CN101300361A - 关于血管性血友病因子的适体及其作为血栓形成疾病治疗剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明主要涉及核酸领域，更尤其涉及能结合血管性血友病因子，在血栓形成性疾病和/或其他疾病的诊断和治疗过程中用作治疗剂的适体，在所述血栓形成性疾病和/或其他疾病中，血管性血友病因子调节的血小板凝聚牵连其中。本发明进一步涉及用于给药能结合血管性血友病因子的适体的材料和方法。

Description

关于血管性血友病因子的适体及其作为血栓形成疾病治疗剂的应用

技术领域

本发明主要涉及核酸领域，更尤其涉及能结合血管性血友病因子，在血栓形成性疾病和/或其他疾病的诊断和治疗过程中用作治疗剂的适体，在所述血栓形成性疾病和/或其他疾病中，血管性血友病因子调节的血小板凝聚牵连其中。本发明进一步涉及用于给药能结合血管性血友病因子的适体的材料和方法。

背景技术

适体是核酸分子，通过不同于传统的沃森-克里克碱基配对的分子间相互作用对分子具有特异性结合亲和性。

适体，如同通过噬菌体显示或单克隆抗体技术(″mAbs″)产生的肽一样，能够特异结合选定的目标并调节靶分子的活性或结合相互作用，例如，通过结合的适体可以阻断其靶分子发挥功能性作用。通过从低聚核苷酸随机序列库中进行体外选择过程发现，得到的适体可以产生超过130种蛋白质，包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白和受体。典型的适体大小在10-15kDa(20-45个核苷酸)之间，以纳摩尔到次纳摩尔的亲合力与其靶分子结合，并区分密切相关的其它靶分子(例如，适体一般地不会结合同基因族的其他蛋白质)。一系列的抗体结构研究已经表明，适体能够使用同类的结合相互作用(例如，氢键键合、静电互补、疏水性接触、空间排斥)，增强抗体-抗原复合物亲合性和专一性。

适体在用作治疗剂和诊断制剂过程中具有许多理想的特征，包括高特异性和亲合性、生物有效性和杰出的药代动力学性质。此外，它们可以提供比抗体及其他蛋白质生物体更优越的特殊的竞争优势，例如：

1)速度和控制。适体通过完全的体外过程生产，允许最初先导物，包括治疗剂先导物的快速生成。体外筛选过程严格控制了适体的特异性和亲合性，允许先导物，包括针对有毒的和非免疫原的靶分子的先导物的生成。

2)毒性和免疫原性。作为一类物质，适体具有已经证明的治疗可接受的毒性和缺乏免疫原性。但是许多单克隆抗体的功效由于其自身与抗体的免疫反应而大大受到限制，得到关于适体的抗体是非常困难的，这很可能是因为适体不能由T-cells通过MHC(主要组织相容性复合体)产生，且免疫应答通常不识别核酸片段。

3)给药。虽然目前最认可的抗体治疗剂是通过静脉输液给药的(一般地为2-4小时)，但是适体可以通过皮下注射给药(在猴子体内进行研究证明，适体通过皮下给药的生物利用率＞80％(Tucker et al，J.Chromatography B.732：203-212，1999))。由于适体具有良好的可溶性(＞150mg/ml)和相对较低的分子量(适体：10-50kDa；抗体：150kDa)，周剂量的适体可能通过以小于0.5mL的体积注射给药。此外，适体较小的尺寸使它们能够渗入抗体或抗体片段不能渗入的构象限制区，展现了基于适体的治疗剂或预防剂一个另外的优势。

4)可规模性和成本。适体治疗剂是化学合成的，因此容易根据目前的生产需要进行规模性放大。然而目前在放大生产中的难点限制了某些生物体的可用性，且大规模蛋白质生产制造厂的基建费用是巨大的，但是，单一大规模的低聚核苷酸合成器的产量可达到100kg/年，且其只需要相对中等成度的创办投资。目前目前用于适体合成的生产原料的成本以千克为单位估计为500美元/g，基本相当于高度优化的抗体的生产。在未来5年内工艺的持续改进可以预料原料成本将下降到＜100美元/g。

5)稳定性。适体治疗剂是化学稳定的。在暴露于例如热处理和变性剂等条件下之后，他们能够本能的恢复活性，在室温下，适体作为冻干粉末可以储存相当长的时间(＞1年)。

血栓形成性疾病

在进行普通的，控制的止血过程中，血小板通常只黏附于受伤血管的内皮下膜处，并不与健康的血管相粘黏。血小板的黏附引发一系列的血小板活化过程，从而最终产生血栓起到止血作用。在血管创伤部位，血管性血友病因子(“vWF”)是血小板凝结作用的调节剂。vWF是一种大的多亚基，复合可溶性因子，主要由血管的内皮细胞产生。血管性血友病因子通过血管性血友病因子A3区域和暴露胶原质的相互作用固定在流血的血管壁上。血小板受体糖蛋白Ib(下文中用GP Ib表示)和固定的血管性血友病因子A1区域发生短暂的相互作用，促进血小板在血管创伤处的黏附与活化。参见E.G.Huizinga et al.，Science，297，1176(2002)。因此，血管性血友病因子具有趋血栓阻塞性，在止血过程中对于促进血管创伤处的血栓形成起到重要的作用。

相反的，通过相同的机制，血管性血友病因子对于包括血小板凝聚和血栓形成的疾病，例如心血管疾病，也起着重要的作用。尽管目前抗血栓形成治疗剂是可以购得的，但在进一步治疗方面仍有许多未满足的需要。美国心脏协会估计，只在美国就有超过6千万人患有一种或更多种形式的心血管病，绝大部分患病人群很有可能患有动脉血栓病。参见S.P.Jackson and S.M.Schoenwaelder，Nature Reviews，2，1-12(2003).

目前通用的治疗剂有一种重要的问题，就是改进的功效降低了安全性。参见S.P.Jackson和S.M.Schoenwaelder，NatureReviews，2，1-12(2003).因此，在流血的副作用被最小化同时，通过防止血小板在血管系统处凝聚来治疗和防止血栓形成疾病是非常有益的。本发明提供了用于满足这些及其他需要的材料和方法。

附图说明

图1表示了从低聚核苷酸随机序列库中进行的体外适体筛选(SELEX^TM)过程。

图2是描述了不同聚乙二醇化策略的示意图，表示了标准单聚乙二醇化、多聚乙二醇化和通过聚乙二醇化进行的齐聚反应。

图3是图表，列出了本发明试验所用的血管性血友病因子A1区域蛋白的氨基酸序列。

图4是图表，列出了本发明试验所用的血管性血友病因子全长蛋白的氨基酸序列。

图5是描述了ARC 1029(序列号214)被提议的二级结构的示意图。

图6是ARC 1029(序列号214)与人vWF全长和兔vWF A1区域定点印记结合曲线的图表。

图7是FACS数据图，表示了ARC 1029(序列号214)抑制人vWF全长和兔vWF A1区域与冻干的人血小板的结合。

图8是血小板凝聚分析仪曲线图，表示了随着时间变化，ARC1029(序列号214)对botrocetin诱导的血小板凝聚的抑制性。

图9表示了ARC 1029(序列号214)对botrocetin诱导的血小板凝聚的抑制性。

图10是描述序列号217被提议的二级结构的示意图，其中，C＝fC，T＝fU，N＝任意核苷，但在配对区域满足Watson/Crick碱基配对原则，且X＝可以被PEG间隔体替换的1到4个核苷或Nx-Nx-Nx-Nx。

图11是描述vWF rRfY SELEX FAMILY#1中3个适体序列阵的示意图。

图12是描述序列号218被提议的二级结构的示意图。

图13是描述序列号219被提议的二级结构的示意图。

图14是描述vWF DNA SELEX 2FAMILY#1中26个适体的序列阵示意图，阵列顶端的黑线表示结合血管性血友病因子所需的被提议的核心核酸结合序列。

图15是描述序列号220被提议的二级结构的示意图。图15B是描述ARC 1172(序列号222)二级结构的示意图，ARC 1172的残基耐受2’-OMe取代。

图16是表示核酸序列的图表，这些核酸序列包括ARC 1029(序列号214)，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)和ARC 1194(序列号223)到ARC 1243(序列号272)的任意修饰。

图17是表示核酸序列的图表，这些核酸序列包括ARC 1172(序列号222)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1348(序列号283)和ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)的任意修饰。图表中的黑框表示一种缺失。在核苷指示剂(例如T或dA)之前的“s”表示在磷酸骨架5’到指示核苷之间的硫代磷酸取代。

图18是表示核酸序列的图表，这些核酸序列包括ARC 1172(序列号222)，ARC 1524(序列号305)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)和ARC 1759(序列号318)的任意修饰。图表中的黑框表示一种缺失。

图19是表示ARC 1368(序列号291)和ARC 1534(序列号315)的二级结构的示意图。

图20表示了在PFA-100试验中用ARC 1368(序列号291)或ARC 1525(序列号306)处理人全血时的凝固时间，在这里，凝固时间是适体浓度的函数。

图21表示了在PFA-100试验中用Integrilin^TM，ReoPro^TM或ARC1368(序列号291)处理人全血时的封闭时间，在这里，封闭时间是药物浓度的函数。

图22表示了在BIPA试验中，用Integrilin^TM，ReoPro^TM或ARC1368(序列号291)处理的人PRP抑制性百分比，在这里，抑制性百分比是药物浓度的函数。

图23表示了在AIPA试验中，用Integrilin^TM，ReoPro^TM或ARC1368(序列号291)处理的人PRP抑制性百分比，在这里，抑制性百分比是药物浓度的函数。

图24表示了作为时间函数，在人血浆中检测到的ARC 1172(序列号222)或ARC 1368(序列号291)全长序列百分比。

图25表示了在给药ARC 1368(序列号291)、ARC 1779(序列号320)或ARC 1780(序列号321)之后，作为时间函数的灵长类动物须将适体浓度(使用Oligreen分析仪测定)。

图26中的横轴表示从三只猕猴身上吸取试验用血的时间点，三个纵轴中最上面的一个表示了ARC 1779(序列号320)的血浆浓度(以nM为单位)，三个纵轴中中间的一个表示了PFA-100闭合时间(以秒为单位)，三个纵轴最下面的一个表示了模版或皮肤的流血时间(以分钟为单位)。顶部、中部和下部的三个图分别表示了三只动物的血浆适体浓度、PFA-100闭合时间和皮肤流血时间的平均值。

图27是一个图表，表示了对三只不同的猕猴给药ARC 1779(序列号320)之后，在第1栏所示的不同时间点，以分钟为单位的皮肤流血时间(CBT)、BIPA原始数据和PFA闭合时间(秒)。

图28表示了对猕猴给药ARC 1779(序列号320)之后，在不同的时间点PFA-100闭合时间的平均值。

图29表示了在给药后不同时间点测定的用ARC 1779(序列号320)处理的三只猕猴的平均流血时间。

图30是一个图表，将用ARC 1779(序列号320)处理的猕猴平均流血时间(左纵轴)与PFA-100闭合时间相关联。

图31描述了在猕猴电解产生的血栓模型中用来评估ARC1779(序列号320)的血液样品收集方案。

图32描述了在电解产生的血栓模型中，治疗组3中的每只猕猴体内，作为时间函数的ARC 1779(序列号320)的血浆浓度(纵轴)。

图33表示了在猕猴电解产生的血栓模型中进行试验的每个治疗组的每只猕猴体内，封闭右颈动脉(阴影棒)或左颈动脉(实心棒表示)的时间。第1、8、9对棒形图表示了治疗组1(只给药介质)，第2、10、11、12和13对棒形图表示了治疗组2和4(给药ReoPro)。第3-7对棒形图表示了治疗组3(1000nM适体血浆浓度靶向组)。第20、22、16和18对棒形图表示了治疗组7(750nM适体血浆浓度靶向组)。第19、21、23和24对棒形图表示了治疗组6(500nM适体血浆浓度靶向组)。第15和17对棒形图表示了治疗组5(300nM适体血浆浓度靶向组)。

图34表示了在电创伤模型中，如纵轴所示时间点测定的不同猕猴治疗组中以分钟(横轴)为单位的皮肤流血时间。

发明内容

本发明提供了用于治疗血栓形成性病症的材料和方法，所述的血栓形成性病症包括血管性血友病因子调节的血小板凝聚。

本发明提供了对血管性血友病因子靶分子具有特异性结合能力的适体。在某些实施方案中，血管性血友病因子靶分子是人的血管性血友病因子。在某些实施方案中，血管性血友病因子靶分子是一种人血管性血友病因子的变异体，这种人血管性血友病因子变异体表现出的生物功能与人血管性血友病因子功能相同。在某些实施方案中，血管性血友病因子靶分子或其变体的生物机能是调节血小板凝聚。在某些实施方案中，人血管性血友病因子靶分子的变体基本上具有相同的结构，并且其结合本发明适体的能力基本上与人血管性血友病因子结合本发明适体的能力相同。在某些实施方案中，vWF靶分子是一种非人的血管性血友病因子。在某些实施方案中，本发明的适体结合血管性血友病因子靶分子或其变体，其中，所述变体包括一种氨基酸顺序，该氨基酸顺序与序列号7(图4)有至少75％、80％、90％或95％的同源性。在一个实施方案中，血管性血友病因子靶分子包括序列号7的氨基酸顺序。

在文中，当比较和调整最大值一致性时，两个或两个以上核酸或蛋白质序列之间的术语″序列同源性″或″％同源性″是指，通过使用下列序列之一进行比较运算或通过目测检查，两个或两个以上序列或子序列是相同的，或具有确定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，在进行比较运算时，一般一个序列作为参比序列，待测待测序列与之相比较。当使用序列比较运算时，将待测序列和参比序列输入电脑中，如果必要的话子序列的坐标是指定的，且序列运算的程序参数也是指定的。然后，根据指定的程序参数，序列比较运算可以计算出待测序列(s)相对于参比序列的序列同源性百分比。可以通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的区域同源性算法，或通过Needleman & Wunsch，J MoI.Biol.48：443(1970)的阵列同源性算法，或通过Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性搜索法，或通过在计算机上执行这些算法(遗传学计算机集团生产的威斯康星遗传学程序包中的程序GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，575Science Dr.，Madison Wis.)，或通过目测检查(通常参见Ausubel，F.M.et al Current Protocols in Molecular Biology，Greene出版协会和Wiley-interscience出版(1987))进行序列阵列最优化。

适用于确定序列同源性百分比的算法的一个例子是在局部阵列基础搜索工具中使用的算法(下称″BLAST″)，参见例如Altschul et al，J MoI.Biol.215：403-410(1990)和Altschul et al，Nucleic Acids Res.，15：3389-3402(1997)。用于进行BLAST分析的软件可以从国家生物工程学信息中心(下称″NCBI″)获得。使用软件确定序列同源性的默认参数也可以从NCBI中获得。例如，在文献McGinnis et al.，Nucleic Acids Res.，32：W20-W25(2004)中描述的BLASTN(用于核苷酸序列)和BLASTP(用于氨基酸顺序)。在一种优选的实施方案中，通过使用Altschul等人的BLAST算法和McGinnis等人的默认参数确定同源性百分比，在这里可能被认为是BLAST同源性百分比。

在一个实施方案中，本发明的vWF适体包括一种电离常数，对于人血管性血友病因子或其变异体此电离常数大约是100nM或更少，优选50nM或更少，优选10nM或更少，优选5nM或更少，优选1nM或更少，更优选500pM或更少。电离常数可以通过定点印记试验确定，定点印记试验使用多点滴定，且满足实施例1中描述的等式y＝(max/(1+K/蛋白质))+yint。

本发明还提供了一种能够与血管性血友病因子A1区域靶分子特异性结合的适体。在某些实施方案中，血管性血友病因子A1区域靶分子是人血管性血友病因子A1区域靶分子。在某些实施方案中，人血管性血友病因子A1区域靶分子是人血管性血友病因子A1区域的变异体，其生物功能本质上与人血管性血友病因子A1区域功能相同。在某些实施方案中，血管性血友病因子A1区域或其变异体的生物功能是结合血小板。在某些实施方案中，人血管性血友病因子区域靶分子变异体的结构与人血管性血友病因子A1区域的结构基本上相同，并且与人血管性血友病因子A1区域具有基本上相同的结合所述适体的能力。在其他实施方案中，血管性血友病因子A1区域靶分子是非人类的血管性血友病因子A1领域靶分子，例如兔或非人灵长类动物的血管性血友病因子A1领域靶分子。

在某些实施方案中，本发明的血管性血友病因子A1区域靶分子包括一种氨基酸顺序，此氨基酸顺序与选自由序列号4到6所组成的组的任何一个的序列有至少75％、80％、90％或95％的同源性。在一种优选的实施方案中，血管性血友病因子A1区域靶分子靶分子包括选自由序列号4到6所组成的组的任何一个的氨基酸顺序。

在一个实施方案中，本发明关于人血管性血友病因子A1区域或其变异体的vWF适体，包括大约100nM或更少，优选50nM或更少，优选10nM或更少，优选5nM或更少，优选1nM或更少，更优选500pM或更少的电离常数。在另一个实施方案中，本发明对于非人血管性血友病因子A1区域或其变异体的适体包括大约100nM或更少，优选50nM或更少，优选10nM或更少，优选5nM或更少，优选1nM或更少，更优选500pM或更少的电离常数。电离常数可以通过使用多点滴定的定点印记试验确定，且满足下面实施例1所述等式y＝(max/(1+K/蛋白质))+yint。

在某些实施方案中，本发明提供了一种能够特异性结合血管性血友病因子全长靶分子的适体。在某些实施方案中，本发明提供了能够特异性结合血管性血友病因子全长靶分子和血管性血友病因子A1区域靶分子的适体。在某些实施方案中，血管性血友病因子全长靶分子是人血管性血友病因子靶分子或其变异体。在其他的实施方案中，血管性血友病因子全长靶分子是一种非人血管性血友病因子靶分子或其变异体。在某些实施方案中，血管性血友病因子A1区域靶分子是一种非人血管性血友病因子A1区域靶分子或其变异体。在其他的实施方案中，血管性血友病因子A1区域靶分子是人血管性血友病因子A1区域靶分子或其变异体。在某些实施方案中，血管性血友病因子全长靶分子或A1区域靶分子选自由兔、豚鼠、猴子、狗、羊、老鼠和小鼠的血管性血友病因子全长或A1区域靶分子所组成的组。在某些实施方案中，本发明适体特异性结合的血管性血友病因子全长靶分子和血管性血友病因子A1区域靶分子来自于不同的种类。

本发明提供抗血管性血友病因子靶分子的适体，所述适体是核糖核酸或脱氧核糖核酸或核糖核酸和脱氧核糖核酸的混合。本发明的适体可以是单链核糖核酸或脱氧核糖核酸或核糖核酸和脱氧核糖核酸的混合。在某些实施方案中，本发明的适体包括至少一个化学修饰。在某些实施方案中，核酸的化学修饰选自由糖位点的化学取代；磷酸盐位点的化学取代；碱基位点的化学取代所组成的组。在其他的实施方案中，化学修饰选自由修饰核苷酸的结合、3′封端、与高分子量非免疫原性化合物的结合、与亲脂性化合物的结合和硫代磷酸进入磷酸盐骨架的结合所组成的组。在一种优选的实施方案中，非免疫原的高分子化合物是聚烯基二醇，更优选是聚乙二醇。

在本发明的某些实施方案中，提供了一种能够特异性地与靶分子结合的适体，例如血管性血友病因子适体，其中，该适体包括一种具有不大于四个，不大于三个，不大于两个或不大于一个硫代磷酸骨架修饰，并且该适体对于靶分子具有结合亲合性，其中，此结合亲合性相对于具有相同核苷酸序列但是没有硫代磷酸骨架修饰的第二适体有所增加。在某些实施方案中，靶分子是一种不具有已知的核酸结合功能，特别是不具有已知的结合核酸基本功能的蛋白质或肽。

在某些实施方案中，本发明的适体调节任何一个选自由血管性血友病因子、血管性血友病因子A1区域靶分子和任一靶分子的变异体所组成的组的成员的功能。在某些实施方案中，功能调节是血小板凝聚作用的调节。在某些实施方案中，本发明的适体抑制血管性血友病因子调节体内血小板凝聚作用。在其他的实施方案中，本发明的适体阻止任意一个选自由血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子A1区域靶分子和其变异体所组成的组的分子与血小板结合。在其他的实施方案中，本发明的适体阻止任意一个选自由血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子A1区域靶分子和其变异体所组成的组的分子与血小板受体蛋白结合。在另外的实施方案中，本发明的适体阻止任意一个选自由血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子A1区域靶分子和其变异体所组成的组的分子与血小板受体蛋白GPIb结合。在某些实施方案中，本发明的适体阻止vWF因子调节的血小板凝聚作用，同时不会明显的增加出血时间。在某些实施方案中，出血时间不显著的增加小于15分钟，优选小于10分钟，更优选小于5分钟，并且在某些实施方案中，相对于未用本发明适体处理的患者的出血时间增加小于3分钟。在某些实施方案中，出血时间是由皮肤(或者模板)的出血时间决定的。

在某些实施方案中，本发明的适体对于血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子A1区域靶分子和其变异体具有基本上相同的结合能力，其中，适体选自序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)。在其他的实施方案中，本发明的适体具有基本上相同的结构，且对于血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子A1区域靶分子和其变异体具有基本上相同的结合能力，其中适体选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)到ARC 1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)所组成的组。在另外的实施方案中，本发明的适体选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC1 115(序列号221)，ARC1 172(序列号222)，ARC1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)所组成的组。

在一种特殊的实施方案中，本发明的适体包括的主要核酸序列为ARC 1172(序列号222)或ARC 1115(序列号221)或ARC1029(序列号214)或序列号220，且在6到9、20、22、24到27、30或32到33位点处不包括2′-O-Me取代的核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的适体包括核酸序列ARC 1172(序列号222)或ARC 1115(序列号221)或ARC1029(序列号214)或序列号220，并且在一个或一个以上位点，在5个或5个以上位点，在10个或10个以上位点，在15个或15个以上位点，或在20个或20个以上位点包括2′-O-Me取代的核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的适体包括核酸序列ARC 1172(序列号222)或ARC 1115(序列号221)或ARC 1029(序列号214)或序列号220，且在1到5位点、10到19位点、21位点、23位点、28到29位点和34到41位点包括2′-O-Me取代的核苷酸，其中，位点号码从核酸序列的5′末端开始编号。

在本发明特殊的实施方案中，提供了一种适体，该适体包括一种选自由序列号95到97和序列号217到219所组成的组的核酸序列，其中，Y＝C或T/U，R＝A或G，N＝任意核苷，在成对区域满足沃森克里克碱基配对规则；且X＝1到4。在另一种实施方案中，本发明的适体选自：序列号217和220，其中，Nx-Nx-Nx-Nx-，或N_(3-10)可以被PEG连接体取代。在另外的实施方案中，本发明的适体选自序列号325-327，其中Y＝C或T，R＝A或G。

在特殊的实施方案中，能够特异性结合血管性血友病因子的适体包括一种三元螺旋结合的二级结构部分，此部分与图15所描述的序列号220具有一致的序列结构。在另一个特殊的实施方案中，具有三元螺旋结构的适体包括与图19A所描述的(ARC 1368(序列号291))一致的结构。然而在另一种实施方案中，具有三元螺旋结构的适体与图19B所描述的(ARC 1534(序列号315))一致的结构。

在另外的实施方案中，能够特异性结合血管性血友病因子的适体包括茎-环-茎-环状二级结构部分，此部分具有与图10描述的序列号217一致的序列结构。在其他的实施方案中，特异性结合血管性血友病因子的适体包括茎-环-环二级结构部分，该部分含有与图12描述的序列号218一致的序列结构。在其他的实施方案中，特异性结合血管性血友病因子的适体包括一种三元结合的二级结构部分，该部分有两个螺旋状的茎和一个如图13所描述的序列19的茎-环结构。在某些实施方案中，本发明适体的二级结构部分可以通过4.1版的RNAstructure.(参见，Mathews，D.H.；Disney，M.D.；Childs，J.L.；Schroeder，SJ.；Zuker，M.；和Turner，D.H.2004年在美国国家科学院学报101卷7287-7292页发表的名为″将化学修饰限制引入动态规划法则来预计RNA二级结构″的文献).预测。

在优选地实施方案中，提供了能够特异性结合人血管性血友病因子靶分子和非人血管性血友病因子靶分子的适体。

在一个实施方案中，提供了包括下列结构的适体或其盐：

适体3’

其中：n大约为454个环氧乙烷单位(PEG＝20KDa)

～～～是一种连接体，且该适体是本发明的抗-vWF适体。在一种特殊的实施方案中，适体包括下列核酸序列或其片断：

mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-S-dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(序列号291)。其中“s”是指硫代磷酸盐取代，“3T”是指反向脱氧胸腺嘧啶。在其他的实施方案中，适体包括下列核酸序列或其片断：dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCdTdTdCdGdGdCdCdGdTdGdCdGdGdTdGdCdCdTdCdCdGdTdCdAdCdGdCdC-3T(序列号323)，其中，“d”是指脱氧核苷，“3T”是指一种反向的脱氧胸腺嘧啶。在本发明此方面的某些实施方案中，连接体是烷基连接体。在特殊的实施方案中，烷基连接体包括2-12个连续的CH₂基团。在特殊的优选实施方案中，烷基连接体包括3-6个连续的CH₂基团。

在一种特殊的实施方案中，本发明实体包括下列结构：

适体3’

其中：n大约为454个环氧乙烷单位(PEG＝20KDa)且该适体核酸序列是本发明的抗-vWF适体。在一种特殊的实施方案中，适体包括下列核酸序列或其片断：mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-S-dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(序列号291)。其中“s”是指硫代磷酸盐取代，“3T”是指反向脱氧胸腺嘧啶。在其他的实施方案中，适体包括下列核酸序列或其片断：dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCdTdTdCdGdGdCdCdGdTdGdCdGdGdTdGdCdCdTdCdCdGdTdCdAdCdGdCdC-3T(序列号323)，其中，“d”是指脱氧核苷，“3T”是指一种反向的脱氧胸腺嘧啶。

在另一种实施方案中，提供了本发明适体的盐。在一种特殊的实施方案中，提供了如下的适体盐：

N-(甲氧基-聚乙二醇)-6-氨基己基-(1-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-尿苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧腺苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-尿苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-尿苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-尿苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-胞苷酸基-(3′--＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-P-硫代鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧胸腺苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-脱氧胸腺苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-尿苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-尿苷酸基-(3′-＞5′)-2′-脱氧胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-腺苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-胞苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-鸟苷酸基-(3′-＞5′)-2′-OMe-胞苷酸基-(3′-＞5′)-(3′-＞3′)-2′-脱氧胸腺嘧啶，40-钠盐，其中，甲氧基聚乙二醇包括分子量为为20KDa的分子。

在另外的实施方案中，提供了一种药物组合物，该药物组合物包括任一治疗有效量的本发明适体或其盐和药用可接受的载体或稀释剂。在一种特殊的实施方案中，本发明的药物组合物包括ARC 1779。在一种更特殊的实施方案中，药物组合物包括具有下述结构的适体或其盐：

适体3′

其中，n是大约454个环氧乙烷单位(PEG＝20KDa)，且该适体包括下列核酸序列或其片断：mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(序列号291)，其中，“m”指2′-甲氧基取代，″d″指脱氧的核酸，“s”是指硫代磷酸盐取代，“3T”是指反向脱氧胸腺嘧啶。

本发明提供了一种治疗、预防或改善由血管性血友病因子调节的疾病的方法，包括对脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人，给药本发明适体或药物组合物。在某些实施方案中，需要治疗、预防或改善的疾病选自：原发性血小板减少症、血栓形成性紫斑症(“TTP”)、IIb型血管性血友病、例如周围动脉闭塞性疾病的周围动脉疾病、不稳定型心绞痛、心绞痛、动脉血栓症、动脉硬化、心肌梗塞、急性冠脉综合征、心房颤动、颈动脉狭窄、脑梗塞、脑血栓、缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作。在某些实施方案中，在进行透析、CABG手术、冠心病介入治疗或心脏瓣膜置换术之前/期间/或之后，给药本发明的药物组合物。

根据治疗、改善和/或预防的疾病不同，本发明适体的体内半衰期时间是变化的。例如，在某些实施方案中，根据治疗、改善和/或预防的疾病不同，需要缓慢进行适体给药，则本发明的适体具有相对较长的半衰期，例如，在人体内的半衰期超过5个小时。

在其他的实施方案中，本发明的适体包括一种需要的功能性半衰期或作用持续时间。功能性半衰期或作用持续时间是适体药代动力学半衰期和药效活性二者共同的效果。在其他的实施方案中，本发明的适体包括一种需要的功能性半衰期或作用持续时间.功能性半衰期或作用持续时间是适体药代动力学半衰期和药效活性的函数。在某些实施方案中，抗-vW治疗剂适体所需的人功能性半衰期或作用持续时间对于适应症选择的PCI和ACS为1-5个小时。具有这种动力学的适体表现出一种两者间的平衡，这两者是(1)最小化总的适体服药量(从而实现比较长的半衰期)和(2)停止治疗之后(实现较短的半衰期)，允许血小板功能快速正常化。在某些实施方案中，血小板的快速正常化功能是非常重要的，因为这样可以使临床医师在病人进行治疗后不能稳定的情况下，有机会快速的介入治疗

因此，在某些实施方案中，用于治疗方法的适体和/或本发明的药物组合物包括一种相对短的功能性半衰期，例如在人体内的功能性半衰期大约为1到5小时。在某些实施方案中，在人体内的功能性半衰期为至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时且不大于5小时。在某些实施方案中，功能性半衰期或作用持续时间大约与适体的分布半衰期T_1/2相同。

在某些实施方案中，包括较短的人体内功能性半衰期的本发明适体被用于一些方法和组合物中，所述方法和组合物用于治疗、改善或防止可能需要外科手术的疾病，例如急性冠状动脉综合症。在某些实施方案中，包括短的人体内功能性半衰期的本发明此方面的适体与PEG连接，例如5、10或20kDa的PEG。在某些实施方案中，包括短的人体内功能性半衰期的本发明此方面的适体是ARC 1779。

本发明还提供了一种诊断方法，包括将本发明的适体与有可能包括血管性血友病因子、血管性血友病因子A1区域或其变异体的组合物接触，检测其中有没有血管性血友病因子、血管性血友病因子A1区域或其变异体存在。在某些实施方案中，这种诊断方法在体外使用，而在其他的实施方案中，这种诊断方法在体内使用。

本发明还提供了一种鉴别能够阻断体内的生物功能的适体的方法，包括：

a)制备一种单链核酸的候补混合物；

b)将此候补混合物与全长蛋白质靶分子和全长蛋白质靶分子的一个区域相接触；

c)分离对全长蛋白质靶分子和全长蛋白质靶分子的一个区域具有增加的亲合性的核酸；和

d)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生一种特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物。

在某些实施方案中，鉴别方法进一步包括：

e)将特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物与全长靶分子蛋白质接触；

f)分离对全长靶分子蛋白质具有增加的亲合性的核酸；和

g)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生特异性靶分子富集的适体混合物；

h)将此特异性靶分子富集的适体混合物与蛋白质目标领域接触；

i)分离对蛋白质目标领域具有增加的亲合性的亲合性核酸；和

j)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物。

在某些实施方案中，鉴别方法进一步包括，选择能够体内阻断全长靶分子蛋白质生物功能的适体，同时，在其他的实施方案中，该方法进一步包括选择能够体内阻断靶分子蛋白质目标领域生物功能的适体。在本发明鉴别方法的某些实施方案中，全长靶分子蛋白质来自于第一物种，蛋白质目标领域来自于第二物种。在本发明鉴别方法的进一步实施方案中，该方法进一步包括，选择能与第一和第二物种的蛋白质靶分子结合的适体，优选地，选择一种能够在第一和第二物种体内阻断靶分子蛋白质的生物功能的适体。在本发明鉴别方法的某些实施方案中，全长靶分子蛋白质靶向是血管性血友病因子。在本发明鉴别方法的某些实施方案中，全长靶分子蛋白质靶向是血管性血友病因子，其中，优选选择的适体能够阻断血管性血友病因子调节的血小板凝聚。在某些实施方案中，蛋白质目标领域是血管性血友病因子A1区域。本发明还提供了一种通过本发明鉴别方法鉴别出的适体。

在某些实施方案中，本发明还提供了一种能够特异性结合血管性血友病因子的适体，该适体包括的主要的核酸序列，与选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC1 115(序列号221)，ARC1 172(序列号222)，ARC1 194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281)，ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC1546(序列号317)，ARC1635(序列号319)，ARC1759(序列号318)，ARC1779到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列有至少80％的同源性，特别地至少90％的同源性，更特别地至少95％的同源性。在某些实施方案中，本发明适体的％序列同源性是BLAST序列同源性。

在另一种实施方案中，本发明的适体包括一种具有化学修饰的核酸序列，包括的化学修饰与任何一个选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)所组成的组的核酸序列有至少80％的同源性，特别地90％的同源性，更特别地至少95％的同源性。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种适体，其通过结合血管性血友病因子靶分子调节血管性血友病因子功能，且优选在体内，该适体包括30个邻近的核苷酸序列，该序列与选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC1172(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列的30个邻近的核苷酸同源。在另一种实施方案中，本发明提供了一种适体，优选在体内通过结合血管性血友病因子靶分子调节血管性血友病因子功能，且该适体包括20个邻近的核苷酸序列，该序列与选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列独特区域的20个邻近的核苷酸同源。在另一种实施方案中，本发明提供了一种适体，优选在体内通过结合血管性血友病因子靶分子调节血管性血友病因子功能，且该适体包括8个邻近的核苷酸序列，该序列与选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635(序列号319)，ARC1759(序列号318)，ARC 1779到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列独特区域的8个邻近的核苷酸同源。在另一种实施方案中，本发明提供了一种适体，优选在体内通过结合血管性血友病因子靶分子调节血管性血友病因子功能，且该适体包括4个邻近的核苷酸序列，该序列与选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列独特区域的4个邻近的核苷酸同源。

具体实施方案

以下的描述详细地阐明了本发明的一个或一个以上实施方案的细节。尽管与这里描述的相似或相同的任何材料和方法都可以用于本发明的实现或试验，但是在这里描述的，是优选的方法和材料。通过描述，本发明的其他特点、目的和优势变得清楚明了，除非文中另有指出，否则在说明书中的单数形式还包括复数。除非另有定义，否则，这里使用的所有的科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。如果发生矛盾，则以本说明书的意思为准。

SELEX ^TM 方法

产生适体的合适的方法是图1描述的名为“指数级富集的配体系统进化技术”(“SELEX^TM”)。SELEX^TM过程是一种用于体外核酸分子进化的方法，该方法对靶分子具有高度的特异性结合能力，并在一些文献中有所描述，例如1990年6月11日递交、目前放弃的美国第07/536,428号专利申请，名为″核酸配位体″的美国专利第5,475,096号和名为“核酸配位体”的美国专利第5,270,163号(也参见WO 91/19813)。每个SELEX^TM识别的核酸配位体，即每个适体都是给定的靶子化合物或分子的特异性配位体。SELEX过程的独特依据是，核酸具有足够形成多样的二维和三维结构的能力，且具有足够的化学多功能性，可被其单体利用作为几乎任何化合物的配位体(即，形成特异性结合对)，无论此化合物是单链的还是聚合的。任意大小的分子或组合物可以作为靶分子。

SELEX在起点依赖于一种包括随机序列的大的单链低聚核苷酸文库。低聚核苷酸可以是修饰或未修饰的DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。在某些实施例中，序列库包括100％随机的or部分随机的低聚核苷酸。在其他的实施例中，序列库包括随机的或部分随机的低聚核苷酸，该随机的或部分随机的低聚核苷酸包含与随机序列结合的至少一个固定序列和/或保守序列。在其他的实施例中，序列库包括随机的或部分随机的低聚核苷酸，此随机的或部分随机的低聚核苷酸在其5′和/或3′端包含至少一个固定序列和/或保守序列，在5′和/或3′端可能包括一种被低聚核苷酸序列库中所有分子分享的序列。固定序列是用于预定目的的低聚核苷酸库中常见的序列从而促进克隆和/或测序所需低聚核苷酸，其中常见序列例如下面会描述到的CpG部分、PCR引物杂交地点、RNA聚合酶启动基因序列(例如，T3、T4、T7和SP6)、限制酶切位点或例如多聚腺苷酸或多聚胸腺嘧啶区的均聚序列、催化核心、亲和层析柱选择性结合位点及其他序列。保守序列是除了以前描述到的固定序列之外的序列，被许多结合相同靶分子的适体分享。

基因库的低聚核苷酸优选包括随机序列部分和有效扩增必须的固定序列。通常起始库的低聚核苷酸包括固定的5’和3’末端序列，所述末端序列侧面与30-50个随机核苷的内部区域连接。随机核苷可以通过多种方式生产，包括化学合成和从随机黏附于胞内的核酸中进行大小筛选。在反复筛选/扩增过程之前或过程之中，待测核酸中的序列变异体也可以通过突变的方法引入或增加。

低聚核苷酸的随机序列部分可以是任意长度的，包括核糖核苷和/或脱氧核糖核苷，还可以包括经过修饰的或非天然的核苷或核苷类似物。参加例如美国专利第5,958,691号；美国专利第5,660,985号；美国专利第5,958,691号；美国专利第5,698,687号；美国专利第5,817,635号；美国专利第5,672,695号，和PCT公开文件WO 92/07065。随机低聚核苷酸可由磷酸内酯键连接的核苷通过本领域内已知的固定相低聚核苷酸合成技术合成。参见例如Froehleret al，Nucl.Acid Res.14：5399-5467(1986)和Froehler et al，Tet.Lett.27：5575-5578(1986)。随机低聚核苷酸也可以使用溶液相方法例如三酯合成的方法合成。参见例如Sood et al，Nucl.Acid Res.4：2557(1977)和Hirose et al，Tet.Lett.，28：2449(1978)。典型的合成过程在自动DNA合成仪中进行，产生10¹⁴-10¹⁶个独立的分子，这些分子对于大多数SELEX^TM实验来讲是足够的。在序列设计中足够大的随机序列区域增加了每个合成的分子有可能代表一种独特序列的可能性。

低聚核苷酸的起始文库可以通过DNA合成仪自动化学合成。为了合成随机序列，在每个核酸添加步骤加入全部四种核苷的混合物，允许核苷随机结合。如上所述，在一个实施方案中，随机低聚核苷酸包括全部的随机序列；然而在其他的实施方案中，随机低聚核苷酸包括非随机或部分随机的序列排列。部分随机序列可以通过在每个添加步骤加入不同比率的四种核苷产生。

低聚核苷酸的起始文库可以是RNA也可以是DNA，或者是取代的DNA或RNA。在RNA文库被用作起始文库的情况下，此RNA文库通常由合成的DNA文库产生，随机PCR扩增，然后使用T7 RNA合成酶或修饰的T8 RNA合成酶体外转录DNA文库，最后纯化转录的文库。随后，在有利于结合的条件下，将RNA或DNA文库与靶分子混合，逐级反复结合、分离和扩增，使用相同的筛选计划，从而实质上达到任意希望的结合亲和性和选择性标准。更具体的，以包含核酸起始序列库的混合物为开端，SELEX^TM方法包括如下步骤：(a)在适于结合的情况下将混合物与靶分子接触；(b)从对靶分子有结合特异性的核酸中分离未结合的核酸；(c)解离核酸-靶分子复合物；(d)扩增从核酸-靶分子混合物中解离的核酸，从而产生一种配位体富集的核酸混合物；和(e)在每个循环中重复结合、分离、解离和扩增步骤，从而产生对于靶分子有高特异性、高亲和性的核酸配体。在筛选RNA适体的情况下，SELEX^TM方法进一步包括：(i)在扩增步骤(d)之前，反转录从核酸-靶分子复合物上解离下来的核酸；和(ii)在此过程从新开始前，转录步骤(d)扩增的核酸。

在包含大量可能的序列和结构的核酸混合物的内部，对于给定的靶分子有较大范围的结合亲和性。例如，包括20个随机排列核苷的核酸混合物，可产生4²⁰个可能的候选排列。其中对靶分子具有较高亲和性(较低的解离常数)的核酸最有可能与靶分子结合。分离、解离和扩增之后，可产生富集高结合亲和性候选排列的第二核酸混合物。附加的筛选过程逐渐筛选出最佳配体，直到所得核酸混合物主要由一种或少数几种序列组成。这些序列可以作为纯配体或适体而克隆、测序和分别测定结合亲和性。

重复进行筛选和扩增循环直到获得所需目标。在最常见的情况下，重复循环过程继续筛选/扩增步骤直至结合强度没有明显改善时为止。当样品为大约10¹⁴个不同的核酸种类时通常使用这种方法，当样品为大约10¹⁸个不同的核酸种类时，也可以使用这种方法。通常，核酸适体分子经过5-20轮筛选过程，在一个实施方案中，只在最初的筛选步骤中引入杂质，在整个复制过程的中没有杂质引入。

在一个SELEX^TM实施方案中，筛选过程是非常有效的，能够分离对选择的靶分子有最强结合能力的核酸配体，因此，只需要一步筛选扩增步骤。在例如层析过程中，可能发生这种有效的筛选，在层析过程中，核酸与固定在层析柱上的靶分子的结合能力使层析柱能够有效地筛选分离具有最高亲和性的核酸配体。

在许多情况下，并不一定必须进行重复的SELEX^TM步骤直至确定出单一核酸配体。靶分子特异性核酸配体溶液可能包括一族核酸结构或部分，该核酸结构或部分具有大量反义序列和大量进行取代或添加之后核酸配体对靶分子的亲和性没有明显改变的序列。在完成之前停止SELEX^TM过程，可以确定核酸配体溶液族多数成员的序列。

已知多数核酸存在初级、二级和三级结构。结构或部分大多数属于非沃森克里克型相互作用的结构或部分是指发夹环、相称的和不相称的凸泡、假扭结及大量同类物结合体。大多数已知的情况表明，这种部分能在少于30个核苷的核酸序列中形成。因此，通常优选带有相邻随机片段的SELEX^TM过程起始于包含大约20-50个核苷随机片段的核酸序列，在一些实施方案中，起始于包含大约30-40个核苷随机片段的核酸序列。在一个实施例中，5′-固定：随机：3′-固定的序列包括大约30-50个核苷的随机序列。

核心SELEX^TM方法经过修饰可以实现多种特殊的目的。例如，美国专利第5,707,796号描述的使用SELEX^TM与凝胶电泳相结合的方法筛选具有特殊结构特点的核酸分子，例如弯曲DNA。美国专利第5,763,177号描述了以SELEX^TM为基础的方法，此方法可用于筛选包含光活性基团的核酸配体，此光活性基团具有结合或光交联能力，能够光活化靶分子。美国专利第5,496,938号描述了完成SELEX^TM过程之后，获得改进的核酸配体的方法。美国专利第5,705,337号描述了共价结合配体和靶分子的方法。

SELEX^TM也可以用于获得能够与靶分子上超过1个位点结合的核酸配体，还可以用于获得包括非核酸物质的核酸配体，所述非核酸物质能与靶分子特定位点结合。SELEX^TM提供了一种分离和鉴定核酸配体的方法，所述配体能结合任意可视靶分子，包括大的和小的生物分子，例如核酸结合蛋白和能够与核酸结合作为其生物活性部分的蛋白，以及辅因子和其他小分子。例如美国专利第5,580,737号公开的核酸序列，此核酸序列是通过SELEX^TM鉴定的，能够高亲和性结合咖啡因及其相近的类似物茶碱。

反-SELEX^TM是一种用于改进核酸配体对靶分子特异性的方法，通过去除对一个或一个以上非靶分子物质有交叉反应性的核酸配体起作用。反-SELEX^TM包括以下步骤：(a)制备核酸的候选混合物；(b)使候选混合物与靶分子相接触，其中相对于候补混合物，对靶分子具有增加的亲和性的核酸就有可能从候补混合物的其他成分中分离出来；(c)将具有增加的亲和性的核酸从候补混合物的其他成分中分离出来；(d)从靶分子上将具有增加的亲和性的核酸解离下来；(e)将具有增加的亲和性的核酸与一个或一个以上非靶分子物质相接触，从而除去对非靶分子物质具有特异亲和性的核酸配体；和(f)扩增只对靶分子具有特异亲和性的核酸，产生核酸混合物，该混合物富集了对靶分子具有相对较高亲和性和结合特异性的核酸序列。如上所述，重复进行筛选和扩增的SELEX^TM循环直到获得所需目标产物。

在使用核酸作为治疗剂和疫苗时会遇到一个潜在的问题就是，磷酸二酯形式的低聚核苷酸在表现出所需作用之前，会被体液中胞内和胞外酶很快的降解，所述胞内和胞外酶例如核酸内切酶和核酸外切酶。因此，SELEX^TM方法包括识别包含修饰核苷酸的高亲合性核酸配体，所述修饰核苷酸赋予配体改进的特征，例如改进的体内稳定性或改进的给药特征。这种修饰的例子包括在糖和/或磷酸盐和/或碱基位点处的化学取代。SELEX^TM-识别的包含修饰核苷酸的核酸配体在一些文献中有所描述，例如美国专利第5,660,985号，该专利描述了包含核苷酸衍生物的低聚核苷酸，此核苷酸衍生物在2′核糖位点、5嘧啶位点和8嘌呤位点存在化学修饰；美国专利第5,756,703号描述了包含不同的2′-修饰嘧啶的低聚核苷酸；和美国专利第5,580,737号，该专利描述了包含一种或一种以上修饰核苷酸的高特异性核酸配体，其中修饰核苷酸被2′-氨基(2′-NH₂)、2′-氟代(2′-F)和/或2′-OMe取代。

本发明构思之内的核酸配体的修饰包括但不局限于，提供其他的化学基团，为核酸配体的碱基或整个核酸配体引入额外的电荷、极性、疏水性、氢键作用、静电相互作用、和流变性。产生能抵抗核酸酶的低聚核苷酸的修饰还可以包括一种或一种以上核苷酸间连接键取代、改变的糖、改变的碱基或其结合。这些修饰包括但不局限于2′-位点的糖基修饰，5-位点的嘧啶修饰，8-位点的嘌呤修饰，外环胺修饰，4-硫代尿嘌呤取代，5-溴代或5-碘代尿嘧啶取代，骨架修饰，硫代磷酸酯或磷酸烷基酯修饰，甲基化和罕见的碱基对结合例如等基线异胞嘧啶衍生物和异胍衍生物。修饰还可以包括3′和5′修饰例如封端。

在一个实施方案中，提供了低聚核苷酸，其中P(O)O基团被P(O)S(″硫代″)，P(S)S(″二硫代″)，P(O)NR2(″酰胺化″)，P(O)R，P(O)OR′，CO或CH₂(″formacetal″)或3′-氨基(-NH-CH₂-CH₂-)，其中每个R或R′分别是H或取代的或未被取代的烷基。连接体基团可以与相邻的核苷酸通过-O-，-N-，或-S-连接体相连。不是所有的低聚核苷酸内的连接体都是一样的。在经过一种或多种硫原子取代的磷酸二酯键中，这里使用的术语硫代磷酸酯包括一种或多种非桥氧原子。

在进一步实施方案中，低聚核苷酸包括修饰的糖基团，例如一个或一个以上羟基被卤素、脂肪基取代或功能化为醚或胺。在一个实施方案中，2′-位点的呋喃残基被O-甲基、O-烷基、O-丙烯基、S-烷基、S-丙烯基或卤素基团取代。文献，例如Sproat，et al.，Nucl.Acid Res.19：733-738(1991)；Gotten，et al，Nucl.Acid Res.19：2629-2635(1991)；和Hobbs，et al，Biochemistry 12：5138-5145(1973)描述了2′-修饰的糖的合成方法。其他的修饰是本领域内普通技术人员已知的。这种修饰可能是预SELEX^TM过程修饰或后SELEX^TM过程修饰(先前识别的未修饰配体的修饰)，或者这种修饰可能通过SELEX^TM过程引入。

预-SELEX^TM过程修饰或通过SELEX^TM过程引入的修饰产生的核酸配体，该核酸配体既具有对其SELEX^TM靶分子的特异性也具有改进的稳定性，例如体内稳定性。核酸配体的后-SELEX^TM过程修饰可以产生改进的稳定性，例如，体内稳定性，且对核酸配体的结合力没有不利影响。

SELEX^TM方法包括将所选择的低聚核苷酸与另外选择的低聚核苷酸和非低聚核苷酸功能单元相结合，如在美国专利第5,637,459号和美国专利第5,683,867号所描述的一样。SELEX^TM方法进一步包括，在诊断剂或治疗剂复合物中，将选择的核酸配体与亲脂性或非免疫原性高分子化合物结合，如美国专利第6,011,020号、美国专利第6,051,698和PCT公开的WO 98/18480中所描述的一样。这些专利和申请教导了将宽范围内的形式或其他性质，与低聚核苷酸的有效的扩增和复制性质的结合，以及与其他分子的理想性质的结合。

核酸配体通过SELEX^TM方法识别小的柔性肽的方法也进行了研究。小肽具有柔性结构，且通常以多重构象体平衡的形式存在于溶液中，因此起初认为，由于在与柔性肽结合时会有构象熵损失，所以适体的结合亲和性可能受到限制。然而，美国专利第5,648,214号论证了核酸配体在溶液中对小肽的识别可能性，其中识别了一种对P物质具有高亲合性的RNA核酸配体，所述P物质是一种具有11个氨基酸的肽。

如这里所述，对靶分子具有特异性和结合亲合性的本发明适体一般通过SELEX^TM过程筛选。然后，作为SELEX^TM过程的一部分，筛选的与靶分子结合的序列被可操作的最小化，从而确定具有所需结合亲合性的最小序列。筛选的适体序列和/或最小化适体序列通过进行序列随机诱变或直接诱变进行可操作的优化从而增加结合亲合性，或作为选择，确定在序列中那个位点对于结合活性是必不可少的。例如，″掺杂重筛选″过程可能用来研究适体内部的序列要求。在掺杂重筛选过程中，对合成并且退化的序列库进行筛选，其中此序列库是根据单一序列设计的。野生型核苷酸的退化水平通常在70％到85％之间变化。通常，按照掺杂重筛选过程可以观察到中性突变，但有时序列变化可以改进序列亲合性。另外，可以对与修饰序列结合的序列进行筛选过程，从而稳定适体分子，抵抗在体内的退化过程。

2’修饰的SELEX ^TM

为了使适体适合于用作治疗剂，优选通过廉价的合成方法合成该适体，并使其在体内具有安全性和稳定性。由于对核酸酶的降解作用敏感，野生型RNA和DNA适体在体内一般不稳定。如果需要的话，可以通过在2′-位点结合修饰基团来极大地增加对核酸酶降解作用的耐受性。

2′-氟代和2′-氨基基团已经成功地从随后筛选出的适体中引入低聚核苷酸文库。然而这些修饰极大地增加了合成适体产物的成本，并且，在某些情况下可能引起安全性考虑，这是由于，修饰的核苷酸可能通过修饰低聚核苷酸的降解作用和随后的此核苷酸作为DNA合成底物的使用，再循环进入宿主DNA之内。

如同在某些实施方案中所提供的，包含2′-O-甲基(″2′-OMe)核苷酸的适体能够克服多种缺陷。包含2’-OMe的低聚核苷酸是具有核酸酶-耐受性的，且其合成过程是廉价的。虽然2′-OMe核苷酸在生物系统中是普遍存在的，但在生理条件下，天然的聚合酶不将2′-OMe NTPs作为底物结合，因此无需考虑2′-OMe核苷酸进入宿主DNA之内再循环的安全性。例如，在2002年12月3日递交的美国临时专利申请第60/430,761号、2003年7月15号递交的美国临时专利申请第60/487,474号、2003年11月4号递交的美国临时专利申请第60/517,039号、2003年12月3日递交的美国专利申请第10/729,581号、2004年6月21号递交的名为″2′-OMe取代的核酸体外筛选方法″的美国专利申请第10/873,856号和2005年6月30日递交的名为“用于生产包含全2′-修饰的核酸转录产物的改进的材料和方法”美国临时专利申请第60/696,295号中，描述了用于产生T-修饰的适体的SELEX^TM方法，这里提到的每篇文献通过在此引证而全文并入本文。

本发明包括一种能结合血管性血友病因子并调节其功能的适体，所述血管性血友病因子包含修饰的核苷酸(例如，在2′位点具有修饰的核苷酸)，从而产生比未修饰的低聚核苷酸更稳定的低聚核苷酸，对酶催化降解和化学降解以及热降解和物理降解稳定。虽然在个别的文献中存在过包含2′-OMe的适体的例子(参见，例如，Ruckman et al.，J.Biol.Chem，1998273，20556-20567-695)，但这些适体是通过体外筛选修饰转录产物文库而生产的，其中修饰的转录产物的C和U残基是2′-氟代(2′-F)的，A和G残基是2′-OH化的。一旦识别到功能性序列，就试验每个A和G残基对2′-OMe取代的耐受性，之后重合成适体，使其具有耐受2′-OMe取代的A和G残基都为2′-OMe残基。虽然平均有大约20％的例外，但大部分通过这种两步方式产生的适体A和G残基能够耐受2′-OMe残基取代。因此，使用这种方法产生的适体往往包含二到四个2′-OH残基，其结果是，合成方法的稳定性与合成成本达到一种综合平衡的状态。将修饰的核苷酸引入转录反应，以该反应产生被稳定的低聚核苷酸以用于低聚核苷酸文库，通过SELEX^TM方法(和/或其任何变型及改进方法，包括本文中所描述的)从该文库中筛选和富集适体，本发明的方法就省去了对筛选的适体低聚核苷酸进行稳定化的必要(例如，通过修饰的核苷酸的对低聚核苷酸进行再合成)。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包括ATP，GTP，CTP，TTP，和UTP核苷2′-OH，2′-F₃，2′-脱氧，和2′-OMe修饰结合体的适体。在其他的实施方案中，本发明提供了包括ATP，GTP，CTP，TTP，和UTP核苷2′OH，2′-F，2′-脱氧，2′OMe，2′-NH₂，和2′-甲氧基乙基修饰结合体的适体。在其他的实施方案中，本发明提供了包括56种ATP，GTP，CTP，TTP和UTP核苷2′-OH、2′-F，2′-脱氧，2′OMe，2′-NH₂和2′-甲氧基乙基修饰结合体的适体。

本发明某些实施方案中2′-修饰的适体是通过使用修饰的聚合酶产生的，例如，经过修饰的T7聚合酶，与野生型聚合酶相比，此修饰的T7聚合酶对在2′-位置具有大量呋喃糖取代的修饰核苷具有较高的结合速率。例如，639位的酪氨酸残基变为苯丙氨酸残基的单一突变体T7聚合酶(Y639)可以方便的使用2′脱氧，2′氨基-，和2′氟代-核苷三磷酸(NTPs)作为底物，在许多应用过程中广泛地用于修饰的RNAs合成。然而，据报道，此突变体T7聚合酶不能容易的使用(即，结合)具有大量2′取代物的NTPs，例如2′-OMe或2′-叠氮(N₃)取代。为了结合具有大量2′取代物的NTPs，报道公开了一种T7聚合酶双突变体(Y639F/H784A)，此T7聚合酶双突变体在具有Y639突变之外，其784位的组氨酸变为丙氨酸残基，在有限的情况下，此T7聚合酶双突变用于结合修饰的嘧啶NTPs。参见Padilla，R.and Sousa，R.，Nucleic Acids Res.，2002，30(24)：138。在有限的情况下，使用Y639F/H784A/K378R突变体T7 RNA聚合酶来结合修饰的嘌呤或嘧啶NTPs，例如，2’-OMeNTPs，但是用于转录的话，需要一种2’-OH GTP刺突。参见Burmeister et.al.，Chemistry and Biology，2005，12：25-33。文献Padilla et ah，Nucleic Acids Research，2002，30：138报道了784位组氨酸被丙氨酸残基取代的单一突变T7聚合酶(H784)。在Y639F/H784A双突变和H784A单一突变T7聚合酶中，一个小氨基酸残基，例如丙氨酸的改变能够结合大量核苷底物，例如，2′-O-甲基取代的核苷。参见Chelliserry，K.and Ellington，A.D.，NatureBiotech，2004，9：1155-60。也报道了其他的T7聚合酶，这些聚合酶在T7RNA聚合酶活性位点具有突变，更易于结合大量2’-修饰的底物，例如，639位酪氨酸残基变为亮氨酸的T7聚合酶单一突变体(Y639L)。然而，这种突变在增加底物特异性的同时往往牺牲了一部分结合活性，从而导致较低的转录产量。参见Padilla Rand Sousa，R.，Nucleic Acids Res.，1999，27(6)：1561。

总体而言，现已发现，在这里公开的条件下，Y639单一突变体可以用于结合除了GTP之外所有2’-OMe取代的NTPs，Y639F/H784A，Y639F/H784A/K378R，Y639L/H784A，和Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶可以用于结合包括GTP在内的所有2’-OMe取代的NTPs。当在这里公开的条件下使用时，可期望的是H784A单一突变体具有和Y639F和Y639F/H784A相似的性质。

2’-修饰的低聚核苷酸可以全部由修饰的核苷合成，或具有一种修饰核苷子集。所有的核苷都可以是被相同的修饰体修饰的。所有的核苷也可以是被不同的修饰体修饰的，例如，包含同一碱基的所有核苷可以含有一个类型的修饰，而含有其他碱基的核苷可以含有不同类型的修饰。所有嘌呤核苷可以含有一个类型的修饰(或未修饰)，而所有嘧啶核苷含有其他的、不同类型的修饰(或未修饰)。这样，通过任意修饰的结合，包括例如核糖核苷(2’-OH)、脱氧核糖核苷(2’-脱氧)、2’-F和2’-OMe核苷的结合，可以产生转录产物或转录产物文库。包含2’-OMe U和C和2’-OH A和G的转录混合物被叫做“rRmY”混合物，从其中筛选的适体叫做“rRmY”适体。包含脱氧A和G和2’-OMe U和C的转录混合物被叫做“dRmY”混合物，从其中筛选的适体叫做“dRmY”适体。包含2’-OMe A、U和C和2’-OH G的转录混合物被叫做“rGmH”混合物，从其中筛选的适体叫做“rGmH”适体。交替包含2’-OMeA、C、U和G及2’-OMe A、U和C和2’-F G的转录混合物被叫做“交替混合物”，从其中筛选的适体叫做“交替混合物”适体。包含2’-OMe A、C、U和G且其中高达10％的G是核糖核酸的转录混合物被叫做“r/mGmH”混合物，从其中筛选的适体叫做“r/mGmH”适体。包含2’-OMe A、U和C和2’-F G的转录混合物被叫做“fGmH”混合物，从其中筛选的适体叫做“fGmH”适体。包含2’-OMe A、U和C和脱氧G的转录混合物被叫做“dGmH”混合物，从其中筛选的适体叫做“dGmH”适体。包含脱氧A和2’-OMe C、G和U的转录混合物被叫做“dAmB”混合物，从其中筛选的适体叫做“dAmB”适体，包含所有2’-OH核苷的转录混合物叫做“rN”混合物，从其中筛选的适体叫做“rN”、“rRrY”或“RNA”适体。包含2’-OH三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷及脱氧三磷酸胞苷和三磷酸胸苷的转录混合物叫做rRdY混合物，从其中筛选的适体叫做“rRdY”适体。″mRmY″适体是除了起始核苷为2’-氢氧化核苷之外，只包含2′-OMe核苷的适体。

一种优选地实施方案包括2′OH，2′-脱氧和2’-OMe核苷的任意结合。其他的实施方案包括2’-脱氧和2’-OMe核苷的任意结合。另外的实施方案包括2’-脱氧和2’-OMe核苷的任意结合，其中嘧啶是2’-OMe修饰的(例如dRmY，mRmY或dGmH)。

本发明适体中修饰核苷的引入可以在筛选过程之前完成(例如，预-SELEX^TM修饰作用)。作为选择，经过预-SELEX^TM修饰作用引入修饰核苷的本发明适体可以被后-SELEX^TM修饰过程进一步修饰(即，预-SELEX^TM修饰作用之后的后-SELEX^TM修饰作用)。预-SELEX^TM修饰作用产生的修饰核酸配体对SELEX^TM靶分子具有特异性和改进的体内稳定性。后-SELEX ^TM修饰作用，即修饰作用(例如对具有预-SELEX^TM修饰作用引入核苷的前面鉴定的配体进行切段、消除、取代或附加核酸修饰)可以进一步改善体内稳定性，且不会负面影响具有预-SELEX^TM修饰作用引入核苷的核酸配体的结合能力。

在聚合酶接受2’-修饰的NTPs的情况下，为了产生2’-修饰的(例如2’-OMe)RNA转录产物，可以使用Y693F、Y693F/K378R、Y693F/H784A、Y693F/H784A/K378R、Y693L/H784A、Y693L/H784A/K378R Y639L或Y639L/K378R突变体T7RNA聚合酶。优选的聚合酶是Y639L/H784A突变体T7RNA聚合酶。另一种优选的聚合酶是Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶。其他的聚合酶，尤其是对大量2’-底物具有高耐受力的聚合酶也可以用于本发明。当在这里公开的条件下用于直接模版聚合时，Y639L/H784A或Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶可以用于引入所有2′-OMe NTPs，包括GTP，且其转录产量高于使用Y639F，Y639F/K378R，Y639F/H784A，Y639F/H784A/K378R，Y639L或Y639L/K378R突变体T7RNA聚合酶所能达到的转录产量。Y639L/H784A和Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA可以，但并不是必须与2’-OH GTP一起使用，从而达到高产量2’-修饰的低聚核苷酸，例如，包括2’-OMe修饰的低聚核苷酸。

已经确定了一些对这里公开的方法所使用的转录条件十分重要的因素。例如，当在DNA转录模版的5’末端引入一种引导序列时，可以观察到修饰转录产物的产量有所增加。此前导序列通常长度为6-15个核苷，可以全部由嘌呤组成，或者为嘌呤或嘧啶核苷的混合物。

转录过程可以分为两个阶段：第一阶段是开始，在此阶段，将一种NTP加入到GTP(或其他取代的鸟嘌呤)的3’-氢氧基末端，从而产生一种双核苷，随后，此双核苷延长大约10-12个核苷；第二阶段是延长，在此阶段，在第一阶段的基础上进行转录过程，加入大约10-12个核苷。已经发现，将少量2’-OH GTP加入包含过量2’-OMe GTP的转录混合物中，足以使聚合酶使用2’-OH GTP起始转录过程，但一旦转录过程进入延长阶段，由于2’-OMe GTP与2’-OH GTP的区别越来越不明显，相对2’-OH GTP来讲过量的2’-OMe GTP导致被引入的主要是2’-OMe GTP。

在将2’-OMe取代核苷引入转录过程中的其他重要因素是转录混合物中二价镁离子和二价锰离子的使用。已经发现，不同的氯化镁和氯化锰的结合浓度能够影响2’-O-甲基化转录产物的产量，最优化的氯化镁和氯化锰的浓度依赖于转录反应混合物中复合二价金属离子的NTPs的浓度。为了获得最高产量的最大2’-O-甲基化转录产物(即，所有的A、C和U以及大约90％的G是2’-OMe化的核苷)，当每种NTP的浓度为0.5mM时，优选大约5mM的氯化镁和1.5mM的氯化锰。当每种NTP的浓度为1.0mM时，优选大约6.5mM的氯化镁和2.0mM的氯化锰。当每种NTP的浓度为2.0mM时，优选大约9.5mM的氯化镁和3.0mM的氯化锰。在任意情况下，在这些浓度高达两倍的偏差范围内，仍能得到足够量的修饰转录产物。

用GMP或鸟嘌呤、或其他的非2′-OMe非三磷酸盐引发的转录过程是同样重要的。其作用源自聚合酶对起始核苷的特异性。作为结果，用这种方式产生的所有转录产物的5′-末端核苷可能都是2′-OH G。优选的GMP(或鸟嘌呤)浓度是0.5mM，更优选1mM。此外，已经发现在转录反应中，包括的PEG，优选PEG-8000对于修饰核苷的最佳化引入是有帮助的。

为了将2′-OMe ATP(100％)，UTP(100％)，CTP(100％)和GTP(～90％)(″r/mGmH″)最大的引入转录产物中，优选下列条件：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800010％(w/v)，Triton X-1000.01％(w/v)，MgCl₂ 5mM(当每种2′-OMe NTP的浓度都是1.0mM时，MgCl₂为6.5mM)，MnCl₂ 1.5mM(当每种2′-OMe NTP的浓度都是1.0mM时，MnCl₂为2.0mM)，2′-OMe NTP(每种)500μM(更优选为1.0mM)，2′-OH GTP 30μM，2′-OH GMP500μM，pH值为7.5，Y639F/H784A T7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml，且全部为嘌呤的前导序列长度至少为8个核苷。这里使用的一单位Y639F/H784A突变体T7RNA聚合酶(或任何其它在此叙述的突变体T7RNA聚合酶)的定义是，在r/mGmH条件下，向转录产物中引入1nmole 2′-OMeNTPs所需的酶的量。这里使用的一单位无机焦磷酸酶的定义是，在25℃，pH为7.2的条件下，每分钟释放1.0摩尔无机正磷酸盐所需的酶的量。

为了将2′-OMe ATP，UTP和CTP(″rGmH″)最大的引入(100％)转录产物中，优选下列条件：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl₂5mM(当每种2′-OMe NTP的浓度都是2.0mM时，MgCl₂为9.5mM)，MnCl₂ 1.5mM(当每种2′-OMe NTP的浓度都是2.0mM时，MnCl₂为3.0mM)，2′-OMe NTP(每种)500μM(更优选为2.0mM)，pH值为7.5，Y639F T7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml，且全部为嘌呤的前导序列长度至少为8个核苷。

为了将2′-OMe ATP(100％)，2′-OMe UTP(100％)，2′-OMe CTP(100％)和2′-OMe GTP(100％)(″mRmY″)最大的引入转录产物中，优选下列条件：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800010％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl₂ 8mM，MnCl₂ 2.5mM，2′-OMe NTP(每种)1.5mM，2′-OH GMP 1mM，pH值为7.5，Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml，和一种在衍生的转录条件下增加转录产量的前导序列。在一个实施方案中，前导序列是全部为嘌呤的前导序列。在另一个实施方案中，前导序列是嘌呤和嘧啶的混合物。这里使用的一单位无机焦磷酸酶的定义是，在25℃，pH为7.2的条件下，每分钟释放1.0摩尔无机正磷酸盐所需的酶的量。

为了将2′-OMe UTP和CTP(″rRmY″)最大的引入(100％)转录产物中，优选下列条件：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl₂5mM(当每种2′-OMe NTP的浓度都是2.0mM时，MgCl₂为9.5mM)，MnCl₂ 1.5mM(当每种2′-OMe NTP的浓度都是2.0mM时，MnCl₂为3.0mM)，2′-OMe NTP(每种)500μM(更优选为2.0mM)，pH值为7.5，Y639F/H784A T7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml，且全部为嘌呤的前导序列长度至少为8个核苷。

为了将2′-OMe脱氧ATP和GTP及2′-OMe UTP和CTP(″dRmY″)最大的引入(100％)转录产物中，优选下列条件：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，精胺2mM，亚精胺2mM，PEG-800010％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl₂ 9.5mM，MnCl₂ 3.0mM，2′-OMe NTP(每种)2.0mM，pH值为7.5，Y639F T7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml，且全部为嘌呤的前导序列长度至少为8个核苷。

为了将2′-OMe ATP，UTP和CTP及2′-F GTP(″fGmH″)最大的引入(100％)转录产物中，优选下列条件：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800010％(w/v)，Triton X-1000.01％(w/v)，MgCl₂ 9.5mM，MnCl₂ 3.0mM，2′-OMe NTP(每种)2.0mM，pH值为7.5，Y639F T7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml，且全部为嘌呤的前导序列长度至少为8个核苷。

为了将2′-OMe脱氧ATP及2′-OMe UTP，GTP和CTP(″dAmB″)最大的引入(100％)转录产物中，优选下列条件：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，TritonX-100 0.01％(w/v)，MgCl₂ 9.5mM，MnCl₂ 3.0mM，2′-OMe NTP(每种)2.0mM，pH值为7.5，Y639F T7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml，且全部为嘌呤的前导序列长度至少为8个核苷。

对于上述每种情况，(a)转录优选在大约20℃到大约50℃，优选从大约30℃到45℃更优选在大约37℃温度下进行至少两小时，和(b)使用50-300nM的双链DNA转录模板(在第一轮，使用200nM模板来增加多样性(对于dRmY转录过程使用300nM模板))，对于随后几轮，使用大约50nM的双链DNA转录模板，在这里描述的条件下，进行1/10稀释的优化PCR反应。优选的DNA转录模板在下面有所描述(在全部是2′-OMe条件下进行ARC 254和ARC 256，在rRmY条件下进行ARC 255转录)。

序列号：1

序列号：2

序列号：3

在本发明的rN转录条件下，转录反应混合物包括2′-OH三磷酸腺苷(ATP)、2′-OH三磷酸鸟苷(GTP)、2′-OH三磷酸胞苷(CTP)和2′-OH三磷酸尿苷(UTP)。使用本发明rN转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2′-OH腺嘌呤、2′-OH鸟嘌呤、2′-OH胞嘧啶和2′-OH尿嘧啶。在rN转录作用的一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2′-OH腺嘌呤，至少80％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，至少80％的胞嘧啶核苷是2′-OH胞嘧啶，至少80％的尿嘧啶核苷是2′-OH尿嘧啶。在rN转录作用的一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90％的腺嘌呤核苷是2′-OH腺嘌呤，至少90％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，至少90％的胞嘧啶核苷是2′-OH胞嘧啶，至少90％的尿嘧啶核苷是2′-OH尿嘧啶。在rN转录作用的一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100％的腺嘌呤核苷是2′-OH腺嘌呤，100％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，100％的胞嘧啶核苷是2′-OH胞嘧啶，100％的尿嘧啶核苷是2′-OH尿嘧啶。

在本发明rRmY转录条件下，转录反应混合物包括2′-OH三磷酸腺苷、2′-OH三磷酸鸟苷、2′-OH三磷酸胞苷和2′-OH三磷酸尿苷。使用本发明rRmY转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2′-OH腺嘌呤、2′-OH鸟嘌呤、2′-OMe胞嘧啶和2′-OMe尿嘧啶。在一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2′-OH腺嘌呤，至少80％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，至少80％的胞嘧啶核苷是2′-OMe胞嘧啶，至少80％的尿嘧啶核苷是2′-OMe尿嘧啶。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90％的腺嘌呤核苷是2′-OH腺嘌呤，至少90％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，至少90％的胞嘧啶核苷是2′-OMe胞嘧啶，至少90％的尿嘧啶核苷是2′-OMe尿嘧啶。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100％的腺嘌呤核苷是2′-OH腺嘌呤，100％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，100％的胞嘧啶核苷是2′-OMe胞嘧啶，100％的尿嘧啶核苷是2′-OMe尿嘧啶。

在本发明dRmY转录条件下，转录反应混合物包括2′-脱氧三磷酸腺苷、2′-脱氧三磷酸鸟苷、2′-O-甲基三磷酸胞苷和2′-O-甲基三磷酸尿苷。使用本发明dRmY转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2′-脱氧腺嘌呤、2′-脱氧鸟嘌呤、2′-O-甲基胞嘧啶和2′-O-甲基尿嘧啶。在一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2′-脱氧腺嘌呤，至少80％的鸟嘌呤核苷是2′-脱氧鸟嘌呤，至少80％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少80％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90％的腺嘌呤核苷是2′-脱氧腺嘌呤，至少90％的鸟嘌呤核苷是2′-脱氧鸟嘌呤，至少90％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少90％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100％的腺嘌呤核苷是2′-脱氧腺嘌呤，100％的鸟嘌呤核苷是2′-脱氧鸟嘌呤，100％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，100％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶。

在本发明rGmH转录条件下，转录反应混合物包括2′-OH三磷酸鸟苷、2′-O-甲基三磷酸胞苷、2′-O-甲基三磷酸尿苷和2′-O-甲基三磷酸腺苷。使用本发明rGmH转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2′-OH鸟嘌呤、2′-O-甲基胞嘧啶、2′-O-甲基尿嘧啶和2′-O-甲基腺嘌呤。在一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，至少80％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少80％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，至少80％的腺嘌呤核苷是2′-O-甲基腺嘌呤。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，至少90％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少90％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，至少90％的腺嘌呤核苷是2′-O-甲基腺嘌呤。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，100％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，100％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，100％的腺嘌呤核苷是2′-O-甲基腺嘌呤。

在本发明r/mGmH转录条件下，转录反应混合物包括2′-O-甲基三磷酸腺苷、2′-O-甲基三磷酸胞苷、2′-O-甲基三磷酸鸟苷、2′-O-甲基三磷酸尿苷和2′-OH三磷酸鸟苷。使用本发明r/mGmH转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2′-O-甲基腺嘌呤、2′-O-甲基胞嘧啶、2′-O-甲基鸟嘌呤、2′-O-甲基尿嘧啶，其中，鸟嘌呤核苷至多包括大约10％的2′-OH鸟嘌呤。在一种优选实施方案中，本发明r/mGmH产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2′-O-甲基腺嘌呤，至少80％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少80％的鸟嘌呤核苷是2′-O-甲基鸟嘌呤，至少80％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，且不超过10％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90％的腺嘌呤核苷是2′-O-甲基腺嘌呤，至少90％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少90％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤，至少90％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，且不超过10％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100％的腺嘌呤核苷是2′-O-甲基腺嘌呤，100％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，90％的鸟嘌呤核苷是2′-O-甲基鸟嘌呤，100％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，且不超过10％的鸟嘌呤核苷是2′-OH鸟嘌呤。

在本发明mRmY转录条件下，转录反应混合物只包括2′-O-甲基三磷酸腺苷、2′-O-甲基三磷酸胞苷、2′-O-甲基三磷酸鸟苷和2′-O-甲基三磷酸尿苷。使用本发明mRmY转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100％的腺嘌呤核苷是2′-O-甲基腺嘌呤，100％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，100％的腺嘌呤核苷是2′-O-甲基腺嘌呤，100％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶。

在本发明fGmH转录条件下，转录反应混合物包括2′-O-甲基三磷酸腺苷、2′-O-甲基三磷酸尿苷、2′-O-甲基三磷酸胞苷和2′-F三磷酸鸟苷。使用本发明fGmH转录条件生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2′-O-甲基腺嘌呤、2′-O-甲基尿嘧啶、2′-O-甲基胞嘧啶和2′-F鸟嘌呤。在一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2′-O-Me腺嘌呤，至少80％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，至少80％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少80％的鸟嘌呤核苷是2′-F鸟嘌呤。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90％的腺嘌呤核苷是2′-O-Me腺嘌呤，至少90％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，至少90％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少90％的鸟嘌呤核苷是2′-F鸟嘌呤。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100％的腺嘌呤核苷是2′-O-Me腺嘌呤，100％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基尿嘧啶，100％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，100％的鸟嘌呤核苷是2′-F鸟嘌呤。

在本发明dAmB转录条件下，转录反应混合物包括2′-脱氧三磷酸腺苷、2′-O-甲基三磷酸胞苷、2′-O-甲基三磷酸鸟苷和2′-O-甲基三磷酸尿苷。使用本发明dAmB转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2′-脱氧腺嘌呤、2′-O-甲基胞嘧啶、2′-O-甲基鸟嘌呤和2′-O-甲基尿嘧啶。在一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2′-脱氧腺嘌呤，至少80％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少80％的鸟嘌呤核苷是2′-O-甲基鸟嘌呤，至少80％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基-尿嘧啶。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90％的腺嘌呤核苷是2′-脱氧腺嘌呤，至少90％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，至少90％的鸟嘌呤核苷是2′-O-甲基鸟嘌呤，至少90％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基-尿嘧啶。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100％的腺嘌呤核苷是2′-脱氧腺嘌呤，100％的胞嘧啶核苷是2′-O-甲基胞嘧啶，100％的鸟嘌呤核苷是2′-O-甲基鸟嘌呤，100％的尿嘧啶核苷是2′-O-甲基-尿嘧啶。

在每种情况下，转录产物随后进入SELEX^TM过程从而鉴定适体，和/或从而确定对给定的靶分子有特异性结合能力的保藏序列。所得序列已经经过部分稳定化过程，从后SELEX^TM过程中除去这一过程从而得到优化的适体序列和高度稳定化的适体。2′-OMeSELEX过程的另一个优点是，所得序列可能含有序列所需的少量2′-OH核苷，也可能不含有。2′OH核酸残余物可以通过进行后SELEX^TM修饰而除去。

如下所述，在除了上述优化的条件之外的条件下，获得的全部引入2’取代核酸的转录产量比较低，但仍然有效。例如，上述转录条件的改变包括：

HEPES缓冲液浓度可以从0M变化到1M。本发明还预计到可以使用其他pKa值在5-10之间的缓冲试剂，包括，例如三-羟甲基-氨基甲烷。

DTT浓度可以在0-400nM范围内。本发明的方法还提供了其他还原剂的使用，包括，例如，巯基乙醇。

亚精胺和/或精胺的浓度可以在0-20nM范围内。

PEG-8000的浓度在0-50％(w/V)范围内。本发明的方法还提供了其他亲水性聚合物的使用，包括例如，其他分子量的PEG或其他的聚烯基二醇。

Triton X-100的浓度在0-0.1％(w/v)范围内。本发明方法还提供了其他的非离子型去污剂的使用，包括例如，其他的去污剂包括其他的Triton X去污剂。

MgCl₂的浓度在0.5mM到50mM范围内。MnCl₂的浓度在0.15mM到15mM范围内。MgCl₂和MnCl₂必须以描述的范围存在，在优选地实施方案中，MgCl₂∶MnCl₂存在的浓度比大约为10∶3，优选的，该比率为大约3-5∶1，更优选地，该比率为大约3-4∶1。

2’-OMe NTP的浓度(每种NTP)在5μM到5mM范围内。

2′-OH GTP的浓度在0μM到300μM范围内。

2′-OH GMP的浓度在0到5mM范围内。

pH值在6-9的范围内。本发明的方法可以在大多数能够结合修饰核苷的聚合酶具有活性的pH范围内实现。另外，在转录反应条件下，本发明的方法提供了螯合剂的任选使用，螯合剂包括，例如，EDTA，EGTA，和DTT。

适体药物化学

适体药物化学是一种适体改进技术，在此技术中能够化学合成一系列适体变异体。通过引入单一的取代基与母适体相区别，同时，变异体之间由于取代的位置不同而不同。随后，在这些变异体之间，变异体与母适体之间进行比较。其性质的改进具有非常重要的影响，这表明只需要引入一种单一取代基，就可以达到某种特殊的治疗剂标准。

作为选择，从单一变异体系列获得的信息可以用来设计进一步的变异体系列，在此进一步的变异体系列中，同时引入了一种以上的取代基。在一个设计方案中，排列所有的单一取代基变异体，选择最上面的4种单一取代变异体，合成并分析这4种变异体的全部二倍(6)、三倍(4)和4倍(1)结合体。在第二设计方案中，将最佳单一取代变异体作为新的母体，合成并分析包括这种最高排列单一取代突变体的所有可能的双取代变异体。也可以使用其他的方案，这些方案可以重复使用使取代基的数量逐步增加，同时，继续鉴定这些进一步改进的变异体。

适体药物化学尤其可以用作研究将取代基局部引入，而不是整体引入的方法。由于适体是从转录过程产生的文库中制得的，在SELEX^TM过程中任何取代基的引入都必须是整体引入。例如，如果需要将硫代磷酸键引入核苷中，则只能在每个A(或每个G、C、T、U等等)位点都引入(整体取代)。只需要在某些A位点(或每个G、C、T、U等等)引入硫代磷酸键(局部取代)而其他的A位点不耐受此取代的适体，不能通过这一过程方便的制得。

适体药物化学过程可以利用多种取代基，这些取代基只受到作为固相合成试剂的生成能力和将其引入低聚体合成方案的能力的限制。此过程当然不仅限于核苷。适体药物化学方案可能包括能够引入空间位阻、疏水性、亲水性、亲脂性、疏油性、正电荷、负电荷、中性电荷、两性离子、极性、抗核酸酶能力、构象刚性、构象柔性、蛋白结合性质、聚集作用等等的取代基。适体药物化学方案可能包括碱基修饰、糖修饰或磷酸二酯键修饰。

当考虑用于治疗剂适体领域可能会产生有益作用的取代基的种类时，引入的取代基需要属于下列类别的一种或一种以上：

(1)在体内已经存在的取代基，例如，2’-脱氧、2’-核、2′-O-甲基嘌呤或嘧啶或5-甲基胞嘧啶。

(2)取代基是已经批准的治疗剂的一部分，例如，硫代磷酸键连接的低聚核苷酸。

(3)能够被水解或降解为上述两类中的一类的取代基，例如，甲基膦酸酯连接的低聚核苷酸。

本发明的vWF适体包括这里描述的通过适体药物化学制得的适体。

血管性血友病因子特异性结合适体

本发明的材料包括一系列长度在29到76核苷之间，能特异性结合血管性血友病因子的核酸适体。在一个实施方案中，本发明的材料包括一系列长度在29到76核苷之间，能特异性结合血管性血友病因子的核酸适体，此适体功能性调节，例如，阻断血管性血友病因子在体内和/或细胞基试验中的活性。

这里描述了能够特异性结合和调节血管性血友病因子全长和/或血管性血友病因子A1区域的适体。这些适体提供了一种低毒性、安全和有效的方式来治疗和/或预防心血管疾病或不适。在一个实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防冠状动脉疾病的方法，其中冠状动脉疾病包括任意一种选自动脉血栓症和急性冠状动脉综合症的疾病，例如不稳定心绞痛和心肌梗塞，众所周知，这些疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关。在特殊的实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防冠状动脉疾病的方法，所述疾病包括选自动脉血栓症和急性冠状动脉综合症的疾病，例如不稳定心绞痛和心肌梗塞的任意一种疾病，总所周知，这些疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关，同时，血小板凝聚将流血的副作用减到最小。在另一个实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防外周血管疾病的方法，所述外周血管疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关。在一种特殊的实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防外周血管疾病的方法，总所周知，这些疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关，优选地，同时，血小板凝聚将流血的副作用减到最小。在另一个实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防脑血管疾病的方法，所述疾病包括选自短暂性脑缺血发作、中风和和颈动脉狭窄的任意一种疾病，总所周知，这些疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关，优选地，同时，血小板凝聚将流血的副作用减到最小。进一步讲，在患者进行经皮冠心病介入治疗之前，其间和/或之后，本发明的适体对于在患者体内抑制血管性血友病因子调节的血小板凝聚是有效的，所述经皮冠心病介入治疗包括血管成形术、血栓溶解剂治疗或冠状动脉架桥术。在患者进行冠状动脉架桥术之前、其间和/或之后，本发明的适体对于维持患者体内血管畅通也是有效的。本发明的适体对于治疗正在进行透析的病人也是有效的。本发明的适体还可以有效抑制患者体内血管性血友病因子调节的血栓形成，优选地，同时将流血的副作用减到最少。被治疗的和/或被抑制的血栓可能与发炎反应有关。

在一个实施方案中，用于治疗或诊断过程的血管性血友病因子特异性结合适体选自序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)到ARC 1780和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)由所组成的组。

在另一实施方案中，用于治疗或诊断过程的血管性血友病因子特异性结合适体包括任意一种下述序列：序列号23，序列号44，序列号49，序列号98-100，序列号106，序列号109，序列号114到115，序列号118，序列号127，序列号134，序列号164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号208，和序列号212到214.在有些实施方案中，用于治疗或诊断过程的血管性血友病因子特异性结合适体包括任意一种下述序列：ARC 1029(序列号214)，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)，ARC 1368(序列号291)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)，ARC 1780(序列号321)，ARC1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)。

在下面的实施例1和2中，描述了本发明其他能够结合血管性血友病因子的适体。

这些适体可能包括一些本文所述的修饰，例如，与亲脂性化合物或高分子化合物(例如，PEG)的结合；与修饰核苷的结合和磷酸盐骨架修饰(包括将硫代磷酸盐引入磷酸盐骨架中)。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种分离的、非天然产生的适体，该适体能够结合血管性血友病因子。在另一个实施方案中，本发明的适体调节血管性血友病因子的功能。在另一个实施方案中，本发明的适体抑制血管性血友病因子的功能，而在另一个实施方案中，适体刺激血管性血友病因子的功能。在本发明的另一个实施方案中，适体结合和/或调节血管性血友病因子变异体的功能。如此所述，血管性血友病因子变异体包括与血管性血友病因子具有基本上相同功能的变异体，优选包括基本上相同的结构，和在某些实施方案中，包括的序列与人血管性血友病因子的氨基酸序列具有至少70％的序列同源性、优选至少80％的序列同源性、更优选至少90％的序列同源性、更优选至少95％的序列同源性。

在本发明的另一实施方案中，适体与包括序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115，ARC 1172(序列号222)(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)中任意一个序列的适体具有完全相同的结合血管性血友病因子的能力。在本发明的另一实施方案中，适体与包括序列号11到50，序列号54到94，序列号98到165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115，ARC 1172(序列号222)(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC1635，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)中任意一个序列的适体具有完全相同的结构和完全相同的结合血管性血友病因子的能力。在另一实施方案中，本发明的适体包括一种序列，该序列与序列号11到50，序列号54到94，序列号98到165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-213，ARC 1115，ARC1172(序列号222)(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635，ARC 1759(序列号318)，ARC1779(序列号320)到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)中任意一个序列一致。在另一实施方案中，本发明的适体包括一种序列，该序列与和序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115，ARC 1172(序列号222)(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)中任意一种一致的序列具有至少80％，优选至少90％，在某些实施方案中至少95％的同源性。在另一实施方案中，本发明的适体特异性地结合血管性血友病因子，且包括一种具有30个相邻核苷的序列，此序列与选自序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115，ARC 1172(序列号222)(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC 1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1635，ARC 1759(序列号318)，ARC 1779(序列号320)到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)中的任意一个序列中相邻的30个核苷具有同源型。在另一实施方案中，本发明的适体用作药物组合物中的活性成份。在其他的实施方案中，本发明适体或包括本发明适体的组合物被用于治疗血栓形成性疾病，例如心血管疾病，包括急性冠状动脉综合症；外周动脉疾病；和脑血管病，包括中风。在某些实施方案中，本发明的适体或包括本发明适体的组合物被用于治疗、预防或改善选自原发性血小板减少症、血栓形成性紫斑症(“TTP”)、IIb型血管性血友病、假性血管性血友病，例如周围动脉闭塞性疾病的周围动脉疾病、不稳定型心绞痛、心绞痛、动脉血栓症、动脉硬化、心肌梗塞、急性冠脉综合征、心房颤动、颈动脉狭窄、脑梗塞、脑血栓、缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作。在某些实施方案中，在进行透析、CABG手术、经皮冠心病介入治疗或心脏瓣膜置换术之前/期间/或之后，给药本发明的药物组合物。

在某些实施方案中，本发明的适体治疗剂对于他们的靶分子具有较大的亲合性和特异性，同时，如果适体治疗剂在病人或患者身体内分解的话，能够降低非天然产生的核苷取代带来的有害的副作用。在某些实施方案中，包含本发明适体治疗剂的治疗剂组合物不含有，或含有很小数量的氟化核苷。

本发明的适体可以使用本领域已知的任何低聚核苷酸合成方法合成，所述方法包括固相低聚核苷酸合成技术(参见，例如Froehler et al，Nucl.Acid Res.14：5399-5467(1986)和Froehler et al，Tet.Lett.27：5575-5578(1986))和液相方法，例如三酯合成法(参见，例如Sood et al，Nucl.Acid Res.4：2557(1977)和Hirose et al，Tet.Lett，28：2449(1978))，这两种方法在本领域内，都是已知的。

药物组合物

本发明还包括包含能够结合血管性血友病因子的适体分子的药物组合物。在某些实施方案中，该组合物是与体内应用，且包括有效量的具有药理活性的本发明化合物单体或结合体，和药学上可接受的载体。该化合物如果具有毒性的话，则其在具有很低的毒性时尤其有效。

本发明组合物可以用于治疗或预防一种病状，例如疾病或不适，本发明组合物还可以用于缓解患者体内这些疾病或不适的症状。例如，本发明组合物可以被用于治疗或预防与血小板凝聚作用相关的病状。在某些实施方案中，被治疗、预防或改善的疾病选自：原发性血小板减少症、血栓形成性紫斑症(“TTP”)、IIb型血管性血友病、假性血管性血友病，例如周围动脉闭塞性疾病的周围动脉疾病、不稳定型心绞痛、心绞痛、动脉血栓症、动脉硬化、心肌梗塞、急性冠脉综合征、心房颤动、颈动脉狭窄、脑梗塞、脑血栓、缺血性脑卒中风和短暂性脑缺血发作。在某些实施方案中，在进行透析、CABG手术、经皮冠心病介入治疗或心脏瓣膜置换术之前/期间/或之后，给药本发明的药物组合物。

本发明组合物是有用的，可以用于给药患有或倾向于患有由本发明适体特异性结合的靶分子引起的或与之相关的疾病或不适的患者。

本发明组合物可以在治疗患病病人或患者的方法中使用。所述方法包括，将适体或包括适体的组合物给药病人或患者，该适体可以结合病状中包括的血管性血友病因子，因此，适体与靶分子的结合改变了血管性血友病因子的生理功能，从而起到治疗病状的作用。

患有病状的病人或患者，即可以用本发明所述方法治疗的病人或患者可以是哺乳动物，更优选是脊椎动物，或更优选是人。

在实践过程中，给药一定量的适体或其药学上可接受的盐，使其足够发挥理想的生物活性，例如，干扰依赖于vWF的血小板凝聚。

本发明的一个方面包括与其他血栓形成性疾病疗法相结合的本发明适体组合物。本发明适体组合物可能包含，例如，一个以上适体，例如，抗-血栓形成适体和抗-vWF适体。在某些实施例中，包含一个以上适体的本发明适体组合物与其他有效的组合物，例如消炎剂、免疫抑制剂、抗病毒制剂等等相结合给药。总的来讲，可用于这种结合的已知治疗剂的常见有效剂量形式都是适用的。

“结合治疗”(或“协同治疗”)包括，给药本发明适体组合物和至少一种第二制剂，此第二制剂作为一种特异性治疗体通过这些治疗剂的协同作用起到了有益的效果。结合治疗的有益效果包括但不限于，由于治疗剂结合得到了药代动力学或药效共同作用结果。这些治疗剂的结合给药通常在给定的时间段进行(根据所选择的结合方法，该时间段通常是几分钟、几小时、几天或几周)。

“结合治疗”可以包括给药两种或两种以上治疗剂作为单独单药治疗方案的一部分，但通常不这么做。“结合治疗”包括按照某种有序的方式给药这些治疗剂，即，其中的每种治疗剂在不同的时间给药，“结合治疗”还包括基本上同时给药这些治疗剂，或同时给药至少两种治疗剂。可以通过例如，给患者服用含有固定比例的各个治疗剂的单一胶囊，或多个含有单一治疗剂的胶囊，从而完成基本上同时给药过程。

通过任意合适的给药途径，可以使各个治疗剂的顺序给药或基本上同时给药发挥作用，其中，适合的给药途径包括，但不仅限于，局部途径、口服途径、静脉途径、肌肉途径、或通过粘膜组织直接吸收。这些治疗剂可以通过相同的途径或不同的途径给药。例如，选择结合体的第一治疗剂通过注射给药，而结合体的其他治疗剂通过局部方式给药。

作为选择，例如，所有的治疗剂都可以局部给药或注射给药。除非另有说明，治疗剂给药的顺序不再详细的描述。“结合治疗”还包括给药上述治疗剂与其他生物活性成分的进一步结合体。该结合治疗剂进一步包括一种非药物治疗，这种非药物治疗可以在任意合适的时间内进行，直到治疗剂与非药物治疗结合的协同活性达到有益的效果。例如，在合适的情况下，当非药物治疗暂时从治疗剂的给药过程中除去，可能除去几天或几周时，该治疗仍能达到有益的效果。

本发明的治疗组合物或药物组合物通常包括有效量的治疗活性成分，这些活性成分溶解或分散在药学上可接受的介质中。药学上可接受的介质或载体包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗病毒剂或抗菌剂、等渗剂和延缓吸收试剂等等。在本领域中，这些介质或试剂作为药物活性底物的应用是已知的。本发明治疗剂组合物还可以结合辅助活性成分。

按照目前公开的内容，药物组合物或药理组合物的制备方法对本领域技术人员是已知的。一般地，这些组合物被制成液态的溶液或悬浮液作为血管注射剂；也可以制成固态形式，在注射之前，溶解于或悬浮于液体中；也可以制成片剂或其他固体制剂口服给药；也可以制成缓释胶囊；也可以制成其他常用的制剂形式，包括滴眼剂、霜剂、洗液、药膏、吸入剂等等。在使用过程中，外科医生、内科医生或护工用例如盐水冲洗的方法获得的无菌配方用来治疗特殊部位是非常有效的。组合物还可以通过微装置、微粒或海绵体给药。

在制剂中，治疗剂以一种与剂量处方相协调的方式给药，且给药量是具有药理活性的。制剂可以通过多种剂量形式给药。在优选的实施方案中，本发明的适体被制成上述可血管注射的溶剂，但也可以使用药物缓释胶囊等等。

在本文中，给药的活性成分的数量和组合物的量依赖于被治疗的主体动物。需要给药的活性化合物精确的量依赖于使用者的判断，且对每个病人来讲都是不同的。

通常使用的是分散活性化合物所需的最少量的组合物。合适给药的方案也是多种多样的，但可以表示为最初的化合物给药和结果控制和随后在进一步间隔中给予的进一步剂量控制。如下面实施例3所述，本发明抗-vWF适体的给药效果可以通过使用PFA-100血小板功能分析仪测定血小板凝聚作用进行控制，例如，测定botrocetin诱导的血小板凝聚(“BIPA”)和/或剪切力诱导的止血栓形成。

举例来说，为了以片剂或胶囊剂(例如一种明胶胶囊)的形式口服给药，药物活性成分可以与一种可口服的无毒的药学可接受惰性载体结合，其中所述多性载体例如乙醇、甘油、水等等。此外，在有需要或必要的时候，混合物还可以引入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。合适的粘合剂包括淀粉；硅酸镁铝；淀粉糊；明胶；甲基纤维素；羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；天然糖例如葡萄糖或β-乳糖；玉米甜味剂；天然的和合成的树胶例如阿拉伯胶、黄芪胶或海藻酸钠；聚乙二醇；蜡等等。这些剂型可以使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、它的镁盐或钙盐和/或聚乙二醇等等。崩解剂包括，但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、斑脱土、黄原胶淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾混合物等等。稀释剂包括，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸。

注射剂组合物优选是水相等渗溶液或悬浮液，栓剂可以从脂肪族的乳化液或悬浮液中方便地制得。组合物可以被灭菌且包含例如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶体助剂、渗透压调节盐和/或缓冲液等添加剂。此外，还可能包含其它的有治疗价值的物质。组合物分别按照传统的混合、造粒或包衣方法制备，并且一般包含大约0.1％到75％，优选大约1％到50％的活性成分。

本发明化合物还可以以延时释放和持续释放的片剂或胶囊剂、药丸、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、悬浮剂、糖浆和乳剂的口服剂量形式给药。

液体，特别地注射剂组合物可以通过例如溶解、分散等等的方法制备。将活性化合物溶于或混合于药学纯溶剂中，从而形成血管注射剂溶液或悬浮液，所述药学纯溶剂例如水、生理盐水、水相葡萄糖、甘油、乙醇等等。另外，也可以配制在注射之前适于溶入液体中的固体形式。

本发明的化合物可以通过静脉注射(注射和输液)、腹腔内给药、皮下给药或肌肉注射的形式给药，所有的使用形式对药物领域普通技术人员都是已知的。血管注射剂可以制成常用形式，如液体溶液或悬浮液。

肠胃外的注射给药常被用于皮下注射、肌肉注射或静脉注射和输液。另外，按照美国专利第3,710,795号，一个肠胃外给药途径使用了缓释系统或持续释放系统，从而保证维持剂量在体内的恒定水平，该专利在这里通过引证并入本文。

此外，本发明优选的化合物可以通过适当的经鼻给药工具、吸入器的局部使用以经鼻给药方式给药，或通过透皮吸收途径，使用本领域普通技术人员已知的透皮片剂给药。为了以透皮制剂的形式给药，在整个给药过程中，给药剂量当然是持续的，而不是间歇的。其他优选的局部制剂包括膏剂、软膏剂、洗液、气雾喷雾剂和凝胶剂，其中活性成分的浓度一般在0.01％到15％w/w或w/v范围内。

对于固体组合物，可以使用赋形剂，包括医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。上面定义的活性化合物，也可以使用例如聚烯基二醇，比如丙二醇作为载体配制成栓剂。在某些实施方案中，栓剂可以从脂肪族的乳剂或悬浮液中方便地制得。

本发明的化合物还可以以脂质体给药系统的形式给药，例如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体。脂质体可以由各种磷脂组成，包括胆固醇、十八胺或卵磷脂。在某些实施方案中，如美国专利第5,262,564号所述，脂质成分层是用一种药物的水溶液水合而成的，形成一种包含药物的脂质层。例如，提供这里描述的适体分子，使用本领域已知的方法，可以构建该适体分子与亲脂性化合物或非免疫原性、高分子化合物的复合物。另外，脂质体能在其表面嵌合适体，用于内部靶向和传送细胞毒剂，从而调节细胞死亡。美国专利第6,011,020号提供了核酸相关的复合物的例子。

本发明的化合物还可以与可溶性聚合物耦合，作为靶向药物载体。这种聚合体包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺基苯酚(polyhydroxyethylaspanamidephenol)或用十六酰基取代的聚乙烯基氧化聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可能与一类对实现药物控制释放有效的可生物降解聚合物耦合，例如，聚乳酸、聚ε己内酯、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二羟基吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或两性的水凝胶嵌段共聚物。

如果需要的话，给药的药物组合物还可能包括少量的无毒辅助剂，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂及其他物质例如醋酸钠和油酸三乙醇胺酯。

依照不同的因素，包括类型、种类、年龄、体重、性别和病人的医学状况；治疗疾病的严重程度；给药途径；病人的肾和肝脏的功能；和使用的特定适体或其盐，选择适体使用的给药方案。普通的医生或兽医可以容易地确定和指定用于预防对抗或抑制疾病发展所需的有效量的药物。

为了起到指定的作用，本发明的口服剂量在大约0.05mg/day到7500mg/day的范围内。组合物优选以刻痕片剂形式提供，该片剂包含0.5mg，1.0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，15.0mg，25.0mg，50.0mg，100.0mg，250.0mg，500.0mg和1000.0mg的活性成分。输液剂量、经鼻给药剂量和透皮剂量在0.05mg/day到7500mg/day范围内。皮下注射静脉注射和腹腔内给药的剂量在0.05mg/day到3800mg/day范围内。

本发明化合物可能以单一日剂量给药，或分二、三或四次每日定时给药每日的总剂量。

本发明化合物的有效的血浆水平在0.002mg/mL到50mg/mL范围内。在本发明的剂量中，质量只涉及适体低聚核苷酸部分的分子量，不包括与PEG结合所获得的质量。

适体治疗剂的药代动力学和生物分布调节

量身定做所有以低聚核苷酸为基础的治疗剂，包括适体，使之与所需的药物应用相匹配，这一点是十分重要的。尽管直接抗胞外靶分子的适体不会遇到与胞内运输相关的困难(反义和RNAi治疗剂会遇到这种情况)，但是，这种适体仍然必须能够分布到目标器官和组织中，并通过理想的给药方案在体内(未修饰的)持续一段时间。

因此，本发明提供了能够影响适体组合物药代动力学，特别是能够调和适体药代动力学的材料和方法。通过修饰部分(例如PEG聚合物)与适体的结合，和/或引入修饰核苷(例如2’-F或2’-O-甲基)来改变核算的化学组合物，可以实现对适体药代动力学的调和能力(即，调节能力)。使用适体药代动力学的调和能力来改进现有的治疗剂应用，或作为选择，来开发新的治疗剂应用。例如，在某些治疗剂应用过程中，例如，在抗肿瘤或急性疾病护理过程中，需要快速的药物清除或完全消失，这就需要缩短适体在循环过程中的保留时间。作为选择，在其他的治疗剂应用过程中，例如，需要在治疗剂进行系统循环的位置维持治疗剂，这就需要延长适体在循环过程中的保留时间。

另外，使用适体药代动力学调和能力来修改患者体内适体治疗剂的生物分布。例如，在某些治疗剂应用过程中，需要努力改变适体治疗剂的生物分布来靶向特定的组织类型或确定的器官(或器官系统)。在这些应用过程中，适体治疗剂优选聚集在确定的组织或器官中。在其他的治疗应用中，需要目标组织表现出一种胞内标记物或与给定的疾病、胞内损伤或其他不正常的病症相关的症状，从而使适体治疗剂优选地聚集在受伤组织中。例如，在2004年三月5日递交的，同时待审的名为“适体治疗剂的药代动力学和生物分布的控制调节”的美国临时专利申请第60/550790号中有所描述。使用适体治疗剂的聚乙二醇化(例如，用20KDa的PEG聚合物进行聚乙二醇化)来靶向发炎的组织，因此，聚乙二醇化的适体治疗剂优选地聚集在发炎的组织中。

为了确定适体治疗剂(例如适体结合物或具有改变的化学物质，如修饰的核苷的适体)的药代动力学曲线和生物分布曲线，要控制多种参数。这些参数包括，例如，适体组合物的半衰期((t1/2)、血浆清除率(CL)、分布量(Vss)、浓度-时间曲线下面积(AUC)、观察到的最大血清或血浆浓度(C_max)和平均保持时间(MRT)。如这里使用的，术语“AUC”是指适体给药后，随着时间变化绘制的适体治疗剂血浆浓度曲线下的面积。AUC值用于估算给定的适体治疗剂的生物利用率(即，适体给药后在循环过程中给药的适体治疗剂的百分比)和/或总清除率(CL)(即，适体治疗剂从循环中除去的速率)。分布量与适体治疗剂的浓度和体内适体的量相关。Vss值越大，血浆外存在的适体越多(即溢出物越多)。

本发明提供了某种材料和方法，这些材料和方法通过适体与调节部分的结合或将修饰核苷引入适体，以控制的方式调节稳定的适体组合物在体内的药代动力学和生物分布，其中所述调节部分例如，一种小分子、肽或聚合物末端基团。如在此所述，修饰部分或改变核苷化学组合物的结合改变了适体在循环中的保留时间和组织分布的基本方面。

除了核酸酶的清除作用，低聚核苷酸治疗剂还受到肾脏过滤作用的消除。因此，除非阻止了过滤作用，抗核酸酶低聚核苷酸静脉给药后的体内半衰期一般＜10分钟。可以通过促进流入组织的血液之外的快速分布，或通过在低聚核苷酸有效大小基础上增加合适的分子量用于被肾小球切割来实现过滤作用的消除。小分子治疗剂与PEG聚合物(聚乙二醇化作用)的结合可以显著延长适体在循环内的保持时间，因此减少了给药频率，提高了对于血管靶分子的有效性。

适体可以与多种修饰部分结合，例如像PEG似的高分子量聚合物；肽，例如Tat(一种HIV Tat蛋白的13个氨基酸片段(Vives，et al，(1997)，J.Biol.Chem.272(25)：16010-7))，Ant(果蝇的触角足同源异型蛋白三螺旋结构衍生的一种16个氨基酸序列(Pietersz，etal，(2001)，Vaccine 19(11-12)：1397-405))和Arg7(一种由聚精氨酸(Arg7)组成的短链带正电荷的渗入细胞型肽(Rothbard，et al，(2000)，Nat.Med.6(11)：1253-7；Rothbard，J et al，(2002)，J.Med.Chem.45(17)：3612-8))和小分子，例如亲脂性化合物，如胆固醇。在这里描述的不同的结合过程中，与PEG基团的结合使适体的体内性质具有最有意义的改变。例如，混有2′F和2′-OMe修饰的适体治疗剂与20KDa PEG聚合物的复合作用妨碍了肾脏的过滤作用，并促进适体向健康的和发炎的组织分布。另外，20KDa的PEG聚合物-适体聚合物也证明，适体的40KDa PEG聚合物在阻止肾脏过滤作用过程中一样有效。同时，聚乙二醇化的一个作用表现在适体的清除过程中，20KDa的部分可以在身体组织中暴露更长时间，也加速了适体到组织中的分布，尤其加速了在进行高速器官灌流时和发炎位点的分布。适体-20KDa PEG聚合物结合体指导适体分布到发炎位点，以便于聚乙二醇化的适体优选地聚集在发炎组织中。在某些情况下，20KDa的聚乙二醇化适体结合体能够进入细胞内部，例如，肾细胞内部。

修饰的核苷还可以用来调节适体的血浆清除率。例如，引入2′-F和2′-OMe的稳定化学体的未结合适体是这里产生的适体的典型，表现出高度的体内体外核酸酶稳定性，与未修饰的适体相比，该适体能够快速的从血浆中消失(即，快速的血浆清除率)，且能够快速的分布于组织，主要是肾脏中。

PEG衍生的核酸

如上所述，核酸的高分子量非免疫原性聚合物衍生物能够改变核酸的药代动力学性质和药理性质，使他们成为更有效的治疗剂。活性的有利改变包括对核酸酶降解作用增加的抵抗力，降低的肾脏过滤作用，减少暴露于免疫系统的时间和改变的治疗剂在体内的分布。

本发明的适体组合物可以用聚烯基二醇(PAG)部分进行衍生。从2003年11月21号递交的美国专利申请第10/718,833号中可以发现PAG衍生核算的例子，该专利通过引证在此全部并入本文。本发明使用的典型的聚合物包括聚乙二醇(PEG)，也可认作聚乙烯氧化物(PEO)和聚丙二醇(包括聚异丙二醇)。不同的氧化烯(例如，氧化乙稀盒氧化丙烯)的随机共聚物或封闭共聚物可在多种申请中应用。聚烯基二醇，例如PEG最为常见的形式是一种直链聚合物，结尾处的末端基团是羟基基团：HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH。α-ω-双羟基聚(乙二醇)这种聚合物也可以用HO-PEG-OH表示，其中已知符号-PEG-代表下面的结构单元：-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-，其中，n一般在4到10,000范围内。

如图所示，PEG分子是双功能性分子，有时也叫做“双羟基PEG”。PEG分子的末端部分是相对无反应性的羟基部分，-OH基团，该部分可被活化转变为功能性部分，使PEG或其它化合物附着于化合物的活性位点。这种活化的双羟基PEG在这里叫做双-活化的PEG。例如，通过用N-羟基琥珀酰亚胺中的琥珀酰亚胺活化酯部分取代相对无反应性的羟基部分-OH，从而功能化双羟基PEG的末端部分，使之作为活性碳酸酯用于与氨基部分进行筛选反应。

在许多应用过程中，理想的情况是用一种基本上无反应性的部分封住PEG分子的一段，以致此PEG分子是单功能性(或单活化的)PEG分子。蛋白质治疗剂对于活化的PEG通常显示多重反应位点，对此蛋白质治疗剂来讲，双功能性活化的PEG会引起大规模的交联作用，产生缺乏功能性聚集物。为产生单活化PEG，将双羟基PEG分子的一个羟基部分用无反应性的甲氧基末端部分-OCH3取代。另一个未封端的PEG分子一般被转变为反应端部分，反应端部分能够被活化从而附着于平面或例如蛋白质分子的活性位点。

PAG是一种聚合体，一般在水中和许多有机溶剂中具有溶解性、无毒性和无免疫原性。PAG的一个应用是将其共价附着在不可溶的聚合体分子上，从而产生PAG-分子可溶性“结合物”。例如，已经公布，不溶于水的药物紫杉醇在与PEG结合后，会变为水可溶物。Greenwald，et at，J.Org.Chem.，60：331-336(1995)。PAG结合物不仅可以用于提高可溶性和稳定性，而且可以用于延长分子的血液循环半衰期。

本发明的多烷基化合物的大小一般在5kDa和80kDa之间，然而也能使用任意大小的化合物，这种选择取决于适体和应用过程。本发明其它的PAG化合物大小在10kDa和80kDa之间。本发明另外的PAG化合物大小在10kDa和60kDa之间。例如，一种PAG聚合体的大小可能至少为10，20，30，40，50，60，或80kDa。这些聚合体可以是直线型的，也可以是有支链的。

与生物表达的蛋白治疗剂相反，核酸治疗剂一般是由活化的核苷单体化学合成的。PEG-核酸结合物可以通过相同的单体重复合成结合PEG来制备。例如，通过转变为亚磷酰胺形式实现的PEG活化，能够被结合到低聚核苷酸合成的固体阶段。做为选择，可以通过反应性PEG附着位点的位点-特异性结合，完成低聚核苷酸合成。通常，这一过程通过在5′-末端加入自由伯胺(在固相合成的最后一步耦合步骤，使用亚磷酰胺调节剂结合伯胺)来完成。使用这些方法，反应性PEG(例如，PEG被活化，从而使其能够与胺类物质起作用并形成化学键)与纯化的低聚核苷酸结合，且耦合反应在溶液中进行。

PEG结合体改变治疗剂生物分布的能力与多种因素有关，包括结合体的外观尺寸(例如，依照流体动力学半径测量)。已知较大的结合体(＞10KDa)对于妨碍肾的过滤作用更为有效，并从而增加小的高分子(例如，肽、抗敏低聚核苷酸)的血清半衰期。PEG大小约为50KDa(进一步增加分子量效果不大，这是由于半衰期由巨噬细胞调节的代谢过程决定，而不是由肾的消除决定)的PEG结合体已经表现出妨碍过滤作用的能力。

高分子量PEG(＞10KDa)的生产是困难的，效率低且价格昂贵。作为合成高分子量PEG-核酸结合体的一种途径，前面的工作主要集中在高分子量活化PEG的生产。生产这种分子的一个方法包括形成一种支链的活化PEG，在这种支链活化PEG中，两个或两个以上PEG附着于带有活化基团的核心处。活化高分子量PEG分子的末端部分，即相对无反应性羟基(-OH)部分，或将其转变为功能性部分，用于将一个或一个以上PEG附着在化合物的反应位点上。支链活化PEG具有两个以上末端，在两个或两个以上末端被活化的情况下，这种活化的高分子量PEG分子在这里叫做多重活化的PEG。在某些情况下，并不是所有支链PEG分子的末端都是活化的。在支链PEG分子任意两个末端被活化的情况下，这种PEG分子叫做双活化的PEG。在支链PEG分子只有一个末端被活化的情况下，这种PEG分子叫做单活化的PEG分子。作为这种应用的一个例子，已经有文献描述了将两个单甲氧基化PEG分子附着与赖氨酸核心制得的活化PEG(Harris et al，Nature，vol.2：214-221，2003)。

本发明提供了另一种途径来合成包括多重聚乙二醇化核酸分子的高分子量PEG-核酸(优选，适体)结合体。本发明还包括PEG-连接的多体低聚核苷酸，例如，适体二聚体。本发明还关于高分子量组合物，其中，PEG稳定部分作为一种连接体将适体分为不同的部分，例如，PEG与单一适体序列结合，从而形成直链排列的高分子量适体组合物，例如，核酸-PEG-核酸(-PEG-核酸)n，其中，n大于或等于1。

本发明的高分子量组合物包括的分子量至少为10KDa。一般，组合物的分子量在10KDa到80KDa之间。本发明高分子量组合物的分子量至少是10KDa，20KDa，30KDa，40KDa，50KDa，60KDa或80kDa。

稳定的部分是能够改进本发明高分子量适体组合物的药代动力学性质和药理学性质的分子或分子的一部分。在某些情况下，稳定的部分是能够使两个或两个以上适体、或适体区域相靠近，或提供减少本发明高分子量适体的整体旋转自由度的分子或分子的一部分。稳定的部分可以是聚烯基二醇，例如，直链或支链的聚乙二醇，也可以是均聚物或杂聚物。其他稳定的部分包括聚合物，例如肽核酸(PNA)。低聚核苷酸也可以是稳定的部分；这种低聚核苷酸包括修饰的核苷，和/或修饰的连接体，例如硫代磷酸键。稳定部分可以是适体组合物的一个完整的部分，即，与适体共价结合的。

本发明的组合物包括高分子量适体组合物，其中，两个或两个以上核酸部分与至少一个聚烯基二醇部分共价结合。聚烯基二醇部分共价结合于任一适体末端，从而该聚烯基二醇与核酸部分结合成一个分子，该聚烯基二醇被叫做连接部分。在这种组合物中，共价分子的初级结果包括线性排列的核酸-PAG-核酸。一个例子是初级结构为核酸-PAG-核酸的组合物。另一个例子是线性排列的核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。

为了生产核酸-PEG-核酸结合物，从头合成核酸使其具有一个单一活性位点(例如，是单活化的)。在一种优选的实施方案中，该活性位点是一种氨基基团，该氨基基团是在低聚核苷酸固相合成的最后一部通过加入亚磷酸胺修饰剂引入5’-末端的。随后进行修饰的低聚核苷酸的去保护和纯化过程，并在高浓度的溶液中进行重组，高浓度的溶液能够减小活化PEG自然发生的水解作用。在优选的实施方案中，低聚核苷酸的浓度是1mM，重组溶液包含200mM NaHCO₃-缓冲液，pH值为8.3。缓慢的逐步加入高纯化的双羟基PEG起始结合体合成过程。在优选的实施方案中，通过丙酸琥珀酰亚胺酯衍生作用活化双功能性PEG的两个末端(双活化)。反应之后，用凝胶电泳或液相色谱纯化PEG-核酸结合体，分离成完全结合、部分结合和未结合的几类。多重PAG分子连接体(例如，作为随机共聚物或嵌合共聚物)或较小的PAG链可以被连接成不同的长度(或分子量)。不同长度的PAG链之间可以使用非PAG连接体。

2’-O-甲基、2’-氟代和其他修饰核苷的修饰作用使适体对核酸酶稳定，且增加了适体的体内半衰期。3′-3′-dT帽子还增加了适体对核酸外切酶的抵抗力。参见例如，美国专利第5,674,685；5,668,264；6,207,816；和6,229,002号，这些专利通过在此引证全部并入本文。

反应性核酸的PAG衍生作用

高分子量PAG-核酸-PAG结合体可以通过单功能性活化的PEG与包含一个以上活性位点的核酸反应而制备。在一个实施方案中，该核酸是双反应性或双活化的，包含两个反应位点：通过常见的亚磷酸酯合成引入低聚核苷酸的5’-氨基基团和3’-氨基基团，例如：图2表示了3’-5’-双聚乙二醇化过程。在作为选择的实施方案中，使用例如5-嘧啶位点、8-嘌呤位点、或2’-核糖位点作为前体胺的附着位点，可以将反应位点引入内部位置。在这种实施方案中，核酸具有多个活化位点或反应位点，被称为是多重活化的。合成并纯化之后，在促进低聚核苷酸反应位点进行选择性反应的条件下，修饰的低聚核苷酸与单活化的PEG结合，同时减小自然水解作用的发生。在优选的实施方案中，单甲氧基-PEG用丙酸琥珀酰亚胺酯活化，在pH为8.3的条件下进行耦合反应。为了引发双取代PEG的合成，提供关于低聚核苷酸理想配比过剩的PEG。反应之后，用凝胶电泳或液相色谱纯化PEG-核酸结合体，分离成完全结合体、部分结合体和未结合体几类。

连接区域还可以有一个或一个以上聚烯基二醇部分附着于此。这种PAGs可以是任意长度的，还可以以合适的结合体被使用，从而实现理想的组合物分子量。

具体的连接体的作用可以被其化学组合物和其长度影响。太长、太短、或与靶分子形成不适宜的空间位阻、和/或不适宜的离子间相互作用的连接体不会再适体和靶分子间形成复合物。由于减少了配体的有效浓度，比跨越核酸之间距离所需更长的连接体会减少结合稳定性。因此，通常需要优化连接体组合物及其长度，从而增大适体对靶分子的亲和力。

所有在此引用的专利和刊物都被在此引证而全部合并于本文，就如同每个专利文件和刊物都被分别明确逐个的引证而合并于本文。引用刊物和专利文件并不表明其是现有技术文献，也不表明对其内容或日期的认可。本发明已通过书面描述和举例的方式进行描述，本领域技术人员将意识到本发明可在多种不同实施方案中实践。前面的描述和下面的实施例都是用以阐述的而不是对所附权利要求的限制。

实施例

实施例1适体筛选和测序

实施例1A rRfY vWF A1区域适体筛选

使用由2′-OH嘌呤核苷酸和2′-F嘧啶核苷酸组成的核苷序列库(rRfY)进行筛选过程，识别能够结合人或兔vWF A1区域的适体。筛选方案产生对于人和兔vWF A1区域具有高亲合特异性的适体，其中人和兔vWF A1区域被固定在疏水性的平皿上。

基因库制备

使用ABI EXPEDITE^TM DNA合成仪合成序列为5′-GGAGCGCACTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTCGACCTCTCTGCTAGC 3′(序列号8)的DNA模版，并用标准的方法去保护。在DNA模板(序列号8)中的一系列N可以是任一核苷酸的结合，并使产生的适体具有独特的序列区域。用引物5′-TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC-3′(序列号9)和5′-GCTAGCAGAGAGGTCGAAA-3′(序列号10)扩增模板，然后作为模板与T7RNA聚合酶(Y639F)一起用于体外转录。转录一般在37℃条件下被培养过夜，使用40mM Tris、pH 8.0、40mM DTT、1mM亚精胺-HCl，0.002％TritonX-100，4％(w/v)PEG-8000，12mM MgCl2，3mM2′-F-CTP，3mM 2′-F-UTP，3mM GTP，3mM ATP，0.5X无机焦磷酸酶，和IX T7聚合酶(Y639F)，和大约5μM模板DNA。

筛选

为了筛选人vWF A1区域，在100μL IX Dulbecco′s PBS(GibcoBRL，Cat.#14040-133，Carlsbad，CA)中，在室温条件下，将24pmoles的人vWF A1区域(序列号4，图4)固定到Nunc Maxisorp疏水性平皿(Nunc Cat.#_446612，Rochester，纽约)上1小时，起始头10轮筛选。对于第11轮和12轮筛选，将12pmoles人vWF全长序列(序列号7，登录号VWHU，购自Calbiochem Cat.#_681300，La Jolla，加拿大)固定到疏水性平皿上。对于兔vWF筛选，在与固定人vWF A1区域相同的条件下固定24pmoles兔vWFA1区域(序列号6，登录号AAB51555，图3)，起始每一轮筛选过程。

在所有情况下，在进行一小时的蛋白质固定之后，去掉上清液，用120μL IX Dulbecco′s PBS洗涤小孔4次。然后在室温条件下，用100uL封闭缓冲液(含有1％BSA的IX Dulbecco′s PBS)封闭固定蛋白质的小孔1小时。在第一轮，在100μL IX Dulbecco′s PBS中，在包括BSA-封闭的固定化蛋白质靶分子的小孔中，在室温条件下培养333pmoles RNA序列库(2x 10¹⁴独立的分子)1小时。然后去掉上清液，用120μL IX Dulbecco′s PBS洗涤小孔。在随后的几轮中，添加另外的洗涤步骤来增加阳性筛选步骤的严格度(见表1和2)。从第2轮开始到所有随后的步骤中，在阳性筛选步骤之前包括二个阴性筛选步骤。首先，RNA序列库在未封闭的小孔中室温下培养1小时从而从序列库中去掉塑性结合序列。在第二阴性筛选步骤，在室温条件下，RNA转入BSA封闭的小孔(不包括蛋白质靶分子)中1小时，从而在阳性筛选之前，从序列库中去掉任一BSA结合序列。从第2轮开始到随后的几轮中，在阳性筛选反应中掺入0.1mg/mL tRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA，作为非特异性竞争剂。在所有情况下，结合固定化蛋白质靶分子的RNA序列库在筛选平皿中，外加反转录混合物(第一轮：100uL；第二轮+：50uL；包括序列号10的3′-前体和Thermoscript RT(Invitrogen Cat.#11146-016，Carlsbad，CA))直接进行反转录，随后在65℃下培养1小时。

所得cDNA作为模版进行PCR反应(第一轮：500uL；第二轮+：250uL；包括序列号9的5′-前体，序列号为10的3′-前体，和Taq聚合酶(New England Biolabs Cat.#MO267L，Beverly，MA))。PCR反应在下列条件下进行：a)变性步骤：94℃反应2分钟；b)循环步骤：94℃反应30秒，60℃反应30秒，72℃反应1分钟；c)最后的延长步骤：72℃反应3分钟。重复这一循环直到生成足够的PCR产物。表1和表2中的“PCR域值”报道了生成足够的PCR产物所需的最小循环次数。扩增的模版DNA序列库用异丙醇沉淀，一半PCR产物用作模版在下一轮筛选过程中转录为RNA序列库。每三轮筛选后，用10％的聚丙烯酰胺凝胶纯化转录的RNA序列库，当不用凝胶纯化时，将转录的RNA序列库用两个Centri-Spin 10色谱柱(Princeton Separations Cat.#CS-101，Adelphia，NJ)脱盐。在所有的情况下，相当于1/10的总转录产物作为起始序列库进入后续的筛选过程中。

表1使用rRfY序列库进行的人vWF A1区域筛选条件

轮	靶分子	洗涤液	PCR域值	纯化
					1	24pmol hA1	4×120μL	16	脱盐(2×)
2	24pmol hA1	4×120μL	18	脱盐(2×)
					3	24pmol hA1	4×120μL	16	凝胶纯化
4	24pmol hA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
					5	24pmol hA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
6	24pmol hA1	8×120μL	15	凝胶纯化
					7	24pmol hA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
8	24pmol hA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
					9	24pmol hA1	8×120μL	10	凝胶纯化
10	24pmol hA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	脱盐(2×)
					11	12pmol全长vWF	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	20	脱盐(2×)
12	12pmol全长vWF	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	15	凝胶纯化

表2使用rRfY序列库进行的兔vWF A1区域筛选条件

轮	靶分子	洗涤液	PCR域值	纯化
					1	24pmol rA1	4×120μL	16	脱盐(2×)
2	24pmol rA1	4×120μL	18	脱盐(2×)
					3	24pmol rA1	4×120μL	16	凝胶纯化
4	24pmol rA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
					5	24pmol rA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
6	24pmol rA1	8×120μL	15	凝胶纯化
					7	24pmol rA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
8	24pmol rA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
					9	24pmol rA1	8×120μL	10	凝胶纯化
10	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	脱盐(2×)
					11	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	脱盐(2×)
12	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	凝胶纯化

vWF A1区域结合分析

使用夹层过滤结合试验监控筛选过程。将5′-³²P-标记的RNA序列库(痕量浓度)与无靶分子蛋白参照物，100nM人vWF A1区域(序列号4)或100nM兔vWF A1区域(序列号6)在室温条件下，在包含0.1mg/mL tRNA，和0.1mg/mL鲑鱼精DNA的IX Dulbecco′s PBS(总体积50uL)溶液中培养30分，然后用定点印记仪器(Schleicher and Schuell，Keene，NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。经过第6、9、12轮之后，用三点筛选(100nM人vWF A1区域、100nM兔vWF A1区域和无靶分子参照物)的方法计算RNA序列库结合硝化纤维的百分比。将序列库的结合率与原始序列库(第0轮)的结合率相比。表3表示了rRfY序列库结合分析的结果。

表3vWF A1区域rRfY筛选序列库结合实验

筛选	序列库轮数	100nM人A1	100nM兔A1	无蛋白
					原始序列库	第0轮	11.2％	14.3％	10.5％
人vWF A1区域	第6轮	16.0％	16.9％	13.8％
					兔vWF A1区域	第6轮	15.2％	17.9％	14.7％
人vWF A1区域	第9轮	14.7％	14.3％	10.5％
					兔vWF A1区域	第9轮	13.7％	14.7％	10.1％
人vWF A1区域	第12轮	31.8％	33.1％	13.2％
					兔vWF A1区域	第12轮	24.1％	17.7％	10.3％

与不存在蛋白的对照相比，当观察到相当比例的RNA与存在的人或兔的vWF A1区域结合时，依照操作说明，用TOPO TA克隆试剂盒(invitrogen，Cat.#45-0641，Carlsbad，CA)克隆序列库。对第9轮和第12轮的模版序列库进行克隆和测序(总共125个序列)，产生48个独特的克隆体。转录、脱盐并用5-³²P末端标记物标记独特的克隆体，用三点定点印记筛选(无靶分子参照物、100nM人vWF A1区域(图3，序列号5)、100nM兔vWF A1区域(图3，序列号6))的方法进行实验。下面表4的第三栏和第四栏表示了实验数据，此实验数据是靶分子蛋白存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量与靶分子蛋白不存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量的比值。

基于最初的筛选，使用定点印记实验测定的12个最好的vWF结合序列的K_Ds值表示在图4的第五栏内。为了确定K_D值，用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶纯化适体转录产物，用γ³²P ATP标记5’-末端。在定点印记实验(1μM，300nM，100nM，30nM，10nM，3nM，1nM，0nM)中使用人vWF A1区域(序列号5)的8点蛋白滴定法，使用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)通过满足等式y＝(max/(1+K/protein))+yint来计算K_D值。对于实施例中描述的所有用来确定单克隆体K_D值的定点印记试验，用包括0.1mg/mL BSA的IX Dulbecco′s PBS缓冲液稀释靶分子蛋白，例如，人vWF A1区域，并在过滤和定量之间，将稀释的靶分子蛋白与标记的适体一起在24℃条件下培养30分。

表4人和兔的vWF A1区域rRfY适体结合活性(ND＝未实验)

适体	筛选人/无蛋白	筛选兔/无蛋白	人A1区域KD值(nM)
				(AMX 201.B 1)(序列号11)	ND	ND	19
(AMX 198.G1)(序列号12)	1.89	1.90	45
				(AMX 201.H3)(序列号13)	1.88	1.89	90
(AMX 201.B3)(序列号14)	1.69	1.64	ND
				(AMX 201.G1)(序列号15)	2.14	2.20	190
(AMX 198.C6)(序列号16)	3.03	4.62	249
				(AMX 201.B11)(序列号17)	1.55	1.52	ND
(AMX 201.D10)(序列号18)	1.59	1.52	ND
				(AMX 198.C10)(序列号19)	1.40	3.39	555
(AMX 201.H4)(序列号20)	1.79	1.86	ND
				(AMX 201.G9)(序列号21)	2.06	2.11	182
(AMX 201.H11)(序列号22)	1.75	1.40	ND
				(AMX 201.C8)(序列号23)	2.47	1.50	0.2
(AMX 201.H1)(序列号24)	2.61	2.46	189
				(AMX 198.E11)(序列号25)	1.03	2.37	1056
(AMX 198.A10)(序列号26)	1.26	5.74	1860
				(AMX 201.D4)(序列号27)	2.23	2.46	ND
(AMX 201.D3)(序列号28)	1.76	1.52	ND
				(AMX 201.A8)(序列号29)	1.82	1.51	ND
(AMX 198.E5)(序列号30)	1.60	1.56	172

序列号5的人vWF A1区域用于适体筛选和适体K_Ds值测定

下面列出了表4所表示的rRfY适体的核酸序列。下列每个适体的独特序列开始于第18位核苷，紧接着是序列GGAGCGCACTCAGCCAC(序列号221)，一直延伸到3’末端固定的核酸序列TTTCGACCTCTCTGC TAGC(序列号222)。

除非另有说明，下面列出的每个序列是从5’端到3’端表示的，且在rRfY SELEX^TM条件下进行的筛选，其中所有的嘌呤(A和G)是2’-OH嘌呤(核糖)，所有的嘧啶(U和C)是2’-氟代嘧啶。

(AMX201.B1)序列号11

GGAGCGCACUCAGCCACAGAGCCCUGAGUGUAUGAUCGCCUAGAUCUAUCGAUGCUUUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX198.G1)序列号12

GGAGCGCACUCAGCCACAACACUAAUGGGGAAAGUUCAAGGAUUCUUGACCGGUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.H3)序列号13

GGAGCGCACUCAGCCACUAACGGUUGAUCUCAGGACUAAAUAGUCAACAAGGAUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.B3)序列号14

GGAGCGCACUCAGCCACAGAGCCCUGAGUGUAUGAUCGCCGAGAUCUAUCGAUGCUUUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.G1)序列号15

GGAGCGCACUCAGCCACGCUCGGUGGGGAAAUUUUAGCCUAAUUGGCUACUUGUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX198.C6)序列号16

GGAGCGCACUCAGCCACGGUGGUCAGUCAGUGAUAUGAUUAAGUUCAGCUGUGGCUGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.B11)序列号17

GGAGCGCACUCAGCCACACCGAGGCUGGAUAUCUACGAGAGGAAGUGCUGCUUGAAUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.D10)序列号18

GGAGCGCACUCAGCCACACUGAGGCUGGAUAUCUACGAGAGGAAGUGCUGCUUGGAUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX198.C10)序列号19

GGAGCGCACUCAGCCACUGGUCCUUAGCUAGUUGUACUAGCGACGCGUUCAGGUGGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.H4)序列号20

GGAGCGCACUCAGCCACUAACGGUUGAUCUCAGGACUAAUAGUCAACAAGGAUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.G9)序列号21

GGAGCGCACUCAGCCACUAACGGCUGAUCUCAGGACUAAAUAGUCAACAAGGAUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.H11)序列号22

GGAGCGCACUCAGCCACCCUGUCGUCUUUUGGUAGUCAGCCAAAAGCUAGUUGGUUGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.C8)(ARC840)序列号23

GGAGCGCACU

CAUUUUAAGAAUGA

UUUUCGACCUCUCUGCUAG

C

(AMX201.H1)序列号24

GGAGCGCACUCAGCCACUUUACGGUGAAAGUCUCUCGGGGUUCCGAGUUACGGUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX198.E11)序列号25

GGAGCGCACUCAGCCACGGUAACAUUGUUUCCGGCGAUUCUUUGAACGCCGUCGUGGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX198.A10)序列号26

GGAGCGCACUCAGCCACCAGUUAUGCUGGCUUUGGUCUUUGACUGUCUGAGUGUUCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.D4)序列号27

GGAGCGCACUCAGCCACUGGGGCUGAUCUCGCACGAUAGUUCGUGUCAAGGAUGCGUUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.D3)序列号28

GGAGCGCACUCAGCCACGCCCACGUCAAAUUAUAGUCUACUUUGAUGUGCCCGUGGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX201.A8)序列号29

GGAGCGCACUCAGCCACGCUGUACACUGAUGUUGUAACAUGUACCCCCUGGCUGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

(AMX198.E5)序列号30

GGAGCGCACUCAGCCACUUCGACUUUCAUGUCUGAAGUCCCUGCAGUGCGAGAGACGUUUCGACCUCUCUGCUAGC

虽然不希望被任何理论限制，但是基于SELEX^TM筛选所得全长适体和最小化的适体序列(见实施例2a)表示在表4中的结合数据和表示在表21种的胞内实验活性，在图10中，将由适体衍生而来的，能够结合本发明所有实施方案的vWF靶分子的预计基因二级结构和预计核心核酸序列表示为序列号217(使用Version4.1的RNAstructure，参见，Mathews，D.H.；Disney，M.D.；Childs，J.L.；Schroeder，SJ.；Zuker，M.；和Turner，D.H.2004年在美国国家科学院学报101卷7287-7292页发表的名为″将化学修饰限制引入动态规划法则来预计RNA二级结构″的文献)。ARC840(序列号23)是具有图10所描述的序列的一个例子，其中，序列表中粗体带下划线的部分表示必需的碱基。

实施例1B：rRdY vWF A1区域适体筛选

用由2’-OH嘌呤和脱氧嘧啶核苷组成的核苷库(rRdY)进行筛选过程来鉴别能够结合(1)人vWF A1区域，(2)兔vWF A1区域或(3)人和兔的vWF A1区域的适体。筛选方案产生的高亲和性适体对固定在疏水平皿上的人和兔的vWF A1区域具有特异性。

序列库制备

使用ABI EXPEDITE^TM DNA合成仪合成序列为5′-GGAGCGCACTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTCGACCTCTCTGCTAGC-3′(序列号8)的DNA模版，然后用标准的方法去保护。DNA模版(序列号8)中的一系列N可以是任一核苷酸的结合，并使产生的适体具有独特的序列区域。用引物5′-TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC-3′(序列号9)和5′-GCTAGCAGAGAGGTCGAAA-3′(序列号10)扩增模板，然后作为模板与T7RNA聚合酶(Y639F)一起用于体外转录。转录一般在37℃条件下被培养过夜，使用40mM Tris、pH 8.0、40mM DTT、1mM亚精胺-HCl，0.002％TritonX-100，4％(w/v)PEG-8000，12mM MgCl2，3mM 2′-F-CTP，3mM 2′-F-UTP，3mM GTP，3mM ATP，0.5X无机焦磷酸酶，和IX T7聚合酶(Y639F)，和大约5μM模板DNA。

筛选

为了筛选人vWF，在100μL IX Dulbecco′s PBS (Gibco BRL，Cat.#14040-133，Carlsbad，CA)中，在室温条件下，将24pmoles的人vWF A1区域(序列号4)固定到Nunc Maxisorp疏水性平皿(Nunc Cat.#_446612，Rochester，纽约)上1小时，起始头10轮筛选。对于第11轮和12轮筛选，将12pmoles人vWF全长序列(序列号7，图4)固定到疏水性平皿上。对于兔vWF筛选，在与固定人vWF A1区域相同的条件下固定24pmoles兔vWF A1区域(序列号6)，起始每一轮筛选过程。对于人/兔交互筛选的头两轮，将12pmole的人vWF A1区域(序列号4)和12pmole兔vWF A1区域(序列号6)按照前面的描述固定在疏水性平皿上。在交互筛选随后的几轮中，每轮筛选过程中人和兔的vWF A1区域(分别是序列号4和5)交替作为蛋白质靶分子，第11轮例外，在第11轮，使用人vWF全长序列(序列号7)。

在所有情况下，在进行一小时的蛋白质固定之后，去掉上清液，用120μL IX Dulbecco′s PBS洗涤小孔4次。然后在室温条件下，用100uL封闭缓冲液(含有1％BSA的IX Dulbecco′s PBS)封闭固定蛋白质的小孔1小时。在第一轮，在100μL IX Dulbecco′s PBS中，在包括BSA-封闭的固定化蛋白质靶分子的小孔中，在室温条件下培养333pmoles RNA序列库(2x 10¹⁴独立的分子)1小时。然后去掉上清液，用120μL IX Dulbecco′s PBS洗涤小孔。在随后的几轮中，添加另外的洗涤步骤来增加阳性筛选步骤的严格度(见表5、6和7)。从第2轮开始到所有随后的步骤中，在阳性筛选步骤之前包括二个阴性筛选步骤。首先，RNA序列库在未封闭的小孔中室温下培养1小时从而从序列库中去掉塑性结合序列。在第二阴性筛选步骤，在室温条件下，RNA转入BSA封闭的小孔(不包括蛋白质靶分子)中1小时，从而在阳性筛选之前，从序列库中去掉任一BSA结合序列。从第2轮开始到随后的几轮中，在阳性筛选反应中掺入0.1mg/mL tRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA，作为非特异性竞争剂。

在所有情况下，结合固定化蛋白质靶分子的RNA序列库在筛选平皿中，外加反转录混合物(第一轮：100uL；第二轮+：50uL；包括序列号为10的3′-前体和Thermoscript RT(Invitrogen Cat.#11146-016，Carlsbad，CA))直接进行反转录，随后在65℃下培养1小时。所得cDNA作为模版进行PCR反应(第一轮：500uL；第二轮+：250uL；包括序列号9的5′-前体，序列号为10的3′-前体，和Taq聚合酶(New England Biolabs Cat.#MO267L，Beverly，MA))。PCR反应在下列条件下进行：a)变性步骤：94℃反应2分钟；b)循环步骤：94℃反应30秒，60℃反应30秒，72℃反应1分钟；c)最后的延长步骤：72℃反应3分钟。重复这一循环直到生成足够的PCR产物。表5、6和7中的“PCR域值”报道了生成足够的PCR产物所需的最小循环次数。扩增的模版DNA序列库用异丙醇沉淀，一半PCR产物用作模版在下一轮筛选过程中转录为RNA序列库。每二轮筛选后，用10％的聚丙烯酰胺凝胶凝胶纯化转录的RNA序列库。当不用凝胶纯化时，将转录的RNA序列库用两个Centri-Spin10色谱柱(Princeton Separations Cat.#CS-101，Adelphia，NJ)脱盐。在所有的情况下，相当于1/10的总转录产物作为起始序列库进入后续的筛选过程中。

表5使用rRdY序列库进行的人vWF A1区域筛选条件

轮	靶分子	洗涤液	PCR域值	纯化
					1	24pmol hA1	4×120μL	13	脱盐(2×)
2	24pmol hA1	4×120μL	18	脱盐(2×)
					3	24pmol hA1	4×120μL	16	凝胶纯化
4	24pmol hA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
					5	24pmol hA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
6	24pmol hA1	8×120μL	15	凝胶纯化
					7	24pmol hA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
8	24pmol hA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
					9	24pmol hA1	8×120μL	10	凝胶纯化
10	24pmol hA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	脱盐(2×)
					11	12pmol全长vWF	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	20	脱盐(2×)
12	12pmol全长vWF	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	20	凝胶纯化

表6使用rRdY序列库进行的兔vWF A1区域筛选条件

轮	靶分子	洗涤液	PCR域值	纯化
					1	24pmol rA1	4×120μL	13	脱盐(2×)
2	24pmol rA1	4×120μL	18	脱盐(2×)
					3	24pmol rA1	4×120μL	10	凝胶纯化
4	24pmol rA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
					5	24pmol rA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
6	24pmol rA1	8×120μL	15	凝胶纯化
					7	24pmol rA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
8	24pmol rA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
					9	24pmol rA1	8×120μL	10	凝胶纯化
10	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	脱盐(2×)
					11	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	脱盐(2×)
12	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	凝胶纯化

表7使用rRdY序列库进行的人/兔vWF A1区域交互筛选条件

轮	靶分子	洗涤液	PCR域值	纯化
					1	12pmol hA1/12pmol rA1	4×120μL	13	脱盐(2×)
2	12pmol hA1/12pmol rA1	4×120μL	18	脱盐(2×)
					3	24pmol hA1	4×120μL	16	凝胶纯化
4	24pmol rA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
					5	24pmol hA1	8×120μL	15	脱盐(2×)
6	24pmol rA1	8×120μL	15	凝胶纯化
					7	24pmol hA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
8	24pmol rA1	8×120μL	12	脱盐(2×)
					9	24pmol hA1	8×120μL	10	凝胶纯化
10	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	脱盐(2×)
					11	12pmol vWF全长序列	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	20	脱盐(2×)
12	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	凝胶纯化

vWF结合分析

使用夹层过滤结合试验监控筛选过程。将5′-³²P-标记的RNA序列库(痕量浓度)与无靶分子蛋白参照物，100nM人vWF A1区域(序列号4)或100nM兔vWF A1区域(序列号6)在室温条件下，在包含0.1mg/mL tRNA，和0.1mg/mL鲑鱼精DNA的IX Dulbecco′s PBS(总体积50uL)溶液中培养30分，然后用定点印记仪器(Schleicher and Schuell，Keene，NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。经过第6、9、12轮之后，用三点筛选(100nM人vWF A1区域、100nM兔vWF A1区域和无靶分子参照物)的方法计算RNA序列库结合硝化纤维的百分比。将序列库的结合率与原始序列库(第0轮)的结合率相比。表8表示了rRfY序列库结合分析的结果。

表8vWF A1区域rRdY筛选序列库结合实验

筛选	序列库轮数	100nM人A1	100nM兔A1	无蛋白
					原始序列库	第0轮	9.7％	10.4％	10.5％
人vWF A1区域	第6轮	19.6％	19.7％	15.3％
					兔vWF A1区域	第6轮	14.3％	14.4％	12.3％
hA1/rA1	第6轮	19.8％	19.8％	15.9％
					人vWF A1区域	第9轮	23.8％	24.3％	15.6％
兔vWF A1区域	第9轮	24.4％	24.0％	16.6％
					hA1/rA1	第9轮	19.6％	19.4％	14.6％
人vWF A1区域	第12轮	25.8％	23.0％	17.0％
					兔vWF A1区域	第12轮	20.7％	20.5％	13.8％
hA1/rA1	第12轮	25.2％	26.3％	16.8％

与不存在蛋白的对照相比，当观察到相当比例的RNA与存在的人或兔的vWF A1区域结合时，依照操作说明，用TOPO TA克隆试剂盒(rnvitrogen，Cat.#45-0641，Carlsbad，CA)克隆序列库。对第9轮和第12轮的模版序列库进行克隆和测序(总共185个序列)，产生3个序列族总共78个独特的克隆体。转录、脱盐并用5-³²P末端标记物标记所有独特的克隆体，用三点定点印记筛选(无靶分子参照物、100nM人vWF A1区域(序列号5)、100nM兔vWFA1区域(序列号6))的方法进行实验。下面表9的第三栏和第四栏表示了实验数据，此实验数据是靶分子蛋白存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量与靶分子蛋白不存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量的比值。在三个序列族中，族1#和2#的序列和两个独立的非序列族适体能够与人vWF A1区域(序列号5)和兔vWF A1区域(序列号6)结合。

基于最初的筛选，使用定点印记实验测定的16个最好的vWF结合序列的K_Ds值表示。为了确定K_D值，用变性聚丙烯酰胺凝胶纯化适体转录产物，用γ³²P ATP标记5’-末端。在定点印记实验(1μM，300nM，100nM，30nM，10nM，3nM，1nM，0nM)中使用人vWF A1区域(序列号5)的6点蛋白滴定法，使用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)通过满足等式y＝(max/(1+K/protein))+yint来计算K_D值。对于实施例中描述的所有用来确定单克隆体K_D值的定点印记试验，用包括0.1mg/mL BSA的IX Dulbecco′s PBS缓冲液稀释靶分子蛋白，例如，人vWF A1区域，并在过滤和定量之间，将稀释的靶分子蛋白与标记的适体一起在24℃条件下培养30分。

表9人和兔的vWF A1区域rRdY适体结合活性

#	适体	筛选-人/无蛋白	筛选-兔/无蛋白	人A1区域KD值(nM)
					1	(AMX 203.D6)(序列号31)	1.92	1.57	523
2	(AMX 205.H8)(序列号32)	2.04	2.84	788
					3	(AMX 205.H11)(序列号33)	2.18	2.41	144
4	(AMX 205.A7)(序列号34)	1.24	1.37	ND
					5	(AMX 205.D 11)(序列号35)	2.22	2.07	124

6	(AMX 206.F9)(序列号36)	2.98	3.00	139
					7	(AMX 206.H9)(序列号37)	1.98	2.31	109
8	(AMX 206.A10)(序列号38)	2.62	2.58	111
					9	(AMX 205.F9)(序列号39)	2.22	2.47	145
10	(AMX 206.E7)(序列号40)	2.11	2.26	151
					11	(AMX 206.D7)(序列号41)	2.19	2.08	187
12	(AMX 203.A6)(序列号42)	1.16	1.16	ND
					13	(AMX 203.A1)(序列号43)	2.99	2.67	1148
14	(AMX 203.G9)(序列号44)	1.65	1.35	1.3
					15	(AMX 205.H9)(序列号45)	2.36	3.14	178
16	(AMX 206.D8)(序列号46)	2.80	3.76	370
					17	(AMX 203.F9)(序列号47)	1.45	1.29	ND
18	(AMX 205.G9)(序列号48)	1.30	1.73	ND
					19	(AMX 205.F7)(序列号49)	3.13	2.37	1.5
20	(AMX 205.H10)(序列号50)	1.88	2.47	397

序列号5的人vWF A1区域用于适体筛选和适体KDs值测定

ND＝未实验

下面列出了表9所表示的rRdY适体的核酸序列。下列每个适体的独特序列开始于第18位核苷，紧接着是序列GGAGCGCACTCAGCCAC(序列号221)，一直延伸到3’末端固定的核酸序列TTTCGACCTCTCTGC TAGC(序列号222)。

除非另有说明，下面列出的每个序列是从5’端到3’端表示的，且在rRdY SELEX^TM条件下进行的筛选，其中所有的三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷是2’-OH，三磷酸胞苷和三磷酸尿苷是脱氧的。

vWF rRdY筛选Family#1

下列序列中黑体和加下划线的部分表示了vWF rRdY Family#1的核心靶分子蛋白结合部分：

(AMX203.G9)(ARC842)序列号44

GGAGCGCACT

GTGTCGAAGGGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX203.F9)序列号47

GGAGCGCACTCAGCTGCGCGTGTATTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX203.A6)序列号42

GGAGCGCACTCA

ATTGCGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

预计的能够结合本发明一些实施方案中vWF靶分子的二级结构和核心核酸序列在图12种表示为序列号218.

vWF rRdY SELEX^TM Family#2

(AMX203.D6)序列号31

GGAGCGCACTCAGCCACAGTTCTGTCGGTGATGAATTAGCGCGAGAGCTGTGGGACGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX205.H8)，序列号32

GGAGCGCACTCAGCCACAAACGGACGGTGATGGATTAACGCGGGTTTATGGCAAGGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX205.H11)，序列号33

GGAGCGCACTCAGCCACGGCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCATTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX205.D11)，序列号35

GGAGCGCACTCAGCCACGGCACGACGGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCATTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX206.F9)，序列号36

GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGCTCCGTGGTACACATTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX206.H9)，序列号37

GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGTTCCGTGGTACACCTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX206.A10)，序列号38

GGAGCGCACTCAGCCACGGCATGACGGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCATTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX205.F9)，序列号39

GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGCTCCGTGGTACGCCTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX206.E7)，序列号40

GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGCTCCGTGGTACACCTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX206.D7)，序列号41

GGAGCGCACTCAGCCACGGCACGACGGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTTATTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX203.A1)，序列号43

GGAGCGCACTCAGCCACAGTTCTGTCGGTGATGAATTAGCGCGGGAGCTGTGGGACGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX205.H9)，序列号45

GGAGCGCACTCAGCCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGGAGAAGATGCGCTGTTGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX206.D8)，序列号46

GGAGCGCACTCAGCCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGGATCTTAACGTGCGAGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX205.G9)，序列号48

GGAGCGCACTCAGCCACAACTGGTTGTCGGTGATGGCATTAACGCGGACCAGGCATGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX205.H10)，序列号50

GGAGCGCACTCAGCCACTGTTGCCGACGGTGATGTATTAACGCGGGCAACGTTGGTGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

vWF rRdY SELEX ^TM 单一序列

下面的黑体和加下划线部分表示了序列号49的预计核心核酸结合部分：

(AMX205.F7)(ARC 841)序列号49

GGAGCGCACTTTTGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

(AMX205.A7)，序列号34

GGAGCGCACTCAGCCACTCAAGGGGGTCGCGTGGGGACGAAGGGTTGCAGTGTGTCGTTTCGACCTCTCTGCTAGC

预计的能够结合本发明某些实施方案的vWF靶分子的核心核酸序列和二级结构在图13中表示为序列号219.

实施例1C：vWF A1区域适体DNA筛选#1

用由脱氧核苷(DNA)组成的核苷库进行筛选来鉴别能够结合(1)人vWF A1区域，(2)兔vWF A1区域或(3)人和兔的vWF A1区域的适体。筛选方案产生的高亲和性适体对固定在疏水平皿上的人和兔的vWF A1区域具有特异性。

序列库制备

使用ABI EXPEDITE^TM DNA合成仪合成序列为5′-CTACCTACGATCTGACTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCTTACTCTCATGTAGTTCC-3′(序列号51)(ARC 493)的DNA模版，然后用标准的方法去保护。DNA模版(序列号51)中的一系列N可以是任一核苷酸的结合，并使产生的适体具有独特的序列区域。用引物(5′-CTACCTACGATCTGACTAGC-3′)(序列号52)和(5′-AGGAACTACATGAGAGTAAGC(OH)-3′)(序列号53)在标准条件下扩增模板。PCR产物用碱水解(333mM NaOH，90℃，15分钟)之后沉淀。用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA，以较慢移动性移动的单链DNA从凝胶中分离出来，用异丙醇被动的洗提沉淀。

筛选

为了筛选人vWF，在100μL IX Dulbecco′s PBS(Gibco BRL，Cat.#14040-133，Carlsbad，CA)中，在室温条件下，将24pmoles的人vWF A1区域(序列号4)固定到Nunc Maxisorp疏水性平皿(Nunc Cat.#_446612，Rochester，纽约)上1小时，起始头10轮筛选。对于第11轮和12轮筛选，将12pmoles人vWF全长序列(序列号7)固定到疏水性平皿上。对于兔vWF筛选，在与固定人vWFA1区域相同的条件下固定24pmoles兔vWF A1区域(序列号6)，起始每一轮筛选过程。对于人/兔交互筛选的头两轮，将12pmole的人vWF A1区域(序列号4)和12pmole兔vWF A1区域(序列号6)按照前面的描述固定在疏水性平皿上。在交互筛选随后的几轮中，每轮筛选过程中人和兔的vWF A1区域(分别是序列号4和5)交替作为蛋白质靶分子，第11轮例外，在第11轮，使用人vWF全长序列(序列号7)。

在所有情况下，在进行一小时的蛋白质固定之后，去掉上清液，用120μL IX Dulbecco′s PBS洗涤小孔4次。然后在室温条件下，用100uL封闭缓冲液(含有1％BSA的IX Dulbecco ′s PBS)封闭固定蛋白质的小孔1小时。在第一轮，在100μL IX Dulbecco′s PBS中，在包括BSA-封闭的固定化蛋白质靶分子的小孔中，在室温条件下培养333pmoles RNA序列库(2x 10¹⁴独立的分子)1小时。然后去掉上清液，用120μL IX Dulbecco′s PBS洗涤小孔。在随后的几轮中，添加另外的洗涤步骤来增加阳性筛选步骤的严格度(见表10、11和12)。从第2轮开始到所有随后的步骤中，在阳性筛选步骤之前包括二个阴性筛选步骤。首先，RNA序列库在未封闭的小孔中室温下培养1小时从而从序列库中去掉塑性结合序列。在第二阴性筛选步骤，在室温条件下，RNA转入BSA封闭的小孔(不包括蛋白质靶分子)中1小时，从而在阳性筛选之前，从序列库中去掉任一BSA结合序列。从第2轮开始到随后的几轮中，在阳性筛选反应中掺入0.1mg/mL tRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA，作为非特异性竞争剂。

在所有情况下，结合固定化蛋白质靶分子的RNA序列库用2x100μL含有洗提缓冲液(预加热至90℃，7M尿素，100mMNaOAc，pH 5.3，3mM EDTA)的洗涤液洗提5分钟。倒出洗脱液并用乙醇沉淀，然后用初始PCR反应(100μL反应物包括序列号52的5′-前体、序列号为53的3′-前体和Taq聚合酶(New EnglandBiolabs Cat.#MO267L，Beverly，MA))。PCR反应在下列条件下进行：a)变性步骤：94℃反应2分钟；b)循环步骤：94℃反应30秒，60℃反应30秒，72℃反应1分钟；c)最后的延长步骤：72℃反应3分钟。重复这一循环直到生成足够的PCR产物。表10、11和12中的“PCR域值”报道了生成足够的PCR产物所需的最小循环次数。10μL PCR产物加入到另外300μL PCR混合物中进行制备规模的PCR反应(prep-scale PCR)。制备规模的PCR反应产物用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA，以较慢移动性移动的单链DNA从凝胶中分离出来，用异丙醇被动的洗提沉淀。在所有的情况下，相当于1/2的总转录产物作为起始序列库进入后续的筛选过程中。

表10使用DNA序列库进行的人vWF A1区域筛选条件

轮	靶分子	洗涤液	PCR域值	纯化
					1	24pmol hA1	4×120μL	10	凝胶纯化
2	24pmol hA1	4×120μL	15	凝胶纯化
					3	24pmol hA1	4×120μL	13	凝胶纯化
4	24pmol hA1	8×120μL	15	凝胶纯化
					5	24pmol hA1	8×120μL	15	凝胶纯化
6	24pmol hA1	8×120μL	20	凝胶纯化
					7	24pmol hA1	8×120μL	10	凝胶纯化
8	24pmol hA1	8×120μL	10	凝胶纯化
					9	24pmol hA1	8×120μL	10	凝胶纯化
10	24pmol hA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	12	凝胶纯化
					11	12pmol全长vWF	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	18	凝胶纯化
12	12pmol全长vWF	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	15	凝胶纯化

表11使用DNA序列库进行的兔vWF A1区域筛选条件

轮	靶分子	洗涤液	PCR域值	纯化
					1	24pmol rA1	4×120μL	10	凝胶纯化
2	24pmol rA1	4×120μL	13	凝胶纯化
					3	24pmol rA1	4×120μL	13	凝胶纯化
4	24pmol rA1	8×120μL	15	凝胶纯化
					5	24pmol rA1	8×120μL	15	凝胶纯化
6	24pmol rA1	8×120μL	20	凝胶纯化
					7	24pmol rA1	8×120μL	10	凝胶纯化
8	24pmol rA1	8×120μL	10	凝胶纯化
					9	24pmol rA1	8×120μL	10	凝胶纯化
10	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	12	凝胶纯化
					11	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	凝胶纯化
12	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	凝胶纯化

表12使用DNA序列库进行的人/兔vWF A1区域交互筛选条件

轮	靶分子	洗涤液	PCR域值	纯化
					1	12pmol hA1/12pmol rA1	4×120μL	12	凝胶纯化
2	12pmol hA1/12pmol rA1	4×120μL	15	凝胶纯化
					3	24pmol hA1	4×120μL	10	凝胶纯化
4	24pmol rA1	8×120μL	15	凝胶纯化
					5	24pmol hA1	8×120μL	15	凝胶纯化
6	24pmol rA1	8×120μL	20	凝胶纯化
					7	24pmol hA1	8×120μL	12	凝胶纯化
8	24pmol rA1	8×120μL	12	凝胶纯化
					9	24pmol hA1	8×120μL	12	凝胶纯化
10	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	12	凝胶纯化
					11	12pmol vWF全长序列	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	18	凝胶纯化
12	24pmol rA1	6×120μL；2×120μL(每15分钟)	10	凝胶纯化

vWF结合分析

使用夹层过滤结合试验监控筛选过程。将5′-³²P-标记的RNA序列库(痕量浓度)与无靶分子蛋白参照物，100nM人vWF A1区域(序列号4)或100nM兔vWF A1区域(序列号6)在室温条件下，在包含0.1mg/mL tRNA，和0.1mg/mL鲑鱼精DNA的IX Dulbecco′s PBS(总体积50uL)溶液中培养30分，然后用定点印记仪器(Schleicher and Schuell，Keene，NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。经过第6、9、12轮之后，用三点筛选(100nM人vWF A1区域、100nM兔vWF A1区域和无靶分子参照物)的方法计算RNA序列库结合硝化纤维的百分比。将序列库的结合率与原始序列库(第0轮)的结合率相比。表13表示了rRfY序列库结合分析的结果。

表13vWF A1区域DNA筛选序列库结合实验

筛选	序列库轮数	100nM人A1	100nM兔A1	无蛋白
					原始序列库	第0轮	30.1％	35.4％	29.4％
人vWF A1区域	第6轮	34.4％	36.4％	NA
					兔vWF A1区域	第6轮	37.9％	36.8％	35.6％
hA1/rA1	第6轮	47.9％	50.6％	49.0％
					人vWF A1区域	第9轮	30.4％	43.7％	19.1％
兔vWF A1区域	第9轮	15.9％	35.0％	6.6％
					hA1/rA1	第9轮	40.8％	49.5％	34.7％
人vWF A1区域	第12轮	36.7％	45.9％	33.0％
					兔vWF A1区域	第12轮	23.7％	38.7％	13.4％
hA1/rA1	第12轮	21.4％	34.2％	16.4％

与不存在蛋白的对照相比，当观察到相当比例的DNA与存在的人或兔的vWF A1区域结合时，依照操作说明，用TOPO TA克隆试剂盒(invitrogen，Cat.#45-0641，Carlsbad，CA)克隆序列库。对第9轮和第12轮的模版序列库进行克隆和测序(总共243个序列)，产生8个序列族总共106个独特的克隆体。其中41个能够结合vWF靶分子，且属于下面描述的序列族。

所有独特的克隆体用三点定点印记筛选(无靶分子参照物、100nM人vWF A1区域(序列号5)、100nM兔vWF A1区域(序列号6))的方法进行实验。下面表14的第三栏和第四栏表示了实验数据，此实验数据是靶分子蛋白存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量与靶分子蛋白不存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量的比值。

基于最初的筛选，使用定点印记实验测定的10个最好的vWF结合序列的K_Ds值表示在图4的第五栏内。为了确定K_D值，用γ-32P ATP标记5’-末端，以100nM的持续的蛋白浓度进行竞争性定点印记试验。使用0.1mg/mL BSA加IX Dulbecco′s PBS缓冲液进行8点冷却竞争性DNA滴定(333nM，100nM，33nM，10nM，3nM，1nM，33pM，0nM)30分，使用KaleidaGraph(Kaleida Graphv.3.51，Synergy Software)通过满足等式y＝(max/(1+K/protein))+yint来计算K_D值。表14列出蛋白结合特性的结果。

表14人和兔的vWF A1区域rRdY适体结合活性

#	适体	筛选人/无蛋白	筛选兔/无蛋白	人A1区域KD值(nM)
					1	(AMX 199.B3)(序列号54)	1.76	1.99	30
2	(AMX 199.D11)(序列号55)	4.19	3.42	30
					3	(AMX 200.G11)(序列号56)	1.73	1.28	ND
4	(AMX 200.D11)(序列号57)	3.34	2.04	ND
					5	(AMX 200.D8)(序列号58)	2.86	1.61	ND
6	(AMX 200.C11)(序列号59)	6.00	3.64	26
					7	(AMX 199.G10)(序列号60)	4.97	2.66	22
8	(AMX 199.F7)(序列号61)	5.47	5.00	22
					9	(AMX 200.A7)(序列号62)	0.97	0.96	ND
10	(AMX 200.B9)(序列号63)	2.54	2.06	ND
					11	(AMX 200.B1)(序列号64)	4.01	3.01	ND
12	(AMX 199.C2)(序列号65)	5.09	4.61	17
					13	(AMX 200.B8)(序列号66)	4.13	3.13	ND
14	(AMX 200.F1)(序列号67)	3.83	3.25	34

15	(AMX 200.D1)(序列号68)	1.26	1.06	ND
					16	(AMX 200.F9)(序列号69)	0.97	0.99	ND
17	(AMX 199.B7)(序列号70)	4.08	3.65	29
					18	(AMX 200.D3)(序列号71)	2.68	2.41	36
19	(AMX 199.C4)(序列号72)	3.60	2.85	34
					20	(AMX 200.E8)(序列号73)	1.04	1.03	ND
21	(AMX 199.F10)(序列号74)	1.17	1.24	ND
					22	(AMX 199.F6)(序列号75)	1.37	1.30	ND
23	(AMX 199.G5)(序列号76)	1.41	1.34	ND
					24	(AMX 199.F11)(序列号77)	1.44	1.35	ND
25	(AMX 199.H7)(序列号78)	1.32	1.14	ND
					26	(AMX 199.A10)(序列号79)	1.25	1.29	ND
27	(AMX 199.G1)(序列号80)	1.19	1.26	ND
					28	(AMX 199.F1)(序列号81)	1.32	1.36	ND
29	(AMX 199.G4)(序列号82)	1.19	1.11	ND
					30	(AMX 200.A11)(序列号83)	1.49	1.19	ND
31	DL.159.83.31(AMX 200.H8)(序列号84)	1.86	1.27	ND
					32	(AMX 199.F8)(序列号85)	1.78	1.79	ND
33	(AMX 199.B6)(序列号86)	20.1	1.91	ND
					34	(AMX 199.D8)(序列号87)	1.89	2.00	ND
35	(AMX 200.E10)(序列号88)	1.69	1.82	ND
					36	(AMX 202.H10)(序列号89)	1.92	1.76	ND
37	(AMX 202.B8)(序列号90)	1.66	1.41	ND
					38	(AMX 202.D6)(序列号91)	1.94	1.55	ND
39	(AMX 202.A3)(序列号92)	2.28	2.10	ND
					40	DL.159.83.98(AMX 202.A8)(序列号93)	1.27	1.27	ND
41	(AMX 202.F6)(序列号94)	1.49	1.46	ND

使用序列号5的人vWF A1区域用于适体筛选和适体K_Ds值测定

ND＝未实验

下面列出了表14所表示的DNA适体的核酸序列。下列每个适体的独特序列开始于第21位核苷，紧接着是序列CTACCTACGATCTGACTAGC(序列号52)，一直延伸到3’末端固定的核酸序列GCTTACTCTCATGTAGTTCC(序列号223)。

除非另有说明，下面列出的每个序列是从5’端到3’端表示的，且在DNA SELEX^TM条件下进行的筛选，其中所有核苷都是是脱氧的。

DNA SELEX ^TM  1，Family#1

在适体AMX 199.B3(序列号54)和一致性序列(序列号95)中用黑体加下划线表示了预计的DNA SELEX^TM 1，Family#1核心核酸结合序列。

(AMX199.B3)序列号54

CTACCTACGATCTGACTAGCGGA

GTAGTTC

(AMX200.C11)序列号59

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.G11)序列号56

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAACGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.D11)序列号55

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.D8)序列号58

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGTTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.D11)序列号57

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATAAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.F7)序列号61

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.A7)序列号62

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGTTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX202.D6)序列号91

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAAGGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.B1)序列号64

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCCCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.G10)序列号60

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGTTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.B8)序列号66

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCACAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.B9)序列号63

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGACTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX202.B8)序列号90

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGTATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX202.H10)序列号89

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAAGGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.F9)序列号69

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGATGGATTGGTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX202.A3)序列号92

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGCGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.C2)序列号65

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATTGCCCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.F11)序列号67

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.D1)序列号68

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGATGGATTGCTCAGGTCTACTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.C4)序列号72

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGATGGATTGCACAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.D3)序列号71

CTACCTACGATCTGACTAGCGCAATGAGGATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.B7)序列号70

CTACCTACGATCTGACTAGCGGGATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.E8)序列号73

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGTTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

DNA SELEX 1，Family#1的一致性序列如下所示：

序列号95

CTACCTACGATCTGACTAGCGGA

GTAGTTCC

其中Y＝C或T，R＝A或G且H＝A，C或T

DNA SELET ^TM  1Family#2

(AMX199.F10)序列号74

(AMX199.F10)序列号74

CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCCGTTCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX199.F6)序列号75

CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGCTCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.H7)序列号78

CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCCGCTTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.G5)序列号76

CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGCCCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.F11)序列号77

CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCTGCTCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.A10)序列号79

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGTTTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.G1)序列号80

CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGCTTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.G4)序列号82

CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGGTTGGTGTGTTCCCGCTTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.F1)序列号81

CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGCTATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

DNA SELEX Family#2的一致性序列如下所示：

序列号96

CTACCTACGATCTGACTAGCGRAACACTAGGTTGGTTAGGRT

TGGTGTGTTYCYGYYHGCTTACTCTCATGTAGTTCC

其中Y＝C或T，R＝A或G且H＝A，C或T

DNA SELET ^TM  1Family#3

(AMX199.B6)序列号86

CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGTACCTCCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.D8)序列号87

CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGCATCTTCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX199.F8)序列号85

CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGCACCTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.E10)序列号88

CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTCGGCACCTTTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX202.F6)序列号94

CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTCGGCACCTTCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX202.A8)序列号93

CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTCGGCACTTCCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

DNA SELEX^TM 1，Family#4

(AMX200.A11)序列号83

CTACCTACGATCTGACTAGCTGAGTAGTTAGTAACTTTTTATTATGGTTTGGTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

(AMX200.H8)序列号84

CTACCTACGATCTGACTAGCTGAGTAGTCAGTAATTTTTTATTATGGTTTGGTGGGCCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

实施例1D：vWF适体DNA筛选#2

在交互筛选过程中，使用人vWF全长序列和兔vWF A1区域进行单组DNA筛选。虽然不希望局限于任何理论，但是我们假定，这种筛选需要成功筛选的适体与vWF全长结合，与vWF A1区域特异性结合，且能够在人和兔蛋白间发生交互作用。如下面实施例3所述，从第二组DNA筛选所得的显性序列族能够结合人vWF全长序列、兔vWF A1区域，且在FACS和BIPA生物实验中具有功能性。

用人vWF全长序列/兔vWF A1区域交互筛选方法进行筛选过程来鉴别能够结合人vWF全长序列和兔vWF A1区域的适体。该筛选使用由脱氧核苷(DNA)组成的核苷酸序列库。筛选方案产生的高亲和性适体对固定在疏水平皿上的人vWF全长序列和兔vWF A1区域具有特异性。

序列库制备

使用ABI EXPEDITE^TM DNA合成仪合成序列为5′-CTACCTACGATCTGACTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCTTACTCTCATGTAGTTCC-3′(序列号51)(ARC 493)的DNA模版，然后用标准的方法去保护。DNA模版(序列号51)中的一系列N可以是任一核苷酸的结合，并使产生的适体具有独特的序列区域。用引物(5′-CTACCTACGATCTGACTAGC-3′)(序列号52)和(5′-AGGAACTACATGAGAGTAAGC(OH)-3′)(序列号53)在标准条件下扩增模板。PCR产物用碱水解(333mM NaOH，90℃，15分钟)之后沉淀。用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA，以较慢移动性移动的单链DNA从凝胶中分离出来，用异丙醇被动的洗提沉淀。

筛选

对于头3轮人vWF全长序列/兔vWF A1区域交互筛选，将24pmoles的人vWF全长序列(序列号7)和24pmoles兔vWF A1区域固定。在随后的几轮中，每轮筛选过程中人vWF全长序列和兔的vWF A1区域交替作为蛋白质靶分子。在所有情况下，在进行一小时的蛋白质固定之后，去掉上清液，用120μL IX Dulbecco′s PBS洗涤小孔4次。然后在室温条件下，用100uL封闭缓冲液(含有1％BSA的IX Dulbecco′s PBS)封闭固定蛋白质的小孔1小时。在第一轮，在100μL IX Dulbecco′s PBS中，在包括BSA-封闭的固定化蛋白质靶分子的小孔中，在室温条件下培养333pmoles RNA序列库(2x 10¹⁴独立的分子)1小时。然后去掉上清液，用120μL IX Dulbecco′s PBS洗涤小孔。在随后的几轮中，添加另外的洗涤步骤来增加阳性筛选步骤的严格度(见表15)。在第8轮，暂停筛选而加入一种高盐的洗涤条件，作为一种可能的方法来增加SELEX^TM的严格度(使用IX Dulbecco′sPBS+400mMNaCl)。从第2轮开始到所有随后的步骤中，在阳性筛选步骤之前包括二个阴性筛选步骤。首先，RNA序列库在未封闭的小孔中室温下培养1小时从而从序列库中去掉塑性结合序列。在第二阴性筛选步骤，在室温条件下，RNA转入BSA封闭的小孔(不包括蛋白质靶分子)中1小时，从而在阳性筛选之前，从序列库中去掉任一BSA结合序列。从第2轮开始到随后的几轮中，在阳性筛选反应中掺入0.1mg/mL tRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA，作为非特异性竞争剂。

在所有情况下，结合固定化蛋白质靶分子的RNA序列库用2x100μL含有洗提缓冲液(预加热至90℃，7M尿素，100mMNaOAc，pH5.3，3mM EDTA)的洗涤液洗提5分钟。倒出洗脱液并用乙醇沉淀，然后用初始PCR反应(100μL反应物包括序列号52的5′-前体、序列号为53的3′-前体和Taq聚合酶(New EnglandBiolabs Cat.#MO267L，Beverly，MA))。PCR反应在下列条件下进行：a)变性步骤：94℃反应2分钟；b)循环步骤：94℃反应30秒，60℃反应30秒，72℃反应1分钟；c)最后的延长步骤：72℃反应3分钟。重复这一循环直到生成足够的PCR产物。表15中的“PCR域值”报道了生成足够的PCR产物所需的最小循环次数。10μLPCR产物加入到另外300μL PCR混合物中进行制备规模的PCR反应(prep-scale PCR)。制备规模的PCR反应产物用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA，以较慢移动性移动的单链DNA从凝胶中分离出来，用异丙醇被动的洗提沉淀。在所有的情况下，相当于一半的总转录产物作为起始序列库进入后续的筛选过程中。

表15使用DNA序列库进行的人vWF全长序列/兔vWF A1区域交互筛选条件

vWF结合分析

使用夹层过滤结合试验监控筛选过程。将5′-³²p-标记的RNA序列库(痕量浓度)与无靶分子蛋白参照物，100nM人vWF全长序列(Calbiochem Cat.#681300，La Jolla，CA)或100nM兔vWF A1区域在室温条件下，在包含0.1mg/mL tRNA，和0.1mg/mL鲑鱼精DNA和0.1mg/mL BSA的IX Dulbecco′s PBS(总体积50uL)溶液中培养30分，然后用定点印记仪器(Schleicher and Schuell，Keene，NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。经过第7和9轮之后，通过将无靶分子蛋白参照物、100nM人vWF全长序列(Calbiochem Cat.#681300，La Jolla，CA)和100nM兔vWF A1区域(序列号6)一起筛选，来计算RNA序列库结合硝化纤维的百分比。将序列库的结合率与原始序列库(第0轮)的结合率相比。表16表示了rRfY序列库结合分析的结果。

表16人vWF全长序列/兔vWF A1区域的DNA筛选序列库结合实验

与不存在蛋白的对照相比，当观察到相当比例的DNA与存在的人或兔的vWF A1区域结合时，依照操作说明，用TOPO TA克隆试剂盒(rnvitrogen，Cat.#45-0641，Carlsbad，CA)克隆序列库。对第7轮和第11轮的模版序列库进行克隆和测序(总共218个序列)，产生12个序列族总共146个独特的克隆体。其中6个序列族表现出结合vWF靶分子活性。所有独特的克隆体用三点定点印记筛选(无靶分子参照物、20nM人vWF全长序列(Calbiochem Cat.#681300，La Jolla，CA)、20nM兔vWF A1区域)的方法进行实验。下面表17的第三栏和第四栏表示了实验数据，此实验数据是靶分子蛋白存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量与靶分子蛋白不存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量的比值。

基于最初的筛选，使用定点印记实验测定的3个最好的vWF结合序列的K_Ds值。为了确定K_D值，用γ-³²P ATP标记5’-末端，并通过实验直接与人vWF全长序列和兔vWF A1区域结合。在0.1mg/mL BSA加IX Dulbecco′s PBS缓冲液中，在定点印记实验中室温条件下，进行12点蛋白滴定(300nM，100nM，30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，30pM，10pM，3pM，0pM)30分。使用KaleidaGraph(Kaleida Graph v.3.51，Synergy Software)通过满足等式y＝(max/(1+K/protein))+yint来计算K_D值。表17列出蛋白结合特性的结果。

表17人vWF全长序列和兔的vWF A1区域DNA适体结合活性

#	适体	筛选人/无蛋白	筛选兔/无蛋白	人vWF全长序列KD值(nM)	兔vWF A1区域KD值(nM)
						1	AMX237.A11(序列号98)	2.66	2.38	ND	ND
2	AMX237.A2(序列号99)	2.60	2.34	ND	ND
						3	AMX238.D12(序列号100)	2.40	2.19	ND	ND
4	AMX237.H5(序列号101)	1.63	1.61	ND	ND
						5	AMX237.E2(序列号102)	1.61	1.61	ND	ND
6	AMX237.B4(序列号103)	1.42	1.38	ND	ND
						7	AMX237.E9	2.13	2.06	ND	ND

	(序列号104)
						8	AMX237.D11(序列号105)	1.16	1.17	ND	ND
9	AMX238.G5(序列号106)	3.06	2.68	ND	ND
						10	AMX237.C7(序列号107)	1.15	1.16	ND	ND
11	AMX238.D5(序列号108)	1.46	1.40	ND	ND
						12	AMX237.B11(序列号109)	2.87	2.57	ND	ND
13	AMX237.F6(序列号110)	1.20	1.21	ND	ND
						14	AMX238.D8(序列号111)	2.02	1.97	ND	ND
15	AMX238.G6(序列号112)	1.25	1.22	ND	ND
						16	AMX236.F8(序列号113)	1.14	1.13	ND	ND
17	AMX237.G6(序列号114)	3.80	3.63	0.20	47
						18	AMX238.E9(序列号115)	3.44	3.36	0.39	5.3
19	AMX238.E7(序列号116)	3.02	2.83	ND	ND
						20	AMX238.F3(序列号117)	2.83	2.72	ND	ND
21	AMX238.H5	3.75	3.46	0.33	6.0

	(序列号118)
						22	AMX237.C11(序列号119)	2.04	1.95	ND	ND
23	AMX238.F2(序列号120)	2.84	2.76	ND	ND
						24	AMX237.F9(序列号121)	2.21	2.31	ND	ND
25	AMX237.F12(序列号122)	1.95	2.08	ND	ND
						26	AMX237.C9(序列号123)	2.05	2.19	ND	ND
27	AMX237.F10(序列号124)	2.90	2.90	ND	ND
						28	AMX236.H2(序列号125)	2.12	2.06	ND	ND
29	AMX237.C5(序列号126)	2.55	2.36	ND	ND
						30	AMX236.A12(序列号127)	2.64	2.41	ND	ND
31	AMX236.B8(序列号128)	1.66	1.88	ND	ND
						32	AMX236.A11(序列号129)	2.02	2.02	ND	ND
33	AMX237.D5(序列号130)	1.41	1.48	ND	ND
						34	AMX236.E6(序列号	1.31	1.49	ND	ND

	131)
						35	AMX236.C12(序列号132)	1.99	2.24	ND	ND
36	AMX237.H10(序列号133)	1.71	1.94	ND	ND
						37	AMX237.G7(序列号134)	2.68	2.54	ND	ND
38	AMX237.H8(序列号135)	1.21	1.41	ND	ND
						39	AMX236.G4(序列号136)	1.70	1.72	ND	ND
40	AMX236.C1(序列号137)	1.03	3.28	ND	ND
						41	AMX237.E10(序列号138)	1.12	6.04	ND	ND
42	AMX238.F5(序列号139)	1.05	4.40	ND	ND
						43	AMX237.C1(序列号140)	0.76	3.47	ND	ND
44	AMX237.B 12(序列号141)	1.13	4.67	ND	ND
						45	AMX238.A6(序列号142)	0.92	3.47	ND	ND
46	AMX238.A11(序列号143)	0.85	4.54	ND	ND
						47	AMX236.C6(序列号144)	1.06	5.77	ND	ND

48	AMX238.F6(序列号145)	1.18	5.36	ND	ND
						49	AMX236.E2(序列号146)	0.93	3.59	ND	ND
50	AMX238.G4(序列号147)	1.09	1.39	ND	ND
						51	AMX238.H9(序列号148)	1.11	1.32	ND	ND
52	AMX237.B1(序列号149)	2.00	2.10	ND	ND
						53	AMX238.A3(序列号150)	1.36	1.03	ND	ND
54	AMX237.C4(序列号151)	0.97	1.31	ND	ND
						55	AMX237.E5(序列号152)	0.97	1.15	ND	ND
56	AMX237.F1(序列号153)	0.98	1.22	ND	ND
						57	AMX237.F5(序列号154)	0.99	1.22	ND	ND
58	AMX238.H11(序列号155)	0.98	1.14	ND	ND
						59	AMX237.G2(序列号156)	1.02	1.16	ND	ND
60	AMX238.A12(序列号157)	1.23	0.99	ND	ND
						61	AMX236.C9	1.24	1.00	ND	ND

	(序列号158)
						62	AMX236.H1(序列号159)	1.10	1.14	ND	ND
63	AMX236.F7(序列号160)	1.18	1.20	ND	ND
						64	AMX236.B3(序列号161)	1.54	1.41	ND	ND
65	AMX238.D9(序列号162)	1.22	0.97	ND	ND
						66	AMX238.F7(序列号163)	1.20	1.88	ND	ND
67	AMX236.G1(序列号164)	1.47	1.51	ND	ND

使用的序列号7的人vWF全长序列和兔vWF A1区域用于适体筛选和适体

K_Ds值测定

ND＝未实验

下面列出了表17所表示的DNA适体的核酸序列。下列每个适体的独特序列开始于第21位核苷，紧接着是序列CTACCTACGATCTGACTAGC(序列号52)，一直延伸到3’末端固定的核酸序列GCTTACTCTCATGTAGTTCC(序列号223)。

除非另有说明，下面列出的每个序列是从5’端到3’端表示的，且在DNA SELEX^TM条件下进行的筛选，其中所有核苷都是是脱氧的。

vWF DNA SFLEX ^TM 2，Family 1.1

序列族1.1和1.2产生了ARC 1029(序列号214)的母适体。AMX 237.E9(序列号104)和AMX 238.H5(序列号118)中用黑体加下划线表示了预计的能结合靶分子血管性血友病因子的核心核酸结合序列。

AMX237.E9(序列号104)

CTACCTACGATCTGACT

TACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.B11(序列号109)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.A11(序列号98)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.G5(序列号106)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATTCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.D8(序列号111)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAACAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.E2(序列号102)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.H5(序列号101)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATTTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.D5(序列号108)

CTACCTACGATCTGAGTAGCTCCAGTGTTTTATTCAATAACCGTGCGGTGTCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.A2(序列号99)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATCCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.D12(序列号100)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATTCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.F6(序列号110)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.D11(序列号105)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATATAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.B4(序列号103)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATCCAATAACCGTGCGGTGCTTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.F8(序列号113)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.C7(序列号107)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATTCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.G6(序列号112)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAATAACCGTGCGGGGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

vWF DNA SELEX^TM2，Family#1.2

AMX238.H5(序列号118)

CTACCTACGATCTGACT

TACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.C11(序列号119)

CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.E7(序列号116)

CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTTTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.G6(序列号114)

CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTCCAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.F2(序列号120)

CTACCTACGATCTGACTAGCATGCAGTGCCCATTCTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.E9(序列号115)

CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCCATCTTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.F3(序列号117)

CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTTTAGGTCGTGCGGGGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.F10(序列号124)

CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCCATTCCAGGCCGTGCGGTATCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.C5(序列号126)

CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATCTCAGGCCGTGCGGTATCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.H2(序列号125)

CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATCCCAGGCCGTGCGGTAGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC

适体筛选中Family#1所包括的，结合本发明某些实施方案中靶分子vWF所需的预计二级结构和核心核酸序列在图15中表示为序列号220。

vWF DNA SELEX ^TM  2.结合Family#2

AMX237.C9(序列号123)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGTGACTTTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.F12(序列号122)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGATTTTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.F9(序列号121)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGATTCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.G7(序列号134)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.A12(序列号127)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.G4(序列号136)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGTGGAGATGCGGTTTGGTTGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.C12(序列号132)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCCGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.A11(序列号129)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTCTGGCCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.E6(序列号131)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACCCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

MX236.B8(序列号128)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTCTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.H8(序列号135)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACATCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.D5(序列号130)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACACTGTGGAGCTGCGGTTTGGTTGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.H10(序列号133)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCAGAGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.B1(序列号149)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACACAGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

DNA SELEX^TM 2Family#2的一致性序列如下：

序列号325

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAG Y GA Y(Y/A)Y(Y/A)G(T/A)GGAG(C/A)TGCGGT Y TGG YY GAC R

TCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

其中Y＝C或T，R＝A或G且(Y/A)＝C，T或A，

vWF DNA SELEX ^TM  2.结合Family#3

这一序列族与上面描述的vWF DNA SELEX^TM 1，Family#1是等价的，两个序列族具有至少90％的一致性。

AMX238.A11(序列号143)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGTTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.C1(序列号140)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.C6(序列号144)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.C1(序列号137)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGTTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.E10(序列号138)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.F6(序列号145)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGTATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.E2(序列号146)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGTATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.B12(序列号141)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCAGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.A6(序列号142)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCAGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.F5(序列号139)

CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAAGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

vWF DNA SELEX ^TM 2，结合#4

AMX237.G2(序列号156)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTTCATATTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.C4(序列号151)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTCCACATTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.F5(序列号154)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTTTAGTCTTCCACATTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.H11(序列号155)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTTCACATTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.G4(序列号147)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGTCGCACTTTTGGTTGGTCTGGTTGGTTCTAAGTGCGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.E5(序列号152)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTCTACATTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.H9(序列号148)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTGTCGCACTTTTGGTTGGTCTGGTTGGTTTTAAGTGCGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX237.F1(序列号153)

CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTCCACGTTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

vWF DNA SELEX ^TM 2，Family#5

AMX236.G1(序列号164)

CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATTGTCTCCGGCTGACTTGTTTTAATCTTCTGAGTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.B3(序列号161)

CTACCTACGATCTGACTAGCCTTACCTATTCCCTTCTGCGGAATACGTCGAGTACTATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.F7(序列号160)

CTACCTACGATCTGACTAGCCCCCACTTATCGTGTACCTTATGATATGTCGAATACTCTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.H1(序列号159)

CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATTGACTCCGGCCGACTTGTTTTAATCTTCTGAGTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

SELEX 2Family#5的DNA一致性序列如下：

序列号326

Family5.1＝序列号164和序列号159

CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATTGACTCCGGCYGACT

TGTTTTAATCTTCTGAGTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

其中Y＝C或T

序列号327

Family 5.2＝序列号161和序列号160

CTACCTACGATCTGACTAGCC YY AC Y TAT Y(C/G)Y(C/G)T

(T/A)C Y(GTT)Y R(G/T)R ATA Y GTCGA R TACT(AJC)

TGCTTACTCTCATGTAGTTCC

其中Y＝C或T，R＝A或G

vWF DNA SELEX ^TM  2.Family#6

AMX238.A3(序列号150)

CTACCTACGATCTGACTAGCTCAAAGTATTACTTATTGGCAATAAGTCGTTTACTCTATAGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.F7(序列号163)

CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGCATCTTTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX236.C9(序列号158)

CTACCTACGATCTGACTAGCCAGTTCTGGGAAAAATTATTTTTTTATTTCGATCGTATTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.D9(序列号162)

CTACCTACGATCTGACTAGCCAGTTCTGGGAAAAATCATTTTTTATTTCGATCGTATTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC

AMX238.A12(序列号157)

CTACCTACGATCTGACTAGCCAGTTCTGGGAAAAATTATTTTTTTATTTCGATCGTATATGCTTACTCTCATGTAGTTCC

实施例2：组合物、序列优化和测序

实施例2A：rRfY vWF适体的切断

基于实施例1所描述的vWF结合分析和下面实施例3描述的基于细胞的实验数据，从rRfY筛选株重选择适体ARC 840(AMX201.C8)(序列号23)进行进一步定性分析。

为了鉴定结合vWF所需的核心结构成分，确定了ARC 840(AMX 201.C8)(序列号23)的3’-边界。RNA转录产物全长序列的5’-末端用γ-³²P ATP和T4聚核苷酸激酶标记。放射性标记的配体经过部分碱水解，然后在经过硝化纤维过滤器之前，在溶液中，选择性的与500nM人血管性血友病因子A1区域(序列号5)结合。保留的和未保留的低聚核苷酸分别溶解于8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中。能够与vWF结合的最小的低聚核苷酸定义为3’-边界。基于边界实验和预计折叠的视觉检测，设计了一组最小化序列。使用从Rochester大学下载的第4.1版RNAstructure预计本发明核酸序列的折叠。RNAstructure是Zuker运算法则的Windows执行方式，可以根据自由能最小化原理(参见Mathews，D.H.；Disney，M.D.；Childs，J.L.；Schroeder，SJ.；Zuker，M.；和Turner，D.H 2004年在美国国家科学院学报101卷7287-7292页发表的名为“将化学修饰限制引入动态规划法则来预计RNA二级结构”的文献″)预计RNA二级结构。RNAstructure 4.1使用得自Turner实验室最新的热力学参数。

对于最小化rRfY适体，如下所述，嘌呤包括2’-OH修饰，所述嘧啶包括2’-F修饰，同时，模版和引物包括未修饰的脱氧核糖核苷。

对于最小化rRfY适体5′-GGAGCGCACUCAGCCACCCUCGCAAGCAUUUUAAGAAUGACUUGUGC CGCUGGCUG-3′(序列号165)，使用5′PCR引物5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR引物5′-CAGCCAGCGGCACAAGTC-3′(序列号167)来扩增模版5′-TCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACCCTCGCAAGCATTTTAAGAATGACTTGTGCCGCTGGCTG-3′(序列号168).

为了最小化适体5′-GGACCACCCUCGCAAGCAUUUUAAGAAUGACUUGUGCCGCUGGUCC-3′(序列号169)，使用5′PCR引物5′-GATCGAT CTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR引物5′-GGACCAGCGGCACAAGTC-3′(序列号170)来扩增模版5′-GATCGATCTAAT ACGACTCACTATAGGACCACCCTCGC AAGCATTTTAAGAATGACTTGTGCCGCTGGTCC-3′(序列号171).

为了最小化适体5′-GGACCACCCUCGCAAGCAUUGAGAAAUGACUUGUGCCGCUGGUCC-3′(序列号172)，使用5′PCR引物5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR引物5′-GGACCAGCGGCACAAGTC-3′(序列号170)来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACT ATAGGACCACCCTCGCAAGCATTGAGAAATGACTTGTGCCGCTGGTCC-3′(序列号173).

为了最小化适体5′-GGACCACCCUCGCAACGAGAGUUGUGCCGCUGGUCC-3′(序列号174)，使用5′PCR引物5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR引物5′-GGACCA GCGGCACAACTC-3′(序列号175)来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCAC TATAG GACCACCCTCGCAACGAGAGTTGTGCCGCTGGTCC-3′(序列号176).

转录上述所有最小化适体，并用15％变性聚丙烯酰胺凝胶纯化，用γ³²P ATP进行5-³²P末端标记，然后，用两个Centri-Spin 10色谱柱(Princeton Separations Cat.#CS-IO1，Adelphia，NJ)脱盐，这些最小化适体在后面实施例3的细胞实验中进行初步定性。

实施例2B：rRdY vWF适体的切断

基于实施例1所描述的vWF结合分析和下面实施例3描述的基于细胞的实验数据，分别对适体AMX 203.G9(序列号44)和AMX 205.F7(序列号49)进行进一步定性分析。

为了鉴定结合vWF所需的核心结构成分，确定了AMX203.G9(序列号44)和AMX 205.F7(序列号49)的3’-边界。RNA转录产物全长序列的5’-末端用γ-³²P ATP和T4聚核苷酸激酶标记。放射性标记的配体经过部分碱水解，然后在经过硝化纤维过滤器之前，在溶液中，选择性的与500nM人血管性血友病因子A1区域(序列号5)结合。能够与vWF结合的最小的低聚核苷酸定义为3’-边界。基于边界实验和预计折叠的视觉检测，使用RNAstructure 4.1版设计了一组最小化序列

如下所述，为了最小化rRdY适体，所有的嘌呤都是2′-OH嘌呤，所有的嘧啶都是脱氧嘧啶，同时模版和引物包括未修饰的脱氧核糖核酸。下列三组最小化适体序列衍生自DL.159.87.70(序列44)：

为了最小化适体序列5′-GGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCT-3′(序列号177)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-AGCCACATACCCGCCGTC-3′(序列号178)来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCT-3′(序列号179).

为了最小化适体序列5′-GGAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCTCC-3′(序列号180)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-GGAGCCACATACCCGCCG-3′(序列号181)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA GGAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTA TGTGGCTCC-3′(序列号182).

为了最小化适体序列5′-GGGACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTCCC-3′(序列号183)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-GGGAC ATACCCGCCG-3′(序列号184)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGGACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGT CCC-3′(序列号185).

下列7个最小化适体衍生自序列号49的适体：

为了最小化适体序列5′-GGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGG CTG-3′(序列号186)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTA TA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-CAGCCATGCGTGGTA ATT-3′(序列号187)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTG-3′(序列号188).

为了最小化适体序列5′-GGAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-S′(序列号189)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-GGAGCCATGCGTGG-3′(序列号190)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGA GCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATT ACCACGC ATGGCTCC-3′(序列号191).

为了最小化适体序列5′-GGAGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-S′(序列号192)，使用5′PCR前体b 5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-GGAGCCATGCGTGG-3′(序列号190)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA GGAGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGC CACGCATGGCTCC-3′(序列号193).

为了最小化适体序列5′-GGAGCCACACGACATTGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-S′(序列号194)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-GGAGCCATGCGTGG-SX序列号190)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGA GCCACACGACATTGGCGAGAGCCACG CATGGCTCC-3′(序列号195).

为了最小化适体序列5′-GGAGCCACACGAGAGTGGC GGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-S′(序列号196)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-GGAGCCATGCGTGG-3′(序列号190)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGAGAGTGGCGGGTTGTAATT ACCACGCATGGCTCC-3′(序列号197).

为了最小化适体序列5′-GGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCC-3′(序列号198)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-GGCCATGCGTGGCTCTC-3′(序列号199)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA GGCCAC

ACGACATTGGCGGGCGAGAGCCA CGCATGGCC-3′(序列号200).

为了最小化适体序列5′-GGAGCCACACGACATTGGCGCGAGAGCGCATGGCTCC-3′(序列号201)，使用5′PCR前体5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3′(序列号166)和3′PCR前体5′-GGAGCC ATGCGCTCTCG-3′(序列号202)，来扩增模版5′-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGCGAGAGCGC ATGGCTCC-3′(序列号203)。

rRdY vWF最小化序列结合

转录所有最小序列，用15％变性聚丙烯酰胺凝胶纯化，用γ³²PATP进行5-³²P末端标记，然后使用2个Centri-Spin 10色谱柱(Princeton Separations Cat.#CS-101，Adelphia，NJ)脱盐。为了确定K_D值，在包含0.1mg/mL BSA的IX Dulbecco′s PBS溶液(总体积为50uL)中使用0-300nM(3倍稀释)的8点蛋白滴定方法检测最小转录产物，在室温条件下反应30分，使之直接与人vWF(序列号7)全长序列、人vWF A1区域(序列号5)和兔vWF A1区域(序列号6)结合，然后然后用定点印记仪器(Schleicher and Schuell，Keene，NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。使用KaleidaGraph(Kaleida Graph v.3.51，Synergy Software)通过满足等式y＝(max/(1+K/protein))+yint来计算K_D值。表18列出蛋白结合特性的结果。

表18：rRdY适体最小结合体数据，在细胞反应中，只测试了显示出潜在活性的适体的结合亲和性(ND＝未实验)

#	最小化序列	人vWF全长序列KD值(nM)	人vWF A1区域KD值(nM)	兔vWF A1区域KD值(nM)
					1	序列号177	ND	ND	ND
2	序列号180	1	11	14
					3	序列号183	10±5	ND	14±7
4	序列号186	ND	ND	ND
					5	序列号189	1	ND	ND
6	序列号192	2±0.2	4±1	8±1
					7	序列号194		ND
8	序列号196	ND	ND	ND
					9	序列号198	3±0.6	5±2	11±2
10	序列号201	ND	ND	ND

实施例2C：DNA SELEX ^TM #1vWF适体的切断

基于上面实施例1所述的vWF结合分析和预计折叠的视觉检查，从族#1中设计出一组最小化序列，作为最好的一类结合体。在这种情况下，从族#1中得到的所有结合体是结构相关的，且通过分子5’-末端和3’-末端的碱基互补规则测定，这些结构属于四个互斥折叠(用RNAstructure 4.1预测的)之一。我们分别合成并测试这四种预计折叠。四种合成的最小化DNA适体序列分别如下所示：

序列号204

5’-CCAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGG-3’ARC 845(序列号205)

5’ATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCAT-3’

序列号206

5’-CGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATCG-3’

序列号207

5’-GATCTGACTAGCGCAATGAGGATGCdTGATGGATTGCTCAGGTC-3’

所有的最小化DNA序列都是化学合成的，用γ³²p ATP进行5-³²P末端标记，然后用两个Centri-Spin 10色谱柱(PrincetonSeparations，Cat.#CS-IO1，Adelphia，NJ)脱盐。为了确定KD值，使用竞争性定点印记试验，维持10nM稳定的蛋白浓度，室温下，在包含0.1mg/mL BSA的IX Dulbecco′s PBS溶液中(最终体积为50uL)进行12点冷竞争性DNA滴定(3uM，1uM，333nM，100nM，33nM，10nM，3.3nM，1nM，333pM，100pM，33.3pM，0pM)30分，从而测定最小化序列与人vWF A1区域(序列号5)的结合。使用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)，通过等式y＝(max/(1+K/protem))+yint计算K_D值。表19列出了蛋白结合特性结果。如图所示，最小化序列构建物中，只有ARC845即能与人vWF A1区域结合，又能与兔vWF A1区域结合。

表19DNA 1最小化序列结合数据(ND＝未实验)

#	最小化序列	人vWF全长序列KD值(nM)	人vWF A1区域KD值(nM)	兔vWF A1区域KD值(nM)
					1	ARC 845＝序列号205	未结合	10
2	序列号204	ND	未结合	未结合
					3	序列号206	ND	末结合
4	序列号207	ND	未结合

基于这些结合结果，ARC 845(序列号205)代表了DNASELEX^TM 1，族1适体的核心核酸结合序列。

实施例2D：DNA vWF交互筛选适体最小化

基于实施例1所描述的vWF结合分析和下面实施例3描述的基于细胞的实验数据，还有对适体AMX 237.B 11(序列号109)和AMX 236.A12(序列号127)预计折叠的视觉观察，设计了一系列最小化适体。另外，基于观察，在细胞实验中适体AMX 237.G6(序列号114)，AMX 238.E9(序列号115)，和AMX 238.H5(序列号118)更为有效，因此合成了一系列最小化序列ARC 1027-1031(序列号212-216)。最小化序列序列号208和序列号209代表了两个从适体AMX237.B11(序列号109)中预计的互斥折叠。

上述最小化DNA适体的核酸序列如下：

(序列号208)

5’-GGACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTCC-3’

(序列号209)

5’-GGAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTCC-3’

(序列号210)

5’-GGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTCC-3’

(序列号211)

5’-GGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTTTGG-3’

ARC1027(序列号212)

5’-GGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3’

ARC1028(序列号213)

5’-dGCGTGCAGTGCCT-[PEG]-AGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3’

ARC1029(序列号214)

5’-GGCGTGCAGTGCC-[PEG]-GGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3’

ARC1030(序列号215)

5’-GGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGG-[PEG]-CCGTCACGCC-3T-3’

ARC1031(序列号216)

5’-GGCGTGCAGTGCCT-[PEG]-AGGCCGTGCGG-[PEG]-CCGTCACGCC-3T-3’

上述所有最小化适体都是化学合成的，用15％变性聚丙烯酰胺凝胶凝胶纯化，然后按照标准方法技术用两个Centri-Spin 10色谱柱(Princeton Separations Cat.#CS-IO1，Adelphia，NJ)脱盐。如下面实施例3所述，最小化序列在细胞实验中进行定性。

在从序列号208到序列号211的最初的一系列核酸中，只有序列号208在细胞实验中表现出活性(见下面实施例3)。将适体AMX 237.B11(序列号109)和适体AMX 237.G6(序列号114)、适体AMX 238.E9(序列号115)及适体AMX 238.H5(序列号118)进行比较可知，它们是密切相关的，且能够支持最小化适体(序列号208)的预计二级结构(见图14和图15)。分子ARC 1027-1031(序列号212-216)进一步测试了我们关于适体AMX 237.G6(序列号114)、AMX 238.E9(序列号115)和AMX 238.H5(序列号118)的折叠和二级结构的假设(见图5、14和15)。

为了测定K_D值，用γ-³²P ATP对在实施例3所述的细胞实验中表现出有效活性的最小化序列进行5’-³²P末端标记，然后用两个Centri-Spin 10色谱柱(Princeton Separations，Cat.#CS-IO1，Adelphia，NJ)脱盐。在包含0.1mg/mL B SA的IX Dulbecco′s PB S缓冲液中，室温条件下，进行9点蛋白滴定(100nM，30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，30pM，0pM)30分，测试最小化适体与人vWF全长序列(序列号7)和兔vWF A1区域(序列号6)的直接结合，然后用定点印记仪器(Schleicher and Schuell，Keene，NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。使用KaleidaGraph(Kaleida Graph v.3.51，Synergy Software)通过满足等式y＝(max/(1+K/protein))+yint来计算K_D值。表20列出蛋白结合特性的结果。

表20DNA 2适体最小化序列结合数据，只测定了在细胞实验中表示出有效活性的适体最小化序列(见下面实施例3)(‘ND’＝未实验)

#	最小化序列	人vWF全长序列KD值(nM)	人vWFA1区域KD值(nM)	兔vWFA1区域KD值(nM)
					1	序列号208	ND	ND	ND
2	序列号209	ND	ND	ND
					3	序列号210	ND	ND	ND
4	序列号211	ND	ND	ND
					5	ARC 1027(序列号212)	0.8	ND	4.6
6	ARC 1028(序列号213)	1.1	ND	3.8
					7	ARC 1029(序列号214)	1.4±0.2	ND	6.5±1.5
8	ARC 1030(序列号215)	未结合	ND	未结合
					9	ARC 1031(序列号216)	未结合	ND	未结合

实施例2E：通过适体药物化学优化ARC 1029

通过系统的合成修饰方法鉴定具有高稳定性和有效性的ARC1029(序列号214)变异体，该方法包括适体合成、纯化和结合活性实验5个步骤。在适体修饰过程中，为了促进化学合成的简化，ARC 1029(序列号214)的PEG间隔体用一种短的低聚核苷酸序列dTdTdC取代，得到ARC 1115(序列号221)，如下面图16和表21所示。在ARC 1115(序列号221)的三个最初的末端合成一种高度稳定的3’-反向dT，得到ARC 1172(序列号222)，序列号222表示出与人vWF序列的结合能力，在下面的实施例中，将ARC1172(序列号222)作为修饰的基础模板。

在修饰过程的步骤1，ARC 1172(序列号222)中的每个残基分别被相应的包含2’-O-甲基的残基(除非另有指出，该残基的dT被取代)取代，得到ARC 1194(序列号223)-ARC 1134，如下面表21和图16所示。另外，在步骤1中，在ARC 1172(序列号222)的支链部分发生一组复合取代，得到ARC 1235到ARC 1243，如下面表21和图16所示。

例如，如实施例1、2、3所述，在对ARC 1029(序列号214)进行克隆筛选和切断的过程中，适体的结合试验(定点印记)、FACS实验和BIPA实验的相关效力具有很好的一致性。因此，用定点印记结合实验测定方法测得的人vWF全长序列的亲和性可以用来表现大多数合成的适体变异体的相对亲和性特点。

为了测定K_D值，化学合成的适体用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，用γ-³²P ATP标记5′末端，并检测与人vWF全长序列(Calbiochem Cat.#681300，La Jolla，CA)的直接结合能力。在包含0.1mg/mL BSA的IX Dulbecco′s PBS缓冲液中，在定点印迹实验中室温条件下，进行8点蛋白滴定(100n M，30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，0pM)30分。使用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)通过满足等式y＝(max/(1+K/protein))+yint来计算K_D值。合成、纯化并测试ARC 1029(序列号214)衍生物序列与人vWF全长序列的结合能力，表21列出蛋白结合特性的结果，在表21中，结合亲和性(K_D)表示在第四栏，适体与100nM vWF的结合程度表示在最后一栏。

表21步骤1修饰过程结合结果

序列号	ARC#	序列(5’-3’)NH2＝5’-己胺连接体磷胺(3T＝反向dT)(T＝dT)(s＝硫代磷酸酯)(mN＝包含2’-O甲基的残基)(PEG＝聚乙二醇)(dN＝脱氧残基)	KD(nM)	对100nMvWF的结合率％
					221	ARC1115	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC	2	36
222	ARC1172	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	37
					223	ARC1194	mGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	3	46
224	ARC1195	dGmGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	1	55
					225	ARC1196	dGdGmCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	46

226	ARC1197	dGdGdCmGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	46
					227	ARC1198	dGdGdCdGmUdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	0.9	50
228	ARC1199	dGdGdCdGTmGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	19	28
					229	ARC1200	dGdGdCdGTdGmCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	5	25
230	ARC1201	dGdGdCdGTdGdCmAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	0.9	6
					231	ARC1202	dGdGdCdGTdGdCdAmGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	0.4	56
232	ARC1203	dGdGdCdGTdGdCdAdGmUdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	3	40
					233	ARC1204	dGdGdCdGTdGdCdAdGTmGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	45
234	ARC1205	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGmCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	1	50
					235	ARC1206	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCmCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	50

236	ARC1207	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCmUTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	54
					237	ARC1208	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTmUdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	45
238	ARC1209	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTmCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	44
					239	ARC1210	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCmGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	49
240	ARC1211	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGmGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	47
					241	ARC1212	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGmCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	49
242	ARC1213	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCmCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	6	43
					243	ARC1214	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCmGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	3	39
244	ARC1215	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGmUdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	3	2
					245	ARC1216	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTmGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	0.6	40

246	ARC1217	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGmCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	14		18
						247	ARC1218	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCmGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	32		2
248	ARC1219	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGmGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	3		33
						249	ARC1220	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGmUdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	11		17
250	ARC1221	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTmGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	1		43
						251	ARC1222	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGmCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	0.9		40
252	ARC1223	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCmCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	36		26
						253	ARC1224	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCmUdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	0.5		47
254	ARC1225	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTmCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	11		16
						255	ARC1226	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCmCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	12		25

256	ARC1227	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCmGTdCdAdCdGdCdC-3T	3	40
					257	ARC1228	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGmUdCdAdCdGdCdC-3T	2	43
258	ARC1229	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTmCdAdCdGdCdC-3T	5	37
					259	ARC1230	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCmAdCdGdCdC-3T	3	46
260	ARC1231	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAmCdGdCdC-3T	1	50
					261	ARC1232	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCmGdCdC-3T	1	51
262	ARC1233	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGmCdC-3T	2	39
					263	ARC1234	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCmC-3T	2	42
264	ARC1235	mGmGdCmGTmGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCmAdCmGdCdC-3T	13	23
					265	ARC1236	dGdGmCdGmUdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTmCdAmCdGmCmC-3T	3	32

266	ARC1237	mGmGmCmGmUmGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTmCmAmCmGmCmC-3T	41	9
					267	ARC1238	dGdGdCdGTdGdCdAdGTmGdCdCTTdCmGmGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	2	43
268	ARC1239	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGmCmCTTdCdGdGmCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	5	37
					269	ARC1240	dGdGdCdGTdGdCdAdGTmGmCmCTTdCmGmGmCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	4	40
270	ARC1241	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCmGmGTdGdCdCTdCdCmGTdCdAdCdGdCdC-3T	nobinding	nobinding
					271	ARC1242	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGmCdGdGTdGdCdCTmCmCdGTdCdAdCdGdCdC-3T	nobinding	nobinding
272	ARC1243	dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGmCmGmGTdGdCdCTmCmCmGTdCdAdCdGdCdC-3T	nobinding	nobinding

从表21中的结合数据可以看出，最容易耐受脱氧残基被2′-O-甲基残基取代的位点与ARC 1029(序列号214)二级结构所示意的序列保守性很好的联系起来，并进一步为提议的适体结构提供支持。图15B中表示了ARC 1172(序列号222)上不耐受2′-O-Me修饰的位点和忍受2′-O-Me修饰的位点。

基于上述修饰过程步骤1描述的单个或多个脱氧适体到甲氧基适体的结构活性关系(SAR)结果，设计、合成、纯化和测试能够结合vWF的第二系列适体。这些和随后的适体的目的是获得保持亲和性为～10nM或更好，且对100nM vWF的结合程度至少为35％的分子。如图17和表21所示，在修饰过程步骤2中合成ARC 1338(序列号273)-ARC 1348(序列号283)。基于修饰步骤1的耐受性个体取代，合成带有封闭修饰的ARC 1338(序列号273)到ARC 1342。合成分别带有不同硫代磷酸酯磷酸骨架修饰的ARC 1343(序列号278)-ARC 1345(见图17和表21)。最后，合成ARC 1346(序列号281)-ARC 1348(序列号283)，如图17和表21所示，来测试茎1环、茎2环和ARC 1342的两个茎环结构中一对碱基对的移除。

表22：步骤2修饰结合结果

如表22所示，适体修饰步骤2所得的结果显示ARC 1346(序列号281)是高取代的ARC 1029(序列号214)衍生物适体迄今为止产生的最有效的适体。有趣的是，如ARC 1347(序列号282)和ARC 1348(序列号283)的结果所示，高修饰的序列不能耐受茎2环中一对碱基对的移除。

如表23和图17所示，在适体修饰步骤3种合成ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)。由于在适体修饰步骤1中实验变异株的6位上对dG到mG取代的耐受力较差，且6位上的鸟嘌呤与36位上胞嘧啶成对出现，所以，如下表23所示合成在36位上带有从mC到dC修饰的ARC 1346(序列号281)可以得到ARC 1361(序列号284)。如下表23所示，ARC 1361(序列号284)作为部分列，引入单一硫代磷酸酯磷酸骨架修饰，得到ARC1362到ARC 1381(序列号304)。

表23：修饰步骤3结合结果

如表23所示，尽管步骤3种测试的大多数修饰作用很小或者没有有效作用，但是ARC 1368(序列号291)与其母体化合物ARC 1172(序列号222)对人vWF分子具有一致的(在实验误差范围内)结合亲和性，其中，ARC 1368在mG-20和dT-21之间具有单一硫代磷酸酯修饰。

在适体修饰步骤4和步骤5中，如图18所示，合成ARC 1524(序列号305)到ARC 1535(序列号316)，ARC1546(序列号317)和ARC 1759(序列号318)。合成一种序列的循环排列，如图19所示，该循环排列能够关闭茎1环和打开茎2环。

如下表24所示，这些适体中大多数都能与vWF结合，但是没有一个像ARC 1368(序列号291)这样有效。有趣的是，尽管在适体修饰步骤1中持续生成SAR，但是只包含27位上从dT到mT单一改变的ARC 1525表现出对vWF没有结合性。在随后进行的ARC 1368(序列号291)的生物实验中，将ARC 1525作为阴性参照物。此外，在适体修饰步骤3中维持SAR数据，ARC 1759(序列号318)的结合亲和性相对于ARC 1172表现出重大的进步，ARC 1759在21位的G和22位的T之间具有单一硫代磷酸酯取代，除此之外，该序列与ARC 1172(序列号222)具有一致性。

表24：适体修饰步骤4和步骤5的结合结果

实施例2F：修饰适体的PEG部分结合

聚烯基二醇部分通过胺活化化学体与ARC 1368(序列号291)和ARC 1172(序列号222)得5’末端相结合。化学合成低聚核苷酸ARC 1635NH2-mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-dTmGdCdGdGdTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(5’-己胺修饰的ARC1368(序列号291))和ARC 1884(序列号322)NH2-dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCTdTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdC dAdCdGdCdC-3T(5’-己胺修饰的ARC 1172(序列号222))。

如下表25所示，胺修饰的适体与后合成的不同的PEG部分结合。

表25：己胺修饰或PEG结合适体

实施例3：功能性细胞实验

vWF生物依赖性实验

本实施例描述了在多种生物实验中不同的适体在封闭vWF功能中的效力。

在一个实验中使用了botrocetin。Botrocetin是从蛇毒中分离出来的蛋白，已知该蛋白可以诱导血管性血友病因子与活的且固定的血小板上的gpIb受体结合。这一反应通过vWF多聚作用可以导致固定化血小板悬浮液的胶合。在制备富集血小板的血浆(PRP)时，在vWF/botrocetin感应到胶合作用之后，血小板的代谢活动导致第二步血小板凝聚。这两个反应：vWF结合固定的血小板和vWF诱导的血小板凝聚可以用来测定本发明适体的活性。

可以用vWF的抗体来测定与固定化血小板结合的vWF的量。结合抗体与带有荧光剂的抗体一起培养并检测其中的荧光信号，用流式细胞计定量。本发明适体阻碍vWF与血小板结合的能力与荧光信号的减弱有关。

Botrocetin诱导vWF A1区域以及全长蛋白与血小板结合。发明者确定，6-组氨酸标记的兔A1区域vWF纯化蛋白可以被Botrocetin诱导与人冻干的血小板结合。用抗-聚-His抗体测定兔A1区域结合的血小板，然后与藻红蛋白结合的二级抗体一起培养。可以用流式细胞仪定量结合程度。适体阻碍兔A1与人固定化血小板结合的能力与荧光信号的减少有关。

在从人血中分离出来的富集血小板的血浆中，botrocetin通过vWF诱导血小板凝聚。由于血小板的凝聚使血浆变的澄清，所以，血小板凝聚的形成可通过Chronolog Model 490-4D血小板凝聚计上透光率％的增加视觉测定。在人血中，分析本发明的适体抑制botrocetin诱导的血小板凝聚作用(“BIPA”)的能力。在加入botrocetin之后六分钟内，如果本发明适体能够防止凝聚形成，则认为本发明的适体是由活性的。

利用PFA-100血小板功能分析仪，本实施例的另一个试验是一种使用PFA-100血小板功能分析仪的不依赖于激动剂，但依赖于vWF的试验(参见Harrison et al.，Clin.Lab.Haem.，v24，ρ225-32(2002))。在体内高剪切压的条件下，PFA-100血小板功能分析仪通过记录血小板凝聚需要的时间，阻断含枸橼酸盐的全血流过涂有胶原和肾上腺素或者ADP的薄膜中的微小窗口，来模拟止血栓的形成。由于血流过微小窗口导致剪切力，当高分子量vWF多聚体在薄膜上时结合固定的胶原，然后结合并活化血小板，这种活性具有血管性血友病因子依赖性。因此，由于具有vWF依赖性，这种试验对于BIPA和FACS试验来讲是值得称赞的，然而，它具有某些优点，就是他不需要加入vWF激动剂botrocetin，并使用全血代替富集血小板的血浆。

本实施例的另一个试验使用ADP来导致血小板凝聚。通过多种方式可以导致富集血小板的血浆(PRP)的凝聚。如上所述蛇毒蛋白botrocetin处理vWF，稳定vWF与血小板受体gplb的相互作用，从而导致血小板凝聚。vWF与gplb的结合是血小板凝聚的早期步骤，因此，存在一种可能性，就是阻碍凝聚过程的下游成分(即，IIbIIIa拮抗物Integrelin^TM和ReoPro^TM)也可能预防botrocetin导致的血小板凝聚。然而，对于直接作用于血小板导致凝聚作用的激动剂(例如ADP)，可以预料到激动剂上游拮抗物可能是无效的(例如一种抗-vWF适体)，而直接作用于血小板的拮抗物(IIbIIIa拮抗物)可能保持有效性。结合治疗，vWF拮抗物相对于IIbIIIa拮抗物的特异性能够通过缩短出血时间增加抗vWF拮抗物的安全性。对于在狭窄动脉患有动脉粥样硬化的患者，当血小板在动脉粥样斑表面结合固定有胶原的vWF时发生血小板凝聚。因此抑制vWF/gpIb相互作用且阻断IIbIIIa受体结合纤维蛋白能够防止血小板凝聚。与抗IIbllla治疗不同，靶分子vWF给予的生物学特异性确保血小板本身不直接作为靶分子，保证它们仍然可以用其它方式活化，因此减少抗血小板治疗潜在的出血并发症。

如下所述，在实施例3A-3D中使用了下列材料：人血管性血友病因子(序列号7)，和从Calbiochem购买的牛血清白蛋白(分别为Cat#_681300和#_126593)(La Jolla，CA)；利用标准方法和条件表达并纯化的兔vWF A1区域(序列号6)。冻干的人血小板(P/N 299-2)、电池(P/N 312)，搅拌棒(P/N 311)，血小板凝聚分析仪(model 490-4D)，和从Chronolog购买的AGGRO/LINK软件(Haverton，PA)。Pentapharm(巴塞尔，瑞士)制造的botrocetin(12201-100U-B)。从健康的、非甾醇类抗炎药(NSAID″)无偿献血者处获得新鲜血液，倒入5mL 0.105M柠檬酸钠真空管(Cat#_369714)(Becton Dickinson-Franklin Lakes，NJ)中。Aldon公司制造的生理盐水(Cat#_9420306)(Avon，NY)和从Cellgro公司(Herndon，VA)购买的磷酸盐缓冲盐水(Cat#_21-040-CV)。在BD Biosciences FACSCAN仪上进行流式细胞实验，并用CellQuest软件(San Jose，CA)分析。从GTI(Waukesha，WI)购买的抗血管性血友病因子鼠单克隆抗体(Cat#_GTI-V1A)。从Qiagen(德国)购买的penta-HIS-生物素结合物单克隆抗体(Cat#_34440)。从BD Biosciences(San Diego，CA)购买的抗鼠IgG2a-FITC结合物(Cat#_553390)。从Jackson ImmunoResearch实验室(West Grove，PA)购买的抗鼠IgG-PE结合物抗体(Cat#_715-116-150)。

实施例3A：人血管性血友病因子全长序列血小板结合试验

通过流式细胞分析仪评估适体阻断人vWF结合冻干血小板的效力。用5nM的人vWF全长序列室温条件下，在体积为50uL的FACS缓冲液(PBS溶液加0.5％牛血清白蛋白)中预培养适体的滴定物(0nM、0.1nM到1000nM)。向适体/vWF中加入另外50uL FACS缓冲液，此FACS缓冲液中包含5uL冻干血小板加1uL0.1U/uL的botrocetin。在37℃下，进行15分钟反应，随后补充200uL FACS缓冲液。通过以1470转每分旋转收集血小板，丢弃上清液。将血小板重新悬浮在100uL包含1∶100稀释的抗vWF抗体的FACS缓冲液中，并在室温条件下培养30分钟。之后用200uLFACS缓冲液稀释，以1470转每分旋转血小板6分钟，丢弃上清液。将血小板重新悬浮在1∶100的抗IgG2a-FITC抗体溶液中，并在室温条件下黑暗中培养30分钟。将全部100uL稀释到200uLFACS缓冲液中，并立即用流式细胞分析仪在FACSCAN中分析。通过在单一的和凝聚的血小板周围划分一个差值，从被污染的反应物中除去人为数据。通过流式细胞计分别定量被分析的样品的平均荧光强度(″MFI″)示数。从所有数据点中减去背景MFI。通过计算人vWF全长序列在适体以给定的浓度存在条件下与血小板的结合量与没有任何一种适体存在条件下的结合量的百分比，来表示抑制百分比(参见图7)。vWF结合血小板的抑制百分比是适体浓度的参数，通过满足下列等式来确定IC5O值：

％抑制性＝％抑制性_max/(1+IC₅₀/适体浓度)

下面的表26列出了Botrocetin诱导的vWF结合特性结果。

实施例3B：兔血管性血友病因子A1区域血小板结合试验

通过流式细胞分析仪还可以评估本发明适体阻断兔vWF A1区域结合冻干血小板的能力。用4nM的兔vWF A1区域室温条件下，在体积为50uL的FACS缓冲液(PBS溶液加0.5％牛血清白蛋白)中预培养适体的滴定物(0nM、0.1nM到1000nM)。向适体/vWF中加入另外50uL FACS缓冲液，此FACS缓冲液中包含5uL冻干血小板加1uL 0.1U/uL的botrocetin。在37℃下，进行15分钟反应，随后补充200uLFACS缓冲液。通过以1470转每分旋转收集血小板，丢弃上清液。将血小板重新悬浮在100uL包含1∶200稀释的抗-penta-HIS-生物素的FACS缓冲液中，并在室温条件下培养30分钟。之后用200uL FACS缓冲液稀释，以1470转每分旋转血小板6分钟，丢弃上清液。将血小板重新悬浮在1∶100的抗IgG-PE抗体溶液中，并在室温条件下黑暗中培养30分钟。将全部100uL稀释到200uL FACS缓冲液中，并立即用流式细胞分析仪在FACSCAN中分析。通过在单一的和凝聚的血小板周围划分一个差值，从被污染的反应物中除去人为数据，从10000个事件中收集数据。通过流式细胞计定量每个分析样品的荧光强度中值(″MedFI″)示数(为了比较目的，荧光强度中值示数通常等于上面实施例3a所述的MFI示数)。从所有数据点中减去背景MFI。通过计算人vWF全长序列在适体以给定的浓度存在条件下与血小板的结合量与没有任何一种适体存在条件下的结合量的百分比，来表示抑制百分比(参见图7)。vWF结合血小板的抑制百分比是适体浓度的参数，通过满足下列等式来确定IC₅₀值：

％抑制性＝％抑制性_max/(1+IC₅₀/适体浓度)

下面的表26列出了Botrocetin诱导的兔vWF A1区域结合特性结果。

表26：FACS和BIPA试验的结果(’ND’＝未试验)

实施例3C：抑制Botrocetin诱导的血小板凝聚(BIPA试验)

为了确定适体对活的人血小板的活性，使用新制备的富集血小板的血浆进行BIPA试验。血液得自健康的献血者，该献血者至少有5天没有服用NSAIDS。使用从Becton Dickinson购买的213/4标准蝶形针汲取血液浸入0.105M的柠檬酸钠真空管中。收集血液，倒入15ml的圆锥试管中，在室温条件下静置。剩余的血液以2500g离心10分钟，回收血浆澄清层在室温下静置，其中，血浆澄清层叫做贫血小板血浆(“PPP”)。将PRP以470μL的体积整分入包含搅拌浆的试管中。将500μL的PPP整分入试管中，然后放入血小板凝聚分析仪的PPP参比室中。在用于BIPA试验前，PRP样品在血小板凝聚分析仪中在37℃下预热3-5分钟。首先，通过滴定确定诱导每个献血者的血小板凝聚所需的botrocetin浓度。在试验余下的步骤中一直使用该botrocetin浓度。接下来，在预热后的PRP中进行1分钟的适体滴定(0、1nM到1000nM)，对适体进行试验，随后加入botrocetin。随着血小板凝聚，可以看到投射光振幅的增加(图8)。表26的最后一栏报道了6分钟之后能够阻止90％或更多的血小板凝聚的浓度。使用Aggro/LINK软件可以从凝聚分析仪曲线下计算出曲线下面积(“AUC”)，在botrocetin诱导的血小板凝聚中，曲线下面积被用来计算任意给定浓度的适体的抑制性，如关于适体ARC 1029(序列号214)的图9所示。

实施例3D：筛选的修饰适体在一系列生物试验中的生物活性

如上面实施例2所述，药物化学修饰过程鉴定的ARC 1172(序列号222)、ARC 1346(序列号281)、ARC 1368(序列号291)，ARC1525(阴性参照)，ARC 1779(序列号320)，ARC 1780(序列号321)，和ARC 1885(序列号323)在一系列生物试验中进行了测试。这些试验包括FACS(如实施例3A和3B所述)和BIPA试验(如实施例3C所述)，还有下面描述的血小板PFA-100试验。

材料：

在血小板功能分析(PFA)试验中使用了下列材料：得自健康的，未服用非甾体类抗炎药(NSAID)的献血者的新鲜的全血，使用213/4标准蝶形针(Cat#367287，Becton Dickenson)将全血收集到5ml 0.105M的柠檬酸钠试管(Cat#369714，Becton Dickenson)中。得自健康的，未服用非甾体类抗炎药(NSAID)的猕猴体内的新鲜的全血。在无添加的真空试管(Cat#366434，BectonDickenson)中用从Aldon购买的生理盐水(Cat#9420306)稀释适体。将样品放入PFA-100血小板功能分析仪(Dade Behring)使用的coUagen/epinephrine试验填料室(Cat#B4170-2OA，Dade Behring)内。使用引发溶液(Cat#B4170-50，Dade Behring)进行自测并预润湿试验填料室。在自测和O型环清洁过程中使用O型环清洁垫(Cat#B4170-73，Dade Behring)。

PFA检测

在测试样品之前，PFA-100血小板功能分析仪通常要先运行一种包括O型环清洁过程的自测过程，从而确保分析仪合适的功能。

如下表27所示，从健康的献血者或猕猴身上收集新鲜全血，其中，献血者或猕猴至少在三天内没有服用NSAID。收集从献血人身上得到的血液用21^3/4标准蝶形针放入5ml 0.105M的柠檬酸钠试管中，然后轻轻的倒转试管三次，确保血液与柠檬酸钠混合。在整个试验过程，每隔五分钟将全血试管轻轻倒转一次以避免沉淀。

为了试验全血中的适体滴定，将适体加入到无添加的真空试管中，并用生理盐水稀释到理想浓度(例如，0nM、1nM到1000nM)，终体积为60μL。当PFA-100准备好运行下一组样品时，向含有一定浓度的适体的试管中加入1940μL的全血。将此试管轻轻的倒转3次使适体和全血完全混合。PFA-100常常成倍的运行样品。800μL血混合物放入coUagen/epinephrine试验填料室内，将此试验填料室装入PFA-100分析仪中。用PFA-100测定孔径的封闭时间，最大值为300秒。我们估计本试验中的IC95就是能够将封闭时间延长到300秒的最小适体浓度。

图20描绘了ARC 1368(序列号291)和阴性对照ARC 1525在PFA-100血小板功能分析试验中人全血凝聚时间，该凝聚时间是适体浓度的函数。下面的表27列出了FACS，BIPA和PFA-100试验的其他结果。

表27：FACS，BIPA和PFA-100试验结果

ARC#	FACSIC50对人vWF全长序列(nM)	FACSIC50对兔vWFA1区域(nM)	人富集血小板的血浆BIPA试验的～IC90(nM)	柠檬酸化人全血PFA-100试验的～IC90(nM)	柠檬酸化猕猴全血PFA-100试验的～IC90(nM)
						ARC 1172	2	2	～200	～100	ND

(序列号222)
						ARC 1346	50	180	＞1000	ND	ND
ARC 1368	2	4.0	～200	～100	～100
						ARC 1525	ND	ND	无抑制性	无抑制性	ND
ARC 1779	ND	ND	＞100	＞100	ND
						ARC 1780	ND	ND	＞100	＞100	ND
ARC 1185	ND	ND	＞50	＞100	ND

如希望的一样，在上面实施例2所描述的结合试验中观察到的适体对vWF的亲和性与生物试验中他们的相对效力之间存在密切关系。无结合的阴性参照ARC 1525在其所进行的任何试验中都不显示活性。

实施例3E：在BIPA、PFA-100和AIPA检测中的ARC 1368、Integrilin^TM和ReoPro^TM

在人全血PFA-100试验，人PRP BPA试验(分别如上面实施例3D和3C所述)和ADP诱导的血小板凝聚(AIPA)试验中评价ARC1368、Integrilin^TM和ReoPro^TM的效力。用人PRP，严格按照上面实施例3C所述进行BIPA的方法进行AIPA试验，只是不加入botrocetin，改为加入10微摩尔ADP(Chronolog，Haverton，PA)诱导血小板凝聚。图21表示了PFA-100结果。图22表示了BIPA结果。图23表示了AIPA结果。如图21和22所示，与ReoPro^TM相比，在PFA-100和BIPA试验中ARC 1368(序列号291)表现出一定效力。与上面描述的vWF依赖机制一致，在图23所示试验中，当IIbIIa颉抗物保持效力时，抗-vWF适体对阻断AIPA无活性。

实施例4：药代动力学研究

在实施例4和5中，质量单位的浓度数据只涉及适体低聚核苷酸部分的分子量，不考虑由于PEG结合体引入的质量。

实施例4A：抗-vWF适体仔人和兔血浆中的稳定性

化验人和兔血浆内ARC 1172(序列号222)，ARC 1346(序列号281)，ARC 1368(序列号291)和ARC 1533的核酸酶稳定性。如下所述，血浆核酸酶的降解作用通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定。简单的说，为了确定血浆稳定性，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化化学合成的适体，用γ-³²P ATP进行5’-末端标记，然后再进行一次凝胶纯化。32-P标记的适体在100nM未标记的适体存在条件下培养，所述未标记的适体位于200微升结合反应的95％人或兔的血浆中。用相同的成分单独进行零时刻的反应，只是其中的血浆换成PBS缓冲液。这样可以保证凝胶上的量或放射性标记在试验过程中是恒定的。除非另有说明，在温度循环仪中培养反应物1、3、10、30和100小时。在每个时间电，移除20微升的反应物，与200微升甲酰胺装载染料结合，在液氮中速冻并存储在-20℃条件下。在最后一个时间点完成后，解冻冷冻样品，从每个时间点的样品中移出20微升。在小样品中加入SDS至终浓度为0.1％。样品在90℃条件下培养10-15分钟，然后直接装入15％的变性PAGE凝胶中，在12W电压下运行35分钟。用Storm 860phosphoroimager系统定量凝胶上的放射性标记物。通过定量适体全长条带并除以泳道总量，可以确定出每个时间点的适体全长序列百分比。然后相对零时刻适体全长序列百分比标准化每个时间点的适体全长序列分数。适体全长序列分数是时间函数，该分数能够满足下列等式：

M1*e^Λ(-m2*m0)

其中，m1是适体全长序列％最大值(m1＝100)；m2是降解速度。适体半衰期(T_1/2)等于(ln2)/m2。

图24表示了人血浆的样品数据，表28概括了测试的适体结果。与我们的期望一致，适体在人血浆中比在兔血浆中更稳定，且2’-O-Me修饰的数量越多，血浆越稳定。

表28：适体血浆稳定性半衰期

ARC#	人血浆半衰期T1/2(hrs)	兔血浆半衰期T1/2(hrs)
			ARC 1172(序列号222)	17	3
ARC 1346	未试验	19
			ARC 1368	63	21
ARC 1533	93	未试验

实施例4B：猕猴ARC 1368聚乙二醇化衍生物的PK/PD

向猕猴(n＝3/组)体内静脉注射剂量为3mg/kg的ARC 1368(序列号291)，1779(序列号320)和1780(序列号321)(如上面实施例2所述)，这里使用的剂量能够产生3μM的静脉血浆浓度，大约是假定有效剂量的30倍。随后，间隔一定时间收集柠檬酸化的血样品并处理得到血浆。

为了证明适体在体内具有药代动力学活性，给药5分钟后进行Botracetin以最大血浆浓度C_max诱导的血小板凝聚(BIPA)。在这一时间点所以动物都对BIPA具有完全的抑制性，从而证明适体在体内具有功能性。

随后，使用Oligreen试验(Gray et ah，Antisense and NucleicAcid Drug Development 7(3)：133-140(1997)测定血浆适体浓度。随后使用程序WinNonlin分析数据，得到如图29到31所示的药代动力学参数。

另外，图25表示了灵长类动物的血浆适体浓度，在这里血浆适体浓度是时间的函数。基于Oligreen试验的平均浓度-时间曲线显示，ARC 1368(序列号291)、ARC 1368(序列号291)，ARC 1780(序列号321)和ARC 1779(序列号320)的药代动力学曲线主要是单相的。未聚乙二醇化的适体(ARC 1368(序列号291))与ARC1779(序列号320)和ARC 1780(序列号321)相比显示出快速的分布相。与ARC 1368(序列号291)不同，40kDa的PEG结合ARC1780(序列号321)与ARC 1779(序列号320)相比，显示出延长的分布相。ARC 1779(序列号320)显示分布相的α-半衰期为～2小时。

表29：基于Oligreen试验数据，对猴子IV给药3mg/kg之候，ARC 1368的非房式药代动力学参数估计

PK参数	单位	1101	1102	1103	平均值	标准方差函数
							Tmax	hr	0.08	0.08	0.08	0.08	0.00

Cmax	ng/mL	26409	19170	23301	22960	3632
							AUC0-last	hr*ng/mL	23096	31926	20650	25224	5932
MRTlast	hr	4.50	5.46	3.48	4.48	0.99

表30：基于Oligreen试验数据，对猴子IV给药3mg/kg之后，ARC 1779的非房式药代动力学参数估计

PK参数	单位	2101	2102	2103	平均值	标准方差函数
							PK	hr	0.25	0.50	0.25	0.33	0.14
Tmax	ng/mL	69065	65717	70344	68375	2389
							Cmax	Hr*ng/mL	309245	336590	235503	293779	52288
AUClast	hr	5.27	4.66	2.69	4.21	1.35

表31：基于Oligreen试验数据，对猴子IV给药3mg/kg之后，ARC 1780的非房式药代动力学参数估计

PK参数	单位	3101	3102	3103	平均值	标准方差函数
							Tmax	hr	2.00	2.00	0.25	1.42	1.01
Cmax	ng/mL	55965	37320	50690	47992	9611

AUClast	hr*ng/mL	740559	613180	899455	751065	143426
							AUCaI1	hr*ng/mL	740559	613180	899455	751065	143426
MRTlast	hr	8.69	9.54	14.11	10.78	2.91

Oligreen试验分析之后，利用有效的基于HPLC的试验确定服用ARC 1779(序列号320)的动物体内的血浆适体浓度。利用程序WinNonlin，通过非房室和2-房室分析法来分析HPLC数据。用更灵敏的HPLC方法重新分析猴子样品，产生ARC 1779(序列号320)的浓度-时间图，该图双相显示了分布相和排除相。与利用OliGreen试验观察到的结果一致，HPLC结果表明ARC 1779(序列号320)的分布半衰期(t_1/2α)是1.4小时，消除半衰期是12.9(t_1/2β)小时。

实施例4C：猕猴体内ARC 1779的PK/PD值

单一静脉注射(IV)0.5mg/kg剂量之后，评价ARC 1779在三只猕猴体内的-PK/PD相关关系。血浆中ARC 1779的水平与ARC 1779对血小板功能或皮肤出血时间(CBT)延长的抑制作用有关。

IV给药后，在服药后不同的时间点经皮采血，用于PK和PD分析。通过PFA-100试验确定ARC 1779对血小板功能的PD作用，通过CBT时间测定ARC 1779对出血的作用。另外，用HPLC分析血浆样品，从而定量ARC 1779的水平。用2-房室分析确定PK参数估计。图26表示出结果。

每只猴子产生的浓度-时间曲线主要表示了ARC 1779的药代动力学分布相。可以确定分布半衰期大约是1.0小时(t_1/2α)。从现有数据中不能很好的确定消除半衰期(t_1/2β)。

图26表示了PFA-100试验测定的ARC 1779对血小板凝聚的PD作用。当ARC 1779的血浆浓度超过300nM时，如同PFA-100分析仪所估计的一样，血小板功能被抑制。然而当血浆适体浓度减少到大约77nM时，血小板功能恢复正常。

从图26中还可以看出，在本研究中，ARC 1779对出血时间延长的作用是最小的。

总之，ARC 1779在血浆浓度大约是300nM时能够在体内抑制血小板功能。这个体内浓度比观察到的体外抑制血小板功能所必需的适体浓度大约高3倍。可是，即使在高血浆浓度(1000nM)条件下，ARC 1779在单一注射给药后，仍然表现对皮肤出血时间具有最小的作用。

实施例5：功能性细胞试验

在实施例4和5中，质量单位的浓度数据只涉及适体低聚核苷酸部分的分子量，不考虑由于PEG结合体引入的质量。

实施例5A：猕猴体内ARC 1179的药代动力学

对猕猴IV注射剂量为0.5mg/kg的ARC 1779(序列号320)。在整个研究过程中，PFA-100闭合时间、BIPA和皮肤出血时间(″CBT″)作为时间的函数进行测量。如前面实施例3中所述测量BIPA和PFA-100闭合时间。使用下面描述的标准方法测量皮肤出血时间。

在前臂的二头肌部分使用血压袖带，从而检测并膨胀以维持40mmHg的恒定血压。使用Surgicutt自动切割装置(ITC，Edison，NJ)，从前臂末端的手掌表面侧部到肘前皱切出一个纵向的切口。在切割开始时启动秒表。在切割15-30秒之后，用Surgicutt

出血时间吸水纸(ITC，Edison，NJ)将血液吸走，同时避免吸水纸与伤口直接接触。每隔15-30秒，将吸水纸旋转并用纸上干净的部分重新吸血。重复吸血过程，直到血液不再被吸到纸上或者直到流血时间满30分钟为止，这两种情况无论那种先发生都要停止吸血过程。当血液不再被吸水纸吸取时，确定流血时间在30秒钟之内。

图27中的表显示了关于ARC 1779(序列号320)对三只不同的动物给药后，以分钟为单位的猕猴出血时间，第一栏显示了在不同时间点，以nM为单位的BIPA IC90值和以nM为单位的PFAIC95的值。图28显示了从服用ARC 1779(序列号320)的三只猕猴体内，在服药后不同时间点的取出的血液中的平均PFA-100闭合时间。图29显示了服用ARC 1779(序列号320)的三只猕猴，在服药后不同时间点的皮肤出血时间。图30使服用ARC 1779(序列号320)的三只猕猴的皮肤出血时间(左纵轴)与PFA-100闭合时间(右纵轴)相互关联。如图27到30所示，在BIPA和PFA-100闭合时间被最大程度的抑制的大于并包括2小时的时间点，皮肤出血时间增加很小。当抗gpIIbIIa颉抗物Integrilin^TM的浓度能够对血小板凝聚产生非体内相似抑制性时，此浓度下模版或皮肤出血时间在20和30分钟之间。参见e.g.Phillips，D.R.andScarborough，R.M.，Am J Cardiol，80(4A)：11B-20B(1997)。尽管不希望被任意特定的理论限制，但是这些数据与我们的假设一致，并能够为我们的假设提供支持，其中，我们的假设是，抗-vWF A1区域适体颉抗物能够通过妨碍血小板与固定化vWF在血管创伤位点结合，来妨碍血小板活性，但不抑制血小板功能，因此不会延长皮肤出血时间。

实施例5B：在猕猴体内由电解产生的血栓模型中ARC 1779的评 估

进行研究来检测ARC 1779(序列号320)在记录详细的非人灵长类动物电解血栓模型中，对有创动脉血栓的抑制作用。参见，例如Rote et al，Stroke，1994：25，1223-1233。将十三只猕猴分为4组，施与下表32所示的治疗方案。

表32：电解产生的血栓研究设计

DVE＝体积剂量相当；IV＝静脉内

在外科手术前麻醉每只动物，插入导管并通过体积调节呼吸器输送异氟烷吸入式麻醉剂以维持麻醉状态。在外周静脉血管内插入静脉导管，在过程中给药乳酸盐林格氏溶液。

在股动脉中插入一根导管来连续监视动脉血压。相似的，在股静脉中也插入一根导管来收集血液样品。每个颈动脉都装有Doppler流量探针，Doppler流量探针与一种流量计相连。流量探针放置在静脉周围最接近插入有创动脉电极和通道收缩的位置。通道收缩放置在每个颈动脉周围，从而在不改变平均血流量的同时将血流量降低大约50％到60％。在整个观察过程中持续监控并记录颈动脉的血流量。

通过放置一个血管内电极，在每个颈动脉的内膜表面制造电解产生的伤口。每个电极都与一种持续电流装置的正极相连，负极与间隔的皮下位点相连。向每个血管输送持续的电流，输送时间选择3个小时或完全闭合后30分钟中更短的一个。

一旦电极放置到正确的颈动脉位置(“RCA”)，如表32所示对动物给药试验材料。在给药试验材料大约15分钟后，使用100μA的电解电流。按照图31中血液样品收集时间表所示的特定时间点收集血液样品和CBT测量值。在血液流量信号稳定为零流量(这表明该位点处形成了封闭的血栓)30分钟后，或电刺激180分钟后停止电流。给药试验材料大约195分钟后，对左颈动脉(“LCA”)以与上述RCA相似的方式施用电流。当所有的手术程序和样品收集完成之后，对每个动物实施安乐死。

图32表示了治疗组3中每只动物体内ARC 1779(序列号320)相对于时间的血浆浓度(用HPLC测定)。图33中显示了通过Doppler流量计测定的每个治疗组的封闭时间。从图33中可以确定，在这种动物血栓模型中，ARC 1779(序列号320)在对猕猴颈动脉进行连续的180分钟电损伤时间内，能够抑制血栓形成。

实施例5C：在猕猴电解产生的血管模型中，对不同剂量的ARC 1779进行评估

在非人灵长类动物电解产生的血栓模型中，延用上面实施例5B所描述的研究测试低适体剂量水平的ARC 1779(序列号320)在抑制创动脉血栓方面的效力。

将另外10只猕猴(2.5Kg到3.5Kg)分为处理组5到7，按照下表33指出的方案进行处理。

表33：研究设计

按照实施例5B中处理动物的程序处理表33中的每个处理组中的动物。图33中指出了每个试验组用Doppler流量计测量的闭合时间。

在未进行任何血小板颉抗治疗(参照动物)的情况下，100％的颈动脉在60分钟内产生封闭血栓。相反，在用Reopro治疗后，只有20％的动脉发生封闭血栓。在ARC 1779处理组中，当对恒定血浆水平的灌流速度为1000nM，750nM，500nM和300nM时，分别有0％，25％，63％和100％的颈动脉发生封闭血栓。除了封闭血栓的形成，我们还可以评估ARC 1779对皮肤出血时间的影响，如图34所示。从图34中可以看出，在某些剂量和/或某个时间点下，在这个动物模型中可以观察到延长的CBT，而在其他的剂量和时间点下，CBT没有被延长。

本发明已通过书面描述和举例的方式进行描述，本领域技术人员将意识到本发明可在多种不同实施方案中实践。前面的描述和实施例都是用以说明为目的的，并不是对所附权利要求的限制。

序列表

<110>阿切埃米克斯有限公司

<120>关于血管性血友病因子的适体及其作为血栓形成疾病治疗剂的应用

<130>23239-582-061

<150>60/608,047

<151>2004-09-07

<150>60/661,950

<151>2005-03-11

<150>60/678,427

<151>2005-05-06

<150>60/690,231

<151>2005-06-13

<160>327

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>93

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(24)..(53)

<223>n可以是任意核苷(A，T，C或G)

<220>

<221>其他特征

<222>(54)..(54)

<223>n是a，c，g或t

<400>1

catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa    60

cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta                                 93

<210>2

<211>92

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(24)..(53)

<223>n可以是任意核苷(A，T，C或G)

<400>2

catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac    60

gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta                                  92

<210>3

<211>92

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(24)..(53)

<223>n可以是任意核苷(A，T，C或G)

<400>3

catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac    60

gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta                                  92

<210>4

<211>213

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>4

Met Gly His His His His His His Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr

1               5                   10                  15

Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg

            20                  25                  30

Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met

        35                  40                  45

Met Glu Gln Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val

    50                  55                  60

Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys

65                  70                  75                  80

Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly

                85                  90                  95

Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln

            100                 105                 110

Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

        115                 120                 125

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg

    130                 135                 140

Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly

145                 150                 155                 160

Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln

                165                 170                 175

Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu

            180                 185                 190

Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu

        195                 200                 205

Ala Pro Pro Pro Thr

    210

<210>5

<211>246

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>5

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gln Glu Pro Gly

1               5                   10                  15

Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu

            20                  25                  30

Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser

        35                  40                  45

Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser

    50                  55                  60

Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu

65                  70                  75                  80

Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr

                85                  90                  95

His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro

            100                 105                 110

Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

        115                 120                 125

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe

    130                 135                 140

Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met

145                 150                 155                 160

Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val

                165                 170                 175

Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly

            180                 185                 190

Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro

        195                 200                 205

Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln

    210                 215                 220

Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro

225                 230                 235                 240

Pro Pro Thr Leu Pro Pro

                245

<210>6

<211>213

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>6

Met Gly His His His His His His Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr

1               5                   10                  15

Trp Ser Asn Leu Met Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Gln

            20                  25                  30

Leu Ser Glu Ala Glu Phe Gly Val Leu Lys Ala Phe Val Val Ser Val

        35                  40                  45

Met Glu Arg Leu His Ile Ser Gln Lys Arg Ile Arg Val Ala Val Val

    50                  55                  60

Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ser Tyr Ile Ser Leu Lys Asp Arg Lys

65                  70                  75                  80

Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly

                85                  90                  95

Gly Pro Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe His

            100                 105                 110

Ile Phe Ser Asn Val Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

        115                 120                 125

Leu Ser Ala Ser Gln Glu Thr Pro Arg Met Val Arg Asn Leu Val Arg

    130                 135                 140

Tyr Ala Gln Gly Leu Lys Lys Glu Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly

145                 150                 155                 160

Ile Gly Pro His Val Ser Leu Arg Gln Ile His Leu Ile Glu Lys Gln

                165                 170                 175

Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Gly Val Asp Glu Leu Glu

            180                 185                 190

Gln Arg Arg Asp Glu Ile Ile Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Gly Pro Glu

        195                 200                 205

Ala Pro Val Pro Thr

    210

<210>7

<211>2813

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>7

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1               5                   10                  15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

            20                  25                  30

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

        35                  40                  45

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

    50                  55                  60

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65                  70                  75                  80

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

                85                  90                  95

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

            100                 105                 110

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

        115                 120                 125

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

    130                 135                 140

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145                 150                 155                 160

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

                165                 170                 175

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

            180                 185                 190

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

        195                 200                 205

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

    210                 215                 220

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225                 230                 235                 240

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

                245                 250                 255

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

            260                 265                 270

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

        275                 280                 285

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

    290                 295                 300

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305                 310                 315                 320

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

                325                 330                 335

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

            340                 345                 350

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

        355                 360                 365

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

    370                 375                 380

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385                 390                 395                 400

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

                405                 410                 415

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

            420                 425                 430

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

        435                 440                  445

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

    450                 455                 460

Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465                 470                 475                 480

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

                485                 490                 495

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

            500                 505                 510

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

        515                 520                 525

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

    530                 535                  540

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545                 550                 555                 560

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

                 565                570                 575

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

            580                 585                 590

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

        595                 600                 605

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

    610                 615                 620

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625                 630                 635                 640

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

                645                 650                 655

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

            660                 665                 670

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

        675                 680                 685

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

    690                 695                 700

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705                 710                 715                 720

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

                725                 730                 735

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

            740                 745                 750

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

        755                 760                 765

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

    770                 775                 780

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785                 790                 795                 800

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

                805                 810                 815

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

            820                 825                 830

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

        835                 840                 845

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

    850                 855                 860

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865                 870                 875                 880

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

                885                 890                 895

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

            900                 905                 910

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

        915                 920                 925

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

    930                 935                 940

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945                 950                 955                 960

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

                965                 970                 975

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

            980                 985                 990

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

        995                 1000                1005

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

    1010                1015                1020

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

    1025                1030                1035

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

    1040                1045                1050

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

    1055                1060                1065

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

    1070                1075                1080

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

    1085                1090                1095

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

    1100                1105                1110

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

    1115                1120                1125

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

    1130                1135                1140

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

    1145                1150                1155

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

    1160                1165                1170

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

    1175                1180                1185

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

    1190                1195                1200

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

    1205                12l0                1215

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

    1220                1225                1230

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

    1235                1240                1245

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

    1250                1255                1260

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

    1265                1270                1275

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

    1280                1285                1290

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

    1295                1300                1305

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

    1310                1315                1320

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

    1325                1330                1335

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

    1340                1345                1350

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

    1355                1360                1365

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

    137                 1375                1380

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

    1385                1390                1395

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

    1400                1405                1410

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

    1415                1420                1425

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

    1430                1435                1440

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

    1445                1450                1455

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

    1460                1465                1470

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

    1475                1480                1485

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

    1490                1495                1500

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

    1505                1510                1515

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

    1520                1525                1530

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

     1535               1540                1545

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

    1550                1555                1560

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

    1565                1570                1575

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

    1580                1585                1590

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

    1595                1600                1605

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

    1610                1615                1620

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

    1625                1630                1635

Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp

    1640                1645                1650

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

    1655                1660                1665

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala

    1670                1675                1680

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly

    1685                1690                1695

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

    1700                1705                1710

Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

    1715                1720                1725

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

     1730                1735                1740

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

    1745                1750                1755

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

    1760                1765                1770

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

    1775                1780                1785

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

    1790                1795                1800

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

    1805                1810                1815

Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

    1820                1825                1830

Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

    1835                1840                1845

Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

    1850                1855                1860

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

    1865                1870                1875

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

    1880                1885                1890

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

    1895                1900                1905

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

    1910                1915                1920

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

    1925                1930                1935

Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

    1940                1945                1950

Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu

    1955                1960                1965

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

    1970                1975                1980

Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

    1985                1990                1995

Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

    2000                2005                2010

Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

    2015                2020                2025

Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

    2030                2035                2040

Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile

    2045                2050                2055

Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser

    2060                2065                2070

Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys

    2075                2080                2085

Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

    2090                2095                2100

Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg

    2105                2110                2115

Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

    2120                2125                2130

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

    2135                2140                2145

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

    2150                2155                2160

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala

    2165                2170                2175

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

    2180                2185                2190

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

    2195                2200                2205

Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn

    2210                2215                2220

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

    2225                2230                2235

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

    2240                2245                2250

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

    2255                2260                2265

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys

    2270                2275                2280

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

    2285                2290                2295

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

    2300                2305                2310

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

    2315                2320                2325

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

    2330                2335                2340

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

    2345                2350                2355

Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro

    2360                2365                2370

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

   2375                2380                2385

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

    2390                2395                2400

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

    2405                24l0                2415

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

    2420                2425                2430

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

    2435                2440                2445

Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

    2450                2455                2460

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

    2465                2470                2475

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

    2480                2485                2490

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

    2495                2500                2505

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

    2510                2515                2520

Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

    2525                2530                2535

Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu

    2540                2545                2550

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

    2555                2560                2565

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

    2570                2575                2580

Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp

    2585                2590                2595

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser

    2600                2605                2610

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

    2615                2620                2625

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

    2630                2635                2640

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile

    2645                2650                2655

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

    2660                2665                2670

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

    2675                2680                2685

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

    2690                2695                2700

Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

    2705                2710                2715

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

    2720                2725                2730

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

    2735                2740                2745

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp

    2750                2755                2760

Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

    2765                2770                2775

Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val

    2780                2785                2790

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

    2795                2800                2805

Arg Lys Cys Ser Lys

    2810

<210>8

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(18)..(57)

<223>n可以是任意核苷(A，T，C或G)

<400>8

ggagcgcact cagccacnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>9

taatacgact cactatagga gcgcactcag ccac    34

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>10

gctagcagag aggtcgaaa                     19

<210>11

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>11

ggagcgcacu cagccacaga gcccugagug uaugaucgcc uagaucuauc gaugcuuuuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>12

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>12

ggagcgcacu cagccacaac acuaaugggg aaaguucaag gauucuugac cggugcguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>13

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>13

ggagcgcacu cagccacuaa cgguugaucu caggacuaaa uagucaacaa ggaugcguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>14

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>14

ggagcgcacu cagccacaga gcccugagug uaugaucgcc gagaucuauc gaugcuuuuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>15

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>15

ggagcgcacu cagccacgcu cgguggggaa auuuuagccu aauuggcuac uugugcguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>16

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>16

ggagcgcacu cagccacggu ggucagucag ugauaugauu aaguucagcu guggcuguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>17

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(75)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>17

ggagcgcacu cagccacacc gaggcuggau aucuacgaga ggaagugcug cuugaauuuc    60

gaccucucug cuagc                                                     75

<210>18

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(75)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>18

ggagcgcacu cagccacacu gaggcuggau aucuacgaga ggaagugcug cuuggauuuc    60

gaccucucug cuagc                                                     75

<210>19

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(75)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>19

ggagcgcacu cagccacugg uccuuagcua guuguacuag cgacgcguuc aggugguuuc    60

gaccucucug cuagc                                                     75

<210>20

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(75)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>20

ggagcgcacu cagccacuaa cgguugaucu caggacuaau agucaacaag gaugcguuuc    60

gaccucucug cuagc                                                     75

<210>21

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(75)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>21

ggagcgcacu cagccacuaa cggcugaucu caggacuaaa uagucaacaa ggaugcguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>22

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(75)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>22

ggagcgcacu cagccacccu gucgucuuuu gguagucagc caaaagcuag uugguuguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>23

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>23

ggagcgcacu cagccacccu cgcaagcauu uuaagaauga cuugugccgc uggcuguuuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>24

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>24

ggagcgcacu cagccacuuu acggugaaag ucucucgggg uuccgaguua cggugcguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>25

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>25

ggagcgcacu cagccacggu aacauuguuu ccggcgauuc uuugaacgcc gucgugguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>26

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>26

ggagcgcacu cagccaccag uuaugcuggc uuuggucuuu gacugucuga guguucguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>27

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>27

ggagcgcacu cagccacugg ggcugaucuc gcacgauagu ucgugucaag gaugcguuuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>28

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(75)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>28

ggagcgcacu cagccacgcc cacgucaaau uauagucuac uuugaugugc ccgugguuuc    60

gaccucucug cuagc                                                     75

<210>29

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(73)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>29

ggagcgcacu cagccacgcu guacacugau guuguaacau guacccccug gcuguuucga    60

ccucucugcu agc                                                       73

<210>30

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(76)

<223>所有的嘌呤(A和G)都是2’-OH(核糖)；所有的嘧啶(U和C)都是2’-氟代嘧啶

<400>30

ggagcgcacu cagccacuuc gacuuucaug ucugaagucc cugcagugcg agagacguuu    60

cgaccucucu gcuagc                                                    76

<210>31

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>31

ggagcgcact cagccacagt tctgtcggtg atgaattagc gcgagagctg tgggacgttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>32

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>32

ggagcgcact cagccacaaa cggacggtga tggattaacg cgggtttatg gcaaggtttc    60

gacctctctg ctagc                                                     75

<210>33

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>33

ggagcgcact cagccacggc acgacggtga tggattagcg cggtgtcggt ggtgtcattt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>34

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>34

ggagcgcact cagccactca agggggtcgc gtggggacga agggttgcag tgtgtcgttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>35

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>35

ggagcgcact cagccacggc acgacggtga tgaattagcg cggtgtcggt ggtgtcattt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>36

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>36

ggagcgcact cagccacgga gcgtcggtga tggattagcg cggctccgtg gtacacattt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>37

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>37

ggagcgcact cagccacgga gcgtcggtga tggattagcg cggttccgtg gtacaccttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>38

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>38

ggagcgcact cagccacggc atgacggtga tgaattagcg cggtgtcggt ggtgtcattt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>39

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>39

ggagcgcact cagccacgga gcgtcggtga tggattagcg cggctccgtg gtacgccttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>40

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>40

ggagcgcact cagccacgga gcgtcggtga tggattagcg cggctccgtg gtacaccttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>41

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>41

ggagcgcact cagccacggc acgacggtga tgaattagcg cggtgtcggt ggtgttattt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>42

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>42

ggagcgcact cagccaccac ggggacgggt agggcgggcg aggtggtggc attagcgttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>43

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>43

ggagcgcact cagccacagt tctgtcggtg atgaattagc gcgggagctg tgggacgttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>44

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>44

ggagcgcact cagccacggg gtgggtagac ggcgggtatg tggctggtgt cgaagggttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>45

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>45

ggagcgcact cagccacgac ggtgatggat tagcgcggtg gagaagatgc gctgttgttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>46

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>46

ggagcgcact cagccacgac ggtgatggat tagcgcggtg gatcttaacg tgcgagtttc    60

gacctctctg ctagc                                                     75

<210>47

<211>77

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>47

ggagcgcact cagccactga agggtaagga cgaggagggt atacagtgtg cgcgtgtatt    60

tcgacctctc tgctagc                                                   77

<210>48

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>48

ggagcgcact cagccacaac tggttgtcgg tgatggcatt aacgcggacc aggcatgttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>49

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>49

ggagcgcact cagccacacg acattggcgg gttgtaatta ccacgcatgg ctgtttgttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>50

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>50

ggagcgcact cagccactgt tgccgacggt gatgtattaa cgcgggcaac gttggtgttt    60

cgacctctct gctagc                                                    76

<210>51

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(21)..(60)

<223>n可以是任意核苷(A，T，G或C)

<400>51

ctacctacga tctgactagc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>52

ctacctacga tctgactagc      20

<210>53

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>53

aggaactaca tgagagtaag c    21

<210>54

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>54

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>55

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>55

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>56

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>56

ctacctacga tctgactagc ggaacgagaa tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>57

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>57

ctacctacga tctgactagc ggaataagaa tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>58

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>58

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgttgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>59

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>59

ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttc                                                  79

<210>60

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>60

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgttggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>61

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>61

ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>62

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>62

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctgatgga ttgttcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>63

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>63

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctgatgga ttgctcaggt ctgctgactg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>64

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>64

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctgatgga ttgcccaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>65

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>65

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctggtgga ttgcccaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>66

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>66

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgttggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>67

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>67

ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>68

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>68

ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgctgatgga ttgctcaggt ctactggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>69

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>69

ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctgatgga ttggtcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>70

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>70

ctacctacga tctgactagc gggatgagag tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>71

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>71

ctacctacga tctgactagc gcaatgagga tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>72

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>72

ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctgatgga ttgcacaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>73

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>73

ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctggtgga ttgctcaggt ctgttggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>74

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>74

ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt ttccgttctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>75

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>75

ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgctctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>76

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>76

ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgccctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>77

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>77

ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt ttctgctctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>78

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>78

ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt ttccgctttg    60

cttactctca tgtagttcc                                                79

<210>79

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>79

ctacctacga tctgactagc ggaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgttttg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>80

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>80

ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgctttg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>81

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>81

ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgctatg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>82

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>82

ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgctatg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>83

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>83

ctacctacga tctgactagc tgagtagtta gtaacttttt attatggttt ggtgggtctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>84

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>84

ctacctacga tctgactagc tgagtagtca gtaatttttt attatggttt ggtgggcctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>85

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>85

ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctt ggcacctctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>86

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>86

ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctt ggtacctccg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>87

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>87

ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctt ggcatcttcg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>88

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>88

ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctc ggcacctttg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>89

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>89

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa ggctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>90

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>90

ctacctacga tctgactagc ggaatgagta tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>91

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>91

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa ggctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>92

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>92

ctacctacga tctgactagc ggaatgagag cgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>93

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>93

ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctc ggcacttccg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>94

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>94

ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctc ggcaccttcg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>95

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(29)..(57)

<223>其中，Y是C或T；R是A或G；H是A，C，或T.

<400>95

ctacctacga tctgactagc ggaatgagra tgytgrtgga ttgchcaggt ctrytgrctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>96

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(22)..(58)

<223>其中，Y是C或T；R是A或G；H是A，C，或T.

<400>96

ctacctacga tctgactagc graacactag gttggttagg rttggtgtgt tycygyyhgc    60

ttactctcat gtagttcc                                                  78

<210>97

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(49)..(59)

<223>其中，Y是C或T；R是A或G；H是A，C，或T.

<400>97

ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgcty ggyayyyyyg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>98

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>98

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatccaataa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>99

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>99

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt catccaataa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>100

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>100

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt cattcaataa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>101

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>101

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt catttaataa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>102

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>102

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt catctaataa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>103

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>103

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt catccaataa ccgtgcggtg cttccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>104

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>104

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tgtctaataa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>105

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>105

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatataataa ccgtgcggtg cctccgtgat    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>106

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>106

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tattcaataa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>107

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>107

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tattcaataa ccgtgcggtg cctccgtgat    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>108

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>108

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tattcaataa ccgtgcggtg tctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>109

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>109

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatctaataa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>110

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>110

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatctaataa ccgtgcggtg cctccgtgat    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>111

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>111

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatccaacaa ccgtgcggtg cctccgtgag    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>112

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>112

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatccaataa ccgtgcgggg cctccgtgat    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>113

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>113

ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatccaataa ccgtgcggtg cctccgtgat    60

gcttactctc atgtagttcc                                                 80

<210>114

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>114

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattccaggc cgtgcggtgc ctccgtcacg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>115

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>115

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc catcttaggc cgtgcggtgc ctccgtcacg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>116

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>116

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattttaggc cgtgcggtgc ctccgtcacg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>117

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>117

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattttaggt cgtgcggggc ctccgtcacg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>118

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>118

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattctaggc cgtgcggtgc ctccgtcacg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>119

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>119

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattctaggc cgtgcggtgc ctccgtcatg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>120

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>120

ctacctacga tctgactagc atgcagtgcc cattctaggc cgtgcggtgc ctccgtcatg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>121

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>121

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ttctgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>122

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>122

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ttttgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>123

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>123

ctacctacga tctgactagc ttggtagtga ctttgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>124

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>124

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc cattccaggc cgtgcggtat cctccgtcac    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>125

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>125

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tatcccaggc cgtgcggtag cctccgtcac    60

gcttactctc atgtagttcc                                                 80

<210>126

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>126

ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tatctcaggc cgtgcggtat cctccgtcac    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>127

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>127

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctctgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>128

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>128

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctctgtggag ctgcggtctg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>129

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>129

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctctgtggag ctgcggtctg gccgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>130

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>130

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga cactgtggag ctgcggtttg gttgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>131

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>131

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ccctgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>132

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>132

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctccgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>133

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>133

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctcagaggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>134

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>134

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctttgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>135

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>135

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctttgtggag ctgcggtttg gtcgacatca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>136

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>136

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctttgtggag atgcggtttg gttgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>137

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>137

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgttggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>138

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>138

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>139

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>139

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa gctggtggat tgctcaggtc tgctggctgc    60

ttactctcat gtagttcc                                                  78

<210>140

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>140

ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>141

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>141

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgcaggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>142

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>142

ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgcagatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>143

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>143

ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgttggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>144

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>144

ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>145

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>145

ctacctacga tctgactagc ggaatgagta tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>146

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>146

ctacctacga tctgactagc ggaatgagta tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>147

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>147

ctacctacga tctgactagc ttgtcgcact tttggttggt ctggttggtt ctaagtgcgc    60

ttactctcat gtagttcc                                                  78

<210>148

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>148

ctacctacga tctgactagc ttgtcgcact tttggttggt ctggttggtt ttaagtgcgc    60

ttactctcat gtagttcc                                                  78

<210>149

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>149

ctacctacga tctgactagc ttggtagcga cacagtggag ctgcggtttg gtcgacgtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>150

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>150

ctacctacga tctgactagc tcaaagtatt acttattggc aataagtcgt ttactctata    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>151

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>151

ctacctacga tctgactagc tttcagtctt ccacatttat agggtttggc attgggtctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>152

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>152

ctacctacga tctgactagc tttcagtctt ctacatttat agggtttggc attgggtctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>153

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>153

ctacctacga tctgactagc tttcagtctt ccacgtttat agggtttggc attgggtctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>154

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>154

ctacctacga tctgactagc ttttagtctt ccacatttat agggtttggc attgggtctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>155

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>155

ctacctacga tctgactagc tttcagtctt tcacatttat agggtttggc attgggtctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>156

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>156

ctacctacga tctgactagc tttcagtctt tcatatttat agggtttggc attgggtctg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>157

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>157

ctacctacga tctgactagc cagttctggg aaaaattatt tttttatttc gatcgtatat    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>158

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>158

ctacctacga tctgactagc cagttctggg aaaaattatt tttttatttc gatcgtattt    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>159

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>159

ctacctacga tctgactagc ctcagattga ctccggccga cttgttttaa tcttctgagt    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>160

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>160

ctacctacga tctgactagc ccccacttat cgtgtacctt atgatatgtc gaatactctt    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>161

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>161

ctacctacga tctgactagc cttacctatt cccttctgcg gaatacgtcg agtactatgc    60

ttactctcat gtagttcc                                                  78

<210>162

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>162

ctacctacga tctgactagc cagttctggg aaaaatcatt ttttatttcg atcgtatttg    60

cttactctca tgtagttcc                                                 79

<210>163

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>163

ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctt ggcatctttg    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>164

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>164

ctacctacga tctgactagc ctcagattga ctccggctga cttgttttaa tcttctgagt    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>165

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>165

ggagcgcact cagccaccct cgcaagcatt ttaagaatga cttgtgccgc tggctg       56

<210>166

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>166

gatcgatcta atacgactca ctata                                         25

<210>167

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>167

cagccagcgg cacaagtc                                                  18

<210>168

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>168

tcgatctaat acgactcact ataggagcgc actcagccac cctcgcaagc attttaagaa    60

tgacttgtgc cgctggctg                                                 79

<210>169

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>169

ggaccaccct cgcaagcatt ttaagaatga cttgtgccgc tggtcc                   46

<210>170

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>170

ggaccagcgg cacaagtc                                                  18

<210>171

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>171

gatcgatcta atacgactca ctataggacc accctcgcaa gcattttaag aatgacttgt    60

gccgctggtc c                                                         71

<210>172

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>172

ggaccaccct cgcaagcatt gagaaatgac ttgtgccgct ggtcc                    45

<210>173

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>173

gatcgatcta atacgactca ctataggacc accctcgcaa gcattgagaa atgacttgtg    60

ccgctggtcc                                                           70

<210>174

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>174

ggaccaccct cgcaacgaga gttgtgccgc tggtcc                              36

<210>175

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>175

ggaccagcgg cacaac tc                                                18

<210>176

<211>61

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>176

gatcgatcta atacgactca ctataggacc accctcgcaa cgagagttgt gccgctggtc    60

c                                                                    61

<210>177

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>177

ggagcgcact cagccacggg gtgggtagac ggcgggtatg tggct                    45

<210>178

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>178

agccacatac ccgccgtc                                                  18

<210>179

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>179

gatcgatcta atacgactca ctataggagc gcactcagcc acggggtggg tagacggcgg    60

gtatgtggct                                                           70

<210>180

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>180

ggagccacgg ggtgggtaga cggcgggtat gtggctcc                            38

<210>181

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>181

ggagccacat acccgccg                                                  18

<210>182

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>182

gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacggggtgg gtagacggcg ggtatgtggc    60

tcc                                                                  63

<210>183

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>183

gggacggggt gggtagacgg cgggtatgtc cc                                32

<210>184

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>184

gggacatacc cgccg                                                   15

<210>185

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>185

gatcgatcta atacgactca ctatagggac ggggtgggta gacggcgggt atgtccc    57

<210>186

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>186

ggagcgcact cagccacacg acattggcgg gttgtaatta ccacgcatgg ctg        53

<210>187

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>187

cagccatgcg tggtaatt                                                  18

<210>188

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>188

gatcgatcta atacgactca ctataggagc gcactcagcc acacgacatt ggcgggttgt    60

aattaccacg catggctg                                                  78

<210>189

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>189

ggagccacac gacattggcg ggttgtaatt accacgcatg gctcc                    45

<210>190

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>190

ggagccatgc gtgg                                                      14

<210>191

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>191

gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgacat tggcgggttg taattaccac    60

gcatggctcc                                                           70

<210>192

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>192

ggagccacac gacattggcg ggcgagagcc acgcatggct cc                       42

<210>193

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>193

gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgacat tggcgggcga gagccacgca    60

tggctcc                                                              67

<210>194

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>194

ggagccacac gacattggcg agagccacgc atggc tcc                           38

<210>195

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>195

gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgacat tggcgagagc cacgcatggc    60

tcc                                                                  63

<210>196

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>196

ggagccacac gagagtggcg ggttgtaatt accacgcatg gctcc                    45

<210>197

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>197

gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgagag tggcgggttg taattaccac    60

gcatggctcc                                                           70

<210>198

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>198

ggccacacga cattggcggg cgagagccac gcatggcc                            38

<210>199

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>199

ggccatgcgt ggctctc                                                   17

<210>200

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>200

gatcgatcta atacgactca ctataggcca cacgacattg gcgggcgaga gccacgcatg    60

gcc                                                                  63

<210>201

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>201

ggagccacac gacattggcg cgagagcgca tggctcc                             37

<210>202

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成引物

<400>202

ggagccatgc gctctcg                                                   17

<210>203

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>203

gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgacat tggcgcgaga gcgcatggct    60

cc                                                                   62

<210>204

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>204

ccagcggaat gagaatgctg atggattgct caggtctgct gg                       42

<210>205

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>205

atgagagtgc tggtggattg ctcaggtctg ctggctgctt actctcat                 48

<210>206

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>206

cgatctgact agcggaatga gaatgctggt ggatcg                             36

<210>207

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>207

gatctgacta gcgcaatgag gatgcdtgat ggattgctca ggtc                     44

<210>208

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>208

ggacgatctg actagctcca gtgttttatc taataaccgt cc                       42

<210>209

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>209

ggagctccag tgttttatct aataaccgtg cggtgcctcc gtgagctcc                49

<210>210

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>210

ggagctgcgg tttggtcgac gtcagctcc                                      29

<210>211

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>211

ggtagcgact ctgtggagct gcggtttgg                                      29

<210>212

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(46)..(46)

<223>46位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>212

ggcgtgcagt gcctattcta ggccgtgcgg tgcctccgtc acgcct                  46

<210>213

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(13)..(14)

<223>用PEG修饰13位的胸腺嘧啶并附着14位的腺嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>213

gcgtgcagtg cctaggccgt gcggtgcctc cgtcacgcct                         40

<210>214

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(13)..(14)

<223>用PEG修饰13位上的胞嘧啶并与14位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(39)..(39)

<223>19位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>214

ggcgtgcagt gccggccgtg cggtgcctcc gtcacgcct                           39

<210>215

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(30)..(31)

<223>用PEG修饰30位上的鸟嘌呤且与31位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(41)..(41)

<223>41位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>215

ggcgtgcagt gcctattcta ggccgtgcgg ccgtcacgcc t                       41

<210>216

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(14)..(15)

<223>用PEG修饰14位上的胸腺嘧啶并与15位上的腺嘌呤相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(25)..(26)

<223>用PEG修饰25位上的鸟嘌呤并与26位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(36)..(36)

<223>36位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>216

ggcgtgcagt gcctaggccg tgcggccgtc acgcct                             36

<210>217

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(1)..(4)

<223>n是a，t，c或g

<220>

<221>其他特征

<222>(15)..(16)

<223>n是a，t，c或g

<220>

<221>其他特征

<222>(17)..(20)

<223>n是a，t，c或g且代表一到四个核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(21)..(22)

<223>n是a，t，c或g

<220>

<221>其他特征

<222>(33)..(36)

<223>n是a，t，c或g

<400>217

nnnncaccct cgcannnnnn nntgtgccgc tgnnnn                            36

<210>218

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(1)..(5)

<223>n是a，t，c或g

<220>

<221>其他特征

<222>(28)..(32)

<223>n是a，t，c或g

<400>218

nnnnnrggry rggtagacgg cgggyrtnnn nn                                 32

<210>219

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(1)..(2)

<223>n是a，t，c或g

<220>

<221>其他特征

<222>(21)..(26)

<223>n是a，t，c或g

<220>

<221>其他特征

<222>(37)..(38)

<223>n是a，t，c或g

<400>219

nnccacacga cattggcggg nnnnnnccac gcatggnn                           38

<210>220

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(1)..(5)

<223>n是t，c，g或a

<220>

<221>其他特征

<222>(11)..(12)

<223>n是t，c，g或a

<220>

<221>其他特征

<222>(13)..(13)

<223>n是t，c，g或a且代表310个核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(14)..(15)

<223>n是t，c，g或a

<220>

<221>其他特征

<222>(33)..(37)

<223>n是t，c，g或a

<400>220

nnnnncagtg nnnnnycgtg cggkryytcc gtnnnnn                            37

<210>221

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>221

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc c                       41

<210>222

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>222

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>223

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>1位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>223

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>224

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(2)..(2)

<223>2位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>224

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>225

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(3)..(3)

<223>3位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>225

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>226

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(4)..(4)

<223>4位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>226

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>227

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(5)..(5)

<223>5位上的尿嘧啶是2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>227

ggcgugcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>228

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(6)..(6)

<223>6位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>228

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>229

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(7)..(7)

<223>7位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>229

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>230

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(8)

<223>8位上的腺嘌呤是2’-O-甲基腺嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>230

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>231

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(9)

<223>9位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>231

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>232

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(10)..(10)

<223>10位上的尿嘧啶是2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>232

ggcgtgcagu gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>233

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>11位的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>233

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>234

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(12)..(12)

<223>12位的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>234

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>235

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(13)..(13)

<223>13位的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>235

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>236

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(14)..(14)

<223>14位上的尿嘧啶是2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>236

ggcgtgcagt gccutcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>237

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(15)..(15)

<223>15位上的尿嘧啶是2’-O-甲基

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>237

ggcgtgcagt gcctucggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>238

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(16)..(16)

<223>16位的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>238

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>239

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(17)..(17)

<223>17位的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>239

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>240

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(18)..(18)

<223>18位的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>240

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>241

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>19位的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>241

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>242

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>242

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>243

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>243

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>244

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的尿嘧啶是2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>244

ggcgtgcagt gccttcggcc gugcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>245

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>23位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>245

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>246

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>24位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>246

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>247

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(25)..(25)

<223>25位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>247

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>248

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(26)..(26)

<223>26位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’tp3’连接的)

<400>248

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>249

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(27)

<223>27位上的尿嘧啶是2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>249

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggugcc tccgtcacgc ct                      42

<210>250

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(28)..(28)

<223>28位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>250

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>251

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(29)..(29)

<223>29位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>251

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>252

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位的胞嘧啶是2’-O-甲基

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶

<400>252

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>253

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>尿嘧啶at position 31 is 2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>253

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc uccgtcacgc ct    42

<210>254

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(32)..(32)

<223>32位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>254

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>255

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(33)

<223>33位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>255

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>256

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(34)

<223>34位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>256

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>257

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(35)..(35)

<223>35位上的尿嘧啶是2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>257

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgucacgc ct                       42

<210>258

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(36)

<223>36位上的胞嘧啶是2’-O甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶

<400>258

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>259

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(37)..(37)

<223>37位上的腺嘌呤是2’-O甲基腺嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>259

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>260

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(38)..(38)

<223>38位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>260

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>261

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(39)..(39)

<223>39位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>261

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>262

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>262

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>263

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(41)..(41)

<223>41位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>263

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>264

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(2)

<223>在1位和2位上的鸟嘌呤都是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(4)..(4)

<223>4位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(6)..(6)

<223>6位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(37)..(37)

<223>37位上的腺嘌呤是2’-O-甲基腺嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(39)..(39)

<223>39位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>264

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>265

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(3)..(3)

<223>3位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(5)..(5)

<223>5位上的尿嘧啶是2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(36)

<223>36位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(38)..(38)

<223>38位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(41)..(41)

<223>41位上的胞嘧啶是2’O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>265

ggcgugcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>266

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(2)

<223>1位和2位上的鸟嘌呤都是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(3)..(3)

<223>3位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(4)..(4)

<223>4位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(5)..(5)

<223>5位上的尿嘧啶是2’-O-甲基尿嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(6)..(6)

<223>6位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(36)

<223>36位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(37)..(37)

<223>37位的腺嘌呤是2’-O-甲基腺嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(38)..(38)

<223>38位的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(39)..(39)

<223>39位的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(40)..(41)

<223>40位和41位上的胞嘧啶都是2’-O-甲基

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>266

ggcgugcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>267

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>11位的鸟嘌呤是2’-O-甲基

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(17)..(18)

<223>17位和18位上的鸟嘌呤都是2’-O-甲基鸟嘌呤。

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>267

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>268

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(12)..(13)

<223>12位和13位的胞嘧啶都是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>19位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>268

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>269

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(11)..(11)

<223>11位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(12)..(13)

<223>12位和13位上的胞嘧啶都是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(17)..(18)

<223>17位和18位上的鸟嘌呤都是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>19位的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>269

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>270

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(25)..(26)

<223>25位和26位的鸟嘌呤都是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(34)

<223>34位上的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>270

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>271

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>24位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(32)..(33)

<223>32位上的胞嘧啶都是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>271

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>272

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(24)..(24)

<223>24位上的胞嘧啶是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(25)..(26)

<223>25位和26位上的鸟嘌呤都是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(32)..(33)

<223>32位和33位上的胞嘧啶都是2’-O-甲基胞嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(34)

<223>34位的鸟嘌呤是2’-O-甲基鸟嘌呤

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>272

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                      42

<210>273

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的所有残基都是2’-O甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(37)..(41)

<223>37位到41位上的所有残疾都是2’-O甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>273

ggcgugcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>274

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(10)

<223>9位到10位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位上的残疾是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>23位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(36)

<223>34到36位的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>274

ggcgtgcagu gccttcggcc gtgcggtgcc tccgucacgc ct                       42

<210>275

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>23位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(28)..(29)

<223>28位到29位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>31位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(36)

<223>34位到36位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>275

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc uccgucacgc ct                       42

<210>276

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(19)

<223>9位到19位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(37)..(41)

<223>37位到41位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>276

ggcgugcagu gccuucggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>277

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(19)

<223>9位到19位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>23位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(28)..(29)

<223>28位到29位上的都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>31位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(41)

<223>34位到41位上的核苷都是2’-O-甲基

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>277

ggcgugcagu gccuucggcc gtgcggtgcc uccgucacgc ct                       42

<210>278

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(7)

<223>6位上的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰，且与7位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(19)

<223>9位到19位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(19)..(20)

<223>19位上的胞嘧啶被硫代磷酸酯修饰并与20位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>23位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(25)..(26)

<223>25位上的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰，且与26位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(28)..(29)

<223>28位到29位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>31位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(32)..(33)

<223>32位上的胞嘧啶被硫代磷酸酯修饰并与33位的胞嘧啶相附着。

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(41)

<223>34位到41位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>278

ggcgugcagu gccuucggcc gtgcggtgcc uccgucacgc ct                       42

<210>279

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(7)

<223>6位上的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰并与7位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(7)..(8)

<223>7位上的胞嘧啶被硫代磷酸酯修饰且与8位上的腺嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(19)

<223>9位到19位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(19)..(20)

<223>19位上的胞嘧啶被硫代磷酸酯修饰且与20位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>23位的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(24)..(25)

<223>24位的胞嘧啶被硫代磷酸酯修饰且与25位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(25)..(26)

<223>25位的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰并与26位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(28)..(29)

<223>28位到29位的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>31位的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(32)..(33)

<223>32位的胞嘧啶被硫代磷酸酯修饰，并与33位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(41)

<223>34位到41位的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>279

ggcgugcagu gccuucggcc gtgcggtgcc uccgucacgc ct                       42

<210>280

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(5)..(6)

<223>5位上的尿嘧啶被硫代磷酸酯所修饰，并与6位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(7)

<223>6位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰，并与7位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(7)..(8)

<223>7位上的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯修饰，并与8位上的腺嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(19)

<223>9位到19位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(19)..(20)

<223>19位的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯所修饰，并与20位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(21)..(22)

<223>21位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰，并与22位的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(23)

<223>23位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(23)..(24)

<223>23位的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯修饰，并与24位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(24)..(25)

<223>24位的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯修饰，并与25位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(25)..(26)

<223>25位的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰，并与26位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(26)..(27)

<223>26位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰，并与27位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(28)..(29)

<223>28位到29位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(29)..(30)

<223>29位上的胞嘧啶被硫代磷酸酯所修饰，并与30位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(31)..(31)

<223>31位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(31)..(32)

<223>31位上的尿嘧啶被一种硫代磷酸酯所修饰，并与32位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(32)..(33)

<223>32位上的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯修饰，并与33位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(34)..(41)

<223>34位到41位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>280

ggcgugcagu gccuucggcc gtgcggtgcc uccgucacgc ct                       42

<210>281

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(39)

<223>33位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>281

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>282

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(17)

<223>9位到17位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>19位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(26)..(27)

<223>26位到27位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(29)..(29)

<223>29位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(32)..(39)

<223>32位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>282

ggcgugcagu gcuucgccgt gcggtgccuc cgucacgcct                          40

<210>283

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(16)

<223>8位到16位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(18)..(18)

<223>18位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(25)..(26)

<223>25位到26位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(31)..(37)

<223>31位到37位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(38)..(38)

<223>38位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>283

gcgugcagug cuucgccgtg cggtgccucc gucacgct                            38

<210>284

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>284

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>285

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(4)..(5)

<223>4位上的尿嘧啶被一种硫代磷酸酯所修饰，并与5位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(7)..(18)

<223>7位到18位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>285

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>286

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(5)..(6)

<223>5位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰并与6位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>286

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>287

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(7)

<223>6位上的胞嘧啶被硫代磷酸酯所修饰并与7位上的腺嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>287

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>288

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(7)..(8)

<223>7位上的腺嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰，并与8位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>288

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>289

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(18)..(19)

<223>18位上的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯所修饰并与19位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(38)

<223>36位到38位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>289

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>290

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(7)..(18)

<223>7位到18位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(19)..(20)

<223>19位的胞嘧啶被硫代磷酸酯所修饰，并与20位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>290

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                         40

<210>291

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(20)..(21)

<223>20位的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰，并与21位的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>291

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>292

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(21)..(22)

<223>21位上的胸腺嘧啶被一种硫代磷酸酯所修饰并与22位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>292

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>293

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(22)..(23)

<223>22位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰并与23位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>293

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>294

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(23)..(24)

<223>23位的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯修饰，并与24位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>294

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>295

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(24)..(25)

<223>24位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰，并与25位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>295

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                         40

<210>296

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(25)..(26)

<223>25位上的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰，并与26位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>296

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                         40

<210>297

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(26)..(27)

<223>26位上的胸腺嘧啶被硫代磷酸酯所修饰，并与27位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是一种3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>297

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>298

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(28)..(29)

<223>28位上的胞嘧啶被硫代磷酸酯取代并与29位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>298

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>299

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<2210>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(29)..(30)

<223>29位上的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯修饰，并与30位上的尿嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>299

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>300

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(30)..(31)

<223>30位上的尿嘧啶被一种硫代磷酸酯修饰，并与31位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>300

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>301

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(31)..(32)

<223>31位上的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯修饰，并与32位的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>301

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>302

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(32)..(33)

<223>32位上的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯所修饰并与33位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>302

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>303

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(34)..(35)

<223>34位上的尿嘧啶被一种硫代磷酸酯修饰并与35位上的胞嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>303

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>304

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(35)..(36)

<223>35位上的胞嘧啶被一种硫代磷酸酯所修饰，并与36位的腺嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>304

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>305

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(20)..(21)

<223>20位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰并与21位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(39)

<223>33位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>305

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>306

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1）..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(22)

<223>20位到22位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(39)

<223>33位到39位上所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>306

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>307

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(20)..(21)

<223>20位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰并与21位的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(39)

<223>33位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>307

gcgugcagug ccuuuggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>308

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(12)

<223>8位到12位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(12)..(13)

<223>12位上的胞嘧啶被PEG基团修饰并与13位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(13)..(15)

<223>13位到15位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(17)..(17)

<223>17位的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(17)..(18)

<223>17位的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰并与18位的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>19位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(24)..(25)

<223>24位到25位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(27)

<223>27位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(31)

<223>30位到31位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(36)

<223>33位到36位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(37)..(37)

<223>37位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>308

gcgugcagug ccggccgtgc ggtgccuccg ucacgct                             37

<210>309

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(12)

<223>8位到12位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(12)..(13)

<223>12位上的胞嘧啶被PEG基团修饰并与13位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(13)..(15)

<223>13位到15位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(17)..(17)

<223>17位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(17)..(18)

<223>17位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰并与18位的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>19位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(24)..(25)

<223>24位到25位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(27)

<223>27位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(36)

<223>30位到36位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(37)..(37)

<223>37位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>309

gcgugcagug ccggccgtgc ggtgccuccg ucacgct                             37

<210>310

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(3)

<223>1位到3位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(7)..(17)

<223>7位到17位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(19)..(20)

<223>19位的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯所修饰并附着与20位的胸腺嘧啶

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(26)..(27)

<223>26位到27位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(29)..(29)

<223>29位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(32)..(37)

<223>32位到37位的所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(38)..(38)

<223>38位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>310

cgugcagugc cuucggccgt gcggtgccuc cgucacgt                            38

<210>311

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1）..(3)

<223>1位到3位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(7)..(17)

<223>7位到17位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(19)

<223>19位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(19)..(20)

<223>19位的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯修饰并与20位的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(21)..(21)

<223>21位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(26)..(27)

<223>26位到27位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(29)..(29)

<223>29位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(32)..(37)

<223>32位到37位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(38)..(38)

<223>38位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>311

cgugcagugc cuuuggccgt gcggtgccuc cgucacgt                            38

<210>312

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(3)

<223>1位到3位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(7)..(11)

<223>7位到11位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(11)..(12)

<223>11位的胞嘧啶被PEG基团修饰并与12位上的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(12)..(14)

<223>12位到14位的位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(16)..(17)

<223>16位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯修饰并与17位的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(16)..(16)

<223>16位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(18)..(18)

<223>18位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(24)

<223>23位到24位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(26)..(26)

<223>26位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(29)..(30)

<223>29位到30位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(32)..(34)

<223>32位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(35)..(35)

<223>35位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>312

cgugcagugc cggccgtgcg gtgccuccgu cacgt                               35

<210>313

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(3)

<223>1位到3位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(7)..(11)

<223>7位到11位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(11)..(12)

<223>11位上的胞嘧啶被PEG基团修饰并与12位的鸟嘌呤相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(12)..(14)

<223>12位到14位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(16)..(17)

<223>16位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯修饰并与17位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(16)..(16)

<223>16位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(18)..(18)

<223>18位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(24)

<223>23位到24位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(26)..(26)

<223>26位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(29)..(34)

<223>29位到34位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(35)..(35)

<223>35位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>313

cgugcagugc cggccgtgcg gtgccuccgu cacgt                               35

<210>314

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(7)

<223>6位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯修饰并与7位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(6)..(6)

<223>6位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(13)..(14)

<223>13位到14位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(16)..(16)

<223>16位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(23)

<223>19位到23位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(23)..(24)

<223>23位上的胞嘧啶被PEG基团修饰并与24位上的鸟嘌呤相附着。

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(24)..(25)

<223>24位到25位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(29)..(34)

<223>29位到34位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(35)..(35)

<223>35位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>314

cggccgtgcg gtgccuccgu cacgugcagu gccgt                               35

<210>315

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(7)

<223>6位上的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰并与7位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(6)..(6)

<223>6位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(8)

<223>8位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(13)..(14)

<223>13位到14位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(16)..(16)

<223>16位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(19)..(28)

<223>19位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(32)..(37)

<223>32位到37位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(38)..(38)

<223>38位上的残基是2’-O-甲基核苷

<400>315

cggccgtgcg gtgccuccgu cacuuugugc agugccgt                            38

<210>316

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(7)..(8)

<223>7位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯修饰并与8位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(7)..(7)

<223>7位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(9)

<223>9位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(14)..(15)

<223>14位到15位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(17)..(17)

<223>17位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(29)

<223>20位到29位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(39)

<223>33位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>316

ccggccgtgc ggtgccuccg ucacuuugug cagugccggt                          40

<210>317

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(5)

<223>1位到5位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(7)..(8)

<223>7位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯修饰，并与8位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(9)..(9)

<223>9位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(14)..(15)

<223>14位到15位上的核苷都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(17)..(17)

<223>17位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(21)

<223>20位到21位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(23)..(31)

<223>23位到31位上的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(35)..(41)

<223>35位到41位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>317

ccggccgtgc ggtgccuccg ucacguuccg ugcagugccg gt                       42

<210>318

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(21)..(22)

<223>21位上的鸟嘌呤被一种硫代磷酸酯修饰且与22位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>318

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>319

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(20)..(21)

<223>20位上的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰且与21位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>319

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                          40

<210>320

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>1位上的残基被PEG基团修饰

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(20)..(21)

<223>20位上的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰且与21位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上所有的残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>320

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct                           40

<210>321

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(4)

<223>1位到4位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>1位上的残基被PEG基团修饰

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(8)..(18)

<223>8位到18位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(20)..(21)

<223>20位上的鸟嘌呤被硫代磷酸酯修饰并与21位上的胸腺嘧啶相附着

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(20)..(20)

<223>20位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(22)..(22)

<223>22位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(27)..(28)

<223>27位到28位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(30)..(30)

<223>30位上的残基是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(33)..(34)

<223>33位到34位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(36)..(39)

<223>36位到39位上的所有残基都是2’-O-甲基核苷

<220>

<221>其他特征

<222>(40)..(40)

<223>40位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>321

gcgugcagug ccuucggccg stgcggtgcc uccgucacgc t                         41

<210>322

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>322

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>323

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<220>

<221>被修饰的碱基

<222>(1)..(1)

<223>1位上的残基被PEG基团修饰

<220>

<221>其他特征

<222>(42)..(42)

<223>42位上的胸腺嘧啶是3’反向脱氧胸腺嘧啶(3’到3’连接的)

<400>323

ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct                       42

<210>324

<211>0

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>324

000

<210>325

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>325

ctacctacga tctgactagc ttggtagyga yhyhgwggag mtgcggtytg gyygacrtca    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>326

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>326

ctacctacga tctgactagc ctcagattga ctccggcyga cttgttttaa tcttctgagt    60

gcttactctc atgtagttcc                                                80

<210>327

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：化学合成

<400>327

ctacctacga tctgactagc cyyacytaty systwcykyr krataygtcg artactmtgc    60

ttactctcat gtagttcc                                                  78

Claims (42)

1.包括核酸序列的适体，所述核酸序列与选自由ARC 1029(序列号214)，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)，ARC 1368(序列号291)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，和ARC 1884(序列号322)组成的组的序列有95％同源性。

2.根据权利要求1所述的适体，其中适体包括初级核酸序列，该初级序列与选自由ARC 1029(序列号214)，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1346(序列号281)，ARC1361(序列号284)，ARC 1368(序列号291)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，和ARC 1884(序列号322)组成的组的初级核酸序列具有95％的同源性。

3.根据权利要求1所述的适体，其中适体核酸序列包括一种化学修饰，且与选自由ARC 1029(序列号214)，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1346(序列号281)，ARC1361(序列号284)，ARC 1368(序列号291)，ARC 1635(序列号319)，ARC 1759(序列号318)，和ARC 1884(序列号322)组成的组的包括化学修饰的核酸序列具有95％的同源性。

4.根据权利要求1所述的适体，其中该适体与一种高分子量、非免疫原性化合物相结合，或与一种亲脂性化合物相结合。

5.根据权利要求4所述的适体，其中，适体与一种非免疫原性、高分子量化合物相结合，此化合物是聚烯基二醇。

6.根据权利要求5所述的适体，其中聚烯基二醇是聚乙二醇。

7.根据权利要求6所述的适体，其中聚乙二醇包括的分子量选自由5kDa、10kDa、20kDa和40kDa所组成的组。

8.根据权利要求7所述的适体，其中，适体选自由ARC 1779(序列号320)，ARC 1780(序列号321)和ARC 1885(序列号323)所组成的组。

9.一种组合物，包括治疗有效量的权利要求1所述适体或其盐和一种药学上可接受的载体或稀释剂。

10.治疗、预防或缓解由vWF调节的疾病的方法，包括对哺乳动物给药权利要求9所述的组合物。

11.治疗有需要的病人的方法，包括在透析、CABG手术、经皮冠状动脉介入治疗或心瓣膜置换手术之前、其间和/或之后，对患者给药权利要求9所述的组合物。

12.根据权利要求10所述的方法，其中组合物包括与20KDa PEG相结合的ARC 1368(序列号291)或其片断。

13.根据权利要求12所述的方法，其中组合物包括ARC 1779(序列号320)。

14.根据权利要求11所述的方法，其中组合物包括与20KDa PEG相结合的ARC 1368(序列号291)或其片断。

15.根据权利要求14所述的方法，其中组合物包括ARC 1779(序列号320)。

16.一种组合物，包括治疗有效量的权利要求8所述适体及其盐和药学上可接受的载体或稀释剂。

17.治疗、预防或缓解由vWF调节的疾病的方法，包括对哺乳动物给药权利要求16所述的组合物。

18.能够特异结合血管性血友病因子靶分子的适体。

19.根据权利要求18所述的适体，其中，血管性血友病因子靶分子是人血管性血友病因子。

20.根据权利要求18所述的适体，其中，适体调节血管性血友病因子调节的血小板凝聚。

21.一种根据权利要求18所述的适体，能够特异性结合血管性血友病因子全长靶分子和血管性血友病因子A1区域靶分子。

22.权利要求21所述的适体，其中，血管性血友病因子全长靶分子和血管性血友病因子A1区域靶分子来源于不同的物种。

23.一种诊断方法，包括将权利要求18所述的任意一种适体与怀疑包括血管性血友病因子或其变异体的组合物相接触，并检测血管性血友病因子及其变异体的存在或缺失。

24.鉴定能够调节适体靶分子生物功能的适体的方法，包括：

a)制备一种单链核酸的候补混合物；

b)将此候补混合物与全长蛋白质靶分子和全长蛋白质靶分子的一个区域相接触；

c)分离对全长蛋白质靶分子和全长蛋白质靶分子的一个区域具有增加的亲合性的核酸；和

d)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生一种特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中该方法进一步包括：

e)将特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物与全长靶分子蛋白质接触；

f)分离对全长靶分子蛋白质具有增加的亲合性的核酸；和

g)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生靶分子特别富集的适体混合物；

h)将此特异性靶分子富集的适体混合物与蛋白质目标领域接触；

i)分离对蛋白质目标领域具有增加的亲合性的亲合性核酸；和

j)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，该方法进一步包括筛选能够体内妨碍靶分子蛋白全长生物功能的适体。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，靶分子蛋白全长得自第一物种，靶分子蛋白区域得自第二物种。

28.根据权利要求27所述的方法，进一步包括筛选能够结合第一和第二物种靶分子蛋白的适体。

29.使用权利要求26所述方法鉴定的适体。

30.能够特异性结合血管性血友病因子的适体，包括一种初级核酸序列，该初级核酸序列与选自由序列号31到50，序列号54到94，序列号98到164，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201，序列号205，序列号208，序列号212-214，ARC 1115(序列号221)，ARC 1172(序列号222)，ARC 1194(序列号223)到ARC1240(序列号269)，ARC 1338(序列号273)到ARC 1346(序列号281)，ARC 1361(序列号284)到ARC 1381(序列号304)，ARC 1524(序列号305)，ARC 1526(序列号307)到ARC 1535(序列号316)，ARC 1546(序列号317)，ARC 1759(序列号318)，ARC 1635(序列号319)，，ARC 1779(序列号320)到ARC 1780(序列号321)和ARC 1884(序列号322)到ARC 1885(序列号323)组成的组的任意一个初级核酸序列具有至少95％的同源性。

31.一种组合物，包括治疗有效量的权利要求30所述适体或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂。

32.治疗、预防或缓解vWF调节的疾病的方法，包括对哺乳动物给药权利要求31所述组合物。

33.治疗有需要的病人的方法，包括在透析、CABG手术、经皮冠状动脉介入治疗或心瓣膜置换手术之前、其间和/或之后，对患者给药权利要求31所述的组合物。

34.一种诊断方法，包括将权利要求30所述的任意一种适体与怀疑包括血管性血友病因子或其变异体的组合物相接触，并检测血管性血友病因子及其变异体的存在或缺失。

35.一种根据权利要求30所述的适体，用于体外诊断。

36.一种根据权利要求30所述的适体，用于体内诊断。

37.根据权利要求24所述的方法，其中适体靶分子是血管性血友病因子。

38.根据权利要求24所述的方法，其中靶分子蛋白全长区域是血管性血友病因子A1区域。

39.根据权利要求25所述的方法，其中靶分子蛋白全长是血管性血友病因子。

40.根据权利要求39所述的方法，其中靶分子蛋白区域是血管性血友病因子A1区域。

41.根据权利要求28所述的方法，其中第一和第二物种的靶分子蛋白是血管性血友病因子靶分子。

42.根据权利要求41所述方法鉴定的适体。

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