KR20070044813A - 이뮤노글로불린 ｅ에 대한 핵산 리간드 및 아토피성 질환치료제로서의 이의 용도 - Google Patents

이뮤노글로불린 ｅ에 대한 핵산 리간드 및 아토피성 질환치료제로서의 이의 용도 Download PDF

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사라 체스워쓰 킨
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Abstract

본 발명은 아토피성 질환 및/또는 IgE가 관련되어 있는 다른 질환 또는 질병의 치료제 및 진단제로서 유용한 이뮤노글로불린 E("IgE")에 결합할 수 있는 앱타머를 개시한다. 또한, 본 발명은 IgE에 결합할 수 있는 앱타머의 투여를 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.

Description

이뮤노글로불린 Ｅ에 대한 핵산 리간드 및 아토피성 질환 치료제로서의 이의 용도{NUCLEIC ACID LIGANDS TO IMMUNOGLOBULINE E AND THEIR USE AS ATOPIC DISEASE THERAPEUTICS}
본 발명은 일반적으로는 핵산 분야에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 아토피성 질환 및/또는 IgE가 관련되어 있는 다른 질환 또는 질병의 치료제 및 진단제로서 유용한, 이뮤노글로불린 E("IgE")에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 IgE에 결합할 수 있는 앱타머의 투여를 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.
앱타머는 고전적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성(base pairing) 이외의 상호작용을 통하여 분자에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 핵산 분자이다.
앱타머는, 파지 디스플레이에 의해 생성되는 펩티드 또는 단일클론 항체("mAb")와 같이, 선택된 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조절할 수 있는데, 예를 들어 앱타머는 결합을 통하여 그의 표적이 기능하는 능력을 차단할 수도 있다. 시험관내 선별 공정에 의해 랜덤 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 생성되는 앱타머는 성장 인자, 전사 인자, 효소, 이뮤노글로불린 및 수용체를 비롯한 100종이 넘는 단백질에 대하여 생성되었다. 전형적인 앱타머는 크기가 10-15 kDa(30-45개의 뉴클레오티드)이며, 나노몰 이하의 친화도로 그의 표적에 결합하고, 밀접하게 관련된 표적을 구별한다(예를 들어, 앱타머는 전형적으로 동일 유전자 족 유래의 다른 단백질에는 결합하지 않음). 일련의 구조 연구에 의하면, 앱타머는 항체-항원 결합체에서 친화성 및 특이성이 생기게 하는 동일한 유형의 결합 상호작용(예를 들어, 수소 결합, 정전기적 상보성(complemetarity), 소수성 접촉, 입체적 배제(exclusion))을 이용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
앱타머는 높은 특이성 및 친화성, 생물학적 효능, 및 탁월한 약동학적 특성을 비롯하여, 치료제 및 진단제로서의 사용을 위한 다수의 바람직한 특성을 가진다. 또한, 앱타머는 항체 및 기타 단백질 생물 제제보다 예를 들어 하기와 같은 특정한 경쟁적 이점을 제공한다:
1) 속도 및 조절. 앱타머는 전적으로 시험관내 공정에 의해 제조되며, 이는 치료적 선도자(lead)를 비롯한 초기 선도자의 신속한 발생을 허용한다. 시험관내 선별은 앱타머의 특이성 및 친화성이 엄격하게 조절되게 하며, 독성 표적 및 비-면역원성 표적 둘 모두에 대한 선도자를 비롯한 선도자의 발생을 허용한다.
2) 독성 및 면역원성. 소정의 부류(clas)로서의 앱타머는 독성 또는 면역원성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다. 고수준의 앱타머(90일 동안 매일 10 ㎎/kg)를 래트 또는 우드척(woodchuck)에 장기간에 걸쳐 투여하면, 임의의 임상적, 세포적 또는 생화학적 측정에 의해 독성이 전혀 관찰되지 않는다. 다수의 단일클론 항체의 효능은 항체 그 자신에 대한 면역 반응에 의해 과도하게 제한될 수 있는 반면, 아마도 앱타머가 MHC를 통하여 T 세포에 의해 제시될 수 없고 면역 반응이 일반적으로 핵산 단편을 인식하지 못하도록 훈련되기 때문에 앱타머에 대한 항체를 유도하는 것은 극도로 어렵다.
3) 투여. 대부분의 현재 승인된 항체 치료제는(전형적으로 2-4시간에 걸친) 정맥내 관주에 의해 투여되는 반면, 앱타머는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다(피하 투여를 통한 앱타머의 생체이용률은 원숭이 연구에서 >80%임(Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203- 212, 1999)). 이러한 차이는 주로 비교적 낮은 용해도 및 그에 따른 대부분의 치료용 mAb에 필요한 큰 부피로 인한 것이다. 우수한 용해도(>150 ㎎/㎖) 및 비교적 낮은 분자량(앱타머: 10-50 kDa; 항체: 150 kDa)으로, 앱타머의 주 당 투여량은 0.5 ㎖ 미만의 부피로 주사에 의해 전달될 수 있다. 또한, 앱타머의 작은 크기는 항체 또는 항체 단편이 침투하는 것을 허용하지 않는 구조적 제한 영역 내로 앱타머가 침투하는 것을 허용하여, 앱타머 기재의 치료제 또는 예방제의 또 다른 장점을 제시한다.
4) 대규모생산가능성( scalablity ) 및 비용. 치료용 앱타머는 화학적으로 합성되며 그 결과 생산 수요를 맞추는 데에 필요한 만큼 손쉽게 대규모생산될 수 있다. 대규모생산에서의 어려움이 현재 몇몇 생물학적 약제의 이용 가능성을 제한하고 있으며, 대규모 단백질 생산용 공장의 자본 비용이 막대한 반면, 단일한 대규모 올리고뉴클레오티드 합성기는 연간 100 kg 이상을 제조할 수 있으며 상대적으로 적당한 최초 투자비를 필요로 한다. 킬로그램 스케일의 앱타머 합성을 위한 물품의 현행 비용은 $500/g으로 추정되며, 이는 고도로 최적화된 항체에 있어서의 비용에 필적할 만하다. 공정 개발에서의 계속적인 개선에 의해 5년 내에는 물품의 비용이 <$100/g으로 저하될 것으로 기대된다.
5) 안정성. 치료용 앱타머는 화학적으로 안정하다. 상기 앱타머는 열 및 변성제와 같은 인자에의 노출 이후에 활성을 회복하도록 내재적으로 적응되어 있으며 냉동 건조 분말로서 실온에서 장기간 동안(>1년) 저장될 수 있다.
IgE 및 아토피성 질환
아토피는 알레르겐(allergen)-특이적 IgE를 생성하는 유전적 소인(predisposition)이고, 천식 및 다른 알레르기성 질환의 발달에 있어서 가장 중요한 소인적 인자 중 하나이다. 알레르기성 비염(고초열), 천식 및 아토피성 피부염과 같은 아토피성 질환은 미국인들 사이에 널리 퍼져 있고 증가하고 있다. 알레르기성 질환의 증상에는 혈관확장, 평활근 수축, 국소 염증 및 혈관 투과성이 포함된다. 일반적인 환경 알레르겐에 반응한 IgE의 증가된 생성은 아토피성 질환의 특징이다. 일반적인 알레르겐에는 먼지진드기 배설물, 꽃가루, 식품, 동물 비듬 및 진균 포자가 포함된다. 비만 세포(mast cell)는 히스타민, 류코트리엔 및 프로스타글란딘과 같은 다양한 화학적 매개자의 IgE-매개 방출을 통해 알레르기성 질환의 초기 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. T 임파구, 호염기구(basophil) 및 호산구(eosinophil)는 후기 반응을 유도하는 것으로 생각된다. 알레르기-특이적 IgE와 항원의 접촉 시 비만 세포 및 호염기구의 자극에 의해 야기되는 즉각적인 과민반응은 강력한 포유동물 면역 이펙터 시스템이다. 이들 IgE-매개 반응은 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 두드러기, 식품 알레르기, 천식, 및 가장 심각한 경우에는 사망을 초래할 수 있는 아나필락시스성 쇼크와 같은 질환을 일 으킬 수 있다.
임의의 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, IgE가 알레르기성 반응을 매개하는 메카니즘은 결정되어 있다. 요약하면, IgE는 비만 세포 및 호염기구 상의 고 친화성 IgE 수용체인 FcεRI의 α쇄에 결합한다. 이러한 유형의 세포 상의 FcεRI은 α쇄, β쇄 및 동종이량체성 γ쇄로 구성된 4량체이다. β쇄 및 γ쇄는 FcεRI의 신호 전달 도메인이다. 비만 세포에 결합된 IgE의 알레르겐 가교-결합은 FcεRI을 자극시키고, 기관지수축성 물질 및 혈관활성 물질을 비롯한 일정 범위 내의 전구염증성 매개자 및 사이토킨 예컨대, 히스타민, 류코트리엔 및 다양한 기타 사이토킨의 방출을 이끌어 내는 다수의 신호 전달 경로를 활성화시킨다(도 1 참조). IgE 및 FcεRI 및 비만 세포의 역할은 아나필락시스 동물 모델에서 확인되었다: IgE와 특정 항원의 전신 전달(또는 항-IgE만을 사용한 치료)는 정상 마우스에서는 아나필락시스성 반응을 일으키지만, 비만-세포-결핍 또는 FcεRI-결핍 마우스에서는 즉각적인 전신 반응을 유발하지 못한다.
현재, 알레르겐-유도 병상(pathology)의 기초가 되는 면역학적 메카니즘을 방해하는, 임상 평가 중에 있는 치료법 예컨대, IgE 혈청 항체를 직접 표적화하여 즉시형 과민반응의 핵심 메카니즘을 억제하는 항-IgE 이뮤노글로불린이 있다. 또한, 알레르기성 질환을 치유하기 위한 잠재력 때문에 알레르겐-특이적 면역요법을 개발하는 데 관심이 기울여지고 있다. 그러나, 항-IgE 이뮤노글로불린 및 알레르겐-특이적 면역요법은 고비용, 및 영구적인 또는 계절 단위로의 치료가 필요하다는 점에 의해 제한된다.
새로운 치료제 부류로서의 앱타머의 상기 이점 외에, 앱타머는 핵산이기 때문에, 아토피성 질환 및 다른 면역 질환의 치료에 있어서 바람직하고 유익한 면역-자극 효과를 가진 모티프를 포함할 수 있다. 이들 모티프에는 면역조절 효과 예컨대, 타입 II T 헬퍼(TH2) 세포에 의해 매개되는 알레르기성 반응의 억제를 나타내는 CpG 모티프가 포함된다. CpG는 정제된 B 세포에서 T-bet mRNA의 발현을 신속히 유도해는 것으로 밝혀져 있다(Liu et al., 2003, Nature Immun. Vol 4, no. 7, p. 687-693).
따라서, IgE가 발병기전에 관여하는 질환을 치료하기 위해 IgE의 생물학적 기능을 파괴하는 물질 및 방법을 찾는 것이 유리할 것이다. 본 발명은 이러한 필요성 및 다른 필요성을 충족시키는 물질 및 방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 아토피성 질환의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 물질 및 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, PEG 잔기(moiety)에 컨쥬게이션된, 서열 mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(서열 번호 298)을 포함하는 앱타머를 제공한다. 일부 실시양태에서, PEG 잔기는 60 kDa, 40 kDa, 30 kDa 및 20 kDa으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PEG 잔기는 분지쇄 형태인 반면, 다른 실시양태에서는 직쇄 형태이다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006087103447-PCT00001
상기 구조에서,
Figure 112006087103447-PCT00002
는 링커를 표시하고,
앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s- dGmCmU-3T(서열 번호 216)이며,
여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이며, dI는 데옥시 이노신이고, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이며, 3T는 3' 역(inverted) 데옥시 티미딘이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006087103447-PCT00003
상기 구조에서,
Figure 112006087103447-PCT00004
는 링커를 표시하고
앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s- dGmCmU-3T(서열 번호 216)이며,
여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이며, dI는 데옥시 이노신이고, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이며, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006087103447-PCT00005
상기 구조에서,
Figure 112006087103447-PCT00006
는 링커를 표시하고,
앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s- dGmCmU(서열 번호 298)이며,
여기서,
mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이며, dI는 데옥시 이노신이고, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이며, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006087103447-PCT00007
상기 구조에서,
Figure 112006087103447-PCT00008
는 링커를 표시하고,
앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s- dGmCmU(서열 번호 298)이며,
여기서,
mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이며, dI는 데옥시 이노신이고, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이며, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 비-알킬 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 알킬 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알킬 링커는 2개 내지 18개의 연속된 CH2 기, 구체적으로 2개 내지 12개의 연속된 CH2 기, 보다 구체적으로 3개 내지 6개의 연속된 CH2 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006087103447-PCT00009
앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s- dGmCmU-3T(서열 번호 216)
여기서,
mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이며, dI는 데옥시 이노신이고, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이며, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006087103447-PCT00010
앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s- dGmCmU-3T(서열 번호 216)
여기서,
mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이며, dI는 데옥시 이노신이고, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이며, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006087103447-PCT00011
앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s- dGmCmU(서열 번호 298)
여기서,
mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이며, dI는 데옥시 이노신이고, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이며, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006087103447-PCT00012
앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s- dGmCmU(서열 번호 298)
여기서,
mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이며, dI는 데옥시 이노신이고, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이며, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 IgE 또는 이의 변이체의 기능을 조절, 특히 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 앱타머는 시험관내에서 IgE 또는 이의 변이체의 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 앱타머는 생체내에서 IgE 또는 이의 변이체의 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 IgE와 이의 수용체의 결합을 방해한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머 또는 이의 염을 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, IgE에 의해 매개되는 질환의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의, 상기 앱타머 중 임의의 앱타머 또는 이의 염을 포함하는 치료적 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 앱타머, 특히 상기 치료적 조성물을 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, IgE에 의해 매개되는 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료될 질환은 아토피성 질환이다. 구체적 실시양태에서, 치료될 질환은 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 천식, 급성 두드러기, 식품 알레르기, 땅콩 알레르기, 전신성 아나필락시스, 알레르기성 결막염, 봄철 각막결막염, 아토피성 각막결막염, 거대 유도 결막염 및 호산성 위장염으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 치료될 질환은 천식이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-IgE 앱타머는 면역자극성 핵산 서열 예컨대, CpG 모티프를 포함하는 제2 앱타머와 함께 대상체 예컨대, 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여한다.
일부 실시양태에서, 앱타머는 피하 투여, 정맥내 투여 및 비강내 투여로 구성된 군으로부터 선택된 경로를 통해 대상체에게 투여한다. 특정 실시양태에서, 치료적 조성물은 아토피성 질환을 앓거나 아토피성 질환을 앓을 위험에 있는 인간 대상체에게 피하 투여한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, PEG에 컨쥬게이션된 앱타머를 IgE 또는 이의 변이체가 포함된 것으로 의심되는 조성물과 접촉시키는 단계, 및 IgE 또는 이의 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 진단 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시험관내 진단제로서 사용하기 위한 본 발명의 앱타머가 제공된다. 반면 다른 실시양태에서는, 생체내 진단제로서 사용하기 위한 본 발명의 앱타머가 제공된다. 일부 실시양태에서, 생체내 질환의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 본 발명의 앱타머가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96, 및 98-102로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 하나와 80% 이상, 특히 90% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는, IgE에 특이적으로 결합하는 앱타머가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50 및 56-89로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 하나의 유니크(unique) 서열 영역과 80% 이상, 특히 90% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는, IgE에 특이적으로 결합하는 앱타머가 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50 및 56-96으로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머 핵산 서열 중 어느 하나 내의 30개의 인접한 뉴클레오티드로 된 서열과 동일한 30개의 인접한 뉴클레오티드로 된 서열을 포함하는, IgE에 결합할 수 있는 앱타머가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96, 98-102로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머 서열 중 어느 하나의 유니크 서열 영역 내의 20개의 인접한 뉴클레오티드로 된 서열과 동일한 20개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머가 제공된다. 훨씬 더 구체적인 실시양태에서, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96, 98-102로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머 서열 중 어느 하나의 유니크 서열 영역 내의 8개의 인접한 뉴클레오티드로 된 서열과 동일한 8개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머가 제공된다. 바람직하게는, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96, 98-102로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머 서열 중 유니크 서열과 동일한 8개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머는 IgE, 특히 인간 IgE에 특이적으로 결합하고 일부 실시양태에서는 IgE, 바람직하게는 인간 IgE의 기능을 조절한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96, 98-102, 119-124, 126-136, 139-157, 158-176, 178-190, 194-201, 206-243, 247, 249-259, 261-267, 269-290 및 292로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 단일 가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 고분자량의 비-면역원성 화합물 또는 친유성 화합물에 컨쥬게이션되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 폴리알킬렌 글리콜 잔기, 특히 폴리에틸렌 글리콜 잔기에 컨쥬게이션되어 있다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 잔기는 분지쇄형인 반면, 다른 실시양태에서는 직쇄형이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 당 위치에서의 화학적 치환; 인산염 위치에서의 화학적 치환; 핵산의 염기 위치에서의 화학적 치환; 역 뉴클레오티드로의 3' 캡핑(capping); 및 역 뉴클레오티드로의 5' 캡핑으로 구성된 군으로부터 선택된 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 면역자극성 핵산 서열 예컨대, CpG 모티프를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 IgE 또는 이의 변이체의 기능을 조절, 특히 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 앱타머는 시험관내에서 IgE 또는 이의 변이체의 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 앱타머는 생체내에서 IgE 또는 이의 변이체의 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 IgE와 이의 수용체의 결합을 방해한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머 또는 이의 염을 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, IgE에 의해 매개되는 질환의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 제공된 다.
일부 실시양태에서, 치료 유효량의 본 발명의 앱타머 또는 이의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 치료적 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머, 바람직하게는 본 발명의 치료적 조성물을 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, IgE에 의해 매개되는 질환의 치료, 예방 및/또는 개선 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료될 질환은 아토피성 질환, 특히 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 천식, 급성 두드러기, 식품 알레르기, 땅콩 알레르기, 전신성 아나필락시스, 알레르기성 결막염, 봄철 각막결막염, 아토피성 각막결막염, 거대 유도 결막염 및 호산성 위장염으로 구성된 군으로부터 선택된 질환이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-IgE 앱타머는 면역자극성 핵산 서열 예컨대, CpG 모티프를 포함하는 제2 앱타머와 함께 대상체 예컨대, 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역자극성 핵산 서열은 본 발명의 항-IgE 앱타머 내에 포함되거나 부착되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 피하 투여, 정맥내 투여 및 비강내 투여로 구성된 군으로부터 선택된 경로로 대상체에게 투여한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 앱타머를 IgE 또는 이의 변이체가 포함된 것으로 의심되는 조성물과 접촉시키는 단계, 및 IgE 또는 이의 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 진단 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 진단제로서 사용하기 위한 본 발명의 앱타머가 제공된다. 한편 다른 실시양태 에서는, 생체내 진단제로서 사용하기 위한 본 발명의 앱타머가 제공된다. 일부 실시양태에서, 생체내 질환의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 본 발명의 앱타머가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 표적에 대한 앱타머의 결합 친화성을 증가시키는 방법으로서 앱타머는 다량체성 응집체를 형성할 수 있는 것인 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 응집체 형성 앱타머 내의 뉴클레오티드를, 응집체 형성을 방해하도록 선택된 뉴클레오티드로 치환시키는 단계를 포함하며, 여기서 표적에 대한 치환된 앱타머의 결합 친화성은 모 앱타머(parent aptamer)의 결합 친화성에 비하여 증가되어 있고, 상기 모 앱타머는 동일한 핵산 서열을 가지나 뉴클레오티드 치환을 가지지 않는다. 일부 실시양태에서, 응집체 형성을 방해하도록 선택된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 이노신이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 표적에 대한 모 앱타머의 결합 친화성에 비하여 동일 표적에 대한 이노신 치환 앱타머의 결합 친화성을 증가시키는 위치에서 1 이상의 뉴클레오티드를 이노신으로 치환시키는 단계를 포함하는, 표적에 대한 앱타머의 결합 친화성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 모 앱타머는 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지만 이노신 변형을 가지지 않는다. 상기 제공된 방법의 한 실시양태에서, 치환 단계는 4개, 3개 또는 2개의 뉴클레오티드 각각을 4개, 3개 또는 2개 이하의 이노신으로 치환시키는 단계를 포함하며, 여기서 생성된 앱타머는 모 앱타머에 비하여 표적에 대한 증가된 결합 친화성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 이노신으로 치환된 뉴클레오티드는 퓨린이다. 구체적 실시양태에서, 이노신으로 치환된 퓨린은 구아노신이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 핵산의 당 위치에서의 화학적 치환; 핵산의 인산염 위치에서의 화학적 치환 및 핵산의 염기 위치에서의 화학적 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 제2의 화학적 치환 단계를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 추가로 치환된 앱타머는 제2의 화학적 치환을 가지지 않다는 점을 제외하고는 추가로 치환된 앱타머와 동일한 앱타머에 비하여 표적에 대한 증가된 결합 친화성을 보유한다.
일부 실시양태에서, 치환 단계는 원하는 치환을 가진 앱타머를 화학적으로 합성하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적에 대한 이노신 치환 앱타머의 결합 친화성은 모 앱타머에 비하여 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 25배 이상, 50배 이상, 75배 이상, 85배 이상, 95배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상 증가되어 있다. 일부 실시양태에서, 치환 단계는 앱타머를 화학적으로 합성하는 것을 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 치환 방법에 의해 얻어진 표적에 대한 증가된 결합 친화성을 가진 앱타머를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 상기 앱타머는 IgE, 특히 인간 IgE에 대한 증가된 결합 친화성을 보유한다.
도 1은 IgE-매개 신호 전달 과정의 개략도이다.
도 2는 리보핵산으로 구성된 랜덤 서열 올리고뉴클레오티드로 된 풀(pool)로 부터의 시험관내 앱타머 선별(SELEXTM) 공정의 개략도이다. 데옥시리보핵산으로 구성된 랜덤 서열 올리고뉴클레오티드로 된 풀을 사용한 시험관내 앱타머 SELEX 공정의 경우, 역 전사 및 전사 단계가 생략되어 있다.
도 3은 40 kDa의 분지쇄 PEG를 나타낸 것이다.
도 4는 앱타머의 5' 말단에 부착된 40 kDa의 분지쇄 PEG를 나타낸 것이다.
도 5는 표준 모노-PEG화(PEGylation), 다중 PEG화 및 PEG화를 통한 이량체화를 대표하는 다양한 PEG화 방법을 나타내는 도면이다.
도 6은 dRmY 클론 선별의 6 및 7 순환 후 h-IgE에의 풀 결합 반응의 곡선이다.
도 7은 변형이 h-IgE에의 결합 비율을 증가시키는 것을 나타내는, ARC445(서열 번호 101) 및 이의 유도체에 대한 직접적 결합 곡선 및 결합 친화성을 나타낸다.
도 8은 항-IgE 앱타머 ARC445(서열 번호 101) 및 이의 여러 유도체의 이온 교환 HPLC 미량 분석을 나타낸 것이다.
도 9는 ARC445(서열 번호 101)에서의 NMM 형광도의 증가를 나타내며, dG 대신에 7-데아자-G-치환을 보유하는 ARC445 유도체인 ARC909-911(서열 번호 191-193)에서의 NMM 형광도의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 10은 ARC183(양성 실험 대조구)에서의 NMM 형광도의 증가, 및 ARC1346(음성 실험 대조구)에서의 NMM 형광도의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 11은 (ARC909-911(서열 번호 191-193)에서와 같이) dG를 7-데아자-G로 치환시키는 것이 h-IgE에의 결합 비율을 상당히 감소시키는 것을 나타내는, ARC445(서열 번호 101)의 유도체와 비교한 ARC445(서열 번호 101)에 대한 직접적 결합 곡선을 보여준다.
도 12는 ARC1384(서열 번호 181)와 비교할 때 dG에 대한 이노신 치환을 보유하는 ARC445 유도체 ARC1641, ARC1642 및 ARC1666(서열 번호 212, 213 및 216 각각)에서의 NMM 형광도의 감소, 및 2'-O-메틸 및 포스포로티오에이트 치환을 보유하지만 dG에 대한 이노신 치환을 보유하지 않는 ARC445 유도체(서열 번호 101)의 NMM 형광도의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 13은 FACS에 의할 때 IgE:FcεRI 결합 억제에서 가장 높은 효능을 보여주는 rRfY, dRmY 및 DNA 최소화 앱타머에 대한 예측된 2차 구조의 개략도이다. 도 13(A)는 밑줄친 잔기가 2'-F인 서열 번호 91에 따른 rRfY 클론을 나타내고, 도 13(B)는 흑색 잔기가 2'-데옥시이고 회색 잔기가 2'-OMe인 ARC445(서열 번호 101), dRmY 클론을 나타내고; 도 13(C)는 밑줄친 잔기가 2'-데옥시인 ARC475(서열 번호 151), DNA 클론을 나타낸다.
도 14는 SX38 세포에서 h-IgE-유도 히스타민 방출을 차단하는 ARC445(서열 번호 101) 및 ARC656(서열 번호 157)을 보여주는 그래프이다.
도 15A는 인간 및 래트 혈장에 존재하는 전장 ARC1384 및 ARC1666(%)을 인큐베이션 시간의 함수로서 도시한 그래프이다. 도 15B는 인간 및 래트 혈장에 존재하는 전장 ARC1384, ARC1572 및 ARC1573(%)을 인큐베이션 시간의 함수로서 도시한 그 래프이다.
도 16은 10 ㎎/kg의 양으로 마우스에게 정맥내 투여된 PEG화 항-IgE 앱타머 RC1785(서열 번호 295), ARC1787(서열 번호 293), ARC1788(서열 번호 294) 및 ARC1790(서열 번호 296)의 약동학적 연구의 설계를 개략적으로 나타내는 표이다.
도 17은 10 ㎎/kg의 양으로 마우스에게 정맥내(IV) 투여된 후 PEG화 항-IgE 앱타머 ARC1785(서열 번호 295), ARC1787(서열 번호 293), ARC1788(서열 번호 294), ARC1790(서열 번호 296)의 약동학적 프로필을 보여주는 그래프이다.
도 18은 10 ㎎/kg의 양으로 마우스에게 피하 투여된 PEG화 항-IgE 앱타머 ARC1785(서열 번호 295), ARC1787(서열 번호 293), ARC1788(서열 번호 294) 및 ARC1790(서열 번호 296)의 약물 동력학적 연구의 설계를 개략적으로 나타내는 표이다.
도 19는 10 ㎎/kg의 양으로 마우스에게 피하(SC) 투여된 후 PEG화 항-IgE 앱타머 ARC1785(서열 번호 295), ARC1787(서열 번호 293), ARC1788(서열 번호 294) 및 ARC1790(서열 번호 296)의 약동학적 프로필을 보여주는 그래프이다.
도 20은 10 ㎎/kg의 양으로 마우스에게 정맥내(IV) 및 피하(SC) 투여된 후 PEG화 항-IgE 앱타머 ARC1785(서열 번호 295), ARC1787(서열 번호 293), ARC1788(서열 번호 294) 및 ARC1790(서열 번호 296)에 대한 비-구획 PK 파라미터 평가치를 요약하는 표이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 대한 상세한 기술이 하기에 첨부되는 설명에 기재되어 있다. 본원에 기술되어 있는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 지금부터 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 본 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 본 명세서에서, 단수형은 내용상 달리 명시하지 않는 한 복수형 또한 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 본 명세서가 조절할 것이다.
SELEX TM 방법
앱타머를 생성하는 적합한 방법은 도 2에서 리보핵산 선별에 대해 일반적으로 도시되어 있는 "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment"("SELEXTM")라는 표제 하의 공정을 이용하는 것이다(데옥시리보핵산 풀을 사용한 선별의 경우에는, 도 2에 도시되어 있는 역 전사 및 전사 단계를 생략함). SELEXTM 공정은 표적 분자에 고도로 특이적으로 결합하는 핵산 분자의 시험관내 진화 방법이며, 예를 들어 1990년 6월 11일자로 출원되고 현재는 포기된 미국 특허 출원 제07/536,428호, 발명의 명칭이 "핵산 리간드"인 미국 특허 제5,475,096호, 및 발명의 명칭이 "핵산 리간드"인 미국 특허 제5,270,163호(WO 91/19813도 참조)에 개시되어 있다. 각각의 SELEXTM-동정 핵산 리간드, 즉, 각각의 앱타머는 주어진 표적 화합물 또는 분자의 특이적 리간드이다. SELEXTM 공정은 핵산이 다양한 2차원 및 3차원 구조 형성에 충분한 능력과, 이의 단량체 내에서 이용가능한 충분한 화학적 다재다능함(versatility)을 가져서 단량체든지 중합체든지 간에 사실상 임의의 화학적 화합물과의 리간드로서 작용한다(즉, 특이적 결합쌍을 형성함)는 독특한 통찰력에 기초한 것이다. 임의의 크기 또는 조성의 분자가 표적으로서의 역할을 할 수 있다.
SELEXTM은 랜덤화 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 큰 라이브러리 또는 풀을 출발점으로서 의존한다. 올리고뉴클레오티드는 변형 또는 비변형 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 몇몇 예에 있어서, 풀은 100% 랜덤하거나 부분적으로 랜덤한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예에 있어서, 풀은 랜덤화 서열 내에 삽입되어 있는 1 이상의 고정된 서열 및/또는 보존된 서열을 포함하는 랜덤 또는 부분적 랜덤 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예에 있어서, 풀은 올리고뉴클레오티드 풀의 모든 분자에 의해 공유되는 서열을 포함할 수 있는 5' 및/또는 3' 말단에서 1 이상의 고정된 서열 및/또는 보존된 서열을 포함하는 랜덤 또는 부분적 랜덤 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 고정 서열은 풀 중의 올리고뉴클레오티드에 공통적이며 사전 선별 목적으로 삽입되는 서열, 예를 들어, 하기에서 추가로 설명되는 CpG 모티프, PCR 프라이머를 위한 하이브리드화 부위, RNA 폴리머라제를 위한 프로모터 서열(예를 들어, T3, T4, T7, 및 SP6), 제한 효소 부위, 또는 단독중합체성 서열, 예를 들어 폴리 A 또는 폴리 T 트랙(tract), 촉매 코어, 친화성 컬럼에의 선택적 결합을 위한 부위, 및 목적 올리고뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 시퀀싱을 용이하게 하기 위한 기타 서열이다. 보존된 서열은 상기 고정 서열 이외의, 동일 표적에 결합하는 다수의 앱타머에 의해 공유되는 서열이다.
풀의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 랜덤화 서열 부분과, 효율적인 증폭에 필요한 고정 서열을 포함한다. 전형적으로, 출발 풀의 올리고뉴클레오티드는 30-50개의 랜덤 뉴클레오티드의 내부 영역 측면을 플랭킹하는 고정된 5' 및 3' 말단 서열을 포함한다. 랜덤화 뉴클레오티드는 랜덤하게 절단된 세포 핵산으로부터의 크기에 의한 선별법 및 화학적 합성법을 비롯한 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 또한 시험 핵산에 있어서의 서열 변이가 선별/증폭 반복 이전에 또는 선별/증폭 반복 동안에 돌연변이유발에 의해 도입 또는 증가될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 랜덤 서열 부분은 임의의 길이의 것일 수 있으며 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고 변형 또는 비천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,958,691호; 미국 특허 제5,660,985호; 미국 특허 제5,958,691호; 미국 특허 제5,698,687호; 미국 특허 제5,817,635호; 미국 특허 제5,672,695호, 및 PCT 공보 제WO 92/07065호를 참조한다. 랜덤 올리고뉴클레오티드는 당 분야에 잘 알려진 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-결합 뉴클레오티드로부터 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14: 5399-5467(1986)] 및 문헌[Froehler et al., Tet. Lett. 27: 5575-5578(1986)]을 참조한다. 또한, 랜덤 올리고뉴클레오티드는 용액 상 방법, 예를 들어, 트리에스테르 합성 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sood et al., Nucl. Acid Res. 4: 2557(1977)] 및 문헌[Hirose et al., Tet. Lett., 28: 2449(1978)]을 참조한다. 자동화 DNA 합성 기기 상에서 실시되는 전형적인 합성에 의해 1014-1016개의 개개의 분자가 생성되며, 이는 대부분의 SELEXTM 실험에 충분한 갯수이다. 서열 디자인에 있어서의 충분히 큰 랜덤 서열 영역은 각각의 합성된 분자가 유니크 서열을 나타낼 가능성을 증가시킨다.
출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리는 DNA 합성기 상에서의 자동화된 화학적 합성에 의해 생성시킬 수 있다. 랜덤화 서열의 합성을 위하여, 모든 4종의 뉴클레오티드의 혼합물을 합성 공정 동안 각각의 뉴클레오티드 첨가 단계에서 첨가하여, 뉴클레오티드의 랜덤 삽입을 허용한다. 상기한 바와 같이, 한 실시양태에 있어서, 랜덤 올리고뉴클레오티드는 전적으로 랜덤한 서열을 포함하지만, 다른 실시양태에 있어서는 랜덤 올리고뉴클레오티드는 비랜덤 또는 부분적 랜덤 서열의 스트레치(stretch)를 포함할 수 있다. 부분적 랜덤 서열은 각각의 첨가 단계에서 4종의 뉴클레오티드를 상이한 몰 비로 첨가함으로써 생성시킬 수 있다.
출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리는 예를 들어, RNA, DNA 또는 RNA/DNA 하이브리드일 수 있다. RNA 라이브러리가 출발 라이브러리로서 사용될 경우, 이는 전형적으로 T7 RNA 폴리머라제 또는 변형 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 DNA 라이브러리를 전사시키는 단계에 의해 생성되며 정제된다. 이어서, 이 RNA 또는 DNA 라이브러리는 결합에 유리한 조건 하에서 표적과 혼합하고 동일한 일반적 선별 방법을 이용하여 결합, 분리 및 증폭의 단계별 반복으로 처리하여, 사실상 임의의 원하는 기준의 결합 친화성 및 선택성을 달성한다. 더 구체적으로는, SELEXTM 방법은, 출발 핵산 풀을 포함하는 혼합물로부터 출발하여, 하기 단계를 포함한다: (a) 결합에 유리한 조건 하에 이 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계; (b) 표적 분자에 특이적으로 결합한 핵산으로부터 비결합 핵산을 분리하는 단계; (c) 핵산-표적 결합체를 해리시키는 단계; (d) 핵산-표적 결합체로부터 해리되는 핵산을 증폭시켜 리간드가 풍부한 핵산 혼합물을 생성하는 단계; 및 (e) 원하는 만큼 많은 주기를 통하여 결합, 분리, 해리 및 증폭 단계들을 반복하여 표적 분자에 대하여 고도로 특이적인 고 친화성 핵산 리간드를 생성하는 단계. RNA 앱타머를 선별하는 경우, SELEXTM 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (i) 단계(d)에서의 증폭 전에 핵산-표적 결합체로부터 해리되는 핵산을 역전사시키는 단계; 및 (ii) 이 공정의 재출발 전에 단계 (d)로부터의 증폭 핵산을 전사시키는 단계.
다수의 가능한 서열 및 구조를 포함하는 핵산 혼합물 내에는 주어진 표적에 대한 광범위한 결합 친화성이 존재한다. 예를 들어, 20개의 뉴클레오티드 랜덤화 절편을 포함하는 핵산 혼합물은 420개의 가능한 후보를 가질 수 있다. 표적에 대한 친화도 상수가 보다 높은 것은 표적에 결합할 가능성이 가장 크다. 분리, 해리 및 증폭 후, 제2 핵산 혼합물을 생성하고 보다 높은 결합 친화성 후보가 풍부하게 한다. 추가의 선별 순환은 생성되는 핵산 혼합물이 단지 하나 또는 수 개의 서열로 주로 구성될 때까지 점진적으로 최상의 리간드 쪽으로 향하게 한다. 이어서 이들을 클로닝하고, 시퀀싱하고, 순수한 리간드 또는 앱타머로서 결합 친화도에 대하여 개별적으로 시험한다.
선별 및 증폭 주기는 원하는 목표가 달성될 때까지 반복한다. 가장 일반적인 경우, 이 주기의 반복 시 결합 강도의 유의한 개선이 전혀 달성되지 않을 때까지 선별/증폭을 계속한다. 이 방법은 전형적으로 대략 1014개의 다양한 핵산 종을 샘플링하기 위하여 사용되지만, 약 1018개만큼 많은 다양한 핵산 종의 샘플링에도 사용될 수 있다. 일반적으로, 핵산 앱타머 분자는 5회 내지 20회의 주기 과정에서 선별된다. 한 실시양태에 있어서, 이종성은 초기 선별 단계에서만 도입되며 복제 과정 전반에 걸쳐서는 나타나지 않는다.
SELEXTM의 한 실시양태에서, 선별 공정은 선별된 표적에 가장 강력하게 결합하는 핵산 리간드의 단리 시 매우 효율적이어서, 1회 주기의 선별 및 증폭만이 필요하다. 그러한 효율적인 선별은, 예를 들어 크로마토그래피형 공정에서 일어날 수도 있는데, 여기서, 핵산이 컬럼 상에 결합된 표적과 결합하는 능력은 상기 컬럼이 가장 높은 친화성을 가진 핵산 리간드의 분리 및 단리를 충분히 허용할 수 있는 방식으로 작용한다.
다수의 경우, 단일 핵산 리간드가 확인될 때까지 SELEXTM의 반복적인 단계를 수행하는 것이 반드시 바람직한 것은 아니다. 표적-특이적 핵산 리간드 용액은 다수의 보존된 서열, 및 표적에 대한 핵산 리간드의 친화성에 유의하게 영향을 주지 않으면서 치환 또는 부가될 수 있는 다수의 서열을 갖는 핵산 구조 또는 모티프의 족을 포함할 수 있다. SELEXTM 공정의 완결 이전에 SELEXTM 공정을 종결함으로써 핵산 리간드 용액 족의 다수의 구성원의 서열을 결정할 수 있다.
다양한 핵산의 일차, 이차 및 삼차 구조가 존재하는 것으로 공지되어 있다. 비-왓슨-크릭형 상호작용에 가장 일반적으로 관여하는 것으로 밝혀진 구조 또는 모티프는 헤어핀 루프(hairpin loop), 대칭 및 비대칭 돌출부(bulge), 유사매듭(peudoknot) 및 이들의 무수한 조합으로 칭해진다. 이러한 모티프의 거의 모든 공지된 경우는 이 모티프가 30개 이하의 뉴클레오티드의 핵산 서열에서 형성될 수 있음을 시사한다. 이러한 이유로, 인접한 랜덤화 절편을 이용한 SELEXTM 공정은 약 20개 내지 약 50개, 몇몇 실시양태에 있어서는 약 30개 내지 약 40개의 뉴클레오티드로 된 랜덤화 절편을 포함하는 핵산 서열로 개시하는 것이 종종 바람직하다. 일례에 있어서, 5'-고정:랜덤:3'-고정 서열은 약 30개 내지 약 50개의 뉴클레오티드로 된 랜덤 서열을 포함한다.
코어 SELEXTM 방법을 변형하여 다수의 특정 목적을 달성하였다. 예를 들어, 미국 특허 제5,707,796호에는 SELEXTM을 겔 전기영동과 함께 이용하여 특정한 구조적 특징을 갖는 핵산 분자, 예를 들어, 벤트(bent) DNA를 선별하는 것이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,763,177호에는 표적 분자에 결합하고/하거나 광-가교 결합하고/하거나 표적 분자를 광-불활성화시킬 수 있는 광 반응기를 포함하는 핵산 리간드를 선별하기 위한, SELEXTM에 기초한 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,567,588호 및 미국 특허 제5,861,254호에는 표적 분자에 대하여 친화도가 높은 올리고뉴클레오티드와 표적 분자에 대한 친화도가 낮은 올리고뉴클레오티드 사이에 고도로 효율적인 분리가 달성되는 SELEXTM에 기초한 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,496,938호에는 SELEXTM 공정이 수행된 후 개선된 핵산 리간드를 수득하는 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,705,337호에는 리간드를 이의 표적에 공유 결합으로 결합시키는 방법이 개시되어 있다.
또한, SELEXTM를 이용하여 표적 분자 상의 1 초과의 부위에 결합하는 핵산 리간드를 수득하고, 표적 상의 특정 부위에 결합하는 비-핵산 종을 포함하는 핵산 리간드를 수득할 수 있다. SELEXTM는 크거나 작은 생체분자, 예를 들어 핵산 결합 단백질, 및 생물학적 기능의 일부로서 핵산에 결합하는 것으로 공지되어 있지 않은 단백질과, 보조 인자(cofactor) 및 기타 소분자를 비롯하 예상될 수 있는 임의의 표적에 결합하는 핵산 리간드를 단리하고 확인하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,580,737호에는 SELEXTM를 통하여 확인되며, 카페인 및 밀접하게 연관된 유사체인 테오필린과 높은 친화도로 결합할 수 있는 핵산 서열이 개시되어 있다.
카운터(Counter)-SELEXTM는 1 이상의 비-표적 분자에 대한 교차 반응성을 갖는 핵산 리간드 서열의 제거에 의해 표적 분자에 대한 핵산 리간드의 특이성을 개선하는 방법이다. 카운터-SELEXTM는 (a) 후보 핵산 혼합물을 제조하는 단계; (b) 후보 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계 - 여기서, 후보 혼합물에 비하여 표적에 대한 친화도가 증가된 핵산을 나머지 후보 혼합물로부터 분리할 수 있음 -; (c) 친화도가 증가된 핵산을 나머지 후보 혼합물로부터 분리하는 단계; (d) 친화도가 증가된 핵산을 표적으로부터 해리시키는 단계; (e) 친화도가 증가된 핵산을 하나 이상의 비-표적 분자와 접촉시켜 비-표적 분자(들)에 대하여 특정 친화도를 갖는 핵산 리간드가 제거되게 하는 단계; 및 (f) 표적 분자에 대해서만 특정 친화도를 갖는 핵산을 증폭시켜 표적 분자와의 결합에 있어서 상대적으로 보다 높은 친화도 및 특이성을 갖는 핵산 서열이 풍부한 핵산 혼합물을 생성하는 단계로 이루어진다. SELEXTM에 대하여 상기에 기술되어 있는 바와 같이, 선별 및 증폭 주기는 원하는 목표가 달성될 때까지 필요한 만큼 반복한다.
치료제 및 백신으로서의 핵산의 사용에서 우연히 만나는 한 가지 잠재적인 문제점은, 원하는 효과가 명백해지기 전에 포스포디에스테르 형태의 올리고뉴클레오티드가 세포내 및 세포외 효소, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의해 체액에서 빠르게 분해될 수도 있다는 점이다. 따라서 SELEXTM 방법은 리간드 상에 개선된 특성, 예를 들어, 개선된 생체내 안정성 또는 개선된 전달 특성을 부여하는 변형 뉴클레오티드를 포함하는 고 친화성 핵산 리간드의 확인을 포함한다. 그러한 변형의 예는 리보스 및/또는 인산염 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 변형 뉴클레오티드를 포함하는 SELEXTM-확인 핵산 리간드는 예를 들어 리보스의 2' 위치, 피리미딘의 5 위치, 및 퓨린의 8 위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 개시하는 미국 특허 제5,660,985호, 다양한 2'-변형 피리미딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 개시하는 미국 특허 제5,756,703호, 및 2'-아미노(2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F), 및/또는 2'-O-메틸(2'-OMe) 치환체로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 고도로 특이적인 핵산 리간드를 개시하는 미국 특허 제5,580,737호에 개시되어 있다.
본 발명에서 고려되는 핵산 리간드의 변형은 추가의 전하, 편광성, 소수성, 수소 결합, 정전기적 상호작용 및 유동성(fluxionality)을 핵산 리간드의 염기 또는 전체로서의 핵산 리간드에 도입시키는 다른 화학 기를 제공하는 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 뉴클레아제에 대하여 내성을 갖는 올리고뉴클레오티드 집단을 생성하기 위한 변형은 하나 이상의 치환 뉴클레오티드간 결합, 변경된 당, 변경된 염기, 또는 그 조합도 포함할 수 있다. 이러한 변형은 2'-위치의 당 변형, 5-위치의 피리미딘 변형, 8-위치의 퓨린 변형, 엑소시클릭(exocyclic) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오도-우라실의 치환; 골격 변형, 포스포로티오에이트 또는 알킬 포스페이트 변형, 메틸화, 및 이례적인 염기쌍 형성 조합, 예를 들어, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아노신을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 변형은 3' 및 5' 변형, 예를 들어 캡핑도 포함할 수 있다.
한 실시양태에 있어서, P(O)O 기가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), P(O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈") 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 대체된 올리고뉴클레오티드가 제공되며, 여기서, 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 알킬이다. 결합 기는 -O-, -N-, 또는 -S-결합을 통하여 인접 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다.
추가의 실시양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 기를 포함하는데, 예를 들어, 히드록실 기 중 하나 이상은 할로겐 또는 지방족 기로 대체되거나, 에테르 또는 아민으로서 관능화된다. 한 실시양태에 있어서, 푸라노스 잔기의 2' 위치는 임의의 0-메틸, 0-알킬, 0-알릴, S-알킬, S-알릴, 또는 할로 기로 치환된다. 2'-변형 당의 합성 방법은 예를 들어, 문헌[Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19: 733-738(1991)]; 문헌[Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19: 2629-2635(1991)]; 및 문헌[Hobbs, et al., Biochemistry 12: 5138-5145(1973)]에 기술되어 있다. 다른 변형이 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 이러한 변형은 SELEXTM 공정 이전의 변형 또는 SELEXTM 공정 이후의 변형(이전에 확인된 비변형 리간드의 변형)일 수 있거나 SELEXTM 공정 내로의 도입에 의해 만들어질 수 있다.
SELEXTM 공정 이전의 변형 또는 SELEXTM 공정 내로의 도입에 의해 만들어지는 변형에 의해 SELEXTM 표적에 대한 특이성 및 개선된 안정성, 예를 들어 생체내 안정성 둘 다를 갖는 핵산 리간드가 생성된다. 핵산 리간드에 행해지는 SELEXTM 공정 이후의 변형에 의해 이 핵산 리간드의 결합 능력에 악영향을 주지 않으면서 안정성, 예를 들어, 생체내 안정성을 개선시킬 수도 있다.
SELEXTM 방법은, 미국 특허 제5,637,459호 및 미국 특허 제5,683,867호에 개시되어 있는 바와 같이, 선별된 올리고뉴클레오티드를 다른 선별된 올리고뉴클레오티드 및 비-올리고뉴클레오티드 작용 유니트를 조합하는 단계를 포함한다. SELEXTM 방법은, 예를 들어 미국 특허 제6,011,020호, 미국 특허 제6,051,698호, 및 PCT 공보 제WO 98/18480호에 개시되어 있는 바와 같이, 선별된 핵산 리간드를, 진단용 또는 치료용 결합체 형태로 친유성 또는 비-면역원성 고분자량 화합물과 조합하는 단계를 포함한다. 상기 특허 및 특허 출원에는 형상 및 기타 특성의 광범위한 어레이(array)와, 올리고뉴클레오티드의 효율적인 증폭 및 복제 특성과, 다른 분자의 바람직한 특성의 조합이 교시되어 있다.
SELEXTM 방법을 통한 작고 유연한 펩티드에 대한 핵산 리간드의 확인도 탐구되었다. 작은 펩티드는 유연한 구조를 가지며 일반적으로 용액 중에 다수의 이형태체(conformer)의 평형 상태로 존재하고, 따라서, 처음에는 결합 친화성이 가요성 펩티드의 결합 시 손실되는 구조적 엔트로피에 의해 제한될 수 있다고 생각되었다. 그러나, 용액 중의 작은 펩티드에 대한 핵산 리간드의 확인에 대한 실현 가능성이 미국 특허 제5,648,214호에서 입증되었다. 상기 특허에서, 11개의 아미노산으로 된 펩티드인 물질 P에 대한 고 친화성 RNA 핵산 리간드가 확인되었다.
표적(들)에 대하여 특이성 및 결합 친화성을 갖는 본 발명의 앱타머는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 전형적으로 SELEXTM 공정으로 선별된다. SELEXTM 공정의 일부로서, 표적에 결합하는 것으로 선별된 서열은 그 후 경우에 따라 최소화되어 원하는 결합 친화성을 갖는 최소 서열을 결정한다. 선별된 서열 및/또는 최소화된 서열은 이 서열의 랜덤 돌연변이유발 또는 지시적 돌연변이유발(directed mutagenesis)을 수행하여 결합 친화성을 증가시키거나 대안적으로는 이 서열 내의 어느 위치가 결합 활성에 필수적인 지를 결정함으로써 경우에 따라 최적화한다. 추가로, 선별은 생체내에서 분해에 대하여 앱타머 분자를 안정화시키기 위한 변형 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 이용하여 수행할 수 있다.
2' 변형 SELEX TM
앱타머를 치료제로서 사용하기에 적합하게 하기 위해서는, 값싸게 합성시키고 생체내에서 안전하며 안정한 것이 바람직하다. 야생형 RNA 또는 DNA 앱타머는 전형적으로 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 그의 감수성 때문에 생체내에서 안정하지 못하다. 뉴클레아제 분해에 대한 내성은 2'-위치에 변형 기를 포함시킴으로써 크게 증가시킬 수 있다.
플루오로 및 아미노 기는 앱타머가 후속적으로 선별되는 올리고뉴클레오티드 풀 내로 성공적으로 도입되었다. 그러나, 이 변형은 생성되는 앱타머의 합성 비용을 크게 증가시키며, 몇몇 경우 안전성 상의 관심사를 도입할 수도 있는데, 이는 변형 올리고뉴클레오티드의 분해 및 DNA 합성에 있어서의 기질로서의 뉴클레오티드의 후속적인 사용에 의해 변형 뉴클레오티드가 숙주 DNA 내로 재활용될 수 있다는 가능성 때문이다.
본원에 제공되어 있는 바와 같이, 2'-O-메틸("2'-OMe") 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머는 이러한 결점 중 다수를 극복한다. 2'-OMe 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제-내성이며 합성이 값이 싸다. 2'-OMe 뉴클레오티드는 생물학적 시스템에서 편재하지만, 천연 폴리머라제는 생리학적 조건 하에서 2'-OMe NTP를 기질로서 받아들이지 않으며, 따라서 숙주 세포 내로의 2'-OMe 뉴클레오티드의 재활용에 대한 안전성 상의 관심사는 전혀 존재하지 않는다. 2'-변형 앱타머의 생성에 사용되는 SELEXTM 방법은 예를 들어, 2002년 12월 3일자로 출원된 미국 가출원 제60/430,761호, 2003년 7월 15일자로 출원된 미국 가출원 제60/487,474호, 2003년 11월 4일자로 출원된 미국 가출원 제60/517,039호, 2003년 12월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/729,581호, 및 발명의 명칭이 "2'-O-메틸 치환 핵산의 시험관내 선별 방법"이며 2004년 6월 21일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/873,856호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 그의 전체 내용이 참고로 포함되어 있다.
본 발명은 IgE에 결합하여 그의 기능을 조절하며 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 2' 위치에서 변형체를 갖는 뉴클레오티드)를 포함하여 이 뉴클레오티드가 효소 및 화학적 분해와, 열 및 물리적 분해에 대하여 비변형 올리고뉴클레오티드보다 안정하게 되도록 하는 앱타머를 포함한다. 2'-OMe 함유 앱타머의 여러 예가 문헌에 존재하지만(예를 들어, 문헌[Green et al., Current Biology 2, 683-695, 1995] 참조) 이들은 C 및 U 잔기가 2'-플루오로(2'-F) 치환되며 A 및 G 잔기가 2'-OH인 변형 전사체 라이브러리의 시험관내 선별에 의해 제조되었다. 일단 기능성 서열이 확인되면, 각각의 A 및 G 잔기는 2'-OMe 치환에 대한 내성에 대하여 시험하였으며, 2'-OMe 잔기로서 2'-OMe 치환에 내성이 있는 모든 A 및 G 잔기를 갖는 앱타머를 재합성하였다. 대략적으로 평균 20%가 2'-OMe 잔기로 치환한 것에 내성이 없지만, 이 2단계 방식으로 생성된 앱타머의 A 및 G 잔기 중 대부분은 상기 치환에 내성이 있다. 따라서, 이 방법을 사용하여 생성시킨 앱타머는 2개 내지 4개의 2'-OH 잔기를 포함하는 경향이 있으며, 그 결과, 안정성 및 합성 비용이 양보된다. 앱타머가 SELEXTM 에 의해 선별 및 농후화되는 올리고뉴클레오티드 풀에서 사용되는 안정화 올리고뉴클레오티드(및/또는 본원에 기술되어 있는 것을 포함하는 임의의 그의 변이체 및 개선체)를 생성하는 전사 반응 내로 변형된 뉴클레오티드를 포함시킴으로써, 본 발명의 방법에서는(예를 들어, 변형된 뉴클레오티드를 이용하여 앱타머 올리고뉴클레오티드를 재합성함으로써) 선별된 앱타머 올리고뉴클레오티들 안정화시킬 필요성이 제거된다.
한 실시양태에 있어서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 및 2'-OMe 변형들의 조합을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-OMe, 2'-NH2, 및 2'-메톡시에틸 변형체들의 조합을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-OMe, 2'-NH2, 및 2'-메톡시에틸 변형체들의 56개의 조합을 포함하는 앱타머를 제공한다.
본 발명의 2' 변형 앱타머는 변형 폴리머라제, 예를 들어, 야생형 폴리머라제보다 높은 푸라노스 2' 위치에서의 부피가 큰(bulky) 치환체를 갖는 변형 뉴클레오티드의 삽입률을 갖는 변형 T7 폴리머라제를 사용하여 생성한다. 예를 들어, 639 위치에서의 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 변화된 단일 돌연변이 T7 폴리머라제(Y639F)는 손쉽게 2'데옥시, 2'아미노-, 및 2'플루오로-뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP)를 기질로 이용하며 다양한 용도의 변형 RNA의 합성에 널리 사용되었다. 그러나, 이 돌연변이 T7 폴리머라제는 부피가 큰 2'-치환체, 예를 들어, 2'-OMe 또는 2'-아지도(2'-N3) 치환체를 포함하는 NTP를 손쉽게 이용(즉, 삽입)할 수 없다. 부피가 큰 2' 치환체의 삽입에 있어서, Y639F 돌연변이 외에도 784 위치의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변화된 T7 폴리머라제 돌연변이체(Y639F/H784A)가 기술되었으며 제한된 상황에서 변형 피리미딘 NTP의 삽입을 위하여 사용되었다. 문헌[Padilla, R. and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138]을 참조한다. 784 위치의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변화된 돌연변이 T7 폴리머라제(H784A)도 기술되었다. 문헌[Padilla et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138] 참조. Y639F/H784A 돌연변이 및 H784A 돌연변이 T7 폴리머라제 둘 모두에 있어서, 알라닌과 같은 보다 작은 아미노산 잔기로의 변화는 보다 부피가 큰 뉴클레오티드 기질, 예를 들어 2'-OMe 치환 뉴클레오티드의 삽입을 허용한다.
일반적으로, 본원에 개시된 조건 하에서, Y693F 단일 돌연변이체는 GTP를 제외한 모든 2'-OMe 치환 NTP의 삽입에 사용될 수 있으며, Y639F/H784A 돌연변이체는 GTP를 포함하는 모든 2'-OMe 치환 NTP의 삽입에 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본원에 개시된 조건 하에서 사용될 때 H784A 돌연변이체는 Y639F 및 Y639F/H784A 돌연변이체와 유사한 특성을 가질 것이라 기대된다.
전적으로 변형 뉴클레오티드로 또는 변형 뉴클레오티드의 서브세트를 이용하여 2'-변형 뉴클레오티드를 합성할 수도 있다. 이 변형체는 동일하거나 상이할 수 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수도 있으며, 모두가 동일한 변형체를 포함할 수도 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있으며, 상이한 변형체를 포함할 수 있는데, 예를 들어 동일한 염기를 포함하는 모든 뉴클레오티드는 하나의 유형의 변형체를 가질 수 있는 반면, 다른 염기를 포함하는 뉴클레오티드는 상이한 유형의 변형체를 가질 수 있다. 모든 퓨린 뉴클레오티드는 하나의 유형의 변형체를 가질 수 있는 반면(또는 비변형되는 반면), 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 다른 상이한 유형의 변형체를 갖는다(또는 비변형됨). 이러한 방식으로, 전사체, 또는 전사체 풀은 예를 들어, 리보뉴클레오티드(2'-OH), 데옥시리보뉴클레오티드(2'-데옥시), 2'-F, 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 포함하는 변형체의 임의의 조합을 사용하여 ㅅ새생성한다. 2'-OMe C 및 U와 2'-OH A 및 G를 포함하는 전사 혼합물은 "rRmY" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "rRmY" 앱타머로 칭해진다. 데옥시 A 및 G와 2'-OMe U 및 C를 포함하는 전사 혼합물은 "dRmY" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "dRmY" 앱타머로 칭해진다. 2'-OMe A, C, 및 U와, 2'-OH G를 포함하는 전사 혼합물은 "rGmH" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "rGmH" 앱타머로 칭해진다. 교대로 2'-OMe A, C, U 및 G와 2'-OMe A, U 및 C와 2'-F G를 포함하는 전사 혼합물은 "교대 혼합물"로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "교대 혼합" 앱타머로 칭해진다. 2'-OMe A, U, C, 및 G - 여기서, G 중 최대 10%는 리보뉴클레오티드임 - 를 포함하는 전사 혼합물은 "r/mGmH" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "r/mGmH" 앱타머로 칭해진다. 2'-OMe A, U, 및 C와, 2'-F G를 포함하는 전사 혼합물은 "fGmH" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "fGmH" 앱타머로 칭해진다. 2'-OMe A, U, 및 C와, 데옥시 G를 포함하는 전사 혼합물은 "dGmH" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "dGmH" 앱타머로 칭해진다. 데옥시 A와, 2'-OMe C, G 및 U를 포함하는 전사 혼합물은 "dAmB" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "dAmB" 앱타머로 칭해지고, 모든 2'-OH 뉴클레오티드를 포함하는 전사 혼합물은 "rN" 혼합물로 칭해지며 그로부터 선별되는 앱타머는 "rN" 또는 "rRrY" 앱타머로 칭해진다. "mRmY" 앱타머는 모든 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 포함하는 것이며 일반적으로 가능할 경우 임의의 2'-OH G를 2'-OMe G로 SELEXTM TKGN 대체에 의해 r/mGmH 올리고뉴클레오티드로부터 유도된다.
바람직한 실시양태는 2'-OH, 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함한다. 더 바람직한 실시양태는 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시양태는 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함하는 것이며, 여기서, 피리미딘은 2'-OMe(예를 들어, dRmY, mRmY 또는 dGmH)이다.
본 발명의 앱타머 내로의 변형 뉴클레오티드의 삽입은 선별 공정 전(이전)에 성취된다(예를 들어, SELEXTM 공정 이전 변형). 선별적으로, 변형 뉴클레오티드가 SELEXTM 공정 이전 변형에 의해 삽입되어 있는 본 발명의 앱타머는 SELEXTM 공정 이후의 변형에 의해(즉, SELEXTM 이전 변형 후 SELEXTM) 공정 이후 변형)에 의해 추가로 변형될 수 있다. SELEXTM 공정 이전의 변형은 SELEXTM 표적에 대하여 특이성을 가지며 생체내 안정성도 개선된 변형된 핵산 리간드를 생성한다. SELEXTM 공정 이후의 변형, 즉, 변형(예를 들어, SELEXTM 공정 이전의 변형에 의해 뉴클레오티드가 삽입되기 전에 확인된 리간드의 절단, 결실, 치환 또는 부가 뉴클레오티드 변형)은 SELEXTM 공정 이전의 변형에 의해 뉴클레오티드가 삽입된 핵산 리간드의 결합 능력에 악영향을 주지 않으면서 생체내 안정성을 추가로 개선시킬 수 있다.
폴리머라제가 2'-변형 NTP를 받아들이는 조건 하에 2'-변형(예를 들어, 2'-OMe) RNA 전사체의 풀을 생성하기 위하여, 바람직한 폴리머라제는 Y693F/H784A 돌연변이체 또는 Y693F 돌연변이체이다. 다른 폴리머라제, 특히 부피가 큰 2'-치환체에 대하여 높은 내성을 나타내는 것도 본 발명에서 사용될 수 있다. 그러한 폴리머라제는 본원에 개시된 전사 조건 하에 변형 뉴클레오티드를 삽입시키는 그의 능력을 분석함으로써 상기 가능성에 대하여 스크리닝할 수 있다.
다수의 요인이 본원에 개시된 방법에 유용한 전사 조건에 중요한 것으로 결정되었다. 예를 들어, 변형 전사체의 수율의 증가는, 생성되는 전사체의 적어도 대략 초기의 6개의 잔기가 모두 퓨린이 되도록 리더 서열이 DNA 전사 주형의 5' 말단의 고정 서열의 5' 말단 내로 삽입될 때 관찰된다.
변형 뉴클레오티드가 삽입된 전사체의 수득에서 중요한 다른 요인은 2'-OH GTP의 존재 또는 농도이다. 전사는 2단계로 나뉘어진다: 제1 단계는 개시 단계이며, 이 단계 동안 NTP가 GTP(또는 다른 치환 구아노신)의 3'-히드록실 말단에 첨가되어 디뉴클레오티드를 생성하고 이어서 이 디뉴클레오티드는 약 10-12개의 뉴클레오티드에 의해 연장되고; 제2 단계는 신장 단계이며, 이 단계 동안 전사는 약 10-12개의 처음의 뉴클레오티드의 부가 이상으로 진행된다. 과량의 2'-OMe GTP를 함유하는 전사 혼합물에 첨가되는 소량의 2'-OH GTP는 폴리머라제가 2'-OH GTP를 사용하여 전사를 개시하게 하기에 충분하지만, 일단 전사가 연장 단계에 들어가면, 2'-OMe와 2'-OH GTP 사이의 구별 감소와, 2'-OH GTP에 비해 과량인 2'-OMe GTP가 주로 2'-OMe GTP의 삽입을 허용한다.
전사체 내로의 2'-OMe 치환 뉴클레오티드 삽입에서의 다른 중요한 요인은 전사 혼합물에서의 이가 마그네슘 및 망간 둘 모두의 사용이다. 염화마그네슘 및 염화망간의 농도의 상이한 조합은 2'-O-메틸화 전사체의 수율에 영향을 주는 것으로 밝혀졌는데, 염화마그네슘 및 염화망간의 최적 농도는 이가 금속 이온과 착체를 형성하는 NTP의 전사 반응 혼합물 중의 농도에 따라 달라진다. 최대로 2' 치환된 O-메틸화 전사체(즉, 모든 A, C 및 U와 약 90%의 G 뉴클레오티드)의 최고 수율을 얻기 위하여, 각각의 NTP가 0.5 mM의 농도로 존재할 때 대략 5 mM의 염화마그네슘 및 1.5 mM의 염화망간의 농도가 바람직하다. 각각의 NTP의 농도가 1.0 mM일 때는, 대략 6.5 mM의 염화마그네슘 및 2.0 mM의 염화망간의 농도가 바람직하다. 각각의 NTP의 농도가 2.0 mM일 때, 대략 9.6 mM의 염화마그네슘 및 2.9 mM의 염화망간의 농도가 바람직하다. 모든 경우, 최대 2배의 상기 농도로부터의 이탈은 여전히 유효한 양의 변형 전사체를 생성한다.
GTP 또는 구아노신을 이용한 전사의 프라이밍도 중요하다. 이 효과는 개시 뉴클레오티드에 대한 폴리머라제의 특이성으로부터 생긴다. 그 결과, 이러한 방식으로 생성되는 모든 전사체의 5' 말단 뉴클레오티드는 2'-OH G가 될 가능성이 있다. GMP(또는 구아노신)의 바람직한 농도는 0.5 mM, 더욱 더 바람직하게는 1 mM이다. 전사 반응에서 PEG를 포함하여, 바람직하게는 PEG-8000이 변형 뉴클레오티드의 삽입의 최대화에 유용하다는 것이 또한 밝혀졌다.
2'-OMe ATP(100%), UTP(100%), CTP(100%) 및 GTP(~90%)("r/mGmH")의 전사체 내로의 최대 삽입에 있어서, 하기 조건이 바람직하다: 헤페스 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), 트리톤 X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(6.5 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 1.0 mM임), MnCl2 1.5 mM(2.0 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 1.0 mM임), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(더 바람직하게는 1.0 mM), 2'-OH GTP 30 μM, 2'-OH GMP 500 μM, pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 폴리머라제 15 단위/㎖, 무기 피로포스파타제 5 단위/㎖, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두-퓨린(all-purine)인 리더 서열. 본원에 사용되는 바와 같이, Y639F/H784A 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제(또는 본원에 명시된 임의의 다른 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제)의 1 단위는 r/mGmH 조건 하에서 전사체 내로 1 nmole의 2'-OMe NTP를 삽입시키는 데에 필요한 효소의 양으로 정의된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 무기 피로포스파타제의 단위는 pH 7.2 및 25℃에서 1분 당 무기 오르토포스페이트 1.0몰을 유리시키는 효소의 양으로 성의된다.
전사체 내로의 2'-OMe ATP, UTP 및 CTP("rGmH")의 최대 삽입(100%)에 있어서, 하기 조건이 바람직하다: 헤페스 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), 트리톤 X-100 0. 01%(wlv), MgCl2 5 mM(9.6 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), MnCl2 1.5 mM(2.9 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(더 바람직하게는 2.0 mM), pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 단위/㎖, 무기 피로포스파타제 5 단위/㎖, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체 내로의 2'-OMe UTP 및 CTP("rRmY")의 최대 삽입(100%)에 있어서, 하기의 조건이 바람직하다: 헤페스 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), 트리톤 X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(9.6 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), MnCl2 1.5 mM(2.9 mM - 여기서, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(더 바람직하게는 2.0 mM), pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 폴리머라제 15 단위/㎖, 무기 피로포스파타제 5 단위/㎖, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체 내로의 데옥시 ATP 및 GTP와 2'-OMe UTP 및 CTP("dRmY")의 최대 삽입(100%)에 있어서는 하기 조건이 바람직하다: 헤페스 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼민 2 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), 트리톤 X- 100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 단위/㎖, 무기 피로포스파타제 5 단위/㎖, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체 내로의 2'-OMe ATP, UTP 및 CTP와 2'-F GTP("fGmH")의 최대 삽입(100%)에 있어서는 하기 조건이 바람직하다: 헤페스 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), 트리톤 X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 단위/㎖, 무기 피로포스파타제 5 단위/㎖, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체 내로의 데옥시 ATP와 2'-OMe UTP, GTP 및 CTP("dAmB")의 최대 삽입(100%)에 있어서는 하기 조건이 바람직하다: 헤페스 완충제 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), 트리톤 X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 단위/㎖, 무기 피로포스파타제 5 단위/㎖, 및 길이가 적어도 8개의 뉴클레오티드인 모두 퓨린인 리더 서열.
각각의 상기 사항에 있어서, (a) 전사는 약 20℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 45℃, 더 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 적어도 2시간 동안 수행하는 것이 바람직하며 (b) 50-300 nM의 이중 가닥 DNA 전사 주형이 사용된다(200 nM의 주형을 1 순환에서 사용하여 다양성을 증가시킴(300 nM의 주형이 dRmY 전사에 사용됨), 후속 순환에 있어서는 본원에 기술된 조건을 사용하여, 최적 PCR 반응물의 1/10 희석물인 대략 50 nM이 사용됨). 바람직한 DNA 전사 주형이 이하에 기술되어 있다(여기서, ARC254 및 ARC256는 모두 2'-OMe인 조건 하에 전사되며 ARC255는 rRmY 조건 하에 전사됨).
서열 번호 1(ARC254)
5'-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTC
TCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
서열 번호 2(ARC255)
5'-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCT
CTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
서열 번호 3(ARC256)
5'-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCT
CTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
본 발명의 rN 전사 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2'-OH 구아노신 트리포스페이트(GTP), 2'-OH 시티딘 트리포스페이트(CTP), 및 2'-OH 우리딘 트리포스페이트(UTP)를 포함한다. 본 발명의 rN 전사 혼합물을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-OH 시티딘, 및 2'-OH 우리딘을 포함한다. rN 전사의 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사의 더 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사의 가장 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 rRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트, 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rRmY 전사 혼합물을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘 및 2'-0-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 dRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-데옥시 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dRmY 전사 조건을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-데옥시 아데노신, 2'-데옥시 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘, 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-데옥시 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-데옥시 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-데옥시 구아노신이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 rGmH 전사 조건 하에서 전사 반응 혼합물은 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rGmH 전사 조건을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-OH 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 우리딘 및 2'-O-메틸 아데노신을 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-OH 구아노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘이며, 모두 아데노신인 튜클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 아데노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-OH 구아노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘이며, 모두 아데노신인 튜클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 아데노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-OH 구아노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘이며, 모두 아데노신인 튜클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 아데노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 r/mGmH 전사 조건 하에서 전사 반응 혼합물은 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-OH 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 r/mGmH 전사 조건을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함하며, 여기서, 구아노신 뉴클레오티드 집단은 최대 약 10%의 2'-OH 구아노신을 갖는다. 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 r/mGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 구아노신이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 구아노신이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 구아노신이고, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 fGmH 전사 조건 하에서 전사 반응 혼합물은 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-F 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 fGmH 전사 조건을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 우리딘, 2'-O-메틸 시티딘 및 2'-F 구아노신을 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 fGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-F-구아노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 fGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-F-구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 본 발명의 fGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 아데노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-F-구아노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 dAmB 전사 조건 하에서 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 구아노신 트리포스페이트 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dAmB 전사 혼합물을 사용하여 생성한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두의 2'-데옥시 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 구아노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 80%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 구아노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 90%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에 있어서, 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모두 아데노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-데옥시 아데노신이며, 모두 시티딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모두 구아노신인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 구아노신이며, 모두 우리딘인 뉴클레오티드 중 적어도 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
각각의 경우, 전사 산물은 그 후 SELEXTM 공정에서 라이브러리로서 사용되어 앱타머를 확인하고/하거나 주어진 표적에 결합 특이성을 갖는 서열의 보존된 모티프를 결정할 수 있다. 생성된 서열은 이미 부분적으로 안정화되어, 최적 앱타머 서열에 도달하기 위한 공정으로부터 이 단계가 제외되고, 그 결과 보다 고도로 안정화된 앱타머가 주어진다. 2'-OMe SELEXTM 공정의 다른 장점은 생성된 서열이 서열 중에 필요한 보다 적은 2'-OH 뉴클레오티드를 가질 것 같으며, 아마도 이를 전혀 갖지 않을 것 같다는 것이다. 2'-OH 뉴클레오티드가 남아있는 정도까지 이 뉴클레오티드는 사후-SELEXTM 변형의 수행에 의해 제거될 수 있다.
이하에 기술되어 있는 바와 같이, 2' 치환 뉴클레오티드가 완전히 삽입된 보다 낮지만 여전히 유용한 수율의 전사체가 상기에 기술한 최적 조건 이외의 조건 하에 수득될 수 있다. 예를 들어, 상기 전사 조건의 변동은 하기를 포함한다:
헤페스 완충제 농도는 0 내지 1 M 범위일 수 있다. 본 발명에서는 pKa가 5 내지 10 사이인, 예를 들어 트리스-히드록시메틸-아미노메탄을 포함하는 다른 완충제의 사용도 고려된다.
DTT 농도는 0 내지 400 mM 범위일 수 있다. 본 발명은 예를 들어 머캅토에탄올을 포함하는 다른 환원제의 용도도 제공한다.
스퍼미딘 및/또는 스퍼민의 농도는 0 내지 20 mM의 범위일 수 있다.
PEG-8000의 농도는 0 내지 50%(w/v)의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 예를 들어 다른 분자량의 PEG 또는 기타 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 다른 친수성 중합체의 용도도 제공한다.
트리톤 X-100의 농도는 0 내지 0.1%(w/v)의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 예를 들어 다른 트리톤-X 세제를 포함하는 기타 세제를 포함하는 다른 비이온성 세제의 용도도 제공한다.
MgCl2의 농도는 0.5 mM 내지 50 mM의 범위일 수 있다. MnCl2의 농도는 0.15 mM 내지 15 mM의 범위일 수 있다. MgCl2 및 MnCl2 둘 모두는 기술된 범위 이내로 존재하여야 하며 바람직한 실시양태에 있어서는 약 10 내지 약 3의 비의 MgCl2:MnCl2로 존재하고, 바람직하게는 이 비는 약 3-5:1이며, 더 바람직하게는 약 3-4:1이다.
2'-OMe NTP의 농도(각각의 NTP)는 5 μM 내지 5 mM의 범위일 수 있다.
2'-OH GTP의 농도는 0 μM 내지 300 μM의 범위일 수 있다.
2'-OH GMP의 농도는 0 내지 5 mM의 범위일 수 있다.
pH는 pH 6 내지 pH 9의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 변형 뉴클레오티드를 삽입시키는 대부분의 폴리머라제의 활성의 pH 범위 내에서 실행될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 전사 반응 조건에 있어서 예를 들어 EDTA, EGTA, 및 DTT를 포함하는 킬레이팅제의 임의적 사용을 제공한다.
앱타머의 의학적 화학기법
앱타머의 의학적 화학기법은 변이체 앱타머 셋트가 화학적으로 합성되는 앱타머 개선 기술이다. 이들 변이체 셋트는 전형적으로는 단일 치환체의 도입에 의해 모 앱타머와 구별되고, 이 치환체의 위치에 의해 서로 구별된다. 그 후, 이들 변이체를 서로 간에 비교하고 모 엡타머와 비교한다. 특성에 있어서의 개선은 단일 치환체의 포함이 특정한 치료적 기준을 달성하기에 필요한 전부일 수 있을 정도로 충분히 클 수 있다.
별법으로, 단일 변이체 셋트로부터 모은 정보를 이용하여 1 이상의 치환체가 동시에 도입되는 추가 변이체 셋트를 디자인할 수 있다. 한 디자인 방법에서, 모든 단일 치환 변이체에 대해 등급을 매기고, 상위 4개를 선택하고 이들 4개의 단일 치환 변이체의 모든 가능한 이중(6), 삼중(4) 및 사중(1) 조합물을 합성하여 분석한다. 제2 디자인 방법에서, 최적의 단일 치환 변이체를 새로운 모 앱타머로 간주하고, 가장 우수한 상기 단일 치환 변이체를 포함하는 모든 가능한 이중 치환 변이체를 합성하고 분석한다. 다른 방법을 이용할 수 있고, 이 방법들을 반복 적용하여 개선된 추가 변이체를 계속 확인하면서 치환체의 수를 점차 증가시킨다.
앱타머 의학적 화학기법은 특히 치환체의 전반적 도입보다는 오히려 치환체의 국소 도입을 탐구하는 데 이용할 수 있다. 앱타머는 전사에 의해 생성되는 라이브러리 내에서 발견되기 때문에, SELEXTM 공정 중에 도입되는 임의의 치환체를 전반적으로 도입해야 한다. 예를 들면, 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 도입하는 것이 바람직한 경우, 이들을 모든 A(또는 모든 G, C, T, U 등)에만 도입될 수 있다(전반적 치환). 일부 A(또는 일부 G, C, T, U 등)에서는 포스포로티오에이트를 요구하지만(국소적 치환) 다른 A에서는 포스포로티오에이트를 허용할 수 없는 앱타머는 이 공정에서 쉽게 발견될 수 없다.
앱타머 의학적 화학기법 공정에 의해 이용될 수 있는 치환체의 종류는 이들을 고체-상 합성 시약으로 생성시켜 올리고머 합성 반응 내로 도입할 수 있는 능력에 의해서만 제한된다. 상기 공정은 뉴클레오티드에만 한정되는 것은 아니다. 앱타머 의학적 화학기법 공정은 입체적 용적, 소수성, 친수성, 친유성, 소유성, 양 전하, 음 전하, 중성 전하, 쯔비터이온, 분극가능성, 뉴클레아제-내성, 구조적 강성, 구조적 가요성, 단백질-결합 특성, 질량 등을 도입하는 치환체를 포함할 수 있다. 앱타머 의학적 화학기법 공정은 염기-변형, 당-변형 또는 포스포디에스테르 결합- 변형을 포함할 수 있다.
치료적 앱타머의 관점에서 유익할 수 있는 치환체의 종류를 고려할 때, 하기 카테고리 중 1 상의 카테고리에 속하는 치환을 도입시키는 것이 바람직할 수 있다:
체내에 이미 존재하는 치환체, 예를 들면, 2'-데옥시, 2'-리보, 2'-O-메틸 퓨린 또는 피리미딘 또는 5-메틸 시토신.
이미 승인된 치료제의 일부인 치환체, 예를 들면, 포스포로티오에이트-결합 올리고뉴클레오티드.
상기 2개의 카테고리 중 하나로 가수분해되거나 분해되는 치환체, 예를 들면, 메틸포스포네이트-결합 올리고뉴클레오티드.
본 발명의 항-IgE 앱타머에는 상기 앱타머 의학적 화학기법을 통해 개발된 앱타머가 포함된다.
IgE 특이적 결합 앱타머
본 발명의 물질에는 IgE에 특이적으로 결합하며 일부 실시양태에서는 생체내 및/또는 기능 분석 예컨대, 세포 기재 분석에서 IgE의 활성을 기능적으로 조절하는, 예를 들면, 차단하는, 20-50 뉴클레오티드 길이의 일련의 핵산 앱타머가 포함된다.
IgE에 특이적으로 결합하여 이를 조절할 수 있는 앱타머는 본 명세서에 기재되어 있다. 이들 앱타머는 IgE에 의해 야기되거나 아니면 IgE와 관련되어 있는 것으로 공지되어 있는 아토피성 질환 또는 질병 예컨대, 알레르기성 비염(고초열), 아토피성 피부염, 천식, 급성 두드러기(팽진-및-발적), 식품 알레르기 및 전신성 아나필락시스를 치료하고/하거나 예방하는, 안전하고 효과적인 저 독성의 방법을 제공한다.
치료제 및/또는 진단제로서 사용하기 위한 IgE 특이적 결합 앱타머의 예에는 서열 번호 11 내지 15, 18 내지 19, 21, 29, 33, 41 내지 44, 46, 50, 56 내지 96, 98 내지 102, 119 내지 124, 126 내지 136, 139 내지 176, 178 내지 190, 194 내지 201, 206 내지 243, 247, 249 내지 259, 261 내지 267, 269 내지 290, 292 내지 295 및 296이 포함되고; 특히 서열 번호 29, 33, 41 내지 44, 46, 50, 98 내지 102, 157 내지 176, 178 내지 190, 194 내지 201, 206 내지 219, 293 내지 295 및 296으로 구성된 군으로부터 선택된 서열; 보다 구체적으로는 서열 번호 101, 157, 181, 216, 293 내지 295 및 296으로 구성된 군으로부터 선택된 서열이 제공된다.
IgE에 결합하는 다른 앱타머는 아래 실시예 1 내지 4에 기재되어 있다.
이러한 앱타머는 예를 들어, 친유성 또는 고분자량의 화합물 예를 들어, PEG에의 콘쥬게이션, CpG 모티프의 도입, 캡핑 부분의 도입, 변형 뉴클레오티드의 도입, 및 포스페이트 골격에서의 치환을 포함하여 본원에 기술되어 있는 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 있어서, IgE에 결합하는 단리된 비-천연 발생 앱타머가 제공된다. 몇몇 실시양태에 있어서, 분리된 비-천연 발생 앱타머는 IgE에 대한 해리 상수("KD")가 100 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 100 pM 미만, 50 pM 또는 1 pM미만이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에 있어서, 이 해리 상수는 하기 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같은 조건 하에서의 인간 IgE의 적정을 이용하는 도트 블롯 분석으로 측정한다. 구체적인 실시양태에서, 해리 상수는 실온에서 0.1 ㎎/㎖의 BSA가 함유된 둘베코스 PBS(Mg++ 및 Ca++를 포함함) 중의 IgE의 적정을 이용하는 표준 도트 블롯 분석으로 30분 동안 측정한다.
다른 실시양태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 IgE의 기능을 조절한다. 다른 실시양태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 IgE의 기능을 억제한다. 본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 본 앱타머는 IgE 변이체에 결합하고/하거나 IgE의 기능을 조절한다. 본원에 사용되는 바와 같이 IgE 변이체에는 IgE의 기능과 본질적으로 동일한 기능을 수행하며, 바람직하게는 실질적으로 동일한 구조를 포함하고 몇몇 실시양태에 있어서는 IgE의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 보유하는 변이체가 포함된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에 있어서, 표적 변이체의 서열 동일성은 이하에 기술되어 있는 바와 같이 BLAST를 이용하여 측정한다.
2개 이상의 핵산 또는 단백질 서열이 있는 문맥에서 "서열 동일성"이라는 용어는 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나의 알고리즘 또는 시각적 점검에 의해 측정되는 바와 같이, 동일하거나 명시된 백분율의, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 말한다. 서열 비교에 있어서, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로 작용하며, 시험 서열은 이것과 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터 내로 입력하고, 필요할 경우 서브서열 코오디네이트(coordinate)를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 시험 서열(들)에 있어서의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다. 비교에 있어서의 최적의 서열 정렬은 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482(1981)]의 국소적 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, J Mol. Biol.48 : 443(1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 85: 2444(1988)]의 유사성 검색 방법, 상기 알고리즘의 이행의 컴퓨터화(미국 위스콘신주 매드슨 사이언스 Dr. 575 소재의 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 시각적 점검(일반적으로, 하기의 문헌[Ausubel et al.] 참조)에 의해 행해질 수 있다.
서열 동일성 퍼센트를 측정하는 데에 적합한 알고리즘의 일례로는 BLAST(basic local alignment search tool, 이하, "BLAST")에서 사용되는 알고리즘이 있으며, 예를 들어 문헌[Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403-410(1990)] 및 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402(1997)]을 참조한다. BLSAT 분석 수행용 소프트웨어는 NCBI(National Center for Biotechnology Information, 이하, "NCBI")를 통하여 공식적으로 입수가능하다. NCBI로부터 입수가능한 소프트웨어, 예를 들어 BLASTN(뉴클레오티드 서열의 경우) 및 BLASTP(아미노산 서열의 경우)를 사용하여 서열 동일성을 결정하는 데에 사용되는 초기 설정 파라미터가 문헌[McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 32: W20-W25(2004)]에 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 앱타머는 서열 번호 11 내지 15, 18 내지 19, 21, 29, 33, 41 내지 44, 46, 50, 56 내지 96, 98 내지 102, 119 내지 124, 126 내지 136, 139 내지 176, 178 내지 190, 194 내지 201, 206 내지 243, 247, 249 내지 259, 261 내지 267, 269 내지 290, 292-295 alc 296 중 어느 하나에 따른 앱타머와 실질적으로 동일한 능력으로 IgE에 결합한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 앱타머는 서열 번호 11 내지 15, 18 내지 19, 21, 29, 33, 41 내지 44, 46, 50, 56 내지 96, 98 내지 102, 119 내지 124, 126 내지 136, 139 내지 176, 178 내지 190, 194 내지 201, 206 내지 243, 247, 249 내지 259, 261 내지 267, 269 내지 290, 292 내지 295 및 296 중 어느 하나를 포함하는 앱타머와 실질적으로 동일한 구조를 가지고/가지거나 실질적으로 동일한 능력으로 IgE와 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 번호 11 내지 15, 18 내지 19, 21, 29, 33, 41 내지 44, 46, 50, 56 내지 96, 98 내지 102, 119 내지 124, 126 내지 136, 139 내지 176, 178 내지 190, 194 내지 201, 206 내지 243, 247, 249 내지 259, 261 내지 267, 269 내지 290, 292 내지 295 및 296 중 어느 하나에 따른 앱타머가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 101, 157, 181, 216, 293 내지 295 및 296 중 어느 하나에 따른 앱타머가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 앱타머는 약학 조성물에서 활성 성분으로서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 앱타머 및 본 발명의 앱타머를 포함하는 조성물은 아토피성 질환 또는 질병 예컨대, 알레르기성 비염(고초열), 아토피성 피부염, 천식, 급성 두드러기(팽진-및-발적), 식품 알레르기, 땅콩 알레르기, 전신성 아나필락시스, 알레르기성 결막염, 봄철 각막결막염, 아토피성 각막결막염, 거대 유도 결막염 및 호산성 위장염을 치료하는 데 사용된다.
몇몇 실시양태에 있어서, 본 발명의 앱타머 치료제는 앱타머 치료제가 환자 또는 대상체의 신체에서 분해될 경우 비-천연 발생 뉴클레오티드 치환으로부터 생기는 유해한 부작용을 감소시키면서 그의 표적에 대하여 높은 친화성 및 특이성을 가진다. 몇몇 실시양태에 있어서, 본 발명의 앱타머 치료제를 함유하는 치료 조성물은 플루오르화 뉴클레오티드를 가지지 않거나 감소된 양의 플루오르화 뉴클레오티드를 가진다.
본 발명의 앱타머는 당 분야에 잘 알려져 있는 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성 기법(예를 들어, 문헌[Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14: 5399-5467(1986)] 및 문헌[Froehler et al., Tet. Lett., 27: 5575-5578(1986)] 참조) 및 용액 상 방법 예컨대, 트리에스테르 합성 방법(예를 들어, 문헌[Sood et al., Nucl. Acid Res. 4: 2557(1977)] 및 문헌[Hirose et al., Tet. Lett., 28: 2449(1978)] 참조)을 비롯하여 당 분야에 공지되어 있는 임의의 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 이용하여 합성할 수 있다.
면역자극성 모티프를 가진 앱타머
본 발명은 IgE에 결합하여 이의 생물학적 기능을 조절하는 앱타머를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 IgE와 IgE 수용체 FcεRI의 결합을 방해하여 IgE 매개 알레르기성 반응을 방지하는 앱타머를 제공한다. 이러한 앱타머의 치료적 잠재력은 IgE에 결합하고 면역자극성 또는 면역조절성 모티프를 보유하는 앱타머를 선별함으로써, 또는 면역자극성 및/또는 면역조절성 서열에 결합하는 것으로 공지되어 있는 표적에 대한 앱타머와 함께 IgE에 결합하는 앱타머로 처리함으로써 더욱 증강시킬 수 있다.
척추 동물 면역계에 의한 박테리아 DNA의 인식은 특정 서열 내용에서의 비메틸화 CG 디뉴클레오티드("CpG 모티프")의 인식에 기초한다. 이러한 모티프를 인식하는 하나의 수용체는 구별되는 미생물 구성 성분을 인식함으로써 선천적 면역 반응에 참여하는 Toll-유사 수용체 족(~10종의 구성원)의 구성원인 Toll-유사 수용체 9("TLR 9")이다. TLR 9는 비메틸화 올리고데옥시뉴클레오티드("ODN") CpG 서열에 서열 특이적 방식으로 결합한다. CpG 모티프의 인식은 방어 메카니즘을 유발하여 선천적 면역 반응 및 궁극적으로는 후천적 면역 반응을 이끌어 낸다. 예를 들어, 마우스에서 TLR 9의 활성화는 항원 제시 세포의 활성화, MHC 클래스 I 및 II 분자의 상향 조절, 및 중요한 보조-자극 분자 및 IL-12와 IL-23을 포함하는 사이토카인의 발현을 유도한다. 이러한 활성화는 TH1 사이토카인 IFN-감마의 강력한 상향 조절을 포함하여, B 및 T 세포 반응을 직접적으로, 그리고 간접적으로 증강시킨다. 총체적으로, CpG 서열에 대한 반응은 감염성 질환에 대한 방어, 백신에 대한 개선된 면역 반응, 천식에 대한 효과적인 반응, 및 개선된 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 이끌어 낸다. 따라서, CpG ODN은 감염성 질환에 대한 방어를 제공하며 면역-면역보강제(adjuvant) 또는 암 치료제(단일요법 또는 mAb 또는 기타 치료법과의 병용요법)로서 기능할 수 있으며, 천식 또는 알레르기 반응을 감소시킬 수 있다.
하나 이상의 CpG 또는 기타 면역자극성 서열을 포함하는 본 발명의 앱타머는 다양한 방법 예를 들어, 본원에 기술되어 있는 SELEXTM 공정으로 확인하고 생성할 수 있다. 일반적으로, 이 방법은 두 군으로 나눌 수 있다. 1 군에서, 이 방법은 CpG 모티프 또는 기타 면역자극성 서열뿐만 아니라 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 앱타머를 확인하거나 생성하는 것에 관한 것이며, 여기서, 표적(이하, "비-CpG 표적")은 CpG 모티프 또는 기타 면역자극성 서열을 인식하면서 CpG 모티프와의 결합 시 면역 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있는 것 이외의 표적이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에 있어서, 비-CpG 표적은 IgE이다. 이 군의 제1 방법은 올리고뉴클레오티드 풀(여기서, CpG 모티프는 고정된 영역으로서 또는 고정된 영역의 일부로서 올리고뉴클레오티드 풀의 각 구성원 내에 포함되어 있고, 예를 들면, 몇몇 실시양태에서는 상기 풀 구성원의 랜덤화 영역은 CpG 모티프가 포함되어 있는 고정된 영역을 포함함)을 이용하여 SELEXTM을 수행하여 특정한 비-CpG 표적, 바람직하게는 예컨대 표적 IgE에 대한 앱타머를 얻는 단계 및 CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함하며, 이때 면역 반응은 질환 발달과 관련되어 있다. 이 군의 제2 방법은 SELEXTM을 수행하여 특정한 비-CpG 표적, 바람직하게는 예컨대 표적 IgE에 대한 앱타머를 얻는 단계, 및 선별 후 CpG 모티프를 5' 및/또는 3' 말단에 첨부하거나 CpG 모티프를 앱타머의 소정의 영역, 바람직하게는 비-필수 영역 내로 도입시키는 단계를 포함하며, 여기서 면역 반응은 질환 발달과 관련되어 있다. 이 군의 제3 방법은 SELEXTM을 수행하여 특정한 비-CpG 표적, 바람직하게는 예컨대 표적 IgE에 대한 앱타머를 얻는 단계 및 CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함하며, 이때 면역 반응은 질환 발달과 관련되어 있고 상기 풀의 합성 동안 다양한 뉴클레오티드의 몰 비는 1 이상의 뉴클레오티드 첨가 단계에서 편향되게 하여 풀의 각 구성원의 랜덤화 영역이 CpG 모티프에 풍부하게 한다. 이 군의 제4 방법은 SELEXTM을 수행하여 특정한 비-CpG 표적, 바람직하게는 예컨대 표적 IgE에 대한 앱타머를 얻는 단계 및 CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함하고, 이때 면역 반응은 질환 발달과 관련되어 있다. 이 군의 제5 방법은 SELEXTM을 수행하여 특정한 비-CpG 표적, 바람직하게는 예컨대 표적 IgE에 대한 앱타머를 얻는 단계, 및 결합 시 면역 반응을 자극하지만 CpG 모티프를 포함하지 않는 앱타머를 확인하는 단계를 포함하고, 이때 억제된 면역 반응은 질환 발달과 관련되어 있다.
군 2에서, 방법은 CpG 모티프, 및/또는 CpG 모티프에 대한 수용체(예컨대, TLR9 또는 다른 toll-유사 수용체)가 결합하는 다른 서열을 포함하며 결합 시 면역 반응을 자극하는 앱타머를 확인하거나 생성시키는 것에 관한 것이다. 이 군의 제1 방법은 올리고뉴클레오티드 풀(여기서, CpG 모티프는 고정된 영역으로서 또는 고정된 영역의 일부로서 올리고뉴클레오티드 풀의 각 구성원 내에 포함되어 있고 예를 들면, 몇몇 실시양태에서는 상기 풀 구성원의 랜덤화 영역은 CpG 모티프가 포함되어 있는 고정된 영역을 포함함)을 이용하여 SELEXTM을 수행함으로써 CpG 모티프 또는 다른 면역자극성 서열에 결합하며 결합 시 면역 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있는 표적에 대한 앱타머를 얻는 단계, 및 CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다. 이 군의 제2 방법은 SELEXTM을 수행하여 CpG 모티프 또는 다른 면역자극성 서열에 결합하며 결합 시 면역 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있는 표적에 대한 앱타머를 얻는 단계, 그 후 CpG 모티프를 5' 및/또는 3' 말단에 첨부하거나 CpG 모티프를 앱타머의 소정의 영역 바람직하게는 비-필수 영역 내로 도입시키는 단계를 포함한다. 이 군의 제3 방법은 SELEXTM을 수행하여 CpG 모티프 또는 다른 면역자극성 서열에 결합하며 결합 시 면역 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있는 표적에 대한 앱타머를 얻는 단계 및 CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함하고, 이때 풀의 합성 동안 다양한 뉴클레오티드의 몰 비는 1 이상의 뉴클레오티드 첨가 단계에서 편향되게 하여 풀의 각 구성원의 랜덤화 영역에 CpG 모티프가 풍부하게 한다. 이 군의 제4 방법은 SELEXTM을 수행하여 CpG 모티프 또는 다른 면역자극성 서열에 결합하며 결합 시 면역 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있는 표적에 대한 앱타머를 얻는 단계 및 CpG 모티프를 포함하는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다. 이 군의 제5 방법은 SELEXTM을 수행하여 CpG 모티프 또는 다른 면역자극성 서열에 결합하는 것으로 공지되어 있는 표적에 대한 앱타머를 얻는 단계, 및 결합 시 면역 반응을 자극하지만 CpG 모티프를 포함하지 않는 앱타머를 확인하는 단계를 포함한다.
다양한 CpG 모티프 부류가 확인되어 있고, 각각은 상이한 반응 캐스케이드에서 인식 시 사이토카인 및 다른 분자를 방출시키고 특정 유형의 세포를 활성화시킨다. 예컨대, 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌(CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, Annu. Rev. Immunol. 2002, 20: 709-760)을 참조한다. 다른 면역자극성 모티프는 미국 특허 제6,207,646호; 제6,239,116호; 제6,429,199호; 제6,214,806호; 제6,653,292호; 제6,426,434; 제6,514,948호; 및 6,498,148호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 도입된다. 이들 CpG 또는 다른 면역자극성 모티프 중 임의의 것이 앱타머 내로 도입될 수 있다. 앱타머의 선택은 치료될 질환 또는 질병에 달려 있다. 바람직한 면역자극성 모티프는 하기와 같고(좌측에서 우측으로 5' 내지 3'), 여기서 "r"은 퓨린을 나타내고, "y"는 피리미딘을 나타내며, "X"는 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다: AACGTTCGAG(서열 번호 4); AACGTT; ACGT, rCGy; rrCGyy, XCGX, XXCGXX, 및 X1X2CGY1Y2(여기서, X1은 G 또는 A이고, X2는 C가 아니고, Y1은 G가 아니며, Y2는 바람직하게는 T임).
CpG 모티프에 결합하는 것으로 알려져 있는 표적 외의 특정한 표적("비-CpG 표적")에 결합하고 결합 시 면역 반응을 자극하는 앱타머 내로 CpG 모티프가 삽입되어 있는 경우, CpG는 바람직하게는 앱타머의 비-필수 영역 내에 위치한다. 앱타머의 비-필수 영역은 부위-지시적 돌연변이유발, 결실 분석 및/또는 치환 분석으로 확인할 수 있다. 그러나, 비-CpG 표적에 결합하는 앱타머의 능력을 유의하게 방해하지 않는 임의의 위치가 이용될 수 있다. CpG 모티프는 앱타머 서열 내에 포함되는 것 외에, 5' 또는 3' 말단 또는 이들 둘 다에 첨부될 수 있거나 앱타머에 부착될 수 있다. 비-CpG 표적에 결합하는 앱타머의 능력이 유의하게 방해받지 않는 한 임의의 부착 위치 또는 부착 수단이 이용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "면역 반응의 자극"은 (1) 특정 반응의 유도(예컨대, Th1 반응의 유도) 또는 특정 분자의 생성, 또는 (2) 특정 반응의 저해 또는 억제(예컨대, Th2 반응의 저해 또는 억제) 또는 특정 분자의 저해 또는 억제를 의미할 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 IgE에 결합하는 앱타머 분자를 함유하는 약학 조성물도 포함한다. 몇몇 실시양태에 있어서, 본 조성물은 내복용에 적합하며 유효량의 본 발명의 약리학적 활성 화합물을 단독으로, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함한다. 본 화합물은, 만일 있다 해도, 매우 낮은 독성을 갖는다는 점에서 특히 유용하다.
본 발명의 조성물은 병상, 예를 들어 질환 또는 질병의 치료 또는 예방, 또는 환자에 있어서 그러한 질환 또는 질병의 증상의 완화를 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 아토피성 질환 또는 질병 예컨대, IgE에 의해 초래되거나 IgE와 관련되어 있는 것으로 공지되어 있는 알레르기성 비염(고초열), 아토피성 피부염, 천식, 급성 두드러기(팽진-및-발적), 식품 알레르기 및 전신성 아나필락시스와 관련되어 있는 병상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 앱타머가 특이적으로 결합하는 표적과 관련되거나 그로부터 유래되는 질환 또는 질병를 앓고 있거나 상기 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여하기에 유용하다. 본 발명의 조성물은 병상을 갖는 환자 또는 대상체의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 방법은 환자 또는 대상체에게 병상과 관계되는 IgE에 결합하는 앱타머 또는 이 앱타머를 함유하는 조성물을 투여하여, IgE와의 앱타머의 결합에 의해 표적의 생물학적 기능을 변경시키고, 그럼으로써 병상을 치료하는 단계를 포함한다.
병상을 갖는 환자 또는 대상체, 즉, 본 발명의 방법으로 치료되는 환자 또는 대상체는 척추 동물, 더욱 특히는 포유류, 또는 더욱 특히는 인간일 수 있다.
실제로, 본 앱타머 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 그의 원하는 생물학적 활성을 발휘하기에, 예를 들어, IgE 앱타머와 FcεRI의 결합을 저해하기에 충분한 양으로 투여된다.
본 발명의 한 측면은 IgE 매개 질환의 다른 치료법과 조합된 본 발명의 앱타머 조성물을 포함한다. 본 발명의 앱타머 조성물은 예를 들어 하나보다 많은 앱타머를 함유할 수도 있다. 몇몇 예에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유하는 본 발명의 앱타머 조성물은 다른 유용한 조성물, 예를 들어, 소염제, 면역 억제제, 항바이러스제 등과 함께 투여된다. 일반적으로, 이러한 병용에 사용하기 위해서는 공지된 치료제의 현재 이용가능한 투약 제형이 적합할 것이다.
"병용 요법"(또는 "공동-요법(co-therapy)")은 본 발명의 앱타머 조성물과, 적어도 제2 약제를 상기 치료제들의 공동 작용으로부터 유익한 효과를 제공하려는 특정 치료 섭생법의 일부로서 투여하는 것을 포함한다. 병용법의 유익한 효과는 치료제의 조합으로부터 생기는 약동학적 또는 약효학적 공동 작용을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기 치료제들을 조합하여 투여하는 것은 전형적으로 규정된 기간에 걸쳐(일반적으로, 선별되는 조합에 따라 수분, 수시간, 수일 또는 수주) 실시된다.
"병용 요법"은 우연히 그리고 임의로 본 발명의 조합으로 이어지는 개별적인 단일 요법 섭생법의 일부로서 2가지 이상의 상기 치료제들의 투여를 포함할 수 있지만, 일반적으로는 이를 포함하려는 것은 아니다. "병용 요법"은 상기 치료제들의 투여를 순차적인 방식으로 투여하는 것을 포함하려는 것인데, 즉, 각각의 치료제는 상이한 시점에서 투여되며, 이 외에도, 상기 치료제, 또는 치료제 중 적어도 2가지를 실질적으로 동시에 투여하는 방식으로 투여하는 것을 포함하려는 것이다. 실질적 동시 투여는 예를 들어 대상체에게 고정된 비의 각각의 치료제를 갖는 단일 캡슐, 또는 치료제 각각을 위한 다수의 단일 캡슐을 투여함으로써 달성될 수 있다.
각각의 치료제의 순차적 투여 또는 실질적 동시 투여는 국소 경로, 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접적 흡수를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 임의의 적절한 경로로 행해질 수 있다. 치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 선별된 조합의 제1 치료제는 주사로 투여될 수 있는 반면, 조합의 다른 치료제는 국소적으로 투여될 수 있다.
별법으로는, 예를 들어 모든 치료제가 국소적으로 투여될 수 있거나 모든 치료제가 주사로 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 순서는 달리 나타내지 않는 한 편협하게 결정적이지는 않다. "병용 요법"은 상기의 치료제를 다른 생물학적 활성 성분과 추가로 조합하여 투여하는 것도 포함할 수 있다. 병용 요법이 약물외 치료를 추가로 포함하는 경우, 약물외 치료는 치료제와 약물외 치료의 조합의 공동 작용으로부터의 유익한 효과가 성취되기만 한다면 임의의 적합한 시점에서 행해질 수 있다. 예를 들어, 적절한 경우에, 유익한 효과는 약물외 치료가 아마도 수일 또는 심지어 수주간 치료제의 투여로부터 일시적으로 제거될 때에 여전히 성취된다.
본 발명의 치료용 또는 약리학적 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용가능한 매질 중에 용해되거나 분산된 유효량의 치료 활성 성분(들)을 함유한다. 약학적으로 허용가능한 매질 또는 담체는 임의의, 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 약제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 있어서의 그러한 매질 및 약제의 용도는 당 분야에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분도 본 발명의 치료 조성물 내로 혼입될 수 있다.
약학 또는 약리학적 조성물의 제조는 본 발명의 개시 내용에 비추어 보면 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 그러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액; 주사 전에 액체 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서 주사가능한 약으로서; 정제 또는 경구 투여용의 기타 고체로서; 정시 방출형(time release) 캡슐로서; 또는 점안액, 크림, 로션, 고약(salve), 흡입제 등을 포함하여 현재 사용되는 임의의 기타 형태로 제조될 수 있다. 외과 의사, 내과 의사 또는 건강 관리 종사자가 살균 제형, 예를 들어, 염수 기재의 세척액을 사용하여 수술 현장에서 특정 영역을 처리하는 것도 특히 유용할 수 있다. 조성물은 마이크로장치, 미세 입자 또는 스폰지를 통하여 또한 전달될 수 있다.
제형화시, 치료제는 투여 제형과 상용성인 방식으로, 그리고 약리학적으로 유효한 양으로 투여된다. 제형은 다양한 투여 형태, 예를 들어, 상기의 주사가능한 용액형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출형 캡슐 등도 이용될 수 있다.
이와 관련하여, 투여될 조성물의 부피 및 활성 성분의 양은 치료할 숙주 동물에 따라 달라진다. 투여에 필요한 활성 화합물의 정확한 양은 개업의의 판단에 따라 달라지며 각각의 개체에 독특하다.
활성 화합물의 분산에 필요한 조성물의 최소 부피가 전형적으로 이용된다. 또한 투여에 적합한 섭생법은 가변적이지만, 처음에 화합물을 투여하고 결과를 모니터링하고 이어서 추가의 제어된 용량을 추가의 간격으로 줌에 의해 전형화된다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐(예를 들어, 젤라틴 캡슐)의 형태로 경구 투여하는 것에 있어서, 활성 약물 성분은 경구용의 비독성의 약학적으로 허용가능한 불활성 담체, 예를 들어 에탄올, 글리세롤, 물 등과 조합될 수 있다. 또한, 요망되거나 필요할 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제도 혼합물 내로 혼입될 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 천연 당, 예를 들어 글루코스 또는 β-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 고무, 예를 들어, 아라비아 고무, 트래거캔쓰 또는 소듐 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 상기 투여 형태에서 사용되는 윤활제는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탤컴, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함한다. 붕해제는, 한정됨이 없이, 전분, 메틸 셀룰로오스, 한천, 벤토나이트, 잔탄 고무 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물 등을 포함한다. 희석제는, 예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신을 포함한다.
본 발명의 화합물은 정시 방출형 및 서방형 정제 또는 캡슐, 알약, 분말, 과립, 엘릭시르제, 팅크제, 현탁액, 시럽 및 에멀젼과 같은 경구 투여 형태로도 투여될 수 있다. 좌약은 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 제조되는 것이 유리하다.
본 약학 조성물은 살균되고/되거나 면역보강제, 예를 들어, 방부제, 안정제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 또한, 본 조성물은 치료용으로 가치 있는 다른 물질을 또한 함유할 수 있다. 본 조성물은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조되며, 전형적으로는 약 0.1% 내지 75%, 바람직하게는 약 1% 내지 50%의 활성 성분을 함유한다.
액체, 특히 주사가능한 조성물은 예를 들어 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매, 예를 들어 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해되거나 그들과 혼합됨으로써 주사가능한 용액 또는 현탁액을 형성한다. 추가로, 주사 전에 액체 중에 용해되기에 적합한 고체 형태가 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 정맥내(볼루스(bollus) 및 주입 둘 모두), 복강내, 피하 또는 근육내 형태로 투여될 수 있는데, 이 모든 것에서 약학 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 형태가 사용된다. 주사가능한 물질은 통항적인 형태로, 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다.
주사가능한 비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 및 주입에 사용된다. 추가로, 비경구 투여에 있어서의 한 가지 접근법에서는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제3,710,795호에 따른, 일정한 수준의 투여량의 유지를 보증하는 느린 방출형 또는 서방형 시스템의 이식이 이용된다.
또한, 본 발명에 바람직한 화합물은 피부 경피 패치 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 피부 경피 패치의 형태를 사용하여 경피 경로를 통하여, 또는 적합한 비강내 비히클, 흡입기의 국소적 사용을 통하여 비강내 형태로 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여하기 위하여, 투여량은 물론 투여 섭생법 전반에 걸쳐 간헐적이기보다는 연속적일 것이다. 다른 바람직한 국소용 제제는 크림, 연고, 로션, 에어로졸 스프레이 및 겔을 포함하며, 여기서, 활성 성분의 농도는 전형적으로 0.01% 내지 15%(w/w 또는 w/v)의 범위이다.
고체 조성물에 있어서, 부형제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 탤컴, 셀룰로오스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 상기에 정의된 활성 화합물은, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜을 담체로 하여 좌약으로도 제형화될 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 좌약은 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 제조되는 것이 유리하다.
본 발명의 화합물은 리포좀 전달 시스템, 예를 들어, 작은 단일층 소포체(unilamellar vesicle), 큰 단일층 소포체 및 다중층 소포체의 형태로도 투여될 수 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 포함하는 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 미국 특허 제5,262,564호에 개시되어 있는 바와 같이, 지질 성분의 필름은 약물 수용액으로 수화되어 지질층 캡슐화 약물을 형성한다. 예를 들어, 본원에 기술되어 있는 앱타머 분자는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 제작되는 친유성 화합물 또는 비-면역원성의 고분자량 화합물과의 결합체로서 제공될 수 있다. 핵산 결부 결합체의 예가 미국 특허 제6,011,020호에 제공되어 있다.
본 발명의 화합물은 표적성(targetable) 약물 담체로서 용해성 중합체와 또한 커플링될 수 있다. 그러한 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스파나미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 방출 제어형의 약물의 성취에 유용한 생분해성 중합체류, 예를 들어, 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 가교 결합 또는 친양쪽성 히드로겔 블록 공중합체에 커플링될 수 있다.
원하는 경우, 투여될 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 및 기타 물질, 예를 들어 아세트산나트륨 및 트리에탄올아민 올레에이트를 또한 함유할 수 있다.
앱타머가 이용되는 투여 섭생법은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료할 병의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능과; 이용되는 특정 앱타머 또는 그의 염을 포함하는 다양한 요인에 따라 선별된다. 숙련된 의사 또는 수의사라면 병의 진행을 예방, 저지 또는 정지시키는 데 필요한 약물의 유효량을 손쉽게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 경구 투여량은, 표시된 효과에 사용될 경우, 경구 투여로 약 0.05 내지 7500 ㎎/일 사이의 범위이다. 본 조성물은 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 및 1000.0 ㎎의 활성 성분을 함유하는 스코어드 정제(scored tablet)의 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 주입 투여량, 비강내 투여량 및 경피 투여량은 0.05 내지 7500 ㎎/일 사이의 범위이다. 피하, 정맥내 및 복강내 투여량은 0.05 내지 3800 ㎎/일 사이의 범위이다.
본 발명의 화합물의 유효한 혈장 중 수준은 0.002 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖ 범위이다.
본 발명의 화합물은 단일한 일일 용량으로 투여될 수 있거나, 전체 일일 투여량을 일일 2회, 3회 또는 4회의 분할된 투여량으로 투여될 수 있다.
앱타머 치료제의 약동학적 특성 및 생체 분포의 조절
앱타머를 포함하는 모든 올리고뉴클레오티드 기재의 치료제의 약동학적 특성은 원하는 약학적 용도에 매치되도록 맞추어지는 것이 중요하다. 세포외 표적에 대하여 유도되는 앱타머는 세포내 전달과 결부된 어려움(안티센스 및 RNAi-기재의 치료제의 경우에서와 같음) 때문에 고통을 받지는 않지만, 그러한 앱타머는 여전히 표적 기관 및 조직에 분포될 수 있어야 하며, 원하는 투여 섭생법과 일치되게 소정 기간 동안 체내에 남아 있어야 한다(비변형).
따라서, 본 발명은 앱타머 조성물의 약동학적 특성과, 특히, 앱타머의 약동학적 특성을 조절하는 능력에 영향을 주는 물질 및 방법을 제공한다. 앱타머의 약동학적 특성의 조율성(tunability)(즉, 조절하는 능력)은 변형 부분(예를 들어, PEG 중합체)을 앱타머에 콘쥬게이션시키고/시키거나 변형 뉴클레오티드(예를 들어, 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸)를 삽입시켜 핵산의 화학 조성을 변경시키는 것을 통하여 성취된다. 앱타머의 약동학적 특성의 조절 능력은 기존의 치료 용도의 개선, 또는 대안적으로는 새로운 치료 용도의 개발에 사용된다. 예를 들어, 몇몇 치료 용도에 있어서, 예를 들어, 항-신생물 또는 급성 케어 세팅(care setting) - 여기서, 신속한 약물의 제거 또는 중지(turn-off)가 원하는 수도 있음 - 에서, 순환에서 앱타머의 체류 시간을 감소시키는 것이 바람직하다. 대안적으로는, 다른 치료 용도, 예를 들어, 치료제의 전신 순환이 원하는 유지 요법에서, 순환에서 앱타머의 체류 시간을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 앱타머의 약동학적 특성의 조율성을 이용하여 대상체에서 앱타머 치료제의 생체 분포를 변형시킨다. 예를 들어, 몇몇 치료 용도에서, 특정 유형의 조직 또는 특정 기관(또는 기관 세트)를 표적화하려는 노력으로 앱타머 치료제의 생체 분포를 변경시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 용도에 있어서, 앱타머 치료제는 특정 조직 또는 기관(들)에서 우선적으로 축적된다. 다른 치료 용도에 있어서, 주어진 질환, 세포 상해 또는 기타 비정상적 병상과 결부된 증상 또는 세포 마커를 표시하는 조직을 표적화하여, 앱타머 치료제가 영향을 받은 조직에서 우선적으로 축적되게 하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 2004년 3월 5일자로 출원되고 발명의 명칭이 "앱타머 치료제의 약동학적 특성 및 생체 분석의 제어된 조절"인 공계류 중인 미국 가출원 제60/550790호와, 2005년 3월 7일자로 출원되고 발명의 명칭이 또한 "앱타머 치료제의 약동학적 특성 및 생체 분포의 제어된 조절"인 미국 비-가출원 제10/___,___호에 개시되어 있는 바와 같이, 앱타머 치료제의 PEG화(예를 들어, 20 kDa의 PEG 중합체를 이용한 PEG화)를 사용하여 염증을 일으킨 조직을 표적화하여, PEG화 앱타머 치료제가 염증을 일으킨 조직에 우선적으로 축적되게 한다.
앱타머 치료제(예를 들어, 앱타머 콘쥬게이트 또는 변경된 화학적 특성을 갖는 앱타머, 예를 들어 변형 뉴클레오티드)의 약동학적 특성 및 생체 분포 프로필을 결정하기 위하여 다양한 파라미터를 모니터링한다. 그러한 파라미터는 예를 들어, 반감기(t1 /2), 혈장 제거율(C1), 분포 부피(Vss), 농도-시간 곡선 하의 면적(AUC), 최대 혈청 또는 혈장 관찰 농도(Cmax), 및앱타머 조성물의 평균 체류 시간(mean residence time, MRT)을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "AUC"라는 용어는 앱타머 투여 후 시간에 대한 앱타머 치료제의 혈장 중 농도의 도면 하의 면적을 말한다. AUC 값을 사용하여 주어진 앱타머 치료제의 생체이용률(즉, 앱타머 투여 후 순환에서 투여 앱타머 치료제의 백분율) 및/또는 총 제거율(C1)(즉, 앱타머 치료제가 순환으로부터 제거되는 속도)을 개산한다. 분포 부피는 앱타머 치료제의 혈장 중 농도를 체내에 존재하는 앱타머의 양에 관련시킨 것이다. Vss가 커질수록, 보다 많은 앱타머가 혈장 외부에서 발견된다(즉, 보다 삼출성임).
본 발명은 앱타머를 조절 부분, 예를 들어 소분자, 펩티드 또는 중합체 말단 기에 콘쥬게이션시킴으로써, 또는 변형 뉴클레오티드를 앱타머 내로 삽입시킴으로써 생체 내에서 안정화된 앱타머 조성물의 약동학적 특성 및 생체 분포를 제어된 방식으로 조절하는 물질 및 방법을 제공한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 변형 부분의 콘쥬게이션 및/또는 변경 뉴클레오티드(들)의 화학 조성은 앱타머의 순환에서의 체류 시간과 조직으로의 분포의 근본적인 측면을 변경시킨다.
뉴클레아제에 의한 제거 외에도, 올리고뉴클레오티드 치료제는 신장 여과를 통하여 제거되게 된다. 이와 같이, 정맥내로 투여되는 뉴클레아제 내성 올리고뉴클레오티드는, 여과가 차단될 수 있지 않는 한, <10분의 생체내 반감기를 나타낸다. 이는, 혈류로부터의 조직 내로의 신속한 분포를 용이하게 함으로써 또는 사구체에 있어서 효과적인 크기 컷-오프(cut-off)보다 큰 겉보기 분자량의 올리고뉴클레오티드를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 하기에 기술되어 있는 PEG 중합체에의 작은 치료제의 콘쥬게이션(PEG화)은 순환에서 앱타머의 체류 시간을 극적으로 연장시켜, 투여 빈도를 감소시키고 혈관 표적에 대한 유효성을 증강시킬 수 있다.
앱타머는 다양한 변형 부분, 예를 들어 고분자량의 중합체, 예를 들어 PEG; 펩티드, 예를 들어 Tat(HIV Tat 단백질의 13개의 아미노산의 단편(Vives, et al.,(1997), J. Biol.Chem. 272(25): 16010-7)), Ant(드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia) 호메오틱 단백질(homeotic protein)의 제3 나선으로부터 유래되는 16개의 아미노산 서열(Pietersz, et al.,(2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405) ) 및 Arg7(폴리아르기닌(Arg7)으로 구성되며 짧고 양으로 하전된 세포 침투 펩티드(Rothbard, et al.,(2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J et al.,(2002), J. Med. Chem. 45(17):3612-8)); 및 소분자, 예를 들어, 친유성 화합물, 예를 들어 콜레스테롤에 콘쥬게이션될 수 있다. 본원에 기술되어 있는 다양한 콘쥬게이트 중에서, 앱타머의 생체내 특성은 PEG 기와의 결합체 형성에 의해 가장 심원하게 변경된다. 예를 들어, 혼합된 2'F 및 2'-OMe 변형 앱타머 치료제와 20 kDa PEG 중합체와의 결합체 형성은 신장 여과를 방해하며 건강한 조직 및 염증을 일으킨 조직 둘 모두로의 앱타머의 분포를 촉진한다. 또한, 20 kDa PEG 중합체-앱타머 콘쥬게이트는 앱타머의 신장 여과의 방지에 있어서 거의 40 kDa PEG 중합체만큼 효과적인 것으로 입증된다. PEG화의 한 가지 영향은 앱타머 제거에 대한 것이지만, 20 kDa의 부분의 존재에 의해 주어지는 전신 노출 연장도 앱타머가 조직, 특히 고도로 관류된 기관 및 염증 부위로의 앱타머의 분포를 용이하게 한다. 앱타머-20 kDa PEG 중합체 콘쥬게이트는 염증 부위로의 앱타머의 분포를 지시하여, PEG화 앱타머가 염증을 일으킨 조직에 축적되게 한다. 몇몇 경우, 20 kDa PEG화 앱타머 콘규게이트는 세포, 예를 들어 신장 세포의 내부에 접근할 수 있다.
또한 변형 뉴클레오티드를 사용하여 앱타머의 혈장 제거를 조절할 수 있다. 예를 들어, 2'-F 및 2'-OMe 안정화 화학적 특성 둘 모두가 도입된 미콘쥬게이션화 앱타머 - 이는, 시험관내 및 생체내에서 높은 정도의 뉴클레아제 안정성을 나타내기 때문에 전형적인 현 세대의 앱타머임 - 는 비변형 앱타머와 비교할 때 혈장으로부터의 신속한 손실(즉, 신속한 혈장 제거) 및 조직, 특히 신장 내로의 신속한 분포를 나타낸다.
PEG 유도체화 핵산
상기에 기술한 바와 같이, 고분자량의 비면역원성 중합체를 이용한 핵산의 유도체화는 핵산의 약동학 및 약효학적 특성을 변경시켜 핵산이 보다 효과적인 치료제가 되게 하는 잠재력을 갖는다. 활성에서의 유리한 변화는 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성 증가, 신장을 통한 여과 감소, 면역계에의 노출 감소, 및 신체를 통한 치료제의 분포 변경을 포함할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 부분으로 유도체화할 수 있다. PAG-유도체화 핵산의 예가 2003년 11월 21일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/718,833호에서 발견되는데, 상기 특허 출원은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함되어 있다. 본 발명에서 사용되는 전형적인 중합체는 폴리에틸렌 옥시드("PEO")로도 공지된 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 및 폴리프로필렌 글리콜(폴리 이소프로필렌 글리콜을 포함함)을 포함한다. 추가로, 상이한 알킬렌 옥시드(예를 들어, 에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드)의 랜덤 또는 블록 공중합체가 다수의 용도로 사용될 수 있다. 가장 일반적인 형태에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 PEG는 각각의 말단이 히드록실 기로 종결된 선형 중합체: HO-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH이다. 이 중합체, 알파-, 오메가-디히드록시폴리에틸렌 글리콜은 HO-PEG-OH로도 나타내어질 수 있는데, 여기서, -PEG- 기호는 하기의 구조 단위: -CH2CH2O-(CH2CH20)n-CH2CH2- 를 나타내며, 여기서, n은 전형적으로 약 4 내지 약 10,000의 범위이다.
예시된 바와 같이, PEG 분자는 이작용성이며 때로 "PEG 디올"로 칭해진다. PEG 분자의 말단 부분은 상대적으로 비반응성인 히드록실 부분인 -OH 기이며, 상기 기는 화합물 상의 반응성 부위에서 PEG가 다른 화합물에 부착되기 위한 작용 부분으로 전환되거나 활성화될 수 있다. 그러한 활성화 PEG 디올은 본원에서 이-활성화 PEG로 칭해진다. 예를 들어, PEG 디올의 말단 부분은 상대적으로 비반응성인 히드록실 부분, -OH를 N-히드록시 숙신이미드 유래의 숙신이미딜 활성 에스테르 부분으로 치환함으로써 아미노 부분과의 선별적 반응을 위한 활성 카르보네이트로서 작용화하였다.
다수의 용도에 있어서, PEG 분자의 하나의 말단을 본질적으로 비반응성인 부분으로 캡핑하여 PEG 분자가 일-작용성(또는 일-활성화)이 되도록 하는 것이 바람직하다. 일반적으로 활성화 PEG에 대한 다수의 반응 부위를 나타내는 단백질 치료제의 경우, 이-작용성 활성화 PEG는 광범위한 가교 결합을 하여, 불충분한(poorly) 작용성의 응집체를 생성한다. 일-활성화 PEG의 생성을 위하여, PEG 디올 분자의 말단 상의 하나의 히드록실 부분은 전형적으로 비반응성 메톡시 말단 부분, -OCH3으로 치환된다. PEG 분자의 다른 미캡핑화 말단은 전형적으로 반응성 말단 부분으로 전환되며, 이는 단백질과 같은 분자 또는 표면 상의 반응성 부위에서의 부착에 대하여 활성화될 수 있다.
PAG는 전형적으로 물 및 다수의 유기 용매 중의 용해성, 독성의 결여, 및 면역원성의 결여의 특성들을 갖는 중합체이다. PAG의 한 가지 용도는 이 중합체를 불용성 분자에 공유 결합에 의해 부착시켜 생성된 PAG-분자 "콘쥬게이트"가 용해성이 되도록 하는 것이다. 예를 들어, 수불용성 약물 파클리탁셀은, PEG에 커플링될 때, 수용성으로 된다. 문헌[Greenwald, et al., J. Org. Chemin., 60: 331-336(1995)]. PAG 콘쥬게이트는 흔히 용해도 및 안정성 증강을 위해서뿐만 아니라 ㅂ분자의 혈액 순환 반감기의 연장을 위해서도 사용된다.
본 발명의 폴리알킬화 화합물은 크기가 전형적으로 5 내지 80 kDa 사이이지만, 임의의 크기가 사용될 수 있으며, 그 선별은 앱타머 및 용도에 따라 달라진다. 본 발명의 다른 PAG 화합물은 크기가 10 내지 80 kDa 사이이다. 본 발명의 또 다른 PAG 화합물은 크기가 10 내지 60 kDa 사이이다. 예를 들어, PAG 중합체는 크기가 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 또는 80 kDa일 수 있다. 그러한 중합체는 선형이거나 분지형일 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 중합체는 PEG이다. 몇몇 실시양태에 있어서 중합체는 분지형 PEG이다. 또 다른 실시양태에 있어서 중합체는 도 3에 도시되어 있는 바와 같이 40 kDa의 분지형 PEG이다. 몇몇 실시양태에 있어서, 40 kDa의 분지형 PEG는 도 4에 도시되어 있는 바와 같이 앱타머의 5' 말단에 부착된다.
생물학적 발현 단백질 치료제와는 대조적으로, 핵산 치료제는 활성화 단량체 뉴클레오티드로부터 화학적으로 합성되는 것이 전형적이다. PEG-핵산 콘쥬게이트는 동일한 반복 단량체 합성법을 사용하여 PEG를 도입시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 포스포르아미다이트 형태로의 전환에 의해 활성화된 PEG는 고체상 올리고뉴클레오티드 합성으로 도입될 수 있다. 대안적으로는, 올리고뉴클레오티드 합성은 반응성 PEG의 부착 부위의 부위 특이적 도입으로 완료시킬 수 있다. 가장 일반적으로는 이는 5'-말단에서의 자유 일차 아민의 부가(고체상 합성의 마지막 커플링 단계에서 변형자 포스포르아미다이트를 사용하여 삽입시킴)에 의해 달성되었다. 이러한 접근법을 사용하여, 반응성 PEG(예를 들어, 아민과 반응하여 아민과 결합을 형성하도록 활성화된 것)는 정제 올리고뉴클레오티드와 조합되며 커플링 반응이 용액 중에서 실시된다.
치료제의 생체 분포를 변경시키는 PEG 콘쥬게이션의 능력은 콘쥬게이트의 겉보기 크기(예를 들어, 유체 역학적 반경에 의해 측정되는 바와 같음)를 포함하는 다수의 요인에 관련된다. 보다 큰 콘쥬게이트(>10 kDa)는 신장을 통한 여과를 보다 효과적으로 차단하며, 그 결과, 작은 거대분자(예를 들어, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 혈청 중 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 여과를 차단하는 PEG 콘쥬게이트의 능력은 PEG 크기에 따라 최대 대략 50 kDa까지 증가하는 것으로 밝혀졌다(추가의 증가는 반감기가 신장을 통한 제거라기보다는 오히려 대식세포 매개 대사 작용에 의해 정의되게 되기 때문에 최소의 유익한 효과를 가짐).
고분자량 PEG(>10 kDa)의 제조는 어렵고 비효율적이며 비용이 많이 들 수 있다. 고분자량의 PEG-핵산 콘쥬게이트의 합성 경로로서, 이전의 연구는 고분자량의 활성화 PEG의 생성에 초점이 맞추어졌다. 그러한 분자의 한 가지 생성 방법은 분지형의 활성화 PEG의 형성을 포함하며, 여기서, 2개 이상의 PEG는 활성화 기를 지니는 중앙 코어에 부착된다. 이러한 보다 큰 분자량의 PEG 분자의 말단 부분, 즉, 상대적으로 비반응성인 히드록실(-OH) 부분은, 화합물 상의 반응성 부위에서의 다른 화합물에의 하나 이상의 PEG의 부착을 위하여, 활성화되거나 작용성 부분으로 전환될 수 있다. 분지형 활성화 PEG는 2개 초과의 말단을 가지며, 2개 이상의 말단이 활성화되었을 경우, 그러한 활성화된 보다 큰 분자량의 PEG 분자는 본원에서 다중 활성화 PEG로 칭해진다. 몇몇 경우, 분지형 PEG 분자의 일부 말단이 활성화된다. 분지형 PEG 분자의 임의의 2개의 말단이 활성화되는 경우, 그러한 PEG 분자는 이-활성화 PEG로 칭해진다. 분지형 PEG 분자 중의 단지 하나의 말단이 활성화되는 몇몇 경우, 그러한 PEG 분자는 일-활성화된 것으로 칭해진다. 이러한 접근법의 일례로서, 반응에 있어서 이후에 활성화되는 리신 코어에 2개의 모노메톡시 PEG를 부착시킴으로써 제조되는 활성화 PEG가 기술되어 있다(문헌[Harris et al., Nature, vol. 2: 214-221, 2003]).
본 발명은 다중 PEG화 핵산을 포함하는 고분자량 PEG-핵산(바람직하게는 앱타머) 콘쥬게이트의 합성을 위한 다른 비용 효과적 경로를 제공한다. 본 발명은 PEG-결합된 다량체성 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 이량체화 앱타머도 포함한다. 또한 본 발명은 고분자량 조성물에 관한 것이며, 여기서, PEG 안정화 부분(moiety)은 앱타머의 다른 부분을 분리하는 링커인데, 예를 들어, PEG는 단일 앱타머 서열 내에서 콘쥬게이션되어, 선형 배열의 고분자량 앱타머 조성물은 예를 들어 핵산 - PEG - 핵산(-PEG--핵산)n - 여기서, n은 1 이상임 - 이다.
본 발명의 고분자량 조성물은 분자량이 적어도 10 kDa인 것을 함유한다. 조성물은 전형적으로 크기가 10 내지 80 kDa 사이의 분자량을 갖는다. 본 발명의 고분자량 조성물은 크기가 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 또는 80 kDa이다.
안정화 부분은, 본 발명의 고분자량 앱타머 조성물의 약동학 및 약효학적 특성을 개선시키는 분자 또는 분자의 일부이다. 몇몇 경우, 안정화 부분은 2개 이상의 앱타머 또는 앱타머 도메인을 근접하게 되도록 하거나, 본 발명의 고분자량 앱타머 조성물의 전체 회전 자유도 감소를 제공하는 분자 또는 분자 부분이다. 안정화 부분은 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 - 이는 선형 또는 분지형일 수 있음 - , 단일 중합체 또는 이종 중합체일 수 있다. 다른 안정화 부분은 펩티드 핵산(PNA)과 같은 중합체를 포함한다. 올리고뉴클레오티드도 안정화 부분일 수 있으며, 그러한 올리고뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드 및/또는 변형 결합체, 예를 들어 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 안정화 부분은 앱타머 조성물의 필수 부분일 수 있는데, 즉, 이는 앱타머에 공유 결합에 의해 결합된다.
본 발명의 조성물은 2개 이상의 핵산 부분이 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 부분에 공유 결합에 의해 콘쥬게이션된 고분자량 앱타머 조성물을 함유한다. 폴리알킬렌 글리콜 부분은 안정화 부분 역할을 한다. 폴리알킬렌 글리콜 부분이 어느 하나의 말단에서 앱타머에 공유 결합에 의해 결합되어 폴리알킬렌 글리콜이 하나의 분자에서 핵산 부분들을 함께 결합시키는 조성물에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜은 결합 부분이라고 한다. 그러한 조성물에 있어서, 공유 분자의 일차 구조는선형 배열 핵산 PAG-핵산을 포함한다. 일례로는 일차 구조 핵산-PEG-핵산을 갖는 조성물이 있다. 다른 예로는 핵산-PEG -핵산-PEG-핵산의 선형 배열이 있다.
핵산-PEG-핵산 콘쥬게이트의 생성을 위하여, 핵산은 원래 핵산이 단일 반응 부위를 소유하도록 합성된다(예를 들어, 핵산은 일-활성화됨). 바람직한 실시양태에 있어서, 이러한 반응성 부위는 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성의 마지막 단계로서 변형자 포스포르아미다이트의 부가에 의해 5'-말단에서 도입되는 아미노 기이다. 변형 올리고뉴클레오티드의 탈보호 및 정제 후, 이는 활성화 PEG의 자발적인 가수 분해를 최소화하는 용액으로 고농도로 재구성된다. 바람직한 실시양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 1 mM이며, 재구성된 용액은 200 mM의 pH 8.3의 NaHCO3-완충제를 함유한다. 콘쥬게이트의 합성은 고도로 정제된 이-작용성 PEG의 느린 계단식 첨가에 의해 개시된다. 바람직한 실시양태에 있어서, PEG 디올은 숙신이미딜 프로피오네이트를 이용한 유도체화에 의해 양 말단에서 활성화된다(이-활성화). 반응 후, PEG-핵산 콘쥬게이트는 완전 콘쥬게이션되거나, 부분적으로 콘쥬게이션되거나 비콘쥬게이션된 화학종의 분리를 위하여 겔 전기 영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제된다. 연결된 다수의 PAG 분자(예를 들어, 랜덤 또는 블록 공중합체로서) 또는 보다 작은 PAG 사슬을 결합시켜 다양한 길이(또는 분자량)를 성취할 수 있다. PAG외 링커가 다양한 길이의 PAG 사슬들 사이에서 사용될 수 있다.
2'-O-메틸, 2'-플루오로 및 기타 변형 뉴클레오티드 변형체는 뉴클레아제에 대하여 앱타머를 안정화시키며 생체내에서 앱타머의 반감기를 증가시킨다. 3'-3'-dT 캡도 엑소뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제5,674,685호; 미국 특허 제5,668,264호; 미국 특허 제6,207,816호; 및 미국 특허 제6,229,002호를 참조하는데, 상기 특허 각각은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함되어 있다.
반응성 핵산의 PAG - 유도체화
고분자량의 PAG-핵산-PAG 콘쥬게이트는 일-작용성 활성화 PEG를, 하나보다 많은 반응성 부위를 포함하는 핵산과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 일 실시양태에 있어서, 핵산은 이-반응성 또는 이-활성화된 것이며, 하기의 2개의 반응성 부위: 즉, 통상적인 포스포르아미다이트 합성, 예를 들어, 도 5에 도시되어 있는 바와 같이 3'-5'-디-PEG화를 통하여 올리고뉴클레오티드 내로 도입되는 5'-아미노 기 및 3'-아미노기를 포함한다. 대안적인 실시양태에 있어서, 반응성 부위는 예를 들어 피리미딘의 5-위치, 퓨린의 8-위치 또는 리보스의 2'-위치를 일차 아민의 부착 부위로 하여, 내부 위치에 도입할 수 있다. 그러한 실시양태에 있어서, 핵산은 여러 활성화 또는 반응성 부위를 가질 수 있으며 다중적으로 활성화된 것이라고 한다. 합성 및 정제 후, 변형 올리고뉴클레오티드는 자발적인 가수분해는 최소화하면서 올리고뉴클레오티드 반응성 부위와의 선별적 반응은 촉진하는 조건 하에서 일-활성화 PEG와 조합한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 모노메톡시-PEG는 숙신이미딜 프로피오네이트로 활성화되며 커플링 반응은 pH 8.3에서 실시된다. 이-치환 PEG의 합성을 유도하기 위하여, 화학량론적 과량의 PEG를 올리고뉴클레오티드에 대하여 제공한다. 반응 후, PEG-핵산 콘쥬게이트는 완전-콘쥬게이션되거나 부분적으로 콘쥬게이션되거나 비콘쥬게이션된 화학종의 불리를 위하여 겔 전기 영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제한다.
또한 결합 도메인은 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜 분자가 이 도메인에 부착된 것일 수 있다. 그러한 PAG는 다양한 길이의 것일 수 있으며 적합한 조합으로 사용되어 본 조성물의 원하는 분자량을 성취할 수 있다.
특정 링커의 효과는 그의 화학적 조성 및 길이 둘 모두에 의해 영향을 받을 수 있다. 너무 길거나, 너무 짧거나, IgE와의 불리한 입체 및/또는 이온 상호작용을 형성하는 링커는 앱타머와 IgE 사이의 결합체의 형성을 배제시킬 것이다. 핵산들 사이의 거리에 걸치는 데에 필요한 것보다 긴 링커는 리간드의 유효 농도를 감소시킴으로써 결합 안정성을 저하시킬 수 있다. 따라서, 앱타머의 표적에의 친화도를 최대화하기 위하여 링커의 조성 및 길이를 최적화하는 것이 흔히 필요하다.
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허는, 각각의 그러한 간행물 또는 문서가 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적으로, 그리고 개별적으로 나타내어지는 것과 같이 본원에 참고로 포함된다. 간행물 및 특허의 인용은 이들이 관련되어 있는 종래 기술임을 인정하려는 것이 아니며, 이것이 상기 간행물 또는 특허의 날짜 또는 내용에 대한 인정이 되는 것도 아니다. 지금까지 본 발명은 기재된 설명으로 기술하였는데, 당업자라면 본 발명이 다양한 실시양태로 실행될 수 있으며 전술한 상세한 설명 및 하기의 실시예는 예시를 위한 것으로서 하기 특허청구범위를 한정하는 것이 아님을 인식할 것이다.
실시예 1: 앱타머 선별 및 서열
실시예 1A: rRfY IgE 앱타머의 h- IgE 선별
인간 골수종 혈장으로부터 정제된 인간 IgE(이하, "h-IgE")를 아텐스 리서치 앤드 테크놀러지(Athens Research and Technology (Athens, GA))로부터 구입하였다. T7 RNA 폴리머라제(Y639F)를 발현시키고 정제하였다. 2'-F 피리미딘 뉴클레오티드 및 2'-OMe 퓨린 및 피리미딘 올리고뉴클레오티드를 트리링크 바이오테크놀러지스(TriLink BioTechnologies (San Diego, CA))로부터 구입하였다. 모든 다른 일반적인 시약을 시판 공급처로부터 구입하였다. 2'-OH 퓨린 및 2'-F 피리미딘 뉴클레오티드로 구성된 풀(rRfY)을 사용하여 1회 선별을 수행함으로써 h-IgE에 대한 앱타머를 확인하였다. h-IgE에 대한 직접적 선별을 수행하여 h-IgE에 대해 특이적인 고 친화성 앱타머를 수득하였다.
풀 제조: ABI EXPEDITETM DNA 합성기를 사용하여 서열 5'-GGGAAAAGCGAATCATACACAAGAN40GCTCCGCCAGAGACCAACCGAGAA-3'(서열 번호 5)을 가진 DNA 주형을 합성하고, 표준 방법으로 탈보호하였다. 주형을 프라이머 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAAAGCGAATCATACACAAGA-3'(서열 번호 6) 및 5'-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-3'(서열 번호 7)로 증폭한 후 T7 RNA 폴리머라제(Y639F)를 사용한 시험관내 전사를 위한 주형으로 사용하였다. 전사는 40 mM 트리스, 40 mM DTT, 1 mM 스퍼미딘, 0.002 % 트리톤 X-100, 4% PEG-8000, 12 mM MgCl2, 3 mM 2'-F-CTP, 3 mM 2'-F-UTP, 3 mM GTP, 3 mM ATP, 0.01 units/㎖ 무기 피로포스파타 제 및 T7 폴리머라제(Y639F), 및 대략 0.5 μM 주형 DNA를 사용하여 행하였다.
선별: 실온에서 최종 부피 100 ㎕ 선별 완충제(1 X SHMCK: 20 mM 헤페스, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7.4) 중에서 2'-F 피리미딘 변형 ARC212 풀(5'-GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGA-N4o- GCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA-3')(서열 번호 8) 2×1014 분자를 100 pmole의 h-IgE 단백질과 1시간 동안 인큐베이션함으로써 선별을 시작하였다. 0.45 마이크론 니트로셀룰로스 스핀 컬럼(Schleicher & Schuell, Keene, NH)을 사용하여 RNA-단백질 결합체와 비결합 RNA 분자를 분리하였다. 상기 컬럼을 1 ㎖의 1× SHMCK 완충제로 미리 세정한 후, 풀:IgE 결합체를 함유하는 용액을 상기 컬럼에 첨가하고 1500 × g에서 2분 동안 원심분리하였다. 필터를 400 ㎕의 1× SCHMK로 2회 세정하여 비특이적 결합제를 제거하였다(1 순환, 2 × 400 ㎕ 1× SCHMK; 후기 순환, 2 × 500 ㎕ 1× SCHMK). 2×200 ㎕ 용출 완충제(7 M 우레아, 100 mM 아세트산나트륨, 3 mM EDTA, 95℃로 미리 가열시킨 것)를 첨가하여 RNA를 용출하였다.
페놀:클로로포름을 이용하여 RNA 혼합물로부터 용출된 단백질을 추출하고, 풀 RNA를 침전시켰다(2 ㎕ 글리코겐, 1 부피 이소프로판올). 서열 번호 7에 따른 3' 프라이머를 사용하여 제조자의 지시에 따라 ThermoScriptRT-PCRTM 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 RNA를 역전사시켰다. cDNA를 PCR(20 mM 트리스 pH 8.4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.5 μM 5' 프라이머(서열 번호 6), 0.5 μM 3' 프 라이머(서열 번호 7), 0.5 mM의 각 dNTP, 0.05 units/㎕ Taq 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA))로 증폭하였다. QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다. 37℃에서 밤새 α32P ATP 본체 표지화(4% PEG-8000, 40 mM 트리스 pH 8.0, 12 mM MgCl2, 1 mM 스퍼미딘, 0.002 % 트리톤 ×-100, 3 mM 2' OH 퓨린, 3 mM 2'-F CTP 및 UTP, 25 mM DTT, 무기 피로포스파타제, T7 RNA 폴리머라제(Y639F) 5μCi α32P ATP)를 이용하여 주형을 전사하였다. 제조자의 지시에 따라 Centrisep Spin 컬럼(Princeton Separations, Adelphia, NJ)을 사용하여 반응물을 탈염시키고 1.5 mm 변성 폴리아크릴아미드 겔(8 M 우레아, 10% 아크릴아미드; 19:1 아크릴아미드:비스아크릴아미드) 상에서 정제하였다.
음성 선별 단계의 부가를 제외하고는 1 순환과 동일한 방법을 이용하여 후속 순환을 반복하였다. 단백질 표적과의 인큐베이션 전, 풀 RNA를 0.45 마이크론 니트로셀룰로스 필터 컬럼에 통과시켜 필터 결합 서열을 제거한 후, 여액을 양성 선별 단계에서 계속 사용하였다.
대안적 순환에서, 풀 RNA를 겔 정제하였다. 전사 반응물을 50 mM EDTA로 켄칭하고, 에탄올 침전시킨 후, 1.5 mm 변셩 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하였다. Elutrap® 장치(Schleicher and Schuell, Keene, NH)에서 1× TBE(90 mM 트리스, 90 mM 붕산, 0.2 mM EDTA) 중에서 225 V에서 1시간 동안 전기용출하여 풀 RNA를 겔로부터 제거하였다. 300 mM 아세트산나트륨 및 2.5 부피의 에탄올을 첨가하여 용출된 물질을 침전시켰다.
선별 전체에 걸쳐 RNA 농도를 h-IgE 농도를 초과하게 유지하였다. 단백질 농도는 처음 두 순환에서 1 μM인 후, 후속 순환 동안 보다 낮은 농도로 떨어뜨렸다(표 1). 경쟁자 tRNA를 4 순환에서 시작하여 0.1 ㎎/㎖ 만큼 결합 반응물에 첨가하였다. 10회 순환의 선별을 완결한 후, 풀을 2개로 나누었다. 11a 순환은 풀 대 h-IgE 농도 비가 10:1인 양성 선별을 이용하여 수행하였다. 11b 및 12b 순환에서, 100:1의 RNA 대 h-IgE 농도 비가 이용되었다. 친화성이 보다 높은 결합제에 대한 선별을 이끌어 내기 위한 시도에서 이를 행함으로써 엄격도(stringency)를 증가시켰다. 표 1은 각 순환에서 이용된 풀 RNA 농도, 단백질 농도 및 tRNA 농도, (존재하는 경우) 음성 선별 단계(들), 및 제조자(New England Biolabs, Catalog # N3231L, Beverly, MA)의 지시에 따라 로딩한 경우 100 bp DNA 래더(∼48 ng의 DNA 질량)의 100 bp 마커 레인과 동일한 강도를 가진 4% 아가로스 E-겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 상의 PCR 밴드를 얻기 위해 필요한 PCR 주기의 수를 비롯한 선별에 대한 세부적 사항을 포함하고 있다.
선별의 진행은 양성 선별 단계 동안 니트로셀룰로스 필터로부터 용출된 유입 풀 RNA 비율을 측정함으로써 모니터링하였다.
[표 1]
Figure 112006087103447-PCT00013
h- IgE 결합 분석: 선별 전체에 걸쳐 도트 블롯 결합 분석을 수행하여 풀의 단백질 결합 친화성을 모니터링하였다. 미량의 32P-표지 풀 RNA를 h-IgE와 합하고 실온에서 최종 부피 25 ㎕의 1× SHMCK 완충제 + 0.1 ㎎/㎖ tRNA 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 혼합물을 도트 블롯 장치(Schleicher and Schuell Minifold-1 Dot Blot, Acrylic)에 적용하고, 니트로셀룰로스, 나일론 및 겔 블롯 막으로 (상부부터 하부까지) 어셈블링하였다. 단백질에 결합된 RNA는 니트로셀룰로스 필터 상에서 포획한 반면, 비-단백질 결합 RNA는 나일론 필터 상에서 포획하였다. h-IgE 존재 하의 RNA 결합 대 h-IgE의 부재 하의 RNA 결합의 상당한 양(positive)의 비가 관찰된 경우, 제조자의 지시에 따라 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 풀을 클로닝하였다. 11a 순환 풀 주형을 클로닝하고 시퀀싱한 다음, 8개의 특정한 클론을 1-포인트 도트 블롯 스크린(+/- 20 nM h-IgE)에서 분석하였다. 12b 순환 풀을 클로닝하고 시퀀싱한 다음, 4개의 유니크 클론을 1-포인트 도트 블롯 스크린(+/- 20 nM h-IgE)에서 단백질 결합에 대해 분석하였다. 스크리닝한 각각의 클론에 있어서 20 nM h-IgE에서의 결합률(백그라운드 초과의 신호)을 하기 표 2의 최우측 컬럼에 나열하였다. 이들 12개의 클론에 대한 서열은 하기 표 3에 기재되어 있다. 1-포인트 도트 블롯 스크린에 기초하여, KD 결정을 위해 여러 개의 클론을 선별하였다. 클론 전사체를 γ-32P ATP로 5' 말단 표지하였다. 상기 풀 친화도를 스크리닝하는 데 이용된 것과 동일한 조건 하에 결합 반응물을 준비하였다: h-IgE를 적정하면서 미량의 32P 표지 클론을 합하고, 실온에서 최종 부피 25 ㎕의 1× SCHMCK 완충제 + 0.1 ㎎/㎖ tRNA 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 방정식 (ampl.1/(1+KD1/[h-IgE])+amp1.2/(1+KD2/[h-IgE]))+백그라운드에 피팅(fitting)함으로써 초기 스크린에서 +/- h-IgE 결합비가 >2인 모든 유니크 서열에 대한 도트 블롯 분석을 이용하여 KD 값을 측정하였는데, 상기 방정식에서 ampl.l 및 ampl.2는 이층 포화 플롯(plot)의 2층에 대한 플래토우 값(plateau value)을 나타내고, KD1 및 KD2는 생성 데이타에 관한 각 상호작용에 대한 해리 상수(Kaleidagraph)를 나타낸다. 단백질 결합 특징규명의 결과는 표 2에 요약되어 있다.
[표 2]
Figure 112006087103447-PCT00014
표 3에 그 특징이 규명되어 있는 rRfY 앱타머의 핵산 서열은 하기에 기재되어 있다. 각 앱타머의 유니크 서열은 서열 GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGA (서열 번호 9) 직후의 뉴클레오티드 25에서 시작하고, 3' 고정 핵산 서열 GCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA (서열 번호 10)을 만날 때까지 이어진다.
달리 명시하지 않는 한, 하기 나열된 개별 서열은 5'부터 3' 방향으로 나타내었고 퓨린(A 및 G)이 2'-OH이고 피리미딘(U 및 C)이 2-플루오로인 rRfY SELEXTM 조건 하에 선별하였다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 하기 표 3에 기재된 핵산 서열을 가진 앱타머를 포함한다. 다른 실시양태에서, 표 3에 기재된 앱타머의 핵산 서열은 고분자량의 비-면역원성 화합물(예컨대, PEG)에의 화학적 커플링 및/또는 컨쥬게이션을 촉진하기 위한 3' 캡(예컨대, 3' 역 dT(3T)) 및/또는 5' 아민(NH2) 변형을 추가로 포함한다.
[표 3]
Figure 112006087103447-PCT00015
실시예 1B: dRmY IgE 앱타머의 선별
데옥시-A, G 및 2'O-메틸 C, U 잔기을 보유하는 IgE 앱타머(dRmY 조성)를 확인하기 위한 선별을 수행하였다. 이는 소수성 플레이트 상에 고정되어 있는 h-IgE에 대한 직접적 선별이었다. 이 선별을 통해 선별되지 않은 원상태 그대로의 풀에 비해 h-IgE 결합이 상당히 풍부해진 풀을 얻었다.
풀 제조: ABI EXPEDITETM DNA 합성기를 이용하여 서열 5'-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN30CGCTGTCGATCGATCGATCGATG-3'(서열 번호 23)을 가진 DNA 주형을 합성하고 표준 방법으로 탈보호하였다. 주형을 5' 프라이머 5'-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3'(서열 번호 24) 및 3' 프라이머 5'-CATCGATCGATCGATCGACAGC-3'(서열 번호 25)로 증폭하고, T7 RNA 폴리머라제(Y639F)를 사용한 시험관내 전사를 위한 주형으로 사용하였다. 전사는 200 mM 헤페스, 40 mM DTT, 2 mM 스퍼미딘, 0.01 % 트리톤 X-100, 10% PEG-8000, 9.6 mM MgCl2, 2.9 mM MnCl2, 30 μM GTP, 2 mM mCTP, 2 mM mUTP, 2 mM dGTP, 2 mM dATP, 2 mM GMP, 2 mM 스퍼민, 0.01 units/㎕ 무기 피로포스파타제 및 T7 폴리머라제(Y639F)를 사용하여 행하였다.
선별: 각 선별 순환은 실온의 1× PBS 100 ㎕ 중에서 h-IgE 20 pmole을 Nunc Maxisorp (Rochester, NY) 소수성 플레이트의 표면에 1시간 동안 고정시킴으로써 개시하였다. 그 다음, 상청액을 제거하고 웰을 120 ㎕의 세정 완충제(1× PBS, 0.1 ㎎/㎖ tRNA 및 0.1 ㎎/㎖ ssDNA)로 5회 세정하였다. 1 순환에서, 100 pmole의 풀 RNA(6×1013 유니크 분자)를 실온에서 웰 내의 100 ㎕ 결합 완충제(1×PBS, 0.1 ㎎/㎖ tRNA 및 0.1 ㎎/㎖ ssDNA) 중에서 고정화된 단백질 표적과 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 상청액을 제거하고, 웰을 120 ㎕ 세정 완충제로 5회 세정하였다. 후속 순환에서, 음성 선별 단계를 포함시켰다: 또한 풀 RNA를 실온의 빈 웰에서 1시간 동안 인큐베이션하여 양성 선별 단계 전에 풀로부터 임의의 플라스틱 결합 서열을 제거하였다. 3 순환에서 시작하여, 제2 음성 선별 단계를 도입함으로써 비-특이적 결합제에 대해 추가 선별을 행하였다; 풀을 100 ㎕ 블로킹 완충제(1×PBS, 0.1 ㎎/㎖ tRNA, 0.1 ㎎/㎖ ssDNA 및 0.1 ㎎/㎖ BSA)로 미리 블로킹시킨 웰 내에서 1시간 동안 인큐베이션였다. 3 순환부터는, 양성 선별 단계 전에 실온의 100 ㎕ 블로킹 완충제(1×PBS, 0.1 ㎎/㎖ tRNA, 0.1 ㎎/㎖ ssDNA 및 0.1 ㎎/㎖ BSA) 중에서 표적-고정화 웰을 1시간 동안 블로킹하였다. 모든 경우에서, RT 믹스(3' 프라이머, (서열 번호 25), 및 Thermoscript RT, Invitrogen)의 첨가 후 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 고정화된 h-IgE에 결합된 풀 RNA를 선별 플레이트에서 직접 역전사하였다. 생성된 cDNA를 PCR(Taq polymerase, New England Biolabs)용 주형으로서 사용하였다. 68℃ 어닐링 온도와 커플링시킨 "고온 출발(Hot start)" PCR 조건을 이용하여 프라이머-이량체 형성을 최소화하였다. PCR 증폭은 제조자의 권고에 따라 로딩한 경우(~48 ng의 DNA 질량) 100 bp DNA 래더의 100 bp 마커 레인의 강도와 동일한 4% 아가로스 E-겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 상의 PCR 밴드를 얻는 데 필요한 주기 수 동안 수행하였다(하기 표 4의 마지막 컬 럼에 기재되어 있음). 증폭된 풀 주형 DNA를 제조자의 권고 조건에 따라 Micro Bio-Spin 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 탈염시키고 다음 선별 순환을 위한 풀 RNA의 전사를 프로그래밍하는 데 사용하였다. 전사된 풀은 각 순환에서 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 겔 정제하였다. 하기 표 4는 dRmY 앱타머 선별의 각 순환에 이용되는 조건을 보여준다.
[표 4]
Figure 112006087103447-PCT00016
h- IgE 결합 분석: 선별 진행은 샌드위치 필터 결합 분석을 이용하여 모니터링하였다. 5'-32P-표지 풀 RNA(미량의 농도)를 실온에서 h-IgE, 1×PBS + O.1 ㎎/㎖ tRNA, 0.1 ㎎/㎖ ssDNA 및 0.1 ㎎/㎖ BSA와 30분 동안 인큐베이션한 후, 도트 블롯 장치(Schleicher and Schuell) 내의 니트로셀룰로스 및 나일론 필터 샌드위치에 가하였다. 니트로셀룰로스에 결합된 풀 RNA의 비율은 6 및 7 순환 후 7 포인트 스크린(0.25 nM, 0.5 nM, 1 nM, 4 nM, 16 nM, 64 nM 및 128 nM h-IgE, 비-표적 대조구 또한 런닝시킴)으로 계산하였다. 풀 KD 측정치는 단백질 적정 및 상기 도트 블롯 장치를 이용하여 측정하였다.
6회 순환 선별 후 원상태 그대로의 풀에 비하여 h-IgE 결합이 풍부하도록 dRmY h-IgE 선별을 수행하였다. 6 및 7 순환에서, 풀 KD는 대략 4 nM이었다. TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 6 순환 풀을 클로닝하고, 31개의 개별 서열을 발생시켰다. 31개의 서열들 중 8 및 3으로 나타낸 2개의 우성 클론 및 21개의 싱글레톤(singleton)이 있었다. 도 6은 6 및 7 순환 풀에 대한 결합 비율 대 h-IgE 농도의 그래프를 보여준다.
클론 스크리닝. KD 측정을 위해, 23개의 유니크 서열 각각의 클론 전사체의 5' 말단을 γ-32P ATP로 표지화하였다. KD 값은 도트 블롯 분석(0-300 nM h-IgE, 3배 연속 희석)에서 8 포인트 스크린, 및 1×둘베코스 PBS; 1.0 ㎎/㎖ tRNA; 0.1 ㎎/㎖ 전단 연어 정자 DNA; 및 0.1 ㎎/㎖ BSA의 완충제 조건을 이용하여 측정하였다. 데이타를 하기 방정식에 피팅하여 해리 상수(KD)를 평가하였다: 결합된 RNA 비율 = amplitude/(l+KD/[h-IgE]) + 백그라운드. 이 결합 분석 조건 하에서, 23개의 유니크 서열들 중 20개는 유의한 결합을 보이지 않았다. 서열 번호 43 및 서열 번호 46에 따른 클론은 각각 87.7 nM 및 109.7 nM의 해리 상수를 나타내었다.
이어서, 23개의 유니크 클론들 각각을 다양한 분석 조건 하에 h-IgE와의 결합에 대해 다시 시험하였다. 표준 화학적 합성 및 탈보호 방법을 이용하여 클론을 합성 제조하였다. 그 다음, 클론을 겔 전기영동으로 정제하였다. 미량의 5'-32P-표지화 앱타머를, 300 nM(3배 희석)에서 시작하여 그 농도가 7회 감소되는 인간 IgE 및 단백질 무함유 샘플과 합하고, 실온의 dPBS(Mg++ 및 Ca++을 함유함)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 도트 블롯 분석을 이용하여 KD 값을 측정하였다. 상기 분석은 각 클론에 대해 3회 반복하였다. 평균 결합률을 각 단백질 농도에 대해 계산하고, 하기 방정식을 이용하여 평형 해리 상수를 계산하였다: ((A + P + K) - sqrt((A + P + K)^ 2 - 4*A*P))/2A + B; 여기서, A = [앱타머]총계, P = [단백질]총계 및 B = 백그라운드 신호임.
이 분석 조건 하에, 서열 번호 43 및 서열 번호 46에 따른 핵산 서열을 가진 클론은 h-IgE와의 현저하게 개선된 결합을 보였고, 23개의 유니크 서열들 중 추가 6개 클론은 낮은 나노몰 범위 내에서 h-IgE와의 높은 친화성 결합을 나타내었다. 단백질 결합 특징규명의 결과는 표 5A에 요약되어 있고, 생성된 모든 22개의 클론들에 대한 서열은 하기 표 5B에 기재되어 있다.
[표 5A]
Figure 112006087103447-PCT00017
표 5B에서 각 앱타머의 유니크 서열은 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(서열 번호 26) 직후의 뉴클레오티드 23에서 시작하고, 3' 고정 핵산 서열 CGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG(서열 번호 27)를 만날 때까지 이어진다.
달리 명시하지 않는 한, 하기 나열된 개별 서열은 5'부터 3' 방향으로 나타내었고 퓨린(A 및 G)이 데옥시이고 피리미딘(U 및 C)이 2'-OMe인 dRmY SELEXTM 조건 하에 선별하였다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 하기 표 5B에 기재된 핵산 서열을 가진 앱타머를 포함한다. 다른 실시양태에서, 표 5B에 기재된 앱타머의 핵산 서열은 고분자량의 비-면역원성 화합물(예컨대, PEG)에의 화학적 커플링 및/또는 컨쥬게이션을 촉진하기 위한 3' 캡(예컨대, 3' 역 dT(3T)) 및/또는 5' 아민(NH2) 변형을 추가로 포함한다.
[표 5B]
Figure 112006087103447-PCT00018
Figure 112006087103447-PCT00019
실시예 1C: rRmY h- IgE 앱타머의 선별
2'-리보 G 및 A 그리고 2'-O메틸 C 및 U 잔기를 보유하는(rRmY 조성) h-IgE 앱타머를 확인하기 위한 선별을 수행하였다. 이는 소수성 플레이트 상에 고정되어 있는 h-IgE에 대한 직접적 선별이었다. 이 선별을 통해 원상태 그대로의 비선별된 풀에 비하여 h-IgE 결합이 상당히 풍부한 풀을 수득하였다.
풀 제조: ABI EXPEDITETM DNA 합성기를 이용하여 서열 5'-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN30CGCTGTCGATCGATCGATCGATG-3'(서열 번호 51)을 가진 DNA 주형을 합성하고 표준 방법으로 탈보호하였다. 주형을 5' 프라이머 5'-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3'(서열 번호 52) 및 3' 프라이머 5'- CATCGATCGATCGATCGACAGC-3'(서열 번호 53)로 증폭하고, T7 RNA 폴리머라제(Y639F)를 사용한 시험관내 전사를 위한 주형으로 사용하였다. 전사는 200 mM 헤페스, 40 mM DTT, 2 mM 스퍼미딘, 0.01 % 트리톤 X-100, 10% PEG-8000, 5 mM MgCl2, 1.5 mM MnCl2, 500 μM rGTP, 500 μM rATP, 500 μM mCTP, 500 μM mUTP, 500 μM GMP, 0.01 units/㎕ 무기 피로포스파타제 및 T7 폴리머라제(Y639F)를 사용하여 행하였다.
선별: 각 선별 순환은 실온의 100 ㎕ 1×둘베코스 PBS 중에서 h-IgE 20 pmole을 Nunc Maxisorp 소수성 플레이트의 표면에 2시간 동안 고정시킴으로써 개시하였다. 그 다음, 상청액을 제거하고 웰을 120 ㎕의 세정 완충제(1×DPBS, 0.2% BSA 및 0.05% 트윈-20)로 4회 세정하였다. 풀 RNA를 90℃에서 3분 동안 가열하고 10분 동안 실온으로 냉각시켜 리폴딩시켰다. 1 순환에서, 양성 선별 단계를 수행하였다. 요약하건대, 1×1014 분자(0.2 nmole)의 풀 RNA를 실온에서 웰 내의 100 ㎕ 결합 완충제(1×DPBS, 0.05% 트윈-20) 중에서 고정화된 단백질 표적과 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 상청액을 제거하고, 웰을 120 ㎕ 세정 완충제로 4회 세정하였다. 후속 순환에서, 음성 선별 단계를 포함시켰다. 또한, 풀 RNA를 실온의 빈 웰에서 30분 동안 인큐베이션하여 양성 선별 단계 전에 풀로부터 임의의 플라스틱 결합 서열을 제거하였다. 4 순환 후에 2회의 추가 120 ㎕ 세정(총 6 × 120 ㎕ 세정)을 통해 세정의 횟수를 증가시켜 엄격도를 증가시켰다. 모든 경우에서, RT 믹스(3' 프라이머, (서열 번호 53), 및 Thermoscript RT, Invitrogen)의 첨가 후 65 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 고정화된 h-IgE에 결합된 풀 RNA를 선별 플레이트에서 직접 역전사하였다. 생성된 cDNA를 PCR(Taq polymerase, New England Biolabs)용 주형으로서 사용하였다. 68℃ 어닐링 온도와 커플링시킨 "고온 출발" PCR 조건을 이용하여 프라이머-이량체 형성을 최소화하였다. 증폭된 풀 주형 DNA를 제조자의 권고 조건에 따라 Centrisep 컬럼(Princeton Separations)으로 탈염시키고 다음 선별 순환을 위한 풀 RNA의 전사를 프로그래밍하는 데 사용하였다. 전사된 풀을 순환마다 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 겔 정제하였다. 하기 표 6은 순환 당 rRmY 선별 풀 h-IgE 사용을 보여준다.
[표 6]
Figure 112006087103447-PCT00020
선별 진행은 샌드위치 필터 결합 분석을 이용하여 모니터링하였다. 5'-32P-표지 풀 RNA를 90℃에서 3분 동안 리폴딩하고 10분 동안 실온으로 냉각시켰다. 다음으로, 풀 RNA(미량 농도)를 실온에서 1×DPBS + O.l ㎎/㎖ tRNA 중에서 h-IgE와 30분 동안 인큐베이션한 후, 도트 블롯 장치(Schleicher and Schuell) 내의 니트로셀룰로스 및 나일론 필터 샌드위치에 가하였다. 니트로셀룰로스에 결합된 풀 RNA의 비율은 단일 포인트 스크린(+/- 250 nM h-IgE)으로 3개 순환마다 대략적으로 계산하고 모니터링하였다. 풀 KD 측정치는 단백질 적정 및 상기 도트 블롯 장치를 이용하여 측정하였다.
4 순환 후 선별을 원상태 그대로의 풀에 비해 강화시켰다. 선별 엄격도는 2회의 추가 120 ㎕ 세정으로 증가시켰고, 선별을 2회 이상의 순환 동안 계속하였다 6 순환에서, 풀 KD는 대략 500 nM이었다. TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 풀을 클로닝하고, 개별 클론 서열을 얻었다. 6 순환 풀은 시퀀싱된 24개의 클론들의 71%를 차지하는 서열 번호 56에 따른 핵산 서열을 가진 하나의 우성 클론을 함유하였다. 12 포인트 스크린(2배 연속 희석에서 0-250 nM h-IgE)을 이용하여 h-IgE와의 결합에 대해, 상기 우성 클론뿐만 아니라 중복하여 나타난 3개의 클론을 시험하였다. 3개의 중복 클론은 우성 클론보다 더 높은 결합도를 보였지만, 모든 KD는 대략 500 nM이었다. 96개의 서열로 된 추가 세트를 얻었고, 제1 서열 세트에서는 명백하지 않았던 8개의 다른 서열 족과 함께 서열 번호 56에 따른 핵산 서열을 가진 우성 클론은 96개의 클론의 40%를 차지하였다. 단일 포인트 스크린을 추가 유니크 서열(+/- 200 nM h-IgE)에 대하여 수행하였다. 단일 포인트 스크린을 기초로 하여, 12 포인트 스크린(0-400 nM h-IgE, 2배 연속 희석)을 이용하여 추가 24개의 KD 서열에 대해 KD 값을 측정하였다. 이들 클론 각각에 대한 KD는 100 nM을 초과하였고, 이들 클론에 대한 추가 노력을 종결하였다. 하기 표 7은 선별된 rRmY 클론의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
각 앱타머의 유니크 서열은 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUA(서열 번호 54) 직후의 뉴클레오티드 22에서 시작하고, 3' 고정 핵산 서열 CGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG(서열 번호 55)을 만날 때까지 이어진다.
달리 명시하지 않는 한, 하기 나열된 개별 서열은 5'부터 3' 방향으로 나타내었고 모든 퓨린(A 및 G)이 2'-OH이고 모든 피리미딘(U 및 C)이 2'-OMe인 rRmY SELEXTM 조건 하에 선별하였다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 하기 표 7에 기재된 핵산 서열을 가진 앱타머를 포함한다. 다른 실시양태에서, 표 7에 기재된 앱타머의 핵산 서열은 고분자량의 비-면역원성 화합물(예컨대, PEG)에의 화학적 커플링 및/또는 컨쥬게이션을 촉진하기 위한 3' 캡(예컨대, 3' 역 dT(3T)) 및/또는 5' 아민(NH2) 변형을 추가로 포함한다.
[표 7]
Figure 112006087103447-PCT00021
Figure 112006087103447-PCT00022
Figure 112006087103447-PCT00023
실시예 2: 앱타머 변형
실시예 2A: rRfY IgE 클론 최소화
결합 친화성을 유지하면서, 바람직하게는 개선하면서 실시예 1A에서 기재한 IgE 앱타머를 최소화하기 위한 노력을 기울였다. h-IgE 결합에 필요한 코어 구조적 요소를 확인하기 위해, 여러 고 친화성 h-IgE 결합제의 3'-경계를 결정하였다. RNA 전사체의 5'-말단을 γ-32P ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 표지화하였다. 방사선표지 리간드에 대해 부분 알칼리성 가수분해를 행한 다음, 용액 중에서 500 nM의 h-IgE에 선택적으로 결합시킨 후 니트로셀룰로스 필터 위에서 분리하였다. 보유된 올리고뉴클레오티드를 8% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였다. h-IgE 에 결합된 가장 짧은 올리고뉴클레오티드를 3'-경계로 정의하였다. 선별된 클론의 3'-경계는 표 8에 기재되어 있다. 경계 실험뿐만 아니라 예측된 폴드(fold)의 시각적 검사를 기초로 하여, 절단된(truncated) 컨스트럭트를 제조하고 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies (Coralville, IA))사에 올리고를 주문하였다. 서열 번호 11, 서열 번호 18 및 서열 번호 21에 따른 핵산 서열을 가진 모 클론의 최소화 버젼은 상술된 샌드위치 필터 결합 분석에 의한 측정 시 상당한 단백질 결합을 보여주었다. 미니머 결합 데이타는 표 8에 기재되어 있는 한편, 상응하는 서열은 표 9에 기재되어 있다.
[표 8]
Figure 112006087103447-PCT00024
달리 명시하지 않는 한, 하기 나열된 개별 서열은 5'부터 3' 방향으로 나타내었고 모든 퓨린(A 및 G)이 2'-OH이고 모든 피리미딘(U 및 C)이 2'-플루오로인 rRfY SELEXTM 조건 하에 선별하였다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 하기 표 9에 기재된 핵산 서열을 가진 앱타머를 포함한다. 다른 실시양태에서, 표 9에 기재된 앱 타머의 핵산 서열은 고분자량의 비-면역원성 화합물(예컨대, PEG)에의 화학적 커플링 및/또는 컨쥬게이션을 촉진하기 위한 3' 캡(예컨대, 3' 역 dT(3T)) 및/또는 5' 아민(NH2) 변형을 추가로 포함한다.
[표 9]
Figure 112006087103447-PCT00025
실시예 2B: dRmY IgE 클론 최소화
결합 친화성을 유지하면서, 바람직하게는 개선하면서 실시예 1B에서 기재한 dRmY IgE 앱타머를 최소화하기 위한 노력을 기울였다. 서열 번호 43 및 서열 번호 46에 따른 핵산 서열을 가진 클론에 대한 예측된 폴드의 검사를 기초로 하여, 최소화 서열의 패널을 디자인하였다. 가장 높은 친화성을 가진 분자 ARC445(서열 번호 101)는 길이에서 23개 뉴클레오티드이고 22 nM의 KD로 h-IgE에 결합한다. 데이타는 표 10에 요약되어 있다. 표 11은 서열 번호 43 및 서열 번호 46에 따른 핵산 서열을 가진 클론으로부터 유래된 절단물(truncant)인 ARC441 내지 ARC447의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 97-103)을 보여준다.
[표 10]
Figure 112006087103447-PCT00026
달리 명시하지 않는 한, 하기 나열된 개별 서열은 5'부터 3' 방향으로 나타내었고 모든 퓨린(A 및 G)이 데옥시이고 모든 피리미딘(C 및 U)이 2'-O-메틸인 dRmY SELEXTM 하에 선별하였다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 하기 표 11에 기재된 핵산 서열을 가진 앱타머를 포함한다. 다른 실시양태에서, 표 11에 기재된 앱타머의 핵산 서열은 고분자량의 비-면역원성 화합물(예컨대, PEG)에의 화학적 커플링 및/또는 컨쥬게이션을 촉진하기 위한 3' 캡(예컨대, 3' 역 dT(3T)) 및/또는 5' 아민(NH2) 변형을 추가로 포함한다.
[표 11]
서열 번호 43 및 서열 번호 46에 따른 핵산 서열을 가진 클론의 절단물
서열 번호 97(ARC441)
UUCUGGGGACCCAUGGGGGAA
서열 번호 98(ARC442)
GUUCUGGGGACCCAUGGGGGAAC
서열 번호 99(ARC443)
AGUUCUGGGGACCCAUGGGGGAACU
서열 번호 100(ARC444)
GCCUGGGGACCCAUGGGGGGC
서열 번호 101(ARC445)
AGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCU
서열 번호 102(ARC446)
UAGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCUA
서열 번호 103(ARC447)
GCCUGGGGAACCAUGGGGGGC
실시예 2C : 도핑된 재선별( doped reselection ) : ARC445
도핑된 재선별은 활성 클론 또는 미니머 내에서의 서열 요건을 조사하기 위해 사용한다. 도핑된 재선별을 수행하는 도중, 단일 서열에 기초하여 고안한 합성 축퇴성(degenerate) 풀을 사용하여 선별을 수행한다. 축퇴 수준은 대개 야생형 뉴클레오티드의 70% 내지 85%로 다양하다. 일반적으로, 중립 돌연변이가 관찰되지만, 몇몇 경우에 있어서는 서열 변화로 인해 친화도가 개선될 수도 있다. 또한 복합 서열 정보를 사용하여, 최소 결합 모티브를 동정하고 앱타머 의약 화학적 연구에 도움을 줄 수 있다.
최소화된 h-IgE 결합 서열 ARC445(서열 번호 101)(실시예 2B에서 설명함)에 기초하는 도핑된 풀을 사용하는 선별은 친화도가 더 높은 결합제를 동정하기 위해 수행하였다. 상기 선별은 소수성 플레이트의 표면에 고정된 h-IgE에 대한 것으로서, 여러 장시간 세척 시간(예, 30분, 60분, 밤새)을 조합하는 것과 같은, 친화도가 더 높은 앱타머를 선별하기 위해 고안된 기법을 사용하였다.
풀 제조. 서열이 5'- GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGCCTGGGGACCCATGGGGGGCTGGTCG ATCGATCGATCATCGATG -3'(서열 번호 104)인 DNA 주형은 ABI EXPEDITETM DNA 합성장치를 사용하여 합성하고, 표준 방법으로 탈보호화시켰다. 진하게 표시되어 있는 뉴클레오티드는 표시된 잔기인 확률이 85%이고, 다른 3개의 뉴클레오티드 중 1개의 뉴클레오티드인 확률이 5%였다. 주형은 5' 프라이머 5'- GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC -3'(서열 번호 52) 및 3' 프라이머 5'- CATCGATGATCGATCGATCGACC -3'(서열 번호 105)을 사용하여 증폭시킨 뒤, T7 RNA 폴리머라제(Y639F)를 사용하는 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용하였다. 전사는 200 mM Hepes, 40 mM DTT, 2 mM 스퍼미딘, 0.01 % TritonX-100, 10% PEG-8000, 9.6 mM MgCl2, 2.9 mM MnCl2, 30 μM GTP, 2 mM mCTP, 2 mM mUTP, 2 mM dGTP, 2 mM dATP, 2 mM GMP, 2 mM 스퍼민, 0.01 유닛/㎕ 무기 피로포스파타제 및 T7 폴리머라제(Y639F)를 사용하여 수행하였다.
선별. 각 선별 순환은 100 ㎕ 1X 둘베코 PBS(DPBS) 중에서 1시간 동안 실온에서 Nunc Maxisorp 소수성 플레이트 표면에 h-IgE 20 pmole을 고정시켜 개시하였다. 그 뒤, 상청액을 제거하고, 웰은 120 ㎕ 1X 둘베코 PBS로 2회 세척하였다. 웰 은 100 ㎕ 차단 완충액(1X 둘베코 PBS, 0.1 ㎎/㎖ tRNA, 0.1 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA 및 0.1 ㎎/㎖ BSA)을 첨가하여 차단하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액은 제거하고, 웰은 120 ㎕ 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 2 순환을 시작할 때, 1시간 동안 비어있는(empty) 웰에 대한 음성 결합 항온처리, 및 BSA로 차단한 웰에 대한 음성 결합 항온처리를 RNA 풀에 대해 수행하였다. 양성 선별은 100 ㎕ 1X 둘베코 PBS 중의 풀 RNA 100 pmole을 표적 웰에 첨가하여 수행하였다. 0.1 ㎎/㎖ tRNA 및 0.1 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA도 양성 선별에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 뒤, 상청액을 제거하고, 하기 표 12에 약술되어 있는 바와 같이 웰은 120 ㎕ 세척 완충액(1X DPBS)으로 5회 세척하였다. 추가 선별은 3 순환 및 4 순환에서 선별된 풀을 분기시키는 방식으로 추가하였다. 이들은 더 오랜 시간 동안 세척하여, 선별 엄중도(stringency)를 증가시켰다.
RNA는 서열 번호 5에 따른 3' 프라이머 서열을 사용하여 65℃에서 30분간 부피가 100 ㎕인 반응물 중에서 ThermoScript RT-PCRTM 시스템(Invitrogen)을 사용하여 역전사시켰다. cDNA는, 제조업자의 권장에 따라 로딩하는 경우(DNA 질량 ∼48 ng)(New England Biolabs, Catalog # N3231L, Beverly, MA), 100 bp DNA 래더(ladder)의 100 bp 마커 레인에 대한 강도와 동일한 4% 아가로스 E-겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 상의 PCR 밴드를 얻기 위해 필요한 PCR 사이클 횟수로(표 12의 마지막 컬럼), PCR[20 mM Tris pH 8.4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.5 μM 5' 프라이머(서열 번호 52), 0.5 μM 3' 프라이머(서열 번호 105), dNTP 각각 0.5 mM, 0.05 유닛/㎕ Taq 폴리머라제(New England Biolabs)]에 의해 증폭시켰다. 그 뒤, PCR 생성물은 Centrisep Spin 컬럼(Princeton Separations)을 사용하여 탈염시켰다. 주형은 밤새 37℃에서 200 mM Hepes, 40 mM DTT, 2 mM 스퍼미딘, 0.01 % TritonX-100, 10% PEG-8000, 9.6 mM MgCl2, 2.9 mM MnCl2, 30 μM GTP, 2 mM mCTP, 2 mM mUTP, 2 mM dGTP, 2 mM dATP, 2 mM GMP, 2 mM 스퍼민, 0.01 유닛/㎕ 무기 피로포스파타제 및 T7 폴리머라제(Y639F)를 사용하여 전사시켰다. 후속 순환을 위한 RNA는 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하였다. 하기 표 12는 ARC445(서열 번호 101)에 대한 도핑된 재선별 프로파일을 요약한 것이다.
[표 12]
Figure 112006087103447-PCT00027
모두 세척 조건으로부터의 최종 선별 순환으로부터 얻은 DNA, 및 비엄중 선 별로부터의 2순화 및 3 순환으로부터 얻은 DNA는 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad CA)를 사용하여 클로닝하였다. 7개의 서열을 선별하여 합성하고, 상기 실시예 1B에 기재되어 있는 조건 및 도트 블롯 분석법을 사용하여 h-IgE에 대한 특이적인 결합을 시험하였다. 시험한 7개의 클론 중 어느 것도 h-IgE에 대한 유의적으로 결합하지 않았다. 하기 표 13에는 ARC445 도핑된 재선별로부터 얻은 클론의 서열이 기재되어 있다.
달리 언급하지 않는다면, 하기 열거되어 있는 각각의 서열은 5'에서 3' 방향으로 나타나 있고, dRmY SELEXTM 하에 선별하였으며, 여기서, 모든 퓨린(A 및 G)은 데옥시이고 모든 피리미딘(C 및 U)은 2'-O-메틸이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 하기 표 13에 기재되어 있는 바와 같은 핵산 서열을 가지는 앱타머를 포함한다. 다른 구체예에서, 하기 표 13에 기재되어 있는 앱타머의 핵산 서열은 고분자량의 비면역원성 화합물(예, PEG)에 대한 컨쥬게이션 및/또는 화학적 커플링이 용이해지도록 3' 캡[예, 3' 역 dT(3T)] 및/또는 5' 아민(NH2) 개질을 더 포함한다.
[표 13]
Figure 112006087103447-PCT00028
실시예 2D : DNA IgE 앱타머의 도핑된 재-선별
h-IgE 결합 서열 D17.4 5'- GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3'(서열 번호 113)에 기초하는 도핑된 풀을 사용하는 선별(본원에 그 전문이 참조 인용된 US 5,686,592)은 친화도가 더 높은 결합제를 동정하기 위해 수행하였다. 상기 선별은 소수성 플레이트의 표면에 고정된 h-IgE에 대한 것으로서, 여러 장시간 세척 시간(예, 30분, 60분, 밤새)을 조합하는 것과 같은, 친화도가 더 높은 앱타머를 선별하기 위해 고안된 기법을 사용하였다. 이 실험으로 h-IgE에 대한 친화도가 증가된 다수의 D17.4 유도체를 얻었다.
풀 제조. 서열이 5'- gatcccttgttcagtccGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGT GCCCCttaagccacaggactccaaa -3'(서열 번호 114)인 DNA 주형(ARC273)에 있어서, 프라이머 결합 부위는 소문자로 표시하였고, 진하게 표시되어 있는 뉴클레오티드는 표시된 잔기인 확률이 85%이고, 다른 3개의 뉴클레오티드 중 1개의 뉴클레오티드인 확률이 5%였다. 주형은 ABI EXPEDITETM DNA 합성장치 상에서 합성하고, 표준 방법으로 탈보호화시켰다. 풀은 표준 조건을 사용하여 5' 프라이머 5'- GATCCCTTGTTCAGTCCG -3'(서열 번호 115) 및 3' 프라이머 5'- GGAGTCCTGTGGCTTArA - 3'(서열 번호 116)[여기서, rA는 리보 아데노신을 나타내는 것으로서, 이는 PCR 후 프라이머를 절단하여 겔에 의해 주형과 풀 밴드를 분리할 수 있음]을 사용하여 증폭시켰다. 생성물은 알칼리 가수분해(200 mM NaOH, 90℃, 15분)시킨 뒤, 이소프로판올로 침전시켰다. 스트랜드는 8% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 이동성이 더 낮은 ssDNA 풀은 겔로부터 잘라내었다.
각 선별 순환은 100 ㎕ 선별 완충액(1X SCHMK; 실시예 1A 참조) 중에서 1시간 동안 실온에서 Nunc Maxisorp 소수성 플레이트의 표면에 h-IgE 20 pmole을 고정시켜 개시하였다. 그 뒤, 상청액을 제거하고, 웰은 120 ㎕ 세척 완충액(1X SCHMK, 0.2% BSA 및 0.5% Tween-20)으로 4회 세척하였다. 웰은 100 ㎕ 차단 완충액(1X SCHMK, 1% BSA 및 0.5% Tween-20)을 첨가하여 차단하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액은 제거하고, 웰은 120 ㎕ 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 1 순환에서는, 100 ㎕ 선별 완충액 중 풀 DNA 80 pmole(1.5×1013 독특한 분자)을 블랭크 웰에서 1시간 동안 실온에서 비특이적 결합제를 제거하기 위한 음성 선별 단계로서 인큐베이션하였다. 그 뒤, 상청액을 제거하고, 1X SCHMK 중 9.1 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA 12 ㎕를 첨가하고, 혼합물은 표적 단백질을 함유하고 있는 웰로 옮겼다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 상청액은 제거하고, 웰은 120 ㎕ 세척 완충액으로 수회 세척하였다. 하기 표 14에는 도핑된 재선별을 위한 선별 조건이 기재되어 있다.
[표 14]
Figure 112006087103447-PCT00029
모든 경우에서, 고정된 h-IgE에 결합된 풀 DNA는 고온의 용출 완충액(7 M 우레아, 100 mM NaOAc pH 5, 3 mM EDTA)의 2×150 ㎕ 세척액으로 용출시키고, 이소프로판올을 첨가하여 침전시킨 뒤, PCR로 증폭시켰다. 선별 1 순환 후 용출된 DNA는 증폭시키고, 초기 DNA 도핑된 풀 증폭을 위해 상술한 바와 같이 표준 방법을 사용하여 서열 번호 115 및 서열 번호 116에 따른 5' 및 3' 프라이머를 사용하여 정제하였다. 2 순환 내지 4 순환을 위해, 용출시킨 DNA는 서열 번호 115 및 5'-(5-비오틴-T)(5-비오틴-T)(5-비오틴-T)GGAGTCCTGTGGCTTAA- 3'(서열 번호 117)에 따른 5' 및 3' 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 그 뒤, PCR 생성물은 페놀로 추출하고, 에탄올로 침전시켰다. 이어서, DNA는 뉴트라비딘(Pierce, Rockford, IL) 300 pmole을 첨가한 1X SCHMK 완충액 5 ㎕ 내지 10 ㎕에 재현탁시키고, 30분간 실온에서 인큐베이션한 뒤, 포름아미드 로딩 염료(loading dye) 10 ㎕를 첨가하고, 8% 변성 폴리아 크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 비오틴-뉴트라비딘 복합체는 변성 내내 원상태를 유지하며(intact), 센스 DNA 스트랜드에 비해 안티-센스 DNA 스트랜드의 이동성을 상당히 감소시킨다. 따라서, 상기 스트랜드를 분리하고, 이동성이 더 높은 소정의 ssDNA 풀 멤버를 겔로부터 절단하여, 후속 선별 순환으로 전달하였다.
선별 3 순환 및 5 순환 후, 서열 번호 115에 따른 5' 및 3' 프라이머, 및 5'- GGAGTCCTGTGGCTTAA -3'(서열 번호 118)(완전히 비개질된 DNA임)을 사용하여 풀 주형을 재-증폭시키고, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 클로닝하였다. 84개의 개별 서열이 생성되었다. 각각의 클론은 프라이머 결합 서열 없이 제조하였으며, 상기 실시예 1A에 기재되어 있는 도트 블롯 분석법 구성과 조건을 사용하여 5 nM 및 50 nM에서 h-IgE 결합에 대해 스크리닝하였다. 상기 초기 스크리닝에서 서열 번호 125, 서열 번호 137 및 서열 번호 138에 따른 핵산 서열을 가진 3개의 클론은 h-IgE에 전혀 결합하지 않았다. h-IgE 적정(30 pM 내지 30 nM, 3배 희석)을 사용하여, 상기 초기 스크리닝에서 동정된 최적의 결합제에 대해 KDs를 측정하였다(표 15). 다수의 클론이 모(parent) 서열인 D17.4(서열 번호 113)에 대해 개선된 결합력을 보였다. 서열 번호 140에 따른 핵산 서열을 가지고 있는 클론은 모 서열 D17.4(서열 번호 113)에 비해 상당히 개선된 친화도를 보였다. 흥미롭게도, 서열 번호 140에 따른 핵산을 가지고 있는 클론과 클론 D17.4(서열 번호 113) 간의 차이점은 D17.4 앱타머(서열 번호 113)의 루프 영역에 바로 인접하고 있는 소정의 왓슨/크릭 스템에서만 상당히 미묘한 변화를 수반한다는 점이다. (서열 번호 140에 따른 핵산 서열을 가지고 있는 클론을 비롯하여) 재-선별로부터 얻은 거의 모든 독특한 클론은 D17.4의 G8-C30 염기쌍에서 돌연변이가 발생하여, G8-C30의 경우의 5'-스트랜드-카르보닐/3'-스트랜드-아미노로부터 A8-T30과 C-G30의 경우의 5'-스트랜드-아미노/3'-스트랜드 카르보닐에 이르는 염기쌍 위치에서 나선의 넓은 골(major groove)에 존재하는 작용기를 효과적으로 바꾸어 A8-T30 또는 C8-G30이 되었다. 그 뒤, 친화도가 가장 높은 클론(서열 번호 140에 따른 클론의 친화도는 제외)은 이들 자체의 루프 서열(잔기 9-29) 및 서열 번호 140에 따른 핵산 서열을 가지는 클론의 스템에 기초한 최적화된 스템 서열(잔기 1-8 및 30-37)을 가지도록 다시 고안하였다. C4-C34의 잘못된 염기쌍(mispairing)은 최적화된 서열 번호 140 스템에서 G4-C34으로 전환되었다. 하기 표 15는 선별된 DNA 앱타머의 뉴클레오티드 서열의 길이 및 친화도를 나타낸다. 하기 표 16은 선별된 DNA 앱타머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[표 15]
Figure 112006087103447-PCT00030
후술되는 DNA 앱타머에 대한 모든 뉴클레오티드(A, T, C 및 G)는 데옥시이다. 달리 언급하지 않는다면, 각각의 서열은 5'에서 3' 방향으로 표시하였다. 일부 구체예에서, 본 발명은 하기 표 16에 기재되어 있는 바와 같은 핵산 서열을 가지는 앱타머를 포함한다. 다른 구체예에서, 하기 표 16에 기재되어 있는 앱타머의 핵산 서열은 고분자량의 비면역원성 화합물(예, PEG)에 대한 컨쥬게이션 및/또는 화학적 커플링이 용이해지도록 3' 캡[예, 3' 역 dT(3T)] 및/또는 5' 아민(NH2) 개질을 더 포함한다.
[표 16]
Figure 112006087103447-PCT00031
Figure 112006087103447-PCT00032
실시예 2 : 증가된 혈장 안정성 및 증가된 시험관내 친화도에 대한 ARC445 의 앱타머 의약 화학
ARC445(서열 번호 101)의 매우 안정하고 효능이 있는 변이체는 앱타머 합성, 정제 및 결합 활성도 분석이라는 여러 단계를 수반하는 체계적인 합성 접근법을 사용하여 동정하였다. 2'-데옥시 보유 잔기의 2'-O 메틸 보유 잔기로의 체계적 치환과 같은 개질이 혈장 뉴클레아제 내성과 전체 안정도를 상당히 증가시키는 데 사용되는 기본적인 접근법이었다.
ARC445(서열 번호 101)를 유도하는 클론 스크리닝 및 최소화 과정 도중, 결합(상술한 도트-블롯 분석법에 의해 측정된 바와 같음), ELISA, FACS 및 히스타민 방출 분석법(하기 실시예 3에서 설명됨) 시 앱타머의 상대적 효능간에는 상당한 일치점이 존재하였다. 따라서, 상대적 효능의 지표로서 대부분의 시험 변이체를 도트-블롯 결합 분석 시 h-IgE 결합 친화도에 대해 시험하였다. KD 측정을 위해, 5' 말단이 γ-32P ATP로 표지된, 화학적으로 합성된 앱타머를 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하여 정제하고, 전체 인간 h-IgE에 대한 직접 결합에 대해 시험하였다. 8 포인트 단백질 적정은 실온에서 30분간 0.1 ㎎/㎖ BSA가 있는 둘베코 PBS(Mg++ 및 Ca++가 있음)에서 상술한 도트 블롯 결합 분석법({100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 0 pM} 또는 {10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 0 pM})에서 사용하였다. KD 값은 KaleidaGraph(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 사용하여 식 [y = (최대/(1+K/단백질))+yint]에 적합시켜 계산하였다. 단백질 결합 특성의 결과뿐 아니라, 합성하고, 정제하고, h-IgE에 의 결합에 대해 분석한 ARC445 유도체의 서열은 하기 표 17에 기재되어 있다.
데옥시 보유 잔기를 2'-O 메틸 보유 잔기로 치환하는 방법의 제1 단계는 ARC1250 - ARC1264(서열 번호 158 내지 172)를 합성하고 결합 활성을 분석하는 것으로서, 각각은 3'-역-dT(3T)를 부가하고 단일 2'-데옥시 잔기를 2'-O 메틸 잔기로 치환한 ARC445와 동등하다. 표 17의 결합 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 몇몇 위치는 데옥시 잔기의 2'-O 메틸 잔기로의 쉽게 일어나지만, 다른 위치는 그러하지 않다. 흥미롭게도, 2'-데옥시 잔기가 2'-O 메틸 잔기로 치환되면 10번 위치에서의 친화도가 상당히 개선된다(ARC1256)(서열 번호 164).
앱타머 의약 화학 방법의 단계 1로부터 얻은 구조 활성 관계(structure activity relationship : SAR)의 결과에 기초하여, 일련의 제2 앱타머를 고안하고, 합성하고, 정제한 뒤, h-IgE에 대한 결합을 시험하였다. 이들 분자 그리고 모든 후속 분자들에 대해, 추가 앱타머 고안 방법에서 사용되는 경우, 이들 분자들이 1 nM 이상의 친화도(KD)를 보유하도록 하였다. ARC1332-ARC1337(서열 번호 173-178)이 생성되는 단계 2에서는, 단계 1로부터 얻은 데이터를 사용하여 단지 2'-0 메틸 치환만을 사용하여 더 개질시킨 복합 분자를 고안하였다. 안정화 포스포로티오에이트 보유 결합의 부가도 시험하였다. 단순 결합 친화도라는 관점에서는 ARC1335(서열 번호 176)가 최선이었다.
앱타머 의약 화학 방법의 단계 3(ARC1382-ARC1384, 서열 번호 179 내지 181) 및 단계 4(ARC1572-1573, 서열 번호 182 내지 183)에서는, ARC1335(서열 번호 176) 중 추가 포스포로티오에이트 개질의 효과를 시험하였다. 이들 중 포스포로티오에이트의 중간 수(intermediate number)와 최대 친화도 사이의 균형이 최적일 것으로 보이는 분자는 ARC1384(서열 번호 181)였다(도 7 참조).
ARC445 및 이의 유도체를 합성하는 도중, ARC445의 다량체 응집체(multimeric aggregate)에 해당하는 것으로 보이는 피크가 이온 교환 HPLC에서 관찰되었다. 도 8은 앱타머 응집으로 인한 다중 피크를 나타내는 ARC445 및 여러 유도체의 HPLC 미량 분석의 한 예이다. ARC445는 6번 내지 9번 위치 및 16번 내지 21번 위치에서 2 런(run)의 구아노신 잔기를 보유한다. 이론에 구속되지 않는다면, 상기 런 중 하나 또는 둘 다는 앱타머 응집을 야기할 수 있다. 또한, 거의 동일한 방식으로, 브롬화에티듐 형광은 이중 RNA 및 DNA에 결합 시 증가하며, N-메틸메소포르피린 IX(NMM) 형광은 G-사량체 구조에 결합 시 증가한다는 점이 보고된 바 있다(Arthanari et al., Nucleic Acids Research, 26 (16): 3724(1996); Marathais et al., Nucleic Acids Research, 28 (9): 1969(2000); Joyce et al., Applied Spectroscopy, 58 (7): 831(2004)). 따라서, 도 9에 도시되어 있는 바와 같이, ARC445가 G-사량체 구조를 취하도록 본 발명자들은 NMM 형광을 사용하였다. 문헌에 기재된 프로토콜에 따라, 마그네슘과 칼슘을 함유하는 둘베코 PBS 중에 ∼ 1 마이크로몰 NMM 및 ∼2 마이크로몰 앱타머를 함유하는 반응물 100 ㎕는 SpectraMax Gemini XS 형광 플레이트 판독기를 사용하여 분석하였다. 형광 방출 스펙트럼은 550 nm 내지 750 nm의 파장에서 수집(collect)하고, 여기 파장은 405 nm에서 수집하였다. 항-트롬빈 DNA 앱타머 ARC183의 G-사량체 구조는 문헌 [Macaya et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 3745 (1993)]에서 이미 확정되어 있으므로, 상기 구조를 본 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다(도 10). 도 10에 나타나 있는 ARC1346은 G-사량체 구조를 가질 것이라 예측되지 않는 ARC445와 유사한 크기 및 뉴클레오티드 조성을 갖는 앱타머이므로, 본 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다(도 10). 도 9 및 도 10에 도시되어 있는 바와 같이, ARC183 및 ARC445는 단지 NMM만에 비해 NMM 형광에서 상당한 증가를 보였으나, 음성 대조군인 ARC1346은 그러하지 않았다.
NMM 형광 분석에서 dG의 dG 유사체로의 치환 및 "G-사량체" 시그널의 최소화에 대한 스크리닝 외에, dG 유사체가 h-IgE에 대한 친화도와 이에 따른 효능을 개선시키는지의 여부를 시험하기 위해, 상술한 도트 블롯 분석법 및 결합 반응 조건[둘베코 PBS(Ca++ 및 Mg++가 있음) + 0.1 ㎎/㎖ BSA, 30분간 실온]을 사용하여 결합에 대해 앱타머를 스크리닝하였다. 시험한 제1 유사체는 데옥시-7-데아자 G였다. 탄소로 치환된 퓨린 염기 상의 7번 위치의 질소와 함께, G-사량체 중 G:G 쌍에 대해 요구되는 수소 결합 수용체(acceptor)는 효과적으로 제거한다. 단계 5.1(서열 번호 184 내지 210)에서는, ARC445 중 각각의 개별 G를 7-데아자 G로 치환한다. 도 8 및 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 18번 내지 20번 위치(ARC909-911, 서열 번호 191 내지 193)에서의 G N-7의 제거는 HPLC 및 NMM 형광에 의해 관찰되는 앱타머 응집을 완전하게 제거하였다. 그러나, 도 11에 도시되어 있는 결합 곡선에 의해 입증되는 바와 같이, 상기 치환은 h-IgE에 대한 결합을 완전하게 제거한다(하기 표 17에 기재되어 있는 KD 값을 또한 참조). ARC912(서열 번호 194)는 HPLC에서 응집이 상당히 감소하며, h-IgE에 대한 결합을 다소 유지하였다. ARC912(서열 번호 194)에 대한 결합 결과 및 HPLC에 기초하여, 다량체 응집을 감소시키기 위해, 21번 위치에서 dG를 보유하지 않는 또다른 왓슨/크릭 염기쌍에 대해 3:21 위치의 mC:dG 쌍을 치환시켰다. 이를 ARC1244-ARC1249(서열 번호 195 내지 200)에서 수행하였으나, ARC445(서열 번호 101)와 유사한 친화도를 보이는 앱타머를 전혀 얻을 수 없었기 때문에, ARC445의 개질을 위한 옵션이 된다.
어떠한 이론에도 구속되지 않는다면, dG의 7-데아자-G로의 치환은, 응집 현상을 일으킬 수 있는 16번 내지 21번 위치의 더 긴 G-런, 및 앱타머의 기능적 폴딩을 촉진하는, 앱타머 자체에서 다른 잔기와의 상호작용을 통해 또는 직접 수소 결합 상호작용을 통해 h-IgE에 결합하기 위한, 시험한 잔기 중 다수가 높은 친화도를 필요로 하는 N-7 위치에서 일어날 것이다.
앱타머 의약 화학 방법의 단계 5.2에서(서열 번호 201 내지 211), dG는 ARC1335(서열 번호 176)에 있어서 데옥시 이노신으로 치환되었다. 데옥시 이노신에는 데옥시 구아노신에서 발견되는 엑소시클릭 아민이 없기 때문에, N7 수소 결합에 대한 단일 아미노는 각각의 dG에 대한 잠재적 G-사량체로부터 dI 치환으로 제거된다. ARC 1548, 1552 내지 1555, 및 1562 내지 1567(서열 번호 각각 201 내지 210)에 대한 결합 분석에서, dG로부터 7-데아자-G 치환으로 거의 완전히 역전된 dI 치환에 대해 dG에 대한 SAR 관계가 드러났다. dI 시리즈에서는, 6번 내지 9번 위치에서 치환이 일어나지 않았으나, 16번 내지 21번 위치에서는 치환이 잘 일어나거나 어느 정도 일어났다.
단계 5.2로부터 얻은 결과로 ARC1384에서의 dI 치환에 대해 여러 dG를 보유하고 있는 복합 분자를 고안하였다. 단계 5.3(서열 번호 212 내지 219)으로부터 얻은 결과로는, ARC445(서열 번호 101) 및 ARC1384(서열 번호 181)에 대해 친화도가 상당히 개선된 다수의 앱타머를 수득하였다. 예를 들어, ARC1666(서열 번호 216)은 도 12에 도시되어 있는 바와 같이 NMM 형광으로 분석했을 때 G-사량체의 형성이 상당히 감소되었음이 드러났다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 하기 표 17에 기재되어 있는 핵산 서열을 가진 앱타머를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 하기 표 17에 기재되어 있는 앱타머의 핵산 서열은 고분자량의 비면역원성 화합물(예, PEG)에 대한 컨쥬게이션 및/또는 화학적 커플링이 용이해지도록 3' 캡[예, 역 dT 캡(3T)] 및/또는 5' 아민(NH2) 개질을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 하기 표 17에 기재되어 있는 핵산 서열에는 표시된 3' 캡[예, 3' 역 dT 캡(3T)]은 없다. 소문자 "f", "m" 및 "d"는 2-플루오로, 2-O-메틸 및 데옥시 개질을 각각 나타내고, "s"는 인터뉴클레오티드 포스포로티오에이트 치환을 나타내며, "I"는 구아노신에 대한 이노신 치환을 나타낸다.
[표 17]
Figure 112006087103447-PCT00033
Figure 112006087103447-PCT00034
Figure 112006087103447-PCT00035
Figure 112006087103447-PCT00036
실시예 2F : ARC656 앱타머 의약 화학
매우 안정하고 효능이 있는 ARC656(서열 번호 157)(실시예 2D에 기재되어 있음)의 변이체는 앱타머 합성, 정제 및 결합 활성도 분석이라는 여러 단계를 수반하는 체계적인 합성 접근법을 사용하여 동정하였다. 2'-데옥시 보유 잔기의 2'-O 메틸 보유 잔기로의 체계적 치환이 혈장 뉴클레아제 내성 및 전체 안정성을 상당히 증가시키는 데 사용되는 기본적인 접근법이다.
ARC656(서열 번호 157)을 유도하는 클론 스크리닝 및 최소화 과정을 수행하는 도중, 결합(상술한 도트-블롯 분석법에 의해 측정한 바와 같음), ELISA, FACS 및 히스타민 방출 분석(하기 실시예 3에 기재되어 있음) 시 상대적인 앱타머 효능 간에는 상당한 일치점이 존재하였다. 따라서, 합성한 대부분의 앱타머에 대한 상대적 효능을 특징짓고자, 도트-블롯 결합 분석 시 측정한 h-IgE에 대한 시험 변이체 결합 친화도를 사용하였다. KD 측정을 위해, 5' 말단이 γ-32P ATP로 표지된, 화학적으로 합성된 앱타머를 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하여 정제하 고, 전체 인간 IgE에 대한 직접 결합에 대해 시험하였다. 8 포인트 단백질 적정은 0.1 ㎎/㎖ BSA가 있는 둘베코 PBS(Mg++ 및 Ca++가 있음)에서 상술한 도트 블롯 결합 분석법{30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 0 pM}에서 사용하였다. KD 값은 KaleidaGraph(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 사용하여 식 [y = (최대/(1+K/단백질))+yint]에 적합시켜 계산하였다. 단백질 결합 특성의 결과뿐 아니라, 합성하고, 정제하고, h-IgE의 결합에 대해 분석한 ARC656 유도체의 서열은 하기 표 18에 기재되어 있다.
데옥시 보유 잔기를 2'-O 메틸 보유 잔기로 치환하는 방법의 제1 단계는 ARC1265 - ARC1306(서열 번호 220 내지 261)을 합성하고, 이의 결합 활성을 분석하는 것으로서, 각각은 단일 2'-데옥시 잔기가 2'-O 메틸 잔기로 치환된 ARC656과 동등하다. 하기 표 18의 결합 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 몇몇 위치는 데옥시 잔기의 2'-O 메틸 잔기로의 치환이 쉽게 일어나지만, 다른 위치는 그러하지 않다. 제시된 ARC656의 스템 영역에서는 데옥시 보유 잔기가 2'-O 메틸 잔기로 치환되지 않는다. 또한, 단계 1은 앱타머의 스템 영역에서 데옥시의 2'-O 메틸로의 치환을 일부 차단하는 것을 포함한다.
앱타머 의약 화학 방법의 단계 1로부터 얻은 구조 활성 관계(SAR) 결과에 기초하여, 일련의 제2 앱타머를 고안하고, 합성하고, 정제한 뒤, h-IgE에 대한 결합을 시험하였다. 이들 안정화 포스포로티오에이트 보유 결합[ARC1391(서열 번호 266) 및 ARC1417(서열 번호 292)]의 부가도 시험하였다. 단순 결합 친화도라는 관 점에서는 ARC1410(서열 번호 285)이 최선이었다. 시험한 컨스트럭트 중 다수가 h-IgE에 대해 상대적으로 높은 친화도를 보유한다는 점은 명백하지만, 이들 중 몇몇은 모 화합물인 ARC656(서열 번호 157)과 동등한 친화도를 나타내지 않았다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 하기 표 18에 기재되어 있는 바와 같은 핵산 서열을 가진 앱타머를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 하기 표 18에 기재되어 있는 앱타머의 핵산 서열은 고분자량의 비면역원성 화합물(예, PEG)에 대한 컨쥬게이션 및/또는 화학적 커플링이 용이해지도록 3' 캡[예, 역 dT 캡(3T)] 및/또는 5' 아민( NH2) 개질을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 하기 표 18에 기재되어 있는 핵산 서열에는 표시된 3' 캡[예, 3' 역 dT 캡(3T)]이 없다. 뉴클레오티드 약자인 A, C, G 또는 T 앞에 있는 소문자 "f", "m" 및 "d"는 2'-플루오로, 2-O-메틸 및 데옥시 개질을 각각 나타내고, "s"는 인터뉴클레오티드 포스포로티오에이트 치환을 나타낸다.
[표 18]
Figure 112006087103447-PCT00037
Figure 112006087103447-PCT00038
Figure 112006087103447-PCT00039
Figure 112006087103447-PCT00040
Figure 112006087103447-PCT00041
실시예 2G : 앱타머 -5'- PEG 컨쥬게이트의 합성
올리고뉴클레오티드 5' NH2 mA mG mC mC mU dG mG dG-s-dG mA mC mC mC mA mU-s-dI-s-mG dI-s-dG dI-s-dG mC mU - idT 3'(ARC 1666, 서열 번호 216)은 시판되고 있는 표준 2'-OMe RNA, 데옥시이노신 및 DNA 포스포라미디트(Glen Research, Sterling, VA) 및 역-데옥시티미딘 CPG 지지체를 사용하여, 제조업자의 권장에 따라 AKTA OligoPilot 100 합성장치(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 상에서 합성하였다. 말단 아민 작용기는 5'-아미노-개질제(modifier) C6-TFA(Glen Research, Sterling, VA)와 부착시켰다. 탈보호화를 수행한 후, 올리고뉴클레오티드는 Super Q 5PW (30) 수지(Tosoh Biosciences) 상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한 뒤, 에탄올 침전시켰다.
5'-아미노-개질된 앱타머의 분취액은 합성 후 상이한 PEG 잔기(예, 40 kDa, 60 kDa PEG 잔기)에 컨쥬게이션시켰다. 앱타머는 농도가 1.5 mM 내지 3 mM인 물 /DMSO(1:1) 용액에 용해시켰다. pH가 8.5인 탄산나트륨 완충액을 첨가하여 최종 농도가 100 mM이 되도록 하였고, 올리고는 등부피의 아세토니트릴에 용해시킨, 1.7배 내지 3배 몰 과량의 소정의 PEG 제제(예, 40 kDa Sunbright GL2-400NP p-니트로페닐 카르보네이트 에스테르[NOF Corp, Japan], 40 kDa 또는 60 kDa mPEG2-NHS 에스테르[Nektar, Huntsville AL])와 밤새 반응시켰다. 생성된 40 kDa 또는 60 kDa PEG화 생성물은 Super Q 5PW (30) 수지(Tosoh Biosciences) 상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, Amberchrom CG300-S 수지(Rohm and Haas) 상에서 수행하는 역상 크로마토그래피를 사용하여 탈염시킨 뒤, 동결건조시켰다.
생성된 PEG화 앱타머 서열은 하기 표 19에 열거되어 있다. 소문자 "f", "m" 및 "d"는 각각 2'-플루오로, 2-O-메틸 및 데옥시 개질을 나타내고, "s"는 인터뉴클레오티드 포스포로티오에이트 치환을 나타내고, "I"는 구아노신에 대한 이노신 치환을 나타내고, "NH"는 화학적 커플링을 용이하게 하기 위한 아민을 나타내며, "3T"는 3' 역 dT를 나타낸다.
[표 19]
Figure 112006087103447-PCT00042
5' PEG화는 하기 실시예 3에 기재되어 있는 세포계 분석에 의해 측정했을 때 앱타머 기능에 거의 영향을 미치지 않았다.
실시예 2H : 앱타머 -3'-5'- PEG 컨쥬게이트의 합성
올리고뉴클레오티드 5' NH2 mA mG mC mC mU dG mG dG-s-dG mA mC mC mC mA mU-s-dI-s-mG dI-s-dG dI-s-dG mC mU-NH2 3'(ARC 1784, 서열 번호 297)은 시판되고 있는 표준 2'-OMe RNA, 데옥시이노신 및 DNA 포스포라미디트(Glen Research, Sterling, VA) 및 3'-프탈이미드-아미노-개질제 C6 CPG 지지체(Glen Research, Sterling, VA)를 사용하여, 제조업자의 권장에 따라 AKTA OligoPilot 100 합성 장치(GE Healthcare Uppsala, Sweden) 상에서 합성하였다. 말단 아민 작용기는 5'-아미노-개질제 C6-TFA(Glen Research, Sterling, VA)와 부착시켰다. 탈보호화를 수행한 후, 올리고뉴클레오티드는 Super Q 5PW (30) 수지(Tosoh Biosciences) 상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한 뒤, 에탄올 침전시켰다.
3'-5'-디아민-개질된 앱타머의 분취액은 합성 후 상이한 PEG 잔기(예, 20 kDa 및 30 kDa PEG 잔기)에 컨쥬게이션시켰다. 앱타머는 농도가 1.5 mM 내지 3 mM인 물/DMSO(1:1) 용액에 용해시켰다. pH가 8.5인 탄산나트륨 완충액을 첨가하여 최종 농도가 100 mM이 되도록 하였고, 올리고는 등부피의 아세토니트릴에 용해시킨, 2.7배 내지 3.5배 몰 과량의 소정의 PET 제제(예, 20 kDa 또는 30 kDa Sunbright GL2-400NP n-니트로페닐 카르보네이트 에스테르[NOF Corp, Japan])와 밤새 반응시켰다. 생성된 2×20 kDa 또는 2×30 kDa PEG화 생성물은 Super Q 5PW (30) 수지(Tosoh Biosciences) 상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, Amberchrom CG300-S 수지(Rohm and Haas) 상에서 수행하는 역상 크로마토그래피를 사용하여 탈염시킨 뒤, 동결건조시켰다.
생성된 비(bi)-PEG화 앱타머 서열은 하기 표 20에 열거되어 있다. 소문자 "f", "m" 및 "d"는 각각 2'-플루오로, 2-O-메틸 및 데옥시 개질을 나타내고, "s"는 인터뉴클레오티드 포스포로티오에이트 치환을 나타내고, "I"는 구아노신에 대한 이노신 치환을 나타내며, "NH"는 화학적 커플링을 용이하게 하기 위한 아민을 나타낸다.
[표 20]
Figure 112006087103447-PCT00043
3'-5' PEG화는 하기 실시예 3에 기재되어 있는 세포계 분석에 의해 측정했을 때 앱타머 기능에 거의 영향을 미치지 않았다.
실시예 3 : 기능적 세포 분석
실시예 3A : 수용체( Fc ε R1 ) 결합 억제 ELISA
(상기 실시예 1A에서 설명한) rRfY IgE 앱타머 패널은 ELISA 분석을 사용하여 h-IgE 및 가용성 단량체 FcεR1α(인-하우스 정제됨) 간의 복합체 형성을 억제할 수 있는지에 대해 시험하였다. 1X PBS 중 FcεR1(100 ㎕, 10 ㎍/㎖)은 웰의 표면을 코팅하기 위해 밤새 4℃에서 Nunc Maxisorb 96-웰 플레이트의 웰에서 인큐베이션하였다. 상청액은 제거하고, 웰은 120 ㎕ 1X PBS로 3회 세척한 뒤, 2시간 동안 4℃에서 1X PBS + 0.2% Tween-20 300 ㎖로 차단시켰다. 차단 후, 웰은 1X PBS로 3회 세 척하였다. 다양한 농도의 앱타머는 30분간 실온에서 PBS + 0.05% Tween-20 100 ㎕ 중에서 0.5 nM h-IgE와 인큐베이션한 뒤, 혼합물을 분석 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 뒤, 웰은 1X PBS 120 ㎕로 5회 세척하였다. 결합되어 있는 h-IgE는 HRP-표지된 안티-h-IgE 폴리클로날 항체[고우트(goat) 안티-인간 IgE-HRP(074-1004)(KPL, Gaithersburg, MD)]를 첨가하여 검출하였다. 퀀타블루(Quantablue) 기질(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여, 퍼옥시다제 활성을 검출하였다. 퀀타블루 기질 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하여, 15분간 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 소정의 스톱(stop) 용액 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트는 각각 325 nm 및 420 nm의 여기/방출에서 SpectraMax 96-웰 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 각 웰에 대한 상대적 형광 단위(RFU)를 사용하여 IC50을 계산하였다. 하기 표 21에는 rRfY 선별로부터 얻은 다양한 앱타머를 이용한 FcεR1α 수용체 억제에 대해 계산한 IC50이 기재되어 있다.
[표 21]
Figure 112006087103447-PCT00044
실시예 3B : FACS 에 의한 수용체( Fc ε R1 ) 결합 억제
rRfY, dRmY 및 DNA 조성을 나타내는 앱타머의 패널은 래트 호염기성 백혈 병(RBL) 세포의 표면 상에서 발현되는 FcεR1에 대한 h-IgE 결합을 억제할 수 있는지에 대해 시험하였다. h-IgE 수용체의 인간 α, β 및 γ 쇄를 안정하게 발현하는 RBL 세포주인 SX38 세포(Harvard University, Cambridge, MA)는 유세포 분석으로 h-IgE 결합 분석 시 사용하였다. 세포는 5% CO2, 37℃에서 16% 우태혈청(FBS)이 있는 EMEM(Eagle's Minimal Essential Medium) 및 G418(Invitrogen) 1 ㎎/㎖에서 배양하였다. 0.03% NaAzide(FAC 완충액)(VWR, West Chester, PA) 및 1% BSA(Sigma, St. Louis, MO)가 있는 1X DPBS 중 100만 SX38 세포는 96-웰 플레이트에서 적절한 수의 웰에 나누어 넣고, 30분간 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 각각의 앱타머 농도에 대해, 앱타머 + h-IgE(Athens Research and Technology, Athens, GA)의 2X 혼합물은 30분간 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 앱타머 및 h-IgE 혼합물은 SX38 세포에 첨가하여, 최종 1X 농도를 얻었으며, 추가 30분간 더 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 0 μM 내지 1 μM 범위의 최종 앱타머 농도는 3 ㎍/㎖ h-IgE(15 nM)에 대해 스크리닝하였다. 그 뒤, 세포는 FAC 완충액으로 3회 세척하여, 수용체에 결합하지 않은 임의의 h-IgE를 제거하였다. h-IgE 결합을 검출하기 위해, 안티-h-IgE-FITC 항체(QED Biosciences, San Diego, CA)를 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포는 FAC 완충액으로 3회 세척하여, 임의의 미결합 항체를 제거하였다. 세포는 FAC 완충액에 재현탁시키고, FACSCAN(BD Biosciences, San Jose, CA)을 사용하여 분석하였다. h-IgE만, 그리고 나이브(naive) 풀에 대한 h-IgE를 양성 및 음성 대조군으로서 각각 포함시켰다. h-IgE 앱타머 활성은 세포에 대한 h-IgE 결합의 억제율(%)로 측정하였다. 평균 형광 강도 값은 억제율을 계산하는 데 사용하였다. 하기 표 22에는 다양한 FACS 분석으로 계산한, 선별된 다양한 rRfY, dRmY 및 DNA에 대한 IC50이 기재되어 있다.
[표 22]
Figure 112006087103447-PCT00045
ARC656(서열 번호 157)(실시예 2D에 기재되어 있음)뿐 아니라 ARC445(서열 번호 101)(실시예 2E에 기재되어 있음)의 개질된 유도체 중 다수는 다음과 같은 변 형을 가하여 상술한 FACS 분석법을 사용하여 h-IgE 수용체(FcεR1) 결합 억제에 대해 시험하였다: 각각의 앱타머 농도에 대해, 앱타머 + h-IgE(Athens Research and Technology, Athens, GA)의 2X 혼합물을 30분간 얼음 상에서 인큐베이션하는 단계; 앱타머 및 h-IgE 혼합물을 SX38 세포에 첨가하여 최종 1X 농도를 얻고, 2시간 동안 더 얼음 상에서 인큐베이션하는 단계; 및 0 μM 내지 1 μM 범위의 최종 앱타머 농도를 0.5 ㎍/㎖ h-IgE(2.5 nM)에 대해 스크리닝하는 단계. 계산한 IC50 값은 하기 표 23에 요약되어 있다.
[표 23]
Figure 112006087103447-PCT00046
실시예 2G 및 2H에 기재되어 있는 PET-컨쥬게이트된 앱타머는 상술한 조건 하에서의 FACS 분석에서 모두 활성이었다. 계산한 IC50 값은 하기 표 24에 요약되어 있다. 표 24의 데이터로부터 알 수 있듯이, 다양한 형태의 PEG 컨쥬게이션은 앱타머 기능에 거의 영향을 미치지 않았다.
[표 24]
Figure 112006087103447-PCT00047
실시예 3C : 사이노몰거스 원숭이( cynomolgous monkey ) IgE 와 앱타머 교차 반응성
앱타머는 ELISA 분석법을 사용하여 사이노몰거스 원숭이 IgE와 FcεR1α-Fc 간의 복합체 형성을 억제할 수 있는지에 대해 시험하였다. PBS 중 FcεR1α-Fc(100 ㎖, 5 ㎍/㎖)는 웰 표면을 코팅하기 위해 밤새 4℃에서 Nunc Maxisorb 96-웰 플레이트의 웰에서 인큐베이션시켰다. 상청액은 제거하고, 웰은 1X PBS 120 ㎕로 3회 세척한 뒤, 2시간 동안 4℃에서 PBS + 0.2% Tween-20 300 ㎕로 차단시켰다. 웰은 1X PBS 120 ㎕로 3회 세척하였다. 그 뒤 다양한 농도의 앱타머를 30분간 실온에서 PBS 100 ㎕ [또는 10%로 희석시킨 사이노몰거스 원숭이 혈청(Sigma)] 중에서 0.5 ng h-IgE와 인큐베이션한 뒤, 혼합물을 분석 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 뒤, 웰은 PBS 120 ㎕로 5회 세척하였다. 결합된 IgE(원숭이 및 인간 모두)는 HRP-표지된 안티-IgE 폴리클로날 항체[고우트 안티-인간 IgE-HRP(074-1004)(KPL, Gaithersburg, MD)]를 첨가하여 검출하였다. 퀀타블루 기질(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 퍼옥시다제 활성을 검출하였다. 퀀타블루 기질 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 그 뒤, 소정의 스톱 용액 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트는 각각 325 nm 및 420 nm의 여기/방출 파장에서 SpectraMax 96-웰 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 각 웰의 상대적 형광 단위(RFU)를 IC50을 계산하는 데 사용하였다.
각각 최대 농도 250 nM 및 1 μM에서, 서열 번호 149(3' 역 데옥시 티미딘 보유) 및 서열 번호 151(3' 역 데옥시 티미딘 보유)에 따른 핵산 서열을 보유하는 DNA 앱타머, 또는 서열 번호 90 및 서열 번호 93에 따른 핵산 서열을 보유하는 rRfY 앱타머가 존재하면 FcεR1-Fc에 대한 원숭이 결합이 억제되지만, dRmY 앱타머 ARC445(서열 번호 101) 및 ARC1666(서열 번호 216)은 상호작용을 차단하는 데 상당히 효과적인데(ARC445, IC50원숭이 = 161 nM; IC50인간 = 63 nM; ARC 1666, IC50원숭이 = 8 nM; IC50인간 = 5 nM), 이는 상기 분자가 사이노몰구스 원숭이 IgE 및 인간 IgE와 교차 반응성을 띤다는 점을 나타낸다. 추가 대조 실험에서, ARC445가 상기 분석 포맷에서 원숭이 IgE의 검출을 억제하지 않았음이 드러났다.
도 13은 FACS에 의한 IgE:FcεR1 결합 억제 시 높은 효능을 나타내는 rRfY, dRmY 및 DNA 최소화된 앱타머에 대한 가능한 2차 구조를 나타낸 것이다. 왼쪽: 서 열 번호 91(rRfY), 약술한 잔기는 2'-F임; 중간: ARC445(서열 번호 101)(dRmY), 밑줄 친 잔기는 2'-데옥시이고, 약술한 잔기는 2'-OMe임; 오른쪽: ARC475(서열 번호 151)(DNA), 약술한 잔기는 2'-데옥시임.
실시예 3D : 히스타민 방출의 억제
IgE 앱타머 세포계 활성은 h-IgE 수용체의 인간 α, β 및 γ 쇄를 안정하게 발현하는 RBL 세포주인 SX38 세포(Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA)를 사용하는 히스타민 방출 분석법을 사용하여 측정하였다. h-IgE 및 안티-h-IgE 가교 결합 항체의 존재 하에 SX38 세포의 상청액은 앱타머 차단된 세포보다 더 많은 히스타민을 보유하고 있기 때문에, 경쟁적(competitive) 히스타민 ELISA(Immuno-Biological Laboratories, Minneapolis, MN)를 사용하여 h-IgE 및 h-IgE 가교 결합 항체 +/- IgE 앱타머로 처리한 SX38 세포의 상청액으로 방출된 히스타민의 수준을 정량화하였다.
실험 하루 전, 1-웰 당 200,000개의 SX38 세포를 MEM + 16% FBS가 있는 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음 날, 적절한 농도의 앱타머(1 μM로 시작하는 2-배 연속 희석의 8 포인트 적정) + h-IgE(Athens Research and Technology, Athens, GA) 3 ug/㎖을 MEM + 16% FBS에서 30분간 함께 인큐베이션하였다. 그 뒤, 혼합물은 SX38 세포에 첨가하고, 30분간 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 농도는 4번 시험하였다. 세포는 MEM + 16% FBS로 3회 세척한 뒤, MEM + 16% FBS에서 5.5시간 동안 더 인큐베이션하였다. h-IgE 가교-결합 항체(QED Biosciences, San Diego, CA)는 1 ug/㎖ 농도로 세포 상으로 배지에 첨가하고, 2시간 동안 더 인큐베이션하였다. 상청액은 수거하고, 히스타민 ELISA에서 사용할 때까지 -20℃에서 냉동시켰다. 히스타민 ELISA는 제조업자 권장에 따라 사용하였다. h-IgE만, 그리고 나이브 풀에 대한 h-IgE를 각각 양성 및 음성 대조군으로서 포함시켰다. IgE 앱타머 활성은 도 14에 도시되어 있는 바와 같이 상청액으로의 히스타민 방출의 억제율(%)로 측정하였다(여기서, ARC445는 서열 번호 101이고, ARC656은 서열 번호 157이며, ARC714는 비결합 음성 대조군임).
DNA 앱타머, ARC656(서열 번호 157)(실시예 2D에 기재되어 있음)과 함께, ARC445(서열 번호 101)(실시예 2E에 기재되어 있음)의 여러 개질된 유도체도 상술한 SX38 세포에서 히스타민 방출을 억제할 수 있는지에 대해 시험하였다. 시험한 ARC445 유도체에 대해 계산한 IC50 값은 하기 표 25에 요약되어 있다.
[표 25]
Figure 112006087103447-PCT00048
실시예 4 : PK 연구
실시예 4에서, 모든 질량 기준의 농도 데이터는 PEG 컨쥬게이션에 의한 질량에 상관없이 앱타머의 올리고뉴클레오티드부의 분자량만을 언급하는 것이다.
실시예 4A : 안티 - IgE 컨쥬게이션의 혈장 안정성
앱타머 의약 화학 방법으로 동정한 앱타머의 서브세트(subset)는 인간 혈장 및 래트 혈장에서 뉴클레아제 안정성에 대해 분석하였다. 혈장 뉴클레아제 분해는 후술되는 바와 같이 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정하였다. 요컨대, 혈장 안정성을 측정하기 위해, 5' 말단이 γ-32P ATP로 표지된 화학적으로 합성된 앱타머를 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하여 정제한 뒤, 겔 정제시켰다. 미량의 32-P 표지된 앱타머는 결합 반응액 200 ㎕ 중 95% 인간 혈장(또는 95% 래트 혈장)에서 비표지 앱타머 100 nM의 존재 하에 인큐베이션하였다. 시점 0에 대한 반응물은 동일한 성분으로 별도 제조하였으나, 혈장을 PBS로 대체하였다. 이는 겔 상에 로딩된 방사선의 양이 전 실험을 통해 일정하게 한다. 달리 명시하지 않는다면, 반응물은 1시간, 3시간, 10시간, 30시간 및 100시간 동안 열순환기(thermocycler)에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 시점에서, 반응물 20 ㎕를 제거하고, 포름아미드 로딩 염료 200 ㎕와 합한 뒤, 액체 질소에서 급속 동결시키고, -20℃에서 저장하였다. 마지막 시점 이후, 동결시킨 샘플을 해동시키고, 각각의 시점에서 20 ㎕를 제거하였다. 그 뒤, 최종 농도 0.1%가 되도록 소량의 샘플에 SDS를 첨가하였다. 이어서, 상기 샘플은 10분 내지 15분간 90℃에서 인큐베이션 하고, 15% 변성 PAGE 겔 상으로 직접 로딩한 뒤, 35분간 12 W에서 러닝(running)시켰다. 겔 상에 존재하는 방사선은 Storm 860 phosphoroimager 시스템(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 사용하여 정량화하였다. 각 시점에서의 전장 앱타머 비율(%)은 전장 앱타머 밴드를 정량화하고, 레인 중의 총 카운트로 나누어 계산하였다. 그 뒤, 각 시점에서의 전장 앱타머의 분율을 0시간 시점의 전장 앱타머 비율(%)로 정규화시켰다. 시간 함수로서의 전장 앱타머의 분율을 다음의 식에 적합시켰다:
m1*e^(-m2*m0)
상기 식에서,
m1은 최대 전장 앱타머 비율(%)(m1 = 100)이고; m2는 분해 속도이다.
앱타머 반감기(T1 /2)는 (ln2)/m2와 같다.
샘플 데이터는 도 15a 및 도 15b에 나타나 있고, 시험한 앱타머의 결과는 하기 표 26에 요약되어 있다. 예측한 바와 같이, 앱타머는 래트 혈장에서보다 인간 혈장에서 더 안정하며, 당-포스페이트 백본에 대한 안정화 개질의 수 증가는 혈장 안정성의 증가와 관련이 있다.
[표 26]
Figure 112006087103447-PCT00049
실시예 4B : PEG 화에 대한 안티 - IgE 앱타머의 약물동력학 : 10 mg / kg 으로 마우스에 정맥내( IV ) 투여 후의 ARC1785 , ARC1787 , ARC1788 및 ARC1790
정맥내(IV) 투여를 통한 ARC1785, ARC1787, ARC1788 및 ARC1790의 뮤린(murine) 약물동력학적 연구 고안은 도 16에 나타나 있다. 요컨대, 본 연구는 3개의 그룹으로 이루어졌다(동물 수 = 총 33마리). 각각의 샘플 수거 시점에서, 3마리의 동물을 최종 희생시키고, 혈장 수거를 위해 심장 천자(cardiac puncture)를 통해 전혈 0.5 ㎖를 모았다. 앱타머는 표준 0.9% 염수 중에서 최종 농도가 10 ㎎/㎖(올리고 중량)가 되도록 동결건조시킨 분말을 주사용으로 제제화시키고, 이를 투여하기 전 멸균-여과시켰다(0.2 ㎛). 사용된 투여 경로는 투여량 10 mg/kg의 단일 정맥내 볼루스(bolus) 주사였다. 소정의 시점, 즉 t = 투여 전, 0.08시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간, 32시간, 48시간 및 72시간에서, 전혈 샘플을 수득하고, K2EDTA-코팅된 튜브로 직접 옮기고, 역 혼합시킨 뒤, 웨트(wet) 얼음 상에 두었다.
혈장은 5분간 3,500 rpm에서 혈액-EDTA 튜브를 원심분리시켜 수거하였다. 혈장 샘플은 새 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고, 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 앱타머 농도에 대한 혈장 샘플의 분석은, 시판되고 있는 형광 핵산 검출 제제 OligreenTM(Molecular Probes, Eugene, OR)이 함유된 분석 웰에 혈장 분취액을 직접 첨가하여 사용하는, 균일한 분석 포맷을 사용하여 수행하였다. 실온에서 간단히 5분간 인큐베이션한 후, 빛으로부터 보호한 분석 플레이트를 형광 플레이트 판독기로 판독하였다. 각각의 웰로부터 얻은 형광 시그널은 웰 내에 존재하는 앱타머 농도에 비례하며, 샘플 농도는 형광-농도 표준 곡선(이중 곡선으로부터 얻은 평균값)으로부터 형광값을 내삽하여 계산하였다. 평균 혈장 농도는 각각의 시점에서 각 그룹의 동물 3마리로부터 얻었으며, 도 17에서와 같이 투여후 시간에 대해 플로팅하였다.
시간에 대한 혈장 농도 데이터는 산업 표준 약물동력학 모델링 소프트웨어인 WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp., Mountain View, CA)을 사용하여 비구분 분석(noncompartmental analysis: NCA)에 적용하였다. 다음의 1차 약물동력학 파라미터에 대해 추정치를 얻었다: 최대 혈장 농도, Cmax; 농도-시간 곡선 하의 면적, AUC; 최종 반감기, t1/2; 최종 제거, Cl; 및 정상 상태에서의 분포 부피, Vss. WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp., Mountain View, CA)을 사용하는 데이터의 비구분 분석으로, 도 20에 열거되어 있는 1차 약물동력한 파라미터에 대한 추정치를 얻었다.
실시예 4C : PEG 화에 대한 안티 - IgE 앱타머의 약물동력학 및 생물학적 이용가능성: 10 mg / kg 으로 마우스에 피하( SC ) 투여 후의 ARC1785 , ARC1787 , ARC1788 및 ARC1790
피하 투여 경로를 통한 ARC1785, ARC1787, ARC1788 및 ARC1790의 생물학적 이용가능성의 뮤린 약물동력학 연구 고안은 도 18에 도시되어 있는 바와 같다. 요컨대, 본 연구는 3개의 그룹으로 이루어졌다(동물 수 = 총 33마리). 각각의 샘플 수거 시점에서, 3마리의 동물을 최종 희생시키고, 혈장 수거를 위해 심장 천자를 통해 전혈 0.5 ㎖를 모았다. 앱타머는 표준 0.9% 염수 중에서 최종 농도가 10 ㎎/㎖(올리고 중량)가 되도록 동결건조시킨 분말을 주사용으로 제제화시키고, 이를 투여하기 전에 멸균-여과시켰다(0.2 ㎛). 사용된 투여 경로는 투여량 10 mg/kg의 단일 피하 볼루스 주사였다. 소정의 시점, 즉 t = 투여 전, 0.08시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간, 32시간, 48시간 및 72시간에서, 전혈 샘플을 수득하고, K2EDTA-코팅된 튜브로 직접 옮기고, 역 혼합시킨 뒤, 웨트 얼음 상에 두었다.
혈장은 5분간 3,500 rpm에서 혈액-EDTA 튜브를 원심분리시켜 수거하였다. 혈 장 샘플은 새 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고, 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 앱타머 농도에 대한 혈장 샘플의 분석은, 시판되고 있는 형광 핵산 검출 제제 OligreenTM(Molecular Probes, Eugene, OR)이 함유된 분석 웰에 혈장 분취액을 직접 첨가하여 사용하는, 균일한 분석 포맷을 사용하여 수행하였다. 실온에서 간단히 5분간 인큐베이션한 후, 빛으로부터 보호한 분석 플레이트를 형광 플레이트 판독기로 판독하였다. 각각의 웰로부터 얻은 형광 시그널은 웰 내에 존재하는 앱타머 농도에 비례하며, 샘플 농도는 형광-농도 표준 곡선(이중 곡선으로부터 얻은 평균값)으로부터 형광값을 내삽하여 계산하였다. 평균 혈장 농도는 각각의 시점에서 각 그룹의 동물 3마리로부터 얻었으며, 도 19에서와 같이 투여후 시간에 대해 플로팅하였다.
시간에 대한 혈장 농도 데이터는 산업 표준 약물동력학 모델링 소프트웨어인 WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp., Mountain View, CA)을 사용하여 비구분 분석에 적용하였다. 다음의 1차 약물동력학 파라미터에 대해 추정치를 얻었다: 최대 혈장 농도, Cmax; 농도-시간 곡선 하의 면적, AUC; 최종 반감기, t1/2; 최종 제거, Cl; 및 정상 상태에서의 분포 부피, Vss. WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp., Mountain View, CA)을 사용하는 데이터의 비구분 분석으로, 도 20에 열거되어 있는 1차 약물동력한 파라미터에 대한 추정치를 얻었다. 도 20의 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험한 모든 PEG-컨쥬게이트 앱타머는 피하 생물학적 이용가능성을 나타냈다.
상기 발명의 상세한 설명 및 실시예를 통해 설명한 본 발명에 있어서, 당업자라면 본 발명을 다양한 구체예로 실시할 수 있으며, 상술한 발명의 상세한 설명과 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공한 것으로서, 하기 첨부된 청구의 범위를 제한하는 것은 아니라는 점을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Archemix Corp., et al. <120> Nucleic Acid Ligands Specific to Immunoglobulin E and their Use as Atopic Disease Therapeutics <130> 23239-581-061 <140> US2005/014361 <141> 2005-04-26 <150> 60/565,601 <151> 2004-04-26 <150> 60/574,120 <151> 2004-05-24 <150> 60/581,865 <151> 2004-06-22 <150> 60/660,204 <151> 2005-03-07 <160> 298 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (25)..(54) <223> n is a, t, c, or g <400> 1 catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa 60 cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta 93 <210> 2 <211> 92 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n is a, t, c, or g <400> 2 catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 3 <211> 92 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n is a, t, c, or g <400> 3 catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic CpG sequence <400> 4 aacgttcgag 10 <210> 5 <211> 88 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (25)..(64) <223> n is a, t, c, or g <400> 5 gggaaaagcg aatcatacac aagannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnngctccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 6 taatacgact cactataggg aaaagcgaat catacacaag a 41 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 7 ttctcggttg gtctctggcg gagc 24 <210> 8 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (25)..(64) <223> n is a c, u, or g <400> 8 gggaaaagcg aaucauacac aagannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnngcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 9 <211> 24 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 9 gggaaaagcg aaucauacac aaga 24 <210> 10 <211> 24 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 10 gcuccgccag agaccaaccg agaa 24 <210> 11 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 11 gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu gucgugguuc ggguugaggc 60 ggaagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 12 <211> 87 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(87) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 12 ggaaaagcga aucauacaca agagucgcga uagauugcuu gugaaugguu uugguggaag 60 cgggcuccgc cagagaccaa ccgagaa 87 <210> 13 <211> 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(1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 19 gggaaaagcg aaucauacac aagagugccg aggcauugcu ugguaugguu ccggucuugu 60 cggggcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 20 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 20 gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu guggugguuc ggguugaggc 60 ggaagcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 21 <211> 90 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(90) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 21 gggaaaagcg aaucauacac aagacgucag uaagauugag uguaugguuc cugguggaca 60 auaauggcuc cgccagagac caaccgagaa 90 <210> 22 <211> 88 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(88) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 22 gggaaaagcg aaucauacac aagagagugg aggagguaug uaugguuugu gcgucuggug 60 cggugcuccg ccagagacca accgagaa 88 <210> 23 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (23)..(52) <223> n is a, t, c, or g <400> 23 gggagaggag agaacgttct acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgctgtcg 60 atcgatcgat cgatg 75 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 24 gggagaggag agaacgttct ac 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 25 catcgatcga tcgatcgaca gc 22 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 26 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 27 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 27 cgcugucgau cgaucgaucg aug 23 <210> 28 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 28 gggagaggag agaacguucu acgauuagca gggagggaga gugcgaagag gacgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 29 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 29 gggagaggag agaacguucu acacucuggg gacccguggg ggagugcagc aacgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 30 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 30 gggagaggag agaacguucu acgaggugag ggucuacaau ggagggaugg ucgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 31 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is a, c, u, or g <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is a, c, u, or g <400> 31 gggagaggag agaacguucu acccgcagca uagccugngg acccaugngg ggcgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 32 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 32 gggagaggag agaacguucu acuggggggc guguucauua gcagcgucgu gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 33 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 33 gggagaggag agaacguucu acgcagcgca ucuggggacc caagagggga uucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 34 <211> 73 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(73) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 34 gggagaggag agaacguucu acgggauggg uaguuggaug gaaaugggaa cgcugucgau 60 cgaucgaucg aug 73 <210> 35 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 35 gggagaggag agaacguucu acgaggugua gggauagagg gguguaggua acgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 36 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 36 gggagaggag agaacguucu acaggagugg agcuacagag aggguuaggg gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 37 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 37 gggagaggag agaacguucu acggauguug ggagugauag aaggaagggg agcgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 38 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 38 gggagaggag agaacguucu acuuggggug gaaggaguaa gggaggugcu gaucgcuguc 60 gaucgaucga ucgaug 76 <210> 39 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 39 gggagaggag agaacguucu acguauuagg ggggaagggg aggaauagau cacgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 40 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 40 gggagaggag agaacguucu acagggagag aguguugagu gaagaggagg agucgcuguc 60 gaucgaucga ucgaug 76 <210> 41 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 41 gggagaggag agaacguucu acauugugcu ccuggggccc aguggggagc cacgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 42 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 42 gggagaggag agaacguucu acgagcagcc cuggggcccg gagggggaug gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 43 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 43 gggagaggag agaacguucu acaggcaguu cuggggaccc augggggaag ugcgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 44 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 44 gggagaggag agaacguucu accaacggca uccugggccc cacaggggau gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 45 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(74) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 45 gggagaggag agaacguucu acgaguggau agggaagaag gggaguaguc acgcugucga 60 ucgaucgauc gaug 74 <210> 46 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 46 gggagaggag agaacguucu acccgcagca uagccugggg acccaugggg ggcgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 47 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> n is a, c, u, or g <400> 47 gggagaggag agaacguucu acggucgcgu gugggggacg gauggguauu ggucgcuguc 60 naucgaucga ucgaug 76 <210> 48 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 48 gggagaggag agaacguucu acgggguuac gucgcacgau acaugcauuc aucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 49 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 49 gggagaggag agaacguucu acuagcgagg agggguuuuc uauuuuugcg aucgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 50 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 50 gggagaggag agaacguucu acaagcaguu cuggggaccc augggggaag ugcgcugucg 60 aucgaucgau cgaug 75 <210> 51 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (23)..(52) <223> n is a, t, c, or g <400> 51 gggagaggag agaacgttct acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgctgtcg 60 atcgatcgat cgatg 75 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sqeuence <220> <223> synthetic primer <400> 52 gggagaggag agaacgttct ac 22 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 53 catcgatcga tcgatcgaca gc 22 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 54 gggagaggag agaacguucu a 21 <210> 55 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic nucleic acid sequence <400> 55 cgcugucgau cgaucgaucg aug 23 <210> 56 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 56 gggagaggag agaacguucu acgaucuggg cgagccaguc ugacugagga agcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 57 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 57 gggagaggag agaacguucu acgcggucgg guguguggag gaaguaguuc gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 58 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 58 gggagaggag agaacguucu acgacguuaa ugcagcggcu agggaugggc agcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 59 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 59 gggagaggag agaacguucu acaggcgugu ugguagggua cgacgaggca ugcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 60 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 60 gggagaggag agaacguucu acugagggau aauacgggug ggauugucuu cccgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 61 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 61 gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 62 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 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pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 68 gggagaggag agcacguucu acgaaaaaga uauggagaga aaggauuaag agacgcuguc 60 gaucgaucga ucgaugaagg gcg 83 <210> 69 <211> 84 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(84) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 69 gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaaa gagacgcugu 60 cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 84 <210> 70 <211> 85 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(85) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, u, or g <400> 70 gggagaggag agaacguucu acgaanaaga uacauaguag aaaggauuaa uaagacgcug 60 ucgaucgauc gaucgaugaa gggcg 85 <210> 71 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 71 gggagaggag agaacguucu acaggcgugu ugguagggua cgacgaggca ugcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 72 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 72 gggagaggag agaacguucu acgcaaaaau gugaugcgag guaauggaac gccgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 73 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 73 gggagaggag agaacguucu acggaccuca gcgauagggg uugaaaccga cacgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 74 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 74 gggagaggag agaacguucu acauggucgg augcugggga guaggcaagg uucgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 75 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 75 gggagaggag agaacguucu acguaucggc gagcgaagca uccgggagcg uucgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 76 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 76 gggagaggag agaacguucu acguauuggc gcgcgaagca uccgggagcg uucgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 77 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 77 gggagaggag agaacguucu acuuauaccu gacggccgga ggcgcauagg ugcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 78 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 78 gggagaggag agaacguucu acauggucgg augcugggga guaggcaagg uucgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 79 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 79 gggagaggag agaacguucu acacgagagu acugaggcgc uugguacaga gucgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 80 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 80 gggagaggag agaacguucu acagaaggua gaaaaaggau agcugugaga agcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 81 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 81 gggagaggag agaacguucu acugagggau aauacgggug ggauugucuu cccgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 82 <211> 84 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(84) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 82 gggagaggag agaacguucu acauugagcg uugaaguugg ggaagcuccg aggccgcugu 60 cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 84 <210> 83 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 83 gggagaggag agaacguucu acgcggagau auacagcgag guaauggaac gccgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 84 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 84 gggagaggag agaacguucu acgaagacag cccaauagcg gcacggaacu ugcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 85 <211> 84 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(84) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 85 gggagaggag agaacguucu accgguugag ggcucgcgug gaagggccaa cacgcgcugu 60 cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 84 <210> 86 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 86 gggagaggag agaacguucu acauaucaau agacucuuga cguuuggguu ugcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 87 <211> 79 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(79) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 87 gggagaggag agaacguucu acagugaagg aaaaguaagu gaaggugugc gcugucgauc 60 gaucgaucga ugaagggcg 79 <210> 88 <211> 82 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(82) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 88 gggagaggag agaacguucu acggaugaaa ugagugucug cgauagguua agcgcugucg 60 aucgaucgau cgaugaaggg cg 82 <210> 89 <211> 83 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(83) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 89 gggagaggag agaacguucu acggaaggaa augugugucu gcgauagguu aagcgcuguc 60 gaucgaucga ucgaugaagg gcg 83 <210> 90 <211> 49 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(49) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 90 gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu gucgugguu 49 <210> 91 <211> 43 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(43) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 91 ggaaucauac acaagacguc gccagauuga gugucguggu ucc 43 <210> 92 <211> 41 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(41) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 92 ggaaucauac acaagacguc gccagauuga gugucguggu u 41 <210> 93 <211> 37 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 93 ggagauccga gggugggcaa uaggcucaca aggguuu 37 <210> 94 <211> 35 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(35) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 94 ggauccgagg gugggcaaua ggcucacaag ggucc 35 <210> 95 <211> 43 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(43) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 95 ggaaucauac acaagacguc aguaagauug aguguauggu ucc 43 <210> 96 <211> 41 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(41) <223> all purines (A and G) are 2'-OH, all pyrimidines (C and U) are 2'-fluoro <400> 96 ggaaucauac acaagacguc aguaagauug aguguauggu u 41 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 97 uucuggggac ccauggggga a 21 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 98 guucugggga cccauggggg aac 23 <210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 99 aguucugggg acccaugggg gaacu 25 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 100 gccuggggac ccaugggggg c 21 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 101 agccugggga cccauggggg gcu 23 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 102 uagccugggg acccaugggg ggcua 25 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 103 gccuggggaa ccaugggggg c 21 <210> 104 <211> 68 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <400> 104 gggagaggag agaacgttct acagcctggg gacccatggg gggctggtcg atcgatcgat 60 catcgatg 68 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 105 catcgatgat cgatcgatcg acc 23 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 106 agccugggga cccauggggg cu 22 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 107 cgccugggga cccagggggg gcu 23 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 108 agccuggugg cccauggggu gcu 23 <210> 109 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 109 agccugggga cccauggggg guggu 25 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 110 agucugggga cagauggaug gcu 23 <210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(22) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 111 agcuguggag ucgugugggg cu 22 <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> all purines (A and G) are deoxy, all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <400> 112 aagccugggg acccaugggg gggcu 25 <210> 113 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 113 ggggcacgtt tatccgtccc tcctagtggc gtgcccc 37 <210> 114 <211> 74 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <400> 114 gatcccttgt tcagtccggg gcacgtttat ccgtccctcc tagtggcgtg ccccttaagc 60 cacaggactc caaa 74 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 115 gatcccttgt tcagtccg 18 <210> 116 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> adenosine at position 17 is 2'-OH <400> 116 ggagtcctgt ggcttaa 17 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> thymidine at positions 1-3 are 5'-biotin modified <400> 117 tttggagtcc tgtggcttaa 20 <210> 118 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 118 ggagtcctgt ggcttaa 17 <210> 119 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 119 ggggcacatt tatccgtccc tcctagtggt gtgcccc 37 <210> 120 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 120 ggggtacctt tatccgtccc tcctagtggg gtgcccc 37 <210> 121 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 121 ggggtacctt tatccgtccc tcctagtggg gtacccc 37 <210> 122 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 122 ggggcaaatt tatccgtccc tcctagtggt ttgcccc 37 <210> 123 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 123 ggggcatatt tatccgtccc tcctagtggt atgcccc 37 <210> 124 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 124 ggggcacatt tatccgttcc tcctagtggt gtgcccc 37 <210> 125 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 125 ggggtacatt tatccgtccc tcctagtggc atgcccc 37 <210> 126 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 126 ggggcatgtt tatccgtccc tcctagtggc atgcccc 37 <210> 127 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 127 ggggcaactt tatccgttcc tcctagtggg ttgccc 36 <210> 128 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 128 ggggcacatt catccgtccc tcctagtggt gtgctcc 37 <210> 129 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 129 ggggtacctt gatccgtccc tcctagtggg gtgcccc 37 <210> 130 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 130 ggggcatgtt tatccgttcc tcctagtggc atgcccc 37 <210> 131 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 131 ggggcagctt tatccgttcc tcctagtggg ctgcctc 37 <210> 132 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 132 ggggtacctt tatccgtttc tcctagtggg gtgcccc 37 <210> 133 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 133 ggggtatgtt gatccgtccc tcctagtggc atgcccc 37 <210> 134 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 134 ggggcatgtt catccgttcc tcctagtggc gtgcccc 37 <210> 135 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 135 gggacacatt tatccgttac tcttagtggt gtgcccc 37 <210> 136 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 136 ggggcacatt tatccgttac tcttagtggt gtgcccc 37 <210> 137 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 137 ggggcacgtt tacagtccct ccttatcgcc tccc 34 <210> 138 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 138 ggggcacgtt tacagtccct ccttatcgcc tccc 34 <210> 139 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 139 gggcaacttt atccgttcct cttagtgggt tgcccc 36 <210> 140 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 140 gggctacttt atccgtccct cctagtgggt agcccc 36 <210> 141 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 141 ggcaccttta tccgtccctc ctagtggggt gcccc 35 <210> 142 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 142 ggggcacctt tatccgtccc tcctagtggg gtgcccc 37 <210> 143 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 143 gggcacattc atccgttcct cctagtggtg tgcccc 36 <210> 144 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 144 ggcaccttta tccgttcctt ctagtggggt gccc 34 <210> 145 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n at position 28 is a, t, c, or g <400> 145 cggcaccttt atccgttact cttagtgngg tgcccc 36 <210> 146 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 146 ggcaccttga tccgttcctc ctagtggggt gcccc 35 <210> 147 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 147 gcgggcaaat tcatccgtcc ctcctagtgg tttgccc 37 <210> 148 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 148 gggcacttta tccgttcctt ctagtgggtg tccc 34 <210> 149 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 149 ggcggcagct ttatccgtac ctcccagtgg gctgctcc 38 <210> 150 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 150 ggggcagctt tatccgtacc tcccagtggg ctgcccc 37 <210> 151 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 151 ggggctactt tatccgtccc tcctagtggg tagcccc 37 <210> 152 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 152 ggggctactt tatccgtacc tcccagtggg tagcccc 37 <210> 153 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 153 ggggctactt gatccgtccc tcctagtggg tagcccc 37 <210> 154 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 154 ggggctactt catccgtccc tcctagtggg tagcccc 37 <210> 155 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 155 ggggctactt tatccgttcc tcttagtggg tagcccc 37 <210> 156 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <400> 156 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccc 37 <210> 157 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 157 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 158 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except adenosine at position 1 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 158 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 159 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 2 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 159 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 160 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 6 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 160 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 161 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 7 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 161 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 162 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 8 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 162 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 163 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 9 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 163 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 164 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except adenosine at position 10 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 164 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 165 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except adenosine at position 14 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 165 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 166 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 16 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 166 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 167 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 17 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 167 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 168 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 18 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 168 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 169 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 19 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 169 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 170 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 20 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 170 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 171 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 21 is 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 171 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 172 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except adenosine at position 1 is 2'-O-methyl, and guanosine at positions 2, 20, and 21 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 172 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 173 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at position 2 is 2'-O-methyl, and adenosine at positions 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 173 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 174 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 175 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 175 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 176 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 176 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 177 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> deoxy adenosine at position 1 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 2 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy guanosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 177 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 178 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> deoxy adenosine at position 1 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 2 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> deoxy guanosine at position 9 is linked to 2'-O-methyl adenosine at position 10 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy guanosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy guansoine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 178 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 179 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 179 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 180 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to doexy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 180 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 181 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy guanosine at position 16 is linked to 2'-O- methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 181 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10 and 14 are 2'-O-methyl; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> 2'-O-methyl uridine at position 5 is linked to deoxy guanosine at position 6 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 7 is linked to deoxy guanosine at position 8 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 17 is linked to deoxy guanosine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy guanosine at position 19 is linked to deoxy guanosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 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via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy guanosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 17 is linked to deoxy guanosine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy guanosine at position 19 is linked to deoxy guanosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy guanosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> deoxy guanosine at position 21 is linked to 2'-O-methyl cytidine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 183 agccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> guanosine at position 2 is deoxy 7- deaza guanosine <400> 184 agccugggga cccauggggg gcu 23 <210> 185 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 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cccauggggg gcu 23 <210> 191 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> guanosine at position 18 is deoxy 7- deaza guanosine <400> 191 agccugggga cccauggggg gcu 23 <210> 192 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> guanosine at position 19 is deoxy 7-deaza guanosine <400> 192 agccugggga cccauggggg gcu 23 <210> 193 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy; all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> guanosine at position 20 is 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ucu 23 <210> 201 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10 and 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n at position 2 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 201 anccugggga cccauggggg gcut 24 <210> 202 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n at position 6 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 202 agccunggga cccauggggg gcut 24 <210> 203 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n at position 7 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 203 agccugngga cccauggggg gcut 24 <210> 204 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n at position 8 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 204 agccuggnga cccauggggg gcut 24 <210> 205 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n at position 9 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 205 agccugggna cccauggggg gcut 24 <210> 206 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 206 agccugggga cccaungggg gcut 24 <210> 207 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, and 7 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n at position 17 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 207 agccugggga cccaugnggg gcut 24 <210> 208 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine <400> 208 agccugggga cccauggngg gcut 24 <210> 209 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n at position 19 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 209 agccugggga cccaugggng gcut 24 <210> 210 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy 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alll pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy guanosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 212 agccugggga cccauggggn gcut 24 <210> 213 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy inosine at 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linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy guanosine at position 19 is linked to deoxy inosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 214 agccugggga cccauggggn gcut 24 <210> 215 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> 2'-O-methyl uridine at position 5 is linked to deoxy guanosine at position 6 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 7 is linked to deoxy guanosine at position 8 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 17 is linked to deoxy guanosine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy guanosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy guanosine at position 19 is linked to deoxy inosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 215 agccugggga cccaungggn gcut 24 <210> 216 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl 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artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> 2'-O-methyl uridine at position 5 is linked to deoxy guanosine at position 6 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 7 is linked to deoxy guanosine at position 8 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-O-methyl guanosine at position 17 is linked to deoxy inosine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy inosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy guanosine at position 19 is linked to deoxy inosine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 219 agccugggga cccaungngn gcut 24 <210> 220 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 1 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 220 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 221 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 2 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 221 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 222 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 3 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 222 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 223 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 4 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 223 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 224 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 5 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 224 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 225 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 6 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 225 ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 226 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 226 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 227 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 8 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 227 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 228 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 9 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 228 ggggctacut tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 229 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 10 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 229 ggggctactu tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 230 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 11 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 230 ggggctactt uatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 231 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except adenosine at position 12 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 231 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 232 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 13 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 232 ggggctactt tauccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 233 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 14 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 233 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 234 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 15 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 234 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 235 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 16 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 235 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 236 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 17 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 236 ggggctactt tatccgutcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 237 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 18 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 237 ggggctactt tatccgtucc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 238 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 19 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 238 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 239 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 20 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 239 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 240 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 21 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 240 ggggctactt tatccgttcc ucctagtggg tagcccct 38 <210> 241 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 22 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 241 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 242 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 23 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 242 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 243 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 24 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 243 ggggctactt tatccgttcc tccuagtggg tagcccct 38 <210> 244 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except adenosine at position 25 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 244 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 245 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 26 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 245 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 246 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 27 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 246 ggggctactt tatccgttcc tcctaguggg tagcccct 38 <210> 247 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 28 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 247 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 248 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 29 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 248 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 249 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 30 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 249 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 250 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except uridine at position 31 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 250 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg uagcccct 38 <210> 251 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except adenosine at position 32 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 251 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 252 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except guanosine at position 33 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 252 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 253 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 34 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 253 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 254 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 35 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 254 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 255 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 36 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 255 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 256 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) and all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at position 37 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 256 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 257 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4, 30 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 7 and 32 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 257 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 258 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 5, 8, 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl, and uridine at positions 6 and 31 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 258 ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg uagcccct 38 <210> 259 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, and 4 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimdines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 259 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 260 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimdines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 5, 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'- 3' linked) <400> 260 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 261 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(35) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, and 32 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(35) <223> all pyrimdines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 4, 33, 34, and 35 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> thymidine at position 36 is an inverted deoxy thymidine (3'- 3' linked) <400> 261 gggctacttt atccgttcct cctagtgggt agccct 36 <210> 262 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sqeuence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimdines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'- 3' linked) <400> 262 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 263 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimdines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 5, 8, 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl, and uridine at position 6 is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'- 3' linked) <400> 263 ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 264 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> syjnthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimdines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 20, 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl, and uridine at positions 11, 17, and 18 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'- 3' linked) <400> 264 ggggctactt uatccguucc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 265 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimdines (C and, T) are deoxy, except cytidine at positions 5, 8, 20, 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl, and uridine at positions 6, 11, 17, and 18 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'- 3' linked) <400> 265 ggggcuactt uatccguucc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 266 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except at positions 34, 35, 36 and 37, wherein cytidine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy cytidine at position 8 is linked to thymidine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 266 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 267 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> thymidine at position 9 is linked to thymidine at position 10 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 267 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 268 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimdines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> thymidine at position 10 is linked to thymidine at position 11 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 268 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 269 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> thymidine at position 11 is linked to deoxy adenosine at position 12 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 269 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 270 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> deoxy adenosine at position 12 is linked to thymidine at position 13 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 270 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 271 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> thymidine at position 13 is linked to deoxy cytidine at position 14 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 271 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 272 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> deoxy cytidine at position 14 is linked to deoxy cytidine at position 15 via a phosphorothiaote internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 272 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 273 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> deoxy cytidine at position 15 is linked to deoxy guanosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 273 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 274 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy guanosine at position 16 is linked to thymidine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 274 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 275 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> thymidine at position 17 is linked to thymidine at position 18 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 275 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 276 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> thymidine at position 18 is linked to deoxy cytidine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 276 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 277 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> deoxy cytidine at position 19 is linked to deoxy cytidine at position 20 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 277 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 278 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy cytidine at position 20 is linked to thymidine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 278 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 279 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> thymidine at position 21 is linked to deoxy cytidine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 279 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 280 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> deoxy cytidine at position 22 is linked to deoxy cytidine at position 23 via a phosphothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 280 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 281 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> deoxy cytidine at position 23 is linked to thymidine at position 24 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 281 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 282 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> thymidine at position 24 is linked to deoxy adenosine at position 25 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 282 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 283 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> deoxy adenosine at position 25 is linked to deoxy guanosine at position 26 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 283 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 284 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> deoxy guanosine at position 26 is linked to thymidine at position 27 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 284 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 285 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> thymidine at position 27 is linked to deoxy guanosine at position 28 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 285 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 286 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> deoxy guanosine at position 28 is linked to deoxy guanosine at position 29 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 286 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 287 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> deoxy guanosine at position 29 is linked to deoxy guanosine at position 30 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 287 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 288 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> deoxy guanosine at position 30 is linked to thymidine at position 31 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 288 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 289 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> thymidine at position 31 is linked to deoxy adenosine at position 32 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (398)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 289 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 290 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> thymidine at position 9 is linked thymidine at position 10 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> deoxy adenosine at position 12 is linked to thymidine at position 13 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> deoxy cytidine at position 14 is linked to deoxy cytidine at position 15 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> thymidine at position 18 is linked to deoxy cytidine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> thymidine at position 21 is linked to deoxy cytidine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> thymidine at position 24 is linked to deoxy adenosine at position 25 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> thymidine at position 27 is linked to deoxy guanosine at position 28 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> deoxy guanosine at position 30 is linked to thymidine at position 31 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 290 ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 291 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 5, 8, 34 35, 36, and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> thymidine at position 9 is linked to thymidine at position 10 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> deoxy adenosine at position 12 is linked to thymidine at position 13 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> deoxy cytidine at position 14 is linked to deoxy cytidine at position 15 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> thymidine at position 18 is linked to deoxy cytidine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> thymidine at position 21 is linked to deoxy cytidine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> thymidine at position 24 is linked to deoxy adenosine at position 25 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> thymidine at position 27 is linked to deoxy guanosine at position 28 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> deoxy guanosine at position 30 is linked to thymidine at position 31 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 291 ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 292 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 1, 2, 3, 4 and 33 are 2'-O-methyl, and adenosine at position 7 is 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(37) <223> all pyrimidines (C and T) are deoxy, except cytidine at positions 5, 8, 20, 34, 35, 36 and 37 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> thymidine a position 9 is linked to thymidine at position 10 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> deoxy adenosine at position 12 is linked to thymidine at position 13 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> deoxy cytidine at position 14 is linked to deoxy cytidine at position 15 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> thymidine at position 21 is linked to deoxy cytidine at position 22 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> thymidine at position 24 is linked to deoxy adenosine at position 25 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> thymidine at position 27 is linked to deoxy guanosine at position 28 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> deoxy guanosine at position 30 is linked to thymidine at position 31 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 292 ggggcuactt uatccguucc tcctagtggg tagcccct 38 <210> 293 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> All pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methyl adenosine at position 1 is further modified by a branched 40 kDa PEG conjugated to the nucleotide via a 5'- amine linker <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy inosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy inosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 293 agccugggga cccaungngn gcut 24 <210> 294 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> All pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methyl adenosine at position 1 is further modified by a branched 60 kDa PEG conjugated to the nucleotide via a 5'-amine linker <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy inosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy inosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> thymidine at position 24 is an inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 294 agccugggga cccaungngn gcut 24 <210> 295 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> All pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methyl adenosine at position 1 is further modified by a 20 kDa PEG conjugated to the nucleotide via a 5'- amine linker <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy inosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy inosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> 2'-O-methyl uridine at position 23 is further modified by a 20 kDa PEG conjugated to the nucleotide via a 3'- amine linker <400> 295 agccugggga cccaungngn gcu 23 <210> 296 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methyl adenosine at position 1 is further modified by a 30 kDa PEG conjugated to the nucleotide via a 5'-amine linker <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy inosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy inosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> 2'-O-methyl uridine at position 23 is further modified by a 30 kDa PEG conjugated to the nucleotide via a 3'- amine linker <400> 296 agccugggga cccaungngn gcu 23 <210> 297 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyridmidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methyl adenosine at position 1 is further modified by a 5'-amine linker <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy inosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy inosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> 2'-O-methyl uridine at position 23 is further modified by a 3'-amine linker <400> 297 agccugggga cccaungngn gcu 23 <210> 298 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all purines (A and G) are deoxy, except guanosine at positions 2, 7 and 17 are 2'-O-methyl, and adenosine at positions 1, 10, 14 are 2'-O-methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> all pyrimidines (C and U) are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> deoxy guanosine at position 8 is linked to deoxy guanosine at position 9 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl uridine at position 15 is linked to deoxy inosine at position 16 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> deoxy inosine at position 16 is linked to 2'-O-methyl guanosine at position 17 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> deoxy inosine at position 18 is linked to deoxy guanosine at position 19 via a phosphorothioate internucleotide linkage <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is deoxy inosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxy inosine at position 20 is linked to deoxy guanosine at position 21 via a phosphorothioate internucleotide linkage <400> 298 agccugggga cccaungngn gcu 23

Claims (40)

  1. 하기 서열을 포함하는, PEG 잔기(moiety)에 컨쥬게이션된 앱타머(aptamer):
    mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU
  2. 제1항에 있어서, PEG 잔기는 60 kDa, 40 kDa, 30 kDa 및 20 kDa으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 앱타머.
  3. 제2항에 있어서, PEG 잔기는 분지된 PEG인 것인 앱타머.
  4. 제3항에 있어서, 하기 구조를 가지는 앱타머:
    Figure 112006087103447-PCT00050
    상기 구조에서,
    Figure 112006087103447-PCT00051
    는 링커를 표시하고,
    앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(서열 번호 216)이며,
    여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이고, dI는 데옥시 이노신이며, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이고, 3T는 3' 역(inverted) 데옥시 티미딘이다.
  5. 제4항에 있어서, 링커는 알킬 링커인 것인 앱타머.
  6. 제5항에 있어서, 알킬 링커는 2개 내지 18개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  7. 제6항에 있어서, 알킬 링커는 2개 내지 12개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  8. 제7항에 있어서, 알킬 링커는 3개 내지 6개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  9. 제8항에 있어서, 하기 구조를 가지는 앱타머:
    Figure 112006087103447-PCT00052
    앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(서열 번호 216)
    여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이고, dI는 데옥시 이노신이며, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이고, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
  10. 제3항에 있어서, 하기 구조를 가지는 앱타머:
    Figure 112006087103447-PCT00053
    상기 구조에서,
    Figure 112006087103447-PCT00054
    는 링커를 표시하고,
    앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(서열 번호 216)이며,
    여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이고, dI는 데옥시 이노신이며, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이고, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
  11. 제10항에 있어서, 링커는 알킬 링커인 것인 앱타머.
  12. 제11항에 있어서, 알킬 링커는 2개 내지 18개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  13. 제12항에 있어서, 알킬 링커는 2개 내지 12개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  14. 제13항에 있어서, 알킬 링커는 3개 내지 6개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  15. 제14항에 있어서, 하기 구조를 가지는 앱타머:
    Figure 112006087103447-PCT00055
    앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(서열 번호 216)
    여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이고, dI는 데옥시 이노신이며, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이고, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
  16. 제2항에 있어서, 하기 구조를 가지는 앱타머:
    Figure 112006087103447-PCT00056
    상기 구조에서,
    Figure 112006087103447-PCT00057
    는 링커를 표시하고,
    앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(서열 번호 298)이며,
    여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이고, dI는 데옥시 이노신이며, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이고, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
  17. 제16항에 있어서, 링커는 알킬 링커인 것인 앱타머.
  18. 제17항에 있어서, 알킬 링커는 2개 내지 18개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  19. 제18항에 있어서, 알킬 링커는 2개 내지 12개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  20. 제19항에 있어서, 알킬 링커는 3개 내지 6개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  21. 제17항에 있어서, 하기 구조를 가지는 앱타머:
    Figure 112006087103447-PCT00058
    앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(서열 번호 298)
    여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이고, dI는 데옥시 이노신이며, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이고, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
  22. 제2항에 있어서, 하기 구조를 가지는 앱타머:
    Figure 112006087103447-PCT00059
    상기 구조에서,
    Figure 112006087103447-PCT00060
    는 링커를 표시하고,
    앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(서열 번호 298)
    여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이고, dI는 데옥시 이노신이며, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이고, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
  23. 제22항에 있어서, 링커는 알킬 링커인 것인 앱타머.
  24. 제23항에 있어서, 알킬 링커는 2개 내지 18개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  25. 제24항에 있어서, 알킬 링커는 2개 내지 12개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  26. 제25항에 있어서, 알킬 링커는 3개 내지 6개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 앱타머.
  27. 제26항에 있어서, 하기 구조를 가지는 앱타머:
    Figure 112006087103447-PCT00061
    앱타머 = mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(서열 번호 298)
    여기서, mC, mG, mU 및 mA는 각각 2'-OMe C, 2'-OMe G, 2'-OMe U 및 2'-OMe A이고, dG는 데옥시 G이고, dI는 데옥시 이노신이며, s는 포스포로티오에이트 골격 치환이고, 3T는 3' 역 데옥시 티미딘이다.
  28. 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96, 및 98-102로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 한 서열과 80% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는, IgE에 특이적으로 결합하는 앱타머.
  29. 제28항에 있어서, 앱타머 핵산 서열은 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96, 98-102로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 중 어느 한 서열과 90% 이상 동일한 것인 앱타머.
  30. 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50 및 56-89로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 한 서열의 유니크(unique) 서열 영역과 80% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는, IgE에 특이적으로 결합하는 앱타머.
  31. 제30항에 있어서, 앱타머 핵산 서열은 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50 및 56-89로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 어느 한 서열의 유니크 서열 영역과 90% 이상 동일한 것인 앱타머.
  32. 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50 및 56-89로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머 핵산 서열 중 어느 한 서열 내의 30개의 인접한 뉴클레오티드로 된 서열과 동일한 30개의 인접한 뉴클레오티드로 된 서열을 포함하는, IgE 에 결합할 수 있는 앱타머.
  33. 제32항에 있어서, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96 및 98-102로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머 서열 중 어느 한 서열의 유니크 서열 영역 내의 20개의 인접한 뉴클레오티드로 된 서열과 동일한 20개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머.
  34. 제33항에 있어서, 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96 및 98-102로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머 서열 중 어느 한 서열의 유니크 서열 영역 내의 8개의 인접한 뉴클레오티드로 된 서열과 동일한 8개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하며 IgE에 특이적으로 결합하는 앱타머.
  35. 서열 번호 11-15, 18, 19, 21, 29, 33, 41-44, 46, 50, 56-96, 98-102, 119-124, 126-136, 139-157, 158-176, 178-190, 194-201, 206-243, 247, 249-259, 261-267, 269-290 및 292로 구성된 군으로부터 선택된 앱타머.
  36. 제35항에 있어서, 단일 가닥 핵산인 앱타머.
  37. 제36항에 있어서, 고분자량의 비-면역원성 화합물 또는 친유성 화합물에 컨쥬게이션된 앱타머.
  38. 제37항에 있어서, 고분자량의 비-면역원성 화합물은 폴리알킬렌 글리콜인 것인 앱타머.
  39. 제38항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜인 것인 앱타머.
  40. 제35항에 있어서, 당 위치에서의 화학적 치환; 인산염 위치에서의 화학적 치환; 핵산의 염기 위치에서의 화학적 치환; 역 뉴클레오티드로의 3' 캡핑(capping); 및 역 뉴클레오티드로의 5' 캡핑으로 구성된 군으로부터 선택된 화학적 변형을 포함하는 앱타머.
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