KR20070031877A - 인간 ｉｌ-１２ 사이토카인 족에 대한 앱타머 및 자가면역 질환 치료제로서의 이의 용도 - Google Patents

인간 ｉｌ-１２ 사이토카인 족에 대한 앱타머 및 자가면역 질환 치료제로서의 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20070031877A
KR20070031877A KR1020067020628A KR20067020628A KR20070031877A KR 20070031877 A KR20070031877 A KR 20070031877A KR 1020067020628 A KR1020067020628 A KR 1020067020628A KR 20067020628 A KR20067020628 A KR 20067020628A KR 20070031877 A KR20070031877 A KR 20070031877A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
aptamer
nos
aptamers
sequence
Prior art date
Application number
KR1020067020628A
Other languages
English (en)
Inventor
샤론 티. 클로드
존 엘. 디에너
앨리샤 퍼거슨
노부코 하마구치
사라 체스워쓰 킨
에이치. 에이. 대니엘 라가스
푸자 소우니
크리스틴 톰슨
Original Assignee
아케믹스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아케믹스 코포레이션 filed Critical 아케믹스 코포레이션
Priority to KR1020067020628A priority Critical patent/KR20070031877A/ko
Publication of KR20070031877A publication Critical patent/KR20070031877A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 사이토카인이 발병기전에 관여하는 면역 질환을 치료하는 물질 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 물질 및 방법은 자가면역 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 물질 및 방법은 인간 IL-23 및/또는 인간 IL-12 사이토카인에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 조절할 수 있고 면역, 자가-면역 및 암 치료에 있어서 치료제로서 유용한 핵산 리간드에 관한 것이다.

Description

인간 ＩＬ-１２ 사이토카인 족 대한 앱타머 및 자가면역 질환 치료제로서의 이의 용도{APTAMERS TO THE HUMAN IL-12 CYTOKINE FAMILY AND THEIR USE AS AUTOIMMUNE DISEASE THERAPEUTICS}
본 발명은 일반적으로 핵산 분야, 더욱 특히는 인간 인터루킨-12 (IL-12) 사이토카인 족의 구성원, 더욱 구체적으로는 인간 인터루킨-12 (IL-12), 인간 인터루킨-23 (IL-23), 또는 IL-12 및 IL-23 둘 모두, 및 기타 관련 사이토카인 (예를 들어, IL-27 및 p40 이량체)에 결합할 수 있는 앱타머 (aptamer)에 관한 것이다. 그러한 앱타머는 자가면역 관련 질환 및/또는 IL-12 족의 사이토카인, 구체적으로는 IL-23 및 IL-12가 연루된 기타 질환 또는 장애의 치료제 및 진단제로서 유용하다. 본 발명은 또한 IL-23 및/또는 IL-12에 결합할 수 있는 앱타머의 투여를 위한 재료 및 방법에 관한 것이다.
앱타머는 고전적인 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기쌍 형성 (base pairing) 이외의 상호 작용을 통하여 분자에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 핵산 분자이다.
앱타머는, 파지 디스플레이에 의해 생성되는 펩티드 또는 단일클론 항체 ("mAb")와 같이, 선택된 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있 는데, 예를 들어 결합을 통하여 앱타머는 그의 표적이 기능하는 능력을 차단할 수도 있다. 랜덤 서열 올리고뉴클레오티드의 풀 (pool)로부터의 시험관내 선택 공정에 의해 생성된다면 앱타머는 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린 및 수용체를 비롯한 100종이 넘는 단백질에 대하여 생성되었다. 전형적인 앱타머는 크기가 10-15 kDa (30-45개의 뉴클레오티드)이며, 나노몰 이하의 친화도로 그의 표적에 결합하고, 밀접하게 관련된 표적을 구별한다 (예를 들어, 앱타머는 전형적으로 동일 유전자 족 유래의 다른 단백질에는 결합하지 않음). 일련의 구조 연구에 의하면, 앱타머는 항체-항원 복합체에서 친화성 및 특이성이 생기게 하는 동일한 유형의 결합 상호 작용 (예를 들어, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 제외)을 이용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
앱타머는 높은 특이성 및 친화성, 생물학적 효능, 및 탁월한 약동학적 특성을 비롯한, 치료제 및 진단제로 사용함에 있어서의 다수의 바람직한 특징을 갖는다. 또한, 앱타머는 항체 및 기타 단백질의 생물학적 특성에 비하여 예를 들어 하기와 같은 특이적 경쟁 장점을 제공한다:
1) 속도 및 제어. 앱타머는 전적으로 시험관내 공정에 의해 제조되며, 이는 치료용 리드 (lead)를 비롯한 초기 리드의 신속한 생성을 허용한다. 시험관내 선별은 앱타머의 특이성 및 친화성이 엄중하게 제어되게 하며, 독성 표적 및 비-면역원성 표적 둘 모두에 대한 리드를 비롯한 리드의 생성을 허용한다.
2) 독성 및 면역원성. 클래스로서의 앱타머는 독성 또는 면역원성을 거의 보여주지 않거나 전혀 보여주지 않는다. 고수준의 앱타머 (일일 10 mg/kg, 90일 동안)를 쥐 또는 우드척 (woodchuck)에 장기간에 걸쳐 투여하면, 모든 임상, 세포 또는 생화학적 측정에 의해 독성이 전혀 관찰되지 않는다. 다수의 단일클론 항체의 효능은 항체 그 자신에 대한 면역 반응에 의해 심하게 한정될 수 있는 반면, 아마 앱타머가 MHC를 통하여 T 세포에 의해 제시될 수 없고 면역 반응은 일반적으로 핵산 단편을 인식하지 못하도록 훈련되기 때문에 앱타머에 대한 항체를 유도하는 것은 극도로 어렵다.
3) 투여. 대부분의 현재 승인된 항체 치료제는 (전형적으로 2-4시간에 걸친) 정맥내 주입에 의해 투여되는 반면, 앱타머는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다 (피하 투여를 통한 앱타머의 생체 이용률은 원숭이 연구에서 >80%임 (Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203- 212,1999)). 이러한 차이는 주로 비교적 낮은 용해도 및 그에 따른 대부분의 치료용 mAb에 필요한 큰 부피로 인한 것이다. 우수한 용해도 (>150 mg/mL) 및 비교적 낮은 분자량 (앱타머: 10-50 kDa; 항체: 150 kDa)으로, 앱타머의 주 1회 용량은 0.5 mL 미만의 부피로 주사에 의해 전달될 수 있다. 또한, 앱타머의 작은 크기는 항체 또는 항체 단편이 침투하는 것을 허용하지 않는 배좌 속박 지역 내로 앱타머가 침투하는 것을 허용하여, 앱타머 기재의 치료제 또는 예방제의 또다른 장점을 제시한다.
4) 스케일링성 ( scalablity ) 및 비용. 치료용 앱타머는 화학적으로 합성되며 그 결과 생산 수요를 맞추는 데에 필요한 대로 손쉽게 스케일링될 (scaled) 수 있다. 생산에서의 스케일링에 있어서의 어려움이 현재 몇몇 생물학적 약제의 이용 가능성을 제한하고 있으며, 대규모 단백질 생산용 공장의 자본 비용이 막대한 반 면, 단일한 대규모 올리고뉴클레오티드 합성기는 연간 100 kg 이상을 제조할 수 있으며 상대적으로 온당한 최초 투자비를 필요로 한다. 킬로그램 스케일의 앱타머 합성을 위한 물품의 현행 비용은 $500/g으로 추정되며, 이는 고도로 최적화된 항체에 있어서의 비용에 비견할 만하다. 공정 개발에서의 계속적인 개선에 의해 5년 후에는 물품의 비용이 <$100/g으로 저하될 것으로 기대된다.
5) 안정성. 치료용 앱타머는 화학적으로 강건하다. 상기 앱타머는 내재적으로 열 및 변성제와 같은 인자에의 노출 이후에 활성을 회복하도록 수정되며 냉동 건조 분말로서 실온에서 장기간 동안 (>1년) 보관될 수 있다.
사이토카인 및 면역 반응
포유류에서의 면역 반응은 "면역 네트워크"로 불리우는 일련의 복잡한 세포 상호 작용을 기초로 한다. 림프구, 대식세포, 과립구 및 기타 세포의 네트워크 유사 세포 상호 작용 외에도, 림포카인, 사이토카인 또는 모노카인으로 공지된 용해성 단백질이 이러한 세포 상호 작용의 제어에 결정적인 역할을 한다. 면역계 세포에 의한 사이토카인의 발현은 면역 반응의 조절에서 중요한 역할을 한다. 대부분의 사이토카인은 다면 발현성이며 항원 제시; CD4+ 세포 서브세트의 활성화, 증폭 및 분화; B 세포에 의한 항체 반응; 및 과민성 징후를 포함하는 다수의 생물학적 활성을 갖는다. 사이토카인은 면역계 및/또는 조혈 세포가 직접적으로 또는 간접적으로 연루되는 광범위한 퇴행성 또는 비정상 질병에 연루되어 있다. 중요한 사이토카인 족은 IL-12 족이며 이는 예를 들어 IL-12, IL- 23, IL-27, 및 p40 단량체와 p40 이량체를 포함한다.
IL-23은 p19 및 p40 서브유닛으로 구성된 공유 결합된 이형이량체 분자이며, 상기 서브유닛은 각각이 개별적인 유전자로 코딩된다. IL-12도 공유 결합된 이형이량체 분자이며 p35 및 p40 서브유닛으로 이루어진다. 따라서, IL-23 및 IL-12 둘 모두는 p40 서브유닛을 공통으로 갖는다 (도 1). 인간 및 생쥐 p19는 대략 70%의 아미노산 서열 동일성을 공유하며 p35 (IL-12에 특유한 서브유닛)와 밀접하게 연관된다. 트랜스펙션 분석에 의하면 p35와 같이, p19 단백질은 단독으로 발현될 때 잘 발현되지 않으며 보다 높은 발현을 위해서는 그의 이형 이량체화 상대인 p40의 발현을 필요로 한다는 것이 나타났다. 이와 함께, p40 및 p19는 디술피드 결합 이형 이량체를 형성한다. p19 구성 요소는 활성화된 대식세포, 수지상 세포 (dendritic cell, "DC"), 내피 세포 및 T 세포에 의해 다량으로 생산된다. Th1 세포는 Th2 세포가 발현하는 것보다 많은 양의 p19 mRNA를 발현하지만, 이러한 세포 유형들 중에서 활성화된 대식세포 및 DC만이 IL-23의 다른 구성 요소인 p40을 항시적으로 발현한다. p19의 발현은 Toll-유사 수용체-2를 통하여 신호화되는 박테리아 생성물에 의해 증가되는데, 이는 p19와, 그에 따른 IL-23이 소정의 박테리아 감염에 대한 면역 반응에서 기능할 수도 있음을 시사하는 것이다.
IL-12 및 IL-23의 공유된 작용 중 하나는 T 세포에 대한 그의 증식 영향이다 (Brombacher et al., Trends in Immun. (2003)). 그러나, 이러한 사이토카인이 작용하는 T-세포 서브세트에는 명백한 차이가 존재한다. 생쥐에 있어서, IL-12는 나이브 (naive) 쥣과 T 세포의 증식은 유도하지만 기억 T 세포의 증식은 유도하지 않으며, 반면, IL-23의 증식 효과는 기억 T 세포에 국한된다. 인간에 있어서, IL-12 는 나이브 및 기억 인간 T-세포 둘 모두의 증식을 촉진하지만, IL-23의 증식 효과는 여전히 기억 T 세포에 제한된다. 또한, IFN-γ 생성에 대한 IL-23의 작용은 인간에 있어서 주로 기억 T 세포로 향한다. IL-12는 나이브 T-세포에서 그리고 보다 큰 정도로 기억 T-세포에서 INF-γ 생성을 유도할 수 있지만, IL-23은 나이브 T-세포에서 IFN-γ 생성에 대하여 매우 적은 영향을 미친다. IL-23에 의해 자극되는 기억 T-세포에서 IFN-γ 생성이 온화하게 증가한다는 것이 관찰되었지만, 이러한 영향은 IL-12를 이용한 자극에서 생기는 것보다 다소 적다.
이와 같이, IL-23은 IL-12와 별개인 생물학적 활성을 갖지만, 이들 둘 모두 골다공증에서의 골흡수, 제I형 당뇨병 및 암과 같은 질환 외에도 자가면역 및 염증성 질환, 예를 들어, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 전신성 홍반성 루푸스 및 과민성 장질환 (크론병 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염을 포함함)에서 그 역할을 하는 것으로 생각된다.
자가면역 질환 치료제로서의 IL -23 및/또는 IL -12 특이성 앱타머
이론에 구애되고자 함이 없이, IL-12 및 IL-23은 다발성 경화증 (multiple sclerosis, "MS") 병인에 연루되어 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, p40의 수준은 MS 환자의 뇌척수액에서 상향 조절된다 (Fassbender et al., (1998) Neurology 51: 753). 또한, 항-p40 mAb는 뇌에서의 병변에 국소화되는 것으로 밝혀졌다 (Brok et al., JI (2002) 169: 6554). 또한, p40 mRNA의 보다 낮은 기준선 (baseline) 수준은 IFN-β 처리에 대한 임상 반응성을 예측하는 것으로 밝혀졌다 (Van-Boxel-Dezaire et al., 1999). 따라서, p40을 통한 IL-12 및 IL-23 둘 모두 의 넉-다운 (knock-down)은 MS의 증상을 개선시킬 수 있다. 사실상, 항-p40 항체는 생쥐 (Constantinescu et al., JI (1998) 161: 5097) 및 비단 원숭이 (marmoset) (Brok et al., JI (2002) 169: 6554)에서 실험적 자가면역 뇌척수염 (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, "EAE")dml 발병 및 중증도를 유의하게 억제하는 것으로 밝혀졌다.
IL-23 및 IL-12 둘 모두의 넉 아웃 (knock out)이 MS의 발병 및 증상을 억제한다는 것을 보여주는 증거에도 불구하고, EAE 생쥐 모델에 대한 IL-12 및 IL-23 넉 아웃의 영향에 의해 보여지는 바와 같이, IL-23이 생쥐에 있어서의 MS/EAE 병인에서 둘 중 보다 중요하다는 강력한 증거가 존재한다 (Cua et al., (2003) Nature 421: 744). 예를 들어, EAE는 p35 넉 아웃 생쥐에서는 발생할 수 있지만 p19 또는 p40 넉 아웃 생쥐에서는 그러하지 않다 (Cua et al., (2003). IL-12의 과다 발현이 EAE를 악화시켜서, IL-12가 일반적인 TH1 세포 발달 및 활성화에 몇몇 역할을 하는 것으로 보이지만, CNS에서의 IL-12가 아닌 IL-23의 발현이 p19/p40 넉 아웃 생쥐에서 EAE를 구조한다 (Cua et al.). 인간에 있어서는, p35 mRNA가 아닌 p40 mRNA의 과다 발현이 MS 환자의 중추 신경계 (CNS)에서 관찰되었다.
Th1 세포의 활성화에서 일반적인 역할을 하는 것 외에도, IL-12는 IL-23보다 감염과 싸우는 데에 더 중요할 수 있다. 생쥐에서, p19 넉 아웃은 전통적인 Th1 세포 반응 (높은 IFN-γ, 낮은 IL-4)을 유도하며, 반면, p35 및 p40 넉 아웃 생쥐에서의 반응은 Th2 세포에 제한된다 (낮은 IFN-γ, 낮은 IL-4) (Cua et al.). 추가로, p19 넉 아웃 면역 세포는 강력한 전-염증성 사이토카인을 생산하며, 반면, p40 넉 아웃 면역 세포는 그렇게 할 수 없다. 마지막으로, p40, IL-12Rβ1 및 IL-12Rβ2 넉 아웃 생쥐는 다양한 감염에 영향받기 쉽다 (Adorini, from Contemporary Immunology (2003) pg. 253). 따라서 특이적으로 앱타머 치료제를 통한 IL-23의 저해는 환자가 감염과 보다 잘 싸울 수 있게 하면서 IL-23 매개성 질환과 효과적으로 싸울 수 있다.
IL-23 및/또는 IL-12 둘 모두는 말기 관절 염증의 촉진자로서 류머티스 관절염에 연루되어 있다. 이론에 구애되려 함이 없이, IL-23은 기억 T 세포 및 염증성 대식세포의 기능에 상기 세포 상의 IL-23 수용체 (IL-23R)의 개입을 통하여 영향을 주는 것으로 생각된다. 연구에 의하면 IL-23 서브유닛 p19 및/또는 p40은 류머티스 관절염에 있어서의 생쥐 모델인 쥣과 콜라겐 유도성 관절염 (collagen-induced arthritis, "CIA")에서 그 역할을 한다는 것이 나타났다. 항-p40 항체는 단독으로, 또는 항-종양 괴사 인자 (항-TNF) 처리와 조합될 때 쥣과 CIA에서 증상을 개선시키고 발병 및 진행을 예방하는 것으로 밝혀졌다 (Malfait et al., Clin. Exp. Immunol. (1998) 111: 377, Matthys et al., Eur. J. Immunol. (1998) 28: 2143, 및 Butler et al., Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2205). 또한, p19 및 p40 넉아웃 생쥐는 CIA의 발병에 대하여 완전히 내성을 갖는 반면, CIA 발병 및 중증도는 p35 넉아웃 생쥐에서는 악화되는 것으로 밝혀졌다 (McIntyre et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26: 2933, 및 Murphy et al., J. Exp. Med. (2003) 198: 1951). 따라서, IL-23에 결합하여 그를 저해하는 본 발명의 앱타머 및 방법은 류머티스 관절염의 치료제로서 유용하다.
IL-23 및/또는 IL-12 둘 모두는 또한 Th-1 매개성 질환, 예를 들어 심상성 건선과, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 과민성 장질환에서 염증 세포의 모집에서 주된 역할을 하는 것으로 생각된다. 예를 들어, p19 및 p40의 mRNA의 수준 상승이 심상성 건선에 걸린 환자의 피부 병변에서 정량적 RT-PCR로 검출되었으며, 반면 p35 mRNA는 검출되지 않았다 (Lee et al., J Exp Med (2004) 199(1): 125-30). 생쥐에 있어서 염증성 장질환의 실험 모델인 2,4,6, 트리니트로벤젠 술폰산 ("TNBS") 대장염에서, 항-IL-12 단일클론 항체로 치료하면 점막 염증을 완전히 개선/예방하는 데에 유효함이 입증되었다 (Neurath et al., J Exp Med (1995) 182: 1281-1290). TNBS 대장염 모델에서 여러 상이한 IL-12 길항제를 평가한 다른 연구에서, 항-IL-12 p40 항체는 점막 염증의 예방에 가장 효과적임이 입증되었으며, 따라서 IL-12 및 IL-23이 연루됨이 입증되었다 (Schmidt et al., Pathobiology (2002-03); 70: 177-183). 따라서, IL-12 및/또는 IL-23에 결합하여 그를 저해하는 본 발명의 앱타머는 건선 및 염증성 장질환의 치료제로서 유용하다.
또한 IL-12 및/또는 IL-23은 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythamatosus, "SLE")에서 그 역할을 한다고 생각된다. 예를 들어, SLE 환자로부터 수득되는 혈청은 이형 이량체, 예를 들어, IL-12 (p35/p40) 및 IL-23 (p19/p40)로서의 p40의 혈청 중 수준보다 유의하게 더 많은 양의 단량체로서의 p40을 포함하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 부족한 IL-23 및/또는 IL-12 생산이 SLE의 병인에서 그 역할을 할 수도 있음을 나타내는 것이다. 따라서, IL-23 및/또는 IL-12의 생물 학적 기능을 증강시키는 본 발명의 앱타머는 전신성 홍반성 루푸스의 치료에 있어서의 치료제로 유용하다 (Lauwerys et al., Lupus (2002) 11 (6): 384-7).
종양학적 치료제로서의 IL -23 및/또는 IL -12 특이성 앱타머
IL-12의 항-종양 활성은 잘 특성화되어 있으며, 최근의 연구에 의하면 IL-23도 항-종양 및 항-전이 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 레트로바이러스에 의해 IL-23으로 형질도입된 결장암 세포는 대조 세포주와 비교하여 면역 적격성 생쥐에서 상기 세포주에 의해 확립된 결장 종양의 성장을 유의하게 감소시켰는데, 이는 종양에서의 IL-23의 발현이 항-종양 효과를 생성함을 나타내는 것이다 (Wang et al., Int. J. Cancer: 105,820-824 (2003). 이와 마찬가지로, 단쇄 IL-23 ("scIL-23")을 방출하도록 레트로바이러스에 의해 엔지니어링된 폐암 세포주는 BALB/c 생쥐에 있어서의 폐 전이를 유의하게 억제하여, 거의 완전한 종양 거부로 이어졌다 (Lo et al., J. Immunol 2003, 171: 600-607). 따라서, IL-23 및/또는 IL-12에 결합하여 이들의 생물학적 기능을 증강시키는 앱타머는 결장암, 폐암, 구체적으로는 폐 전이와, IL-23 및/또는 IL-12가 항-종양 효과를 갖는 기타 종양학적 질환의 치료에 있어서 종양학적 치료제로서 유용하다.
현재, 인간 IL-23을 특이적으로 표적화하는 공지된 치료제는 전혀 없다. IL-23을 표적화하는 이용가능한 약제는 단지 연구 용도의, R&D Systems (미국 미네소타주 미니아폴리스 소재)를 통하여 입수가능한 항-인간 IL-23 p19 다중클론 항체, IL-12 및 IL-23 둘 모두를 표적화하는 항-인간 p40 단일클론 항체 - 이는 상기 사이토카인 둘 모두가 p40 서브유닛을 공통으로 갖기 때문임 - 및 생쥐 IL-23은 표 적화하며 인간 IL-23은 표적화하지 않는 항-생쥐 IL-23 p19 다중클론 및 단일클론 항체를 포함한다 (Pirhonen, et al., (2002), J Immunology 169: 5673- 5678). 이전에 설명한 바와 같이, IL-23 및 IL-12 둘 모두의 활성을 저해하는 약제는 환자가 감염에 대하여 보다 감염되기 쉽게 할 수도 있으며, 일반적으로 치료제 개발 견지에서 IL-23만을 저해하는 약제보다 많은 합병증을 일으킬 수 있다. 뇌 및 관절에서 자가면역 염증에 있어서 IL-23이 IL-12보다 중요한 역할을 한다는 증거가 있기 때문에, IL-23에만 특이적인 치료제가 상기 사이토카인 둘 모두를 표적화하는 약제, 예를 들어, 항-p40 인간 mAb보다 유리할 수 있다.
치료제로서의 앱타머의 특이성, 작은 크기 및 친화성의 장점이 주어진다면, 인간 사이토카인, 구체적으로는 IL-23 및 IL-12가 병인에서 그 역할을 하는 질환의 치료를 위한 앱타머 치료제를 위한 재료 및 방법을 갖는 것이 유익하다. 본 발명은 이러한 필요성 및 기타 필요성을 충족시키기 위한 재료 및 방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 자가면역 및 염증성 질환과, IL-23 및/또는 IL-12가 병인에 연루되어 있는 기타 관련된 질환/장애의 치료를 위한 재료 및 방법을 제공한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 재료는 IL-23에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머가 결합하는 IL-23은 인간 IL-23인 반면, 다른 실시 형태에 있어서 IL-23은 인간 IL-23의 변이체이다. 일 실시 형태에 있어서, IL-23의 변이체는 인간 IL-23의 기능과 본질적으로 동일한 생물학적 기능을 수행하며 인간 IL-23과 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동 일한 상기 앱타머에의 결합 능력을 갖는다.
일 실시 형태에 있어서, 인간 IL-23 또는 그의 변이체는 서열 번호 4 및/또는 5의 서열을 포함하는 서열과 적어도 70% 동일하며, 바람직하게는 적어도 80% 동일하고, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 인간 IL-23 또는 그의 변이체는 서열 번호 4 및 5의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 인간 IL-23 또는 그의 변이체에 대한 해리 상수가 약 100 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 1 nM 이하이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 인간 IL-23 또는 그의 변이체의 기능을 조정한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 인간 IL-23의 기능을 촉진한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 인간 IL-23 또는 그의 변이체의 기능을 저해한다. 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 생체내에서 인간 IL-23 또는 그의 변이체의 기능을 저해한다. 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 IL-23이 IL-23 수용체에 결합하는 것을 방지한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머에 의해 조정되는 인간 IL-23 또는 그의 변이체의 기능은 인간 IL-23과 결부된 질환, 예를 들어, 자가면역 질환 (다발성 경화증, 류머티스 관절염, 건선, 전신성 홍반성 루푸스 및 과민성 장질환 (예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염)을 포함하지만 이로 한정되지는 않음), 염증성 질환, 암 (결장암, 폐암, 폐 전이를 포함하지만 이로 한정되지는 않음), 골다공증에서의 골 흡수 및 제I형 당뇨병을 매개하는 것이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 하기 서열 번호의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머의 인간 IL-23에의 결합 능력과 실질적으로 동일한 인간 IL-23에의 결합 능력을 갖는다: 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-130, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 203-314의 서열. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 하기 서열 번호의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머의 구조 및 IL-23에의 결합 능력과 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 IL-23에의 결합 능력을 갖는다: 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88,서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-130,서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 203-314의 서열.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 인간 IL-23에 결합하며 하기 서열 번호의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 임의의 하나의 서열에 대하여 적어도 80% 동일한, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다: 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-130, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 203-314의 서열. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 하기 서열 번호의 서열의 군으로부터 선택되는 서 열 중 임의의 하나의 서열의 특유한 서열 영역 중의 4개, 8개 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 서열과 동일한 4개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 8개의 인접 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 20개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머를 제공한다: 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-130, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 203-314. 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 인간 IL-23 또는 그의 변이체에 결합할 수 있으며, 하기 서열 번호의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다: 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-130, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 203-314. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 서열 번호 177, 바람직하게는 서열 번호 224, 더 바람직하게는 서열 번호 309, 더 바람직하게는 서열 번호 310, 더 바람직하게는 서열 번호 311에 나타내어진 서열을 갖는 앱타머를 제공한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 생쥐 IL-23에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 생쥐 IL-23의 기능과 본질적으로 동일한 생물학적 기능을 수행하며 생쥐 IL-23과 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 상기 앱타머에의 결합 능력을 갖는 생쥐 IL-23의 변이체에 결합하는 앱타머를 제공한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머가 결합하는 생쥐 IL-23 또는 그의 변이체는 서열 번호 315 및/또는 316의 서열을 포함하는 서열에 대하여 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 생쥐 IL-23 또는 그의 변이체는 서열 번호 315 및 316의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 생쥐 IL-23 또는 그의 변이체에 대한 해리 상수가 약 100 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 생쥐 IL-23 또는 그의 변이체의 기능을 조정한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 생쥐 IL-23의 기능을 촉진한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 생쥐 IL-23 또는 그의 변이체의 기능을 저해한다. 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 생체내에서 생쥐 IL-23 또는 그의 변이체의 기능을 저해한다. 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 생쥐 IL-23이 생쥐 IL-23 수용체에 결합하는 것을 방지한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머에 의해 조정되는 생쥐 IL-23 또는 그의 변이체의 기능은 생쥐 IL-23과 결부된 질환 모델, 예를 들어, 실험적 자가면역 뇌척수염, 쥣과 콜라겐 유도성 관절염 및 TNBS 대장염을 매개하는 것이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 124-134 및 서열 번호 199-202의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머의 생쥐 IL-23에의 결합 능력과 실질적으로 동일한 생쥐 IL-23에의 결합 능력을 갖는다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 124-134 및 서열 번호 199-202의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머의 구조 및 생쥐 IL-23에의 결합 능력과 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 생쥐 IL-23에의 결합 능력을 갖는다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 생쥐 IL-23에 결합하며 서열 번호 124- 134, 및 서열 번호 199-202의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 임의의 하나의 서열에 대하여 적어도 80% 동일한, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 서열 번호 124-134 및 서열 번호 199-202의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 임의의 하나의 서열의 특유한 서열 영역 중의 4개, 8개 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 서열과 동일한 4개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 8개의 인접 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 20개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 생쥐 IL-23 또는 그의 변이체에 결합할 수 있으며 서열 번호 124-134 및 서열 번호 199-202의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 재료는 IL-12에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머가 결합하는 IL-12는 인간 IL-12인 반면, 다른 실시 형태에 있어서 IL-12는 인간 IL-12의 변이체이다. 일 실시 형태에 있어서, IL-12의 변이체는 인간 IL-12의 기능과 본질적으로 동일한 생물학적 기능을 수행하며 인간 IL-12와 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 상기 앱타머에의 결합 능력을 갖는다.
일 실시 형태에 있어서, 인간 IL-12 또는 그의 변이체는 서열 번호 4 및/또는 6의 서열을 포함하는 서열과 적어도 80% 동일하며, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 인간 IL-12 또는 그의 변이체는 서열 번호 4 및 6의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 인간 IL-12 또는 그의 변이체의 기능을 조정한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 인간 IL-23의 기능을 촉진한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 인간 IL-12 또는 그의 변이체의 기능을 저해한다. 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 생체내에서 인간 IL-12 또는 그의 변이체의 기능을 저해한다. 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 IL-12가 IL-12 수용체에 결합하는 것을 방지한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머에 의해 조정되는 인간 IL-12 또는 그의 변이체의 기능은 인간 IL-12와 결부된 질환, 예를 들어, 자가면역 질환 (다발성 경화증, 류머티스 관절염, 건선, 전신성 홍반성 루푸스 및 과민성 장질환 (예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염)을 포함하지만 이로 한정되지는 않음), 염증성 질환, 암 (결장암, 폐암, 폐 전이를 포함하지만 이로 한정되지는 않음), 골다공증에서의 골흡수 및 제I형 당뇨병을 매개하는 것이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 리보핵산 또는 데옥시리보핵산 중 어느 하나인 앱타머를 제공한다. 추가의 실시 형태에 있어서, 이들 리보핵산 또는 데옥시리보핵산 앱타머는 단일 가닥이다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 앱타머를 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 이 변형은 핵산의 당 위치에서의 화학적 치환; 포스페이트 위치에서의 화학적 치환; 및 염기 위치에서의 화학적 치환; 변형 뉴클레오티드의 혼입; 3' 캡핑 (capping); 고분자량의 비면역원성 화합물에의 콘쥬게이션; 친유성 화합물에의 콘쥬게이션과; 포스페이트 골격 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머에 콘쥬게이션되는 비면역원성의 고분자량 화합물은 폴리알킬렌 글리콜, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일 실시 형태에 있어서, 골격 변형은 하나 이상의 포스포로티오에이트의 포스페이트 골격 내로의 혼입을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 포스페이트 골격 내의 10개보다 적은, 6개보다 적은, 또는 3개보다 적은 포스포로티오에이트의 혼입을 포함한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 재료는 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-130, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 203-314의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 치료적 유효량의 앱타머, 또는 그의 염과, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 재료는 서열 번호 14, 서열 번호 17-19, 서열 번호 21, 서열 번호 27-32, 서열 번호 34-40, 서열 번호 42, 서열 번호 49, 서열 번호 60-61, 서열 번호 91-92, 서열 번호 94, 및 서열 번호 103-118의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 치료적 유효량의 앱타머, 또는 그의 염과, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 재료는 서열 번호 177, 서열 번호 224, 및 서열 번호 309-312의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 치료적 유효량의 앱타머를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 IL-23에 의해 매개되는 질환을 치료, 예방 또는 개선하는 방법으로서, 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-130, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 203-314의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 치료적 유효량의 앱타머를 함유하는 조성물을 척추 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 IL-23 및/또는 IL-12에 의해 매개되는 질환을 치료, 예방 또는 개선하는 방법으로서, 서열 번호 14, 서열 번호 17-19, 서열 번호 21, 서열 번호 27-32, 서열 번호 34-40, 서열 번호 42, 서열 번호 49, 서열 번호 60-61, 서열 번호 91-92, 서열 번호 94, 및 서열 번호 103-118의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 치료적 유효량의 앱타머를 함유하는 조성물을 척추 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 척추 동물에게 투여되는 치료적 유효량의 앱타머를 함유하는 조성물은 서열 번호 177, 서열 번호 224, 및 서열 번호 309-312로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 약학 조성물이 투여되는 척추 동물은 포유류이다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 포유류 는 인간이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법으로 치료, 예방 또는 개선되는 질환은 자가면역 질환 (다발성 경화증, 류머티스 관절염, 건선, 전신성 홍반성 루푸스 및 과민성 장질환 (예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염)을 포함하지만 이로 한정되지는 않음), 염증성 질환, 암 (결장암, 폐암, 폐 전이를 포함하지만 이로 한정되지는 않음), 골다공증에서의 골흡수 및 제I형 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 앱타머를 IL-23 및/또는 IL-12 또는 그의 변이체를 함유할 것이라 추측되는 조성물과 접촉시키는 단계와, IL-23 및/또는 IL-12 또는 그의 변이체의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하는 진단 방법을 제공한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하며 시험관내 진단제로서 사용하기 위한 앱타머를 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하며 생체내 진단제로 사용하기 위한 앱타머를 제공한다. 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하며 생체내에서의 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한 앱타머를 제공한다.
도 1은 인터루킨-12 족의 사이토카인의 개략도이다.
도 2는 랜덤 서열 올리고뉴클레오티드의 풀로부터의 시험관내 앱타머 선별 (SELEX (상표명)) 공정의 개략도이다.
도 3은 음성 선별 단계에서 IL-12를 포함시키고 그럼으로써 IL-12 및 IL-23 둘 모두에서의 공통 서브유닛인 p40을 인식하는 서열을 제거함에 의해 IL-23에 특이적인 앱타머를 선별하기 위한 시험관내 선별 방법의 개략도이다.
도 4는 40 kDa의 분지형 PEG를 도시한 것이다.
도 5는 앱타머의 5' 말단에 부착된 40 kDa의 분지형 PEG를 도시한 것이다.
도 6은 표준 단일-PEG화 (PEGylation), 다중 PEG화 및 PEG화를 통한 이량체화를 나타내는 다양한 PEG화 전략을 도시하는 도면이다.
도 7은 다양한 라운드의 선별 후 rRmY 및 rGmH 풀의 IL-23에의 결합을 도시 하는 그래프이다.
도 8A는 제1형 IL-23 앱타머의 서열 및 예측되는 이차 구조 외형 (configuration)의 개략도이며, 도 8B는 여러 제2형 IL-23 앱타머의 서열 및 예측되는 이차 구조 외형의 개략도이다.
도 9A는 제1형 IL-23 앱타머의 최소화 앱타머의 서열 및 예측되는 이차 구조 외형의 개략도이며, 도 9B는 제2형 IL-23 앱타머의 최소화 앱타머의 서열 및 예측되는 이차 구조 외형의 개략도이다.
도 10에는 dRmY 미니머 (minimer) ARC979 (서열 번호 177)의 예측되는 G-4중체 (Quartet) 구조가 도시되어 있다.
도 11은 ARC979 (서열 번호 177)에서의 NMM 형광성의 증가를 도시하는 그래프이며, 이는 ARC979가 G-4중체 구조를 채택하고 있음을 확인하는 것이다.
도 12는 50 nM IL-23을 사용하여 총 결합 [앱타머]를 기초로 하여 분석한 ARC979 (서열 번호 177)의 경쟁 결합 곡선의 그래프이다.
도 13은 250 nM IL-12를 사용하여 결합 [앱타머]를 기초로 하여 분석한 ARC979 (서열 번호 177)의 경쟁 결합 곡선의 그래프이다.
도 14는 두 가지 상이한 결합 반응 조건 (1X PBS (Ca++ 또는 Mg++를 포함하지 않음) 또는 1X 둘베코 (Dulbeccos) PBS (Ca++ 및 Mg++를 포함함)) 하에서의 ARC979 (서열 번호 177)의 직접적 결합 곡선의 그래프이다.
도 15는 단일 포스포로티오에이트 치환이 IL-23에의 결합 비율을 증가시킨다 는 것을 도시하는 ARC979 (서열 번호 177) 포스포로티오에이트 유도체의 직접적 결합 곡선의 그래프이다.
도 16은 단일 포스포로티오에이트 치환체가 IL-23에 대하여 ARC979보다 큰 친화도로 경쟁한다는 것을 도시하는, ARC979 (서열 번호 177) 포스포로티오에이트 유도체의 경쟁 결합 곡선의 그래프이다.
도 17은 부모 ARC979 (서열 번호 177) 앱타머 (ARC895는 음성 대조임)에 비하여, ARC979 최적화 유도체 ARC1624 (서열 번호 310) 및 ARC1625 (서열 번호 311)의 직접적인 결합 곡선의 그래프이다.
도 18은 ARC979 (서열 번호 177)의 혈장 중 안정성을 최적화 ARC979 유도체 제작물과 비교하여 도시한 그래프이다.
도 19는 본 발명의 앱타머에 노출된 PHA 아세포 (blast cell)의 용해물에서 STAT3 활성의 측정에 사용되는 TransAM (상표명)의 개략도이다.
도 20은 본 발명의 앱타머에 노출된 PHA 아세포에서 IL-23 유도된 STAT3 인산화의 탐지에 사용되는 프로토콜의 흐름도이다.
도 21은 TransAM (상표명) 분석법을 사용하여 PHA 아세포에서 IL-23 유도된 STAT3 인산화에 대한 rRfY 조성물의 부모 IL-23 앱타머의 저해 효과를 그의 각각의 최적화 클론과 비교하여 도시한 대표 그래프이다.
도 22는 TransAM (상표명) 분석에서 dRmY 조성물의 IL-23 앱타머에 의한 IL-23 유도 STAT3 인산화의 저해 퍼센트의 그래프이다 (ARC793 (서열 번호 163)은 비결합 앱타머임).
도 23은 TransAM (상표명) 분석에서 dRmY 조성물 (ARC621 (서열 번호 108), ARC627 (서열 번호 110))의 부모 IL-23 앱타머에 의한 IL-23 유도된 STAT3 인산화의 저해 퍼센트를 그의 각각의 최적화 클론 (ARC979 (서열 번호 177), ARC980 (서열 번호 178), ARC982 (서열 번호 180))과 비교한 그래프이다.
도 24는 Pathscan (등록상표) 분석에서 ARC979 (서열 번호 177) 및 ARC979의 2개의 최적화된 유도체 클론 (ARC 1624 (서열 번호 310) 및 ARC1625 (서열 번호 311))에 의한 IL-23 유도된 STAT3 인산화의 저해 퍼센트 그래프이다.
도 25는 인간 PHA 아세포에서 인간 및 생쥐 IL-23 유도된 STAT3 활성화를 TransAM (상표명) 분석으로 측정하여 비교한 그래프이다.
본 발명의 하나 이상의 실시 형태에 대한 상세한 기술이 하기에 첨부되는 설명에 나타내어져 있다. 본원에 기술되어 있는 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이제 바람직한 방법 및 재료를 기술한다. 본 발명의 다른 특징부, 목적 및 장점은 본 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 본 명세서에서, 단수형은 문맥이 명백하게 다른 것을 지시하지 않는 한 복수형을 또한 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 본 명세서가 좌우할 것이다.
SELEX (상표명) 방법
앱타머의 적합한 생성 방법은 일반적으로 도 2에 도시되어 있는 SELEX (상표명) (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)라는 표제 하의 공정을 이용하는 것이다. SELEX (상표명) 공정은 표적 분자에 고도로 특이적으로 결합하는 핵산 분자의 시험관내 진화 방법이며, 예를 들어 1990년 6월 11일자로 출원되고 현재는 포기된 미국 특허 출원 제07/536,428호, 발명의 명칭이 "핵산 리간드"인 미국 특허 제5,475,096호, 및 발명의 명칭이 "핵산 리간드"인 미국 특허 제5,270,163호 (WO 91/19813도 참조)에 개시되어 있다. 각각의 SELEX (상표명)-동정 핵산 리간드, 즉, 각각의 앱타머는 주어진 표적 화합물 또는 분자의 특이적 리간드이다. SELEX (상표명) 공정은 핵산이 다양한 2차원 및 3차원 구조의 형성에 있어서 충분한 역량을 가지며 그의 단량체 내에서 이용가능한 충분한 화학적 다재다능함 (versatility)을 가져서 단량체든지 중합체든지 간에 사실상 모든 화학적 화합물과의 리간드로서 작용한다 (즉, 특이적 결합쌍을 형성함)는 특유한 식견을 기초로 한다. 임의의 크기 또는 조성의 분자가 표적으로서의 역할을 할 수 있다.
SELEX (상표명)은 출발점으로서 랜덤화 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 큰 라이브러리 또는 풀에 의지한다. 올리고뉴클레오티드는 변형 또는 미변형 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 혼성체일 수 있다. 몇몇 예에 있어서, 풀은 100% 랜덤하거나 부분적으로 랜덤한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예에 있어서, 풀은 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존된 서열이 랜덤화 서열 내에 혼입된 것을 포함하는 랜덤 또는 부분적 랜덤 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예에 있어서, 풀은 올리고뉴클레오티드 풀의 모든 분자에 의해 공유되는 서열을 포함할 수 있는 5' 및/또는 3' 말단에 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존된 서열을 포함하는 랜덤 또는 부분적 랜덤 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 고정 서열은 풀 중의 올리고뉴클레오티드에 공통적이며 사전 선별 목적으로 혼입되는 서열, 예를 들어, 하기에서 추가로 설명되는 CpG 모티프, PCR 프라이머를 위한 혼성화 부위, RNA 폴리머라제를 위한 프로모터 서열 (예를 들어, T3, T4, T7, 및 SP6), 제한 효소 부위, 또는 단일 중합체성 서열, 예를 들어 폴리 A 또는 폴리 T 트랙트 (tract), 촉매 코어, 친화성 컬럼에의 선택적 결합을 위한 부위, 및 목적 올리고뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 서열 결정을 용이하게 하기 위한 기타 서열이다. 보존된 서열은 이전에 기술한 고정 서열 이외의, 동일 표적에 결합하는 다수의 앱타머에 의해 공유되는 서열이다.
풀의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 랜덤화 서열 부분과, 효율적인 증폭에 필요한 고정 서열을 포함한다. 전형적으로, 출발 풀의 올리고뉴클레오티드는 30-50개의 랜덤 뉴클레오티드의 내부 영역 측면에 위치하는 고정된 5' 및 3' 말단 서열을 포함한다. 랜덤화 뉴클레오티드는 랜덤하게 절단된 세포 핵산으로부터의 크기에 의한 선별법 및 화학적 합성법을 비롯한 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 또한 시험 핵산에 있어서의 서열 변이체가 선별/증폭 반복 이전에 또는 선별/증폭 반복 동안에 돌연변이 유발에 의해 도입 또는 증가될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 랜덤 서열 부분은 임의의 길이의 것일 수 있으며 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고 변형 또는 비천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,958,691호; 미국 특허 제5,660,985호; 미국 특허 제5,958,691호; 미국 특허 제5,698,687호; 미국 특허 제5,817,635호; 미국 특허 제5,672,695호, 및 국제 공보 제WO 92/07065호를 참조한다. 랜덤 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 포스포디에스테르-결합 뉴클레오티드로부터 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14: 5399-5467 (1986)] 및 문헌[Froehler et al., Tet. Lett. 27: 5575-5578 (1986)을 참조한다. 또한, 랜덤 올리고뉴클레오티드는 용액상 방법, 예를 들어, 트리에스테르 합성 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sood et al., Nucl. Acid Res. 4: 2557 (1977)] 및 문헌[Hirose et al., Tet. Lett., 28: 2449 (1978)]을 참조한다. 자동화 DNA 합성 기기 상에서 실시되는 전형적인 합성에 의해 1014-1016개의 개개의 분자가 생성되며, 이는 대부분의 SELEX (상표명) 실험에 충분한 갯수이다. 서열 고안에 있어서의 충분히 큰 랜덤 서열 영역은 각각의 합성된 분자가 특유한 서열을 나타낼 것 같은 가능성을 증가시킨다.
출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리는 DNA 합성기 상에서의 자동화된 화학적 합성에 의해 생성시킬 수 있다. 랜덤화 서열의 합성을 위하여, 모든 4종의 뉴클레오티드의 혼합물을 합성 공정 동안 각각의 뉴클레오티드 첨가 단계에서 첨가하여, 뉴클레오티드의 랜덤 혼입을 허용한다. 상기한 바와 같이, 일 실시 형태에 있어서, 랜덤 올리고뉴클레오티드는 전적으로 랜덤한 서열을 포함하지만, 다른 실시 형태에 있어서는 랜덤 올리고뉴클레오티드는 비랜덤 또는 부분적 랜덤 서열의 스트레치를 포함할 수 있다. 부분적 랜덤 서열은 각각의 첨가 단계에서 4종의 뉴클레오티드를 상이한 몰 비로 첨가함으로써 생성시킬 수 있다.
출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리는 RNA 또는 DNA 중 어느 하나일 수 있다. RNA 라이브러리가 출발 라이브러리로서 사용될 경우, 이는 전형적으로 T7 RNA 폴리머라제 또는 변형 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 DNA 라이브러리를 전사시키는 단계에 의해 생성되며 정제된다. 이어서 이 RNA 또는 DNA 라이브러리는 결합에 유리한 조건 하에서 표적과 혼합되며 동일한 일반적 선별 방법을 사용하여 결합, 구분 및 증폭의 단계별 반복에 처하여, 사실상 임의의 원하는 기준의 결합 친화성 및 선택성을 달성한다. 더 구체적으로는, SELEX (상표명) 방법은, 출발 핵산 풀을 포함하는 혼합물로 출발하여, 하기 단계를 포함한다: (a) 결합에 유리한 조건 하에 이 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계; (b) 표적 분자에 특이적으로 결합한 핵산으로부터 미결합 핵산을 구분하는 단계; (c) 핵산-표적 복합체를 해리시키는 단계; (d) 핵산-표적 복합체로부터 해리되는 핵산을 증폭시켜 리간드-농후화 (enriched) 핵산 혼합물을 생성하는 단계; 및 (e) 원하는 만큼 많은 사이클을 통하여 결합, 구분, 해리 및 증폭 단계들을 반복하여 표적 분자에 대하여 고도로 특이적인 고 친화성 핵산 리간드를 생성하는 단계. RNA 앱타머를 선택하는 경우, SELEX (상표명) 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (i) 단계 (d)에서의 증폭 전에 핵산-표적 복합체로부터 해리되는 핵산을 역전사시키는 단계; 및 (ii) 이 공정의 재출발 전에 단계 (d)로부터의 증폭 핵산을 전사시키는 단계.
다수의 가능한 서열 및 구조를 포함하는 핵산 혼합물 내에는 주어진 표적에 대한 광범위한 결합 친화성이 존재한다. 예를 들어, 20개의 뉴클레오티드 랜덤화 절편을 포함하는 핵산 혼합물은 420개의 후보의 가능성을 가질 수 있다. 표적에 대한 친화도 상수가 보다 높은 것은 표적에 결합할 가능성이 가장 크다. 구분, 해리 및 증폭 후, 제2 핵산 혼합물을 생성하고 보다 높은 결합 친화성의 후보에 대하여 농후화한다. 생성되는 핵산 혼합물이 하나 또는 수 개의 서열만으로 우세하게 구성될 때까지 추가의 선별 라운드를 최상의 리간드에 점진적으로 유리하게 한다. 이어서 이들을 클로닝하고, 서열 결정하고, 순수 리간드 또는 앱타머로서 결합 친화도에 대하여 개별적으로 시험한다.
선별 및 증폭 사이클은 요망되는 목표가 달성될 때까지 반복된다. 가장 일반적인 경우, 이 사이클의 반복시 결합 강도의 유의한 개선이 전혀 달성되지 않을 때까지 선별/증폭을 계속한다. 이 방법은 전형적으로 대략 1014개의 상이한 핵산 화학종을 샘플링하기 위하여 사용되지만, 약 1018개만큼 많은 상이한 핵산 화학종의 샘플링에 사용될 수도 있다. 일반적으로, 핵산 앱타머 분자는 5 내지 20회의 사이클의 절차에서 선별된다. 일 실시 형태에 있어서, 이종성은 초기 선별 단계에서만 도입되며 복제 과정 전반에 걸쳐서는 나타나지 않는다.
SELEX (상표명)의 일 실시 형태에서, 선별 공정은 선별된 표적에 가장 강력하게 결합하는 핵산 리간드의 단리에서 너무나도 효율적이어서, 1회의 사이클의 선별 및 증폭만이 필요하다. 그러한 효율적인 선별은, 예를 들어 크로마토그래피형 공정에서 나타날 수도 있는데, 여기서, 핵산이 컬럼 상에 결합된 표적과 결부되는 능력은 가장 높은 친화도의 핵산 리간드의 분리 및 단리를 컬럼이 충분히 허용할 수 있는 방식으로 작용한다.
다수의 경우, 단일 핵산 리간드가 확인될 때까지 SELEX (상표명)의 반복적인 단계를 수행하는 것이 반드시 바람직한 것은 아니다. 표적 특이성 핵산 리간드 용액은 표적에의 핵산 리간드의 친화도에 유의하게 영향을 줌이 없이 치환 또는 부가될 수 있는 다수의 서열 및 다수의 보존된 서열을 갖는 핵산 구조 또는 모티프의 족을 포함할 수도 있다. SELEX (상표명) 공정을 완료 이전에 종결함으로써 핵산 리간드 용액 족의 다수의 구성원의 서열의 결정이 가능하다.
다양한 핵산의 일차, 이차 및 삼차 구조가 존재하는 것으로 공지되어 있다. 비-왓슨-크릭형 상호 작용에 가장 일반적으로 연루된 것으로 밝혀진 구조 또는 모티프는 헤어핀 루프 (hairpin loop), 대칭 및 비대칭 돌출부 (bulge), 유사매듭 (peudoknot) 및 이들의 무수한 조합으로 칭해진다. 거의 모든 공지된 경우의 그러한 모티프는 모티프가 30개 이하의 뉴클레오티드의 핵산 서열에서 형성될 수 있음을 시사한다. 이러한 이유로, 인접한 랜덤화 절편을 이용한 SELEX (상표명) 절차를 약 20개 내지 약 50개, 몇몇 실시 형태에 있어서는 약 30개 내지 약 40개의 뉴클레오티드의 랜덤화 절편을 포함하는 핵산 서열로 개시하는 것이 흔히 바람직하다. 일례에 있어서, 5'-고정:랜덤:3'-고정 서열은 약 30개 내지 약 50개의 뉴클레오티드의 랜덤 서열을 포함한다.
코어 SELEX (상표명) 방법을 변형하여 다수의 특정 목적을 달성하였다. 예를 들어, 미국 특허 제5,707,796호에는 SELEX (상표명)을 겔 전기영동과 함께 사용하여 특정의 구조적 특징을 갖는 핵산 분자, 예를 들어, 벤트 (bent) DNA를 선별하는 것이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,763,177호에는 표적 분자에 결합하고/하거나 광-가교 결합하고/하거나 표적 분자를 광-불활성화시킬 수 있는 광 반응기를 포함하는 핵산 리간드의 SELEX (상표명) 기재의 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,567,588호 및 미국 특허 제5,861,254호에는 표적 분자에 대하여 친화도가 높거나 낮은 올리고뉴클레오티드들 사이에서 고도로 효율적인 분할이 달성되는 SELEX (상표명) 기재의 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,496,938호에는 SELEX (상표명) 공정이 수행된 후 개선된 핵산 리간드를 수득하는 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,705,337호에는 리간드를 그의 표적에 공유 결합으로 결합시키는 방법이 개시되어 있다.
또한 SELEX (상표명)를 사용하여 표적 분자 상에서 하나보다 많은 부위에 결합하는 핵산 리간드를 수득하고, 표적 상의 특정 부위에 결합하는 비-핵산 화학종을 포함하는 핵산 리간드를 수득할 수 있다. SELEX (상표명)는 크거나 작은 생체 분자, 예를 들어 핵산 결합 단백질 및 생물학적 기능의 일부로서 핵산에 결합하는 것으로 공지되어 있지 않은 단백질과, 공동 인자 및 기타 작은 분자를 포함하여, 임의의 생각될 수 있는 표적에 결합하는 핵산 리간드를 단리 및 확인하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,580,737호에는 SELEX (상표명)를 통하여 확인되며, 카페인 및 밀접하게 연관된 유사체인 테오필린에 높은 친화도로 결합할 수 있는 핵산 서열이 개시되어 있다.
카운터 (Counter)-SELEX (상표명)는 하나 이상의 표적외 분자에 대한 교차 반응성을 갖는 핵산 리간드 서열의 제거에 의해 표적 분자에의 핵산 리간드의 특이성을 개선하는 방법이다. 카운터-SELEX (상표명)는 (a) 후보 핵산 혼합물을 제조하는 단계; (b) 후보 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계 - 여기서, 후보 혼합물에 비하여 표적에 대한 친화도가 증가된 핵산을 나머지 후보 혼합물로부터 구분할 수도 있음 - ; (c) 친화도가 증가된 핵산을 나머지 후보 혼합물로부터 구분하는 단계; (d) 친화도가 증가된 핵산을 표적으로부터 해리시키는 단계; (e) 친화도가 증가된 핵산을 하나 이상의 표적외 분자와 접촉시켜 표적외 분자(들)에 대하여 특정 친화도를 갖는 핵산 리간드가 제거되게 하는 단계; 및 (f) 표적 분자에 대해서만 특정 친화도를 갖는 핵산을 증폭시켜 표적 분자에의 결합에 있어서 상대적으로 보다 큰 친화도 및 특이성을 갖는 핵산 서열이 농후화된 핵산의 혼합물을 생성하는 단계로 이루어진다. SELEX (상표명)에 대하여 상기에 기술되어 있는 바와 같이, 선별 및 증폭 사이클은 요망되는 목표가 달성될 때까지 필요한 대로 반복된다.
치료제 및 백신으로서의 핵산의 사용에서 조우되는 한 가지의 잠재적인 문제점은, 요망되는 효과가 명백해지기 전에 포스포디에스테르 형태의 올리고뉴클레오티드가 세포내 및 세포외 효소, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의해 체액에서 빠르게 분해될 수도 있다는 것이다. 따라서 SELEX (상표명) 방법은 리간드 상에 개선된 특징, 예를 들어, 개선된 생체내 안정성 또는 개선된 전달 특징을 주는 변형 뉴클레오티드를 포함하는 높은 친화도의 핵산 리간드의 확인을 포함한다. 그러한 변형의 예는 리보스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 변형 뉴클레오티드를 포함하는 SELEX (상표명)-확인 핵산 리간드가 예를 들어 리보스의 2' 위치, 피리미딘의 5 위치, 및 퓨린의 8 위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 개시되어 있는 미국 특허 제5,660,985호, 다양한 2'-변형 피리미딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 개시되어 있는 미국 특허 제5,756,703호, 및 2'-아미노 (2'-NH2), 2'-플루오로 (2'-F), 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe) 치환체로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 고도로 특이적인 핵산 리간드가 개시되어 있는 미국 특허 제5,580,737호에 개시되어 있다.
본 발명에서 고려되는 핵산 리간드의 변형은 추가의 전하, 편광성, 소수성, 수소 결합, 정전기적 상호 작용 및 유동성 (fluxionality)을 핵산 리간드의 염기 또는 전체로서의 핵산 리간드에 포함시키는 다른 화학 기를 제공하는 것들을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 뉴클레아제에 대하여 내성을 갖는 올리고뉴클레오티드 집단을 생성하기 위한 변형은 하나 이상의 치환 뉴클레오티드간 결합, 변경된 당, 변경된 염기, 또는 그 조합도 포함할 수 있다. 그러한 변형은 2'-위치의 당 변형, 5-위치의 피리미딘 변형, 8-위치의 퓨린 변형, 엑소시클릭 (exocyclic) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오도-우라실의 치환; 골격 변형, 포스포로티오에이트 또는 알킬 포스페이트 변형, 메틸화, 및 이례적인 염기쌍 형성 조합, 예를 들어, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아노신을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 변형은 3' 및 5' 변형, 예를 들어 캡핑도 포함할 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, P(O)O 기가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), P(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") 또는 3'-아민 (-NH-CH2-CH2-)으로 대체된 올리고뉴클레오티드가 제공되며, 여기서, 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 알킬이다. 결합 기는 -O-, -N-, 또는 -S-결합을 통하여 인접 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 중의 일부 결합이 동일하게 되는 데에 필요하다. 본원에 사용되는 바와 같이, 포스포로티오에이트라는 용어는 하나 이상의 황 원자로 대체되는 포스포디에스테르 결합 중의 하나 이상의 비-가교 산소 원자를 포함한다.
추가의 실시 형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 기를 포함하는데, 예를 들어, 히드록실 기 중 하나 이상은 할로겐, 지방족 기로 대체되거나, 에테르 또는 아민으로서 작용화된다. 일 실시 형태에 있어서, 푸라노스 잔기의 2' 위치는 임의의 0-메틸, 0-알킬, 0-알릴, S-알킬, S-알릴, 또는 할로 기로 치환된다. 2'-변형 당의 합성 방법은 예를 들어 문헌[Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19: 733-738 (1991)]; 문헌[Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19: 2629-2635 (1991)]; 및 문헌[Hobbs, et al., Biochemistry 12: 5138-5145 (1973)]에 기술되어 있다. 다른 변형이 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 그러한 변형은 SELEX (상표명) 공정 이전의 변형 또는 SELEX (상표명) 공정 이후의 변형 (이전에 확인된 미변형 리간드의 변형)일 수 있거나 SELEX (상표명) 공정 내로의 포함에 의해 만들어질 수 있다.
SELEX (상표명) 공정 이후의 변형 또는 SELEX (상표명) 공정 내로의 포함에 의해 만들어지는 변형에 의해 SELEX (상표명) 표적에 대한 특이성 및 개선된 안정성, 예를 들어 생체내 안정성 둘 모두를 갖는 핵산 리간드가 생성된다. 핵산 리간드에 행해지는 SELEX (상표명) 공정 이후의 변형에 의해 이 핵산 리간드의 결합 능력에 악영향을 줌이 없이 안정성, 예를 들어, 생체내 안정성을 개선시킬 수도 있다.
SELEX (상표명) 방법은, 미국 특허 제5,637,459호 및 미국 특허 제5,683,867호에 개시되어 있는 바와 같이, 선별된 올리고뉴클레오티드를 다른 선별된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드외 작용 단위를 조합하는 단계를 포함한다. SELEX (상표명) 방법은, 예를 들어 미국 특허 제6,011,020호, 미국 특허 제6,051,698호, 및 국제 공보 제WO 98/18480호에 개시되어 있는 바와 같이, 선별된 핵산 리간드를, 진단용 또는 치료용 복합체 형태로 친유성 또는 비-면역원성 고분자량 화합물과 조합하는 단계를 포함한다. 상기 특허 및 특허 출원에는 광범한 배열의 형상 및 기타 특성과, 올리고뉴클레오티드의 효율적인 증폭 및 복제 특성 및 다른 분자의 바람직한 특성의 조합이 교시되어 있다.
SELEX (상표명) 방법을 통한 작은 가요성 펩티드에 대한 핵산 리간드의 확인도 탐구되었다. 작은 펩티드는 가요성 구조를 가지며 일반적으로 용액 중에 다수의 이형태체 (conformer)의 평형 상태로 존재하며, 따라서, 처음에는 결합 친화도가 가요성 펩티드의 결합시 손실되는 형태 엔트로피에 의해 제한될 수 있다고 생각되었다. 그러나, 용액 중의 작은 펩티드에 대한 핵산 리간드의 확인에 대한 실현 가능성이 미국 특허 제5,648,214호에서 입증되었다. 상기 특허에서, 11개의 아미노산 펩티드인 물질 P에 대한 높은 친화도의 RNA 핵산 리간드가 확인되었다.
표적(들)에 대하여 특이성 및 결합 친화성을 갖는 본 발명의 앱타머는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 전형적으로 SELEX (상표명) 공정으로 선별된다. SELEX (상표명) 공정의 일부로서, 표적에 결합하는 것으로 선별된 서열은 그 후 선별적으로 최소화되어 요망되는 결합 친화성을 갖는 최소 서열을 결정한다. 선별된 서열 및/또는 최소화된 서열은 이 서열의 랜덤 돌연변이 유발 또는 특이적 돌연변이 유발 (directed mutagenesis)을 수행하여 결합 친화도를 증가시키거나 대안적으로는 이 서열 중의 어느 위치가 결합 활성에 필수적인지를 결정함으로써 선별적으로 최적화한다. 추가로, 선별은 변형 뉴클레오티드가 포함되어 생체내에서 분해에 대하여 앱타머 분자를 안정화시킨 서열을 이용하여 수행할 수 있다.
2' 변형 SELEX (상표명)
앱타머를 치료제로서 사용하기에 적합하게 하기 위해서는, 값싸게 합성시키고 생체내에서 안전하며 안정한 것이 바람직하다. 야생형 RNA 또는 DNA 앱타머는 전형적으로 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 그의 감수성 때문에 생체내에서 안정하지 못하다. 뉴클레아제 분해에 대한 내성은 2'-위치에 변형 기를 포함시킴으로써 크게 증가시킬 수 있다.
플루오로 및 아미노 기는 앱타머가 후속적으로 선별되는 올리고뉴클레오티드 풀 내로 성공적으로 혼입되었다. 그러나, 이 변형은 생성되는 앱타머의 합성 비용을 크게 증가시키며, 몇몇 경우 안전성 상의 관심사를 도입할 수도 있는데, 이는 변형 올리고뉴클레오티드의 분해 및 DNA 합성에 있어서의 기질로서의 뉴클레오티드의 후속적인 사용에 의해 변형 뉴클레오티드가 숙주 DNA 내로 재활용될 수 있다는 가능성 때문이다.
본원에 제공되어 있는 바와 같이, 2'-O-메틸 ("2'-OMe") 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머는 이러한 결점 중 다수를 극복한다. 2'-OMe 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제-내성이며 합성이 값이 싸다. 2'-OMe 뉴클레오티드는 생물학적 시스템에서 편재하지만, 천연 폴리머라제는 생리학적 조건 하에서 2'-OMe NTP를 기질로서 받아들이지 않으며, 따라서 숙주 세포 내로의 2'-OMe 뉴클레오티드의 재활용에 대한 안전성 상의 관심사는 전혀 존재하지 않는다. 2'-변형 앱타머의 생성에 사용되는 SELEX (상표명) 방법은 예를 들어, 2002년 12월 3일자로 출원된 미국 가출원 제60/430,761호, 2003년 7월 15일자로 출원된 미국 가출원 제60/487,474호, 2003년 11월 4일자로 출원된 미국 가출원 제60/517,039호, 2003년 12월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/729,581호, 및 발명의 명칭이 "2'-O-메틸 치환 핵산의 시험관내 선별 방법"이며 2004년 6월 21일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/873,856호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 그의 전체 내용이 참고로 포함되어 있다.
본 발명은 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하여 그의 기능을 조정하며 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 2' 위치에서 변형체를 갖는 뉴클레오티드)를 포함하여 이 뉴클레오티드가 효소 및 화학적 분해와, 열 및 물리적 분해에 대하여 미변형 올리고뉴클레오티드보다 안정하게 되도록 하는 앱타머를 포함한다. 2'-OMe 함유 앱타머의 여러 예가 문헌에 존재하지만 (예를 들어, 문헌[Green et al., Current Biology 2, 683-695, 1995] 참조) 이들은 C 및 U 잔기가 2'-플루오로 (2'-F) 치환되며 A 및 G 잔기가 2'-OH인 변형 전사체 라이브러리의 시험관내 선별에 의해 제조되었다. 일단 기능성 서열이 확인되면, 각각의 A 및 G 잔기는 2'-OMe 치환에 대한 내성에 대하여 시험하였으며, 2'-OMe 잔기로서 2'-OMe 치환에 내성이 있는 모든 A 및 G 잔기를 갖는 앱타머를 재합성하였다. 대략적으로 평균 20%가 2'-OMe 잔기로 치환한 것에 내성이 없지만, 이 2단계 방식으로 생성된 앱타머의 A 및 G 잔기 중 대부분은 상기 치환에 내성이 있다. 따라서, 이 방법을 사용하여 생성시킨 앱타머는 2개 내지 4개의 2'-OH 잔기를 포함하는 경향이 있으며, 그 결과, 안정성 및 합성 비용이 양보된다. 앱타머가 SELEX (상표명)에 의해 선별 및 농후화되는 올리고뉴클레오티드 풀에서 사용되는 안정화 올리고뉴클레오티드 (및/또는 본원에 기술되어 있는 것을 포함하는 임의의 그의 변이체 및 개선체)를 생성하는 전사 반응 내로 변형된 뉴클레오티드를 포함시킴으로써, 본 발명의 방법에서는 (예를 들어, 변형된 뉴클레오티드를 이용하여 앱타머 올리고뉴클레오티드를 재합성함으로써) 선별된 앱타머 올리고뉴클레오티들 안정화시킬 필요성이 제거된다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 및 2'-OMe 변형들의 조합을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-OMe, 2'-NH2, 및 2'-메톡시에틸 변형체들의 조합을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-OMe, 2'-NH2, 및 2'-메톡시에틸 변형체들의 56개의 조합을 포함하는 앱타머를 제공한다.
본 발명의 2' 변형 앱타머는 변형 폴리머라제, 예를 들어, 야생형 폴리머라제보다 높은 푸라노스 2' 위치에서의 부피가 큰 (bulky) 치환체를 갖는 변형 뉴클레오티드의 혼입률을 갖는 변형 T7 폴리머라제를 사용하여 생성한다. 예를 들어, 639 위치에서의 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 변화된 단일 돌연변이 T7 폴리머라제 (Y639F)는 손쉽게 2'데옥시, 2'아미노-, 및 2'플루오로-뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP)를 기질로 이용하며 다양한 용도의 변형 RNA의 합성에 널리 사용되었다. 그러나, 이 돌연변이 T7 폴리머라제는 부피가 큰 2'-치환체, 예를 들어, 2'-OMe 또는 2'-아지도 (2'-N3) 치환체를 포함하는 NTP를 손쉽게 이용 (즉, 혼입)할 수 없다. 부피가 큰 2' 치환체의 혼입에 있어서, Y639F 돌연변이 외에도 784 위치의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변화된 이중 T7 폴리머라제 돌연변이체 (Y639F/H784A)가 기술되었으며 제한된 상황에서 변형 피리미딘 NTP의 혼입을 위하여 사용되었다. 문헌[Padilla, R. and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30 (24): 138]을 참조한다. 784 위치의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변화된 단일 돌연변이 T7 폴리머라제 (H784A)도 기술되었다. 문헌[Padilla et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138] 참조. Y639F/H784A 이중 돌연변이 및 H784A 단일 돌연변이 T7 폴리머라제 둘 모두에 있어서, 알라닌과 같은 보다 작은 아미노산 잔기로의 변화는 보다 부피가 큰 뉴클레오티드 기질, 예를 들어 2'-OMe 치환 뉴클레오티드의 혼입을 허용한다.
일반적으로, 본원에 개시된 조건 하에서, Y693F 단일 돌연변이체는 GTP를 제외한 모든 2'-OMe 치환 NTP의 혼입에 사용될 수 있으며, Y639F/H784A 이중 돌연변이체는 GTP를 포함하는 모든 2'-OMe 치환 NTP의 혼입에 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본원에 개시된 조건 하에서 사용될 때 H784A 단일 돌연변이체는 Y639F 및 Y639F/H784A 돌연변이체와 유사한 특성을 가질 것이라 기대된다.
전적으로 변형 뉴클레오티드로 또는 변형 뉴클레오티드의 서브세트를 이용하여 2'-변형 뉴클레오티드를 합성할 수도 있다. 이 변형체는 동일하거나 상이할 수 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수도 있으며, 모두가 동일한 변형체를 포함할 수도 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있으며, 상이한 변형체를 포함할 수 있는데, 예를 들어 동일한 염기를 포함하는 모든 뉴클레오티드는 하나의 유형의 변형체를 가질 수 있는 반면, 다른 염기를 포함하는 뉴클레오티드는 상이한 유형의 변형체를 가질 수 있다. 모든 퓨린 뉴클레오티드는 하나의 유형의 변형체를 가질 수 있는 반면 (또는 미변형되는 반면), 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 다른 상이한 유형의 변형체를 갖는다 (또는 미변형됨). 이러한 방식으로, 전사체, 또는 전사체 풀은 예를 들어, 리보뉴클레오티드 (2'-OH), 데옥시리보뉴클레오티드 (2'-데옥시), 2'-F, 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 포함하는 변형체의 임의의 조합을 사용하여 ㅅ새생성한다. 2'-OMe C 및 U와 2'-OH A 및 G를 포함하는 전사 혼합물은 "rRmY" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "rRmY" 앱타머로 칭해진다. 데옥시 A 및 G와 2'-OMe U 및 C를 포함하는 전사 혼합물은 "dRmY" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "dRmY" 앱타머로 칭해진다. 2'-OMe A, C, 및 U와, 2'-OH G를 포함하는 전사 혼합물은 "rGmH" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "rGmH" 앱타머로 칭해진다. 교대로 2'-OMe A, C, U 및 G와 2'-OMe A, U 및 C와 2'-F G를 포함하는 전사 혼합물은 "교대 혼합물"로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "교대 혼합" 앱타머로 칭해진다. 2'-OMe A, U, C, 및 G - 여기서, G 중 최대 10%는 리보뉴클레오티드임 - 를 포함하는 전사 혼합물은 "r/mGmH" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "r/mGmH" 앱타머로 칭해진다. 2'-OMe A, U, 및 C와, 2'-F G를 포함하는 전사 혼합물은 "fGmH" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "fGmH" 앱타머로 칭해진다. 2'-OMe A, U, 및 C와, 데옥시 G를 포함하는 전사 혼합물은 "dGmH" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "dGmH" 앱타머로 칭해진다. 데옥시 A와, 2'-OMe C, G 및 U를 포함하는 전사 혼합물은 "dAmB" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "dAmB" 앱타머로 칭해지고, 모든 2'-OH 뉴클레오티드를 포함하는 전사 혼합물은 "rN" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "rN" 또는 "rRrY" 앱타머로 칭해진다. "mRmY" 앱타머는 모든 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 포함하는 것이며 일반적으로 가능할 경우 임의의 2'-OH G를 2'-OMe G로 SELEX (상표명) TKGN 대체에 의해 r/mGmH 올리고뉴클레오티드로부터 유도된다.
바람직한 실시 형태는 2'-OH, 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태는 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시 형태는 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함하는 것이며, 여기서, 피리미딘은 2'-OMe (예를 들어, dRmY, mRmY 또는 dGmH)이다.
본 발명의 앱타머 내로의 변형 뉴클레오티드의 혼입은 선별 공정 전 (이전)에 성취된다 (예를 들어, SELEX (상표명) 공정 이전 변형). 선별적으로, 변형 뉴클레오티드가 SELEX (상표명) 공정 이전 변형에 의해 혼입된 본 발명의 앱타머는 SELEX (상표명) 공정 이후의 변형에 의해 (즉, SELEX (상표명) 이전 변형 후 SELEX (상표명) 공정 이후 변형)에 의해 추가로 변형될 수 있다. SELEX (상표명) 공정 이전의 변형은 SELEX (상표명) 표적에 대하여 특이성을 가지며 생체내 안정성도 개선된 변형된 핵산 리간드를 생성한다. SELEX (상표명) 공정 이후의 변형, 즉, 변형 (예를 들어, SELEX (상표명) 공정 이전의 변형에 의해 뉴클레오티드가 혼입된 이전에 확인된 리간드의 절단, 결실, 치환 또는 부가 뉴클레오티드 변형)은 SELEX (상표명) 공정 이전의 변형에 의해 뉴클레오티드가 혼입된 핵산 리간드의 결합 능력에 악영향을 줌이 없이 생체내 안정성을 추가로 개선시킬 수 있다.
폴리머라제가 2'-변형 NTP를 받아들이는 조건 하에 2'-변형 (예를 들어, 2'-OMe) RNA 전사체의 풀을 생성하기 위하여, 바람직한 폴리머라제는 Y693F/H784A 이중 돌연변이체 또는 Y693F 단일 돌연변이체이다. 다른 폴리머라제, 특히 부피가 큰 2'-치환체에 대하여 높은 내성을 나타내는 것도 본 발명에서 사용될 수 있다. 그러한 폴리머라제는 본원에 개시된 전사 조건 하에 변형 뉴클레오티드를 혼입시키는 그의 능력을 분석함으로써 상기 가능성에 대하여 스크리닝할 수 있다.
다수의 요인이 본원에 개시된 방법에 유용한 전사 조건에 중요한 것으로 결정되었다. 예를 들어, 변형 전사체의 수율의 증가는, 생성되는 전사체의 적어도 대략 초기의 6개의 잔기가 모두 퓨린이 되도록 리더 서열이 DNA 전사 주형의 5' 말단의 고정 서열의 5' 말단 내로 혼입될 때 관찰된다.
변형 뉴클레오티드가 혼입된 전사체의 수득에서 중요한 다른 요인은 2'-OH GTP의 존재 또는 농도이다. 전사는 2단계로 나뉘어진다: 제1 단계는 개시 단계이며, 이 단계 동안 NTP가 GTP (또는 다른 치환 구아노신)의 3'-히드록실 말단에 첨가되어 디뉴클레오티드를 생성하고 이어서 이 디뉴클레오티드는 약 10-12개의 뉴클레오티드에 의해 연장되고; 제2 단계는 신장 단계이며, 이 단계 동안 전사는 약 10-12개의 처음의 뉴클레오티드의 부가 이상으로 진행된다. 과량의 2'-OMe GTP를 함유하는 전사 혼합물에 첨가되는 소량의 2'-OH GTP는 폴리머라제가 2'-OH GTP를 사용하여 전사를 개시하게 하기에 충분하지만, 일단 전사가 연장 단계에 들어가면, 2'-OMe와 2'-OH GTP 사이의 구별 감소와, 2'-OH GTP에 비해 과량인 2'-OMe GTP가 주로 2'-OMe GTP의 혼입을 허용한다.
전사체 내로의 2'-OMe 치환 뉴클레오티드 혼입에서의 다른 중요한 요인은 전사 혼합물에서의 이가 마그네슘 및 망간 둘 모두의 사용이다. 염화마그네슘 및 염화망간의 농도의 상이한 조합은 2'-O-메틸화 전사체의 수율에 영향을 주는 것으로 밝혀졌는데, 염화마그네슘 및 염화망간의 최적 농도는 이가 금속 이온과 착체를 형성하는 NTP의 전사 반응 혼합물 중의 농도에 따라 달라진다. 최대로 2' 치환된 O-메틸화 전사체 (즉, 모든 A, C 및 U와 약 90%의 G 뉴클레오티드)의 최고 수율을 얻기 위하여, 각각의 NTP가 0.5 mM의 농도로 존재할 때 대략 5 mM의 염화마그네슘 및 1.5 mM의 염화망간의 농도가 바람직하다. 각각의 NTP의 농도가 1.0 mM일 때는, 대략 6.5 mM의 염화마그네슘 및 2.0 mM의 염화망간의 농도가 바람직하다. 각각의 NTP의 농도가 2.0 mM일 때, 대략 9.6 mM의 염화마그네슘 및 2.9 mM의 염화망간의 농도가 바람직하다. 모든 경우, 최대 2배의 상기 농도로부터의 이탈은 여전히 유효한 양의 변형 전사체를 생성한다.
GTP 또는 구아노신을 이용한 전사의 프라이밍도 중요하다. 이 효과는 개시 뉴클레오티드에 대한 폴리머라제의 특이성으로부터 생긴다. 그 결과, 이러한 방식으로 생성되는 모든 전사체의 5' 말단 뉴클레오티드는 2'-OH G가 될 가능성이 있다. GMP (또는 구아노신)의 바람직한 농도는 0.5 mM, 더욱 더 바람직하게는 1 mM이다. 전사 반응에서 PEG를 포함하여, 바람직하게는 PEG-8000이 변형 뉴클레오티드의 혼입의 최대화에 유용하다는 것이 또한 밝혀졌다.
2'-OMe ATP (100%), UTP (100%), CTP (100%) 및 GTP (~90%) ("r/mGmH")의 전사체 내로의 최대 혼입에 있어서, 하기 조건이 바람직하다: HEPES 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스페르미딘 2 mM, PEG-8000 10% (w/v), 트리톤 X-100 0.01% (w/v), MgCl2 5 mM (6.5 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 1.0 mM임), MnCl2 1.5 mM (2.0 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 1.0 mM임), 2'-OMe NTP (각각) 500 μM (더 바람직하게는 1.0 mM), 2'-OH GTP 30 μM, 2'-OH GMP 500 μM, pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 폴리머라제 15 단위/mL, 무기 파이로포스파타제 5 단위/mL, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두-퓨린 (all-purine)인 리더 서열. 본원에 사용되는 바와 같이, Y639F/H784A 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제 (또는 본원에 명시된 임의의 다른 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제)의 1 단위는 r/mGmH 조건 하에서 전사체 내로 1 nmole의 2'-OMe NTP를 혼입시키는 데에 필요한 효소의 양으로 정의된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 무기 파이로포스파타제의 단위는 pH 7.2 및 25℃에서 1분 당 무기 오르토포스페이트 1.0몰을 유리시키는 효소의 양으로 성의된다.
전사체 내로의 2'-OMe ATP, UTP 및 CTP ("rGmH")의 최대 혼입 (100%)에 있어서, 하기 조건이 바람직하다: HEPES 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스페르미딘 2 mM, PEG-8000 10% (w/v), 트리톤 X-100 0. 01% (wlv), MgCl2 5 mM (9.6 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), MnCl2 1.5 mM (2.9 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), 2'-OMe NTP (각각) 500 μM (더 바람직하게는 2.0 mM), pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 단위/mL, 무기 파이로포스파타제 5 단위/mL, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체 내로의 2'-OMe UTP 및 CTP ("rRmY")의 최대 혼입 (100%)에 있어서, 하기의 조건이 바람직하다: HEPES 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스페르미딘 2 mM, PEG-8000 10% (w/v), 트리톤 X-100 0.01% (w/v), MgCl2 5 mM (9.6 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), MnCl2 1.5 mM (2.9 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), 2'-OMe NTP (각각) 500 μM (더 바람직하게는 2.0 mM), pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 폴리머라제 15 단위/mL, 무기 파이로포스파타제 5 단위/mL, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체 내로의 데옥시 ATP 및 GTP와 2'-OMe UTP 및 CTP ("dRmY")의 최대 혼입 (100%)에 있어서는 하기 조건이 바람직하다: HEPES 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스페르민 2 mM, 스페르미딘 2 mM, PEG-8000 10% (w/v), 트리톤 X- 100 0.01% (w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-OMe NTP (각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 단위/mL, 무기 파이로포스파타제 5 단위/mL, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체 내로의 2'-OMe ATP, UTP 및 CTP와 2'-F GTP ("fGmH")의 최대 혼입 (100%)에 있어서는 하기 조건이 바람직하다: HEPES 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스페르미딘 2 mM, PEG-8000 10% (w/v), 트리톤 X-100 0.01% (w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-OMe NTP (각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 단위/mL, 무기 파이로포스파타제 5 단위/mL, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체 내로의 데옥시 ATP와 2'-OMe UTP, GTP 및 CTP ("dAmB")의 최대 혼입 (100%)에 있어서는 하기 조건이 바람직하다: HEPES 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스페르미딘 2 mM, PEG-8000 10% (w/v), 트리톤 X-100 0.01% (w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-OMe NTP (각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 단위/mL, 무기 파이로포스파타제 5 단위/mL, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
각각의 상기 사항에 있어서, (a) 전사는 약 20℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 45℃, 더 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 적어도 2시간 동안 수행하는 것이 바람직하며 (b) 50-300 nM의 이중 가닥 DNA 전사 주형이 사용된다 (200 nM의 주형을 1라운드에서 사용하여 다양성을 증가시킴 (300 nM의 주형이 dRmY 전사에 사용됨), 후속 라운드에 있어서는 본원에 기술된 조건을 사용하여, 최적 PCR 반응물의 1/10 희석물인 대략 50 nM이 사용됨). 바람직한 DNA 전사 주형이 이하에 기술되어 있다 (여기서, ARC254 및 ARC256는 모두 2'-OMe인 조건 하에 전사되며 ARC255는 rRmY 조건 하에 전사됨).
서열 번호 1 (ARC254)
5'-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTC
TCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
서열 번호 2 (ARC255)
5'-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCT
CTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
서열 번호 3 (ARC256)
5'-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCT
CTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
본 발명의 rN 전사 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 2'-OH 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 2'-OH 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 및 2'-OH 우리딘 트리포스페이트 (UTP)를 포함한다. 본 발명의 rN 전사 혼합물을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-OH 시티딘, 및 2'-OH 우리딘을 포함한다. rN 전사의 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사의 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사의 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 rRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트, 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rRmY 전사 혼합물을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘 및 2'-0-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 dRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-데옥시 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dRmY 전사 조건을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-데옥시 아데노신, 2'-데옥시 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘, 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-데옥시 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-데옥시 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-데옥시 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 rGmH 전사 조건 하에서 전사 반응 혼합물은 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rGmH 전사 조건을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-OH 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 우리딘 및 2'-O-메틸 아데노신을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 구아노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘이며, 모두 아데노신인 튜클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 아데노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 구아노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘이며, 모두 아데노신인 튜클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 아데노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 구아노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘이며, 모두 아데노신인 튜클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 아데노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 r/mGmH 전사 조건 하에서 전사 반응 혼합물은 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-OH 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 r/mGmH 전사 조건을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함하며, 여기서, 구아노신 뉴클레오티드 집단은 최대 약 10%의 2'-OH 구아노신을 갖는다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 r/mGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 구아노신이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 구아노신이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 구아노신이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 fGmH 전사 조건 하에서 전사 반응 혼합물은 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-F 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 fGmH 전사 조건을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 우리딘, 2'-O-메틸 시티딘 및 2'-F 구아노신을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 fGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-F-구아노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 fGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-F-구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 본 발명의 fGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-F-구아노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 dAmB 전사 조건 하에서 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 구아노신 트리포스페이트 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dAmB 전사 혼합물을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-데옥시 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 구아노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 구아노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 구아노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
각각의 경우, 전사 산물은 그 후 SELEX (상표명) 공정에서 라이브러리로서 사용되어 앱타머를 확인하고/하거나 주어진 표적에 결합 특이성을 갖는 서열의 보존된 모티프를 결정할 수 있다. 생성된 서열은 이미 부분적으로 안정화되어, 최적 앱타머 서열에 도달하기 위한 공정으로부터 이 단계가 제외되고, 그 결과 보다 고도로 안정화된 앱타머가 주어진다. 2'-OMe SELEX (상표명) 공정의 다른 장점은 생성된 서열이 서열 중에 필요한 보다 적은 2'-OH 뉴클레오티드를 가질 것 같으며, 아마도 이를 전혀 갖지 않을 것 같다는 것이다. 2' OH 뉴클레오티드가 남아있는 정도까지 이 뉴클레오티드는 사후-SELEX (상표명) 변형의 수행에 의해 제거될 수 있다.
이하에 기술되어 있는 바와 같이, 2' 치환 뉴클레오티드가 완전히 혼입된 보다 낮지만 여전히 유용한 수율의 전사체가 상기에 기술한 최적 조건 이외의 조건 하에 수득될 수 있다. 예를 들어, 상기 전사 조건의 변동은 하기를 포함한다:
HEPES 완충제 농도는 0 내지 1 M 범위일 수 있다. 본 발명에서는 pKa가 5 내지 10 사이인, 예를 들어 트리스-히드록시메틸-아미노메탄을 포함하는 다른 완충제의 사용도 고려된다.
DTT 농도는 0 내지 400 mM 범위일 수 있다. 본 발명은 예를 들어 메르캅토에탄올을 포함하는 다른 환원제의 용도도 제공한다.
스페르미딘 및/또는 스페르민의 농도는 0 내지 20 mM의 범위일 수 있다.
PEG-8000의 농도는 0 내지 50% (w/v)의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 예를 들어 다른 분자량의 PEG 또는 기타 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 다른 친수성 중합체의 용도도 제공한다.
트리톤 X-100의 농도는 0 내지 0.1% (w/v)의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 예를 들어 다른 트리톤-X 세제를 포함하는 기타 세제를 포함하는 다른 비이온성 세제의 용도도 제공한다.
MgCl2의 농도는 0.5 mM 내지 50 mM의 범위일 수 있다. MnCl2의 농도는 0.15 mM 내지 15 mM의 범위일 수 있다. MgCl2 및 MnCl2 둘 모두는 기술된 범위 이내로 존재하여야 하며 바람직한 실시 형태에 있어서는 약 10 내지 약 3의 비의 MgCl2:MnCl2로 존재하고, 바람직하게는 이 비는 약 3-5:1이며, 더 바람직하게는 약 3-4:1이다.
2'-OMe NTP의 농도 (각각의 NTP)는 5 μM 내지 5 mM의 범위일 수 있다.
2'-OH GTP의 농도는 0 μM 내지 300 μM의 범위일 수 있다.
2'-OH GMP의 농도는 0 내지 5 mM의 범위일 수 있다.
pH는 pH 6 내지 pH 9의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 변형 뉴클레오티드를 혼입시키는 대부분의 폴리머라제의 활성의 pH 범위 내에서 실행될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 전사 반응 조건에 있어서 예를 들어 EDTA, EGTA, 및 DTT를 포함하는 킬레이팅제의 선별적 사용을 제공한다.
IL -23 및/또는 IL -12 앱타머의 선별 전략
본 발명은 인간 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하며 몇몇 실시 형태에 있어서는 그의 수용체에의 결합을 저해하고/하거나 그렇지 않을 경우 그의 기능을 조정하는 앱타머를 제공한다. 인간 IL-23 및 IL-12는 둘 모두 공통적인 하나의 서브유닛과 특유한 하나를 갖는 이형 이량체이다. 공통의 서브유닛은 하기의 아미노산 서열 (등록 번호: AF180563) (서열 번호 4)을 포함하는 p40 서브유닛이다:
Figure 112006072186688-PCT00001
Figure 112006072186688-PCT00002
p19 서브유닛은 IL-23에 특유하며 하기의 아미노산 서열 (등록 번호: BC067511) (서열 번호 5)을 포함한다:
Figure 112006072186688-PCT00003
p35 서브유닛은 IL-12에 특유하며 하기의 아미노산 서열 (등록 번호: AF 180562) (서열 번호 6)를 포함한다:
Figure 112006072186688-PCT00004
본 발명은 생쥐 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하며 몇몇 실시 형태에 있어서는 그의 수용체에의 결합을 저해하고/하거나 그렇지 않을 경우 그의 기능을 조정하는 앱타머를 제공한다. 인간과 마찬가지로, 생쥐 IL-23 및 IL-12는 둘 모두 생쥐 p40 서브유닛을 공유하는 이형이량체인 반면, 생쥐 p19 서브유닛은 생쥐 IL-23에 특이적이고 생쥐 p35 서브유닛은 생쥐 IL-12에 특유하다. 생쥐 p40 서브유닛은 하기의 아미노산 서열 (등록 번호: P43432) (서열 번호 315)을 포함한다:
Figure 112006072186688-PCT00005
Figure 112006072186688-PCT00006
생쥐 p19 서브유닛은 하기의 아미노산 서열 (등록 번호: NP112542) (서열 번호 316)을 포함한다:
Figure 112006072186688-PCT00007
생쥐 p35 서브유닛은 하기의 아미노산 서열 (등록 번호: P43431) (서열 번호 317)을 포함한다:
Figure 112006072186688-PCT00008
여러 SELEX (상표명) 전략을 이용하여 IL-23 및 IL-12에 대하여 다양한 특이성을 갖는 앱타머를 생성할 수 있다. 하나의 방법에서는 IL-12를 음성 선별 단계에 포함시킴으로써 IL-12에 비하여 IL-23에 특이적인 앱타머를 생성한다. 이는 공통 서브유닛, p40 (서열 번호 4)을 인식하는 서열을 제외하며, 도 3에 도시되어 있는 바와 같이, IL-23, 또는 p19 서브유닛 (서열 번호 5)에 특이적인 앱타머를 선별한다. 하나의 방법에서는 IL-23을 음성 선별 단계에 포함시킴으로써 IL-23에 비하여 IL-12에 특이적인 앱타머를 생성한다. 이는 공통 서브유닛, p40 (서열 번호 4)을 인식하는 서열을 제외하며, IL-12, 또는 p35 서브유닛 (서열 번호 6)에 특이적인 앱타머를 선별한다. IL-23 및 IL-12가 1라운드 걸러서 교대되는 개별적인 선별은 공통 서브유닛, p40 (서열 번호 4)을 인식하며, 따라서 상기 단백질 둘 모두를 인식하는 앱타머를 이끌어낸다. 일단, 요망되는 결합 특이성을 갖는 서열이 발견되면, 상기 서열의 최소화에 착수하여 결합 특징에 있어서 수반되는 개선 사항을 갖는 서열의 크기를 조직적으로 감소시킬 수 있다.
이하의 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 생물학적 분석에 의해 입증되는 바와 같이 최고의 친화성 및 특이적 결합성을 갖는 선별된 앱타머는 IL-23 및/또는 IL-12가 병인에 연루되어 있는 병의 치료를 위한 적합한 치료제이다.
IL -23/ IL -12 특이성 결합 앱타머
본 발명의 물질은 길이가 ~25-90개의 뉴클레오티드이며, IL-12, IL-23, 및 IL-27을 포함하는 인간 IL-12 사이토카인 족의 사이토카인; p19, p35, 및 p40 서브유닛 단량체와; p40 서브유닛 이량체에 특이적으로 결합하고, 생체내에서 및/또는 세포 기재의 분석에서 IL-23 및/또는 IL-12의 활성을 기능적으로 조정하는, 예를 들어 차단하는 일련의 핵산 앱타머를 포함한다.
특이적으로 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하고 그를 조정할 수 있는 앱타머가 본원에 나타내어져 있다. 이러한 앱타머는 자가면역 및 염증 관련 질환 또는 장애의 저독성의 안전하며 효과적인 치료 및/또는 예방 양식을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 심상성 건선, 및 한정됨이 없이 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 과민성 장질환을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되며, 상기 질환 각각은 IL-23 및/또는 IL-12 사이토카인에 의해 야기되거나 그렇지 않을 경우 상기 사이토카인과 결부된 것으로 공지되어 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 IL-23 및/또는 IL-12 사이토카인에 의해 야기되거나 그렇지 않을 경우 상기 사이토카인과 결부된 것으로 공지되어 있는 제I형 당뇨병의 치료 및/또는 예방에 사용된다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스, 결장암, 폐암, 및 골다공증에서의 골흡수를 포함하는 다른 징후의 치료 및/또는 예방에 사용되며, 이를 위해서는 사이토카인 수용체 결합의 활성화가 바람직하다.
치료제 및/또는 진단제로 사용하기 위한 IL-23 및/또는 IL-12 특이성 결합 앱타머의 예는 이하에 열거되어 있는 하기 서열을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, ARC489 (서열 번호 91), ARC491 (서열 번호 94), ARC621 (서열 번호 108), ARC627 (서열 번호 110), ARC527 (서열 번호 159), ARC792 (서열 번호 162), ARC794 (서열 번호 164), ARC795 (서열 번호 165), ARC979 (서열 번호 177), ARC1386 (서열 번호 224), 및 ARC1623-ARC1625 (서열 번호 309-311)는 퓨린 (A 및 G)이 데옥시이며, 피리미딘 (C 및 U)이 2'-OMe인 SELEX (상표명) 조건 하에서 선별되었으며 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하는 앱타머의 서열을 나타낸다.
ARC489 (서열 번호 91) 및 ARC491 (서열 번호 94)의 특유한 서열 영역은 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (서열 번호 69) 바로 이후의 뉴클레오티드 23에서 시작되며, 이것은 3' 고정 핵산 서열 GCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG (서열 번호 90)을 만날 때까지 전진한다.
ARC621 (서열 번호 108) 및 ARC627 (서열 번호 110)의 특유한 서열 영역은 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (서열 번호 101)의 바로 이후의 뉴클레오티드 23에서 시작되며, 이것은 3' 고정 핵산 서열 GUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG (서열 번호 102)를 만날 때까지 전진한다.
서열 번호 91 (ARC489)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGCGCCGGUGGGCGGGCAUUGGGUGGAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG
서열 번호 94(ARC491)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGCGCCGGUGGGUGGGCAUAGGGUGGAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG
서열 번호 108 (ARC621)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCGGUUACGGGGGAUGCGGGUGGGACAGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG
서열 번호 110 (ARC627)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG
서열 번호 159 (ARC527)
ACAGCGCCGGUGGGCGGGCAUUGGGUGGAUGCGCUGU
서열 번호 162 (ARC792)
GGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGG
서열 번호 164 (ARC794)
GGCGGUACGGGGAGUGUGGGUUGGGGCCGG
서열 번호 165 (ARC795)
CGAUAUAGGCGGUACGGGGGGAGUGGGCUGGGGUCG
서열 번호 177 (ARC979)
ACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGU
ARC1623 (서열 번호 309), ARC1624 (서열 번호 310) 및 ARC1625 (서열 번호 311)는 ARC979 (서열 번호 177)를 기재로 하는 최적 서열을 나타내며, 여기서, "d"는 데옥시를 나타내고, "m"은 2'-O-메틸을 나타내며, "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 나타내고, "3T"는 3'-역위 데옥시 티미딘을 나타낸다.
서열 번호 309 (ARC1623)
ACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGUT
서열 번호 310 (ARC1624)
ACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGUT
서열 번호 311 (ARC1625)
ACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGUT
서열 번호 139-140, 서열 번호 144-145, 서열 번호 147, 및 서열 번호 151-152는 퓨린 (A 및 G)이 2'-OH (리보_이며 피리미딘 (C 및 U)이 2'-플루오로인 SELEX (상표명) 조건 하에서 선별되었으며 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하는 앱타머의 서열을 나타낸다.
서열 번호 139 (A1O.min5)
GGAGCAUACACAAGAAGUUUUUUGUGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUAUGCUCC
서열 번호 140 (A10.min6)
GGAGUACGCCGAAAGGCGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUACUCC
서열 번호 144 (B10.min4)
GGAGCAUACACAAGAAGUGCUUCAUGCGGCAAACUGCAUGACGUCGAAUAGAUAUGCUCC
서열 번호 145 (B10.min5)
GGAGUACACAAGAAGUGCUUCCGAAAGGACGUCGAAUAGAUACUCC
서열 번호 147 (F11.min2)
GGACAUACACAAGAUGUGCUUGAGUUAAAUCUCAUCGUCCCCGUUUGGGGAUAUGUC
서열 번호 151
GGGUACGCCGAAAGGCGCUUCCGAAAGGACGUCCGUAAGGGAUACCC
서열 번호 152
GGAGUACGCCGAAAGGCGCUUCCGAAAGGACGUCCGUAAGGGAUACUCC
IL-23 및/또는 IL-12에 결합하는 기타 앱타머가 하기 실시예 1-3에 기술되어 있다.
이러한 앱타머는 예를 들어 친유성 또는 고분자량의 화합물 (예를 들어, PEG)에의 콘쥬게이션, CpG 모티프의 혼입, 캡핑 부분의 혼입, 변형 뉴클레오티드의 혼입, 및 포스페이트 골격에서의 포스포로티오에이트의 혼입을 포함하여 본원에 기술되어 있는 변형을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, IL-23 및/또는 IL-12에 결합하는 단리된 자연 비발생 앱타머가 제공된다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 단리된 자연 비발생 앱타머는 IL-23 및/또는 IL-12에 대한 해리 상수 ("KD")가 100 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 100 pM 미만, 50 pM 미만이다. 본 발명의 몇몇 실시 형태에 있어서, 이 해리 상수는 하기 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, 도트 블롯 적정에 의해 결정된다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 IL-23 및/또는 IL-12의 기능을 조정한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 IL-23 및/또는 IL-12의 기능을 저해하는 반면, 다른 실시 형태에 있어서는 본 앱타머는 표적의 기능을 촉진한다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 앱타머는 IL-23 또는 IL-12 변이체에 결합하고/하거나 그의 기능을 조정한다. 본원에 사용되는 바와 같이 IL-23 또는 IL-12 변이체는 IL-23 또는 IL-12의 기능과 본질적으로 동일한 기능을 수행하며, 바람직하게는 실질적으로 동일한 구조를 포함하고 몇몇 실시 형태에 있어서는 IL-23 또는 IL-12의 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시 형태에 있어서, 표적 변이체의 서열 동일성은 이하에 기술되어 있는 바와 같이 BLAST를 사용하여 결정한다.
2개 이상의 핵산 또는 단백질 서열의 정황에서 "서열 동일성"이라는 용어는 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나의 알고리즘 또는 시각적 점검에 의해 측정되는 바와 같이, 동일하거나 명시된 백분율의, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 말한다. 서열 비교에 있어서, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로 작용하며, 시험 서열은 이것과 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터 내로 입력하고, 필요할 경우 서브서열 코오디네이트 (coordinate)를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 시험 서열(들)에 있어서의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다. 비교에 있어서의 최적의 서열 정렬은 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]의 국소적 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, J Mol. Biol.48 : 443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 상기 알고리즘의 이행의 컴퓨터화 (미국 위스콘신주 매드슨 사이언스 Dr. 575 소재의 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 시각적 점검 (일반적으로, 하기의 문헌[Ausubel et al.] 참조)에 의해 행해질 수 있다.
서열 동일성 퍼센트를 결정하는 데에 적합한 알고리즘의 일례로는 BLAST (basic local alignment search tool, 이하, "BLAST")에서 사용되는 알고리즘이 있으며, 예를 들어 문헌[Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)] 및 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402 (1997)]을 참조한다. BLSAT 분석 수행용 소프트웨어는 NCBI (National Center for Biotechnology Information, 이하, "NCBI")를 통하여 공식적으로 입수가능하다. NCBI로부터 입수가능한 소프트웨어, 예를 들어 BLASTN (뉴클레오티드 서열의 경우) 및 BLASTP (아미노산 서열의 경우)를 사용하여 서열 동일성을 결정하는 데에 사용되는 초기 설정 파라미터가 문헌[McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 32: W20-W25 (2004)]에 기술되어 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 본 앱타머는 IL-23에의 결합 능력이 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, and 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314의 서열 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 앱타머의 능력과 실질적으로 동일하다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 앱타머는 구조 및 IL-23에의 결합 능력이 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, and 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314의 서열 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 앱타머의 구조 및 능력과 실질적으로 동일하다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 본 앱타머는 IL-23 및/또는 IL-12에의 결합 능력이 서열 번호 14, 서열 번호 17-19, 서열 번호 21, 서열 번호 27-32, 서열 번호 34-40, 서열 번호 42, 서열 번호 49, 서열 번호 60-61, 서열 번호 91-92, 서열 번호 94, 및 서열 번호 103-118의 서열 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 앱타머의 능력과 실질적으로 동일하다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 앱타머는 구조 및 IL-23 및/또는 IL-12에의 결합 능력이 서열 번호 14, 서열 번호 17-19, 서열 번호 21, 서열 번호 27-32, 서열 번호 34-40, 서열 번호 42, 서열 번호 49, 서열 번호 60-61, 서열 번호 91-92, 서열 번호 94, 및 서열 번호 103-118의 서열 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 앱타머의 구조 및 능력과 실질적으로 동일하다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 약학 조성물에서 활성 성분으로 사용된다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 앱타머 또는 본 발명의 앱타머를 함유하는 조성물은 염증성 질환 및 자가면역 질환 (다발성 경화증, 류머티스 관절염, 심상성 건선, 전신성 홍반성 루푸스, 및 한정됨이 없이 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 과민성 장질환을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아님), 제I형 당뇨병, 결장암, 폐암, 및 골다공증에서의 골흡수의 치료에 사용된다.
몇몇 실시 형태에 있어서 본 발명의 앱타머 치료제는 앱타머 치료제가 환자 또는 대상의 신체에서 분해될 경우 자연 비발생 뉴클레오티드 치환체로부터의 해로운 부작용은 감소시키면서 그의 표적에 대하여 큰 친화성 및 특이성을 갖는다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 발명의 앱타머 치료제를 함유하는 치료 조성물은 플루오르화 뉴클레오티드가 없거나 감소된 양의 플루오르화 뉴클레오티드를 갖는다.
본 발명의 앱타머는 트리에스테르 합성 방법 (예를 들어, 문헌[Sood et al., Nucl. Acid Res. 4: 2557 (1977)] 및 문헌[Hirose et al., Tet. Lett., 28: 2449 (1978)] 참조)과 같은 당업계에 잘 알려진 액상법 및 고상 올리고뉴클레오티드 합성 기술 (예를 들어, 문헌[Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14: 5399-5467 (1986)] 및 문헌[Froehler et al., Tet. Lett. 27: 5575-5578 (1986)] 참조)을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 합성할 수 있다.
면역촉진 모티프를 갖는 앱타머
본 발명은 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하며 이들의 생물학적 기능을 조정하는 앱타머를 제공한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 IL-23 및/또는 IL-12가 IL-23 및/또는 IL-12의 수용체에 결합하는 것을 증가시키고 그럼으로써 IL-23 및/또는 IL-12의 생물학적 기능을 증강시키는 앱타머를 제공한다. 그러한 앱타머의 작동 효과는 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하며 면역촉진 모티프를 포함하는 앱타머를 선별하거나, IL-23 및/또는 IL-12에 결합하는 앱타머와, 면역촉진 서열에 결합하는 것으로 공지된 표적에 대한 앱타머를 함께 처리함으로써 추가로 증강시킬 수 있다.
척추 동물 면역계에 의한 박테리아 DNA의 인식은 특정 서열 정황에서의 비메틸화 CG 디뉴클레오티드 ("CpG 모티프")의 인식에 기초한다. 그러한 모티프를 인식하는 하나의 수용체는, 특유한 미생물 구성 성분의 인식에 의해 고유한 면역 반응에 참여하는 Toll-유사 수용체 족의 구성원 (~10종의 구성원)인 Toll-유사 수용체 9 ("TLR 9")이다. TLR 9는 비메틸화 올리고데옥시뉴클레오티드 ("ODN") CpG서열에 서열 특이적 방식으로 결합한다. CpG 모티프의 인식은 방어 기작을 트리거링하여 고유한, 그리고 궁극적으로는 획득된 면역 반응을 생성한다. 예를 들어, 생쥐에 있어서 TLR 9의 활성화는 항원 제시 세포의 활성화, MHC 클래스 I 및 II 분자의 상향 조절 및 IL-12와 IL-23을 포함하는 중요한 공통 촉진 분자 및 사이토카인의 발현을 유도한다. 이러한 활성화는 TH1 사이토카인 IFN-감마의 강건한 상향 조절을 포함하여, B 및 T 세포 응답을 직접적으로, 그리고 간접적으로 증강시킨다. 총체적으로, CpG 서열에 대한 응답은 감염성 질환에 대한 방어, 백신에 대한 면역 반응 개선, 천식에 대한 효과적인 반응, 및 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 개선을 생성한다. 따라서, CpG ODN은 감염성 질환에 대한 방어를 제공하며 면역-아쥬반트 또는 암 치료제 (단일 치료법 또는 mAb 또는 기타 치료법과의 병용 요법)로서 기능할 수 있으며, 천식 또는 알러지 반응을 감소시킬 수 있다.
하나 이상의 CpG 또는 기타 면역촉진 서열을 포함하는 본 발명의 앱타머는 예를 들어 본원에 기술되어 있는 SELEX (상표명) 공정을 사용하여 다양한 전략으로 확인 및 생성할 수 있다. 혼입되는 면역촉진 서열은 DNA, RNA 및/또는 DNA/RNA의 조합일 수 있다. 일반적으로, 이 전략은 두 군으로 나뉘어질 수 있다. 1 군에서, 이 전략은 CpG 모티프 또는 기타 면역촉진 서열과, 표적의 결합 부위를 포함하는 앱타머를 확인 또는 생성하는 것에 관한 것이며, 여기서, 표적 (이하, "CpG외 표적")은 CpG 모티프 또는 기타 면역촉진 서열을 인식하는 것으로 공지되고 CpG 모티프에의 결합시 면역 반응을 촉진하는 것으로 공지된 것 이외의 표적이다. 본 발명의 몇몇 실시 형태에 있어서, CpG외 표적은 IL-23 및/또는 IL-12 표적이다. 이 군의 제1 전략은 올리고뉴클레오티드 풀 - 여기서, CpG 모티프가 고정 영역으로서, 또는 고정 영역의 일부로서 혼입되는데, 예를 들어, 몇몇 실시 형태에 있어서, 풀의 구성원의 랜덤화 영역은 그 안에 혼입된 CpG 모티프를 가짐 - 을 사용하여, SELEX (상표명)를 수행하여 CpG외 표적, 바람직하게는 표적, 예를 들어 IL-23 및/또는 IL-12에 특이적인 앱타머를 수득하는 단계와 - 여기서, 면역 반응 억제는 질환 발병과 관련됨 - , CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다. 이 군의 제2 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 특이적 CpG외 표적, 바람직하게는 표적, 예를 들어 IL-23 및/또는 IL-12에 대한 앱타머를 수득하는 단계와 - 여기서, 면역 반응 억제는 질환 발병과 관련됨 - , 선별 후 CpG 모티프를 앱타머의 5' 및/또는 3' 말단에 부가시키거나 CpG 모티프를 앱타머의 영역, 바람직하게는 비-필수 영역 내로 엔지니어링하는 단계를 포함한다. 이러한 군의 세번째 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 특이적 비-CpG 표적, 바람직하게는 표적, 예를 들어 IL-23 및/또는 IL-12에 대한 앱타머를 수득하는 단계 - 여기서, 면역 반응 억제는 질환 발병과 관련되고, 이 풀의 합성 동안 다양한 뉴클레오티드의 몰 비는 하나 이상의 뉴클레오티드 부가 단계에서 편향되어 이 풀의 각각의 구성원의 랜덤화 영역은 CpG 모티프에서 농후화되어 있음 - , 및 CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다. 이 군의 네번째 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 특이적 CpG외 표적, 바람직하게는 표적, 예를 들어 IL-23 및/또는 IL-12에 대한 앱타머를 수득하는 단계와 - 여기서, 면역 반응 억제는 질환 발병과 관련됨 - , CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다. 이 군의 다섯번째 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 특이적 비-CpG 표적, 바람직하게는 표적, 예를 들어 IL-23 및/또는 IL-12에 대한 앱타머를 수득하는 단계 - 여기서, 면역 반응 억제는 질환 발병과 관련됨 - , 및 결합시 면역 반응을 촉진하지만 CpG 모티프는 포함하지 않는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다.
제2 군에서, 본 전략은 CpG 모티프의 수용체 (예를 들어, TLR9 또는 다른 toll-유사 수용체)에 의해 결합되며 결합시 면역 반응을 촉진하는 CpG 모티프 및/또는 기타 서열을 포함하는 앱타머의 확인 또는 생성법에 관한 것이다. 이 군의 제1 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 CpG 모티프 또는 기타 면역촉진 서열에 결합하고 결합시 올리고뉴클레오티드 풀을 사용하여 면역 반응을 촉진하는 것으로 공지된 표적에 대한 앱타머를 수득하는 단계 - 여기서, CpG 모티프는 고정 영역으로서, 또는 고정 영역의 일부로서 풀의 각각의 구성원 내로 혼입되었고, 몇몇 실시 형태에 있어서, 랜덤화된 영역의 풀 구성원은 CpG 모티프가 혼입된 고정 영역을 포함함 - 와, CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다. 이 군의 제2 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 CpG 모티프 또는 기타 면역촉진 서열에 결합하고 결합시 면역 반응을 촉진하는 것으로 공지된 표적에 대한 앱타머를 수득하는 단계 및 그 후 CpG 모티프를 5' 및/또는 3' 말단에 부가하거나 앱타머의 영역, 바람직하게는 압타마의 비필수 영역 내로 CpG 모티프를 엔지니어링하는 단계를 포함한다. 이 군의 제3 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 CpG 모티프 또는 기타 면역촉진 서열에 결합하고 결합시 면역 반응을 촉진하는 것으로 공지된 표적에 대한 앱타머를 수득하는 단계 - 여기서, 풀의 합성 동안 다양한 뉴클레오티드들의 몰 ㅂ비는 하나 이상의 뉴클레오티드 첨가 단계들에서 편향되어, 풀의 각각의 구성원의 랜덤화 영역은 CpG가 농후화됨 - 와, CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다. 이 군의 제4 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 CpG 모티프 또는 기타 면역촉진 서열에 결합하고 결합시 면역 반응을 촉진하는 것으로 공지된 표적에 대한 앱타머를 수득하는 단계와, CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다. 이 군의 제5 전략은 SELEX (상표명)를 수행하여 CpG 모티프 또는 기타 면역촉진 서열에 결합하는 것으로 공지된 표적에 대한 앱타머를 수득하는 단계와, 결합시 면역 반응은 촉진하지만 CpG 모티프는 포함하지 않는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다.
다양한 상이한 부류의 CpG 모티프가 확인되었으며, 각각은 인식시에 상이한 캐스캐이드의 사건, 사이토카인 및 기타 분자의 방출과, 소정 세포형의 활성화로 이어진다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, Annu. Rev. Immunol. 2002,20 : 709-760]을 참조한다. 추가의 면역촉진 모티프가 하기 미국 특허에 개시되어 있으며, 이 특허 각각은 본원에 참고로 포함되어 있다: 미국 특허 제6,207,646호; 미국 특허 제6,239,116호; 미국 특허 제6,429,199호; 미국 특허 제6,214,806호; 미국 특허 제6,653,292호; 미국 특허 제6,426,434호; 미국 특허 제6,514,948호 및 미국 특허 제6,498,148호. 상기 CpG 또는 기타 면역촉진 모티프 중 임의의 것을 앱타머 내로 혼입시킬 수 있다. 앱타머의 선별은 치료할 질환 또는 장애에 의존적이다. 바람직한 면역촉진 모티프는 하기와 같으며 (좌측에서 우측으로 5'에서 3'으로 예시됨), 여기서, "r"은 퓨린을 나타내고, "y"는 피리미딘을 나타내며, "X"는 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다: AACGTTCGAG (서열 번호 7); AACGTT; ACGT, rCGy; rrCGyy, XCGX, XXCGXX, 및 X1X2CGY1Y2 - 여기서, X1은 G 또는 A이며, X2는 C가 아니고, Y1은 G가 아니며, Y2는 바람직하게는 T임 - .
CpG 모티프가 CpG 모티프에 결합하며 결합시 면역 반응을 촉진하는 것으로 공지된 표적 이외의 특정 표적 ("CpG외 표적")에 결합하는 앱타머 내로 혼입된 경우, CpG는 바람직하게는 앱타머의 비-필수 영역 내에 위치한다. 앱타머의 비-필수 영역은 특정 부위 돌연변이 유발, 결실 분석 및/또는 치환 분석으로 확인할 수 있다. 그러나, 앱타머가 CpG외 표적에 결합하는 앱타머의 능력을 유의하게 간섭하지 않는 임의의 위치가 사용될 수도 있다. 앱타머 서열 내에 묻히는 것 외에도, CpG 모티프는 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나 또는 이 말단 둘 모두에 부가되거나 그렇지 않을 경우 앱타머에 부착될 수 있다. CpG외 표적에 결합하는 앱타머의 능력이 유의하게 간섭되지만 않는다면 임의의 부착 위치 또는 수단이 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역 반응의 촉진"은 (1) 특정 반응의 유도 (예를 들어, Th1 반응의 유도) 또는 소정 분자의 생성의 유도 또는 (2) 특정 반응의 저해 또는 억제 (예를 들어, Th2 반응의 저해 또는 억제) 또는 소정 분자의 저해 또는 억제를 의미할 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하는 앱타머 분자를 함유하는 약학 조성물도 포함한다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 본 조성물은 내복용에 적합하며 유효량의 본 발명의 약리학적 활성 화합물을 단독으로, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 함유한다. 본 화합물은, 만일 있다 해도, 매우 낮은 독성을 갖는다는 점에서 특히 유용하다.
본 발명의 조성물은 병상 (pathology), 예를 들어 질환 또는 장애의 치료 또는 예방, 또는 환자에 있어서 그러한 질환 또는 장애의 증상의 완화를 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 염증성 및 자가면역 관련 질환, 제I형 당뇨병, 골다공증에서의 골흡수 및 암을 포함하여 IL-23 및/또는 IL-12 사이토카인과 결부된 병상을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 앱타머가 특이적으로 결합하는 표적과 관련되거나 그로부터 유래되는 질환 또는 장애를 앓고 있거나 상기 질환 또는 장애에 걸리기 쉬운 대상에게 투여하기에 유용하다. 본 발명의 조성물은 병상을 갖는 환자 또는 대상의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 방법은 환자 또는 대상에게 병상과 관계되는 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하는 앱타머 또는 이 앱타머를 함유하는 조성물을 투여하여, IL-23 및/또는 IL-12에의 앱타머의 결합에 의해 표적의 생물학적 기능을 변경시키고, 그럼으로써 병상을 치료하는 단계를 포함한다.
병상을 갖는 환자 또는 대상, 즉, 본 발명의 방법으로 치료되는 환자 또는 대상은 척추 동물, 더욱 특히는 포유류, 또는 더욱 특히는 인간일 수 있다.
실제로, 본 앱타머 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 그의 요망되는 생물학적 활성, 예를 들어, IL-23 및/또는 IL-12가 그의 수용체에 결합하는 것을 저해하는 것을 발휘하기에 충분한 양으로 투여된다.
본 발명의 일 태양은 염증성 및 자가면역 질환, 암 및 기타 관련 장애의 다른 치료법과 조합된 본 발명의 앱타머 조성물을 포함한다. 본 발명의 앱타머 조성물은 예를 들어 하나보다 많은 앱타머를 함유할 수도 있다. 몇몇 예에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유하는 본 발명의 앱타머 조성물은 다른 유용한 조성물, 예를 들어, 소염제, 면역 억제제, 항바이러스제 등과 조합되어 투여된다. 또한, 본 발명의 화합물은 상기한 바와 같이 세포 독성제, 세포 증식 억제제 (cytostatic agent), 화학 요법제, 예를 들어, 알킬화제, 항대사물질, 우사 분열 저해제 또는 세포 독성 항생제와 조합되어 투여될 수도 있다. 일반적으로, 그러한 조합물에 사용하기 위한 현재 입수가능한 투여 형태의 공지된 치료제가 적합할 것이다.
"병용 요법" (또는 "공동-요법 (co-therapy)")은 본 발명의 앱타머 조성물과, 적어도 제2 약제를 상기 치료제들의 공동 작용으로부터 유익한 효과를 제공하려는 특정 치료 섭생법의 일부로서 투여하는 것을 포함한다. 병용법의 유익한 효과는 치료제의 조합으로부터 생기는 약동학적 또는 약효학적 공동 작용을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기 치료제들을 조합하여 투여하는 것은 전형적으로 규정된 기간에 걸쳐 (일반적으로, 선별되는 조합에 따라 수분, 수시간, 수일 또는 수주) 실시된다.
"병용 요법"은 우연히 그리고 임의로 본 발명의 조합으로 이어지는 개별적인 단일 요법 섭생법의 일부로서 2가지 이상의 상기 치료제들의 투여를 포함할 수 있지만, 일반적으로는 이를 포함하려는 것은 아니다. "병용 요법"은 상기 치료제들의 투여를 순차적인 방식으로 투여하는 것을 포함하려는 것인데, 즉, 각각의 치료제는 상이한 시점에서 투여되며, 이 외에도, 상기 치료제, 또는 치료제 중 적어도 2가지를 실질적으로 동시에 투여하는 방식으로 투여하는 것을 포함하려는 것이다. 실질적 동시 투여는 예를 들어 대상에게 고정된 비의 각각의 치료제를 갖는 단일 캡슐, 또는 치료제 각각을 위한 다수의 단일 캡슐을 투여함으로써 달성될 수 있다.
각각의 치료제의 순차적 투여 또는 실질적 동시 투여는 국소 경로, 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접적 흡수를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 임의의 적절한 경로로 행해질 수 있다. 치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 선별된 조합의 제1 치료제는 주사로 투여될 수 있는 반면, 조합의 다른 치료제는 국소적으로 투여될 수 있다.
대안적으로는, 예를 들어 모든 치료제가 국소적으로 투여될 수 있거나 모든 치료제가 주사로 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 순서는 달리 나타내지 않는 한 편협하게 결정적이지는 않다. "병용 요법"은 상기의 치료제를 다른 생물학적 활성 성분과 추가로 조합하여 투여하는 것도 포함할 수 있다. 병용 요법이 약물외 치료를 추가로 포함하는 경우, 약물외 치료는 치료제와 약물외 치료의 조합의 공동 작용으로부터의 유익한 효과가 성취되기만 한다면 임의의 적합한 시점에서 행해질 수 있다. 예를 들어, 적절한 경우에, 유익한 효과는 약물외 치료가 아마도 수일 또는 심지어 수주간 치료제의 투여로부터 일시적으로 제거될 때에 여전히 성취된다.
본 발명의 치료용 또는 약리학적 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용가능한 매질 중에 용해되거나 분산된 유효량의 치료 활성 성분(들)을 함유한다. 약학적으로 허용가능한 매질 또는 담체는 임의의, 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 약제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 있어서의 그러한 매질 및 약제의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분도 본 발명의 치료 조성물 내로 혼입될 수 있다.
약학 또는 약리학적 조성물의 제조는 본 발명의 개시 내용에 비추어 보면 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 그러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액; 주사 전에 액체 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서 주사가능한 약으로서; 정제 또는 경구 투여용의 기타 고체로서; 정시 방출형 (time release) 캡슐로서; 또는 점안액, 크림, 로션, 고약 (salve), 흡입제 등을 포함하여 현재 사용되는 임의의 기타 형태로 제조될 수 있다. 외과 의사, 내과 의사 또는 건강 관리 종사자가 살균 제형, 예를 들어, 염수 기재의 세척액을 사용하여 수술 현장에서 특정 영역을 처리하는 것도 특히 유용할 수 있다. 조성물은 마이크로장치, 미세 입자 또는 스폰지를 통하여 또한 전달될 수 있다.
제형화시, 치료제는 투여 제형과 상용성인 방식으로, 그리고 약리학적으로 유효한 양으로 투여된다. 제형은 다양한 투여 형태, 예를 들어, 상기의 주사가능한 용액형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출형 캡슐 등도 이용될 수 있다.
이와 관련하여, 투여될 조성물의 부피 및 활성 성분의 양은 치료할 숙주 동물에 따라 달라진다. 투여에 필요한 활성 화합물의 정확한 양은 개업의의 판단에 따라 달라지며 각각의 개체에 독특하다.
활성 화합물의 분산에 필요한 조성물의 최소 부피가 전형적으로 이용된다. 또한 투여에 적합한 섭생법은 가변적이지만, 처음에 화합물을 투여하고 결과를 모니터링하고 이어서 추가의 제어된 용량을 추가의 간격으로 줌에 의해 전형화된다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐 (예를 들어, 젤라틴 캡슐)의 형태로 경구 투여하는 것에 있어서, 활성 약물 성분은 경구용의 비독성의 약학적으로 허용가능한 불활성 담체, 예를 들어 에탄올, 글리세롤, 물 등과 조합될 수 있다. 또한, 요망되거나 필요할 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제도 혼합물 내로 혼입될 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 천연 당, 예를 들어 글루코스 또는 β-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 고무, 예를 들어, 아라비아 고무, 트래거캔쓰 또는 소듐 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 상기 투여 형태에서 사용되는 윤활제는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탤컴, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함한다. 붕해제는, 한정됨이 없이, 전분, 메틸 셀룰로오스, 한천, 벤토나이트, 잔탄 고무 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물 등을 포함한다. 희석제는, 예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신을 포함한다.
본 발명의 화합물은 정시 방출형 및 서방형 정제 또는 캡슐, 알약, 분말, 과립, 엘릭시르제, 팅크제, 현탁액, 시럽 및 에멀젼과 같은 경구 투여 형태로도 투여될 수 있다. 좌약은 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 제조되는 것이 유리하다.
본 약학 조성물은 살균되고/되거나 아쥬반트 (adjuvant), 예를 들어, 방부제, 안정제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 또한, 본 조성물은 치료용으로 가치 있는 다른 물질을 또한 함유할 수 있다. 본 조성물은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조되며, 전형적으로는 약 0.1% 내지 75%, 바람직하게는 약 1% 내지 50%의 활성 성분을 함유한다.
액체, 특히 주사가능한 조성물은 예를 들어 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매, 예를 들어 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해되거나 그들과 혼합됨으로써 주사가능한 용액 또는 현탁액을 형성한다. 추가로, 주사 전에 액체 중에 용해되기에 적합한 고체 형태가 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 정맥내 (볼루스 (bollus) 및 주입 둘 모두), 복강내, 피하 또는 근육내 형태로 투여될 수 있는데, 이 모든 것에서 약학 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 형태가 사용된다. 주사가능한 물질은 통항적인 형태로, 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다.
주사가능한 비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 및 주입에 사용된다. 추가로, 비경구 투여에 있어서의 한 가지 접근법에서는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제3,710,795호에 따른, 일정한 수준의 투여량의 유지를 보증하는 느린 방출형 또는 서방형 시스템의 이식이 이용된다.
또한, 본 발명에 바람직한 화합물은 피부 경피 패치 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 피부 경피 패치의 형태를 사용하여 경피 경로를 통하여, 또는 적합한 비강내 비히클, 흡입기의 국소적 사용을 통하여 비강내 형태로 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여하기 위하여, 투여량은 물론 투여 섭생법 전반에 걸쳐 간헐적이기보다는 연속적일 것이다. 다른 바람직한 국소용 제제는 크림, 연고, 로션, 에어로졸 스프레이 및 겔을 포함하며, 여기서, 활성 성분의 농도는 전형적으로 0.01% 내지 15% (w/w 또는 w/v)의 범위이다.
고체 조성물에 있어서, 부형제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 탤컴, 셀룰로오스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 상기에 정의된 활성 화합물은, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜을 담체로 하여 좌약으로도 제형화될 수 있다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 좌약은 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 제조되는 것이 유리하다.
본 발명의 화합물은 리포좀 전달 시스템, 예를 들어, 작은 단일층 소포체 (unilamellar vesicle), 큰 단일층 소포체 및 다중층 소포체의 형태로도 투여될 수 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 포함하는 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 미국 특허 제5,262,564호에 개시되어 있는 바와 같이, 지질 성분의 필름은 약물 수용액으로 수화되어 지질층 캡슐화 약물을 형성한다. 예를 들어, 본원에 기술되어 있는 앱타머 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제작되는 친유성 화합물 또는 비-면역원성의 고분자량 화합물과의 복합체로서 제공될 수 있다. 핵산 결부 복합체의 예가 미국 특허 제6,011,020호에 제공되어 있다.
본 발명의 화합물은 표적성 (targetable) 약물 담체로서 용해성 중합체와 또한 커플링될 수 있다. 그러한 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스파나미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 방출 제어형의 약물의 성취에 유용한 생분해성 중합체류, 예를 들어, 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 가교 결합 또는 친양쪽성 히드로겔 블록 공중합체에 커플링될 수 있다.
요망될 경우, 투여될 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 및 기타 물질, 예를 들어 아세트산나트륨 및 트리에탄올아민 올레에이트를 또한 함유할 수 있다.
앱타머가 이용되는 투여 섭생법은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료할 병의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능과; 이용되는 특정 앱타머 또는 그의 염을 포함하는 다양한 요인에 따라 선별된다. 숙련된 의사 또는 수의사라면 병의 진행을 예방, 저지 또는 정지시키는 데 필요한 약물의 유효량을 손쉽게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 경구 투여량은, 표시된 효과에 사용될 경우, 경구 투여로 약 0.05 내지 7500 mg/일 사이의 범위이다. 본 조성물은 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 및 1000.0 mg의 활성 성분을 함유하는 새김이 있는 정제 (scored tablet)의 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 주입 투여량, 비강내 투여량 및 경피 투여량은 0.05 내지 7500 mg/일 사이의 범위이다. 피하, 정맥내 및 복강내 투여량은 0.05 내지 3800 mg/일 사이의 범위이다.
본 발명의 화합물의 유효한 혈장 중 수준은 0.002 mg/mL 내지 50 mg/mL 범위이다.
본 발명의 화합물은 단일한 일일 용량으로 투여될 수 있거나, 전체 일일 투여량을 일일 2회, 3회 또는 4회의 나뉘어진 용량으로 투여될 수 있다.
앱타머 치료제의 약동학적 특성 및 생체 분포의 조정
앱타머를 포함하는 모든 올리고뉴클레오티드 기재의 치료제의 약동학적 특성은 요망되는 약학적 용도에 매치되도록 맞추어지는 것이 중요하다. 세포외 표적에 대하여 유도되는 앱타머는 세포내 전달과 결부된 어려움 (안티센스 및 RNAi-기재의 치료제의 경우에서와 같음) 때문에 고통을 받지는 않지만, 그러한 앱타머는 여전히 표적 기관 및 조직에 분포될 수 있어야 하며, 요망되는 투여 섭생법과 일치되게 소정 기간 동안 체내에 남아 있어야 한다 (미변형).
따라서, 본 발명은 앱타머 조성물의 약동학적 특성과, 특히, 앱타머의 약동학적 특성을 조정하는 능력에 영향을 주는 재료 및 방법을 제공한다. 앱타머의 약동학적 특성의 조율성 (즉, 조정하는 능력)은 변형 부분 (예를 들어, PEG 중합체)을 앱타머에 콘쥬게이션시키고/시키거나 변형 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸)를 혼입시켜 핵산의 화학 조성을 변경시키는 것을 통하여 성취된다. 앱타머의 약동학적 특성의 조정 능력은 기존의 치료 용도의 개선, 또는 대안적으로는 새로운 치료 용도의 개발에 사용된다. 예를 들어, 몇몇 치료 용도에 있어서, 예를 들어, 항-신생물 또는 급성 케어 세팅 (care setting) - 여기서, 신속한 약물의 제거 또는 중지 (turn-off)가 요망될 수도 있음 - 에서, 순환에서 앱타머의 체류 시간을 감소시키는 것이 바람직하다. 대안적으로는, 다른 치료 용도, 예를 들어, 치료제의 전신 순환이 요망되는 유지 요법에서, 순환에서 앱타머의 체류 시간을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 앱타머의 약동학적 특성의 조율성을 이용하여 대상에서 앱타머 치료제의 생체 분포를 변형시킨다. 예를 들어, 몇몇 치료 용도에서, 특정 유형의 조직 또는 특정 기관 (또는 기관 세트)를 표적화하려는 노력으로 앱타머 치료제의 생체 분포를 변경시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 용도에 있어서, 앱타머 치료제는 특정 조직 또는 기관(들)에서 우선적으로 축적된다. 다른 치료 용도에 있어서, 주어진 질환, 세포 상해 또는 기타 비정상적 병상과 결부된 증상 또는 세포 마커를 표시하는 조직을 표적화하여, 앱타머 치료제가 영향을 받은 조직에서 우선적으로 축적되게 하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 2004년 3월 5일자로 출원되고 발명의 명칭이 "앱타머 치료제의 약동학적 특성 및 생체 분석의 제어된 조정"인 공계류 중인 미국 가출원 제60/550790호와, 2005년 3월 7일자로 출원되고 발명의 명칭이 또한 "앱타머 치료제의 약동학적 특성 및 생체 분포의 제어된 조정"인 미국 비-가출원 제10/___,___호에 개시되어 있는 바와 같이, 앱타머 치료제의 PEG화 (예를 들어, 20 kDa의 PEG 중합체를 이용한 PEG화)를 사용하여 염증을 일으킨 조직을 표적화하여, PEG화 앱타머 치료제가 염증을 일으킨 조직에 우선적으로 축적되게 한다.
앱타머 치료제 (예를 들어, 앱타머 콘쥬게이트 또는 변경된 화학적 특성을 갖는 앱타머, 예를 들어 변형 뉴클레오티드)의 약동학적 특성 및 생체 분포 프로필을 결정하기 위하여 다양한 파라미터를 모니터링한다. 그러한 파라미터는 예를 들어, 반감기 (t1 /2), 혈장 제거율 (C1), 분포 부피 (Vss), 농도-시간 곡선 하의 면적 (AUC), 최대 혈청 또는 혈장 관찰 농도 (Cmax), 및앱타머 조성물의 평균 체류 시간 (mean residence time, MRT)을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "AUC"라는 용어는 앱타머 투여 후 시간에 대한 앱타머 치료제의 혈장 중 농도의 도면 하의 면적을 말한다. AUC 값을 사용하여 주어진 앱타머 치료제의 생체 이용률 (즉, 앱타머 투여 후 순환에서 투여 앱타머 치료제의 백분율) 및/또는 총 제거율 (C1) (즉, 앱타머 치료제가 순환으로부터 제거되는 속도)을 개산한다. 분포 부피는 앱타머 치료제의 혈장 중 농도를 체내에 존재하는 앱타머의 양에 관련시킨 것이다. Vss가 커질수록, 보다 많은 앱타머가 혈장 외부에서 발견된다 (즉, 보다 삼출성임).
본 발명은 앱타머를 조정 부분, 예를 들어 작은 분자, 펩티드 또는 중합체 말단 기에 콘쥬게이션시킴으로써, 또는 변형 뉴클레오티드를 앱타머 내로 혼입시킴으로써 생체 내에서 안정화된 앱타머 조성물의 약동학적 특성 및 생체 분포를 제어된 방식으로 조정하는 재료 및 방법을 제공한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 변형 부분의 콘쥬게이션 및/또는 변경 뉴클레오티드(들)의 화학 조성은 앱타머의 순환에서의 체류 시간과 조직으로의 분포의 근본적인 측면을 변경시킨다.
뉴클레아제에 의한 제거 외에도, 올리고뉴클레오티드 치료제는 신장 여과를 통하여 제거되게 된다. 이와 같이, 정맥내로 투여되는 뉴클레아제 내성 올리고뉴클레오티드는, 여과가 차단될 수 있지 않는 한, <10분의 생체내 반감기를 나타낸다. 이는, 혈류로부터의 조직 내로의 신속한 분포를 용이하게 함으로써 또는 사구체에 있어서 효과적인 크기 컷-오프 (cut-off)보다 큰 겉보기 분자량의 올리고뉴클레오티드를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 하기에 기술되어 있는 PEG 중합체에의 작은 치료제의 콘쥬게이션 (PEG화)은 순환에서 앱타머의 체류 시간을 극적으로 연장시켜, 투여 빈도를 감소시키고 혈관 표적에 대한 유효성을 증강시킬 수 있다.
앱타머는 다양한 변형 부분, 예를 들어 고분자량의 중합체, 예를 들어 PEG; 펩티드, 예를 들어 Tat (HIV Tat 단백질의 13개의 아미노산의 단편 (Vives, et al., (1997), J. Biol.Chem. 272 (25): 16010-7)), Ant (드로소필라 안테나페디아 (Drosophila antennapedia) 호메오틱 단백질 (homeotic protein)의 제3 나선으로부터 유래되는 16개의 아미노산 서열 (Pietersz, et al., (2001), Vaccine 19 (11-12): 1397-405) ) 및 Arg7 (폴리아르기닌 (Arg7)으로 구성되며 짧고 양으로 하전된 세포 침투 펩티드 (Rothbard, et al., (2000), Nat. Med. 6 (11): 1253-7; Rothbard, J et al., (2002), J. Med. Chem. 45 (17):3612-8)); 및 작은 분자, 예를 들어, 친유성 화합물, 예를 들어 콜레스테롤에 콘쥬게이션될 수 있다. 본원에 기술되어 있는 다양한 콘쥬게이트 중에서, 앱타머의 생체내 특성은 PEG 기와의 복합체 형성에 의해 가장 심원하게 변경된다. 예를 들어, 혼합된 2'F 및 2'-OMe 변형 앱타머 치료제와 20 kDa PEG 중합체와의 복합체 형성은 신장 여과를 방해하며 건강한 조직 및 염증을 일으킨 조직 둘 모두로의 앱타머의 분포를 촉진한다. 또한, 20 kDa PEG 중합체-앱타머 콘쥬게이트는 앱타머의 신장 여과의 방지에 있어서 거의 40 kDa PEG 중합체만큼 효과적인 것으로 입증된다. PEG화의 한 가지 영향은 앱타머 제거에 대한 것이지만, 20 kDa의 부분의 존재에 의해 주어지는 전신 노출 연장도 앱타머가 조직, 특히 고도로 관류된 기관 및 염증 부위로의 앱타머의 분포를 용이하게 한다. 앱타머-20 kDa PEG 중합체 콘쥬게이트는 염증 부위로의 앱타머의 분포를 지시하여, PEG화 앱타머가 염증을 일으킨 조직에 축적되게 한다. 몇몇 경우, 20 kDa PEG화 앱타머 콘규게이트는 세포, 예를 들어 신장 세포의 내부에 접근할 수 있다.
또한 변형 뉴클레오티드를 사용하여 앱타머의 혈장 제거를 조정할 수 있다. 예를 들어, 2'-F 및 2'-OMe 안정화 화학적 특성 둘 모두가 혼입된 미콘쥬게이션화 앱타머 - 이는, 시험관내 및 생체내에서 높은 정도의 뉴클레아제 안정성을 나타내기 때문에 전형적인 현 세대의 앱타머임 - 는 미변형 앱타머와 비교할 때 혈장으로부터의 신속한 손실 (즉, 신속한 혈장 제거) 및 조직, 특히 신장 내로의 신속한 분포를 나타낸다.
PEG 유도체화 핵산
상기에 기술한 바와 같이, 고분자량의 비면역원성 중합체를 이용한 핵산의 유도체화는 핵산의 약동학 및 약효학적 특성을 변경시켜 핵산이 보다 효과적인 치료제가 되게 하는 잠재력을 갖는다. 활성에서의 유리한 변화는 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성 증가, 신장을 통한 여과 감소, 면역계에의 노출 감소, 및 신체를 통한 치료제의 분포 변경을 포함할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 폴리알킬렌 글리콜 ("PAG") 부분으로 유도체화할 수 있다. PAG-유도체화 핵산의 예가 2003년 11월 21일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/718,833호에서 발견되는데, 상기 특허 출원은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함되어 있다. 본 발명에서 사용되는 전형적인 중합체는 폴리에틸렌 옥시드 ("PEO")로도 공지된 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 및 폴리프로필렌 글리콜 (폴리 이소프로필렌 글리콜을 포함함)을 포함한다. 추가로, 상이한 알킬렌 옥시드 (예를 들어, 에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드)의 랜덤 또는 블록 공중합체가 다수의 용도로 사용될 수 있다. 가장 일반적인 형태에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 PEG는 각각의 말단이 히드록실 기로 종결된 선형 중합체: HO-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH이다. 이 중합체, 알파-, 오메가-디히드록시폴리에틸렌 글리콜은 HO-PEG-OH로도 나타내어질 수 있는데, 여기서, -PEG- 기호는 하기의 구조 단위: -CH2CH2O-(CH2CH20)n-CH2CH2- 를 나타내며, 여기서, n은 전형적으로 약 4 내지 약 10,000의 범위이다.
예시된 바와 같이, PEG 분자는 이작용성이며 때로 "PEG 디올"로 칭해진다. PEG 분자의 말단 부분은 상대적으로 비반응성인 히드록실 부분인 -OH 기이며, 상기 기는 화합물 상의 반응성 부위에서 PEG가 다른 화합물에 부착되기 위한 작용 부분으로 전환되거나 활성화될 수 있다. 그러한 활성화 PEG 디올은 본원에서 이-활성화 PEG로 칭해진다. 예를 들어, PEG 디올의 말단 부분은 상대적으로 비반응성인 히드록실 부분, -OH를 N-히드록시 숙신이미드 유래의 숙신이미딜 활성 에스테르 부분으로 치환함으로써 아미노 부분과의 선별적 반응을 위한 활성 카르보네이트로서 작용화하였다.
다수의 용도에 있어서, PEG 분자의 하나의 말단을 본질적으로 비반응성인 부분으로 캡핑하여 PEG 분자가 일-작용성 (또는 일-활성화)이 되도록 하는 것이 바람직하다. 일반적으로 활성화 PEG에 대한 다수의 반응 부위를 나타내는 단백질 치료제의 경우, 이-작용성 활성화 PEG는 광범위한 가교 결합을 하여, 불충분한 (poorly) 작용성의 응집체를 생성한다. 일-활성화 PEG의 생성을 위하여, PEG 디올 분자의 말단 상의 하나의 히드록실 부분은 전형적으로 비반응성 메톡시 말단 부분, -OCH3으로 치환된다. PEG 분자의 다른 미캡핑화 말단은 전형적으로 반응성 말단 부분으로 전환되며, 이는 단백질과 같은 분자 또는 표면 상의 반응성 부위에서의 부착에 대하여 활성화될 수 있다.
PAG는 전형적으로 물 및 다수의 유기 용매 중의 용해성, 독성의 결여, 및 면역원성의 결여의 특성들을 갖는 중합체이다. PAG의 한 가지 용도는 이 중합체를 불용성 분자에 공유 결합에 의해 부착시켜 생성된 PAG-분자 "콘쥬게이트"가 용해성이 되도록 하는 것이다. 예를 들어, 수불용성 약물 파클리탁셀은, PEG에 커플링될 때, 수용성으로 된다. 문헌[Greenwald, et al., J. Org. Chemin., 60: 331-336 (1995)]. PAG 콘쥬게이트는 흔히 용해도 및 안정성 증강을 위해서뿐만 아니라 ㅂ분자의 혈액 순환 반감기의 연장을 위해서도 사용된다.
본 발명의 폴리알킬화 화합물은 크기가 전형적으로 5 내지 80 kDa 사이이지만, 임의의 크기가 사용될 수 있으며, 그 선별은 앱타머 및 용도에 따라 달라진다. 본 발명의 다른 PAG 화합물은 크기가 10 내지 80 kDa 사이이다. 본 발명의 또다른 PAG 화합물은 크기가 10 내지 60 kDa 사이이다. 예를 들어, PAG 중합체는 크기가 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 또는 80 kDa일 수 있다. 그러한 중합체는 선형이거나 분지형일 수 있다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 중합체는 PEG이다. 몇몇 실시 형태에 있어서 중합체는 분지형 PEG이다. 또다른 실시 형태에 있어서 중합체는 도 4에 도시되어 있는 바와 같이 40 kDa의 분지형 PEG이다. 몇몇 실시 형태에 있어서, 40 kDa의 분지형 PEG는 도 5에 도시되어 있는 바와 같이 앱타머의 5' 말단에 부착된다.
생물학적 발현 단백질 치료제와는 대조적으로, 핵산 치료제는 활성화 단량체 뉴클레오티드로부터 화학적으로 합성되는 것이 전형적이다. PEG-핵산 콘쥬게이트는 동일한 반복 단량체 합성법을 사용하여 PEG를 혼입시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 포스포르아미다이트 형태로의 전환에 의해 활성화된 PEG는 고체상 올리고뉴클레오티드 합성으로 혼입될 수 있다. 대안적으로는, 올리고뉴클레오티드 합성은 반응성 PEG의 부착 부위의 부위 특이적 혼입으로 완료시킬 수 있다. 가장 일반적으로는 이는 5'-말단에서의 자유 일차 아민의 부가 (고체상 합성의 마지막 커플링 단계에서 변형자 포스포르아미다이트를 사용하여 혼입시킴)에 의해 달성되었다. 이러한 접근법을 사용하여, 반응성 PEG (예를 들어, 아민과 반응하여 아민과 결합을 형성하도록 활성화된 것)는 정제 올리고뉴클레오티드와 조합되며 커플링 반응이 용액 중에서 실시된다.
치료제의 생체 분포를 변경시키는 PEG 콘쥬게이션의 능력은 콘쥬게이트의 겉보기 크기 (예를 들어, 유체 역학적 반경에 의해 측정되는 바와 같음)를 포함하는 다수의 요인에 관련된다. 보다 큰 콘쥬게이트 (>10 kDa)는 신장을 통한 여과를 보다 효과적으로 차단하며, 그 결과, 작은 거대분자 (예를 들어, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 혈청 중 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 여과를 차단하는 PEG 콘쥬게이트의 능력은 PEG 크기에 따라 최대 대략 50 kDa까지 증가하는 것으로 밝혀졌다 (추가의 증가는 반감기가 신장을 통한 제거라기보다는 오히려 대식세포 매개 대사 작용에 의해 정의되게 되기 때문에 최소의 유익한 효과를 가짐).
고분자량 PEG (>10 kDa)의 제조는 어렵고 비효율적이며 비용이 많이 들 수 있다. 고분자량의 PEG-핵산 콘쥬게이트의 합성 경로로서, 이전의 연구는 고분자량의 활성화 PEG의 생성에 초점이 맞추어졌다. 그러한 분자의 한 가지 생성 방법은 분지형의 활성화 PEG의 형성을 포함하며, 여기서, 2개 이상의 PEG는 활성화 기를 지니는 중앙 코어에 부착된다. 이러한 보다 큰 분자량의 PEG 분자의 말단 부분, 즉, 상대적으로 비반응성인 히드록실 (-OH) 부분은, 화합물 상의 반응성 부위에서의 다른 화합물에의 하나 이상의 PEG의 부착을 위하여, 활성화되거나 작용성 부분으로 전환될 수 있다. 분지형 활성화 PEG는 2개 초과의 말단을 가지며, 2개 이상의 말단이 활성화되었을 경우, 그러한 활성화된 보다 큰 분자량의 PEG 분자는 본원에서 다중 활성화 PEG로 칭해진다. 몇몇 경우, 분지형 PEG 분자의 일부 말단이 활성화된다. 분지형 PEG 분자의 임의의 2개의 말단이 활성화되는 경우, 그러한 PEG 분자는 이-활성화 PEG로 칭해진다. 분지형 PEG 분자 중의 단지 하나의 말단이 활성화되는 몇몇 경우, 그러한 PEG 분자는 일-활성화된 것으로 칭해진다. 이러한 접근법의 일례로서, 반응에 있어서 이후에 활성화되는 리신 코어에 2개의 모노메톡시 PEG를 부착시킴으로써 제조되는 활성화 PEG가 기술되어 있다 (문헌[Harris et al., Nature, vol. 2: 214-221, 2003]).
본 발명은 다중 PEG화 핵산을 포함하는 고분자량 PEG-핵산 (바람직하게는 앱타머) 콘쥬게이트의 합성을 위한 다른 비용 효과적 경로를 제공한다. 본 발명은 PEG-결합된 다량체성 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 이량체화 앱타머도 포함한다. 또한 본 발명은 고분자량 조성물에 관한 것이며, 여기서, PEG 안정화 부분은 앱타머의 다른 부분을 분리하는 링커인데, 예를 들어, PEG는 단일 앱타머 서열 내에서 콘쥬게이션되어, 선형 배열의 고분자량 앱타머 조성물은 예를 들어 핵산 - PEG - 핵산 (-PEG--핵산)n - 여기서, n은 1 이상임 - 이다.
본 발명의 고분자량 조성물은 분자량이 적어도 10 kDa인 것을 함유한다. 조성물은 전형적으로 크기가 10 내지 80 kDa 사이의 분자량을 갖는다. 본 발명의 고분자량 조성물은 크기가 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 또는 80 kDa이다.
안정화 부분은, 본 발명의 고분자량 앱타머 조성물의 약동학 및 약효학적 특성을 개선시키는 분자 또는 분자의 일부이다. 몇몇 경우, 안정화 부분은 2개 이상의 앱타머 또는 앱타머 도메인을 근접하게 되도록 하거나, 본 발명의 고분자량 앱타머 조성물의 전체 회전 자유도 감소를 제공하는 분자 또는 분자 부분이다. 안정화 부분은 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 - 이는 선형 또는 분지형일 수 있음 - , 단일 중합체 또는 이종 중합체일 수 있다. 다른 안정화 부분은 펩티드 핵산 (PNA)과 같은 중합체를 포함한다. 올리고뉴클레오티드도 안정화 부분일 수 있으며, 그러한 올리고뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드 및/또는 변형 결합체, 예를 들어 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 안정화 부분은 앱타머 조성물의 필수 부분일 수 있는데, 즉, 이는 앱타머에 공유 결합에 의해 결합된다.
본 발명의 조성물은 2개 이상의 핵산 부분이 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 부분에 공유 결합에 의해 콘쥬게이션된 고분자량 앱타머 조성물을 함유한다. 폴리알킬렌 글리콜 부분은 안정화 부분 역할을 한다. 폴리알킬렌 글리콜 부분이 어느 하나의 말단에서 앱타머에 공유 결합에 의해 결합되어 폴리알킬렌 글리콜이 하나의 분자에서 핵산 부분들을 함께 결합시키는 조성물에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜은 결합 부분이라고 한다. 그러한 조성물에 있어서, 공유 분자의 일차 구조는선형 배열 핵산 PAG-핵산을 포함한다. 일례로는 일차 구조 핵산-PEG-핵산을 갖는 조성물이 있다. 다른 예로는 핵산 - PEG - 핵산- PEG --핵산의 선형 배열이 있다.
핵산-PEG-핵산 콘쥬게이트의 생성을 위하여, 핵산은 원래 핵산이 단일 반응 부위를 소유하도록 합성된다 (예를 들어, 핵산은 일-활성화됨). 바람직한 실시 형태에 있어서, 이러한 반응성 부위는 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성의 마지막 단계로서 변형자 포스포르아미다이트의 부가에 의해 5'-말단에서 도입되는 아미노 기이다. 변형 올리고뉴클레오티드의 탈보호 및 정제 후, 이는 활성화 PEG의 자발적인 가수 분해를 최소화하는 용액으로 고농도로 재구성된다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 1 mM이며, 재구성된 용액은 200 mM의 pH 8.3의 NaHCO3-완충제를 함유한다. 콘쥬게이트의 합성은 고도로 정제된 이-작용성 PEG의 느린 계단식 첨가에 의해 개시된다. 바람직한 실시 형태에 있어서, PEG 디올은 숙신이미딜 프로피오네이트를 이용한 유도체화에 의해 양 말단에서 활성화된다 (이-활성화). 반응 후, PEG-핵산 콘쥬게이트는 완전 콘쥬게이션되거나, 부분적으로 콘쥬게이션되거나 미콘쥬게이션된 화학종의 분리를 위하여 겔 전기 영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제된다. 연결된 다수의 PAG 분자 (예를 들어, 랜덤 또는 블록 공중합체로서) 또는 보다 작은 PAG 사슬을 결합시켜 다양한 길이 (또는 분자량)를 성취할 수 있다. PAG외 링커가 다양한 길이의 PAG 사슬들 사이에서 사용될 수 있다.
2'-O-메틸, 2'-플루오로 및 기타 변형 뉴클레오티드 변형체는 뉴클레아제에 대하여 앱타머를 안정화시키며 생체내에서 앱타머의 반감기를 증가시킨다. 3'-3'-dT 캡도 엑소뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제5,674,685호; 미국 특허 제5,668,264호; 미국 특허 제6,207,816호; 및 미국 특허 제6,229,002호를 참조하는데, 상기 특허 각각은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함되어 있다.
반응성 핵산의 PAG - 유도체화
고분자량의 PAG-핵산-PAG 콘쥬게이트는 일-작용성 활성화 PEG를, 하나보다 많은 반응성 부위를 포함하는 핵산과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 핵산은 이-반응성 또는 이-활성화된 것이며, 하기의 2개의 반응성 부위: 즉, 통상적인 포스포르아미다이트 합성, 예를 들어, 도 6에 도시되어 있는 바와 같이 3'-5'-디-PEG화를 통하여 올리고뉴클레오티드 내로 도입되는 5'-아미노 기 및 3'-아미노기를 포함한다. 대안적인 실시 형태에 있어서, 반응성 부위는 예를 들어 피리미딘의 5-위치, 퓨린의 8-위치 또는 리보스의 2'-위치를 일차 아민의 부착 부위로 하여, 내부 위치에 도입할 수 있다. 그러한 실시 형태에 있어서, 핵산은 여러 활성화 또는 반응성 부위를 가질 수 있으며 다중적으로 활성화된 것이라고 한다. 합성 및 정제 후, 변형 올리고뉴클레오티드는 자발적인 가수분해는 최소화하면서 올리고뉴클레오티드 반응성 부위와의 선별적 반응은 촉진하는 조건 하에서 일-활성화 PEG와 조합한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 모노메톡시-PEG는 숙신이미딜 프로피오네이트로 활성화되며 커플링 반응은 pH 8.3에서 실시된다. 이-치환 PEG의 합성을 유도하기 위하여, 화학량론적 과량의 PEG를 올리고뉴클레오티드에 대하여 제공한다. 반응 후, PEG-핵산 콘쥬게이트는 완전-콘쥬게이션되거나 부분적으로 콘쥬게이션되거나 미콘쥬게이션된 화학종의 불리를 위하여 겔 전기 영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제한다.
또한 결합 도메인은 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜 분자가 이 도메인에 부착된 것일 수 있다. 그러한 PAG는 다양한 길이의 것일 수 있으며 적합한 조합으로 사용되어 본 조성물의 요망되는 분자량을 성취할 수 있다.
특정 링커의 효과는 그의 화학적 조성 및 길이 둘 모두에 의해 영향을 받을 수 있다. 너무 길거나, 너무 짧거나, IL-23 및/또는 IL-12와의 불리한 입체 및/또는 이온 상호 작용을 형성하는 링커는 앱타머와 IL-23 및/또는 IL-12 사이의 복합체의 형성을 배제시킬 것이다. 핵산들 사이의 거리에 걸치는 데에 필요한 것보다 긴 링커는 리간드의 유효 농도를 감소시킴으로써 결합 안정성을 저하시킬 수 있다. 따라서, 앱타머의 표적에의 친화도를 최대화하기 위하여 링커의 조성 및 길이를 최적화하는 것이 흔히 필요하다.
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허 문서는, 각각의 그러한 간행물 또는 문서가 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적으로, 그리고 개별적으로 나타내어지는 것처럼 본원에 참고로 포함된다. 간행물 및 특허 문서의 인용은 이들이 관련있는 종래 기술임을 인정하려는 것이 아니며, 이것이 상기 간행물 또는 특허 문서의 날짜 또는 내용에 대한 인정이 되는 것도 아니다. 이제 본 발명을 상세한 설명으로 기술하였는데, 당업계의 숙련자라면 본 발명이 다양한 실시 형태로 실행될 수 있으며 전술한 상세한 설명 및 하기의 실시예는 예시를 위한 것으로서 이후의 청구의 범위를 한정하는 것이 아님을 인지할 것이다.
실시예 1: 앱타머의 선별 및 서열
IL -23 앱타머의 선별
여러 SELEX (상표명) 전략을 이용하여 IL-23 및 IL-12에 대하여 다양한 특이성을 갖는 리간드를 생성하였다. IL-12에 대하여 IL-23에 특이적인 앱타머를 생성하도록 고안된 한 가지 방법은 IL-12를 음성 선별 단계에서 포함하여 공통 서브유닛을 인식하는 앱타머를 제외하고 IL-23에 특이적인 앱타머를 선별한다. IL-23 및 IL-12가 한 라운드 걸러서 교대되는 개별적인 SELEX (상표명) 방법에서는 공통 서브유닛을 인식하며 따라서 상기 단백질 둘 모두를 인식하는 앱타머가 유도되었다. 실시예 1A 및 1E에서, 선별은 2'-OH 퓨린 및 2'-F 피리미딘 (rRfY) 함유 풀을 이용하여 행하였다. 이러한 선별로부터의 클론은 세포 기재의 분석에서 IL-23 활성을 차단하는 데 있어서의 효능 및 결합 친화도를 기초로 하여 최적화하였다. 또한, 2'-OMe 뉴클레오티드 함유 풀, 즉, rRmY (2'-OH A 및 G와, 2'-OMe C 및 U), rGmH (2'-OH G 및 2'-OMe C, U, A), 및 dRmY (데옥시 A 및 G와, 2'-OMe C 및 U)를 이용한 선별이 하기 실시예 1B, 1C, 및 1D에 기술되어 있다.
실시예 1A: 2'- 플루오로 피리미딘 함유 풀 ( rRfY )을 이용한 인간 IL -23에 대한 선별
2'-OH 퓨린 (리보-퓨린) 및 2'-F 피리미딘 뉴클레오티드로 이루어진 풀 (rRfY 조건)을 사용하여 3회의 선별을 수행하여 인간 ("h")-IL-23에 대한 앱타머를 확인하였다. 제1 선별 (h-IL-23)은 p19 및 p40 도메인으로 이루어진 h-IL-23에 대한 직접적 선별이었다. 제2 선별 (X-IL-23)에서는 h-IL-23 및 h-IL-12를 교대 라운드에서 이용하여 두 단백질 사이의 공통 서브유닛인 p40에 대한 앱타머가 선별되게 하였다. 제3 선별 (PN-IL-23)에 있어서는, h-IL-12를 음성 선별 단계에 포함시켜 h-IL-23에 특유한 서브도메인인 p19에 결합하는 앱타머가 농후화되게 하였다. 하기에 기술되어 있는 바와 같이, 제3 선별, 즉, PN-IL-23 선별에 있어서의 출발 재료는 h-IL-23 단백질에 대한 두 라운드의 선별 후 나머지 h-IL-232로부터 분리되는, h-IL-23 선별로부터의 풀의 일부였다. 모든 상기 선별 전략에 의해 h-IL-23에 대한 앱타머가 생성되었다. 여러 앱타머는 h-IL-23에 대하여 고도로 특이적이며, 여러 앱타머는 h-IL-23 및 h-IL-12 사이의 교차 반응성을 나타내고, 하나는 h-IL-23에 대하여 h-IL-12에 보다 큰 특이성을 갖는다.
라운드 1의 h-IL-23 및 PN-IL-23 선별은α32P의 스파이크의 ATP 체부 (body) 표지 풀을 포함하는 2 x 1014개의 분자의 2'F 피리미딘 변형 ARC 212 풀 (서열 번호 8) (5'gggaaaagcgaaucauacacaaga-N40-gcuccgccagagaccaaccgagaa3')을, 100 μL의 최종 부피의 100 pmoles의 IL-23 단백질 (R&D, 미국 미네소타주 미니아폴리스 소재) 과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하여 시작하였다. 주형 (서열 8) 중의 N 시리즈는 임의의 조합의 뉴클레오티드일 수 있으며 생성되는 앱타머의 특유한 서열 영역을 생성한다.
라운드 2 후, 풀을 균등한 두 부분으로 나누고, 한 부분은 후속 라운드 (즉, 라운드 3-11)의 h-IL-23 선별에 사용하고 다른 부분은 후속 라운드 (즉, 라운드 3-11)의 PN-IL-23 선별에 사용하였다. 라운드 1의 X-IL-23 선별은, 풀의 RNA를 50 pmoles의 h-IL-23 및 50 pmoles의 h-IL-12와 함께 항온처리한 것을 제외하고는, 상기와 유사하게 행하였다.
모든 선별은 1 X SHMCK 완충제 - pH 7.4 - (20 mM Hepes pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,1 mM CaCl2)에서 수행하였다. RNA:h-IL-23 복합체 및 자유 RNA 분자는 Schleicher & Schuell (미국 뉴햄프셔주 킨 소재)로부터의 0.45 μm의 니트로셀룰로오스 스핀 컬럼을 사용하여 분리하였다. 컬럼은 1 mL의 1X SHMCK로 사전 세척하고, 이어서 RNA:단백질 함유 용액을 컬럼에 첨가하고 원심 분리기에서 1500 g에서 2분 동안 스핀하였다. 완충제 세척을 수행하여 비특이적 결합물들을 필터로부터 제거하고 (라운드 1, 2 x 500 μL의 1X SHMCK; 이후의 라운드에서는 특이적 결합물들의 농후화를 위하여 증가된 횟수 및 부피의 보다 엄격한 세척), 이어서 필터에 부착된 RNA:단백질 복합체를 용출 완충제 (7 M 우레아, 100 mM의 아세트산나트륨, 3 mM EDTA, 95℃로 사전 가열함) 200 200μL로 2회 세척하여 용출시켰다 (이후의 라운드에서는 2 x 100 μL의 세척). 용출된 RNA를 페놀:클로 로포름으로 추출하고, 이어서 침전시켰다 (40 ㎍의 글리코겐, 1부피의 이소프로판올). 이 RNA는 제조업자의 지시에 따라 Thermoscript (상표명) RT-PCR 시스템 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 이용하여, 3' 프라이머 5'ttctcggttggtctctggcggagc 3' (서열 번호 10)을 사용하여 역전사시키고, 이어서 PCR로 증폭시켰다 (20 mM 트리스 pH 8.4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.5 μM의 5' 프라이머 5'taatacgactcactatagggaaaagcgaatcatacacaaga 3' (서열 번호 9), 0.5 μM의 3' 프라이머 (서열 번호 10), 0.5 mM의 각각의 dNTP, 0.05단위/μL의 Taq 폴리머라제 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 비벌리 소재)). PCR 반응은 하기의 PCR 사이클 조건 하에 행하였다: a) 94℃, 30초; b) 55℃, 30초; c) 72℃, 30초. 이사이클은 충분한 PCR 생성물이 생성될 때까지 반복하였다. 충분한 PCR 생성물의 생성에 필요한 최소 사이클 횟수가 "PCR 역치 (threshold)"로서 하기 표 1-3에 보고되어 있다.
PCR 주형은 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 정제하였다. 주형은 α32P ATP 체부 표지법을 사용하여 37에서 하룻밤 전사시켰다 (4% PEG-8000, 40 mM 트리스 pH 8.0, 12 mM MgCl2, 1 mM 스페르미딘, 0.002%의 트리톤 X-100, 3 mM의 2'OH 퓨린, 3 mM의 2'F 피리미딘, 25 mM DTT, 0.0025 단위/μL의 무기 파이로포스파타제, 2 ㎍/mL의 T7 Y639F 단일 돌연변이 RNA 폴리머라제, 5 μCi의 α32P ATP). 제조업자의 지시에 따라 Bio Spin 컬럼 (Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 헤라클레스 소재)을 사용하여 반응물을 탈염하였다.
표 1-3에 나타내어져 있는 변화를 제외하고는, 후속 라운드의 모든 세 선별을 라운드 1과 동일한 방법을 사용하여 반복하였다. 표적 단백질과의 항온처리 이전에, 풀의 RNA를 0.45 마이크론의 니트로셀룰로오스 필터 컬럼에 통과시켜 필터 결합 서열을 제거하고, 이어서 여과액을 양성 선별 단계로 가지고 갔다. 교대 라운드에서, 풀의 RNA를 겔 정제하였다. 전사 반응을 50 mM EDTA로 켄칭하고 에탄올로 침전시키고 이어서 1.5 mm 변성 폴리아크릴아미드 겔 (8 M 우레아, 10% 아크릴아미드; 19:1의 아크릴아미드:비스아크릴아미드) 상에서 정제하였다. 풀의 RNA는 Elutrap (등록상표) 장치 (Schleicher and Schuell, 미국 뉴햄프셔주 킨 소재)에서 225 V에서 1시간 동안 1X TBE (90 mM 트리스, 90 mM의 붕산, 0.2 mM EDTA)에서 전기 용출에 의해 겔로부터 제거하였다. 용출된 물질은 300 mM의 아세트산나트륨 및 2.5 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시켰다.
RNA는 선별 전반에 걸쳐 단백질을 초과하여 남아있었다 (~1-2 μM의 RNA). 단백질의 농도는 처음 두 라운드의 경우 1 μM이었으며, 그 후 특정 선별에 기초하여 다양한 보다 낮은 농도로 하강하였다. 선별에 따라, 라운드 3 또는 4에서 출발하여 경쟁자 tRNA를 0.1 mg/mL로 결합 반응물에 첨가하였다. 총 11-12회의 라운드를 완료하였는데, 결합 분석은 선별 라운드에서 수행하였다. 하기 표 1-3에는 h-IL-23, X-IL-23 및 PN-IL-23 선별 전략을 사용한 rRfY 선별에 사용되는 선별에 대한 상세 사항이 포함되어 있으며, 이는 각각의 라운드에 사용되는 풀의 RNA의 농도, 단백질의 농도, 및 tRNA의 농도를 포함한다. 용출 값 (필터 컬럼에서 유출되 는 전 RNA에 대한 단백질 결합 RNA의 CPM 값들의 비)을 도트 블롯 결합 분석과 함께 사용하여 선별의 진행을 모니터링하였다.
[표 1]
h-IL-23 선별에 사용되는 조건
라운드 # RNA 풀 농도 (μM) 단백질 유형 단백질 농도 (μM) tRNA 농도 (mg/mL) neg 용출 % PCR 역치
1 3.3 IL-23 1 1 0 없음 4.3810
2 ~1 IL-23 1 0 NC 0.85 10
3 0.8 IL-23 0.75 0 NC 10.9 8
4 ~1 IL-23 0.5 0.1 NC 0.53 8
5 1 IL-23 0.1 0.1 NC 1.72 11
6 ~1 IL-23 0.1 0.1 NC 0.11 12
7 1 IL-23 0.1 0.1 NC 1.15 8
8 ~0.5 IL-23 0.05 0.1 NC 0.12 11
9 0.5 IL-23 0.05 0.1 NC 3.54 8
10 ~0.5 IL-23 0.05 0.1 NC 0.18 12
11 0.5 IL-23 0.025 0.1 NC 1.09 12
12 ~0.5 IL-23 0.025 0.1 NC 0.07 12
[표 2]
X-IL-23 선별에 사용되는 조건
라운드 # RNA 풀 농도 (μM) 단백질 유형 단백질 농도 (μM) tRNA 농도 (mg/mL) neg 용출 % PCR 역치
1 3.3 IL-23/ IL-12 각각 0.5 0 없음 3.15 10
2 ~1 IL-23/ IL-12 각각 0.5 0 NC 0.56 10
3 0.8 IL-12 0.75 0 NC 0.58 13
4 ~1 IL-23 0.75 0.1 NC 0.37 8
5 1 IL-12 0.5 0.1 NC 0.38 11
6 ~1 IL-23 0.1 0.1 NC 0.08 12
7 1 IL-12 0.1 0.1 NC 0.50 9
8 ~0.5 IL-23 0.05 0.1 NC 0.10 11
9 0.5 IL-12 0.05 0.1 NC 0.83 11
10 ~0.5 IL-23 0.05 0.1 NC 0.17 8
11 0.5 IL-12 0.025 0.1 NC 0.91 12
12 ~0.5 IL-23 0.025 0.1 NC 0.05 12
[표 3]
PN-IL-23에 사용되는 조건
라운드 # RNA 풀 농도 (μM) 단백질 유형 단백질 농도 (μM) tRNA 농도 (mg/mL) neg neg IL-12 농도 (μM) 용출 % PCR 역치
1 3.3 IL-23 1 0 없음 0 4.38 10
2 ~1 IL-23 1 0 NC 0 0.85 10
3 0.8 IL-23 0.75 0.1 NC/IL-12 0.75 1.15 10
4 ~1 IL-23 0.75 0.1 NC/IL-12 0.75 0.59 10
5 0.7 IL-23 0.5 0.1 NC/IL-12 0.5 4.19 10
6 ~1 IL-23 0.1 0.1 NC/IL-12 0.5 0.05 14
7 1 IL-23 0.1 0.1 NC/IL-12 0.5 0.38 10
8 ~1 IL-23 0.1 0.1 NC/IL-12 0.3 0.18 15
9 1 IL-23 0.1 0.1 NC/IL-12 0.5 2.81 8
10 ~1 IL-23 0.05 0.1 NC/IL-12 0.5 0.21 10
11 ~1 IL-23 0.05 0.1 NC/IL-12 0.5 1.35 12
rRfY 선별 진행의 모니터링 . 이 선별 전반에 걸쳐 도트 블롯 결합 분석을 수행하여 풀의 단백질 결합 친화성을 모니터링하였다. 추적용 32P-표지된 RNA를 희석 시리즈의 h-IL-23과 조합하고 최종 20 μL의 부피에 있어서 0.1 mg/mL의 tRNA + 1X SHMCK (20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7.4)에서 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 결합 반응물은 Minifold I 도트-블롯, 96웰 진공 여과 다기관 (manifold) (Schleicher & Schuell, 미국 뉴햄프셔주 킨 소재)을 사용하여 니트로셀룰로오스 여과로 분석하였다. (상부로부터 기저부로) Protran 니트로셀룰로오스 (Schleicher & Schuell), Hybond-P 나일론 (Amersham Biosciences) 및 GB002 겔 블롯 페이퍼 (Schleicher & Schuell)로 이루어진 3층 여과 매체를 사용하였다. 단백질에 결합하는 RNA를 니트로셀룰로오스 필터 상에 포획하고, 반면, 단백질 비결합 RNA는 나일론 필터 상에 포획하였다. 겔 블롯 페이퍼는 단순히 다른 필터의 지지 매체로서 포함시켰다. 여과 후, 필터 층을 분리하고, 건조시키고, 인광체 스크린 (Amersham Biosciences, 미국 뉴저지주 피스카타웨 이 소재) 상에 노출시키고 Storm 860 Phosphorimager (등록상표) 블롯 이미징 시스템 (Amersham Biosciences)을 사용하여 정량화하였다.
h-IL-23의 부재에 대하여 h-IL-23의 존재 하에서 RNA의 결합의 유의한 양성 비가 보여질 때, 이 풀을 제조업자의 지시에 따라 TOPO TA 클로닝 키트 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 클로닝하였다. h-IL-23 및 X-IL-23 선별에 있어서, 라운드 8의 풀의 주형을 클로닝하고, 각각의 선별로부터의 32개의 개개의 클론을 1-포인트 도트 블롯 스크린 (+/-75 nM h-IL-23, 이외에도 +/-75 nM h-IL-12에서 개별적인 스크린에서) 분석하였다. PN-IL-23 선별에 있어서, 라운드 10의 풀을 클로닝 및 서열 결정하고, 8개의 특유한 클론을 1-포인트 도트 블롯 스크린 (+/-200 nM h-IL-23, 그리고 +/-200nM h-IL-12에서의 개별적인 스크린에서) 단백질 결합에 대하여 분석하였다. 그 후, 라운드 10의 PN-IL-23 풀과, R12의 PN-IL-23 풀을 추가의 서열을 위하여 재클로닝하고, 이 클론을 1-포인트 도트 블롯 스크린 (+/-100 nM h-IL-23 또는 +/-200 nM h-IL-12)에서 단백질 결합에 대하여 분석하였다. KD 결정에 있어서, 클론 전사체는, 초기 스크린에서 우수한 +/-h-IL-23 결합 비를 갖는 모든 특유한 서열에 있어서 도트 블롯 분석에서 희석 시리즈의 h-IL-23 (R&D Systems, 미국 미네소타주 미니아폴리스 소재)를 사용하여, 그리고 1:1의 RNA:단백질 복합체를 설명하는 등식을 생성된 데이터에 맞추어서 결정하였다 (결합 앱타머의 분율 = 진폭*([IL-23]/(KD + [IL-23])) (KaleidaGraph v.3.51, Synergy Software). 단백질 결합 특성화의 결과가 표 4a 내지 표 4c에 나 타내어져 있다. h-IL-23에 대하여 높은 친화도를 갖는 클론을 준비하고 하기 실시예 3에 기술되어 있는 세포 기재의 분석에서 기능성에 대하여 스크리닝하였다.
[표 4a]
rRfY 클론 결합 활성 (모든 측정은 0.1 mg/mL의 tRNA의 존재 하에 행함)
라운드 8의 h-IL-23 1-pt 스크린 데이터
서열 번호 클론명 IL-23의 KD (nM) IL-12의 KD (nM) IL-12의 KD /IL-23의 KD +/- IL-23 75 nM +/- IL-12 75 nM
15 AMX86-B5 195.5 N.B. 5.79 1.01
27 AMX86-C5 80.3 399.8 4.98 6.23 2.65
13 AMX86-D5 27.4 N.B. 7.17 1.52
16 AMX86-D6 25 N.B. 9.82 1.43
24 AMX86-E6 51.3 N.B. 9.02 1.13
22 AMX86-F6 69.1 N.B. 10.17 1.36
18 AMX86-A7 57.7 667.9 11.58 3.99 1.59
14 AMX86-B7 111 934.1 8.42 7.81 1.46
20 AMX86-C7 140.3 N.B. 4.65 0.77
19 AMX86-E7 210.2 267.5 1.27 6.79 1.23
21 AMX86-F7 147 106.4 0.72 13.07 2.49
25 AMX86-H7 89.8 N.B. 10.85 1.26
26 AMX86-C8 107.1 N.B. 5.28 1.17
23 AMX86-D8 294.2 N.B. 6.87 1.08
17 AMX86-G8 133.7 2493.1 18.65 7.26 2.05
[표 4b]
라운드 8의 X-IL-23 1-pt 스크린 데이터
서열 번호 클론명 IL-23의 KD (nM) IL-12의 KD (nM) IL-12의 KD /IL-23의 KD +/- IL-23 75 nM +/- IL-12 75 nM
41 AMX86-A9 190.5 N.B. 3.55 0.68
35 AMX86-B9 23.7 847.6 35.76 12.88 1.96
32 AMX86-C9 97.9 672.8 6.87 6.07 1.86
33 AMX86-G9 109.4 N.B. 10.03 1.04
39 AMX86-H9 104.6 331.5 3.17 10.35 3.66
34 AMX86-A10 460.9 289.4 0.63 6.64 1.40
28 AMX86-B10 77.8 1038.3 13.35 4.73 2.12
42 AMX86-E10 218.1 904.6 4.15 2.44 1.37
36 AMX86-G10 73.7 356.1 4.83 9.88 2.41
37 AMX86-All 157.2 182.4 1.16 7.05 3.23
29 AMX86-B11 179.9 5950 33.07 9.23 1.69
30 AMX86-D11 198.9 113.9 0.57 10.26 2.59
38 AMX86-F11 255.64 540.6 2.11 7.33 2.87
40 AMX86-H11 366.9 214.9 0.59 7.56 3.02
31 AMX86-F12 423.7 2910.3 6.87 11.88 2.51
[표 4c]
PN-IL-23 클론 1-pt 스크린 데이터
서열 번호 클론명 PN-IL-23 IL-23의 KD (nM) IL-12의 KD (nM) +/- IL-23 200 nM +/- IL-23 100 nM +/- IL-12 200 nM
43 AMX84-A10 R10 22.3 N.B. 39.6 2.9
44 AMX84-B10 R10 21.8 N.B. 22.7 1.3
45 AMX84-A11 R10 17.8 N.B. 32.7 1.8
46 AMX84-F11 R10 16.6 N.B. 22.5 0.8
47 AMX84-E12 R10 27.8 N.B. 15.8 0.8
48 AMX84-C10 R10 94.3 N.B. 17.7 2.2
49 AMX84-C11 R10 15.5 286.1 23.4 2.7
50 AMX84-G11 R10 290.7 N.B. 22.3 1.7
51 ARX33-plate1-H01 R12 77.8 N.B. 20.3 1.7
52 AMX91-F11 R10 201.7 N.B. 11.4 2.2
53 AMX91-G1 R10 82.3 N.B. 52.2 1.7
54 AMX91-E3 R10 205.3 N.B. 34.4 2.9
55 AMX91-H3 R10 265.7 N.B. 18.5 2.3
56 AMX91-B5 R10 148.5 N.B. 11.2 0.9
57 AMX91-A6 R10 60.3 N.B. 6.3 1.1
58 AMX91-G7 R12 63.6 N.B. 38.1 1.9
59 AMX91-H7 R12 71.0 N.B. 44.7 1.4
60 AMX91-B8 R12 17.6 409.1 34.0 7.9
61 AMX91-H8 R12 16.6 243.2 25.2 4.1
62 AMX91-G9 R12 33.0 N.B. 31.7 1.1
63 AMX91-D9 R12 44.6 N.B. 25.1 2.1
64 AMX91-G11 R12 104.4 N.B. 12.5 1.7
65 AMX91-C12 R12 30.7 N.B. 22.9 1.9
66 AMX91-H12 R12 60.8 N.B. 48.6 1.2
N.B. = 유의한 결합이 전혀 관찰되지 않음
표 5a 내지 5e에서 특성화된 rRfY 앱타머의 핵산 서열이 하기에 주어져 있다. 하기의 각각의 앱타머의 특유한 서열은 서열 GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGA (서열 번호 11) 직후의 뉴클레오티드 25에서 시작되며 이 서열이 3' 고정 핵산 서열 GCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA (서열 번호 12)을 만날 때까지 나아간다.
달리 나타내지 않는 한, 하기에 열거된 개개의 서열은 5'에서 3' 배향으로 나타내어지며, IL-23 및/또는 IL-12에 결합하고 rRfY SELEX (상표명) 조건 하에서 선별되는 서열을 나타내며, 여기서, 퓨린 (A 및 G)은 2'-OH이고 피리미딘 (U 및 C) 은 2'-플루오로이다. 표 5a 내지 5e에 열거되어 있는 서열 각각은 폴리알킬렌 글리콜 ("PAG") 부분으로 유도체화될 수 있으며, 캡핑 (예를 들어, 3'-역위 dT)DMF 포함할 수 있거나 포함할 수 없다.
[표 5a]
Figure 112006072186688-PCT00009
[표 5b]
Figure 112006072186688-PCT00010
[표 5c]
Figure 112006072186688-PCT00011
[표 5d]
Figure 112006072186688-PCT00012
[표 5e]
Figure 112006072186688-PCT00013
상기에 기술되어 있는 도트 블롯 결합 분석으로 측정되는 바와 같이 IL-23 표적 단백질에 대한 결합 활성을 갖는, 그리고 세포 기재의 분석 (하기 실시예 3에 기술되어 있음)에서 기능성인 서열을 최소화하였다 (하기 실시예 2에 기술되어 있음).
실시예 1B: 리보/2'O-Me 뉴클레오티드 함유 풀을 이용한 인간 IL-23에 대한 IL-23 선별
2회의 선별을 수행하여 리보/2'O-메틸 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머를 확인하였다. 하나의 선별에서는 2'O-메틸 A, C 및 U와 2'OH G (rGmH)를 사용하였으며, 다른 선별에서는 2'-OMe C, U 및 2'-OH G, A (rRmY)를 사용하였다. 상기 선별 둘 모두 소수성 플레이트 상에 고정화된 h-IL-23에 대한 직접적인 선별이었다. p19 또는 p40 서브도메인에 특이적인 앱타머의 선별에 편향된 단계는 취하지 않았다. 상기 선별 둘 모두에 의해 나이브 (naive) 미선별 풀에 대하여 h-IL-23 결합에 대하여 유의하게 농후화된 풀이 생성되었다. 개개의 클론의 서열이 본원에 보 고되어 있으며, h-IL-23 결합 데이터가 선별된 개개의 클론에 대하여 제공되어 있다.
풀의 제조. 서열 5'- GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN30CGCTGTCGATCGATCGATCGATG-3' (ARC256, 서열 번호 3)을 갖는 DNA 주형을 ABI EXPEDITE (상표명) DNA 합성기를 사용하여 합성하고, 표준 방법으로 탈보호하였다. 이 DNA 주형 (서열 번호 3) 중의 N 시리즈는 임의의 조합의 뉴클레오티드일 수 있으며 생성되는 앱타머의 특유한 서열 영역을 생성한다.
이 주형은 5' 프라이머인 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3' (서열 번호 67) 및 3' 프라이머인 5'-CATCGATCGATCGATCGACAGC-3' (서열 번호 68)으로 증폭시키고 이어서 Y639F 단일 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관내 전사에 있어서의 주형으로 사용하였다. 전사는 200 mM Hepes, 40 mM DTT, 2 mM 스페르미딘, 0.01% 트리톤 X-100, 10% PEG-8000, 5 mM MgCl2, 1.5 mM MnCl2, 500 μM NTP, 500 μM GMP, 0.01 단위/μL의 무기 파이로포스파타제, 및 2 ㎍/mL의 Y639F 단일 돌연변이 T7 폴리머라제를 사용하여 37℃에서 하룻밤 행하였다. 두 가지 상이한 조성물, rGmH 및 rRmY를 전사시켰다.
선별. 각각의 선별 라운드는 100 μL의 1X 둘베코 PBS (DPBS (+Ca2 +, Mg2 +))에서 실온에서 2시간 동안 Nunc Maxisorp 소수성 플레이트의 표면에 20 pmoles의 h-IL-23을 고정화함으로써 개시하였다. 이어서 상청액을 제거하고 웰을 120 μL의 세척 완충제 (1X DPBS, 0.2% BSA 및 0.05% 트윈-20)로 4회 세척하였다. 풀의 RNA 를 90℃로 3분 동안 가열하고 실온으로 10분 동안 냉각시켜 재폴딩시켰다. 라운드 1에서, 양성 선별 단계를 수행하였다. 간략하게는, 1 x 1014개의 분자 (0.2 nmoles)의 풀의 RNA를 고정화 단백질 표적을 포함하는 웰에서 100 μL의 결합 완충제 (1X DPBS 및 0.05% 트윈-20)에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서 상청액을 제거하고 웰을 120 μL의 세척 완충제로 4회 세척하였다. 후속 라운드에서 음성 선별 단계를 포함시켰다. 풀의 RNA를 빈 웰에서 실온에서 30분 동안 또한 항온처리하여 양성 선별 단계 전에 풀로부터 모든 플라스틱 결합 서열을 제거하였다. 세척 횟수를 라운드 4 후에 증가시켜 엄격도를 증가시켰다. 모든 경우에, 고정화 h-IL-23에 결합된 풀의 RNA를 RT 믹스 (3' 프라이머, (서열 번호 68) 및 Thermoscript (상표명) RT (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 첨가하고 이어서 65℃에서 1시간 동안 항온처리함으로써 선별 플레이트에서 직접적으로 역전사시켰다.
생성된 cDNA를 Taq 폴리머라제 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 베벌리 소재)를 사용하여 PCR용 주형으로 사용하였다. 60℃ 어닐링 온도와 커플링된 "핫 스타트 (hot start)" PCR 조건을 사용하여 프라이머-이량체 형성을 최소화하였다. 증폭시킨 풀의 주형 DNA는 Centrisep 컬럼 (Princeton Separations, 미국 뉴저지주 아델피아 소재)을 이용하여 제조업자가 권고하는 조건에 따라 탈염시키고, 이를 사용하여 다음 라운드의 선별을 위한 풀의 RNA를 전시시켰다. 전사시킨 풀을 매 라운드마다 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 겔 정제하였다. 표 6에는 선별 라 운드 당 사용되는 RNA 농도가 예시되어 있다.
[표 6]
선별 라운드 당 RNA 풀의 농도
라운드 rRmY (사용되는 풀의 pmoles) rGmH (사용되는 풀의 pmoles)
1 200 200
2 110 40
3 65 100
4 50 170
5 80 100
6 100 110
7 50 70
8 120 60
9 120 80
10 130
11 110
선별의 진행은 실시예 1A에 기술되어 있는 바와 같이 도트 블롯 샌드위치 필터 결합 분석법을 사용하여 모니터링하였다. 5'-32P-표지 풀 RNA를 90℃에서 3분 동안 재폴딩시키고 실온으로 10분 동안 냉각시켰다. 다음, 풀 RNA (미량농도)를 h-IL-23 DPBS + 0.1 mg/mL의 tRNA와 함께 실온에서 30분 동안 항온처리하고 이어서 도트 블롯 장치 (Schleicher and Schuell)의 니트로셀룰로오스 및 나일론 필터 샌드위치에 적용하였다. 니트로셀룰로오스에 결합된 풀 RNA의 백분율을 계산하고 단일 포인트 스크린 (+/- 250 nM h-IL-23)을 이용하여 대략 매 3라운드마다 모니터링하였다. 풀의 KD 측정치는 상기한 바와 같이 도트 블롯 장치와 h-IL-23 단백질 (R&D, 미국 미네소타주 미니아폴리스 소재)의 적정을 사용하여 측정하였다.
rRmY h-IL-23 선별은 4회의 라운드의 선별 후 나이브 풀에 대하여 h-IL-23 결합을 풍부화하였다. 선별 상의 엄격도를 증가시키고 선별을 8회의 추가의 라운 드 동안 계속하였다. 라운드 9에서, 풀의 KD는 대략 500 nM 이상이었다. rGmH 선별은 라운드 10에서 나이브 풀 결합에 대하여 농후화하였다. 풀의 KD는 또한 대략 500 nM 이상이었다. 도 7은 h-IL-23에 대한 rRmY 및 rGmH 풀 선별 결합의 결합 곡선이다. 풀은 TOPO TA 클로닝 키트 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 클로닝하고 개개의 서열을 생성하고 결합에 대하여 시험하였다. 처음에 단일 포인트 결합 스크린을 1:200 희석의 +/- 200 nM IL-23 + 0.1 mg/mL 경쟁자 tRNA를 사용하여 모든 조 rRmY 클론 전사 상에서 수행하였다. 이어서 단일 포인트 스크린에서 최고 결합을 나타낸 24개의 rRmY 클론 상에서 10 포인트 스크린을 수행하였다. 3배의 연속 희석물 중 0 내지 480 nM의 IL-23을 사용하여 10 포인트 스크린을 수행하였다. 결합 곡선을 생성하고 (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software) KD는 데이터를 하기 등식: 결합 RNA의 분율 = 진폭 * [h-IL-23] /KD + [h-IL-23])에 맞춤으로써 개산하였다. 하기 표 7에는 h-IL-23에 대하여 결합 친화성을 나타내는 rRmY 선별된 앱타머의 서열 데이터가 예시되어 있다. 하나의 군의 6개의 이중 서열 및 4개의 쌍의 2개의 이중 서열이 rRmY 클론으로부터 생성되었다. 표 8에는 상기와 같이 시험된 rRmY 클론의 결합 특징이 예시되어 있다. 클론은 또한 1:200의 희석의 48개의 조 rGmH 클론의 전사로부터의 클론도 시험하였으며 0.1 mg/mL의 tRNA를 경쟁자로 사용하였다. 배경에 대한 평균 결합은 단지 약 14%였으며, 반면, 동일한 분석에 있어서 rRmY 클론의 평균은 약 30%였고, 10개의 클론은 40%보다 컸다. 시험한 rGmH 클론의 서열 및 결합 특징은 예시되어 있지 않다.
표 7에서 특성화되어 있는 rRmY 앱타머의 핵산 서열이 하기에 주어져 있다. 표 7에 있어서 각각의 앱타머의 특유한 서열은 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (서열 번호 69) 직후에 뉴클레오티드 23에서 시작되며, 이것이 3' 고정 핵산 서열 GCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG (서열 번호 70)을 만날 때까지 전진한다.
달리 나타내지 않는 한, 하기에 열거되어 있는 각각의 서열은 5'에서 3'으로 나타내어져 있으며, IL-23 및/또는 IL-12에 결합하고 rRmY SELEX (상표명) 조건 하에 선별되는 앱타머의 서열을 나타내는데, 여기서, 퓨린 (A 및 G)은 2'-OH이며 피리미딘 (U 및 C)은 2'-OMe이다. 표 7에 열거되어 있는 서열 각각은 폴리알킬렌 글리콜 ("PAG") 부분으로 유도체화될 수 있으며 캡핑 (예를 들어 3'-역위 dT)을 포함할 수 있거나 포함할 수 없다.
[표 7]
rRmY (라운드 10) 서열
Figure 112006072186688-PCT00014
[표 8]
rRmY IL-23 클론의 결합 데이터
서열 번호 IL-23 KD (nM)
72 211.4
83 8.2
86 219.3
80 3786.3
75 479.4
74 257.0
81 303.2
77 258.9
73 101.4
88 101.2
84 602.5
78 123.7
76 77.2
87 122.3
71 124.0
85 239.9
82 198.6
79 806.7
**분석은 1X DPBS (+Ca2 +, Mg2 +)에서 30분간 실온에서 항온처리하여 수행함.
* R&D IL-23 (캐리어 자유 단백질)
실시예 1C: 데옥시 /2'O- 메틸 뉴클레오티드 함유 풀을 이용한 인간 IL -23에 대한 선별
h-IL-23 전략을 이용하여 데옥시 퓨린 (A 및 G)과 2'-O-Me 피리미딘 (C 및 U)을 사용하여 대안적인 선택을 수행하여 IL-23에 특이적인 안정화 앱타머를 수득하였다.
풀의 제조. 서열 5'- GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN30CGCTGTCGATCGATCGATCGATG-3' (ARC256, 서열 번호 3)을 갖는 DNA 주형을 ABI EXPEDITE (상표명) DNA 합성기를 사용하여 합성하고 표준 방법으로 탈보호하였다. 이 DNA 주형 (서열 번호 3) 중의 N 시리즈는 임의의 조합의 뉴클레오티드일 수 있으며 생성되는 앱타머의 특유한 서열 영역을 생성한다. 이 주형은 5' 프라이머인 5'- TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3' (서열 번호 67) 및 3' 프라이머인 5'-CATCGATCGATCGATCGACAGC-3' (서열 번호 89)으로 증폭시키고 이어서 Y639F 단일 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관내 전사에 있어서의 주형으로 사용하였다. 전사는 200 mM Hepes, 40 mM DTT, 2 mM 스페르미딘, 0.01% 트리톤 X-100, 10% PEG-8000, 9.6 mM MgCl2, 2.9 mM MnCl2, 2 mM NTP, 2 mM GMP, 2 mM 스페르민, 0.01 단위/μL의 무기 파이로포스파타제, 및 2 ㎍/mL의 Y639F 단일 돌연변이 T7 폴리머라제를 사용하여 37℃에서 하룻밤 행하였다.
선별. 각각의 선별 라운드는 100 μL의 1X PBS에서 실온에서 1시간 동안 Nunc Maxisorp 소수성 플레이트의 표면에 20 pmoles의 h-IL-23을 고정화함으로써 개시하였다. 이어서 상청액을 제거하고 웰을 120 μL의 세척 완충제 (1X PBS, 0.1 mg/mL의 tRNA 및 0.1 mg/mL의 연어 정자 DNA ("ss DNA"))로 5회 세척하였다. 라운드 1에서, 양성 선별 단계를 수행하였다: 100 pmoles의 풀의 RNA (6 x 1013개의 특유한 분자)를 고정화 단백질 표적을 포함하는 웰에서 100 μL의 결합 완충제 (1X PBS, 0.1 mg/mL의 tRNA 및 0.1 mg/mL의 ssDNA)에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서 상청액을 제거하고 웰을 120 μL의 세척 완충제로 5회 세척하였다. 후속 라운드에서 음성 선별 단계를 포함시켰다. 풀의 RNA를 빈 웰에서 실온에서 1시간 동안 또한 항온처리하여 양성 선별 단계 전에 풀로부터 모든 플라스틱 결합 서열을 제거하였다. 라운드 3에서 출발하여, 제2 음성 선별 단계를 도입하였다. 표적 고정화 웰을 양성 선별 단계 전에 100 μL의 차단 완충제 (1X PBS, 0.1 mg/mL의 tRNA, 0.1 mg/mL의 ssDNA 및 0.1 mg/mL의 BSA)에서 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 모든 경우에, 고정화 h-IL-23에 결합된 풀의 RNA를 RT 믹스 (3' 프라이머, (서열 번호 89) 및 Thermoscript (상표명) RT (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 첨가하고 이어서 65℃에서 1시간 동안 항온처리한 후 선별 플레이트에서 직접적으로 역전사시켰다. 생성된 cDNA를 Taq 폴리머라제 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 베벌리 소재)를 사용하여 PCR용 주형으로 사용하였다. 68℃ 어닐링 온도와 커플링된 "핫 스타트" PCR 조건을 사용하여 프라이머-이량체 형성을 최소화하였다. 증폭시킨 풀의 주형 DNA는 Micro Bio-Spin 컬럼 (Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 헤라클레스 소재)을 이용하여 제조업자가 권고하는 조건에 따라 탈염시키고, 이를 사용하여 다음 라운드의 선별을 위한 풀의 RNA를 프로그램 전시시켰다. 전사시킨 풀을 매 라운드마다 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 겔 정제하였다.
단백질 결합 분석. 선별의 진행은 이전에 실시예 1A에 기술한 바와 같이 샌드위치 필터 결합 분석법을 사용하여 모니터링하였다. 5'-32P-표지 풀 RNA를 h-IL-23, 1X PBS + 0.1 mg/mL의 tRNA, 0.1 mg/mL의 ssDNA 및 0.1 mg/mL의 BSA와 함께 실온에서 30분 동안 항온처리하고 이어서 도트 블롯 장치 (Schleicher and Schuell, 미국 뉴햄프셔주 킨 소재)의 니트로셀룰로오스 및 나일론 필터 샌드위치에 적용하였다. 니트로셀룰로오스에 결합된 풀 RNA의 백분율은 h-IL-23 (0.25 nM, 0.5 nM, 1 nM, 4 nM, 16 nM, 64 nM 및 128 nM)을 이용한 7 포인트 스크린을 이용하여 계산 하였다. 풀의 KD 측정치는 이전에 기술한 바와 같이 계산하였다.
dRmY IL-23 선별은 6회의 라운드의 선별 후 나이브 풀에 대하여 h-IL-23 결합을 풍부화하였다. 라운드 8에서, 풀의 KD는 대략 54nM 이상이었다. 라운드 6, 7 및 8의 풀은 TOPO TA 클로닝 키트 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 클로닝하고 개개의 서열을 생성하였다. 표 9에는 라운드 6, 7 및 8의 풀로부터 생성된 dRmY 클론의 서열이 열거되어 있다. 단백질 결합 분석을 각각의 클론에 대하여 수행하였다. 결합 분석은 1X PBS + 0.1 mg/mL의 tRNA, 0.1 mg/mL의 연어 정자 DNA, 0.1 mg/mL의 BSA에서, 실온에서의 30분간의 항온처리을 위하여 수행하였다. 표 10은 이러한 개개의 서열에 있어서의 결합 특징을 포함한다.
표 9에서 특성화되어 있는 dRmY 앱타머의 핵산 서열이 하기에 주어져 있다. 하기의 각각의 앱타머의 특유한 서열은 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (서열 번호 69) 직후에 뉴클레오티드 23에서 시작되며, 이것이 3' 고정 핵산 서열 GCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG (서열 번호 90)을 만날 때까지 전진한다.
달리 나타내지 않는 한, 하기에 열거되어 있는 각각의 서열은 5'에서 3'으로 나타내어져 있으며, IL-23 및/또는 IL-12에 결합하고 dRmY SELEX (상표명) 조건 하에 선별되는 앱타머의 서열을 나타내는데, 여기서, 퓨린 (A 및 G)은 데옥시이며 피리미딘 (U 및 C)은 2'-OMe이다. 표 9에 열거되어 있는 서열 각각은 폴리알킬렌 글리콜 ("PAG") 부분으로 유도체화될 수 있으며 캡핑 (예를 들어 3'-역위 dT)을 포함할 수 있거나 포함할 수 없다.
[표 9]
dRmY IL-23 클론의 서열
Figure 112006072186688-PCT00015
[표 10]
dRmY IL-23 앱타머 결합 데이터
서열 번호 IL-23의 KD (nM) IL-12의 KD (nM)
91 4.0 17.2
92 26.0 37.1
93 186.2 시험하지 않음
94 17.1 93.0
95 432.6 시험하지 않음
96 209.7 시험하지 않음
97 NB NB
**분석은 1X PBS + 0.1 mg/mL의 tRNA, 0.1 mg/mL의 ssDNA, 0.1 mg/mL의 BSA에서 실온에서 30분 동안 항온처리하여 수행함.
** R&D IL-23 (캐리어 자유 단백질)
N.B. = 결합이 전혀 검출될 수 없음.
실시예 1D: 데옥시 /2'O- 메틸 뉴클레오티드 함유 풀을 이용한 인간 IL -23에 대한 추가 선별
도입: 데옥시/2'O-메틸 뉴클레오티드를 함유하는 풀을 사용하여 h-IL-23에 대한 앱타머를 동정하기 위해 3개의 선별 방법을 사용하였다. 이들 선별은 2'O-Me C 및 U, 및 데옥시 A 및 G를 사용하였다. 제1 선별 방법(dRmY h-IL-23)은 h-IL-23에 대한 직접 선별이었다. 제2 선별 방법(dRmY h-IL-23/IL-12음성)에서는, h-IL-23에 대해 독특한 서브도메인(subdomain)인 p19에 결합하는 앱타머를 농축시키기 위해, 음성 선별 단계에 h-IL-12를 포함시켰다. 제3 선별 방법(dRmY h-IL-23-S)에서는, 친화도가 더 높은 앱타머를 선별하기 위해, 장시간 세척을 비롯하여 증가된 엄중도(stringency)를 양성 선별에서 사용하였다. 상기 3개의 선별 방법으로 h-IL-23에 대한 앱타머를 얻었다. 몇몇 앱타머는 h-IL-23에 대해 특이적이고, 몇몇은 h-IL-23과 h-IL-12 사이에서 교차 반응성을 나타낸다.
dRmY 선별: dRmY h-IL-23 선별의 라운드(round) 1은 서열 5'-GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC-N30-GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG-3'(ARC520)(서열 번호 98)을 가진, 2'O-Me C 및 U, 및 데옥시 A 및 G 변형된 RNA 풀의 3×1014 분자를 사용하여 시작하였으며, 상기 서열은 ABI EXPEDITETM DNA 합성기를 사용하여 합성하고, 표준 방법으로 탈보호화시켰다. 상기 주형(서열 번호 98) 중 일련의 N은 뉴클레오티드의 임의 조합일 수 있으며, 생성된 앱타머의 독특한 서열 영역을 초래한다.
각각의 선별 라운드는 1× PBS 100 ㎕에서 1시간 동안 실온에서 Nunc Maxisorp 소수성 플레이트의 표면에 h-IL-23 20 pmole을 고정시켜 개시하였다. 그 뒤, 상청액을 제거하고, 세척 완충액 120 ㎕[1× PBS, 0.1 ㎎/㎖ tRNA 및 0.1 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA("ssDNA")]로 웰을 5회 세척하였다. 라운드 1에서는, 풀 DNA 500 pmole(3×1014 분자)을 고정된 단백질 표적이 있는 웰에서 1시간 동안 결합 완충액 100 ㎕(1× PBS, 0.1 ㎎/㎖ tRNA 및 0.1 ㎎/㎖ ssDNA)에서 항온처리하였다. 그 뒤, 상청액을 제거하고, 세척 완충액 120 ㎕로 웰을 5회 세척하였다. 후속 라운드에서도 음성 선별 단계가 포함되는데, 이는 양성 선별 단계를 수행하기 전에 풀로부터 임의의 가소성 결합 서열을 제거하기 위해, 풀 RNA를 비어있는 웰에서 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다.
라운드 3의 시작 시, 제2 음성 선별 단계를 도입하였다. 양성 선별 단계를 수행하기 전에 차단 완충액 100 ㎕(1× PBS, 0.1 ㎎/㎖ tRNA, 0.1 ㎎/㎖ ssDNA 및 0.1 ㎎/㎖ BSA)로 실온에서 1시간 동안 차단시킨 표적-고정화 웰에서 상기 풀을 1시간 동안 항온처리하였다(표 11A). 라운드 3에서, h-IL-12 20 pmole로 실온에서 1시간 동안 차단시키고 세척 완충액 120 ㎕로 5회 세척한 웰에서, 상기 풀을 실온에서 추가 1시간 동안 음성 항온처리 단계에 적용하여, dRmY h-IL-23 풀을 dRmY h-IL-23/IL-12음성 선별로 분리하였는데, 이는 양성 h-IL-23 양성 항온처리 전에 수행하였다. 상기 풀은 엄중도를 증가시키기 위해 이후의 라운드에서 추가 h-IL-12 차단된 웰로 분리하였다(표 11B 참조).
h-IL-23과 h-IL-12 결합 간의 식별력을 증가시키기 위한 추가 방법은 저농도에서 풀과 함께 양성 선별에 h-IL-12를 첨가하는 것으로서, 특이적 h-IL-23 바인더는 고정된 h-IL-23에 결합할 것이고, h-IL-12 바인더는 1시간의 항온처리 후 세척될 것이다. dRmY h-IL-23-S 선별은 양성 선별에서 "엄중한 세척"이 추가된 라운드 6에서 dRmY h-IL-23 풀로부터 분리되었고, h-IL-23과의 1시간 항온처리 후, 풀을 제거하고, 이어서 1× PBS 100 ㎕, 0.1 ㎎/㎖ tRNA 및 0.1 ㎎/㎖ ssDNA를 첨가하고 30분간 항온처리하였다(표 11C). 친화도가 높은 분자를 선별하기 위해, 상기 엄중한 세척 방법을 제거 및 반복하였다.
모든 경우에서, 고정된 h-IL-23에 결합된 풀 RNA는 RT 믹스[3' 프라이머, 5'-CATCGATGATCGATCGATCGAC-3'(서열 번호 100)] 및 ThermoscriptTM RT(캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)를 첨가한 뒤, 1시간 동안 65℃에서 항온처리하여, 선별 플레이트에서 직접 역 전사시켰다. 생성된 cDNA는 PCR용 주형으로 사용하였다[20 mM Tris pH 8.4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.5 μM의 5' 프라이머 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3'(서열 번호 99), 0.5 μM의 3' 프라이머(서열 번호 100), 각 dNTP 0.5 mM, 0.05 유니트/㎕ Taq 폴리머라제(매사츄세츠주 베벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이로랩스)]. PCR 반응은 다음의 사이클 조건 하에서 수행하였다: a) 30초간 94℃; b) 30초간 55℃; c) 30초간 72℃. 충분한 PCR 생성물을 얻을 때까지 상기 사이클을 반복하였다. 충분한 PCR 생성물을 얻기 위해 필요한 최소 사이클 수는 "PCR 역치"로서 하기 표 11A 내지 11C에 기재되어 있다.
PCR 주형은 QIAquick PCR 정제 키트(캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하고, 후속 선별 라운드를 위해 풀 RNA의 전사를 프로그래밍하는 데 사용하였다. 주형은 200 mM Hepes, 40 mM DTT, 2 mM 스페르미딘, 0.01% Triton X-100, 10% PEG-8000, 9.6 mM MgCl2, 2.9 mM MnCl2, 2 mM NTP, 2 mM GMP, 2 mM 스페 르민, 0.01 유니트/㎕ 무기 피로포스파타제 및 2 ㎍/㎖ Y639F 단일 돌연변이 T7 폴리머라제를 사용하여 37℃에서 밤새 전사시켰다. 전사 반응은 50 mM EDTA로 켄칭하고, 에탄올 침전시킨 뒤, 1.5 mm 변성 폴리아크릴아미드 겔(8 M 우레아, 10% 아크릴아미드; 아크릴 아미드:비스아크릴아미드 = 19:1) 상에서 정제하였다. 풀 RNA는 37℃에서 300 mM NaOAc, 20 mM EDTA에서 수동 용출한 뒤 에탄올 침전시켜, 겔로부터 제거하였다. 각각의 라운드에 대한 선별 조건은 하기 표에 나타나 있다.
[표 11A]
Figure 112006072186688-PCT00016
[표 11B]
Figure 112006072186688-PCT00017
[표 11C]
Figure 112006072186688-PCT00018
단백질 결합 분석: 실시예 1A에서 상술한 바와 같이, 풀의 단백질 결합 친화도를 모니터링하기 위해, 선별 내내 도트 블롯 결합 분석을 수행하였다. h-IL-23의 존재 대(vs.) h-IL-23의 부재 하에 RNA 결합의 유의적인 양성 비율이 드러나는 경우, 상기 풀은 제조업자의 지시에 따라 TOPO TA 클로닝 키트(캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)를 사용하여 클로닝하였다. 6 라운드를 통과한 풀로부터 유 사한 서열이 상기 3회의 선별 모두에서 드러났으며, 상기 3회의 선별에서 45개의 독특한 클론이 스크리닝을 위해 선택되었다. 상기 45개의 클론은 ABI EXPEDITETM DNA 합성기 상에서 합성한 뒤, 표준 방법으로 탈보호화시켰다. 상기 45개의 개별 클론은 10% PAGE 겔 상에서 겔 정제하였고, RNA는 300 mM NaOAc 및 20 mM EDTA에서 수동 용출한 뒤, 에탄올 침전시켰다.
클론은 γ-32P ATP로 5' 말단 표지시키고, 3-포인트 도트 블롯 스크린(h-IL-23 0 nM, 20 nM 및 100 nM; h-IL-12 0 nM, 20 nM 및 100 nM)으로 IL-23 및 IL-12 결합 둘 다에 대해 분석하였다(데이터는 나타내지 않음). IL-23 및 IL-12 둘 다에 대해 20 nM 및 100 nM 단백질 조건에서 유의적인 결합을 나타내는 클론은, KD 결정을 위해 상술한 도트 블롯 분석에서 0 nM 내지 480 nM의 단백질 적정을 사용하여(3배 희석) 더 분석하였다. KD 값은 1:1 RNA:단백질 복합체를 나타내는 식을 얻은 데이터에 적합시켜 결정하였다(결합된 앱타머 단편 = 앰플리튜드*([IL-23]/(KD + [IL-23])) + 백그라운드 결합)(칼레이다그래프 버전. 3.51, 시너지 소프트웨어). 친화도가 더 높은 클론에 대한 단백질 결합 특성의 결과는 표 13에 나타나 있으며, 상응하는 클론 서열은 표 12에 열거되어 있다.
표 12에 나타낸 dRmY 앱타머의 핵산 서열은 다음과 같이 주어진다. 하기 각 앱타머의 독특한 서열은 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(서열 번호 101)에 이어 즉시 뉴클레오티드 23에서 시작하여, 3' 고정된 핵산 서열 GUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG(서열 번호 102)과 만날 때까지 계속된다.
달리 언급하지 않는다면, 하기에 열거되어 있는 각 서열들은 5'에서 3' 방향으로 나타나 있고, dRmY SELEXTM 조건 하에서 선별된 IL-23 및/또는 IL-12에 결합하는 앱타머의 서열을 나타내며, 여기서 퓨린(A 및 G)은 데옥시이고 피리미딘(C 및 U)은 2'-OMe이다. 표 12에 열거되어 있는 각각의 서열은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화되고, 캡핑(capping)(예, 3'-역 dT)을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수도 있다.
[표 12]
Figure 112006072186688-PCT00019
[표 13]
Figure 112006072186688-PCT00020
인간 IL -23 앱타머 선별 요약
IL-23 SELEXTM에 대한 상이한 선별 조건 및 방법으로, 상이한 결합 특성을 가지는 안정화 및/또는 최소화된 몇몇 앱타머를 수득하였다. rRfY 선별된 앱타머는 대략 15 nM 내지 460 nM의 범위에서 친화도를 가지고, 임의의 후-SELEXTM 최적화 전에 IC50s가 대략 50 nM 내지 5 μM 범위인 세포 효능을 가진다. 이들은 결합 특성의 적절한 증가와 함께 더 최소화시킬 수 있으며, 세포-기반 분석에서 증가된 효능을 나타낼 것이라 예상된다. 상기 앱타머는 또한 IL-12에 대한 IL-23의 식별력이 100 배 이상인, IL-23 사이에서 가장 구분이 잘 된다.
rRmY 선별 조건 하에서 수득한 앱타머는 대략 8 nM 내지 3 μM 범위의 친화도를 가진다. 그러나, 이들 세포의 효능은 rRfY 앱타머의 효능보다 더 낮다. rGmH 컨스트럭트(construct)에 대해 단일 포인트 스크린을 행하였으나, 더 이상 수행하지 않았는데, 이는 백그라운드에 대한 이의 결합 범위가 rRmY 클론만큼 우수하지 않기 때문이다. 48 미정제 rGmH 클론 전사체는 1:200 희석도에서 사용하였고, 0.1 ㎎/㎖ tRNA는 경쟁자로서 사용하였다. 백그라운드에 대한 평균 결합률은 단지 14%에 불과하지만, 동일한 분석에서 rRmY 클론의 평균 결합률은 약 30%이었고, 10 클론은 40%보다 더 높았다.
dRmY 선별된 앱타머는 ∼3 nM 내지 ∼200 nM의 범위에서 고 친화도를 가지고, 임의의 후-SELEXTM 최적화 전에, IC50s가 ∼50 nM 내지 ∼500 nM 범위인 현저한 세포 효능을 보인다(하기 실시예 3에 기재되어 있음). 또한 이들 앱타머의 일부는 IL-12에 대해 대략 4배의 IL-23에 대한 식별력을 보이는데, 이는 추가 최적화에 의해 개선될 수 있다.
실시예 1E: 2'-F 피리미딘 함유 풀( rRfY )을 이용한 마우스("m")- IL -23에 대한 선별
도입: 2'-OH 퓨린 및 2'-F 피리미딘 뉴클레오티드(rRfY 조성)로 이루어진 풀을 사용하여 mIL-23에 대한 앱타머를 동정하기 위해, 2가지 선별 방법을 사용하였다. 제1 선별 방법(mIL-23)은 mIL-23에 대한 직접 선별이었다. 제2 선별 방법(mIL- 23S)은 보다 엄중한 선별로서, 초기 라운드는 친화도가 더 높은 바인더에 대한 선별을 유도하고자 더 낮은 농도의 RNA 및 단백질을 가졌다. 상기 2가지 선별 방법으로 mIL-23에 대한 앱타머를 얻었다.
선별: 마우스 IL-23(인-하우스 분리함)과, γ-32P ATP 5' 말단 표지된 풀의 스파이크(spike)를 비롯하여, 서열 5' GGAGCGCACUCAGCCAC-N40-UUUCGACCUCUCUGCUAGC 3'(ARC275)(서열 번호 119)이 있는 2'F 피리미딘 변형된 풀의 2×1014 분자를 항온처리하면서 상기 2가지 선별(mIL-23 및 mIL-23S)을 시작하였다. 주형(서열 번호 119) 내의 일련의 N은 뉴클레오티드의 임의 조합이며, 생성된 앱타머의 독특한 서열 영역을 초래한다.
mIL-23 선별의 라운드 1에서, 풀 RNA는 1시간 동안 실온에서 최종 부피 100 ㎕에서 단백질 50 pmole과 함께 항온처리하였다. mIL-23S 선별의 라운드 1에서는, 풀 RNA를 1시간 동안 실온에서 최종 부피 1,300 ㎕에서 mIL-23 65 pmole과 함께 항온처리하였다. 선별은 1× PBS 완충액에서 수행하였다. RNA:mIL-23 복합체 및 유리 RNA 분자는 Schleicher & Schuell(Keene, NH)로부터 입수한 0.45 μm 니트로셀룰로스 스핀 컬럼을 사용하여 분리하였다. 상기 컬럼은 1 ㎖ 1× PBS로 사전 세척한 뒤, RNA:단백질 함유 용액을 상기 컬럼에 첨가하고, 1분간 2,000 rpm의 원심 분리기에서 스핀시켰다. 완충액으로 세척하여, 비특이적 바인더를 필터로부터 제거한 뒤(라운드 1, 2×500 ㎕ 1× PBS; 이후 라운드에서는, 특이적 바인더를 농축하기 위해 증가된 수 및 부피의 더 엄중한 세척을 수행함), 필터에 부착되어 있는 RNA: 단백질 복합체를 용출 완충액(7 M 우레아, 100 mM 아세트산나트륨, 3 mM EDTA, 90℃로 예열함) 2×200 ㎕ 세척액(이후 라운드에서는 2×100 ㎕ 세척액)으로 용출시켰다. 용출된 RNA는 침전시켰다(40 ㎍, 글리코겐, 1 부피 이소프로판올). 상기 RNA는 3'프라이머 5'GCTAGCAGAGAGGTCGAAA 3'(서열 번호 121)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라 ThermoscriptTM RT-PCR 시스템(캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)을 사용하여 역 전사시킨 뒤, PCR 증폭[20 mM Tris pH 8.4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.5 μM의 5' 프라이머, 5' TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC 3'(서열 번호 120), 0.5 μM의 3' 프라이머(서열 번호 121), dNTP 각각 0.5 mM, 0.05 유니트/㎕ Taq 폴리머라제(매사츄세츠주 베벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩)]시켰다. PCR 반응은 다음의 사이클 조건 하에서 수행하였다: a) 30초간 94℃; b) 30초간 60℃; c) 30초간 72℃. 충분한 PCR 생성물을 얻을 때까지 상기 사이클을 반복하였다. 충분한 PCR 생성물을 얻기 위해 필요한 최소 사이클 수는 "PCR 역치"로서 하기 표 14에 나타나 있다.
PCR 주형은 QIAquick PCR 정제 키트(캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. 주형은 α32P GTP 바디 표지(body labeling)를 사용하여 밤새 37℃에서 전사시켰다(4% PEG-8000, 40 mM Tris pH 8.0, 12 mM MgCl2, 1 mM 스페르미딘, 0.002 % Triton X-100, 3 mM 2'OH 퓨린, 3 mM 2'F 피리미딘, 25 mM DTT, 0.25 유니트/100 ㎕ 무기 피로포스파타제, 2 ㎍/㎖ T7 Y639F 단일 돌연변이 RNA 폴 리머라제, 5uCi α32P GTP).
후속 라운드는 라운드 1에 대한 방법과 동일한 방법을 사용하여 반복하였지만, 음성 선별 단계를 추가하였다. 단백질 표적과 함께 항온처리하기 전, 필터 결합 서열을 제거하기 위해 0.45 μ 니트로셀룰로스 필터 컬럼을 통해 풀 RNA를 통과시킨 뒤, 여과물을 양성 선별 단계로 계속 진행시켰다. 한 라운드씩 걸러서, 풀 RNA를 겔 정제하였다. 전사 반응물은 50 mM EDTA로 켄칭하고, 에탄올 침전시킨 뒤, 1.5 mm 변성 폴리아크릴아미드 겔(8 M 우레아, 10% 아크릴아미드; 19:1 아크릴아미드:비스아크릴아미드) 상에서 정제하였다. 풀 RNA는 300 mM NaOAc, 20 mM EDTA에서 수동 용출한 뒤, 300 mM 아세트산나트륨 및 에탄올 2.5 부피를 첨가하여 에탄올 침전시켜 겔로부터 제거하였다.
선별 도중 RNA는 과량의 단백질에 존재하였다(∼1 μM RNA). 단백질 농도는 특별 선별에 기초하여 다양한 수준의 더 낮은 농도로 떨어뜨렸다. 경쟁자 tRNA는 선별에 따라 라운드 2 또는 3에서 시작하여 0.1 ㎎/㎖로 결합 반응에 첨가하였다. 선별 라운드에서 수행한 결합 분석과 함께, 총 7 라운드를 완료하였다. 하기 표 14에는 각 라운드에 대해 사용한 풀 RNA 농도, 단백질 농도 및 tRNA 농도를 비롯한 선별에 대한 세부 사항이 포함되어 있다. 결합 분석과 함께 용출 값(단백질-결합 RNA 대(vs.) 필터 컬럼을 통해 유출된 총 RNA에 대한 CPM 값의 비)을 사용하여 선별 과정을 모니터링하였다.
[표 14]
Figure 112006072186688-PCT00021
rRfY mIL -23 단백질 결합 분석: 상술한 바와 같이 풀의 단백질 결합 친화도를 모니터링하기 위해, 선별 내내 도트 블롯 결합 분석을 수행하였다. mIL-23의 존재 하에 RNA의 유의적인 결합 수준을 관찰하는 경우, TOPO TA 클로닝 키트(캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 풀을 클로닝하였다. mIL-23 선별을 위해, 라운드 7 풀 주형을 클로닝하고, 8-포인트 mIL-23 적정을 사용하여 각 선별로부터 얻은 16개의 개별 클론을 평가하였다. 스크리닝 한 총 32개의 클론 중 7개의 클론이 특이적인 결합 곡선을 보였으며, 이들은 하기 표 16에 열거되어 있다. 하기 표 15에는 상응하는 서열이 열거되어 있다. 나머지 모두는 미선별된 나이브(naive) 풀과 유사한 비특이적인 결합 곡선을 나타내었다. 그 뒤, mIL-23에 대해 높은 친화도를 보이는 클론을 동일한 방식으로 마우스 IL-12, 인간 IL-23 및 인간 IL-12에 대한 단백질 결합에 대해 스크리닝하였다.
하기 표 15에 특징지어진 rRfY 앱타머의 핵산 서열을 하기에 나타낸다. 하기의 각 앱타머의 독특한 서열은 서열 GGAGCGCACUCAGCCAC(서열 번호 122)에 이어 즉시 뉴클레오티드 18에서 시작하여, 3' 고정된 핵산 서열 UUUCGACCUCUCUGCUAGC(서열 번호 123)과 만날 때까지 계속된다.
달리 언급하지 않는다면, 하기에 열거되어 있는 각 서열들은 5'에서 3' 방향으로 나타나 있고, rRfY SELEXTM 조건 하에 선별된 마우스 IL-23에 결합하는 서열을 나타내며, 여기서 퓨린(A 및 G)은 2'-OH이고, 피리미딘(C 및 U)은 2'-플루오로이다. 하기 표 15에 열거되어 있는 각각의 서열은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화될 수 있고, 캡핑(예, 3'-역 dT)을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수도 있다.
[표 15]
Figure 112006072186688-PCT00022
[표 16]
Figure 112006072186688-PCT00023
실시예 1F: 마우스 IL -12에 대한 특이성을 가진 마우스 IL -23 앱타머에 대한 선별
도입: 마우스 IL-12(mIL-12)에 대해 특이성을 가지는 마우스-IL-23(mIL-23)에 대한 앱타머를 동정하기 위해 선별을 수행하였다. 이 선별은 라운드 3에서 시작하는 상술한 rRfY 선별 mIL-23S로부터 분리하였다. 상기 선별로 mIL-12에 비해 ∼3 배 내지 5배의 특이성을 가지는 mIL-23에 대한 앱타머를 얻었다.
mIL -23S/ mIL -12 음성 rRfY 선별: 마우스 IL-12에 대한 특이성을 가지는 마우스 IL-23 앱타머를 얻기 위해, 실시예 1A에서 상술한 음성(PN-IL-23) 선별에서의 단백질과 유사하게, 마우스 IL-12를 음성 선별에 포함시켰다. 상기 실시예 1E에 기재된 mIL-23S 선별의 라운드 2로부터의 생성된 RNA를 사용하여 R3PN mIL-23/12음성 선별을 시작하였으며, mIL-12는 음성 선별 단계에 포함시켰다. 9 라운드의 선별을 수행하면서, 각 선별 라운드에서 결합 분석을 수행하였다. 하기 표 17에는 각 라운드에 대해 사용된 풀 RNA 농도, 단백질 농도 및 tRAN 농도를 비롯한 선별 조건이 요약되어 있다. 결합 분석과 함께 용출 값(단백질-결합 RNA 대(vs.) 필터 컬럼을 통해 유출된 총 RNA에 대한 CPM 값의 비)을 사용하여 선별 과정을 모니터링하였다.
[표 17]
Figure 112006072186688-PCT00024
rRfY mIL -23S/ mIL -12 음성 단백질 결합 분석: 풀의 단백질 결합 친화도를 모 니터링하기 위해, 선별 내내 상술한 도트 불롯 결합 분석을 수행하였다. 미량의 32P-표지된 RNA는 mIL-23 또는 mIL-12와 결합시키고, 최종 부피 30 ㎕에 대해 1× PBS + O.1 ㎎/㎖ BSA에서 30분간 실온에서 항온처리하였다. 반응물은 도트 블롯 기기(Schleicher and Schuell Minifold-1 Dot Blot, Acrylic)에 첨가하였다. 상술한 바와 같이 결합 곡선을 얻었다. mIL-23의 존재 하에 RNA의 유의적인 결합 수준이 관찰되는 경우, TOPO TA 클로닝 키트(캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 풀을 클로닝하였다. 라운드 9 풀 주형을 클로닝하고, 선별로부터 얻은 10개의 개별 클론을 mIL-23에 대한 8-포인트 도트 블롯 적정으로 분석하였다. 그 뒤 mIL-23에 유의적으로 결합한 클론을 mIL-12에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 하기 표 18에는 결합 클론의 단백질 결합 특성이 요약되어 있다. 스크리닝된 총 10개의 클론 중 4개의 클론이 다양한 친화도로 mIL-23 및 mIL-12에 특이적으로 결합하였다. 다른 모든 클론은 미선별된 나이브 풀과 유사한 비특이적인 결합 곡선을 나타내었다. 4개의 결합 클론에 대한 서열은 하기 표 19에 열거되어 있다.
[표 18]
Figure 112006072186688-PCT00025
하기 표 19에 특징지어져 있는 rRfY 앱타머의 핵산 서열은 하기에 나타나 있다. 하기 각 앱타머의 독특한 서열은 서열 GGAGCGCACUCAGCCAC(서열 번호 122)에 이어 즉시 뉴클레오티드 18에서 시작하여, 3' 고정된 핵산 서열 UUUCGACCUCUCUGCUAGC(서열 번호 123)과 만날 때까지 계속된다.
달리 언급하지 않는다면, 하기에 열거되어 있는 각 서열들은 5'에서 3' 방향으로 나타나 있고, rRfY SELEXTM 조건 하에서 선별된 마우스 IL-23에 결합하는 서열을 나타내며, 여기서 퓨린(A 및 G)은 2'-OH이고 피리미딘(C 및 U)은 2'-플루오로이다. 하기 표 19에 열거되어 있는 각각의 서열은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화되고, 캡핑(예, 3'-역 dT)을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수도 있다.
[표 19]
Figure 112006072186688-PCT00026
실시예 2: 조성 및 서열 최적화 및 서열
실시예 2A: 최소화( minimization )
성공적인 선별 및 앱타머 서열의 결정 후, 시험관내에서 작용성을 측정하는 것 외에, 서열을 최소화시켜, 소정의 표적에 대해 결합 특이성을 보유하나 개선된 결합 특성(예, 개선된 KD 및/또는 IC50s)을 가지고 있는 더 짧은 올리고뉴클레오티 드 서열을 수득하였다.
실시예 2A.1: rRfY 클론의 최소화
상기 실시예 1A에 기재되어 있는 rRfY 선별로부터 얻은 결합 모(parent) 클론은 타입 1 및 타입 2로 언급되는 2개의 주요 앱타머 패밀리에 속한다. 도 8A 및 8B는 타입 1 및 타입 2 앱타머의 서열 및 예측되는 2차 구조 배열의 예를 도시한 것이다. 도 9A 및 9B는 타입 1 및 타입 2의 최소화된 앱타머 서열 및 예측되는 2차 구조 배열을 도시한 것이다.
싱기 실시예 1에 기재된 IL-23 결합 분석 및 하기 실시예 3에 기재된 세포-기반 분석에 기초하여, 추가 특성화를 위해 AMX84-A10(서열 번호 43), AMX84-B10(서열 번호 44) 및 AMX84-F11(서열 번호 46)을 비롯하여 rRfY PN-IL-23 선별로부터 얻은 몇몇 타입 1 클론을 선택하였다. 최소화된 DNA 컨스트럭트 올리고뉴클레오티드를 전사시키고, 겔 정제한 뒤, h-IL-23에의 결합에 대한 도트 블롯 분석으로 테스트하였다.
최소화된 클론 A1O미니머5(서열 번호 139) 및 A1O미니머6(서열 번호 140)은 AMX84-A10(서열 번호 43)을 기초로 하였고, 최소화된 클론 B1O미니머4(서열 번호 144) 및 B1O미니머5(서열 번호 145)는 AMX84-B10(서열 번호 44)을 기초로 하였으며, 최소화된 클론 F11미니머2(서열 번호 147)는 AMX84-F11(서열 번호 46)을 기초로 하였다(도 9A). 클론은 γ-32P ATP로 5'말단 표지하였으며, 모 클론에 대해 동일한 방법을 사용하여 KD 결정을 위한 도트 블롯 분석으로 분석하였다. 모두 유의적인 단백질 결합을 보였고(하기 표 21에 요약되어 있음), 각각은 하기 실시예 3에서 논의되는 바와 같이 세포-기반 분석으로 테스트하는 경우 각각의 모 클론보다 더 효능이 있었다.
추가적으로, 타입 1 및 타입 2 앱타머를 예시하는 최소화된 컨스트럭트를 제조하고, 타입 1 및 타입 2 앱타머 서열 패밀리의 컨센서스(consensus) 서열을 기초로 하여 테스트하였다. 타입1.4(서열 번호 151) 및 타입1.5(서열 번호 152)는 타입 1 패밀리 서열을 기초로 하는 상기 최소화된 컨스트럭트의 2가지 예로서, 이들은 상술한 기타 타입 1 미니머와 비교했을 때 실시예 3에 기재되어 있는 세포-기반 분석에서 높은 IL-23 결합 친화도 및 가장 효과적인 활성을 나타내었다.
생성된 rRfY 미니머의 서열은 하기 표 20에 열거되어 있다. 하기 표 21에는 하기 표 20에 열거되어 있는 미니머에 대한 미니머 결합 데이터가 나타나 있다.
하기 표 20에 기재되어 있는 최소화된 rRfY 앱타머에 대해, 퓨린(A 및 G)은 2'-OH 퓨린이고, 피리미딘(C 및 U)은 2'-플루오로 피리미딘이다. 달리 언급하지 않는다면, 각 서열은 5'에서 3' 방향으로 나타나 있다. 하기 표 20에 열거되어 있는 각각의 서열은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화될 수 있고, 캡핑(예, 3'-역 dT)을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수도 있다.
[표 20]
Figure 112006072186688-PCT00027
Figure 112006072186688-PCT00028
[표 21]
Figure 112006072186688-PCT00029
실시예 2A.2: dRmY 선별 1의 최소화
IL-23에의 앱타머 결합에 대한 dRmY 선별 과정(상기 실시예 1C에 기재되어 있음) 및 올리고뉴클레오티드 서열의 결정에 이어, 서열을 체계적으로 최소화시켜, 결합 특성을 보유하고 있는 더 짧은 올리고뉴클레오티드 서열을 수득하였다. 상기 실시예 1A에 기재되어 있는 IL-23 결합 분석 및 하기 실시예 3에 기재되어 있는 세포-기반 분석 데이터에 기초하여, 추가 특성화를 위해 ARC489(서열 번호 91)(74머) 를 선택하였다. 클론 ARC489(서열 번호 91)에 기초로 한 3개의 최소화된 컨스트럭트를 고안 및 만들었다. 클론은 γ-32P ATP로 5'말단을 표지하고, KD 측정을 위해 실온에서의 항온처리 30분간 1× PBS + 0.1 mg/mL tRNA, 0.1 mg/mL 연어 정자 DNA, 0.1 mg/mL BSA에서 모 클론에 대해 동일한 방법을 사용하여 도트 블롯 분석으로 분석하였다. 하기 표 22는 최소화된 dRmY 앱타머에 대한 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 23은 dRmY 최소화된 앱타머에 대한 결합 데이터를 포함하고 있다. 단 하나의 최소화된 클론, 즉 ARC527(서열 번호 159)은 IL-23에의 결합을 보였다. 상기 클론은 하기 실시예 3에 기재되어 있는 TransAMTM STAT3의 활성화 분석으로 테스트하였고, 이의 각각의 모 ARC489(서열 번호 91)와 비교했을 때 분석 활성이 감소된다는 것이 드러났다.
하기 표 22에 나타나 있는 최소화된 dRmY 앱타머에 대해, 퓨린(A 및 G)은 데옥시-퓨린이고, 피리미딘(U 및 C)은 2'-OMe 피리미딘이다. 달리 언급하지 않는다면, 각 서열은 5'에서 3' 방향으로 나타나 있다. 하기 표 22에 열거되어 있는 각각의 서열은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화될 수 있고, 캡핑(예, 3'-역 dT)을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수도 있다.
[표 22]
Figure 112006072186688-PCT00030
[표 23]
Figure 112006072186688-PCT00031
실시예 2A.3: dRmY 선별 2의 최소화
IL-23에의 앱타머 결합에 대한 dRmY 선별 과정(상기 실시예 1D에 기재되어 있음) 및 올리고뉴클레오티드 서열의 결정에 이어, 서열을 체계적으로 최소화시켜, 결합 특성을 보유하고 있는 더 짧은 올리고뉴클레오티드 서열을 수득하였다.
상기 실시예 1D에 기재되어 있는 모 dRmY 앱타머 서열의 서열 분석 및 시각 검사를 기초로 하여, dRmY h-IL-23 결합 클론 및 이의 최소화된 컨스트럭트의 활성 형태가 G-쿼텟(quartet) 구조로 폴딩(folding)된다는 가설을 세웠다(도 10). 기능성 결합 서열의 분석으로 G 쿼텟 형태와 일치하는 G 더블 패턴이 드러났다(표 24). G 쿼텟 패밀리 내의 서열은 2개의 서브클래스, 즉 제1 스템에서 3 염기쌍을 가지는 것과, 2개의 염기쌍을 가지는 것으로 나뉜다. 동일한 방식으로, 에티듐 브롬화물 형광이 2중 RNA 및 DNA에의 결합 시 증가하고, N-메틸메소포르피린 IX(NMM) 형광은 G-쿼텟 구조에의 결합 시 증가한다는 것은 보고된 바 있다(Arthanari et al., Nucleic Acids Research, 26 (16): 3724 (1996); Marathais et al., Nucleic Acids Research, 28 (9): 1969 (2000); Joyce et al., Applied Spectroscopy, 58 (7): 831 (2004)). 따라서, 도 11에 나타나 있는 바와 같이, NMM 형광을 사용하여, ARC979(서열 번호 177)은 사실 G-쿼텟 구조를 취한다는 것을 확인하였다. 상기 문헌의 프로토콜에 따라, 마그네슘과 칼슘을 함유하는 둘베코 PBS 중 ∼1 μM NMM 및 ∼2 μM 앱타머를 함유하는 100 ㎕의 반응물은 SpectraMax Gemini XS 형광 플레이트 리더를 사용하여 분석하였다. 형광 방출 스펙트럼은 550 nm 내지 750 nm에서 수집하고, 여기 파장은 405 nm였다. 이 실험에서는 항트롬빈 DNA 앱타머 ARC183의 G-쿼텟 구조(Macaya et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 3745 (1993))를 양성 대조구로서 사용하였다. ARC1346은 G-쿼텟 구조를 가지는 것으로는 예측되지 않은 ARC979(서열 번호 177)과 유사한 크기 및 뉴클레오티드 조성을 보이는 앱타머이며, 실험에서는 음성 대조구로서 사용하였다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, ARC183 및 ARC979(서열 번호 177)가 NMM만에 대한 NMM 형광에서 유의적인 증가를 보이는 반면, 음성 대조구인 ARC1346은 그러하지 않았다.
최소화된 컨스트럭트는 ABI EXPEDITETM DNA 합성기 상에서 합성한 뒤, 표준 방법으로 탈보호화시켰다. 최소화된 클론은 10% PAGE 겔 상에서 겔 정제하고, RNA는 300 mM NaOAc 및 20 mM EDTA에서 수동 용출한 뒤, 에탄올 침전시켰다.
클론은 γ-32P ATP로 5' 말단 표지하고, KD 결정을 위해 직접 결합 분석을 사용하여 도트 블롯 분석으로 분석하였으며, 상기 분석에서 앱타머는 방사능표지시키고 미량 농도(< 90 pM)로 유지시키는 동시에, 실온에서의 항온처리 30분간 IL-23의 농도를 0.1 ㎎/㎖ BSA와 1× PBS에서 변화시켰다. 하기 식에 데이터를 적합(fit)시켜 KD를 계산하기 위해 결합된 앱타머 단편 대(vs.) [IL-23]을 사용하였다:
결합된 앱타머 단편 = 앰플리튜드*([IL-23]/(KD + [IL-23])) + 백그라운드 결합.
dRmY 선별 2로부터의 여러 최소화된 컨스트럭트는 또한 콜드(cold) 앱타머를 적정하고 미량의 32P ATP 표지된 앱타머와 경쟁하는 경쟁 포맷으로 분석하였다. 경쟁 분석에서, [IL-23]은 일정하게 유지되었고, [표지된 미량의 앱타머]도 일정하게 유지되었으나, [미표지된 앱타머]는 변화하였다. KD는 다음의 식에 데이터를 적합시켜 계산하였다:
결합된 앱타머 단편 = 앰플리튜드*([앱타머]/KD + [앱타머])) + 백그라운드 결합.
G 쿼텟을 기초로 하는 미니머는 작용성 바인더인 반면, 스템 루프를 예측하고(RNA structure; D.H. Mathews, et al., "Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure". Journal of Molecular Biology, 288, 911-940 (1999)), G 더블 패턴을 포함하지 않는 폴딩 알고리즘을 기초로 하는 미니머는 작용성을 띠지 않았다[ARC793(서열 번호 163)].
하기 표 25에는 최소화된 서열 및 상기 서열이 유도된 모 클론이 요약되어 있고, 하기 표 26에는 직접 결합 분석으로부터의 결합 특성(+/- RNA) 및 테스트한 최소화된 컨스트럭트에 대한 경쟁 결합 분석이 요약되어 있다.
[표 24]
Figure 112006072186688-PCT00032
표 24에 열거되어 있는 클론에 대한 서열 번호는 표 12에 나타나 있다.
하기 표 25에 기재되어 있는 최소화된 dRmY 앱타머에 대해, 퓨린(A 및 G)은 데옥시-퓨린이고, 피리미딘(C 및 U)은 2'-OMe 피리미딘이다. 달리 언급하지 않는다면, 각 서열들은 5'에서 3' 방향으로 나타나 있다. 하기 표 25에 열거되어 있는 각각의 서열은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화되고, 캡핑(예, 3'-역 dT)을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수도 있다.
[표 25]
Figure 112006072186688-PCT00033
[표 26]
Figure 112006072186688-PCT00034
Figure 112006072186688-PCT00035
경쟁적 결합 데이터는 포화 결합 실험에서 재분석하였으며, 상기 실험에서 리간드(앱타머)의 농도는 변화하고, 수용체(IL-23)의 농도는 일정하게 유지되며, [결합된 앱타머]는 [총 투입 앱타머]에 대하여 플로팅하였다. ARC979(서열 번호 177)를 이 분석에서 사용하였다.
결합된 [ARC979]는 ∼1.7 nM에서 포화되는데(도 12), 이는 앱타머에 결합할 수 있는 IL-23의 농도가 1 nM이거나, 또는 투입 IL-23의 2%(1/50)라는 점을 암시한다. 계산된 KD 값은 8 nM이었는데, 이는 경쟁 모드에서 나타난 데이터를 적합시켜 얻은 값(8.7 nM)과 잘 일치하는 것이다.
IL-12 경쟁 결합 데이터를 동일한 분석에 적용하는 경우(도 13), IL-12 단편 활성이 더 높았고(10%), IL-23 대(vs.) IL-12에 대한 ARC979의 특이성(33배)은 직접 결합 측정에 의해 예측한 것(2배 내지 5배)보다 더 높았다.
그 후, 상술한 결합 반응 조건(실온에서 항온처리 30분간 0.1 ㎎/㎖ BSA와 1× PBS)을 사용하고, 상이한 결합 반응 조건[실온에서 30분간 0.1 ㎎/㎖ BSA와 1× 둘베코 PBS(Mg 및 Ca가 있음)]을 사용하여, ARC979에 대한 직접 결합 분석을 반복하였다. 상기 두 조건 모두에서, 화학적으로 새로 합성된 앱타머는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 γ-32P ATP로 표지된 5'말단을 정제하고, 전체 인간 IL-23에의 직접 결합에 대해 테스트하였다. 8 포인트 단백질 적정은 도트 블롯 결합 분석에서 사용하였다({100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 0 pM} 또는 {10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 0pM}). KD 값은 칼레이다그래프(칼레이다그래프 버전 3.51, 시너지 소프트웨어)를 사용하여, 식 [y = (최대/(1+K/단백질)) + yint]에 적합시켜 계산하였다. 완충액 조건이 결합 친화도에 다소 영향을 미치는 것으로 드러났다. 1× PBS 조건 하에서의 ARC979에 대한 KD 값은 ∼10 nM인 것으로 계산되었으나, 1× 둘베코 PBS 조건 하에서의 ARC979에 대한 KD 값은 ∼1 nM인 것으로 계산되었다(도 14 참조). 상기 KD 값은 후속 분석에서 확인하였고(데이터는 나타내지 않음), 이는 하기 실시예 3D에 기재되어 있는 PHA Blast 분석에서 ARA979가 얻은 IC50 값인 ∼6 nM과 일치하였다.
실시예 2A.4: 마우스 IL -23 rRfY 최소화
실시예 1E에 기재된 마우스 IL-23 rRfY 앱타머의 모클론 서열의 시각적 검사, 및 RNA 폴딩 프로그램을 사용한 예측된 RNA 구조(RNA 구조)에 기초하여, 7개의 결합 mIL-23 클론 각각에 대해 최소화 컨스트럭트를 디자인하였다. 최소화 컨스트럭트 올리고에 대한 PCR 기질은 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies (Coraville, IA))에 주문하여 만들었다. 컨스트럭트를 PCR 증폭시키고, 전사시키고, 겔 정제한 다음, 상기 도트 블롯 결합 분석을 이용하여 mIL-23에의 결합에 대해 시험하였다. 미량의 32P-표지 RNA를 mIL-23과 배합하고 1X PBS + 0.1 ㎎/㎖ BSA 중에서 최종 부피 30 ㎕에 대하여 30분 동안 실온에서 항온처리하였다. 반응물을 도트 블롯 장치(Schleicher and Schuell Minifold-1 Dot Blot, Acrylic)에 첨가하였다. 결합 곡선을 앞 부분에서 기재한 바와 같이 만들었다. 표 32는 mIL-23 결합 최소화 컨스트럭트의 서열을 나열한 것이다. 표 33은 mIL-23에의 유의한 결합을 가진 각 rRfY 최소화 컨스트럭트에 대한 단백질 결합 특징을 요약한 것이다.
달리 명시하지 않는 한, 아래에 나열된 개개의 서열은 5'부터 3' 방향으로 나타나 있고, rRfYSELEXTM 조건 하에 선택된 마우스 IL-23에 결합하는 서열을 나타낸 것으로서, 여기서 퓨린(A 및 G)는 2'-OH이고, 피리미딘(U 및 C)는 2'플루오로이다. 표 32에 나열된 서열 각각은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화될 수 있고, 캡핑(예컨대, 3'-역 dT)를 보유할 수 있거나 보유할 수 없다.
[표 32]
최소화 마우스 rRfY 클론 서열
Figure 112006072186688-PCT00036
[표 33]
mIL-23 rRfY 클론 KD 요약
Figure 112006072186688-PCT00037
실시예 2B: 의약화학법을 통한 최적화
앱타머 의약화학법은 변이체 앱타머 세트가 화학적으로 합성되는 앱타머 개선 기술이다. 이들 변이체 세트는 전형적으로는 단일 치환의 도입에 의해 모앱타머와 구별되고, 이러한 치환의 위치에 의해 서로 간에 구별된다. 그 다음, 이들 변이체를 서로 비교하고 모앱타머와 비교하였다. 특징에서의 개선은 단일 치환의 포함이 특정한 치료적 기준을 달성하는 데 필요한 모두일 수 있을 만큼 충분히 깊을 수 있다.
별법으로, 단일 변이체 세트로부터 모은 정보를 이용하여 1 초과의 치환이 동시에 도입되어 있는 추가 변이체 세트를 디자인할 수 있다. 한 디자인 방법에 있어서, 단일 치환 변이체 모두의 등급을 매기고, 상위 4개를 선택하고, 이들 4개의 단일 치환 변이체의 모든 가능한 이중(6), 삼중(4) 및 사중(1) 조합물을 합성하여 분석하였다. 제2 디자인 방법에서, 가장 좋은 단일 치환 변이체를 새로운 모앱타머로 간주하고, 이 가장 높은 등급의 단일 치환 변이체를 포함하는 모든 가능한 이중 치환 변이체를 합성하고 분석하였다. 다른 방법을 이용할 수 있고, 이들 방법을 반복적으로 적용하여, 더욱 개선된 변이체를 계속 확인하면서 치환의 수를 점차적으로 증가시킬 수 있다.
앱타머 의약화학법은 치환의 전반적 도입보다는 오히려 치환의 국소적 도입을 조사하기 위한 방법으로서 가장 가치있다. 앱타머는 전사에 의해 생성되는 라이브러리 내에서 발견되기 때문에, SELEXTM 과정 동안 도입된 임의의 치환이 전반적으로 도입되어야 한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 도입하고자 하는 경우, 이들은 모든 A(또는 모든 G, C, T, U 등)에서 도입될 수만 있다(전반적 치환). 일부 A(또는 일부 G, C, T, U 등)(국소적 치환)에서는 포스포로티오에이트를 필요로 하지만 다른 A에서는 이것을 허용할 수 없는 앱타머는 이 방법에 의해 용이하게 발견될 수 없다.
앱타머 의약화학법에 의해 활용될 수 있는 치환의 종류는 이들을 고체상 합성 시약으로서 만드는 능력 및 이들을 올리고머 합성 반응 내로 도입시키는 능력에 의해서만 제한된다. 상기 방법은 확실히 뉴클레오티드 단독에만 한정되지 않는다. 앱타머 의약화학법은 입체적 용적, 소수성, 친수성, 친유성, 소유성, 양 전하, 음 전하, 중성 전하, 쯔비터이온, 분극성, 뉴클레아제-내성, 구조적 강성, 구조적 가요성, 단백질-결합 특성, 질량 등을 도입하는 치환을 포함할 수 있다. 앱타머 의약화학법은 염기-변형, 당-변형 또는 포스포디에스테르 결합-변형을 포함할 수 있다.
치료적 앱타머의 관점에서 유익할 것 같은 치환의 종류를 고려할 때, 하기 카테고리 중 1 이상의 카테고리 내에 속하는 치환을 도입하는 것이 바람직할 수 있다:
(1) 본체, 예를 들어, 2'-데옥시, 2'-리보, 2'-O-메틸 퓨린 또는 피리미딘 또는 5-메틸 시토신에 이미 존재하는 치환,
(2) 승인된 치료적 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 포스포로티오에이트-결합 올리고뉴클레오티드의 이미 일부인 치환,
(3) 상기 2개의 카테고리 중 하나, 예를 들어, 메틸포스포네이트-결합 올리고뉴클레오티드로 가수분해되거나 분해되는 치환.
실시예 2B.1: 포스포로티오에이트 치환에 의한 ARC979 의 최적화
ARC979 (서열 번호 177)는 dRmY 조성의 IL-23에 대한 34개 뉴클레오티드 앱타머이다. 단일 포스포로티오에이트 치환이 각 인산염 결합에서 만들어져 있는 ARC979의 21개의 포스포로티오에이트 유도체를 디자인하고 합성하였다(ARC1149 내지 ARC1169) (서열 번호 203 내지 서열 번호 223) (표 27 참조). 이들 분자를 겔 정제하고, 상기 도트 블롯 분석을 이용하여 IL-23 결합에 대해 분석한 다음, 서로 간에 비교하고 모분자 ARC979와 비교하였다. 8 점 IL-23 적정(0 nM 내지 300 nM, 3 배 희석 시리즈)을 결합 분석에 이용하였다. 계산된 KDS는 표 28에 요약되어 있다.
ARC979에의 포스포로티오에이트 결합의 포함은 ARC979와 비교할 때 잘 허용되었다. 이들 컨스트럭트 중 대다수가 IL-23에의 증가된 비율 결합을 보였고, 추가로 개선된(즉, 보다 낮은) KD 값을 가졌다(도 15). 친화도에서의 유사한 증가가 경쟁 분석에서 확인되었고(도 16), 이 분석은 ARC979의 포스포로티오에이트 유도체가 ARC979보다 더 높은 친화도로 IL-23에 대해 경쟁한다는 것을 더욱 지지한다.
달리 명시하지 않는 한, 하기 표 27에 나열된 서열 각각은 5'-3' 방향으로 되어 있고, 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화될 수 있고, 캡핑(예컨대, 3'-역 dT)을 보유할 수 있거나 보유할 수 없다.
[표 27]
ARC979 포스포로티오에이트 유도체의 서열: 단일 포스포로티오에이트 치환
Figure 112006072186688-PCT00038
[표 28]
ARC979 포스포로티오에이트 유도체에 대한 KD 요약
Figure 112006072186688-PCT00039
실시예 2B.2: 최적화: 2'- OMe , 포스포로티오에이트 및 이노신 치환
전체적인 안정성 및 혈장 뉴클레아제 내성을 증가시키기 위해 ARC979(서열 번호 177)에 대해 체계적인 변형을 가했다. ARC979의 가장 안정하고 강력한 변이체는 앱타머 합성, 정제 및 결합 활성에 대한 분석이라는 4 주기를 포함하는 체계적인 합성 방법을 통해 확인하였다. 과정에서의 제1 주기는 ARC1386(서열 번호 224) (3'-역-dT를 가진 ARC979)의 합성 및 결합 활성에 대한 분석이었다. 일단 ARC1386(서열 번호 224)가 모분자 ARC979(서열 번호 177)의 친화도와 유사한 친화 도로 IL-23에 결합하는 것으로 밝혀졌으면, 안정화 3'-역-dT를 가진 ARC979의 모든 후속 유도체를 합성하였다.
상기 도트 블롯 결합 분석을 이용하여 합성된 앱타머의 대부분의 상대적인 효능을 특징규명하였다. KD 측정을 위해, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 화학적으로 합성된 앱타머를 정제하고, γ-32P ATP로 5' 말단을 표지하고, 전장 인간 IL-23에의 직접적 결합에 대해 시험하였다. 0.1 ㎎/㎖ BSA를 가진 둘베코스 PBS(Mg++ 및 Ca++를 함유함) 중에서의 도트 블롯 결합 분석({100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 0 pM} 또는 {10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 0 pM})에서 8 점 단백질 적정을 이용하였다. KD 값은 칼레이다그래프(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 방정식 y = (최대/(l+K/단백질)) + yint를 피팅(fitting)함으로써 계산하였다. 합성되고 정제되고 IL-23에의 결합에 대해 분석된 ARC979 유도체의 서열뿐만 아니라 단백질 결합 특징규명의 결과를 하기 표 29 및 30에 표로 만들었다. 표 30에서 알 수 있는 바와 같이, 그리고 상기 실시예 2A.3에 상술되어 있는 바와 같이, ARC1386(서열 번호 224)(3' 역 dT를 가진 ARC979(서열 번호 177)임)는 이들 조건 하에서 1 nM의 KD를 가졌다.
ARC1427-ARC1471(서열 번호 225-269)로 구성된, 최적화 과정의 주기 1에서, ARC1386(서열 번호 224)의 각 개별 퓨린 잔기는 상응하는 2'-O 메틸 보유 잔기로 치환시켰다. 추가로 주기 1에서, 포스포로티오에이트 치환이 뉴클레아제 안정성을 부여하는 것 외에 ARC979 유도체의 결합 친화도를 증강시킨다는 것을 암시하는 앞서 얻은 결과에 기초하여 개별 및 복합 포스포로티오에이트 치환 시리즈를 시험하였다. 마지막으로 주기 1의 말기에서, ARC979/ARC1386의 기능성 관점에서 스템 1의 역할을 추가로 조사하기 위해 앱타머 시리즈를 시험하였다. 표 30의 결합 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 많은 위치가 2'-O 메틸 잔기에 대한 데옥시 잔기의 치환을 용이하게 허용하였다. 임의의 특정한 포스포로티오에이트의 부가는 앱타머의 친화도에 있어서 유의한 증강을 부여하지 못하는 듯하였다. 흥미롭게는, ARC1465-1471(서열 번호 263-269)의 비교에 의해 알 수 있는 바와 같이, 스템 1은 고친화도 결합의 유지에 중요하나, 이의 역할은 구조적 클램프(clamp)인 것으로 보였는데, 이는 스템 1을 포함하는 2개 가닥과 앱타머 코어 사이의 PEG 스페이서의 도입이 앱타머의 결합 특성에 유의한 영향을 주지 못하는 것으로 보였기 때문이다.
최적화 과정의 주기 1로부터 얻은 구조 활성 관계(SAR)에 기초하여, 제2 앱타머 시리즈를 디자인하고 합성하고, 정제하고 IL-23에의 결합에 대하여 시험하였다. ARC1539-ARC1545(서열 번호 270-276)로 구성된 주기 2 최적화에서, 2'-O 메틸 치환만을 이용하여 보다 많이 변형된 복합 분자를 생성시키기 위해 주기 1로부터 얻은 데이타를 이용하였다. 이들 및 모든 후속 분자의 경우, ~ 2 nM 이상의 친화도(KD)뿐만 아니라 100 nM(또는 주기 3 및 4에서는 10 nM) IL-23에서의 50% 이상의 결합도를 보유하는 분자를 확인하는 것이 목적이었다. 단순한 결합 친화도의 관점 에서 이들 중 가장 우수한 것 ARC1544(서열 번호 275)이었다.
ARC1591-ARC1626(서열 번호 277-312)으로 구성된 최적화의 주기 3에서, 데옥시 이노신(dI)로의 (데옥시 구아노신) dG의 체계적 치환 과정 동안 IL-23 결합에 대해 분석함으로써 ARC979(서열 번호 177)의 G-4분체(quartet) 구조의 안정성을 입증하였다. 데옥시 이노신에는 데옥시 구아노신에서 발견된 엑소시클릭 아민이 없기 때문에, N7 수소에의 단일 아미노 결합은 dI로의 각 dG 치환에 대한 잠재적 G-4분체로부터 제거되었다. 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 유의한 치환만이 앱타머 구조가 강하다는 것을 암시하는, IL-23에 대한 치환도의 실질적인 감소를 이끌어 냈다. 추가로, ARC1544(서열 번호 275) 내로의 포스포로티오에이트 보유 잔기의 부가를 평가하였다(ARC1620 내지 ARC1626(서열 번호 306-312)을 포함함). 표 30에서 알 수 있는 바와 같이, ARC1620-1626(서열 번호 306-312)의 친화도는 ARC979(서열 번호 177)에 비해 사실상 개선되어 있었다. 도 17은 모분자 ARC979에 비하여 선별 포스포로티오에이트 보유 잔기의 포함에 의해 부여된 현저히 개선된 결합 친화도를 보여주는, 주기 3 최적화 노력으로부터 얻은 선별 ARC979 유도체(ARC1624 및 ARC1625)에 대한 결합 곡선을 도시한 것이다.
ARC1755-1756(서열 번호 313-314)로 구성된 최적화의 주기 4는 2'-O 메틸 치환에 보다 많은 데옥시를 도입하고 친화도를 보유하기 위한 시도에서 단지 2개의 서열만을 포함하였다. ARC1755 및 1756에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 실험은 성공적이었다.
달리 명시하지 않는 한, 표 29에 나열된 서열 각각은 5'에서 3' 방향으로 나 타나 있고 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 잔기로 유도체화될 수 있다.
[표 29]
서열 정보 주기 1-4 ARC979 최적화
Figure 112006072186688-PCT00040
Figure 112006072186688-PCT00041
Figure 112006072186688-PCT00042
Figure 112006072186688-PCT00043
Figure 112006072186688-PCT00044
Figure 112006072186688-PCT00045
Figure 112006072186688-PCT00046
[표 30]
결합 특징규명
Figure 112006072186688-PCT00047
Figure 112006072186688-PCT00048
Figure 112006072186688-PCT00049
Figure 112006072186688-PCT00050
Figure 112006072186688-PCT00051
Figure 112006072186688-PCT00052
실시예 2C: 항- IL -23 앱타머의 혈장 안정성
최적화 과정 동안 확인된 앱타머의 서브세트를 인간 혈장 내에서의 뉴클레아제 안정성에 대해 분석하였다. 혈장 뉴클레아제 분해는 하기 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 측정하였다. 요약하면, 혈장 안정성 측정을 위해, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 화학적으로 합성된 앱타머를 정제하고, γ-32P ATP로 5' 말단을 표지한 다음 다시 겔 정제하였다. 200 마이크로리터 결합 반응에서 95% 인간 혈장 중의 100 nM 비표지 앱타머의 존재 하에 미량의 32P 표지 앱타머를 인큐베이션하였다. 혈장을 PBS로 대체하여 겔 상에 로딩된 방사능 양이 실험 전체에 걸쳐 확실히 일정하게 하였다는 점을 제외하고는 0 시점에 대한 반응물을 동일한 성분들로 따로 만들었다. 반응물을 1, 3, 10, 30 및 100 시간 동안 37℃, 열순환기(thermocycler)에서 항온처리하였다. 각 시점에서, 반응물 20 마이크로리터를 취하여 200 마이크로리터의 포름아미드 로딩 염료와 혼합하고 액체 질소 중에서 급속 동결하고, -20℃에 저장하였다. 마지막 시점이 지난 후, 동결된 샘플을 해동하고 20 마이크로리터를 각 시점으로부터 취하였다. 이어서, SDS를 0.1%의 최종 농도까지 상기 작은 샘플에 첨가하였다. 그 다음, 상기 샘플을 90℃에서 10-15분 동안 항온처리하고 15% 변성 PAGE 겔 상에 직접 로딩하고, 12W에서 35분 동안 런닝하였다. 스톰 860 포스포르이미지 시스템(Storm 860 Phosphorimager system)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 이용하여 겔 상의 방사능을 정량하였다. 전장 앱타머 밴드를 정량하고 레인의 총수로 나눔으로써 각 시점에서의 전장 앱타머의 비율을 측정하였다. 그 다음, 각 시점에서의 전장 앱타머의 분획을 0 시간 시점의 전장 앱타머 비율로 표준화하였다. 시간의 함수로서 전장 앱타머의 분획을 하기 방정식에 피팅하였다:
m1*e^(-m2*m0)
상기 식에서, m1은 최대 % 전장 앱타머(m1 = 100)이고; m2는 분해 속도이다.
앱타머의 반감기(T1 /2)는 (In 2)/m2와 동일하였다.
샘플 데이타는 도 18에 나타내었고, 시험된 앱타머에 대한 결과는 표 31에 요약되어 있다.
[표 31]
혈장 안정성
Figure 112006072186688-PCT00053
실시예 3: 기능적 세포 분석
활성 rRfY IL -23 앱타머의 세포-기반 분석( cell - based assay) 및 최소화
IL-23은 JAK/STAT 신호 전달도입에서 소정의 역할을 하고 STAT 1, 3, 4 및 5를 인산화시킨다. IL-23 앱타머가 세포-기반 활성을 나타내는 지를 시험하기 위해, PHA(파이토헤마글루티닌) 또는 PHA 블라스트(Blast)를 함유하는 배지에서 생장된 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 용해물에서 신호 전달도입을 분석하였다. 보다 구체적으로는, 세포-기반 분석은 IL-23 앱타머가 PHA 블라스트에서의 IL-23 유도 STAT-3 인산화를 억제할 수 있는 지를 결정하였다.
필수적으로, IL-23 처리 세포의 용해물은 휴지기 세포 또는 앱타머 차단 세 포보다 더 활성화된 STAT3을 함유할 것이다. IL-23에 의해 유도된 STAT3 인산화의 억제는 2가지 방법: 항-포스포-STAT3 항체(Tyr705)(Cell Signaling, Beverly, MA)를 사용한 웨스턴 블롯; 및 트랜스AMTM 분석(Active Motif, Carlsbad, CA)으로 측정하였다. 트랜스AMTM 분석 키트는 STAT 컨센서스 결합 부위(5'TTCCCGGAA-3')를 보유하는 올리고뉴클레오티드가 고정화되어 있는 96웰 플레이트를 제공한다. STAT3이 활성화된 경우에만 접근할 수 있는 STAT3 상의 에피토프를 인식하는 항-STAT3 항체를 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체와 함께 사용하여 분광광도법으로 정량화할 수 있는 비색계 판독정보를 얻었다(도 19 참조).
요약하면, 히스토파크(Histopaque) 구배(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 전혈로부터 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리함으로써 세포-기반 분석을 수행하였다. PHA를 함유하며 IL-12(100 유니트/㎖)(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 보충된 말초혈 배지(Sigma) 중에서 37℃/5% CO2에서 3 내지 5일 동안 PBMC를 배양하여 PHA 블라스트를 생성시켰다. IL-23 앱타머를 시험하기 위해, PHA 블라스트를 1X PBS로 2회 세정한 후, 혈청이 공급되지 않는 상태를 RPMI, 0.20% FBS 중에서 4시간 동안 유지하였다. 혈청 비공급 상태 후, 대략 2 백만개 세포를 적절히 표지된 에펜도르프 튜브 내로 분취하였다. 최종 농도가 3 ng/㎖인 hIL-23(R&D Systems, Minneapolis, MN)을 실시예 1에 기재된 다양한 IL-23 앱타머의 희석 시리즈와 배합하고, 사이토카인/앱타머 혼합물을 최종 부피 100 ㎕가 되도록 상기 분취된 세포에 첨가하고, 37℃에서 10-12분 동안 항온처리하였다. 1.5 mM Na3VO4와 함께 빙냉 PBS 1 ㎖를 첨가하여 항온처리 반응을 중단시켰다. 제조자의 지시에 따라 트랜스AMTM STAT3 분석에 의해 제공된 용해 완충제를 이용하여 세포 용해물을 만들었다. 도 20은 세포 기반 분석에 이용된 프로토콜의 순서 요약을 도시한 것이다.
모앱타머, 및 2'-F 피리미딘-보유 풀(rRfY), 리보/2'O-Me 보유 풀(rRmY), 데옥시/2'O-Me 보유 풀(dRmY)을 사용한 다양한 선별로부터 얻은 최소화 IL-23 앱타머, 및 최적화 dRmY 앱타머를 트랜스AMTM 방법을 이용하여 시험하였다.
실시예 3A: rRfY 선별로부터 얻은 모클론 및 최소화 클론에 대한 세포 기재 분석 결과
트랜스AMTM STAT3 활성화 분석을 이용하여, 실시예 1A에 기재된 rRfY 선별로부터 얻은 전장 클론, 및 실시예 2A.1에 기재된 선별 최소화 rRfY 클론을 시험하였다. 표 34는 실시예 1A에 기재된 rRfY 선별로부터 생성된 IL-23 전장 앱타머에 대한 세포-기반 분석 데이타를 요약한 것이다. 표 35는 실시예 2A.1에 기재된 rRfY 최소화 클론의 활성 데이타를 요약한 것으로서, 각각을 이의 각 (전장) 모클론의 활성과 비교하였다. 최소화된 rRfY 클론 F11min2(서열 번호 147), A10min5(서열 번호 139), A10min6(서열 번호 140), BlOmin4(서열 번호 144), BlOmin5(서열 번호 145), 타입 1.4(서열 번호 151) 및 타입 1.5(서열 번호 152) 각각은 트랜스AMTM STAT3 활성화 분석에서 시험한 경우 전장 rRfY 클론 모두 외에 이들 각각의 모클론 을 능가하였다(도 21 참조).
[표 34]
세포-기반 분석 결과: 시험한 rRfY 클론의 요약
Figure 112006072186688-PCT00054
Figure 112006072186688-PCT00055
[표 35]
모앱타머와 비교한 IL-23 2'F rRfY 최소화 앱타머 결합
Figure 112006072186688-PCT00056
실시예 3B: 제1 dRmY 선별로부터 얻은 모클론 및 최소화 클론에 대한 세포-기반 분석 결과
트랜스AMTM STAT3 활성화 분석을 이용하여, 실시예 1C에 기재된 dRmY 선별로부터 얻은 모클론 및 이 선별로부터 얻은 최소화 dRmY 클론(실시예 2A.2에 기재됨)의 활성을 시험하였다. IL-23에 대한 가장 높은 결합 친화도를 보여주는 실시예 1C에 기재된 3개의 전장 dRmY 클론 ARC489(서열 번호 91), ARC490(서열 번호 92), ARC491(서열 번호 94)을 시험하였다. IL-23에의 결합을 나타내지 않은 ARC 492(서열 번호 97)를 음성 대조구로서 사용하였다. ARC489(서열 번호 91) 및 ARC491(서열 번호 94)은 트랜스AMTM STAT3 활성화 분석에서 필적할만한 세포-기반 활성을 보였고, 예비 데이타는 50 nM - 500 nM 범위 내의 IC50을 나타내었다(데이타는 기재하지 않음).
IL-23에의 결합을 보여준, 실시예 2A.2에 기재된 dRmY 최소화 노력으로부터 얻은 최소화 클론 ARC527(서열 번호 159)만이 트랜스AMTM STAT3 활성화 분석에서 시험하였고 이의 각 전장 ARC489(서열 번호 91)에 비하여 분석 활성에서의 감소를 보였다(데이타는 기재하지 않음).
실시예 3C: 제2 dRmY 선별로부터 얻은 모클론 및 최소화 클론에 대한 세포-기반 분석 결과
hIL-23에 대한 높은 친화도를 보여주는, 실시예 1D에 기재된 dRmY 선별로부 터 얻은 모클론 및 이 선별로부터 얻은 최소화 클론(실시예 2A.3에 기재됨)을, 3 ng/㎖의 일정한 IL-23 농도와 함께 3배 희석에서의 0 내지 3 μM의 8-점 IL-23 적정을 이용한 트랜스AMTM 분석에서 기능성에 대해 스크리닝하였다. 전장 클론에 대한 IC50을 투여량 반응 곡선으로부터 계산하였다. 도 22는 트랜스AMTM 분석에서 강력한 세포-기반 활성을 나타내는, 실시예 1D에 기재된 선별로부터 얻은 dRmY 클론에 대한 투여량 반응 곡선의 예이다(ARC611(서열 번호 103), ARC614(서열 번호 105), ARC621(서열 번호 108) 및 ARC627(서열 번호 110)).
트랜스AMTM 분석에서 최소화 dRmY 클론(실시예 2A.3에 기재됨)을 기능성에 대해 스크리닝하고 이의 각 모클론과 비교하였다. IC50은 투여량 반응 곡선으로부터 계산하였다. 도 23은 전장 모클론 ARC621(서열 번호 108) 및 ARC627(서열 번호 110)에 비하여 보다 강력한 일부 최소화 dRmY 클론 ARC979(서열 번호 177), ARC980(서열 번호 178), ARC982(서열 번호 180)에 대한 투여량 반응 곡선의 예이다. ARC979(서열 번호 177)는 3가지 실험 과정에 걸쳐 평균을 산출하였을 경우 40 nM +/- 10 nM의 IC50을 가지면서 트랜스AMTM 분석에서 일관되게 최적으로 수행하였다. ARC792(서열 번호 162), ARC794(서열 번호 164), ARC795(서열 번호 165) 또한 트랜스AMTM 분석에서 강력한 활성을 나타내었다.
실시예 3D: 최적화된 ARC979 유도체에 대한 세포-기반 분석 결과
IL-23에 대한 높은 친화도를 보여주는, 실시예 2B.2에 기재된 최적화 ARC979 유도체 중 여러 개를, 상술된 PHA 블라스트 분석을 이용하여 IL-23 유도 STAT3 활성화를 억제하는 이들의 능력에 대해 스크리닝하였다. IL-23-유도 STAT3 인산화의 억제는 패쓰스캔® 포스포-STAT3(Tyr705) 샌드위치 ELISA 키트(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)를 이용하여 측정하였다.
상기 트랜스AMTM 분석 방법과 유사하게, 패쓰스캔® 포스포-STAT3(Tyr705) 샌드위치 ELISA 키트는 96-웰 플레이트의 웰 상에 코팅된 STAT3 토끼 모노클로날 항체를 사용함으로써 포스포-STAT3(Tyr705) 단백질의 내재 수준을 검출한다. 세포 용해물과의 항온처리 후, 비포스포-STAT3 및 포스포-STAT3 단백질 둘 다를 코팅된 항체로 포획하였다. 포스포-STAT3 마우스 모노클로날 항체를 첨가하여 포획된 포스포-STAT3 단백질을 검출한 후, HRP-결합 항-마우스 항체를 사용하여 결합된 검출 항체를 인식하였다. HRP 기질인 TMB를 첨가하여 발색시켰고, 이 발색된 색상에 대한 광학 밀도의 크기는 포스포-STAT3 단백질의 양에 비례하였다.
PHA 블라스트를 상술한 바와 같이 단리하고 준비한 다음, 트랜스AMTM 분석에서 상술된 바와 같이 3 ng/㎖ 대신에 6 ng/㎖의 최종 일정 농도에서 hIL-23으로 처리하여 (R&D Systems, Minneapolis, MN), STAT3 활성화를 유도하였다. 트랜스AMTM 분석에서 상술된 바와 같이 3 ng/㎖ 대신에 6 ng/㎖의 일정한 IL-23 농도와 함께 3배 희석에서의 0 내지 700 nM의 6-점 IL-23 적정을 이용하여, 2C에서 기재된 선별 로부터 얻은 여러 클론을 스크리닝함으로써 STAT3 활성화를 유도하였다. 패쓰스캔® 키트에 의해 제공된 완충제를 사용하여 처리된 세포의 용해물을 준비하고, 제조자의 지시에 따라 분석을 진행하였다. 전장 클론에 대한 IC50을 투여량 반응 곡선으로부터 계산하였다.
트랜스AMTM 방법을 이용할 때 40 +/- 10 nM의 IC50을 나타낸 ARC979는 패쓰스캔® 방법을 이용할 때에는 6 +/- 1 nM의 IC50을 일관되게 나타내었다. 상술한 바와 같이 이 IC50 값은 실시예 2B.2에 기재된 직접적 결합 분석 조건 하에서 반복적으로 입증된 1 nM의 ARC979에 대한 KD 값과 일치하였다. 표 36으로부터 알 수 있는 바와 같이, ARC979의 최적화 유도체 중 여러 개는 패쓰스캔® 방법을 이용하여 직접 비교할 경우 ARC979보다 훨씬 더 높은 효능을 현저하게 나타내었고, 특히 ARC1624 및 ARC1625는 각각 2 nM 및 4 nM의 IC50 값을 제공하였다.
도 24는 패쓰스캔® 분석에서 IL-23에 대한 높은 친화도 및 강력한 세포-기반 활성 둘 다를 나타내는 최적화 클론 중 여러 개에 대한 투여량 반응 곡선의 예이다. 표 36은 시험한 최적화 앱타머에 대한 투여량 반응 곡선으로부터 유도된 IC50을 요약한 것이다.
[표 36]
패쓰스캔® 분석에서의 최적화 ARC979 유도체에 대한 IC50
Figure 112006072186688-PCT00057
실시예 3E: 마우스 IL -23 선별로부터 얻은 모클론 및 최소화 클론에 대한 세포-기반 분석 결과
PHA 블라스트 분석 및 상기 트랜스AMTM 방법을 이용하여, 마우스 IL-23이 인간 PHA 블라스트에서 STAT3을 활성화시킨다는 것을 밝혔다(도 25 참조). 따라서, mIL-23에 대한 친화도를 나타내어 인간 PHA 블라스트 세포에서 마우스 IL-23 유도 STAT3 활성화를 차단하는, 실시예 1E에 기재된 마우스 IL-23 선별로부터 얻은 모클론 및 이 선별로부터 얻은 최소화 클론(실시예 2A.4에 기재됨)의 능력을 트랜스AMTM 분석을 이용하여 측정하였다. 이용된 프로토콜은 PHA 블라스트에서 STAT3 활성화를 유도하기 위해 3 ng/㎖의 농도에서 인간 IL-23을 사용하는 대신에 30 ng/㎖의 농도 에서 마우스 IL-23을 사용하였다는 점을 제외하고는 상술된 바와 동일하였다. 모클론에 대한 결과는 표 37에 기재되어 있고, 최소화 클론에 대한 결과는 하기 표 38에 기재되어 있다.
[표 37]
트랜스AMTM 분석에서의 모 mIL-23-rRfY 클론 활성
Figure 112006072186688-PCT00058
[표 38]
트랜스AMTM 분석에서의 마우스 IL-23 rRfY 최소화 클론 활성
Figure 112006072186688-PCT00059
본 발명은 현재로서는 기재된 설명 및 실시예를 통해 설명되어 있지만, 당업자는 본 발명이 다양한 실시양태로 실시될 수 있고 상기 설명 및 실시예는 설명을 위한 것이지 하기 특허청구범위를 제한하고자 하는 것이 아님을 인식할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Archemix Corp., et al. <120> Aptamers to the Human IL-12 Cytokine Family and Their Use as Autoimmune Disease Therapeutics <130> 23239-578-061 <140> PCT/US2005/007666 <141> 2005-03-07 <150> 60/550,962 <151> 2004-03-05 <150> 60/608,046 <151> 2004-09-07 <160> 317 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 93 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (25)..(54) <223> n is a, t, c, or g <400> 1 catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa 60 cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta 93 <210> 2 <211> 92 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n is a, t, c, or g <400> 2 catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 3 <211> 92 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n is a, t, c, or g <400> 3 catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 4 <211> 328 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325 <210> 5 <211> 189 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr 1 5 10 15 Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln 20 25 30 Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His 35 40 45 Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr 50 55 60 Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln 65 70 75 80 Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly 85 90 95 Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu 100 105 110 Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu 115 120 125 Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr 130 135 140 Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu 145 150 155 160 Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala 165 170 175 Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro 180 185 <210> 6 <211> 253 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala 1 5 10 15 Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg 20 25 30 Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val 35 40 45 Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro 50 55 60 Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg 65 70 75 80 Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr 85 90 95 Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys 100 105 110 Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu 115 120 125 Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys 130 135 140 Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser 145 150 155 160 Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn 165 170 175 Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn 180 185 190 Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser 195 200 205 Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys 210 215 220 Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala 225 230 235 240 Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 245 250 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic CpG <400> 7 aacgttcgag 10 <210> 8 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (25)..(64) <223> n is a, u, c, or g <400> 8 gggaaaagcg aaucauacac aagannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnngcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 9 taatacgact cactataggg aaaagcgaat catacacaag a 41 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 10 ttctcggttg gtctctggcg gagc 24 <210> 11 <211> 24 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 11 gggaaaagcg aaucauacac aaga 24 <210> 12 <211> 24 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 12 gcuccgccag agaccaaccg agaa 24 <210> 13 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 13 gggaaaagcg aaucauacac aagagaggua ugugguuuug cggagcaacu cgugucagcg 60 gucagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 14 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 14 gggaaaagcg aaucauacac aagaaugaau uccguccacg ggcgcccgau gaugucaguu 60 uucggcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 15 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 15 gggaaaagcg aaucauacac aagauuagug cguguguuga aagggcucau aaugucagua 60 ucgagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 16 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 16 gggaaaagcg aaucauacac aagauuaggc gucgugacaa uaacuggucc acgagcaugu 60 cagugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 17 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 17 gggaaaagcg aaucauacac aagauggaag gcgaucguag caguaaccca augauuggga 60 ccuagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 18 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 18 gggaaaagcg aaucauacac aagaucucuu uggccgacgc aacaaugcuc uuuuccgacc 60 uugcgcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 19 <211> 89 <212> RNA <213> artificial sqeuence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(89) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n is a, u, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is a, u, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a, u, c, or g <400> 19 gggaaaagcg aauccuaccc aagauguugu uggcguugau cguaugauun auggagngug 60 ucngugcucc gccagagacc aaccgagaa 89 <210> 20 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 20 gggaaaagcg aaucauacac aagaugcgcu auguuuggcu gggaauugua gcauugcuca 60 aguggcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 21 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, u, c, or g <400> 21 gggaaaagcg aaucauacac aagauguuga accucuugug cgucccgaug uuungcaaug 60 uggagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 22 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 22 gggaaaagcg aaucauacac aagaauguau acaaugcccu aucgucaguu aggcaugugu 60 ggaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 23 <211> 89 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(89) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 23 gggaaaagcg aaucauacac aagacagagg caaugagagc cuggcgaugu cagucgcauc 60 uugcugcucc gccagagacc aaccgagaa 89 <210> 24 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 24 gggaaaagcg aaucauacac aagaucgcaa aaggaguuug ucucugcucu cggagugugu 60 cagugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 25 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 25 gggaaaagcg aaucauacac aagagaugac uacacgccag ugugcgcuuu uugcggaguu 60 agcggcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 26 <211> 89 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(89) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 26 gggaaaagcg aaucauacac aagagucgug augauuuggg uuaugucagu ucccuguaug 60 guuucgcucc gccagagacc aaccgagaa 89 <210> 27 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 27 gggaaaagcg aaucauacac aagaguuuua uguggguccc gaugauuaac uuuauuggcg 60 cauugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 28 <211> 90 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(90) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 28 gggaaaagcg aaucauacac aagagaacga guauauuugc gcuggcggag aagucucucg 60 aagggagcuc cgccagagac caaccgagaa 90 <210> 29 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 29 gggaaaagcg aaucauacac aagaguauca uucggcuggu gggagaaauc ucuguagaua 60 uagagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 30 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 30 gggaaaagcg aaucauacac aagauagcgu cuaugauggc ggagaagcaa guguagcaua 60 acaggcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 31 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 31 gggaaaagcg aaucauacac aagaguguug aaugagcgcu gguggacaga ucuuugguua 60 cagagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 32 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 32 gggaaaagcg aaucauacac aagacucaug gauauggccu agcagccgug gaagcgguca 60 uucugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 33 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 33 gggaaaagcg aaucauacac aagaucccag cgguacguga gucuguuaaa ggccaccuaa 60 ugucgcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 34 <211> 87 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(87) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 34 gggaaaagcg aaucauacac aagaguaaug ugggucccga ugauucgcug ugcggcguuu 60 guagcuccgc cagagaccaa ccgagaa 87 <210> 35 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n at position 44 is a, u, c, or g <400> 35 gggaaaagcg aaucauacac aagagguuga guacgacgga gucnuggcua acacggaaac 60 uagagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 36 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 36 gggaaaagcg aaucauacac aagagucaug gcuuacaauu gaaacaagag cucgcgugac 60 acaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 37 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 37 gggaaaagcg aaucauacac aagaacggcu aggcaucaau ggccagcaaa aauagucgug 60 uaaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 38 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 38 gggaaaagcg aaucauacac aagaccaucg gacgaggcgg gucaccuuuu acgcuuucga 60 gcuggcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 39 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 39 gggaaaagcg aaucauacac aagaugguuc ccacgugaaa guggcuagcg aguaccccac 60 uuaugcuccg ccagagacca accaaggg 88 <210> 40 <211> 90 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(90) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n at position 61 is a, u, c, or g <400> 40 gggaaaagcg aaucauacac aagagcgcuu uagcggguau agcacuuuuc aucuaaugaa 60 nccguagcuc cgccagagac caaccgagaa 90 <210> 41 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 41 gggaaaagcg aaucauacac aagaucuacg auuguucagg uuuuuuguac ucaacuaaag 60 gcgagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 42 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 42 gggaaaagcg aaucauacac aagauugucu cggauugguc acucccauuu uuguucgcuu 60 aacggcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 43 <211> 89 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(89) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 43 gggaaaagcg aaucauacac aagaaguuuu uugugcucug aguacucagc guccguaagg 60 gauaugcucc gccagagacc aaccgagaa 89 <210> 44 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 44 gggaaaagcg aaucauacac aagaagugcu ucaugcggca aacugcauga cgucgaauag 60 auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 45 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 45 gggaaaagcg aaucauacac aagagaggua ugugguuuug cggagcaacu cgugucagcg 60 gucagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 46 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 46 gggaaaagcg aaucauacac aagaugugcu ugaguuaaau cucaucgucc ccguuugggg 60 auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 47 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 47 gggaaaagcg aaucauacac aagaaguuuu ugugcucuga guacucagcg uccguaaggg 60 auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 48 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 48 gggaaaagcg aaucauacac aagagaugua uucaggcggu ccgcauugau gucaguuaug 60 cguagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 49 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 49 gggaaaagcg aaucauacac aagaaugguc ggaaucucug gcgccacgcu gaguauagac 60 ggaagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 50 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 50 gggaaaagcg aaucauacac aagagugcuu cguauguuga auacgacguu cgcaggacga 60 auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 51 <211> 87 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(87) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n at position 75 is a, u, c, or g <400> 51 agggaaaagg aaucauacac aagauguauc auccggucgu acaaaagcgc cacggaacca 60 uucgcuccgc caganaccaa ccgagaa 87 <210> 52 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 52 gggaaaagcg aaucauacac aagacgcguc agguccacgc ugaaauuuau uuucggcagu 60 guaagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 53 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 53 gggaaaagcg aaucauacac aagauaugug ccugggaugg acgacauccc cugucuaagg 60 auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 54 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 54 gggaaaagcg aaucauacac aagauuacuc cguuaguguc aguugacgga gggagcguac 60 uauugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 55 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 55 gggaaaagcg aaucauacac aagacauugu gcuuuaucac gugggugaua acgacgaaag 60 uuaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 56 <211> 89 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(89) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 56 gggaaaagcg aaucauacac aagacagugu augaggaaga uuacuuccau uccugagcgg 60 uuuucgcucc gccagagacc aaccgagaa 89 <210> 57 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 57 gggaaaagcg aaucauacac aagauuggca augugaccuu caacccuuuu cccgaugaac 60 aguggcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 58 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 58 gggaaaagcg aaucauacac aagacaugac ugcaugcuuc gggaguaucu cggucccgac 60 guucgcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 59 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 59 gggaaaagcg aaucauacac aagacuuauc gccucaaggg ggguaauaaa cccagcgugu 60 gcaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 60 <211> 89 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(89) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 60 gggaaaagcg aaucauacac aagaauccug gcuucgcaua guguaugggu aguacgacag 60 cgcgugcucc gccagagacc aaccgagaa 89 <210> 61 <211> 89 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(89) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 61 gggaaaagcg aaucauacac aagaacgcau agucggauuu accgaucauu cugugccuuc 60 gugacgcucc gccagagacc aaccgagaa 89 <210> 62 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 62 gggaaaagcg aaucauacac aagaauugug cuuacaacuu ucguuguacc gacgugucag 60 uuaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 63 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 63 gggaaaagcg aaucauacac aagaguguau uacccccaac ccagggggac cauucgcgua 60 acaagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 64 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 64 gggaaaagcg aaucauacac aagacuuaac agugcggggc gcaguguaua gauccgcaau 60 gugugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 65 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 65 gggaaaagcg aaucauacac aagacgauag uaugaccuuu ugaaaggcuu cccgagcggu 60 guucgcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 66 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 66 gggaaaagcg aaucauacac aagacgugug cuuuauguaa accauaacgu uccauaagga 60 auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 67 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 67 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 68 catcgatcga tcgatcgaca gc 22 <210> 69 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 69 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 70 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 70 gcugucgauc gaucgaucga ug 22 <210> 71 <211> 74 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 71 gggagaggag agaacguucu acaaaugaga gcaggccgaa gaggagucgc ucgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 72 <211> 74 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 72 gggagaggag agaacguucu acaaaugaga gcaggccgaa aaggagucgc ucgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 73 <211> 74 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 73 gggagaggag agaacguucu acaaaugaga gcaggccgaa aaggagucgc ucgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 74 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 74 gggagaggag agaacguucu acgguaaagc aggcugacug aaagguugaa gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 75 <211> 74 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 75 gggagaggag agaacguucu acagguuaag agcaggcuca ggaauggaag ucgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 76 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 76 gggagaggag agaacguucu acaacaaagc aggcucauag uaauauggaa gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 77 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 77 gggagaggag agaacguucu acaacaaagc aggcucauag uaauauggaa gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 78 <211> 74 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 78 gggagaggag agaacguucu acaaaagaga gcaggccgaa aaggagucgc ucgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 79 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 79 gggagaggag agaacguucu acaaaaggca ggcucagggg aucacuggaa gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 80 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 80 gggagaggag agaacguucu acaagauaua auuaaggaua agugcaaagg agacgcuguc 60 gaucgaucga ucgaug 76 <210> 81 <211> 74 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 81 gggagaggag agaacguucu acgaaugaga gcaggccgaa aaggagucgc ucgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 82 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 82 gggagaggag agaacguucu acgagaggca agagagaguc gcauaaaaaa gacgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 83 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 83 gggagaggag agaacguucu acgcaggcug ucguagacaa acgaugaagu cgcgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 84 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 84 gggagaggag agaacguucu acggaaaaag auaugaaaga aaggauuaag agacgcuguc 60 gaucgaucga ucgaug 76 <210> 85 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a, u, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a, u, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n is a, u, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> n is a, u, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, u, c, or g <400> 85 gggagaggag agaacguucu acggaaggna acaanagcac uguuugugca ggcgcugucg 60 aucnaucnau cnaug 75 <210> 86 <211> 73 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(73) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 86 gggagaggag agaacguucu acuaaugcag gcucaguuac uacuggaagu cgcugucgau 60 cgaucgaucg aug 73 <210> 87 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 87 aggagaggag agaacguucu acuagaagca ggcucgaaua caauucggaa gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 88 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 88 gggagaggag agaacguucu acauaagcag gcuccgauag uauucgggaa gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 89 catcgatcga tcgatcgaca gc 22 <210> 90 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 90 gcugucgauc gaucgaucga ug 22 <210> 91 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 91 gggagaggag agaacguucu acagcgccgg ugggcgggca uuggguggau gcgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 92 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 92 gggagaggag agaacguucu acagccuuuu ggguaagggg aggggugccg gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 93 <211> 75 <212> DNA <213> artificials sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 93 gggagaggag agaacguucu acguaacggg gugggagggg cgaacaacuu gacgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 94 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 94 gggagaggag agaacguucu acagcgccgg ugggugggca uaggguggau gcgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 95 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 95 gggagaggag agaacguucu acgggcuacg gggauggagg guggguccca gacgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 96 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 96 gggagaggag agaacguucu acacggggug ggaggggcga gucgcaugga ugcgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 97 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 97 gggagaggag agaacguucu acucaaugac cgcgcgaggc ucugggagag ggcgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 98 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (23)..(52) <223> n is a, u, c, or g <400> 98 gggagaggag agaacguucu acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 99 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 99 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39 <210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 100 catcgatgat cgatcgatcg ac 22 <210> 101 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 101 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 102 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 102 gucgaucgau cgaucaucga ug 22 <210> 103 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 103 gggagaggag agaacguucu acaggcaagg caauugggga gugugggugg ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 104 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 104 gggagaggag agaacguucu acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 105 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 105 gggagaggag agaacguucu acaaggcggu acggggagug uggguugggg ccggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 106 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 106 gggagaggag agaacguucu acgauauagg cgguacgggg ggagugggcu ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 107 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 107 gggagaggag agaacguucu acaggaaagg cgcuugcggg gggugaggga ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 108 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 108 gggagaggag agaacguucu acaggcgguu acgggggaug cgggugggac aggucgaucg 60 aucgaucauc gaug 74 <210> 109 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 109 gggagaggag agaacguucu acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gggucgaucg 60 aucgaucauc gaug 74 <210> 110 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 110 gggagaggag agaacguucu acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugucgaucg 60 aucgaucauc gaug 74 <210> 111 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 111 gggagaggag agaacguucu acaggcaagg caauugggga gcgugggugg gggggucgau 60 cgaucgauca ucgaug 76 <210> 112 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 112 gggagaggag agaacguucu acaauugcag guggugccgg ggguuggggg cgggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 113 <211> 73 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(73) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 113 gggagaggag agaacguucu acaggcucaa aagaggggga ugugggaggg ggucgaucga 60 ucgaucaucg aug 73 <210> 114 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 114 gggagaggag agaacguucu acaggcgcag ccagcgggga gugagggugg gggucgaucg 60 aucgaucauc gaug 74 <210> 115 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 115 gggagaggag agaacguucu acaggccgau gagggggagc aguggguggg gggucgaucg 60 aucgaucauc gaug 74 <210> 116 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 116 gggagaggag agaacguucu acuagugagg cgguaacggg gggugagggu ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 117 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 117 gggagaggag agaacguucu acagguaggc aagauauugg gggaagcggg uggggucgau 60 cgaucgauca ucgaug 76 <210> 118 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 118 gggagaggag agaacguucu acacauggcu cgaaagaggg gcgugagggu ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 119 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(57) <223> n is a, u, c, or g <400> 119 ggagcgcacu cagccacnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnuuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 120 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 120 taatacgact cactatagga gcgcactcag ccac 34 <210> 121 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 121 gctagcagag aggtcgaaa 19 <210> 122 <211> 17 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 122 ggagcgcacu cagccac 17 <210> 123 <211> 19 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 123 uuucgaccuc ucugcuagc 19 <210> 124 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 124 ggagcgcacu cagccacagg uggcuuaaua cuguaaagac gugcgcgcag agggauuuuc 60 gaccucucug cuagc 75 <210> 125 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 125 ggagcgcacu cagccaccgu aauucacaag gucccugagu gcaggguugu auguuuguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 126 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 126 ggagcgcacu cagccacucu acucgauaua guuuaucgag ccggugguag auuaugauuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 127 <211> 75 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 127 ggagcgcacu cagccacgcc uacaauucac ugugauauau cgaauuauag cccugguuuc 60 gaccucucug cuagc 75 <210> 128 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 128 ggagcgcacu cagccaccgg cuuaauaucc aauaggaacg uucgcucuga gcaggcguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 129 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 129 ggagcgcacu cagccacagc ucgguggcuu aauaucuaug ugaacgugcg caacagcuuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 130 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 130 ggagcgcacu cagccaccuu gggcuuaaua ccuaucggau gugcgccuag cacggaauuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 131 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n is a, u, c, or g <400> 131 ggagcgcacu cagccacggu uuacuuccgu ggcaauauug accucncucu agacagguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 132 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 132 ggagcgcacu cagccaccug ggaaaaucug ggucccugag uucuaacagc agagauuuuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 133 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a,u, c or g <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n is a, u, c or g <400> 133 ggagcgcacu cngccacuuc ggaauaucgu ugucuucugg gugagcaugc guugagguuu 60 cnaccucucu gcuagc 76 <210> 134 <211> 76 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n is a, u, c, or g <400> 134 ggagcgcacu cagccacugg ggaacaucuc augucucuga ccgcucuugc aguagaauuu 60 ngaccucucu gcuagc 76 <210> 135 <211> 60 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(60) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 135 ggagaucaua cacaagaagu uuuuugugcu cugaguacuc agcguccgua agggaucucc 60 <210> 136 <211> 48 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(48) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 136 ggagucugag uacucagcgu ccguaaggga uaugcuccgc cagacucc 48 <210> 137 <211> 39 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(39) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 137 ggaguuacuc agcguccgua agggauaugc uccgacucc 39 <210> 138 <211> 50 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(50) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 138 ggagucugag uacucagcgu cccgagaggg gauaugcucc gccagacucc 50 <210> 139 <211> 61 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(61) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 139 ggagcauaca caagaaguuu uuugugcucu gaguacucag cguccguaag ggauaugcuc 60 c 61 <210> 140 <211> 51 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(51) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 140 ggaguacgcc gaaaggcgcu cugaguacuc agcguccgua agggauacuc c 51 <210> 141 <211> 65 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(65) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 141 ggagcgaauc auacacaaga agugcuucau gcggcaaacu gcaugacguc gaauagauau 60 gcucc 65 <210> 142 <211> 55 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(55) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 142 ggaucauaca caagaagugc uucaugcggc aaacugcaug acgucgaaua gaucc 55 <210> 143 <211> 47 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(47) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 143 ggaucauaca caagaagugc uucacgaaag ugacgucgaa uagaucc 47 <210> 144 <211> 60 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(60) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 144 ggagcauaca caagaagugc uucaugcggc aaacugcaug acgucgaaua gauaugcucc 60 <210> 145 <211> 46 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(46) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 145 ggaguacaca agaagugcuu ccgaaaggac gucgaauaga uacucc 46 <210> 146 <211> 30 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(30) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 146 gguuaaaucu caucgucccc guuuggggau 30 <210> 147 <211> 57 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(57) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 147 ggacauacac aagaugugcu ugaguuaaau cucaucgucc ccguuugggg auauguc 57 <210> 148 <211> 47 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(47) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 148 ggcauacacg agagugcugu cgaaagacuc ggccgagagg cuaugcc 47 <210> 149 <211> 47 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(47) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 149 ggcauacgcg agagcgcugg cgaaagccuc ggccgagagg cuaugcc 47 <210> 150 <211> 43 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(43) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 150 ggauacccga gagggcuggc gaaagccucg gcgagagcua ucc 43 <210> 151 <211> 47 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(47) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 151 ggguacgccg aaaggcgcuu ccgaaaggac guccguaagg gauaccc 47 <210> 152 <211> 49 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(49) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 152 ggaguacgcc gaaaggcgcu uccgaaagga cguccguaag ggauacucc 49 <210> 153 <211> 42 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(42) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 153 ggaaucauac cgagagguau uaccccgaaa ggggaccauu cc 42 <210> 154 <211> 48 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(48) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 154 ggaaucauac acaagagugu auuaccccca acccaggggg accauucc 48 <210> 155 <211> 57 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(57) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 155 ggaagaaugg ucggaaucuc uggcgccacg cugaguauag acggaagcuc cgccaga 57 <210> 156 <211> 39 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(39) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 156 ggaggcgcca cgcugaguau agacggaagc uccgccucc 39 <210> 157 <211> 58 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(58) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 157 ggacacaaga gauguauuca ggcgguccgc auugauguca guuaugcgua gcuccgcc 58 <210> 158 <211> 38 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(38) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 158 ggcgguccgc auugauguca guuaugcgua gcuccgcc 38 <210> 159 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 159 acagcgccgg ugggcgggca uuggguggau gcgcugu 37 <210> 160 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(32) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 160 gcgccggugg gcgggcaccg gguggaugcg cc 32 <210> 161 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(35) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 161 acagcgccgg uguuuucauu ggguggaugc gcugu 35 <210> 162 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 162 ggcaaguaau uggggagugc gggcgggg 28 <210> 163 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 163 cuacaaggcg guacggggag ugugg 25 <210> 164 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(30) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 164 ggcgguacgg ggaguguggg uuggggccgg 30 <210> 165 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(36) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 165 cgauauaggc gguacggggg gagugggcug gggucg 36 <210> 166 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(31) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 166 uaauugggga gugcgggcgg ggggucgauc g 31 <210> 167 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(27) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 167 gguggggagu gcgggcgggg ggucgcc 27 <210> 168 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(35) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 168 acaggcaagg uaauugggga gugcgggcgg ggugu 35 <210> 169 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(35) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 169 ccaggcaagg uaauugggga gugcgggcgg ggugg 35 <210> 170 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(29) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 170 ggcaagguaa uugggaagug ugggcgggg 29 <210> 171 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(29) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 171 ggcaagguaa uuggguagug agggcgggg 29 <210> 172 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(29) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 172 ggcaagguaa uuggggagug cgggcuggg 29 <210> 173 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(29) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 173 ggcaagguaa uugggaagug ugggcuggg 29 <210> 174 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(29) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 174 ggcaagguaa uuggguagug agggcuggg 29 <210> 175 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(35) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 175 acaggcaagg uaauugggua gugagggcug ggugu 35 <210> 176 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(40) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> t at position 41 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 176 gauguuggca aguaauuggg gagugcgggc gggguucauc t 41 <210> 177 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 177 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 178 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 178 ccaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugg 34 <210> 179 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 179 ggcgguuacg ggggaugcgg guggg 25 <210> 180 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(30) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 180 ggcgguuacg ggggaugcgg gugggacagg 30 <210> 181 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(26) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 181 ggcaaguaau uggggagugc gggcgg 26 <210> 182 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(32) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 182 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggu gu 32 <210> 183 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 183 ggcgguacgg ggaguguggg uuggggcc 28 <210> 184 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 184 ggcgguacgg ggaguguggg cuggggcc 28 <210> 185 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 185 gguacgggga guguggguug gg 22 <210> 186 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 186 gguacgggga gugugggcug gg 22 <210> 187 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(27) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 187 ggcgguacgg ggaguguggg uugggcc 27 <210> 188 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(27) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 188 ggcgguacgg ggaguguggg cugggcc 27 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 189 gguacgggga guguggguug g 21 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 190 gguacgggga gugugggcug g 21 <210> 191 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 191 ggcgguacgg ggggaguggg cugggguc 28 <210> 192 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(27) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 192 ggcgguacgg ggggaguggg cuggguc 27 <210> 193 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 193 ggcgguacgg ggagaguggg cugggguc 28 <210> 194 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 194 gguacggggg gagugggcug gg 22 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 195 gguacggggg gagugggcug g 21 <210> 196 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 196 gguacgggga gagugggcug gg 22 <210> 197 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 197 ggcgguacgg ggggaguggg cuggg 25 <210> 198 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 198 ggcgguacgg ggaguguggg uuggg 25 <210> 199 <211> 43 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(43) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 199 gggcacucag ccacaggugg cuuaauacug uaaagacgug ccc 43 <210> 200 <211> 48 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(48) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 200 ggagcgcacu cagccaccgg cuuaauaucc aauaggaacg uucgcucu 48 <210> 201 <211> 48 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(48) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 201 gggcacucag ccacagcucg guggcuuaau aucuauguga acgugccc 48 <210> 202 <211> 43 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(43) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 202 gggcacucag ccaccuuggg cuuaauaccu aucggaugug ccc 43 <210> 203 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> deoxy purine at position 1 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 2 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 203 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 204 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 2 is linked to deoxy adenosine at position 3 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 204 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 205 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 6 is linked to deoxy adenosine at position 7 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 205 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 206 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> deoxy adenosine at position 7 is linked to deoxy adenosine at position 8 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 206 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 207 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy adenosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 207 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 208 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> deoxy guanosine at position 9 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 10 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 208 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 209 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> 2'-O-methyl uridine at position 10 is linked to deoxy adenosine at position 11 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 209 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 210 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> deoxy adenosine at position 11 is linked to deoxy adenosine at position 12 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 210 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 211 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> deoxy adenosine at position 12 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 13 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 211 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 212 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> 2'-O-methyl uridine at position 13 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 14 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 212 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 213 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2'-O-methyl uridine at position 14 is linked to deoxy guanosine at position 15 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 213 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 214 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy adenosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 214 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 215 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy adenosine at position 19 is linked to deoxy guanosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 215 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 216 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 216 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 217 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 2'-O-methyl uridine at position 21 is linked to deoxy guanosine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 217 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 218 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> deoxy guanosine at position 22 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 23 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 218 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 219 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> deoxy guanosine at position 26 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 27 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 219 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 220 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 27 is linked to deoxy guanosine at position 28 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 220 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 221 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> deoxy guanosine at position 28 is linked to deoxy guanosine at position 29 via a phopshorothioate internucleotide linkage <400> 221 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 222 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> 2'-O-methyl uridine at position 32 is linked to deoxy guanosine at position 33 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 222 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 223 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> deoxy guanosine at position 33 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 34 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 223 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34 <210> 224 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 224 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 225 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 1, wherein adenosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 225 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 226 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 3, wherein adenosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 226 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 227 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 4, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 227 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 228 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 5, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 228 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 229 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 7, wherein adenosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 229 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 230 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 8, wherein adenosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 230 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 231 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 9, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 231 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 232 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 11, wherein adenosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 232 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 233 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 12, wherein adenosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 233 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 234 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 15, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 234 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 235 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 16, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 235 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 236 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 17, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 236 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 237 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 18, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 237 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 238 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 19, wherein adenosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 238 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 239 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 20, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 239 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 240 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 22, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 240 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 241 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 24, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 241 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 242 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 25, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 242 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 243 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 26, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 243 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 244 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 28, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 244 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 245 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 29, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 245 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 246 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 30 wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 246 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 247 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 31 wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 247 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 248 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 33 wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 248 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 249 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 1 and 3, wherein adenosine is 2'-O-methyl and position 33 wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 249 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 250 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 7 and 8, wherein adenosine is 2'-O-methyl and position 15 wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 250 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 251 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> deoxy adenosine at position 3 is linked to deoxy guanosine at position 4 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 251 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 252 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> deoxy guanosine at position 4 is linked to deoxy guanosine at position 5 via a pohsphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 252 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 253 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> deoxy guanosine at position 5 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 6 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 253 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 254 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> deoxy guanosine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 254 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 255 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy guanosine at position 16 is linked to deoxy guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 255 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 256 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> deoxy guanosine at position 17 is linked to deoxy guanosine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 256 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 257 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 23 is linked to deoxy guanosine at position 24 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 257 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 258 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> deoxy guanosine at position 24 is linked to deoxy guanosine at position 25 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 258 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 259 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> deoxy guanosine at position 25 is linked to deoxy guanosine at position 26 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 259 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 260 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> deoxy guanosine at position 29 is linked to deoxy guanosine at position 30 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 260 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 261 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> deoxy guanosine at position 30 is linked to deoxy guanosine at position 31 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 261 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 262 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> deoxy guanosine at position 31 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 32 via a phosporothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 262 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 263 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> deoxy adenosine at position 11 is linked to deoxy adenosine at position 12 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy adenosine at position 19 is linked to deoxy guanosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 2'-O-methyl uridine at position 21 is linked to deoxy guanosine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> deoxy guanosine at position 22 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 23 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> deoxy guanosine at position 26 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 27 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 263 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 264 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> deoxy adenosine at position 3 is linked to deoxy guanosine at position 4 via a PEG spacer <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> deoxy guanosine at position 31 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 32 via a PEG spacer <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 264 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 265 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(36) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 2 and 36, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> deoxy adenosine at position 5 is linked to deoxy guanosine at position 6 via a PEG spacer <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> deoxy guanosine at position 32 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 33 via a PEG spacer <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> thymidine at position 37 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 265 cgcaggcaag uaauugggga gugcgggcgg ggugcgt 37 <210> 266 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> thymidine at position 29 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 266 ggcaaguaau uggggagugc gggcggggt 29 <210> 267 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 4 and 5, wherein adenosine is 2'-O-methyl, and position 12 wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> thymidine at position 29 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 267 ggcaaguaau uggggagugc gggcggggt 29 <210> 268 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy adenosine at position 8 is linked to deoxy adenosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy adenosine at position 16 is linked to deoxy guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> deoxy guanosine at position 17 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 18 via a phosphorothioate internucleotid linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl uridine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy guanosine at position 19 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> deoxy guanosine at position 23 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 24 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> thymidine at position 29 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 268 ggcaaguaau uggggagugc gggcggggt 29 <210> 269 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(28) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 4 and 5, wherein adenosine is 2'-O-methyl, and position 12, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy adenosine at position 8 is linked to deoxy adenosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy adenosine at position 16 is linked to deoxy guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> deoxy guanosine at position 17 is linked to 2'-O-methyl uridine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-O-methyl uridine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy guanosine at position 19 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> deoxy guanosine at position 23 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 24 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> thymidine at position 29 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 269 ggcaaguaau uggggagugc gggcggggt 29 <210> 270 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 1 wherein adenosine is 2'-O-methyl, and position 33, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 270 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 271 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 8 and 11 wherein adenosine is 2'-O-methyl, and position 9, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 271 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 272 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at position 19 wherein adenosine is 2'-O-methyl, and positions 18, 20, and 22, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 272 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 273 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 26, 28, and 29, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 273 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 274 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 1, 8, 11, and 19, wherein adenosine is 2'-O-methyl, and positions 9, 18, 20, 22, 26, 28, 29, and 33, wherein guanosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 274 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 275 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 16, 17, 24, 25, 30, and 31, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 275 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 276 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are 2'-O-methyl, except at positions 3, 7, and 12, wherein adenosine is deoxy; and positions 4, 5, and 15, wherein guanosine is deoxy <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 276 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 277 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n at position 4 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 277 acangcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 278 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n at position 5 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 278 acagncaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 279 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n at positions 4 and 5 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 279 acanncaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 280 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n at position 9 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 280 acaggcaanu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 281 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n at position 15 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 281 acaggcaagu aauungggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 282 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 282 acaggcaagu aauugnggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 283 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n at position 17 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 283 acaggcaagu aauuggngag ugcgggcggg gugut 35 <210> 284 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 284 acaggcaagu aauugggnag ugcgggcggg gugut 35 <210> 285 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n at positions 15 and 16 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 285 acaggcaagu aauunnggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 286 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n at positions 16 and 17 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 286 acaggcaagu aauugnngag ugcgggcggg gugut 35 <210> 287 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n at positions 17 and 18 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 287 acaggcaagu aauuggnnag ugcgggcggg gugut 35 <210> 288 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> n at positions 15, 16, 17, and 18 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 288 acaggcaagu aauunnnnag ugcgggcggg gugut 35 <210> 289 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 289 acaggcaagu aauuggggan ugcgggcggg gugut 35 <210> 290 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n at position 22 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 290 acaggcaagu aauuggggag uncgggcggg gugut 35 <210> 291 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n at position 24 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 291 acaggcaagu aauuggggag ugcnggcggg gugut 35 <210> 292 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n at position 25 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 292 acaggcaagu aauuggggag ugcgngcggg gugut 35 <210> 293 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n at position 26 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 293 acaggcaagu aauuggggag ugcggncggg gugut 35 <210> 294 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n at positions 24 and 25 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 294 acaggcaagu aauuggggag ugcnngcggg gugut 35 <210> 295 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n at positions 25 and 26 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 295 acaggcaagu aauuggggag ugcgnncggg gugut 35 <210> 296 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(26) <223> n at positions 24, 25, and 26 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 296 acaggcaagu aauuggggag ugcnnncggg gugut 35 <210> 297 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n at position 28 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 297 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcngg gugut 35 <210> 298 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n at position 29 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 298 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcgng gugut 35 <210> 299 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n at position 30 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 299 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggn gugut 35 <210> 300 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n at position 31 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 300 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg nugut 35 <210> 301 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> n at positions 28 and 29 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 301 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcnng gugut 35 <210> 302 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n at positions 29 and 30 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 302 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcgnn gugut 35 <210> 303 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> n at positions 30 and 31 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 303 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggn nugut 35 <210> 304 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(31) <223> n at positions 28, 29, 30 and 31 are deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 304 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcnnn nugut 35 <210> 305 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n at position 33 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 305 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gunut 35 <210> 306 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 16, 17, 24, 25, 30 and 31, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 2 is linked to deoxy adenosine at position 3 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 306 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 307 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 16, 17, 24, 25, 30, and 31, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> deoxy adenosine at position 3 is linked to deoxy guanosine at position 4 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> deoxy guanosine at position 4 is linked to deoxy guanosine at position 5 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 307 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 308 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(24) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 16, 17, 24, 25, 30 and 31, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 6 is linked to deoxy adenosine at position 7 via a phoshorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> deoxy adenosine at position 7 is linked to deoxy adenosine at position 8 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy adenosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> 2'-O-methyl uridine at position 10 is linked to deoxy adenosine at position 11 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> deoxy adenosine at position 11 is linked to deoxy adenosine at position 12 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2'-O-methyl uridine at position 14 is linked to deoxy guanosine at position 15 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 308 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 309 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 16, 17, 24, 25, 30 and 31, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 17 is linked to deoxy guanosine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy adenosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy adenosine at position 19 is linked to deoxy guanosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 2'-O-methyl uridine at position 21 is linked to deoxy guanosine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 309 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 310 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 16, 17, 24, 25, 30, and 31, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 25 is linked to deoxy guanosine at position 26 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 27 is linked to deoxy guanosine at position 28 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> deoxy guanosine at position 28 is linked to deoxy guanosine at position 29 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 310 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 311 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 16, 17, 24, 25, 30 and 31, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> 2'-O-methyl uridine at position 32 is linked to deoxy guanosine at position 33 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 311 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 312 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are deoxy, except at positions 16, 17, 24, 25, 30 and 31, wherein guanosine is 2'-O-methyl; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 2 is linked to deoxy adenosine at position 3 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> deoxy adenosine at position 3 is linked to deoxy guanosine at position 4 via phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> deoxy guanosine at position 4 is linked to deoxy guanosine at position 5 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 6 is linked to deoxy adenosine at position 7 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> deoxy adenosine at position 7 is linked to deoxy adenosine at position 8 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy adenosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> 2'-O-methyl uridine at position 10 is linked to deoxy adenosine at position 11 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> deoxy adenosine at position 11 is linked to deoxy adenosine at position 12 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2'-O-methyl uridine at position 14 is linked to deoxy guanosine at position 15 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 17 is linked to deoxy guanosine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy adenosine at position 19 via a phopshorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy adenosine at position 19 is linked to deoxy guanosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 2'-O-methyl uridine at position 21 is linked to deoxy guanosine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 25 is linked to deoxy guanosine at position 26 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 27 is linked to deoxy guanosine at position 28 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> deoxy guanosine at position 28 is linked to deoxy guanosine at position 29 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> 2'-O-methyl uridine at position 32 is linked to deoxy guanosine at position 33 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 312 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 313 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are 2'-O-methyl, except at positions 3, 7, and 12, wherein adenosine is deoxy, and positions 4, 5, and 15, wherein guanosine is deoxy; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 2 is linked to deoxy adenosine at position 3 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 6 is linked to deoxy adenosine at position 7 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> 2'-O-methyl adenosine at position 11 is linked to deoxy adenosine at position 12 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2'-O-methyl uridine at position 14 is linked to deoxy guanosine at position 15 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 313 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 314 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(34) <223> all purines (A and G) are 2'-O-methyl, except at positions 3, 7, 12, and 19,wherein adenosine is deoxy, and positions 4, 5, 15, 18, 20 and 21, wherein guanosine is deoxy; all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 2 is linked to deoxy adenosine at position 3 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 2'-O-methyl cytidine at position 6 is linked to deoxy adenosine at position 7 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> 2'-O-methyl adenosine at position 11 is linked to deoxy adenosine at position 12 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2'-O-methyl uridine at position 14 is linked to deoxy guanosine at position 15 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 17 is linked to deoxy guanosine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy adenosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deox adenosine at position 19 is linked to deoxy guanosine at position 20 via a phopshorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 2'-O-methyl uridine at position 21 is linked to deoxy guanosine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is an inverted orientation deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 314 acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35 <210> 315 <211> 335 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 315 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 190 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser 210 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 325 330 335 <210> 316 <211> 196 <212> PRT <213> mus musculus <400> 316 Met Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val 1 5 10 15 Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln 20 25 30 Cys Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His 35 40 45 Ala Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu 50 55 60 Thr Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro 65 70 75 80 Gln Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln 85 90 95 Gly Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly 100 105 110 Glu Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser 115 120 125 Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu 130 135 140 Thr Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro 145 150 155 160 Leu Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile 165 170 175 Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu 180 185 190 Val Pro Thr Ala 195 <210> 317 <211> 215 <212> PRT <213> mus musculus <400> 317 Met Cys Gln Ser Arg Tyr Leu Leu Phe Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Asn His Leu Ser Leu Ala Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg 20 25 30 Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val 35 40 45 Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp 50 55 60 Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr 65 70 75 80 Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg 85 90 95 Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr 100 105 110 Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys 115 120 125 Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His 130 135 140 Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp 145 150 155 160 Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys 165 170 175 Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys 180 185 190 Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val 195 200 205 Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala 210 215

Claims (75)

  1. IL-23에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer).
  2. 제1항에 있어서, ,IL-23은 IL-23의 기능과 본질적으로 동일한 생물학적 기능을 수행하는 IL-23의 변이체인 것인 앱타머.
  3. 제2항에 있어서, IL-23의 변이체는 IL-23과 실질적으로 동일한 구조, 및 IL-23과 실질적으로 동일한 앱타머와의 결합 능력을 가진 것인 앱타머.
  4. 제3항에 있어서, IL-23 또는 이의 변이체는 서열 번호 4 및 5를 포함하는 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 앱타머.
  5. 제3항에 있어서, IL-23 또는 이의 변이체는 서열 번호 4 및 5를 포함하는 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 앱타머.
  6. 제3항에 있어서, IL-23 또는 이의 변이체는 서열 번호 4 및 5를 포함하는 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 앱타머.
  7. 제3항에 있어서, IL-23 또는 이의 변이체는 서열 번호 4 및 5를 포함하는 아 미노산 서열을 가지는 것인 앱타머.
  8. 제7항에 있어서, 리보핵산(ribonucleic acid)인 앱타머.
  9. 제8항에 있어서, 단일 가닥 리보핵산인 앱타머.
  10. 제7항에 있어서, 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)인 앱타머.
  11. 제10항에 있어서, 단일 가닥 데옥시리보핵산인 앱타머.
  12. 제7항에 있어서, 약 100 nM 이하의 IL-23 또는 이의 변이체에 대한 해리 상수를 가지는 앱타머.
  13. 제12항에 있어서, 약 50 nM 이하의 IL-23 또는 이의 변이체에 대한 해리 상수를 가지는 앱타머.
  14. 제13항에 있어서, 약 10 nM 이하의 인간 IL-23 또는 이의 변이체에 대한 해리 상수를 가지는 앱타머.
  15. 제14항에 있어서, 약 1 nM 이하의 인간 IL-23 또는 이의 변이체에 대한 해리 상수를 가지는 앱타머.
  16. 제7항에 있어서, 1 이상의 화학적 변형을 포함하는 앱타머.
  17. 제16항에 있어서, 상기 변형은 핵산의 당 위치에서의 화학적 치환; 핵산의 인산염 위치에서의 화학적 치환; 및 핵산의 염기 위치에서의 화학적 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 앱타머.
  18. 제16항에 있어서, 상기 변형은 변형된 뉴클레오티드의 삽입; 3' 캡핑(capping); 고분자량 비-면역원성 화합물에의 컨쥬게이션(conjugation); 친유성 화합물에의 컨쥬게이션; 및 인산염 백본(backbone) 변형으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 앱타머.
  19. 제18항에 있어서, 비-면역원성 고분자량 화합물은 폴리알킬렌 글리콜인 것인 앱타머.
  20. 제19항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜인 것인 앱타머.
  21. 제18항에 있어서, 백본 변형은 인산염 백본 내로의 1 이상의 포스포로티오에이트의 삽입을 포함하는 것인 앱타머.
  22. 제21항에 있어서, 인산염 백본 내로의 10 미만의 포스포로티오에이트의 삽입을 포함하는 앱타머.
  23. 제22항에 있어서, 인산염 백본 내로의 6 미만의 포스포로티오에이트의 삽입을 포함하는 앱타머.
  24. 제23항에 있어서, 인산염 백본 내로의 3 미만의 포스포로티오에이트의 삽입을 포함하는 앱타머.
  25. 제7항에 있어서, IL-23 또는 이의 변이체의 기능을 조절하는 앱타머.
  26. 제25항에 있어서, IL-23 또는 이의 변이체의 기능을 억제하는 앱타머.
  27. 제26항에 있어서, 생체 내에서 IL-23 또는 이의 변이체의 기능을 억제하는 앱타머.
  28. 제26항에 있어서, IL-23 수용체에의 IL-23의 결합을 방해하는 앱타머.
  29. 제1항에 있어서, 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머와 실질적으로 동일한 IL-23과의 결합 능력을 가진 앱타머.
  30. 제1항에 있어서, 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머의 구조와 실질적으로 동일한 구조 및 실질적으로 동일한 IL-23과의 결합 능력을 가진 앱타머.
  31. 제1항에 있어서, 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 하나와 80% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는 앱타머.
  32. 제31항에 있어서, 앱타머 핵산 서열은 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 것인 앱타머.
  33. 제1항에 있어서, 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 하나의 유니크(unique) 서열 영역 내의 20개의 인접하는 뉴클레오티드로 구성된 서열과 동일한 20개의 인접하는 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머.
  34. 제33항에 있어서, 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 하나의 유니크 서열 영역 내의 8개의 인접하는 뉴클레오티드로 구성된 서열과 동일한 8개의 인접하는 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머.
  35. 제34항에 있어서, 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314로 구성 된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 하나의 유니크 서열 영역 내의 4개의 인접하는 뉴클레오티드로 구성된 서열과 동일한 4개의 인접하는 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머.
  36. 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-134, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 199-314로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 IL-23 또는 이의 변이체와 결합할 수 있는 앱타머.
  37. 제36항에 있어서, 1 이상의 화학적 변형을 추가로 포함하는 앱타머.
  38. 제37항에 있어서, 상기 변형은 핵산의 당 위치에서의 화학적 치환; 핵산의 인산염 위치에서의 화학적 치환; 및 핵산의 염기 위치에서의 화학적 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 앱타머.
  39. 제37항에 있어서, 상기 변형은 변형된 뉴클레오티드의 삽입; 3' 캡핑; 고분자량 비-면역원성 화합물에의 컨쥬게이션; 친유성 화합물에의 컨쥬게이션; 및 인산염 백본 변형으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 앱타머.
  40. 제39항에 있어서, 고분자량 비-면역원성 화합물은 폴리알킬렌 글리콜인 것인 앱타머.
  41. 제40항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜인 것인 앱타머.
  42. 제39항에 있어서, 백본 변형은 인산염 백본 내로의 1 이상의 포스포로티오에이트의 삽입을 포함하는 것인 앱타머.
  43. 제42항에 있어서, 인산염 백본 내로의 10 미만의 포스포로티오에이트의 삽입을 포함하는 앱타머.
  44. 제43항에 있어서, 인산염 백본 내로의 6 미만의 포스포로티오에이트의 삽입을 포함하는 앱타머.
  45. 제44항에 있어서, 인산염 백본 내로의 3 미만의 포스포로티오에이트의 삽입을 포함하는 앱타머.
  46. 제1항에 있어서, 추가로 IL-12에 결합할 수 있는 앱타머.
  47. 제46항에 있어서, IL-12는 IL-12의 기능과 본질적으로 동일한 생물학적 기능 을 수행하는 IL-12의 변이체인 것인 앱타머.
  48. 제47항에 있어서, IL-12의 변이체는 IL-12와 실질적으로 동일한 구조, 및 IL-12와 실질적으로 동일한 앱타머에의 결합 능력을 가진 것인 앱타머.
  49. 제48항에 있어서, IL-12 또는 이의 변이체는 서열 번호 4 및 6을 포함하는 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 앱타머.
  50. 제48항에 있어서, IL-12 또는 이의 변이체는 서열 번호 4 및 6을 포함하는 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 앱타머.
  51. 제48항에 있어서, IL-12 또는 이의 변이체는 서열 번호 4 및 6을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것인 앱타머.
  52. 제51항에 있어서, IL-12 또는 이의 변이체의 기능을 조절하는 앱타머.
  53. 제52항에 있어서, IL-12 또는 이의 변이체의 기능을 억제하는 앱타머.
  54. 제53항에 있어서, 생체 내에서 IL-12 또는 이의 변이체의 기능을 억제하는 앱타머.
  55. 제53항에 있어서, IL-12 수용체에의 IL-12의 결합을 방해하는 앱타머.
  56. 제4항에 있어서, IL-23 또는 이의 변이체는 마우스 IL-23인 것인 앱타머.
  57. 제56항에 있어서, 마우스 IL-23은 서열 번호 315 및 316을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것인 앱타머.
  58. 서열 번호 13-66, 서열 번호 71-88, 서열 번호 91-96, 서열 번호 103-118, 서열 번호 124-130, 서열 번호 135-159, 서열 번호 162, 서열 번호 164-172, 서열 번호 176-178, 서열 번호 181-196, 및 서열 번호 203-314으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 치료 유효량의 앱타머 또는 이의 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  59. 제58항의 조성물을 척추동물에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-23에 의해 매개되는 질환을 치료하거나, 예방하거나, 개선하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 척추동물은 포유동물인 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 포유동물은 인간인 것인 방법.
  62. 제59항에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환, 염증 질환, 암, 골다공증에서의 골 재흡수 및 타입 I 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 건선, 전신 홍반성 루푸스 및 과민성 장 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 암은 결장암, 폐암 및 폐 전이로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  65. 제63항에 있어서, 과민성 질환은 크론병 및 궤양성 결장염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  66. 서열 번호 14, 서열 번호 17-19, 서열 번호 21, 서열 번호 27-32, 서열 번호 34-40, 서열 번호 42, 서열 번호 49, 서열 번호 60-61, 서열 번호 91-92, 서열 번호 94, 및 서열 번호 103-118로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 치료 유효량의 앱타머 또는 이의 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  67. 제66항의 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-12에 의해 매개되는 질환을 치료하거나, 예방하거나, 개선하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환, 염증 질환, 암, 골다공증에서의 골 재흡수 및 타입 I 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 건선, 전신 홍반성 루푸스 및 과민성 장 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 암은 결장암, 폐암 및 폐 전이로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  71. 제69항에 있어서, 과민성 질환은 크론병 및 궤양성 결장염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  72. 제36항의 앱타머를, IL-23 또는 이의 변이체를 포함하는 것으로 의심되는 조성물과 접촉시키는 단계, 및 IL-23 또는 이의 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 진단 방법.
  73. 시험관 내 진단시약으로서 사용하기 위한 제36항에 따른 앱타머.
  74. 생체 내 진단시약으로서 사용하기 위한 제36항에 따른 앱타머.
  75. 생체 내에서의 질환의 치료, 예방 또는 개선에 사용하기 위한 제36항에 따른 앱타머.
KR1020067020628A 2004-03-05 2005-03-07 인간 ｉｌ-１２ 사이토카인 족에 대한 앱타머 및 자가면역 질환 치료제로서의 이의 용도 KR20070031877A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020067020628A KR20070031877A (ko) 2004-03-05 2005-03-07 인간 ｉｌ-１２ 사이토카인 족에 대한 앱타머 및 자가면역 질환 치료제로서의 이의 용도

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60/550,962 2004-03-05
US60/608,046 2004-09-07
KR1020067020628A KR20070031877A (ko) 2004-03-05 2005-03-07 인간 ｉｌ-１２ 사이토카인 족에 대한 앱타머 및 자가면역 질환 치료제로서의 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070031877A true KR20070031877A (ko) 2007-03-20

Family

ID=43656015

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067020628A KR20070031877A (ko) 2004-03-05 2005-03-07 인간 ｉｌ-１２ 사이토카인 족에 대한 앱타머 및 자가면역 질환 치료제로서의 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20070031877A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20060193821A1 (en) Aptamers to the human IL-12 cytokine family and their use as autoimmune disease therapeutics
US20090082555A1 (en) Aptamers to the human IL-12 cytokine family and their use as autoimmune disease therapeutics
JP5015923B2 (ja) 完全な２’改変核酸転写物を生成するための材料および方法
KR101718297B1 (ko) Ｈｓｆ1-관련 질환을 치료하기 위한 유기 조성물
KR20070101227A (ko) 폰 빌레브란트 인자에 대한 앱타머 및 이의 혈전증치료제로서의 용도
US20060183702A1 (en) Aptamers to von Willebrand factor and their use as thrombotic disease therapeutics
AU2011223527B2 (en) Aptamers to 4-1BB and their use in treating diseases and disorders
KR20070101226A (ko) 앱타머의 약화학
EP1737879A2 (en) Aptamer-mediated intracellular delivery of therapeutic oligonucleotides
US20080214489A1 (en) Aptamer-mediated intracellular delivery of oligonucleotides
US7579450B2 (en) Nucleic acid ligands specific to immunoglobulin E and their use as atopic disease therapeutics
WO2005052121A2 (en) Multivalent aptamers
KR20070044813A (ko) 이뮤노글로불린 ｅ에 대한 핵산 리간드 및 아토피성 질환치료제로서의 이의 용도
KR20070031877A (ko) 인간 ｉｌ-１２ 사이토카인 족에 대한 앱타머 및 자가면역 질환 치료제로서의 이의 용도
US20090018093A1 (en) Nucleic Acid Ligands Specific to Immunoglobuline E and Their Use as Atopic Disease Therapeutics
ZA200607983B (en) Aptamers to the human IL-12 cytokine family and their use as autoimmune disease therapeutics

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Withdrawal due to no request for examination