管病以及急性心肌梗死。

(17)一种检测vWF蛋白的方法，其包括以下步骤：

使从受试对象获得的样品与(1)～(12)中任一项所述的DNA适配体接触的步骤；以及

基于所述样品与所述DNA适配体的结合来检测vWF蛋白的步骤。

本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2015-214848号的公开内容。

发明效果

根据本发明，能够提供一种针对vWF的DNA适配体，其与现有的核酸适配体相比具有更高的结合能力、解离速率和/或稳定性。此外，根据本发明的DNA适配体，能够提供vWF检测法、辅助诊断是否患有血栓形成等疾病的方法以及用于治疗和/或预防血栓形成等疾病的药物组合物。

附图简述

图1-1表示实施例3制备的各DNA适配体的预测二级结构。以a所示的vWF1-DsDsDs(SEQ ID NO:1)为基础，制备了将3’末端侧的Ds置换为A而成的b所示的vWF1-DsDsA(SEQ IDNO:2)、将中间部分的Ds置换为A而成的c所示的vWF1-DsADs(SEQ ID NO:3)、将5’末端侧的Ds置换为A而成的d所示的vWF1-ADsDs(SEQ ID NO:4)和将中间部分和3’末端侧的Ds置换为A而成的e所示的vWF1-DsAA(SEQ ID NO:5)。人工碱基Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位用箭头表示。图中，粗线表示能够形成沃森-克里克碱基对的碱基，普通线表示碱基是通过磷酸二酯键连接的。粗线和普通线的含义在以下的图1-2、3、6-1和6-2中是相同的。

图1-2表示实施例3制备的各DNA适配体的预测二级结构。以vWF1-DsDsDs(SEQ IDNO:1)为基础，制备了将5’末端侧和3’末端侧的Ds置换为A而成的f所示的vWF1-ADsA(SEQID NO:6)、将5’末端侧和中间部分的Ds置换为A而成的g所示的vWF1-AADs(SEQ ID NO:7)、将全部Ds置换为A而成的h所示的vWF1-AAA(SEQ ID NO:8)、将3’末端侧的Ds置换为A并除去茎部末端的AT碱基对而成的i所示的vWF1-R1Ds(SEQ ID NO:9)。此外，作为阳性对照，也制备了现有的vWF结合性DNA适配体即j所示的ARC1172(SEQ ID NO:10)。人工碱基Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位用箭头表示。

图2表示实施例3制备的各DNA适配体针对vWF A1区域的凝胶迁移实验的结果。图2A表示在进行电泳时利用SYBR GOLD对DNA适配体进行染色的结果。图2B是将ARC1172的凝胶迁移率(泳道整体的条带设为100％时复合物条带的比例)设为1.0，将各寡聚物的迁移率(结合率)设为相对迁移率而制成的图。结合反应在37℃进行，电泳在4℃进行。复合物表示与vWF A1区域结合的DNA适配体，游离表示游离状态的DNA适配体。a～j表示分别使用图1-1和1-2的a～j所示的适配体时的结果。

图3表示在实施例4中用于SPR的结合活性测定的DNA适配体的二级结构。以a所示的vWF1-DsDsDs(SEQ ID NO:1)为基础，制备了将三个Ds置换为A而成的h所示的vWF1-AAA(SEQ ID NO:8)、将茎部区域的一部分AT碱基对置换为GC碱基对而成的k所示的vWF1-DsDsDs-GC(SEQ ID NO:11)、在vWF1-DsDsDs-GC的3’末端添加小发夹而成的l所示的vWF1-DsDsDs-mhGC(SEQ ID NO:12)。Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位和AT碱基对被置换为GC碱基对的部位用箭头表示，添加小发夹的部位用附带箭头的方框表示。

图4表示利用SPR的各种DNA适配体针对vWF A1区域蛋白的结合分析结果。A表示vWF1-DsDsDs的结果，B表示vWF1-DsDsDs-GC的结果，C表示vWF1-DsDsDs-mhGC的结果，D表示vWF1-AAA的结果，E表示ARC1172的结果。

图5表示各种DNA适配体的Tm值的测定结果。A表示各温度的DNA适配体的标准吸光度，B表示各温度的DNA适配体的标准化吸光度的一阶导数。

图6-1表示实施例8制备的DNA适配体的预测二级结构。以m所示的vWF2-DsDsDs(SEQ ID NO:13)为基础，制备了将中间部分的Ds置换为A而成的n所示的vWF2-DsADs(SEQID NO:14)、将中间部分和3’末端侧的Ds置换为A而成的o所示的vWF2-DsAA(SEQ ID NO:15)以及将5’末端侧和中间部分的Ds置换为A而成的p所示的vWF2-AADs(SEQ ID NO:16)。Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位用箭头表示。

图6-2表示实施例8制备的DNA适配体的预测二级结构。以vWF2-DsDsDs(SEQ IDNO:13)为基础，制备了将全部Ds置换为A而成的q所示的vWF2-AAA(SEQ ID NO:17)、将茎部的A-T碱基对置换为G-C碱基对且在3’末端添加小发夹DNA而成的r所示的vWF2-DsDsDs-mhGC(SEQ ID NO:18)、将WF2-DsDsDs-mhGC(SEQ ID NO:18)的中间部分的环部置换为小发夹DNA的环部序列(5′-GAA-3′)而成的s所示的vWF2-DsDsDs-2mhGC(SEQ ID NO:21)。此外，作为阳性对照，也制备了现有的vWF结合性DNA适配体即j所示的ARC1172(SEQ ID NO:10)。Ds用方框表示，Ds被置换为A的部位和AT碱基对被置换为GC碱基对的部位用箭头表示，添加小发夹的部位和置换为小发夹DNA的环部的部位用附带箭头的方框表示。

图7表示各种DNA适配体针对vWF A1区域的凝胶迁移实验的结合分析结果(不同温度的凝胶迁移实验)。A～C分别为在以4℃/300V、25℃/40W和37℃/40W进行电泳时利用SYBRGOLD对DNA适配体进行染色的结果。复合物表示与vWF A1区域结合的DNA适配体，游离表示游离状态的DNA适配体。m～s表示分别使用图6-1和6-2的m～s所示的适配体时的结果。j表示使用ARC1172时的结果。

图8表示利用SPR的各种DNA适配体针对vWF A1区域蛋白的结合分析结果。A表示ARC1172的结果，B表示vWF2-DsDsDs的结果，C表示vWF2-DsDsDs-2mhGC的结果。

图9表示各种DNA适配体对人血清中的核酸酶的稳定性分析结果。泳道左端的c是指对照组，只表示未添加DNA适配体的血清的结果。未分解的条带用箭头表示。A表示vWF2-DsDsDs的结果，B表示vWF2-DsDsDs-mhGC的结果，C表示vWF2-DsDsDs-2mhGC的结果，D表示vWF2-AAA的结果，E表示ARC1172的结果。

图10表示各种DNA适配体的Tm值的测定结果。A表示各温度的DNA适配体的标准吸光度，B表示各温度的DNA适配体的标准化吸光度的一阶导数。

具体实施方式

1.定义

下面针对本说明书中使用的普通术语的定义进行说明。

本说明书中，“核酸”或“核酸分子”是指原则上以核苷酸为组成单位，通过磷酸二酯键将这些核苷酸连接而成的生物高分子。

本说明书中，“天然型核苷酸”是指在自然界中存在的核苷酸，可举出：由具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中任一种天然碱基的脱氧核糖核苷酸构成的DNA，以及由具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中任一种天然碱基的核糖核苷酸构成的RNA，或它们的组合。

本说明书中，“非天然型核苷酸”是指其碱基由人工碱基构成的在自然界中不存在的核苷酸。本发明中构成非天然型核苷酸的磷酸基团和糖，在结构上与天然型核苷酸的磷酸基团和糖相同。

本说明书中，“人工碱基”或“碱基类似物”是指人工构建的化学物质，其具有与构成天然型核苷酸的天然碱基类似的性质，是与天然碱基一样具有能够形成人工碱基对的对象的碱基类似物(本说明书中，以下称为“互补人工碱基”)。本说明书中，“人工碱基配对”是指像天然碱基的腺嘌呤与胸腺嘧啶、腺嘌呤与尿嘧啶或者鸟嘌呤与胞嘧啶那样，一对互补人工碱基彼此形成的碱基配对。人工碱基配对包括通过在天然碱基间的碱基配对中可见的氢键的化学结合，通过基于人工碱基间的分子结构的嵌合的物理结合，以及通过疏水相互作用的堆积效果。

人工碱基所具有的“与天然碱基类似的性质”中，包括可通过人工碱基配对的互补性进行核酸的复制或转录(包括反转录)的性质。人工碱基与天然碱基相同，在人工碱基配对中具有排他选择性。因此，在底物核苷酸中如果存在具有一对互补的人工碱基的非天然型核苷酸，则即使是包含非天然型核苷酸的核酸分子，也可以通过人工碱基间的互补性与天然型核苷酸同样地进行准确的复制和转录。所以，虽然包含非天然型核苷酸，但可以通过PCR等核酸扩增法进行DNA分子的扩增等。

作为上述人工碱基的具体示例，可举出：Ds(7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基，本说明书中称为“Ds”)、Pn(2-硝基吡咯-1-基；本说明书中称为“Pn”)、Pa(2-甲酰基-1H-吡咯-1-基；本说明书中称为“Pa”)、P(2-氨基-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8H)-酮；本说明书中称为“P”)、Z(6-氨基-5-硝基-2(1H)-吡啶酮，本说明书中称为“Z”)、5SICS(6-甲基异喹啉-1(2H)-硫酮，本说明书中称为“5SICS”)、NaM(3-甲氧基萘-2-基，本说明书中称为“NaM”)，以及MMO2(2-甲氧基-4-甲苯基，本说明书中称为“MMO2”)。在这些人工碱基中，Ds的互补人工碱基可举出Pn和Pa。P的互补人工碱基可举出Z。5SICS的互补人工碱基可举出NaM和MMO2。

需要说明的是，人工碱基在复制和转录时，当底物中未包含具有互补人工碱基的非天然型核苷酸时，互补人工碱基与在结构和/或性质上相近的天然碱基能够替代地进行碱基配对。这种情况下，作为模板的核酸分子中的非天然型核苷酸在复制或转录后会被置换为天然型核苷酸。例如，已知在Ds的情况下，会被置换为A或T。

本说明书中，“修饰碱基”是指经过人工化学修饰的碱基。作为修饰碱基，例如可举出：修饰化嘧啶(例如5-羟基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-(3-吲哚-2-乙基)尿嘧啶、5-(4-羟基苯基-2-乙基)尿嘧啶)、修饰化嘌呤(例如，6-甲基腺呤、6-硫鸟苷)及其他杂环碱基等。

本说明书中，“DNA适配体”是指由DNA构成的适配体，是利用基于通过氢键等形成的单链核酸分子的二级结构以及三级结构而形成的三维结构与靶标分子牢固且特异性地结合的配体分子。当DNA适配体具有特异性地阻碍或抑制靶标分子的生理活性等功能的能力时，DNA适配体能够作为靶标分子的功能抑制剂。本说明书中，“靶标分子的功能抑制”是指阻碍或抑制靶标分子所具有的如催化剂功能或基因表达控制功能(包括转录、翻译、运输等的控制)、凋亡控制功能这样的生物学功能。本说明书中，“靶标分子”是指能够成为DNA适配体的结合对象的物质，本发明中作为靶标分子可举出vWF。

本说明书中，“vWF”是指von Willebrand factor(血管性血友病因子)蛋白(本说明书中也称为“vWF蛋白”)。人们已经知道vWF是存在于血液中的凝血因子之一，其基因变异与血管性血友病等各种疾病相关，针对vWF的自身抗体的产生会引发后天性血栓性血小板减少性紫癜等。本发明中，作为vWF来源的生物物种没有限制，例如可举出哺乳动物，如人和黑猩猩等灵长类，大鼠和小鼠等实验动物，猪、牛、马、绵羊和山羊等家畜动物，以及狗和猫等宠物，优选为人的vWF。

vWF例如相对于(a)SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列、(b)在SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列中添加、缺失和/或置换一个或数个氨基酸而成的氨基酸序列或(c)与SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列例如具有70％以上、80％以上、优选90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的同一性的氨基酸序列。vWF也可以由这些氨基酸序列中的任意氨基酸序列构成。本说明书中，同一性的值表示用计算多个序列间的同一性的软件(例如FASTA、DANASYS和BLAST)按照默认设置计算出的值。

本说明书中，vWF的A1区域是指具有针对血小板上的GPIb受体的结合能力的vWF中的区域。vWF的A1区域含有例如(a)SEQ ID NO:28的第1238位～第1481位的氨基酸序列、(b)在SEQ ID NO:28的第1238位～第1481位的氨基酸序列中添加、缺失和/或置换一个或数个氨基酸而成的氨基酸序列或(c)与SEQ ID NO:28的第1238位～第1481位的氨基酸序列例如具有70％以上、80％以上、优选90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的同一性的氨基酸序列。vWF的A1区域也可以由这些氨基酸序列中的任意氨基酸序列构成。

本说明书中，“数个(数個)”是指例如1～6个、1～5个、1～4个、1～3个或1～2个。

本说明书中，“小发夹结构”具有以下第一核酸区域、第二核酸区域以及第三核酸区域这三个DNA核酸区域分别从5’末端侧向3’末端侧依次连接而成的结构。小发夹型DNA通过提高对核酸酶的耐分解性和/或提升DNA适配体的Tm值来提高DNA适配体的热稳定性。

“第一核酸区域”是由2～5个任意核苷酸组成的核酸区域。所述核苷酸是指具有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)碱基的脱氧核苷酸。此核酸区域的碱基优选为鸟嘌呤或胞嘧啶。这是因为在与后述的第三核酸区域之间形成茎部结构时，GC含量越高，Tm值也越增高，能够稳定保持所述茎部结构。因此，第一核酸区域的整个核苷酸序列更优选由G和/或C构成。

“第二核酸区域”是由5’-GNA-3’或5’-GNNA-3’的核苷酸序列组成的核酸区域。序列中的各个N独立地由天然碱基(G、A、T或C)中任一种组成，例如由T组成。

“第三核酸区域”是具有与第一核酸区域互补的核苷酸序列的核酸区域。因此，第三核酸区域的核苷酸序列由第一核酸区域的核苷酸序列决定，并且第一核酸区域和第三核酸区域在分子内形成碱基对。其结果，第一核酸区域和第三核酸区域构成相互完全配对的茎部，此外存在于第一核酸区域与第三核酸区域之间的第二核酸区域构成环部，作为整体，形成有由7～14个核苷酸组成的小发夹型DNA。作为小发夹型DNA的示例，可举出由CGCGTAGCG(即SEQ ID NO:26)所示的核苷酸序列组成的DNA。

2.结合vWF的DNA适配体

在一个方案中，本发明涉及一种结合vWF的DNA适配体，其含有以下(i)或(ii)的核苷酸序列：

(i)SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一个所示的核苷酸序列，优选SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一所示的核苷酸序列；或者

(ii)在(i)所示的核苷酸序列中除Ds以外的位置添加、缺失和/或置换一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。

在一个实施方式中，(i)的核苷酸序列在其末端含有碱基对，例如含有1～5个，如1～4个、1～3个、1～2个或1个GC碱基对。末端的碱基对可以使DNA适配体的Tm值上升，提高热稳定性。(i)的核苷酸序列例如还可以在3’末端侧除这些碱基对以外或者替代这些碱基对，含有形成小发夹结构的序列(以下在本说明书中也称为“小发夹序列”)。

作为在(i)的序列中添加小发夹序列而成的序列的示例，可举出在SEQ ID NO:19所示的序列中添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:18所示的序列和在SEQ ID NO:20所示的序列中添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:21所示的序列。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种结合vWF的DNA适配体，其含有SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，或者在SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列中除Ds以外的位置添加、缺失、置换和/或插入一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。

在一个实施方式中，本发明的DNA适配体由上述(i)或(ii)的核苷酸序列，或者在该核苷酸序列的末端添加碱基对和/或小发夹序列而成的核苷酸序列构成。

含有(i)或(ii)的核苷酸序列的本发明的DNA适配体与vWF，如vWF的A1区域结合。

含有(i)或(ii)的核苷酸序列的本发明的DNA适配体在解离常数K_D和/或解离速率k_off方面，可以具有优异的结合vWF的能力。本说明书中，K_D是指由k_off(解离速率)/k_on(结合速率)表示的解离常数。K_D值越小，与靶标的亲和性越强，此外k_off值越小，与靶标结合后越难解离。

利用Biacore分析与vWF的结合，含有(i)或(ii)的核苷酸序列的本发明的DNA适配体可以具有1.0×10^-7、1.0×10^-8、1.0×10^-9，优选5.0×10^-10、3.0×10^-10、1.0×10^-10或8.0×10^-11M以下的K_D。

利用Biacore分析与vWF的结合，含有(i)或(ii)的核苷酸序列的本发明的DNA适配体可以具有1.0×10^-1，优选9.0×10^-2、8.0×10^-2、7.0×10^-2、6.0×10^-2或5.0×10^-2(1/Ms)以下的k_off。

在一个实施方式中，本发明涉及一种结合vWF的DNA适配体，其含有以下(I)或(II)的核苷酸序列：

(I)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中任一个所示的核苷酸序列，优选SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；或者

在一个实施方式中，(I)的核苷酸序列在其末端含有碱基对，例如含有1～5个，如1～4个、1～3个、1～2个或1个GC碱基对。末端的碱基对可以使DNA适配体的Tm值上升，提高热稳定性。(I)的核苷酸序列例如还可以在3’末端侧除这些碱基对以外或者替代这些碱基对，含有小发夹结序列。

作为在(I)的序列中添加小发夹序列而成的序列的示例，可举出在SEQ ID NO:11所示的序列中添加小发夹序列而成的SEQ ID NO:12所示的序列。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种结合vWF的DNA适配体，其含有SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列，或者在SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列中除Ds以外的位置添加、缺失、置换和/或插入一个或数个核苷酸而成的核苷酸序列。

含有(I)或(II)的核苷酸序列的本发明的DNA适配体尤其在解离速率k_off方面，可以具有优异的结合vWF的能力。例如，利用Biacore分析与vWF的结合，含有(I)或(II)的核苷酸序列的本发明的DNA适配体可以具有1.0×10^-1、1.0×10^-2，优选5.0×10^-3、4.0×10^-3、3.0×10^-3或2.0×10^-3(1/Ms)以下的k_off。

另外，利用Biacore分析与vWF的结合，含有(I)或(II)的核苷酸序列的本发明的DNA适配体可以具有1.0×10^-6、1.0×10^-7、1.0×10^-8，优选5.0×10^-9、4.0×10^-9、3.0×10^-9或2.0×10^-9M以下的K_D。

含有(i)或(ii)，或者(I)或(II)的序列的本发明的DNA适配体(以下也简称为“本发明的DNA适配体”)的长度例如为150mer以下、140mer以下、130mer以下、120mer以下、110mer以下，优选为100mer以下、90mer以下、80mer以下、70mer以下、60mer以下或50mer以下。

本发明的DNA适配体除Ds以外，还可以含有任意碱基类似物、其他的人工碱基或其他的修饰碱基等。

本发明的DNA适配体也可以通过添加其他物质进行修饰，例如聚乙二醇(PEG)(例如约20kDa～约60kDa的PEG聚合物)、氨基酸、肽、反向dT(inverted dT)、脂质、色素、荧光物质、酶、放射性物质、生物素等。这些物质也可以根据需要通过公知的接头连接。作为本说明书中的接头的示例，可举出：核苷酸接头、肽接头和含有二硫键的接头等。已知通过连接PEG，一般可以延长DNA适配体的半衰期。

本发明的DNA适配体的制造方法没有特别限定。使用本领域公知的方法即可。例如，本发明的DNA适配体可以根据上述序列，按照公知的固相合成法进行化学合成。关于核酸的化学合成法，例如建议参考《核酸化学实验室指南》(Current Protocols in NucleicAcid Chemistry)，第1卷，第3节。此外，关于这样的化学合成，很多生命科学类厂商(例如宝生物株式会社、西格玛奥德里奇公司等)正在开展委托制造服务，可以利用这些服务。根据DNA适配体的序列合成一些片段后，也可以通过分子内退火和连接酶进行的连接等将片段连接来制备DNA适配体。

化学合成后的本发明的DNA适配体在使用前，优选利用该领域公知的方法进行纯化。作为纯化方法，例如可举出：凝胶纯化法、亲和柱纯化法、HPLC法等。

3.含有DNA适配体的药物组合物

在一个方案中，本发明涉及一种含有本发明的DNA适配体的药物组合物。本发明的药物组合物在不丧失本发明的DNA适配体所具有的与vWF的结合能力的范围内，还可以含有一种以上的其他药物。

在一个实施方式中，本发明涉及一种用于将药物递送至病变部位的药物组合物，其含有DNA适配体和其他药物。其他药物也可以与DNA适配体结合，由此利用DNA适配体与vWF的结合能力，能够将药物有效地递送至病变部位。DNA适配体与药物的结合方法没有限制。

作为本发明的药物组合物的预防和/或治疗对象的疾病为vWF的基因变异或过量表达等以及针对vWF的自身抗体的产生等能够导致该疾病的疾病(本说明书在以下也称为“vWF相关疾病”)。

作为vWF相关疾病，例如可举出：血栓形成、血栓性血小板减少性紫癜、颅内栓塞、脑栓塞、颈动脉狭窄、血栓性微血管病以及急性心肌梗死等。

向患有这些疾病的受试对象给予药物组合物的治疗效果和向有患有这些疾病风险的受试对象给予药物组合物的预防效果受到期待。

本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指在制剂技术领域中使通常使用的药物组合物容易地进行制剂化和应用于生物体，在不阻碍或抑制其作用的范围内添加的物质。作为载体，例如可举出：赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂(流動添加調節剤)、润滑剂或稳定剂。

作为“赋形剂”，例如可举出：单糖、二糖类、环糊精和多糖类这样的糖(具体没有限制，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉和纤维素)、金属盐(例如磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁)、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低/中/高分子量的聚乙二醇(PEG)、普兰尼克(Pluronic)或它们的组合。

作为“粘合剂”，例如可举出：使用玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉的淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮等。

作为“崩解剂”，例如可举出：上述淀粉、羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠或它们的盐。

作为“填充剂”，例如可举出：上述糖和/或磷酸钙(例如磷酸三钙或磷酸氢钙)。

作为“乳化剂”，例如可举出：山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯等。

作为“流动添加调节剂”和“润滑剂”，例如可举出：硅酸盐、滑石、硬脂酸盐或聚乙二醇。

作为“稳定剂”，例如可举出：抗坏血酸和亚硫酸盐等抗氧化剂、海藻糖和葡萄糖等糖类。

这样的载体根据需要适当使用即可。本发明的药物组合物除上述添加剂以外，还可以根据需要含有：矫味矫臭剂、助溶剂(增溶剂)、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、吸收促进剂(例如季铵盐类、月桂醇硫酸钠等)、增稠剂、湿润剂、保湿剂(例如甘油、淀粉等)、吸附剂(例如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶体状硅酸等)、崩解抑制剂(例如白糖、硬脂精、可可脂、氢化油等)、包衣剂、着色剂、防腐剂、香料、风味剂、甜味剂、缓冲剂、等渗剂、舒缓剂、助溶剂等。

作为“表面活性剂”，例如可举出：木质素磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸的碱金属盐、碱土金属盐和铵盐、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸酯、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸和硫酸化醇乙二醇醚，还有磺化萘与萘衍生物和甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯基醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯基聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、乙醇和脂肪醇/环氧乙烷的缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧化乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木质素亚硫酸废液和甲基纤维素。

本实施方式的药物组合物可以在一种药物组合物中含有一种以上的上述载体。

本发明的药物组合物的剂型为不会使有效成分失活的形式，只要是在给药后能够在生物体内发挥其药理作用的形式，就没有特别限定。一般是因给药方法和/或处方条件而异。

例如，作为适合于经口给药的剂型，可举出：固体制剂(包括片剂、丸剂、舌下片剂、胶囊剂、滴剂、锭剂)、颗粒剂、粉剂、散剂、液剂等。此外，固体制剂可以根据需要采用实施该领域中公知的包衣的剂型，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶片、薄膜包衣片、双层片、多层片。

非经口给药可以细分为全身给药和局部给药，局部给药可以进一步细分为组织内给药、经皮给药、经粘膜给药和经直肠给药，药物组合物也可以制成适合于各给药方法的剂型。作为适合于全身或组织内给药的剂型，例如可举出作为液剂的注射剂。作为适合于经皮给药或经粘膜给药的剂型，例如可举出：液剂(包括涂布剂、滴眼剂、滴鼻剂、吸入剂)、悬浮剂(包括乳剂、霜剂)、粉剂(包括滴鼻剂、吸入剂)、糊剂、凝胶剂、软膏剂、硬膏剂等。作为适合于经直肠给药的剂型，例如可举出栓剂等。

需要说明的是，上述各剂型的具体形状、大小只要在各剂型中均处于该领域公知的剂型范围内即可，没有特别限定。

制造本发明的药物组合物，原则上应用该领域公知的制剂化方法即可。例如，可参考《雷明顿氏制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(马克出版公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚州)中记载的方法。

例如，在注射剂的情况下，可以将本发明的DNA适配体溶解在药学上可接受的溶剂中，根据需要添加药学上可接受的载体，通过该领域惯用的方法来制造。

作为“药学上可接受的溶剂”，例如可举出：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚环氧乙烷山梨糖醇酐脂肪酸酯类等。这些优选根据需要调节为与血液等渗。

本发明的药物组合物可以按照制药上的有效量向生物体给药，以治疗或预防目标癌症等疾病。作为给药对象的生物体为脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。

本发明的药物组合物也可以采用全身给药或局部给药中的任一种进行给药。可以根据疾病的种类、发病部位或发展程度等适当选择。如果是发病部位为局部的疾病，则优选为通过注射等向发病部位及其周围直接给药的局部给药。可以向待治疗的部位(组织或器官)给予足够量的本发明的DNA适配体，此外这也是因为其对其他组织不易产生影响。另一方面，在无法确定治疗部位的情况和全身性发病的疾病的情况下，则没有限制，但优选采用通过静脉注射等的全身给药。这是因为，通过血流使本发明的DNA适配体遍布全身，由此也可以向在诊断中未发现的病变部给药。

本发明的药物组合物可以通过使有效成分不失活的所有适当方法给药。例如，可以采用非经口(例如注射、气雾、涂布、滴眼、滴鼻)或经口中的任一种。优选为注射。

在通过注射给药时，注入部位没有特别限定。只要作为有效成分的DNA适配体能与靶物质结合，则任何部位都可以。例如可举出：静脉内、动脉内、肝脏内、肌肉内、关节内、骨髓内、髓腔内、心室内、经肺、经皮、皮下、皮内和腹腔内等。

4.使用DNA适配体的治疗和/或预防方法

在一个方案中，本发明涉及一种疾病的治疗和/或预防方法，其包括：将本发明的DNA适配体或上述药物组合物向受试对象给药。

作为本发明的药物组合物的预防和/或治疗对象的疾病为vWF相关疾病。例如可举出：血栓形成、血栓性血小板减少性紫癜、颅内栓塞、脑栓塞、颈动脉狭窄、血栓性微血管病以及急性心肌梗死等。

本说明书中，能够作为“受试对象”的动物物种例如为哺乳动物，如人和黑猩猩等灵长类，大鼠和小鼠等实验动物，猪、牛、马、绵羊和山羊等家畜动物，以及狗和猫等宠物，优选为人。

5.含有DNA适配体的检测试剂

在一个方案中，本发明涉及一种含有本发明的DNA适配体的vWF检测试剂。本发明的vWF检测试剂是用于利用本发明的DNA适配体与vWF的结合能力，在体内或体外检测vWF的药物。例如，可以预先用荧光试剂等对DNA适配体进行标记并将该DNA适配体进行给药，由此确定生物体内vWF的表达强度，此外检查其定位。由此，可以辅助诊断上述vWF相关疾病。本发明的DNA适配体在成像和组织染色中有用。

在一个实施方式中，本发明涉及一种含有本发明的DNA适配体的vWF检测用组合物。该组合物的构成与上述药物组合物相同，因此在此处省略该记载。

在一个实施方式中，本发明涉及一种含有本发明的DNA适配体的vWF检测用试剂盒。本发明的试剂盒除本发明的DNA适配体以外，还可以包括缓冲液、标记试剂和/或说明书等。

6.vWF的检测方法

在一个方案中，本发明涉及一种检测vWF的方法。本方法包括：使从受试对象获得的样品与本发明的DNA适配体接触的步骤；以及根据样品与DNA适配体的结合检测vWF的步骤。通过本方法，可以辅助诊断上述vWF相关疾病。

作为本方法中使用的样品，可举出组织和生物样品。作为组织的示例，可举出病变部位，例如大脑、心脏、肝脏、胰腺、肺、骨髓、淋巴结和脾脏等，例如可以使用这些组织的活检样品。作为生物样品的示例，例如可举出：血液、血浆、淋巴液、组织液、尿液和细胞，例如外周血细胞、毛母细胞、口腔细胞、鼻腔细胞、肠道细胞、阴道细胞、粘膜细胞和痰(可以包括肺泡细胞或气管细胞等)，优选血液或血浆。

本发明的检测方法的检测步骤只要是利用样品与DNA适配体的结合，就没有特别限定，使用公知的方法即可。例如，可以使用SPR法、比浊法、比色法或荧光法。

SPR(表面等离子体共振)是指当向金属薄膜照射激光时，反射光强度会在特定的入射角度(共振角)明显衰减的现象。SPR法就是利用该现象的测定方法，可以高灵敏度地测定作为传感器部的金属薄膜表面上的吸附物。本发明中，例如，预先将本发明的DNA适配体固定在金属薄膜表面上，使样品在该金属薄膜表面上通过，对该核酸分子与靶物质的结合所产生的样品通过前后的金属表面上的吸附物之差进行检测，由此可以检测样品中的靶物质。SPR法也可以使用置换法、间接竞争法等已知的任一种方法。

比浊法是向溶液照射光，使用比色计等对因溶液中漂浮的物质而散射的散射光的衰减或透过该溶液的透射光进行光学测量，由此测定溶液中的物质量的方法。本发明中，通过测量在样品中添加本发明的DNA适配体前后的吸光度，可以定量检测样品中的靶物质。

另外，也可以通过联合使用针对靶物质的抗体来检测靶物质。例如，也可以使用应用ELISA法的夹心法的方法。该方法中，首先将本发明的DNA适配体固定在固相载体上，然后添加样品，使存在于样品中的靶物质与上述DNA适配体结合。接着，在将样品洗脱后，加入抗靶物质抗体，使其与靶物质结合。洗涤后，使用进行了适当标记的二抗检测抗靶物质抗体，由此可以检测样品中的靶物质。作为固相载体，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖、纤维素、琼脂糖凝胶、玻璃、金属、陶瓷或磁性体等材料形成的珠、微板、试管、棒或试验片等形状的不溶性载体。

在一个实施方式中，本发明涉及一种辅助诊断受试对象是否患有vWF相关疾病的方法。本方法包括：向受试对象给予本发明的DNA适配体或本发明的vWF检测用组合物的步骤；以及检测DNA适配体的步骤。例如，当在生物体内的特定部位检测到高浓度的DNA适配体时，可以判断该部位产生了疾病。检测步骤使用公知方法即可，例如可以使用上述荧光法。

实施例

<实施例1：使用Ds预测DNA文库筛选结合vWF的DNA适配体>

按照WO2013/073602中记载的预测方法，进行含有人工碱基Ds的DNA文库的制备。在预测方法中使用的文库是设计成在随机核苷酸序列中的特定的固定位置上含有人工碱基Ds的文库。简而言之，将DNA片段(分子种类总数为300pmol，约2×10¹⁴个分子)用作第1轮的文库，混合靶蛋白vWF A1区域(U-Protein公司，V003)后，使用磁珠筛选和分离与靶蛋白结合的DNA，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将DNA-vWF A1区域复合物切割下，由此在筛选和分离后进行PCR扩增，进行共计8轮的筛选操作。各筛选的条件示于表1。在8轮的筛选结束后，进行序列分析，获得含有人工碱基Ds的DNA适配体的序列。

[表1]

表1：筛选条件

方法a：复合物生物素化法

方法b：凝胶迁移分离法

8轮后获得的DNA文库的序列分析结果，得到420526个序列作为分析对象的总序列。根据WO2013/073602中记载的分析方法，从100个克隆以上的序列组中，选取出推测有人工碱基残留的序列，共计选取406086个序列。将该序列数合计，发现排在最前面的序列为单一序列，占整体的80％以上，包括类似序列在内的话则占整体的90％。

<实施例2：确定DNA适配体的序列>

为了准确地鉴定人工碱基Ds的位置，进行以下操作，确定正确的序列。

使用由设计成在实施例1获得的排在最前面的序列中特异性的25个碱基组成的DNA片段的探针序列：5’-ACTCCCTCGGTTGTTGGCGAAAGTTG-3’(SEQ ID NO:22)。该探针为将5’末端进行生物素标记而成的探针，使用从赛默飞世尔科技公司购买的化学合成和简单纯化后的探针。将对在8轮后获得的DNA片段用dDsTP和Diol1-dPxTP进行PCR扩增而制备的单链DNA文库用溶液稀释成100nM/1×结合溶液(20mM Tris-HCl、0.5M NaCl、10mM MgCl₂、pH7.6)，将20μl该溶液和生物素化探针(5μM、1μl)混合。之后，进行退火操作(以90℃ 3分钟、以0.1℃/秒逐渐冷却，55℃15分钟)，与替换为1×结合溶液的链霉亲和素磁珠(5μL)混合，在55℃孵育5分钟，由此将生物素化探针和与探针互补地杂交的DNA片段固定在磁珠上。使用磁力架除去溶液，除去未与探针杂交的剩余的DNA片段后，用150μL的1×结合溶液(55℃)洗涤5次磁珠。之后，向洗涤后的磁珠添加20μL灭菌水，在75℃加热5分钟后立即回收溶液，由此回收与探针杂交的DNA片段。

含有人工碱基Ds的DNA的测序分析是在普通的染料终止剂的序列反应中，当添加ddPa’TP或dPa’TP作为与人工碱基Ds互补的底物，或者添加ddDsTP或dDsTP作为与人工碱基Ds的互补碱基Px互补的底物时，序列模式会不同，因此可以研讨用于序列模板的DNA片段中有无人工碱基Ds和正确的位置。因此，将使用探针回收的DNA片段用作模板，通过以下两种方法((i)和(ii))进行DNA测序。

(i)使用10μl回收的DNA溶液，在dDsTP、Diol1-dPxTP存在下用AccuPrime Pfx DNA聚合酶进行15次循环的PCR扩增后，将通过凝胶纯化而回收的片段溶解在20μl的水中，将其溶液作为模板，在0.05mM ddPa’TP存在下、0.05mM dPa’TP存在下，或者在0.05mM ddDsTP存在下、0.05mM dDsTP存在下进行序列反应(该方法中，如果回收的DNA保持有人工碱基Ds，则Ds也会保持在PCR中)。

(ii)使用10μl回收的DNA溶液，在0.05mM dPa’TP存在下用AccuPrime Pfx DNA聚合酶进行15次循环的PCR扩增后，将通过凝胶纯化而回收的片段溶解在20μl的水中，将其溶液作为模板，在0.05mM ddPa’TP存在下、0.05mM dPa’TP存在下，或者在0.05mM ddDsTP存在下、0.05mM dDsTP存在下进行序列反应(该方法中，如果回收的DNA保持有人工碱基Ds，则Ds的位置在PCR后会被A或T置换)。

具体而言，DNA测序反应是以总量20μL，使用市售的BigDye Terminator v1.1循环测序试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行。序列引物中使用5’-ACGACCGTTCTCTAATTTTGACGTT-3’(SEQ ID NO:23)和5’-ACCAAATTATTGCGATACAGACCCT-3’(SEQ ID NO:24)，将PCR扩增和纯化的双链DNA片段(0.15pmol左右)、ddPa’TP或dPa’TP，或者ddDsTP或dDsTP(500pmol)添加到反应液中，进行25次循环的PCR(96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃ 4分钟)。通过脱盐柱处理除去未反应的染料终止剂，并将剩余溶液减压干燥。向残留物中添加4μl用蓝色葡聚糖稀释的甲酰胺溶液，并利用ABI377DNA测序仪对其中一部分进行分析。序列的峰型使用Applied Biosystems PRISM测序分析软件v3.2进行分析。

分析序列模式后，结果发现在以Px链侧为模板的序列反应样品中，人工碱基模板上出现了3处表示人工碱基的模式(间隔)，而在以天然置换DNA为模板的序列反应样品中则显示出A峰，由此可知，除标签序列所示的2处Ds的位置(随机区域第6个和第15个)以外，在第19个上也存在人工碱基Ds。

<实施例3：DNA适配体利用凝胶迁移实验的结合活性分析>

为了研讨含有3处经过序列鉴定的人工碱基Ds的DNA适配体针对vWF A1区域蛋白的结合，制备从中切割引物区域的40-mer和38-mer的DNA适配体。制备的各DNA适配体的名称和序列示于表2，根据在筛选中获得的核苷酸序列等而预测的二级结构示于图1。

[表2]

表2：使用的各种DNA适配体的序列

以vWF1-DsDsDs(SEQ ID NO:1)为基础，制备了将3’末端侧的Ds置换为A而成的vWF1-DsDsA(SEQ ID NO:2)、将中间部分的Ds置换为A而成的vWF1-DsADs(SEQ ID NO:3)、将5’末端侧的Ds置换为A而成的vWF1-ADsDs(SEQ ID NO:4)、将中间部分和3’末端侧的Ds置换为A而成的vWF1-DsAA(SEQ ID NO:5)、将5’末端侧和3’末端侧的Ds置换为A而成的vWF1-ADsA(SEQ ID NO:6)、将5’末端侧和中间部分的Ds置换为A而成的vWF1-AADs(SEQ ID NO:7)、将全部Ds置换为A而成的vWF1-AAA(SEQ ID NO:8)、将3’末端侧的Ds置换为A并除去茎部末端的AT碱基对而成的vWF1-R1Ds(SEQ ID NO:9)。此外，作为阳性对照，也制备了现有的vWF结合性DNA适配体ARC1172(SEQ ID NO:10)，用于分析。各DNA适配体通过化学合成并按照常规方法制备。

合成的DNA适配体的结合能力分析通过凝胶迁移实验进行。具体而言，在20μL的反应液(1×PBS，0.005％Nonidet P-40)中悬浮各DNA适配体(100nM)和vWF A1区域(100nM，U-Protein公司，V003)，在37℃孵育30分钟。之后，添加含有溴苯酚蓝的25％甘油，使甘油的终浓度变为5％，在4℃进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将与vWF A1区域结合的各DNA适配体和游离状态的各DNA适配体分离。然后，使用通过1×TBE溶液稀释到1/20000的SYBRGold(赛默飞世尔科技公司)对DNA适配体进行染色，利用生物图像分析仪LAS-4000(富士胶片)进行检测。凝胶迁移率作为根据条带推定的复合物的量除以游离和复合物的量得出的数值的百分率计算。

结果示于图2。凝胶迁移实验的结果，在Ds被置换为A而成的任何DNA适配体(vWF1-DsDsA(b)、vWF1-DsADs(c)和vWF1-ADsDs(d))中都确认到结合下降，因此表明3个人工碱基Ds都与结合有关。在vWF1-ADsDs(d)中结合下降较小，因此表明尤其5’侧和中间部分的Ds与结合密切相关。此外，vWF1-DsDsDs(a)表现出比作为阳性对照的现有vWF结合性DNA适配体ARC1172(j)更强的结合力。

<实施例4：DNA适配体针对vWF的结合的Biacore分析>

通过使用GE HEALTHCARE公司的BiacoreT200的表面等离子体共振(SPR)测定获得的DNA适配体的结合能力。用于分析的各种DNA适配体的序列示于上述表2，预测的二级结构示于图3。以vWF1-DsDsDs(SEQ ID NO:1)为基础，制备了将三个Ds置换为A而成的vWF1-AAA(SEQ ID NO:8)、将茎部区域的一部分AT碱基对置换为GC碱基对而成的vWF1-DsDsDs-GC(SEQ ID NO:11)、在vWF1-DsDsDs-GC的3’末端添加小发夹而成的vWF1-DsDsDs-mhGC(SEQID NO:12)。此外，作为阳性对照，使用ARC1172(SEQ ID NO:10)。

这些各DNA适配体分别通过将具有图中所示的核苷酸序列的核酸作为生物素标记的核酸进行化学合成而制备，通过变性丙烯酰胺凝胶纯化。各核酸片段在磷酸缓冲液(pH值7.4)中混合,在95℃加热后逐渐冷却到25℃,从而进行折叠(重构)制备。然后，使用包被有链霉亲和素的SA芯片(GE HEALTHCARE公司)作为SPR的传感芯片，将DNA适配体不可逆地固定在芯片上后，分析其与vWF A1区域的结合。需要说明的是，SPR的测定条件为电泳缓冲液(含有155mM NaCl的磷酸缓冲液、0.05％Nonidet P-40)、在设置温度37℃进行。各DNA适配体固定在传感芯片是将用PBS溶液稀释至25nM的DNA溶液进行折叠处理(95℃、3分钟加热变性后逐渐冷却到25℃)后，添加Nonidet P-40使终浓度变成0.05％。将该DNA溶液以5μL/min的流速注入40μL(相当于8分钟)，由此固定在SA芯片上。此外，固定后，以20μL/min的流速，注入50mM NaOH溶液(5μL，5次)，由此洗涤非特异性地吸附在SA芯片上的DNA适配体。固定的DNA适配体与vWF A1区域的相互作用的检测通过将0nM、0.3125nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM、10nM和20nM的vWF A1区域溶液(用电泳缓冲液稀释)以Kinetic Injection模式注入来监测。测定条件为流速100μL/min，蛋白注入时间为150秒。芯片的再生(结合蛋白的解离和DNA的再折叠)是在注入50mM NaOH的溶液5μL(相当于15秒)后，通过用电泳缓冲液洗脱10分钟来进行。关于各DNA适配体的传感图，为了减去对传感芯片的增量效果和非特异性吸附所导致的响应值，将未固定DNA的孔作为参照孔，从各DNA适配体的传感图中减去其响应值。

结果示于图4。本测定的结果是，各DNA适配体的K_D值为1.03nM(vWF1-DsDsDs)、1.08nM(vWF1-DsDsDs-GC)、0.78nM(vWF1-DsDsDs-GCmh)，因此表明通过将小发夹DNA添加到3’末端会提高结合力。添加了小发夹DNA的DNA适配体(vWF1-DsDsDs-GCmh)的K_D值与现有类型的ARC1172的K_D值程度相同，但k_off值明显低于现有的核酸适配体(ARC1172：k_off＝0.162(1/s)、vWF1-DsDsDs-GCmh：k_off＝0.00159(1/s))。

<实施例5：DNA适配体的Tm值分析>

测定各种DNA适配体(vWF1-DsDsDs、vWF1-DsDsDs-GC、vWF1-DsDsDs-GCmh、vWF1-AAA终浓度：2μM)的热稳定性(Tm值)。DNA适配体的吸光度变化通过紫外可见分光光度计UV-2450(岛津)测定，根据其一阶求导计算解链温度Tm值。结果示于图5。vWF1-DsDsDs为Tm＝65.7℃、vWF1-DsDsDs-GC为Tm＝73.0℃、vWF1-DsDsDs-mhGC为Tm＝74.7℃，则表明茎部的GC碱基对的增加和小发夹DNA的添加使得热稳定性提高。尤其是vWF1-DsDsDs-GC和vWF1-DsDsDs-mhGC，与现有的DNA适配体ARC1172相比，Tm值高出10℃以上，热稳定性明显优于ARC1172。另一方面，Ds被置换为A而成的vWF1-AAA为Tm＝63.0℃，略有降低，表明Ds自身与热稳定性有关。

<实施例6：使用随机DNA文库筛选结合vWF的DNA适配体>

按照WO2013/073602中记载的随机文库方法，进行含有人工碱基Ds的DNA文库的制备。在随机文库方法中使用的文库是设计成在随机核苷酸序列中的随机位置上以预定概率含有人工碱基Ds的文库。筛选方法按照实施例1的方法进行。简而言之，将DNA片段(分子种类总数为300pmol，即约2×10¹⁴个分子)用作第1轮的文库，混合靶蛋白vWF A1区域(U-Protein公司，V003)后，使用磁珠筛选和分离与靶蛋白结合的DNA，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA-vWF A1区域复合物切割下，由此在筛选和分离后进行PCR扩增，进行共计7轮的筛选操作。各筛选轮的条件示于表3。7轮的筛选结束后，进行序列分析，获得含有人工碱基Ds的DNA适配体序列。

[表3]

表3：筛选条件

方法a：复合物生物素化法

方法b：凝胶迁移分离法

7轮后获得的DNA文库的序列分析结果，得到151,495个序列作为分析对象的总序列。通过上述分析方法，选取100个克隆以上的序列组，将具有类似序列的克隆合计，发现排在最前面的序列为单一序列，占整体的44％以上，包括类似序列在内的话则占整体的84％。确认到包括排在最前面的序列的序列组中只出现A或T的概率高的部位有3处。

<实施例7：确定DNA适配体的序列>

使用由设计成在实施例6获得的排在最前面的序列中特异性的25个碱基组成的DNA片段的探针序列：5’-CGTTGAGACCTGTTAGGTGCTCTTC-3’(SEQ ID NO:25)。该探针为将5’末端进行生物素标记而成的探针，使用从赛默飞世尔科技公司购买的化学合成和简单纯化后的探针。使用探针从文库分离目的序列的操作与实施例2同样地进行。

含有人工碱基Ds的DNA的测序分析通过与实施例2相同的方法进行。分析序列模式后，结果发现在以Px链侧为模板的序列反应样品中，人工碱基模板上出现了3处表示人工碱基的模式(间隔)，而在以天然置换DNA为模板的序列反应样品中则显示出A峰，由此可知，在3处(随机区域第9个、第21个和第32个)存在人工碱基Ds。

<实施例8：利用凝胶迁移实验的DNA适配体结合活性分析>

为了研讨含有3处经过序列鉴定的人工碱基Ds的DNA适配体针对vWF A1区域蛋白的结合，制作从中切割引物区域的DNA适配体，通过凝胶迁移实验进行结合分析。将用于本实施例的DNA适配体的序列示于表4，预测的二级结构示于图6。

[表4]

表4：使用的各种DNA适配体的序列

以vWF2-DsDsDs(SEQ ID NO:13)为基础，制备了将中间部分的Ds置换为A而成的vWF2-DsADs(SEQ ID NO:14)、将中间部分和3’末端侧的Ds置换为A而成的vWF2-DsAA(SEQID NO:15)、将5’末端侧和中间部分的Ds置换为A而成的vWF2-AADs(SEQ ID NO:16)、将全部Ds置换为A而成的vWF2-AAA(SEQ ID NO:17)、将茎部的A-T碱基对置换为G-C碱基对且在3’末端添加小发夹DNA而成的vWF2-DsDsDs-mhGC(SEQ ID NO:18)。此外，以vWF2-DsDsDs-mhGC(SEQ ID NO:18)为基础，制备了将WF2-DsDsDs-mhGC的中间部分的环部置换为小发夹DNA的环部序列(5′-GAA-3′)而成的vWF2-DsDsDs-2mhGC(SEQ ID NO:21)。此外，也制备了现有的DNA适配体ARC1172(SEQ ID NO:10)。各DNA适配体通过化学合成并按照常规方法制备。

凝胶迁移实验除在4℃/300V、25℃/40W、37℃/40W这三个条件下进行电泳以外，与实施例3同样地进行。

结果示于图7。凝胶迁移实验的结果，相对于vWF2-DsDsDs(m)，在vWF2-DsADs(n)未确认到结合降低，在vWF2-DsAA(o)和vWF2-AADs(p)中确认到结合降低，由此表明3个人工碱基Ds中5’侧和3’侧的Ds与结合有关。尤其在vWF2-DsAA(o)中确认到结合能力大幅降低，由此表明3’侧的Ds与结合有很大关系。此外，与用作阳性对照的ARC1172(j)相比，ARC1172在25℃～37℃的电泳中基本看不到结合，而含有人工碱基Ds的vWF2-DsDsDs(m)、vWF2-DsADs(n)、vWF2-DsDsDs-mhGC(r)和vWF2-DsDsDs-2mhGC(s)中则在25℃～37℃的电泳中也保持着结合。

<实施例9：DNA适配体针对vWF结合的Biacore分析>

通过使用GE HEALTHCARE公司的BiacoreT200的表面等离子体共振(SPR)测定获得的DNA适配体的结合能力。用于分析的DNA适配体的序列示于上述表4，根据在筛选中获得的核苷酸序列等而预测的二级结构示于图6。

这些各DNA适配体突变体分别通过将具有图中所示的核苷酸序列的核酸进行化学合成而制备，之后，通过变性丙烯酰胺凝胶纯化。各核酸片段在磷酸缓冲液(pH值7.4)中混合，在95℃加热后逐渐冷却到25℃，从而进行折叠(重构)制备。SPR的结合分析除了以0nM、0.078125nM、0.15625nM、0.3125nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM和5nM进行DNA适配体与vWF A1区域的相互作用检测以外，与实施例4同样地进行。

结果示于图8。本测定的结果，各DNA适配体的K_D值为326pM(ARC1172)、74.9pM(vWF2-DsDsDs)、61.3pM(Bio-vWF2-DsDsDs-2mhGC)。将小发夹DNA添加在3’末端，将内部的茎环置换为小发夹，并且将茎部区域的A-T碱基对置换为G-C碱基对，由此提高结合力。本实施例获得的含有人工碱基Ds的DNA适配体与用作阳性对照的现有的vWF结合性DNA适配体ARC1172相比，具有更高的结合能力(图8)。

<实施例10：DNA适配体在人血清中的稳定性分析>

研讨各DNA适配体对人血清中所含的核酸酶的稳定性。将各DNA适配体(vWF2-DsDsDs、vWF2-DsDsDs-mhGC、vWF2-DsDsDs-2mhGC、vWF2-AAA、ARC1172，终浓度2μM)与人血清混合，以使人血清浓度变为96％，将该溶液在37℃进行孵育。在0小时后、1小时后、6小时后、24小时后、48小时后以及72小时后从混合溶液中分离出10μL，与110μL的1×TBE、10M尿素溶液混合使分解反应停止。将反应后的样品通过变性15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，用SYBR Gold(赛默飞世尔科技公司)对凝胶进行染色，检测单链核酸。使用生物成像仪LAS-4000(富士胶片)分析人血清中的核酸酶所产生的分解产物的条带图案。

结果示于图9，以0h小时作为100％时根据未分解条带的颜色深浅推定的各DNA适配体在各时间内的残留比例(％)示于表5。

[表5]

表5：各DNA适配体在血清中的残留比例(％)

适配体名称	1小时后	6小时后	24小时后	48小时后	72小时后
						vWF2-DsDsDs	103	96	69	46	30
vWF2-DsDsDs-mhGC	101	100	78	61	46
						vWF2-DsDsDs-2mhGC	107	111	95	87	75
vWF2-AAA	103	112	77	42	25
						ARC1172	103	91	37	24	20

在vWF2-DsDsDs-mhGC和vWF2-DsDsDs-2mhGC中与vWF-DsDsDs相比，残留的完整长度DNA适配体的量明显多，这提示了对血清中所含有的核酸酶的稳定性得到提高。用作阳性对照的ARC1172在37℃、72小时的孵育后，其残留比例为20％，而vWF2-DsDsDs-2mhGC即使在72小时后也残留75％。以上表明，本发明的DNA适配体对核酸酶的稳定性高于ARC1172，通过添加小发夹序列，还可以大幅改善对血清中的核酸酶的稳定性。

<实施例11：DNA适配体的热稳定性分析>

测定各DNA适配体(vWF2-DsDsDs、vWF2-DsADs、vWF2-DsAA、vWF2-AADs、vWF2-AAA、vWF2-DsDsDs-mhGC、vWF2-DsDsDs-2mhGC，终浓度2μM)的热稳定性(Tm值)。DNA适配体的吸光度变化通过紫外可见分光光度计UV-2450(岛津)测定，根据其一阶求导计算解链温度Tm值。

结果示于图10。vWF2-DsDsDs为Tm＝66.8℃、vWF2-DsADs为Tm＝63.5℃、vWF2-DsAA为Tm＝62.0℃、vWF2-AADs为Tm＝61.5℃、vWF2-AAA为Tm＝60.0℃、vWF2-DsDsDs-mhGC为Tm＝75.5℃、vWF2-DsDsDs-2mhGC为Tm＝76.5℃。如上所述，通过将茎部序列中的A-T碱基对置换为G-C碱基对，在3’末端添加小发夹DNA，使Tm值提高约9℃，再通过将内部的茎环部分置换为小发夹序列，使Tm值提高约10℃。如上所述，可以制作在更高温度也能获得稳定结构的DNA适配体。

本说明书所引用的全部出版物、专利以及专利申请通过直接引用而并本说明书。

序列表

<110> 塔古西库斯生物株式会社

<120> 结合vWF的DNA适配体

<130> PH-6613-PCT

<150> JP 2015-214848

<151> 2015-10-30

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

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<222> (13)..(13)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<220>

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<220>

<221> misc_feature

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<400> 1

tgagactccc canctttcgc cnacanccga gggagtctca 40

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<222> (13)..(13)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

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tgagactccc canctttcgc cnacaaccga gggagtctca 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<222> (26)..(26)

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<212> DNA

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<223> 合成构建体

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<212> DNA

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<223> 合成构建体

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<400> 6

tgagactccc caactttcgc cnacaaccga gggagtctca 40

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<212> DNA

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<223> 合成构建体

<400> 8

tgagactccc caactttcgc caacaaccga gggagtctca 40

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 11

cgaggctccc canctttcgc cnacanccga gggagcctcg 40

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

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<221> misc_feature

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<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<220>

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<222> (22)..(22)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 12

cgaggctccc canctttcgc cnacanccga gggagcctcg cgcgtagcg 49

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

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<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<220>

<221> misc_feature

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

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<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 14

cgtgaccgan gagcacctaa caggtctcaa cgntggaggt cacg 44

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<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 15

cgtgaccgan gagcacctaa caggtctcaa cgatggaggt cacg 44

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 16

cgtgaccgaa gagcacctaa caggtctcaa cgntggaggt cacg 44

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

cgtgaccgaa gagcacctaa caggtctcaa cgatggaggt cacg 44

<210> 18

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

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<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

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<222> (22)..(22)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 18

cgcggccgan gagcacctaa cnggtctcaa cgntggaggc cgcgcgcgta gcg 53

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

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<221> misc_feature

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<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 19

cgcggccgan gagcacctaa cnggtctcaa cgntggaggc cgcg 44

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 20

cgcggccgan gagcaccgaa ggtctcaacg ntggaggccg cg 42

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> N=7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基

<400> 21

cgcggccgan gagcaccgaa ggtctcaacg ntggaggccg cgcgcgtagc g 51

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

actccctcgg ttgttggcga aagttg 26

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 23

acgaccgttc tctaattttg acgtt 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 24

accaaattat tgcgatacag accct 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

cgttgagacc tgttaggtgc tcttc 25

<210> 26

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

cgcgtagcg 9

<210> 27

<211> 8442

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60

ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120

gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180

ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240

agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300

accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360

gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420

gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480

ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540

acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600

gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660

ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720

gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780

ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840

gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900

tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960

tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020

ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080

acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140

aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa gagctttgac 1200

aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260

cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320

acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380

ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440

cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500

gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560

tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620

ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680

gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740

gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800

ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860

tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920

gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980

tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040

gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100

tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160

atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220

agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280

agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340

ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400

agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460

tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520

acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580

catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640

ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700

aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760

tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820

gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880

tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940

tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000

ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060

tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120

tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180

agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240

ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgcctgcttc 3300

tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360

aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420

gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480

gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540

aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600

gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660

cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720

ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag 3780

gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga cctggtcttc 3840

ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa ggcctttgtg 3900

gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 3960

taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc gtcagagctg 4020

cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc 4080

ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc ctcccgcatc 4140

accctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt tgtccgctac 4200

gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 4260

aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc cttcgtgctg 4320

agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct ctgtgacctt 4380

gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac tgtgggcccg 4440

gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct ggatgtggcg 4500

ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag caaggagttc 4560

atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt cacggtgctg 4620

cagtactcct acatggtgac tgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc caaaggggac 4680

atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa cactgggctg 4740

gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg ggagcaggcg 4800

cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa gaggctgcct 4860

ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca ggagctggag 4920

aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct cccccgagag 4980

gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat ccccaccctc 5040

tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga tggctcctcc 5100

agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt catttcaaaa 5160

gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag catcaccacc 5220

attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct tgtggacgtc 5280

atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc tgtgcgatac 5340

ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt catcctggtc 5400

acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc caacagagtg 5460

acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg gatcttggca 5520

ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct ccctaccatg 5580

gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag gatttgcatg 5640

gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga ccagtgccac 5700

accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt caactgtgac 5760

cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga agagacctgt 5820

ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca catcgtgacc 5880

tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt tcaaaacaag 5940

gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc aaggcagggc 6000

tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca cagtgacatg 6060

gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa catggaagtc 6120

aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca catcttcaca 6180

ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt tgcttcaaag 6240

acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat gctgagggat 6300

ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca gcggccaggg 6360

cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc ccactgccag 6420

gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc cacattctat 6480

gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat cgcctcttat 6540

gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga tttctgtgct 6600

atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc ccggcactgt 6660

gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg ccctccagat 6720

aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg cattggtgag 6780

gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc ctgtcagatc 6840

tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc cacggccaaa 6900

gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga ccagtgctgc 6960

cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt gcctcactgt 7020

gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa cttcacctgc 7080

gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc gcaccgtttg 7140

cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa ctgtgtcaac 7200

tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaactg ccaccaatga ctgtggctgt 7260

accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat ctaccctgtg 7320

ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga ggatgccgtg 7380

atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg tcggtcgggc 7440

ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc tgcctgtgag 7500

gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt cggctcccag 7560

tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa ggaggaggtc 7620

tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg cccctcgggc 7680

tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga gcgcatggag 7740

gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat cgatgtgtgc 7800

acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct ggagtgcagg 7860

aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac aggtgaatgt 7920

tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca gatcatgaca 7980

ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa ggtcaatgag 8040

agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga tgaacacaag 8100

tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 8160

gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg aagctgtaag 8220

tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac 8280

tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac acggacggag 8340

cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga ggttctcaat 8400

gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 8442

<210> 28

<211> 2813

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 28

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85 90 95

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265 270

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310 315 320

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405 410 415

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485 490 495

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500 505 510

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515 520 525

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555 560

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635 640

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

660 665 670

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795 800

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840 845

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890 895

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970 975

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

1040 1045 1050

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060 1065

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070 1075 1080

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115 1120 1125

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165 1170

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195 1200

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240 1245

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

1250 1255 1260

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270 1275

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285 1290

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300 1305

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355 1360 1365

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu

1370 1375 1380

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

1400 1405 1410

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

1415 1420 1425

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met

1460 1465 1470

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555 1560

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570 1575

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600 1605

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

1610 1615 1620

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp

1640 1645 1650

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala

1670 1675 1680

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

1715 1720 1725

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

1730 1735 1740

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745 1750 1755

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

1760 1765 1770

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

1805 1810 1815

Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

1820 1825 1830

Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835 1840 1845

Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

1850 1855 1860

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

1865 1870 1875

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

1880 1885 1890

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

1895 1900 1905

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

1910 1915 1920

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

1925 1930 1935

Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

1940 1945 1950

Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu

1955 1960 1965

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

1970 1975 1980

Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985 1990 1995

Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

2000 2005 2010

Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

2015 2020 2025

Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

2030 2035 2040

Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile

2045 2050 2055

Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser

2060 2065 2070

Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys

2075 2080 2085

Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

2090 2095 2100

Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg

2105 2110 2115

Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

2120 2125 2130

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135 2140 2145

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

2150 2155 2160

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala

2165 2170 2175

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

2180 2185 2190

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200 2205

Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn

2210 2215 2220

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

2225 2230 2235

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240 2245 2250

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255 2260 2265

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys

2270 2275 2280

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285 2290 2295

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300 2305 2310

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315 2320 2325

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

2330 2335 2340

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

2345 2350 2355

Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro

2360 2365 2370

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

2375 2380 2385

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

2390 2395 2400

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

2405 2410 2415

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420 2425 2430

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

2435 2440 2445

Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

2450 2455 2460

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

2465 2470 2475

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485 2490

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

2495 2500 2505

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

2510 2515 2520

Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

2525 2530 2535

Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu

2540 2545 2550

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

2555 2560 2565

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

2570 2575 2580

Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp

2585 2590 2595

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser

2600 2605 2610

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

2615 2620 2625

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2630 2635 2640

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile

2645 2650 2655

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

2660 2665 2670

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

2675 2680 2685

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

2690 2695 2700

Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

2705 2710 2715

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

2720 2725 2730

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

2735 2740 2745

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp

2750 2755 2760

Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

2765 2770 2775

Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val

2780 2785 2790

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

2795 2800 2805

Arg Lys Cys Ser Lys

2810

Claims

1.一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其含有SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一个所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的DNA适配体，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的序列。

3.根据权利要求1或2所述的DNA适配体，其在核苷酸序列的末端含有1～5个GC碱基对。

4.根据权利要求1或2所述的DNA适配体，其在核苷酸序列的3’末端还含有小发夹结构，

(A)由2～5个任意核苷酸组成的第一核酸区域；

5.根据权利要求3所述的DNA适配体，其在核苷酸序列的3’末端还含有小发夹结构，

(A)由2～5个任意核苷酸组成的第一核酸区域；

6.一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其含有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。

7.一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其由权利要求1～6中任一项所述的核苷酸序列构成。

8.一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的DNA适配体，其在核苷酸序列的末端含有1～5个GC碱基对。

10.根据权利要求8或9所述的DNA适配体，其在核苷酸序列的3’末端还含有小发夹结构，

(A)由2～5个任意核苷酸组成的第一核酸区域；

11.一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其含有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。

12.一种结合vWF蛋白的DNA适配体，其由权利要求8～11中任一项所述的核苷酸序列构成。

13.一种vWF蛋白检测试剂，其含有权利要求1～12中任一项所述的DNA适配体。

14.一种vWF蛋白检测用试剂盒，其含有权利要求1～12中任一项所述的DNA适配体。

15.一种药物组合物，其含有权利要求1～12中任一项所述的DNA适配体。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防的疾病选自于由以下疾病组成的组：血栓形成、血栓性血小板减少性紫癜、颅内栓塞、脑栓塞、颈动脉狭窄、血栓性微血管病以及急性心肌梗死。

17.权利要求1～12中任一项所述的DNA适配体在制备用于检测vWF蛋白的试剂盒、检测试剂或组合物中的用途，其中，当所述试剂盒、检测试剂或组合物被使用时，以下步骤被包括：

使从受试对象获得的样品与权利要求1～12中任一项所述的DNA适配体接触的步骤；以及

基于所述样品与所述DNA适配体的结合来检测vWF蛋白的步骤。