JP5015923B2 - 完全な2’改変核酸転写物を生成するための材料および方法 - Google Patents
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Description
本仮特許出願は、米国特許法§119(e)の下、次の仮特許出願:2005年6月30日に出願された米国仮特許出願第60/696,292号の優先権を主張し、その全体は本明細書中に参考として援用される。本発明は一般に、核酸の分野、より詳細にはアプタマーに関する。
本発明は、核酸(具体的には、修飾された酵素)を転写するための材料と方法、および修飾されたヌクレオチドの核酸(具体的には、アプタマー)への取り込みを増大させるための鋳型特異的重合において修飾された酵素を使用するための材料と方法に関する。加えて、本発明は、転写鋳型成分配列を選択するための方法と材料、転写物量を増大させるための(具体的には、SELEX(登録商標)法の際の転写物量を増大させるための)そのような成分配列の使用に関する。
定義によると、アプタマーは、ワトソン−クリック(Watson−Crick)塩基対合以外の相互作用によってタンパク質のようないくつかの標的に対して高い特異性および親和性で結合する、単離された核酸分子である。アプタマーは核酸をベースとする分子であるが、アプタマーと他の核酸分子(例えば、遺伝子およびmRNA)の間には根本的に違いがある。後者においては、核酸構造は、その直鎖状の塩基配列を通じて情報をコードしており、したがって、この配列は、情報の保存機能に重要な配列である。全く対照的に、アプタマーの機能は、標的分子の特異的結合に基づき、これは、保存された直鎖状の塩基配列に依存するのではなく、むしろ、特定の二次構造/三次構造に依存する。すなわち、アプタマーは非コード配列である。アプタマーが有する場合がある何らかをコードする可能性は完全に偶然のものであり、そしてどんな形であっても、その同種の標的に対するアプタマーの結合において役割を担うことはない。したがって、同じ標的に対して、さらにその標的上の同じ部位に対して結合するアプタマーは、類似する直鎖状の塩基配列を共有する場合があるが、ほとんどの場合はそうではない。
1)速度および制御。アプタマーは、完全なるインビトロでのプロセスによって生産することができ、それにより、最初のリード化合物(lead)(治療薬のリード化合物を含む)の迅速な作成が可能になる。インビトロでの選択により、アプタマーの特異性および親和性をきっちりと制御することができ、そして、リード化合物(毒素標的および非免疫原性標的の両方に対するリード化合物を含む)の作成が可能となる。
Tuckerら、J.Chromatography B.(1999)732:203−212
本発明は、T7 RNAポリメラーゼに関する。これは、精製することができ、単離することができ、そして/また、組み換え体でもあり得る。本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」には、細胞または組織の中で組み換えによって発現させられた、本発明のポリメラーゼを含む。本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」には、細胞または組織の中に入るように操作された本発明の核酸配列を含む。1つの実施形態においては、639位と784位とに改変アミノ酸を含むT7 RNAポリメラーゼ(ここでは、784位の改変アミノ酸がアラニンである場合には、639の改変アミノ酸はフェニルアラニンではない)が提供される。別の実施形態においては、378位に改変アミノ酸がさらに含まれている上記T7 RNAポリメラーゼが提供される。別の実施形態においては、266位に改変アミノ酸がさらに含まれている上記T7 RNAポリメラーゼが提供される。特定の実施形態においては、639位の改変アミノ酸はロイシンであり、784位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、266位の改変アミノ酸はロイシンである。さらなる実施形態においては、378位の改変アミノ酸はアルギニンである。
本発明の1つ以上の実施形態の詳細が、以下の付随する記載に示される。本明細書中に記載されるものと類似する、または同等の任意の方法と材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載から明らかであろう。明細書中では、単数形には、状況が別の場所に明確に示されていない限りは、複数形も含まれる。他の場所で定義されていない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書が支配するであろう。
アプタマーを作成するための好ましい方法は、図1に概要が示される「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment」(「SELEX(登録商標)」)と題されており、また、インビトロ選択とも呼ばれるプロセスを用いる。SELEX(登録商標)プロセスは、標的分子に対して高度に特異的な結合を用いた核酸分子のインビトロでの発達のための方法であり、例えば、1990年6月11日に提出された米国特許出願番号07/536,428(現在は放棄されている)、「Nucleic Acid Ligands」と題されている米国特許第5,475,096号、および「Nucleic Acid Ligands」と題されている米国特許第5,270,163号(WO91/19813もまた参照のこと)に記載されている。選択と増幅の反復サイクルを行うことにより、SELEX(登録商標)を使用してアプタマーを得ることができ、これは、本明細書中では、何らかの所望されるレベルの標的結合親和性を有する「核酸リガンド」とも呼ばれる。
治療薬としての使用、および/または特定のタイプの診断薬に適しているアプタマーにするためには、合成が安価であること、インビボで安全であり、そして安定であることが好ましい。野生型RNAおよびDNAアプタマーは、通常、インビボでは安定ではない。これは、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感度がその原因である。ヌクレアーゼによる分解に対する耐性は、2’位置での修飾基の取り込みによって大幅に高めることができる。
本発明の2’−修飾されたアプタマーは、修飾されたポリメラーゼ(例えば、フラノースの2’位置にブチル置換を有する修飾されたヌクレオチドが一定の割合での取り込まれている(これは野生型ポリメラーゼよりも高い割合である)修飾されたT7ポリメラーゼを使用して作成される。例えば、639位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化させられている変異体T7ポリメラーゼ(Y639F)は、2’デオキシ、2’アミノ、および2’−フルオロヌクレオチド三リン酸(NTP)を基質として容易に利用することができ、そして様々な用途について修飾されたRNAを合成するために広く使用されている。しかし、この変異体T7ポリメラーゼは、報告によると、ブチル2’置換基(例えば、2’−OMeまたは2’−アジド(2’−N3)置換基)を有するNTPを容易に利用する(すなわち取り込む)ことはできない。ブチル2’置換基の取り込みについては、Y639F変異に加えて、784位のヒスチジンがアラニン残基に変化させられている変異体T7ポリメラーゼ(Y639F/H784A)が記載されており、そして、修飾されたピリミジンNTPを取り込ませるための限られた状況において使用されている。Padilla,R.and Sousa,R.,Nucleic Acids Res.,2002,30(24):138を参照のこと。639位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化させられており、784位のヒスチジン残基がアラニンに変化させられており、そして378位のリジン残基がアルギニンに変化させられている変異体T7RNAポリメラーゼ(Y639F/H784A/K378R)は、修飾されたプリンおよびピリミジンNTP(例えば、2’−OMe NTP)を取り込ませるための限られた状況において使用されているが、これには、転写のための2’−OH GTPのスパイクを含む。Burmeisterら、(2005)Chemistry and Biology,12:25−33を参照のこと。転写のための2’−OH GTPスパイクを含めることによって、完全なる2’−OMeではなく、むしろ、2’−OH GTPの存在に依存し得るアプタマーを得ることができる。
多数の要因が、2’−修飾されたSELEX(登録商標)法の転写条件に重要であることが決定されている。これはまた、以下に記載されるTerminal Region SELEX法に適用することもできる。例えば、修飾された転写物の量の増大が、特定のリーダー配列/変異体ポリメラーゼの組み合わせが使用されるいくつかの条件下で観察され得る。リーダー配列は、DNA転写鋳型の5’末端にある固定された配列の3’末端に取り込ませることができる配列である。リーダー配列は、通常、6〜15ヌクレオチドの長さであり、所定のヌクレオチド組成から構成され得る。例えば、これは、全てがプリンである場合も、また、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドの特定の混合物である場合もある。
HEPES緩衝液の濃度は0から1Mまでの範囲であり得る。本発明によってはまた、5から10の間のpKaを有する他の緩衝物質(例えば、Tris−ヒドロキシメチル−アミノメタンを含む)の使用も意図される。
いくつかの実施形態において鋳型特異的ヌクレオチド三リン酸の重合をプログラムするために使用される核酸転写鋳型配列の発見のための方法によっては、転写物量が増大させられ、これは、Terminal Region SELEX(登録商標)法(TR−SELEX(登録商標)法)として知られているSELEX(登録商標)法の変異形式である。本発明によっては、核酸転写鋳型成分配列(例えば、リーダー配列)を同定するための方法が提供され、その使用によって、転写物量、具体的には、TR−SELEX(登録商標)法を使用する鋳型特異的重合をプログラムするために使用される場合には、2’−修飾されたヌクレオチド(例えば、2’−OMeヌクレオチド)を含む転写物の量が増大する。
一旦、所望される標的に結合するアプタマーが同定されると、いくつかの技術を、必要に応じて、同定されたアプタマーの配列の結合特性および/または機能的特性をさらに高めるために行うことができる。SELEX(登録商標)プロセス(例えば、2’−修飾されたSELEX(登録商標)法)によって同定された所望される標的に結合するアプタマー(例えば、MNAアプタマー)は、所望される結合特性および/または機能的特性を有する最小のアプタマー配列(本明細書中では「最小化された構築物」とも呼ばれる)を得るために、必要に応じて短縮させることができる。これを行うための1つの方法は、折り畳みプログラムおよび配列分析(例えば、保存されているモチーフおよび/または共変動を見るための選択によって得られるクローン配列をアラインメントすること)を使用して、最小化させた構築物の設計についての情報を得ることによる。生化学的プローブ実験もまた、最小化された構築物の設計についての情報を得るために、アプタマー配列の5’境界および3’境界を決定するために行うことができる。最小化された構築物は、その後、化学合成することができ、そしてそれらが由来する最小化されていない配列と比較して、結合特性および機能的特性について試験される。5’、3’、および/または内部欠失のシリーズを含むアプタマー配列の変異体もまた、直接化学的に合成することができ、それらが由来する最小化されていないアプタマー配列と比較して、結合特性および/または機能的特性について試験される。
(1)体内にすでに存在している置換基、例えば、2’−でオキシ、2’−リボ、2’−メチルプリンもしくはピリミジン、または5−メチルシトシン。
脊椎動物の免疫システムによる細菌のDNAの認識は、特定の配列の状況の中のメチル化されていないCGヌクレオチド(「CpGモチーフ」)の認識に基づく。このようなモチーフを認識する1つの受容体はToll様受容体9(「TLR9」)であり、これは、異なる微生物成分を認識することによって先天性免疫応答に関与しているToll様受容体のファミリー(およそ10種類のメンバー)のうちの1つのメンバーである。TLR9は、配列特異的様式で、メチル化されていないオリゴデオキシヌクレオチド(「ODN」)CpG配列に結合する。CpGモチーフの認識によって防御機構が始動させられ、これによって、先天性免疫応答と究極の後天性免疫応答が導かれる。例えば、マウスでのTLR9の活性化によっては、抗原提示細胞の活性化、MHCクラスIおよびII分子のアップレギュレーション、ならびに、重要な共刺激分子およびサイトカイン(IL−12およびIL−23を含む)の発現が誘導される。この活性化によっては、B細胞応答とT細胞応答が、直接的にも、そして間接的にも高められ、これには、TH1サイトカインIFN−γの活発なアップレギュレーションを含む。まとめると、CpG配列に対する応答によっては、感染性疾患に対する防御、ワクチンに対する改善された免疫応答、喘息に対する有効な応答、および改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性が導かれる。したがって、CpG ODNは、感染性疾患に対する防御、免疫アジュバントまたはガン治療薬(単剤療法、またはmAbもしくは他の治療薬との組み合わせ)としての機能を提供することができ、そして、喘息およびアレルギー性の反応を軽減することができる。
このグループの第1のストラテジーには、オリゴヌクレオチドのプールを使用してSELEX(登録商標)を行って、特異的な非CpG標的に対するアプタマーを得る工程(この場合、CpGモチーフは、固定された領域として、またはその一部として、プールの個々のメンバーの中に取り込まれており、例えば、いくつかの実施形態においては、プールのメンバーのランダマイズされた領域にはその中にCpGモチーフが取り込まれている固定された領域を含む)、ならびに、CpGモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第2のストラテジーには、SELEX(登録商標)を行って、特異的な非CpG標的(好ましくは、標的)に対するアプタマーを得、続いて、CpGモチーフの5’および/または3’末端への付加、あるいは、アプタマーの1つの領域(好ましくは、必須ではない領域)の中へのCpGモチーフの操作の選択を含む。このグループの第3のストラテジーには、SELEX(登録商標)を行って、特異的な非CpG標的に対するアプタマーを得る工程(この場合、プールの合成の間に、様々なヌクレオチドのモル比が1つ以上のヌクレオチドの付加において偏らせられ、その結果、プールの個々のメンバーのランダマイズされた領域はCpGモチーフについて富化させられる)、ならびに、CpGモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第4のストラテジーには、SELEX(登録商標)を行って、特異的な非CpG標的に対するアプタマーを得る工程、およびCpGモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第5のストラテジーには、SELEX(登録商標)を行って、特異的な非CpG標的に対するアプタマーを得る工程と、結合すると免疫応答を刺激するが、CpGモチーフが含まれていないアプタマーを同定する工程を含む。
オリゴヌクレオチドをベースとする全ての治療薬(アプタマーを含む)の薬物動態特性を、所望される薬学的用途に適合するように合わせられることが重要である。細胞外標的に特異的なアプタマーは、細胞内送達に伴う問題に悩まされることはない(アンチセンスおよびRNAiをベースとする治療薬が用いられる場合と同様に)が、そのようなアプタマーは、なおも標的の臓器および組織に分布されることが可能でなければならず、そして所望される投与レジュメと一致する時間の間、体内に留まらなければならない(未修飾で)。
上記のように、高分子量の非免疫原性ポリマーでの核酸の誘導には、核酸の薬物動態特性および薬力学的特性を変化させて、それらをさらに有効な治療薬とする可能性がある。活性についての好ましい変化としては、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性の増大、腎臓による濾過の減少、免疫システムへの暴露の減少、および体全体への治療薬の分布の変化を挙げることができる。
高分子量のPAG−核酸−PAG結合体は、一官能性の活性化PEGの、1つ以上の反応部位を含む核酸との反応によって調製することができる。1つの実施形態においては、核酸はニ反応性であるかまたはニ活性化されたものであり、これには、以下の2つの反応部位を含む:従来のホスホルアミダイト合成(例えば、図13に示されるような3’−5’−ジ−PEG化)によってオリゴヌクレオチドの中に導入された5’−アミノ基と3’−アミノ基。別の実施形態においては、反応部位は、例えば、ピリミジンの5位、プリンの8位、または第1級アミンの結合のための部位としてのリボースの2’位を使用して、内部部位に導入することができる。このような実施形態においては、核酸はいくつかの活性化された部位または反応部位を有することができ、マルチ活性化と言われる。合成および精製の後、修飾されたオリゴヌクレオチドは、自発的な加水分解を最小限にしつつ、オリゴヌクレオチドの反応部位との選択的な反応を促進する条件下で、一活性化PEGと混合される。好ましい実施形態においては、モノメトキシ−PEGが、プロピオン酸スクシンイミジルで活性化させられ、そしてカップリング反応がpH8.3で行われる。二置換されたPEGの合成を駆動するためには、オリゴヌクレオチドと比較して立体量論的に過剰なPEGが提供される。反応後、PEG−核酸結合体が、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製されて、完全に結合した種、部分的に結合した種、および未結合の種が分離される。
TR−SELEX(登録商標)法を使用した5’−リーダー配列の同定
以下の構造(5’から3’方向で示す)を有する縮重DNAライブラリー:
T7プロモーター/G4/縮重20ヌクレオチド/3’−固定配列
を、以下の配列を用いて合成した:
T7プロモーターをコードする5’リン酸化オリゴヌクレオチド(ここでは、pは5’リン酸化される可能性がある)」
TR−SELEX(登録商標)法によって同定されたリーダー配列が取り込まれているライブラリー
実施例1に記載したようにTR−SELEX(登録商標)選択を使用して同定されたより高度に2’−修飾された転写物を生じるクローンから同定した5’−リーダー配列エレメント(縮重領域の最初の10ヌクレオチド)を利用して、2’−修飾されたヌクレオチドを含む転写物の量を増大させる目的で5’−固定領域にリーダー配列エレメントを取り込ませたライブラリーを設計した。1つの実施形態においては、設計ストラテジーにより、その後のPCR増幅を促進するためのさらに6〜8個の固定されたヌクレオチドがすぐ続く5’リーダー配列として、同定したクローンの最初の14ヌクレオチド(4個のグアノシンを含む5’固定領域と縮重領域の最初の10個のヌクレオチド)、このすぐ後ろに続く30〜40ヌクレオチドの長さの縮重領域、そのすぐ後に続く、これもまたその後のPCR増幅を促進する3’−固定領域を取り込ませた。
ポリメラーゼの発現および精製
変異体T7 RNAポリメラーゼは、本発明の方法での使用のためには、以下のように調製することができる。T7 RNAポリメラーゼ(核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれ図5Aおよび5Bに示されており、そしてBull,J.Jら、J.Mol.Evol.,57(3),241−248(2003)に記載されている)は、LA変異体(Y639L/H784A)、LAR変異体(Y639L/H784A/K378R)、LLA変異体(P266L/Y639L/H784A)、またはLLAR変異体(P266L/Y639L/H784A/K378R)を生じるように変異させることができる。T7 RNAポリメラーゼは、発現ベクター(T7 RNAポリメラーゼ発現ベクターの一例は、米国特許出願番号5,869,320(その全体が引用により本明細書中に組み入れられる)に記載されている)の中に含めることができ、また、突然変異誘発の後に発現ベクターに挿入することもできる。変異させたT7 RNAポリメラーゼは、必要に応じて、タンパク質精製の際の使用を容易にするためのHis−タグを含むように操作することができる。
変異体T7ポリメラーゼ核酸配列を含む発現ベクターを、BL21(DE3)コンピテント細胞(Stratagene,CA)に形質転換し、氷上で20分間インキュベートした。熱ショックを、42℃の中に試験管を2分間、差し込むことによって行った。氷上に試験管を1分間、差し込んだ後、1mLの培養液(「LB」)を添加し、37℃の震盪装置の中で45分間インキュベートした。100μlの培養液をLB+Amp寒天プレート上にプレートし、37℃で一晩インキュベートした。
2’−O−メチルヌクレオチドを100%取り込む転写
実施例4A:2’−OH GTPを用いない2’−O−メチル転写
Y639L/H784A/K378R変異体ポリメラーゼの、2’−OH GTPの濃度に対する感度を試験するための実験を、2’−OH GTPの滴定を使用して行った。
Y639L/H784A/K378R変異体T7 RNAポリメラーゼを使用し、2’−OH GTPを使用しないMNAの転写の忠実性と偏りを評価するためのさらなる実験を行った。忠実性を試験するために、TR−SELEX(登録商標)選択によって同定した1つのクローニングした配列(実施例1に記載した)をPCRによって増幅させ、Y639L/H784A/K378Rポリメラーゼを使用し、そして2−OH GTPを使用しないMNA転写をプログラムするために使用し、PAGEによって精製し、残っているDNA鋳型をRQ1 DNaseを使用して消化させ(その後、DNA鋳型が存在していないことをPCRによってアッセイした)、そして転写された材料を逆転写させ(Thermoscript,Invitrogen,Carlsbad,CA)、次いでPCRによって増幅させた。このPCR産物を配列決定し、次いで、欠失、挿入、および置換の統計データを計算した。この実験で配列決定した1300塩基の中では、欠失および挿入は観察されず、3個の置換が観察された(図9を参照のこと)。これらの数は、30ヌクレオチドの縮重領域の中にコードされている配列情報が、93%の忠実性でSELEX(登録商標)の次の回に伝達されることを示唆している。この数は、野生型RNAについて測定される数を上回るほどに高い。
鋳型1から4:
多種多様のリーダー配列とともにY639L/H784A/K378R変異体T7 RNAポリメラーゼを使用した場合の転写量を比較するために、リーダー配列(配列番号126から129の1位から14位、以下)中のピリミジンに対して様々な割合のプリンを含む4種類の鋳型を、様々な定常領域を用いて合成した。DNA鋳型を、ABI EXPEDITE(登録商標)(Applied Biosystems,Foster City,CA)DNA合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。配列(5’から3’方向で示す)は以下である:
上記の鋳型1から4と同様に、複数のリーダー配列についての転写量を評価した。4種類の鋳型を様々な定常領域を用いて合成した。DNA鋳型を、ABI EXPEDITE(登録商標)(Applied Biosystems,Foster City,CA)DNA合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。配列(5’から3’方向で示す)は以下である:
以下のDNA鋳型およびプライマーを使用して、二本鎖の転写鋳型を生じるためのポリメラーゼ連鎖反応をプログラムした。Nは、ATGCのそれぞれが存在する可能性がほぼ等しい縮重位置を示しており、全ての配列を、5’から3’方向で列挙する。PCR鋳型(ARC2118)
Y639L/H784A/K378R変異体T7 RNAポリメラーゼを使用したアプタマーの選択
ヒトAng2(本明細書中以後、「h−Ang2」)に対するアプタマーを同定するための選択を、2’−OMeプリンヌクレオチドおよび2’−OMeピリミジンヌクレオチドからなるプール(本明細書中以後、「MNA」)を使用して行った。この選択ストラテジーによって、h−Ang2に特異的な高親和性アプタマーが得られた。
プールの調製
配列
選択は、330pmole(2×1014個の分子)のMNA ARC2118プールを、100μLの最終容量の選択緩衝液(1×ダルベッコPBS(DPBS))の中で100pmoleのタンパク質と共に、室温で1時間インキュベートすることによって開始した。RNA−タンパク質複合体と、結合していないRNA分子を、0.45マイクロンのニトロセルローススピンカラム(Schleicher and Schuell,Keene,NH)を使用して分離させた。カラムをKOHで前処理し(1mLの0.5M KOH中のSoakカラムフィルター RTで15分間;スピンスルー(spin through)、1mLのdH2O中のSoakフィルター、RTで5分間;スピンスルー)、1mLの1×PBSで2回洗浄し、その後、プール:Ang2複合体を含む溶液をカラムに添加し、1500×gで2分間遠心分離した。フィルターを、500μLのDPBSで2回洗浄して、非特異的結合剤を除去した。RNAを、2×100μLの溶出緩衝液(7Mの尿素、100mMの酢酸ナトリウム、3mMのEDTA、予め95℃に加熱した)の添加によって溶出させ、その後、エタノールで沈殿させた。RNAを、製造業者の説明書にしたがって、プライマー(配列番号119)を使用して、ThermoScript RT−PCR(登録商標)システム(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて逆転写させた。cDNAを、製造業者の説明書にしたがって、配列番号118および配列番号119を使用して、Taqポリメラーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)を用いてPCRによって増幅させた。鋳型を、プールの調製のために上記に記載したように転写させ、そして変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。
ドットブロット結合アッセイを、プールのタンパク質結合親和性をモニターするために、選択によって行った。微量の32Pで末端標識したプールのRNAをh−Ang2と混合し、30μLの最終容量においてDPBS緩衝液中で30分間、室温でインキュベートした。混合物をニトロセルロース膜、ナイロン膜、およびゲルブロット膜(上から下に)でアセンブリしたドットブロット装置(Minifold−1 Dot Blot,Acrylic,Schleicher and Schuell,Keene、NH)にアプライした。タンパク質に結合したRNAはニトロセルロースフィルター上に捕捉され、一方、タンパク質に結合していないRNAはナイロンフィルター上に捕捉される。h−Ang2結合の富化は、9回目から見られた。9回目、10回目、および12回目のプールの鋳型を、製造業者による説明書にしたがってTOPO TAクローニングキット(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用してクローニングし、そして26個の特有のクローンを化学合成のために選択し、解離定数(KD)を決定した。簡単に説明すると、合成のRNAをγ−32P ATPで5’末端を標識し、KD値を、ドットブロットアッセイと1×DPBS(w/Ca2+およびMg2+)(Gibco,カタログ番号14040,Invitrogen,Carlsbad,CA)の緩衝液条件を使用して決定した。KDは、データを以下の方程式にフィットさせることによって概算した:結合したRNAの割合=amplitude*(((AptConc+[h−Ang2]+KD)−SQRT((AptConc+[h−Ang2]+KD)2−4(AptConc*[h−Ang2])))/2*AptConc))+バックグラウンド。結果を以下の表4に報告する。
Elisaアッセイ
いくつかのアプタマーをELISAアッセイにおいて試験した。ELISAアッセイは、Tie2受容体に対するAng2の結合を妨害するそれらの能力を測定するように設定した。Tie2受容体を捕捉するために、100μLのPBS(pH7.4)の中の150ngのTie2−Fc(R&D systems 313−TI−100−CF,Minneapolis,NY)を96ウェルMaxisorbプレート(NUNC#446612,Rochester,NY)上にのせ、そして4℃で一晩インキュベートした。捕捉の際には、50μLの様々な濃度の合成のRNAを、0.1%のBSAを含むPBS中の1.8nM(100ng/mLの最終Ang2濃度を有する50μLの3.6nMのAng2(200ng/mL)(R&D systems 623−AN−025/CF,Minneapolis,NY)と混合し、そして室温で1時間インキュベートした。捕捉溶液を一晩のインキュベーション後に除去し、そしてプレートを200μLのTBST(25mMのTris−HCl、pH7.5、150mMのNaCl、および0.01%のTween 20)で3回洗浄した。その後、プレートを、5%の無脂肪粉乳を含む200μLのTBSTで、室温で30分間ブロックした。ブロック後、プレートを、200μLのTBSTで再度3回、室温で洗浄し、合成のRNA:Ang2混合物をプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。その後、プレートを、200μLのTBSTで3回洗浄し、100μLのビオチニル化ヤギ抗Ang2抗体(1:1000;R&D Systems BAF623,Minneapolis、MN)を添加し、室温で1時間インキュベートした。200μLのTBSTでの3回の洗浄後、100μLのHRP結合ストレプトアビジン(1:200;R&D Systems #DY998,Minneapolis、MN)を添加し、そして室温で0.5時間インキュベートした。その後、プレートを再び200μLのTBSTで3回洗浄し、100μLのTMP溶液(Pierce,#34028)を添加し、そして、室温で5分間、暗所でインキュベートした。2NのH2SO4を含む100μLの溶液を反応を停止させるために添加し、そしてプレートをSpectroMaxによって450nmで読み取った。結果を、以下の表4の最後の列に示す。
ヒトの臍帯血内皮細胞(「HUVEC」)(ATCC)およびK293細胞(ヒトTie2受容体を過剰発現している細胞株)を使用して、細胞膜上のTie2受容体に対するAng2の結合を阻害する特異的MNA Ang2アプタマーのIC50を決定した。簡単に説明すると、組み換え体哺乳動物発現ベクターpCDMA3.1−Tie2を293細胞(ATCC,Manassas,VA)にトランスフェクトし、次いで、G418(Invitrogen,Carlsbad,CA)での選択後に安定なクローンを得た。フローサイトメトリーは、HUVECおよびK283細胞の両方の上でのTie2タンパク質の発現を示した。Ang2の滴定アッセイによって、さらに、HUVECおよびK293細胞上でのアプタマー阻害アッセイのためにAng2(R&D Systems.Minneapolis,MN)の量を決定した。これはそれぞれ、1μg/mLおよび0.1μg/mLであった。
Y639L/H784A/K378R変異体T7 RNAポリメラーゼを使用したアプタマーの選択
ヒトIgE(本明細書中以後「h−IgE」)に対するアプタマーを同定するための選択を2’−OMeプリンヌクレオチドおよび2’−OMeピリミジンヌクレオチドからなるプール(本明細書中以後、「mRmY」)を使用して行った。この選択ストラテジーによって、h−IgEに特異的な高親和性アプタマーが得られた。
プールの調製
配列
選択は、330pmole(2×1014個の分子)のMNA ARC2118プールを、100μLの最終容量の選択緩衝液(1×ダルベッコPBS(DPBS))の中のBSAでブロックした疎水性プレート(Maxisorpプレート,Nunc,Rpchester,NY)に結合させた24pmoleのタンパク質とともに、室温で1時間インキュベートすることによって開始した。ウェルを、120μLのDPBSで4回洗浄して、非特異的結合剤を除去した。RNAを溶出させ、そして製造業者の説明書にしたがって、プライマー(配列番号119)を使用して、ThermoScript RT−PCR(登録商標)システム(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて逆転写させた。cDNAを、製造業者の説明書にしたがって、配列番号118および配列番号119を使用して、Taqポリメラーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)を用いてPCRによって増幅させた。鋳型を、プールの調製のために上記に記載したように転写させ、そして変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。
ドットブロット結合アッセイを、プールのタンパク質結合親和性をモニターするための選択によって行った。微量の32Pで末端標識したプールのRNAをh−IgEと混合し、30μLの最終容量においてDPBS緩衝液中で30分間、室温でインキュベートした。この混合物をニトロセルロース膜、ナイロン膜、およびゲルブロット膜(上から下に)でアセンブリしたドットブロット装置(Minifold−1 Dot Blot,Acrylic,Schleicher and Schuell,Keene、NH)にアプライした。タンパク質に結合したRNAはニトロセルロースフィルター上に捕捉され、一方、タンパク質に結合していないRNAはナイロンフィルター上に捕捉される。h−IgE結合の富化は、8回目から見られた。5回目、8回目、および12回目のプールの鋳型を、製造業者による説明書にしたがってTOPO TAクローニングキット(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用してクローニングした。配列決定データは、8回目のプールが、配列全体の59%を含む、1つの主要なクローンに集中していたことを明らかにした。この主要なクローンと3個の可能性のあるミニマー(minimer)を化学合成のために選択し、解離定数(KD)を決定した。簡単に説明すると、合成のRNAをγ−32P ATPで5’末端標識し、KD値を、ドットブロットアッセイと1×DPBS(w/Ca2+およびMg2+)(Gibco,カタログ番号14040,Invitrogen,Carlsbad,CA)の緩衝液条件を使用して決定した。KDは、データを以下の方程式にフィットさせることによって概算した:結合したRNAの割合=amplitude*(((AptConc+[h−IgE]+KD)−SQRT((AptConc+[h−IgE]+KD)2−4(AptConc*[h−IgE])))/2*AptConc))+バックグラウンド。主要なクローンは、約800pMのKDを有していた。最もよく結合したミニマーもまた、サルIgE(m−IgE)に対する結合について試験したが、サルIgEタンパク質に対して交差反応性である結合は示さなかった。この交差反応性がないことを、ELISAによっても確認した。3’末端上に反転したdTを有するミニマーを、医薬品化学プロセスのための親分子として使用した。
IgE特異的MNAミニマーの1つの化学的組成(図11)を、化合物の血漿安定性を維持したまま、親和性および効力を改善するために変化させた。このプロセスには最小化させたIgEアプタマーの誘導体のシリーズの設計、合成、および評価を含めた。ここでは、このシリーズの個々の誘導体には、どの残基が置換を寛容化するかを決定するために、予め決定したヌクレオチドの個々の出現頻度の1つの修飾を含めた。修飾の最初のセットは、個々の特有の2’−OMeヌクレオチドについてのデオキシヌクレオチドの置換とした。別の回の修飾においては、誘導体の1つのシリーズを合成した。ここでは、個々の誘導体に、様々なヌクレオチド間結合部位に1つのホスホロチオエート修飾を含めた。これらの初期段階での修飾において得られたデータを使用して、最小化したアプタマーについての構造と活性の関係(SAR)を確立した。続く段階での修飾においてはアプタマーを合成し、そして、最初のSARデータに基づいて設計した置換の複合的なセットを用いて試験した。複合的な置換のパネルから、その組成の中に導入された2’−デオキシ置換に対して2つの2’−OMeを有する39ヌクレオシドの長さのアプタマーを同定した。加えて、その組成の中に、1つの2’−OMeから2’−デオキシへの置換と、その中に取り込ませた4個のリン酸基からホスホロチオエートへの置換基を有する、39ヌクレオチドの長さの、得られた修飾された最小化したアプタマーを同定した。図12に示したように、このデオキシ/ホスホロチオエート修飾されたアプタマーは、最小化したが未修飾のもとのアプタマー、ならびに、2’−OMe置換について2つのデオキシを有するもとの最小化したアプタマーのいずれと比較しても、高い結合親和性を示した。
最小化した未修飾の元のアプタマー、およびデオキシ/ホスホロチオエート修飾されたアプタマーを、ヒト、ラット、およびサルの血清の中でのそれらの安定性を決定するためにアッセイした。個々のアプタマーを、90%の血清中に5μMの最終濃度のなるように、1mlのプールした血清に添加した。アプタマーを、震盪させながら37℃でインキュベートし、そして時点は、0、0.5、1、4、24、48、72、および98時間とした。それぞれの時点で、インキュベートした試料からの90μlのストックを、10μlの0.5MのEDATに添加し、BIACORE 2000システムを使用する後の安定性についての分析のために、−20℃で凍結させた。
Claims (36)
- 639位と784位とに改変アミノ酸を含む、単離されたT7 RNAポリメラーゼであって、該639位の改変アミノ酸がロイシンであり、かつ該784位の改変アミノ酸がアラニンである、単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- さらに378位に改変アミノ酸を含む、請求項1に記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- さらに266位に改変アミノ酸を含む、請求項1に記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- さらに266位および378位に改変アミノ酸を含む、請求項1に記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- 前記266位の改変アミノ酸がロイシンである、請求項3または4に記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- 前記378位の改変アミノ酸がアルギニンである、請求項2または4に記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- 前記改変アミノ酸が、2’−OMeヌクレオチド三リン酸のみを含む転写反応において、ポリメラーゼによる、2’−OMe修飾を含む核酸の転写量を増大させる、請求項1〜6のいずれかに記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- 前記生じた転写量の増大が、転写が同じ転写条件下で行われた場合の、639位にチロシンを、784位にヒスチジンを含む野生型T7 RNAポリメラーゼに対する増大である、請求項7に記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- 前記改変アミノ酸によって、2’−OMe修飾ヌクレオチド三リン酸に対する識別が低下する、請求項1〜8のいずれかに記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- 前記2’−OMeヌクレオチド三リン酸に対する識別の低下が、639位にチロシンを、784位にヒスチジンを含む野生型T7 RNAポリメラーゼに対する低下である、請求項9に記載の単離されたT7 RNAポリメラーゼ。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号102、および配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリメラーゼを、転写を生じるために十分な反応条件下で鋳型核酸とともにインキュベートする工程を含む、一本鎖核酸を転写する方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
- 配列番号122、配列番号123、配列番号124、および配列番号125からなる群より選択される核酸配列からなる、単離された核酸。
- 請求項13または14に記載の単離された核酸配列を含む、ベクター。
- プロモーターに作動可能に連結された請求項13または14に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項16に記載の発現ベクターを含む、細胞。
- 前記T7 RNAポリメラーゼが前記細胞によって発現される、請求項17に記載の細胞。
- 請求項1〜11のいずれかに記載のT7 RNAポリメラーゼを含む容器を含む、キット。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のT7 RNAポリメラーゼをコードする核酸を含む容器を含む、キット。
- 完全な2’−OMe核酸を転写する方法であって、
a)請求項1〜11のいずれか1項に記載のT7 RNAポリメラーゼ、核酸転写鋳型、およびヌクレオチド三リン酸を含む転写反応混合物中で鋳型核酸をインキュベートする工程であって、該ヌクレオチド三リン酸が2’−OMe修飾される、工程、ならびに、
b)一本鎖核酸を生じるために十分な時間の間、該転写反応混合物を転写する工程であって、該一本鎖核酸のヌクレオチドは、該転写物の最初のヌクレオチドが2’非修飾であり得ることを除き、全てが2’−OMe修飾される、工程
を包含する、方法。 - 前記転写反応混合物が、さらにマグネシウムイオンを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記転写反応混合物が、さらにマンガンイオンを含む、請求項21から22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写反応混合物が、さらに非2’−OMeグアノシン非三リン酸残基を含む、請求項21から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写鋳型がT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含む、請求項21から24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マグネシウムイオンが、前記マンガンイオンよりも3.0から3.5倍高い濃度で前記転写反応混合物の中に存在する、請求項23から25に記載の方法。
- 各ヌクレオチド三リン酸が1.0mMの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が6.5mMであり、そしてマンガンイオンの濃度が2.0mMである、請求項23から26のいずれか1項に記載の方法。
- 各ヌクレオチド三リン酸が1.5mMの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が8mMであり、そしてマンガンイオンの濃度が2.5mMである、請求項23から26のいずれか1項に記載の方法。
- 各ヌクレオチド三リン酸が2.0mMの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が9.5mMであり、そしてマンガンイオンの濃度が3.0mMである、請求項23から26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写反応混合物がポリエチレングリコールをさらに含む、請求項21から29のいずれかに記載の方法。
- 前記非2’−OMeグアノシン非三リン酸残基が、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、2’−フルオログアノシン一リン酸、2’−フルオログアノシン二リン酸、2’−アミノグアノシン一リン酸、2’−アミノグアノシン二リン酸、2’−デオキシグアノシン一リン酸、および2’−デオキシグアノシン二リン酸からなる群より選択される、請求項24から30のいずれかに記載の方法。
- 前記転写反応混合物が無機ピロホスファターゼを含む、請求項21から31のいずれか1項に記載の方法。
- アプタマーを同定するための方法であって、
a)請求項1から11のいずれか1項に記載のT7 RNAポリメラーゼと、1つ以上の核酸転写鋳型を含む転写反応混合物を調製する工程;
b)該転写反応混合物を転写して、一本鎖核酸の候補混合物を生じる工程であって、該一本鎖核酸のヌクレオチドのうち、必要に応じて1つを除く全てが2’−OMe修飾される、工程;
c)該候補混合物を標的分子と接触させる工程;
d)該標的分子に対して高い親和性を有する核酸を分離する工程;ならびに、
e)該親和性が高い核酸を増幅して、アプタマーが富化した混合物を得る工程であって、それによって、該アプタマーの最初のヌクレオチドが2’非修飾であり得ることを除き、全て2’修飾されたヌクレオチドを含む、該標的分子に対するアプタマーが同定される、工程、
を包含する、方法。 - 前記増幅工程が
(i)必要に応じて、前記親和性が高い核酸を前記標的分子から解離させること;
(ii)該核酸−標的複合体から解離した該親和性が高い核酸を逆転写すること;
(iii)該逆転写された親和性が高い核酸を増幅すること;および
(iv)前記転写鋳型として該増幅かつ逆転写された親和性が高い核酸を含む転写反応混合物を調製し、前記転写混合物を転写すること、
を包含する、請求項33に記載の方法。 - 前記1つ以上の核酸転写鋳型が、T7 RNAポリメラーゼプロモーターと、該T7 RNAポリメラーゼプロモーターのすぐ3’側にあるリーダー配列を含む、請求項33から34のいずれか1項に記載の方法。
- 工程a)からe)を繰り返し行うことを含む、請求項33から35のいずれか1項に記載の方法。
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