CN112921014B - T7RNA聚合酶突变体、mRNA、基因、表达载体及细胞 - Google Patents

Abstract

本发明的T7RNA聚合酶突变体，由SEQ ID No:1所示的野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列中通过突变氨基酸突变所得的突变体，所述突变氨基酸为Y639T、M635V、R632Q、K631L、Y571T、R627E、K472S中的一种或多种组合。这里的T7 RNA聚合酶突变体具有基于T7启动子的RNA聚合酶活性，且可利用一种或多种修饰核苷酸作为底物合成修饰信使核糖核酸。且与野生型T7 RNA聚合酶相比，所述的T7 RNA聚合酶变体具有显著增强的基于上述修饰核苷酸底物的mRNA合成效率。

Description

T7RNA聚合酶突变体、mRNA、基因、表达载体及细胞

在先申请：201911237625.9

技术领域

本发明涉及酶工程以及信使核糖核酸(mRNA)体外转录领域，具体涉及与利用修饰核苷酸为底物转录合成mRNA的T7 RNA聚合酶突变体相关的酶突变体、mRNA、基因、表达载体及细胞。

背景技术

早在1970年代，体外合成的RNA被证明能通过转染技术递送到细胞内（Dubes GR,Wegrzyn RJ (1978) Protoplasma 96:209–223）。然而，直到1992年体外转录的RNA才被证实能通过递送至细胞内发挥特定的生理效应（Jirikowski GF (1992) Science 255:996–998）。而体外转录的mRNA作为编码抗原或重组蛋白药物应用于药物治疗、疫苗领域则直到2000年以后才越来越受关注（Weide B, (2008) J Immunother 31:180–188， Weide B ，(2009) J Immunother 32:498–507）。近年以来由于体外转录mRNA应用于肿瘤疫苗或其他治疗领域取得了广泛而快速的突破，使mRNA体外转录合成技术受到空前的重视（UgurSahin，Nature 547, 222–226 (2017) ）。目前已有多个mRNA疫苗、药物进入临床试验。

MRNA作为疫苗等治疗手段的技术瓶颈包括mRNA具有免疫源性难点，在细胞内的蛋白质翻译能力效率难点，将mRNA递送到细胞内的递送技术难点，以及大规模体外转录的效率难点等（Ugur Sahin等，Nature Reviews Drug Discovery 13：759–780 (2014) ）。近几年在这方面的技术突破使mRNA作为潜在的治疗手段具备了光明的前景。利用修饰核苷酸体外转录合成修饰mRNA是近年来的重大突破。研究发现，修饰mRNA具有极大降低的免疫原性，极大提高的蛋白质翻译效率，使mRNA的成药性大大增加。例如，Kormann等发现5-Methyl-CTP, 2-Thio-UTP修饰的mRNA使Toll样受体等介导的免疫反应极大降低，且在小鼠体内表现出良好的稳定性， 修饰mRNA编码的EPO蛋白在小鼠体内具有良好的药代动力学特性（Kormann等， Nature Biotechnology 29:154.）。N6-Methyl-ATP，Pseudo-UTP， N1-Methylpseudo-UTP， 5-Methoxy-UTP，N1-Methyl-ATP，N4-Acetyl-CTP修饰的mRNA也具有类似的效应（He等 (2002) Molec. Pharmac. 62 (5):1187，Karikó等 (2008) MolecularTherapy. 16 (11):1833， Andies等 (2015) J. Control. Release 217:337， Li 等(2016) Bioconjugate Chem. 27:849， Dominissini 等(2016) Nature 530 (7591):441，Arango等 (2018) Cell 175 (7):1872）。尽管T7 RNA聚合酶能利用上述修饰核苷酸通过转录合成mRNA, 然而，与正常的非修饰核苷酸相比，其转录效率比较低。修饰mRNA作为一种具有极高潜力和影响力的治疗手段，其大规模生产将会成为重要的市场需求。基于目前野生型T7 RNA聚合酶的低效的修饰mRNA转录合成能力，修饰mRNA的大规模工业化生产将会面临极大的挑战。

T7 RNA聚合酶（E.C.2.7.7.6）是一种噬菌体来源的单亚基的DNA依赖性RNA聚合酶，可催化从5’ 到3’方向的RNA合成。早期研究确证了T7 RNA聚合酶的氨基酸序列已及重组表达方法（Schenborn, E.T.等， (1985). Nucl. Acids Res. 13, 6223-6236；Davanloo, P等，(1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 2035-2039 ）。T7 RNA聚合酶由883个氨基酸组成，蛋白质分子量约99 Kda。T7 RNA聚合酶通过识别特定的T7 启动子序列并启动转录过程，并利用ATP， UTP，CTP与GTP这四种天然核苷酸作为底物，通过与DNA模板碱基配对，通过碱基互补配对原则合成RNA。早期对T7 RNA聚合酶的一系列蛋白质晶体学结构研究为我们理解T7 RNA聚合酶介导的转录活性奠定了比较好的基础。例如，Sousa,R 与D Jeruzalmi等人初步阐明对T7 RNA聚合酶的蛋白质整体结构（Jeruzalmi, D.等，EMBO.J , 2004, 17, 4101–4113； Sousa, R等，Nature 364, 593–599.），并推测出RNA合成的必要步骤和T7 RNA酶的合成机制。重要的是，Dmitry Temiakov等人研究通过T7 RNA聚合酶与底物类似物的共结晶的结构，并结合定点突变技术，阐明了T7 RNA聚合酶对底物选择性的关键机制以及重要氨基酸位点，具体包括Y639，M635，R632，K631，Y571，R627，K472等（Dmitry Temiakov等， Cell, (2004) 116, 381–391）。这一机理阐明为T7 RNA聚合酶对底物选择性的蛋白质工程改造提供了理论基础。另外，据Ikeda等公开发表的文献报道（Ikeda, R. A. et al. Biochemistry, 31:9073-9080, 1992 and Ikeda, R. A. etal., Nucl. Acid. Res., 20: 2517-2524, 1992），通过基于T7 RNA聚合酶对T7启动子转录活性的双质粒筛选系统，可实现对T7 RNA聚合酶突变体的功能筛选。另外，据JijumonChelliserrykattil 等报道（Jijumon Chelliserrykattil等， Nat Biotechnol. 2004 22(9):1155-60.），利用类似的双质粒筛选系统能筛选出扩展底物范围的T7 RNA聚合酶突变体，并成功筛选出能利用2‘-O甲基修饰的核苷酸作为底物的T7 RNA聚合酶突变体。’这为T7RNA聚合酶的蛋白质工程改造提供了可参考的方法。

从目前已有的文献和专利来看，对T7 RNA聚合酶的蛋白质工程改造主要集中在提高T7 RNA聚合酶的稳定性以及利用2’-O饰的核苷酸底物合成RNA，且应用领域多为合成核酸适配体，而非应用于表达抗原或治疗性蛋白质的体外转录mRNA。本发明通过两亲性双质粒筛选系统方法筛选出一种能高效利用多种修饰核苷酸作为底物合成修饰mRNA的T7 RNA聚合酶突变体。体外转录测试表明， 该T7 RNA聚合酶突变体能利用包括5-甲基胞嘧啶核苷三磷酸（5-Methyl-CTP），N6-甲基腺嘌呤核苷三磷酸（N6-Methyl-ATP），2-巯基-尿嘧啶核苷三磷酸（2-Thio-UTP），假尿嘧啶核苷三磷酸（Pseudo-UTP），N1-甲基假尿嘧啶核苷三磷酸（N1-Methylpseudo-UTP）， 5-甲氧基-尿嘧啶核苷三磷酸（5-Methoxy-UTP），N1-甲基-腺嘌呤核苷三磷酸（N1-Methyl-ATP）， N4-乙酰-胞嘧啶核苷三磷酸（N4-Acetyl-CTP）在内的一种或多种修饰核苷酸转录生成修饰mRNA。尽管野生型T7 RNA聚合酶也能在某种程度利用上述修饰核苷酸底物合成mRNA，然而其转录活性较之非修饰核苷酸底物大幅下降。从已知专利可知，专利US9790531 B2提供了一种T7 RNA聚合酶突变体与加帽酶D1亚基、DNA聚合酶Tgo的融合蛋白。该专利提供的融合蛋白可利用一种或多种修饰核苷酸转录合成修饰mRNA。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种T7 RNA聚合酶突变体，该突变体可利用修饰核苷酸包括5-甲基胞嘧啶核苷三磷酸（5-Methyl-CTP），N6-甲基腺嘌呤核苷三磷酸（N6-Methyl-ATP），2-巯基-尿嘧啶核苷三磷酸（2-Thio-UTP），假尿嘧啶核苷三磷酸（Pseudo-UTP），N1-甲基假尿嘧啶核苷三磷酸（N1-Methylpseudo-UTP）， 5-甲氧基-尿嘧啶核苷三磷酸（5-Methoxy-UTP），N1-甲基-腺嘌呤核苷三磷酸（N1-Methyl-ATP）， N4-乙酰-胞嘧啶核苷三磷酸（N4-Acetyl-CTP）中的一种或者多种组合转录合成修饰mRNA，且与野生型T7 RNA聚合酶相比，其转录合成修饰mRNA的活性显著提高。因此，本发明提供的T7 RNA聚合酶突变体能应用于修饰mRNA的大规模工业化生产。

本发明公开的T7 RNA聚合酶突变体，由SEQ ID No:1（指序列表中的序列1，）所示的野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列中通过突变氨基酸突变所得的突变体，突变氨基酸为Y639T、M635V、R632Q、K631L、Y571T、R627E、K472S中的一种或多种组合。

本发明公开的mRNA，为以一种或多种修饰核苷酸作为底物，经T7 RNA聚合酶突变体合成修饰得到。

作为一种优选，修饰核苷酸包括5-甲基胞嘧啶核苷三磷酸、N6-甲基腺嘌呤核苷三磷酸、2-巯基-尿嘧啶核苷三磷酸、假尿嘧啶核苷三磷酸、N1-甲基假尿嘧啶核苷三磷酸、5-甲氧基-尿嘧啶核苷三磷酸、N1-甲基-腺嘌呤核苷三磷酸、N4-乙酰-胞嘧啶核苷三磷酸中的一种或者多种组合。

本发明公开的基因，编码前述基因序列，其DNA序列由SEQ ID No:1所示的野生型T7 RNA聚合酶DNA序列根据突变氨基酸的突变位点通过突变相应的DNA密码子序列得到。

作为一种优选，突变的DNA密码子包括包括与Y639T、M635V、R632Q、K631L、Y571T、R627E、K472S在内的突变氨基酸的突变相一致的所有编码密码子。

本发明公开的基因表达载体，为将运载体通过插入基因从而表达T7 RNA聚合酶突变体。

作为一种优选，运载体包括pET21a(+)或 pET28a(+)或pET30(+)。

本发明公开的细胞，细胞能够根据前述基因从而表达前述T7 RNA聚合酶突变体。

作为一种优选，细胞为将前述基因表达载体转染到感受态细胞得到。

作为一种优选，感受态细胞包括DH5-alpha感受态细胞或TOP10感受态细胞或BL21感受态细胞。

作为一种优选，细胞其表达温度为16-30℃。

作为一种优选，细胞其表达为在0.2-1mM浓度的IPTG环境下进行。

本发明实质上通过两亲性双质粒筛选系统方法筛选出一种能高效利用多种修饰核苷酸作为底物合成修饰mRNA的T7 RNA聚合酶突变体。体外转录测试表明， 该T7 RNA聚合酶突变体能利用一种或多种修饰核苷酸转录生成修饰mRNA。该突变体不仅能利用上述修饰核苷酸底物合成mRNA，且转录合成mRNA的效率与野生型T7 RNA聚合酶相比得到大幅度提高。且该突变体转录合成的修饰mRNA能在细胞内翻译成相应的蛋白，蛋白表达量得到显著提高。T7 RNA聚合酶突变体具有基于T7启动子的RNA聚合酶活性，且可利用一种或多种修饰核苷酸作为底物合成修饰mRNA。且与野生型T7 RNA聚合酶相比，T7 RNA聚合酶变体具有显著增强的基于上述修饰核苷酸底物的mRNA合成效率。

具体地，本发明T7 RNA聚合酶突变体是通过SEQ ID No.1所示的野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列通过Y639T，M635V，R632Q，K631L，Y571T，R627E，K472S突变所得。T7 RNA聚合酶突变体可利用一种或多种修饰核苷酸转录合成修饰mRNA，且与野生型T7 RNA聚合酶相比具有显著提高的转录活性。

更进一步地，修饰核苷酸包括5-甲基胞嘧啶核苷三磷酸（5-Methyl-CTP），N6-甲基腺嘌呤核苷三磷酸（N6-Methyl-ATP），2-巯基-尿嘧啶核苷三磷酸（2-Thio-UTP），假尿嘧啶核苷三磷酸（Pseudo-UTP），N1-甲基假尿嘧啶核苷三磷酸（N1-Methylpseudo-UTP），5-甲氧基-尿嘧啶核苷三磷酸（5-Methoxy-UTP），N1-甲基-腺嘌呤核苷三磷酸（N1-Methyl-ATP），N4-乙酰-胞嘧啶核苷三磷酸（N4-Acetyl-CTP）。

本发明提供了一种基因，该基因编码T7 RNA聚合酶突变体，为SEQ ID No:2至SEQID No:4 所示的野生型T7 RNA 聚合酶基因序列通过与Y639T，M635V，R632Q，K631L，Y571T，R627E，K472S氨基酸突变相应的编码基因突变所得。T7 RNA 聚合酶突变体具有DNA依赖性RNA聚合酶活性，可利用一种或多种修饰核苷酸转录合成修饰mRNA，且与野生型T7 RNA聚合酶相比具有显著提高的转录活性。

本发明提供了一种细胞，细胞能表达T7 RNA聚合酶突变体。T7 RNA聚合酶突变体是通过SEQ ID No.1所示的野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列通过Y639T，M635V，R632Q，K631L，Y571T，R627E，K472S突变所得。T7 RNA聚合酶突变体可利用一种或多种修饰核苷酸转录合成修饰mRNA，且与野生型T7 RNA聚合酶相比具有显著提高的转录活性。

本发明另一方面提供了T7 RNA聚合酶突变体的制备方法，包括（1）通过两亲性双质粒筛选系统方法筛选T7 RNA聚合酶突变体，所得突变体为SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列在Y639T，M635V，R632Q，K631L，Y571T，R627E，K472S的突变，T7 RNA聚合酶突变体可利用一种或多种修饰核苷酸转录合成修饰mRNA，且与野生型T7 RNA聚合酶相比具有显著提高的转录活性（2）用编码T7 RNA聚合酶突变体的基因所在的质粒转化感受态细胞；（3）T7 RNA聚合酶突变体蛋白表达纯化。

进一步地，修饰核苷酸包括5-甲基胞嘧啶核苷三磷酸（5-Methyl-CTP），N6-甲基腺嘌呤核苷三磷酸（N6-Methyl-ATP），2-巯基-尿嘧啶核苷三磷酸（2-Thio-UTP），假尿嘧啶核苷三磷酸（Pseudo-UTP），N1-甲基假尿嘧啶核苷三磷酸（N1-Methylpseudo-UTP）， 5-甲氧基-尿嘧啶核苷三磷酸（5-Methoxy-UTP），N1-甲基-腺嘌呤核苷三磷酸（N1-Methyl-ATP），N4-乙酰-胞嘧啶核苷三磷酸（N4-Acetyl-CTP）。

一种T7 RNA聚合酶突变体，是由SEQ ID No:1所示的野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列中通过Y639T，M635V，R632Q，K631L，Y571T，R627E，K472S的突变方式所得的突变体。T7RNA聚合酶突变体具有基于T7启动子的RNA聚合酶活性，且可利用一种或多种修饰核苷酸作为底物合成修饰mRNA。且与野生型T7 RNA聚合酶相比，T7 RNA聚合酶变体具有显著增强的基于上述修饰核苷酸底物的mRNA合成效率。

T7 RNA聚合酶突变体，其中修饰核苷酸包括5-甲基胞嘧啶核苷三磷酸（5-Methyl-CTP），N6-甲基腺嘌呤核苷三磷酸（N6-Methyl-ATP），2-巯基-尿嘧啶核苷三磷酸（2-Thio-UTP），假尿嘧啶核苷三磷酸（Pseudo-UTP），N1-甲基假尿嘧啶核苷三磷酸（N1-Methylpseudo-UTP）， 5-甲氧基-尿嘧啶核苷三磷酸（5-Methoxy-UTP），N1-甲基-腺嘌呤核苷三磷酸（N1-Methyl-ATP）， N4-乙酰-胞嘧啶核苷三磷酸（N4-Acetyl-CTP）中的一种或者多种组合。

T7 RNA聚合酶突变体，其中突变氨基酸为Y639T，M635V，R632Q，K631L，Y571T，R627E，K472S中的一种或多种组合。

一种基因，编码T7 RNA聚合酶突变体的基因序列。其DNA序列由SEQ ID No:2至SEQID No:4所示的野生型T7 RNA聚合酶DNA序列根据前述突变氨基酸突变位点通过突变相应的DNA密码子序列而得。

其中突变氨基酸位点相一致的所有密码子。例如，与Y639T，M635V，R632Q，K631L，Y571T，R627E，K472S氨基酸突变相一致的所有编码密码子包括

获得T7 RNA聚合酶的编码基因的方法。包括基因定点突变以及两亲性双质粒筛选系统。

一种基因表达载体，表达载体通过插入前述的编码基因从而表达前述T7 RNA聚合酶突变体蛋白。表达载体包括pET21a(+), pET28a(+)以及pET30(+), 优选pET21a(+).

一种细胞，该细胞能够根据前述基因表达T7 RNA聚合酶突变体。

细胞的制备方法包括将基因表达载体转染到感受态细胞。

感受态细胞包括DH5-alpha，TOP10，BL21，并优选BL21。

一种蛋白质表达方法，表达方法包括应用前述细胞，在表达温度与IPTG浓度范围内进行蛋白质表达。

表达温度包括16℃，20℃，25℃，30℃，并优选30℃。

IPTG浓度包括0.2 mM, 0.5mM以及1mM,并优选0.5mM。

一种蛋白质纯化方法，该纯化方法应用于纯化前述的T7 RNA聚合酶突变体。该方法包括基于Ni-NTA Agarose纯化介质的亲和色谱法，基于Q-Sepherose介质的离子交换色谱法。

一种制备含有一种或多种修饰核苷的修饰mRNA的方法，具体包括：

制备转录反应混合物，包括T7 RNA聚合酶突变体、修饰核苷酸、镁离子、亚精胺、转录模板DNA。修饰核苷酸包括5-甲基胞嘧啶核苷三磷酸（5-Methyl-CTP），N6-甲基腺嘌呤核苷三磷酸（N6-Methyl-ATP），2-巯基-尿嘧啶核苷三磷酸（2-Thio-UTP），假尿嘧啶核苷三磷酸（Pseudo-UTP），N1-甲基假尿嘧啶核苷三磷酸（N1-Methylpseudo-UTP）， 5-甲氧基-尿嘧啶核苷三磷酸（5-Methoxy-UTP），N1-甲基-腺嘌呤核苷三磷酸（N1-Methyl-ATP）， N4-乙酰-胞嘧啶核苷三磷酸（N4-Acetyl-CTP）中的一种或者多种组合。

对转录模板进行转录反应，由此T7 RNA聚合酶突变体高效利用修饰核苷酸转录合成修饰mRNA。

本发明所公开的T7 RNA聚合酶突变体不仅能利用上述修饰核苷酸底物合成修饰mRNA，且转录合成修饰mRNA的效率与野生型T7 RNA聚合酶相比得到大幅度提高。通过进一步的加帽修饰，甲基化修饰等步骤，T7 RNA聚合酶突变体转录合成的修饰mRNA能在细胞内翻译成相应的蛋白，且蛋白表达量得到显著提高。与US9790531 B2等其他专利比较，本发明公开的T7 RNA聚合酶突变体具有独有的氨基酸突变位点，更高的修饰mRNA合成效率，且相应地实现了更高的细胞内蛋白质合成水平。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：本专利涉及的修饰核苷酸的分子结构。

图2：双质粒筛选系统方法示意图

图3: 根据8种单独修饰核苷酸或两种修饰核苷酸组合的荧光素酶基因转录效率表。

图4: 根据8种各自修饰核苷酸，两两组合，三种组合的G-CSF基因转录效率表。

图5根据8种单独修饰核苷酸或两种修饰核苷酸组合的T7转录的荧光素酶修饰mRNA在Hela细胞的蛋白质表达分析。

图6 根据8种单独修饰核苷酸或两种修饰核苷酸组合的T7转录EPO修饰mRNA在Hela细胞的蛋白质表达分析。

具体实施方式

以下将结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细描述。但该等实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据该等实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。

为了表述方便，对于氨基酸突变的表述，其中的数字是指沿着在SEQ ID No.1中给出的野生型T7 RNA聚合酶的参照氨基酸序列的氨基酸残基的位置。氨基酸鉴别使用氨基酸三字母缩写以及单字母字母表，如下表所示：

在氨基酸序列特定位置处的氨基酸，用它的三字母缩写和数字给出。例如，Y639表述在SEQ ID No.1的氨基酸位置639处的酪氨酸残基。 在本专利公开的任意T7 RNA聚合酶突变体中给出的氨基酸置换作为添加在指示位置的数字之后的三字母缩写，例如Y639T表示639位的酪氨酸突变为苏氨酸；M635V、R632Q、K631L、Y571T、R627E、K472S同理可知。

示例1：T7 RNA聚合酶突变体筛选体系的构建

Dmitry Temiakov等人通过T7 RNA聚合酶与底物类似物的共结晶的结构，并结合定点突变技术，阐明了T7 RNA聚合酶对底物选择性的关键机制以及重要氨基酸位点，具体包括Y639，M635，R632，K631，Y571，R627，K472等（Dmitry Temiakov等， Cell, (2004) 116,381–391）。据Ikeda等公开发表的文献报道（Ikeda, R. A. et al. Biochemistry, 31:9073-9080, 1992 and Ikeda, R. A. et al., Nucl. Acid. Res., 20: 2517-2524,1992，Jijumon Chelliserrykattil等， Nat Biotechnol. 2004 22(9):1155-60.），通过基于T7 RNA聚合酶对T7启动子转录活性的双质粒筛选系统，可实现对T7 RNA聚合酶突变体的功能筛选。本发明采用了同样的原理，构建了一种用于筛选T7 RNA聚合酶突变体的双质粒筛选系统。通过将T7 RNA聚合酶针对影响底物选择的关键氨基酸位点Y639，M635，R632，K631，Y571，R627，K472进行随机突变所建造的DNA文库，插入pET21a (+)（购自Novagene公司）T7启动子区后以实现T7 RNA聚合酶文库的构建。该质粒命名为T7突变文库表达质粒。另一质粒pET28a(+)的T7 启动子后插入氯霉素抗性基因氯霉素转移酶（CAT），其基因序列如SEQ ID No.5所示。该质粒命名为CAT报告质粒。上述两种质粒共转化到感受态细胞BL21（DE3），采用氨苄霉素和卡娜霉素进行阳性克隆筛选。因此，该细菌最终包含两种质粒。筛选出来含有两种质粒的细菌具有氨苄霉素与卡娜霉素双重抗性。接下来通过接菌到分别采用30, 50, 100 mg/ml氯霉素条件进行筛选。在此培养条件下能存活的细菌，挑取单克隆并培养，抽提质粒并进行DNA测序，以确定编码T7 RNA聚合酶突变体的基因序列。

具体实施步骤如下：

材料

表达载体pET21a(+)以及pET28a(+)均购自Novagen公司。PFU高保真聚合酶，限制性内切酶Nde I, XhoI均购自NEB公司。感受态细胞BL21（DE3），质粒小抽提试剂盒，IPTG，氯霉素，氨苄霉素，卡娜霉素，LB培养基成分（酵母提取物，胰蛋白胨，氯化钠），琼脂糖粉末均购自生工生物工程（上海）有限公司。

野生型T7 RNA聚合酶表达载体，突变文库和CAT报告质粒的构建

野生型T7 RNA聚合酶表达载体构建委托通用生物系统（安徽）有限公司完成。根据SEQ ID No:2至SEQ ID No:4所示的DNA序列化学合成DNA片段，采用Nde I + XhoI双酶切连接到表达载体pET21a(+)，所得质粒为pET21a(+)/T7 WT。T7 RNA聚合酶突变体文库的构建以pET21a(+)/T7 WT为DNA模板，针对候选的T7底物选择性氨基酸设计引物，通过PFU高保真酶介导的重叠PCR完成文库构建。特定氨基酸对应的引物如下表所示：

PCR产物通过酶切位点Nde I + XhoI连接到T7表达载体pET21a(+)，获得T7 突变体文库。

CAT报告质粒的构建委托通用生物系统（安徽）有限公司完成。根据SEQ ID No.5所示的DNA序列化学合成DNA片段，采用Nde I + XhoI双酶切连接到表达载体pET28a(+)，所得质粒为CAT报告质粒。

T7 RNA聚合酶突变体的初步筛选

用随机突变T7 RNA聚合酶突变体基因文库与CAT报告质粒共转化大肠杆菌DH5α（lac缺失型）感受态细胞。转化后的大肠杆菌在不含抗生素的LB培养基在37℃，220 rpm条件下培养1小时，然后加入50 μg/ml卡娜霉素以及100 μg/ml氨苄青霉素，并在37℃，220rpm条件下培养2小时。然后加入1mM IPTG, 30 ug/ml氯霉素，并在37℃，220 rpm条件下培养6小时。该细菌涂布于含有50 μg/ml卡娜霉素、100 μg/ml氨苄青霉素，分别含30, 50,100 mg/ml氯霉素的LB琼脂培养板，并在37℃条件下培养过夜。随着氯霉素浓度的提高，所得的细菌克隆数越少。挑取单克隆培养并对T7基因进行测序。

示例2： T7 RNA 聚合酶突变体的蛋白质表达纯化与初步功能鉴定

由于T7 编码基因的突变体文库是针对底物选择性有关键选择性的氨基酸进行构建，因此通过上述示例1的初步筛选所获得的T7 RNA聚合酶突变体被认为具有能利用修饰核苷酸转录合成修饰mRNA的潜力。通过对上述筛选出的T7 RNA聚合酶突变体菌种进行扩大培养，并利用pET21a(+)载体C端自带的6xHis标签，基于His标签与Ni-NTA Agarose纯化介质的亲和作用对T7 RNA聚合酶突变体蛋白进行纯化。具体步骤如下：通过离心收集菌体（9000 rpm, 10分钟离心），菌体采用裂解缓冲液进行重悬（50 mM Tris, pH=8.0, 50 mMNaCl）,超声波破碎细菌，并离心（12000 rpm, 15分钟）收集上清液。采用GE Ni-NTAAgarose亲和层析柱对上清液进行纯化。柱子先用平衡缓冲液（50 mM Tris, pH=8.0, 50mM NaCl）平衡，然后上样，采用洗杂缓冲液（50 mM Tris, pH=8.0, 50 mM NaCl， 50mM 咪唑）洗去非特异性结合的杂质，采用洗脱缓冲液（50 mM Tris, pH=8.0, 50 mM NaCl，300mM 咪唑）洗脱目的蛋白。进一步地，通过GE Q-Sepherose离子交换层析法对T7 RNA聚合酶蛋白进行进一步的纯化，以去除杂质。具体步骤如下：Q-Sepherose离子交换层析柱采用平衡缓冲液（50 mM Tris, pH=8.0, 50 mM NaCl）平衡，然后将上一步骤所得的目的蛋白上样。采用洗脱缓冲液（50 mM Tris, pH=8.0, 500 mM NaCl）洗脱目的蛋白。

示例3：T7 RNA聚合酶突变体利用修饰核苷酸转录合成荧光素酶的修饰mRNA，并与野生型T7 RNA聚合酶转录活性比较

利用pET28a上的T7启动子，通过连接SEQ ID No.6所示的荧光素酶基因，用于测试T7 RNA聚合酶突变体的转录活性。据Gallie G.R等人报道（Gallie G.R等， Gene, 1999,165, 233-238），烟草花叶病毒（TEV）的5’非翻译序列（5’UTR, 其DNA序列如SEQ ID No.6所示）可用于介导转录后翻译。因此，此处采用TEV的5’ UTR作为介导荧光素酶的翻译。TEV 5’UTR如SEQ ID No:7至SEQ ID No:8所示。另外，在转录模板引入100 nt的 poly(dT)，通过转录过程的互补配对获得100 nt的poly (A)尾结构。5’ UTR，荧光素酶基因以及100 nt poly(dT) DNA序列通过酶切位点依次插入pET28a(+)以获得最终转录模板。 5’ UTR通过NdeI与EcoRI双酶切连接插入pET28a(+)，荧光素酶基因通过EcoRI与HindIII双酶切位点插入，poly(dT)通过HindIII与XhoI双酶切位点插入。该转录模板质粒委托通用生物系统（安徽）有限公司合成制作。通过转化感受态细胞，挑取单克隆并扩大培养，采用Qiagen质粒中等抽提试剂盒抽取质粒。转录模板采用NheI单酶切以实现线性化，并采用Qiagen DNA回收试剂盒对线性质粒进行纯化。转录缓冲液配方如下：40 mM Tris-HCl, pH=7.9, 6mM MgCl2,1mM DTT, 2mM亚精胺。加入终浓度为0.5 mM ATP, UTP, CTP, GTP，或修饰核苷酸5-Methyl-CTP，N6-Methyl-ATP，2-Thio-UTP，Pseudo-UTP，N1-Methylpseudo-UTP， 5-Methoxy-UTP，N1-Methyl-ATP， N4-Acetyl-CTP中的一种或两种组合，以取代相对应的天然三磷酸核苷酸底物。采用纯化的T7 RNA聚合酶突变体或野生型T7 RNA聚合酶，在37℃条件下转录4小时。所得转录产物采用NEB公司的LiCl RNA纯化试剂盒进行纯化， 并使用NanoDrop 2000 (ThermoFisher)紫外分光光度计测试260 nm吸光度，并得出相应的纯化后mRNA的质量。结果如图3所示，T7 RNA聚合酶突变体可利用修饰核苷酸作为底物转录合成修饰荧光素酶mRNA，且在同一转录体系下，相同数量的DNA模板前提下，其转录合成效率显著高于野生型T7 RNA聚合酶。

示例4：T7 RNA聚合酶突变体利用修饰核苷酸转录合成EPO的修饰mRNA，并与野生型T7 RNA聚合酶转录活性比较

转录模板设计与构建与示例3类似。采用TEV的5’ UTR，以及EPO基因序列（如SEQID No.9所示）以及100 nt poly (dT)，依次连接到pET28a(+)。采用与示例3相同的转录体系进行转录，以测试T7 RNA聚合酶突变体利用修饰核苷酸对EPO基因的转录效果。结果如图4所示，T7 RNA聚合酶突变体可利用修饰核苷酸作为底物转录合成修饰的EPO mRNA，且在同一转录体系下，相同数量的DNA模板前提下，其转录合成效率显著高于野生型T7 RNA聚合酶。

示例5：T7 RNA聚合酶突变体转录合成的荧光素酶的修饰mRNA在Hela细胞蛋白质表达测试,并与野生型T7 RNA聚合酶比较

示例3所示的纯化后mRNA采用NEB公司的vaccinia capping system试剂盒进行加5’帽反应，以及采用NEB公司的2’-O 甲基转移酶试剂盒对加帽后的第一个核苷酸2’-氧原子进行甲基化反应，获得Cap1结构的,碱基修饰的mRNA。采用ThermoFisher公司的Lipofectamine® Messenger MAX转染试剂进行修饰mRNA对Hela细胞的转染。转染为在20℃、0.5mM的IPTG条件下进行。转染后24小时收集细胞，采用Promega公司的Dual-Glo®荧光素酶试剂盒测试Hela细胞的荧光素酶表达量。如图5所示，T7 RNA聚合酶突变体转录的修饰荧光素酶mRNA可表达荧光素酶蛋白，且在同一转录体系下，相同数量的DNA转录模板条件下，其荧光素酶表达水平显著高于野生型T7 RNA聚合酶所对应的荧光素酶表达水平。

上述方案中，转染的表达温度还可以为16℃、25℃、30℃等，均满足本发明对细胞转染要求。同时IPTG的浓度也还可以为0.2 mM、1mM等，均满足本发明对细胞转染要求。

示例6：T7 RNA聚合酶突变体转录合成EPO的修饰mRNA在Hela细胞蛋白质表达测试,并与野生型T7 RNA聚合酶比较

采用与示例5相同的实验体系，示例4所得的纯化后EPO 修饰mRNA经过加5’帽反应，甲基化反应获得cap1结构后，对Hela细胞进行转染。转染24小时后，收集细胞并采用Sigma-Aldrich公司的细胞裂解液试剂盒 Cell Lysis Kit裂解细胞，采用Abcam公司的Human Erythropoietin ELISA Kit (EPO)测试EPO的表达量。如图6所示，T7 RNA聚合酶突变体转录的修饰EPO mRNA可表达EPO蛋白，且在同一转录体系下，相同数量的DNA转录模板条件下，其EPO表达水平显著高于野生型T7 RNA聚合酶所对应的EPO表达水平。

本发明通过引入关键位点的创新性氨基酸突变，提供了一种新颖的T7 RNA聚合酶变体。该变体基于SEQ ID No:1所示野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列的突变方式为Y639T，M635V，R632Q，K631L，Y571T，R627E，K472S。所述的T7 RNA聚合酶具有基于T7启动子的RNA聚合酶活性。该T7 RNA聚合酶变体可利用一种或多种修饰核苷酸，包括5-甲基胞嘧啶核苷三磷酸（5-Methyl-CTP），N6-甲基腺嘌呤核苷三磷酸（N6-Methyl-ATP），2-巯基-尿嘧啶核苷三磷酸（2-Thio-UTP），假尿嘧啶核苷三磷酸（Pseudo-UTP），N1-甲基假尿嘧啶核苷三磷酸（N1-Methylpseudo-UTP）， 5-甲氧基-尿嘧啶核苷三磷酸（5-Methoxy-UTP），N1-甲基-腺嘌呤核苷三磷酸（N1-Methyl-ATP）， N4-乙酰-胞嘧啶核苷三磷酸（N4-Acetyl-CTP），作为底物合成修饰mRNA。且与野生型T7 RNA聚合酶相比，所述的T7 RNA聚合酶变体具有显著增强的基于上述修饰核苷酸底物的mRNA合成效率。以及该突变体的构建方法，利用一种或多种上述修饰核苷酸底物合成mRNA的方法与试剂盒。

在上述方案中，感受态细胞还可以采用DH5-alpha感受态细胞或TOP10感受态细胞或BL21感受态细胞，同样可以实现本发明方案的目的。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施例加以描述，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 左炽健

<120> T7RNA聚合酶突变体、mRNA、基因、表达载体及细胞

<150> 2019112376259

<151> 2019-12-05

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 883

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu

20 25 30

Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu

35 40 45

Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val

50 55 60

Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys

65 70 75 80

Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg

85 90 95

Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu

100 105 110

Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser

115 120 125

Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala

130 135 140

Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys

145 150 155 160

His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His

165 170 175

Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser

180 185 190

Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp

195 200 205

Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr

210 215 220

Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp

225 230 235 240

Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr

245 250 255

Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val

260 265 270

Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala

275 280 285

Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala

290 295 300

Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile

305 310 315 320

Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala

325 330 335

Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile

340 345 350

Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp

355 360 365

Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val

370 375 380

Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe

385 390 395 400

Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe

405 410 415

Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe

420 425 430

Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys

435 440 445

Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly

450 455 460

Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys

465 470 475 480

Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro

485 490 495

Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu

500 505 510

Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr

515 520 525

Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln

530 535 540

His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn

545 550 555 560

Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys

565 570 575

Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn

580 585 590

Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys

595 600 605

Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly

610 615 620

Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly

625 630 635 640

Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln

645 650 655

Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln

660 665 670

Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr

675 680 685

Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys

690 695 700

Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg

705 710 715 720

Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp

725 730 735

Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu

740 745 750

Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu

755 760 765

Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His

770 775 780

Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu

785 790 795 800

Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr

805 810 815

Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met

820 825 830

Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln

835 840 845

Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu

850 855 860

Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe

865 870 875 880

Ala Phe Ala

<210> 2

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

atgaacacca ttaacattgc gaaaaacgat tttagcgata ttgaactggc ggcgattccg 60

tttaacaccc tggcggatca ttatggcgaa cgcctggcgc gcgaacagct ggcgctggaa 120

catgaaagct atgaaatggg cgaagcgcgc tttcgcaaaa tgtttgaacg ccagctgaaa 180

gcgggcgaag tggcggataa cgcggcggcg aaaccgctga ttaccaccct gctgccgaaa 240

atgattgcgc gcattaacga ttggtttgaa gaagtgaaag cgaaacgcgg caaacgcccg 300

accgcgtttc agtttctgca ggaaattaaa ccggaagcgg tggcgtatat taccattaaa 360

accaccctgg cgtgcctgac cagcgcggat aacaccaccg tgcaggcggt ggcgagcgcg 420

attggccgcg cgattgaaga tgaagcgcgc tttggccgca ttcgcgatct ggaagcgaaa 480

cattttaaaa aaaacgtgga agaacagctg aacaaacgcg tgggccatgt gtataaaaaa 540

gcgtttatgc aggtggtgga agcggatatg ctgagcaaag gcctgctggg cggcgaagcg 600

tggagcagct ggcataaaga agatagcatt catgtgggcg tgcgctgcat tgaaatgctg 660

attgaaagca ccggcatggt gagcctgcat cgccagaacg cgggcgtggt gggccaggat 720

agcgaaacca ttgaactggc gccggaatat gcggaagcga ttgcgacccg cgcgggcgcg 780

ctggcgggca ttagcccgat gtttcagccg tgcgtggtgc cgccgaaacc gtggaccggc 840

attaccggcg gcggctattg ggcgaacggc cgccgcccgc tggcgctggt gcgcacccat 900

agcaaaaaag cgctgatgcg ctatgaagat gtgtatatgc cggaagtgta taaagcgatt 960

aacattgcgc agaacaccgc gtggaaaatt aacaaaaaag tgctggcggt ggcgaacgtg 1020

attaccaaat ggaaacattg cccggtggaa gatattccgg cgattgaacg cgaagaactg 1080

ccgatgaaac cggaagatat tgatatgaac ccggaagcgc tgaccgcgtg gaaacgcgcg 1140

<210> 3

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

gcggcggcgg tgtatcgcaa agataaagcg cgcaaaagcc gccgcattag cctggaattt 60

atgctggaac aggcgaacaa atttgcgaac cataaagcga tttggtttcc gtataacatg 120

gattggcgcg gccgcgtgta tgcggtgagc atgtttaacc cgcagggcaa cgatatgacc 180

aaaggcctgc tgaccctggc gaaaggcaaa ccgattggca aagaaggcta ttattggctg 240

aaaattcatg gcgcgaactg cgcgggcgtg gataaagtgc cgtttccgga acgcattaaa 300

tttattgaag aaaaccatga aaacattatg gcgtgcgcga aaagcccgct ggaaaacacc 360

tggtgggcgg aacaggatag cccgttttgc tttctggcgt tttgctttga atatgcgggc 420

gtgcagcatc atggcctgag ctataactgc agcctgccgc tggcgtttga tggcagctgc 480

agcggcattc agcattttag cgcgatgctg cgcgatgaag tgggcggccg cgcggtgaac 540

ctgctgccga gcgaaaccgt gcaggatatt tatggcattg tggcgaaaaa agtgaacgaa 600

attctgcagg cggatgcgat taacggcacc gataacgaag tggtgaccgt gaccgatgaa 660

aacaccggcg aaattagcga aaaagtgaaa ctgggcacca aagcgctggc gggccagtgg 720

ctggcgtatg gcgtgacccg cagcgtgacc aaacgcagcg tgatgaccct ggcgtatggc 780

agcaaagaat ttggctttcg ccagcaggtg ctggaagata ccattcagcc ggcgattgat 840

agcggcaaag gcctgatgtt tacccagccg aaccaggcgg cgggctatat ggcgaaactg 900

atttgggaaa gcgtgagcgt gaccgtggtg gcggcggtgg aagcgatgaa ctggctgaaa 960

agcgcggcga aactgctggc ggcggaagtg aaagataaaa aaaccggcga aattctgcgc 1020

aaacgctgcg cggtgcattg ggtgaccccg gatggctttc cggtgtggca ggaatataaa 1080

aaaccgattc agacccgcct gaacctgatg tttctgggcc agtttcgcct gcagccgacc 1140

<210> 4

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

attaacacca acaaagatag cgaaattgat gcgcataaac aggaaagcgg cattgcgccg 60

aactttgtgc atagccagga tggcagccat ctgcgcaaaa ccgtggtgtg ggcgcatgaa 120

aaatatggca ttgaaagctt tgcgctgatt catgatagct ttggcaccat tccggcggat 180

gcggcgaacc tgtttaaagc ggtgcgcgaa accatggtgg atacctatga aagctgcgat 240

gtgctggcgg atttttatga tcagtttgcg gatcagctgc atgaaagcca gctggataaa 300

atgccggcgc tgccggcgaa aggcaacctg aacctgcgcg atattctgga aagcgatttt 360

gcgtttgcg 369

<210> 5

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

atgggcaact attttgaaag cccgtttcgc ggcaaactgc tgagcgaaca ggtgagcaac 60

ccgaacattc gcgtgggccg ctatagctat tatagcggct attatcatgg ccatagcttt 120

gatgattgcg cgcgctatct gatgccggat cgcgatgatg tggataaact ggtgattggc 180

agcttttgca gcattggcag cggcgcggcg tttattatgg cgggcaacca gggccatcgc 240

gcggaatggg cgagcacctt tccgtttcat tttatgcatg aagaaccggt gtttgcgggc 300

gcggtgaacg gctatcagcc ggcgggcgat accctgattg gccatgatgt gtggattggc 360

accgaagcga tgtttatgcc gggcgtgcgc gtgggccatg gcgcgattat tggcagccgc 420

gcgctggtga ccggcgatgt ggaaccgtat gcgattgtgg gcggcaaccc ggcgcgcacc 480

attcgcaaac gctttagcga tggcgatatt cagaacctgc tggaaatggc gtggtgggat 540

tggccgctgg cggatattga agcggcgatg ccgctgctgt gcaccggcga tattccggcg 600

ctgtatcgcc attggaaaca gcgccaggcg accgcg 636

<210> 6

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

gaattaattc tcaacacaac atatacaaaa caaacgaatc tcaagcaatc aagcattcta 60

cttctattgc agcaatttaa atcatttctt ttaaagcaaa agcaattttc tgaaaatttt 120

caccatttac gaacgatag 139

<210> 7

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

atgggcagca gccatcatca tcatcatcat agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgatggaag atgcgaaaaa cattaaaaaa ggcccggcgc cgttttatcc gctggaagat 120

ggcaccgcgg gcgaacagct gcataaagcg atgaaacgct atgcgctggt gccgggcacc 180

attgcgttta ccgatgcgca tattgaagtg gatattacct atgcggaata ttttgaaatg 240

agcgtgcgcc tggcggaagc gatgaaacgc tatggcctga acaccaacca tcgcattgtg 300

gtgtgcagcg aaaacagcct gcagtttttt atgccggtgc tgggcgcgct gtttattggc 360

gtggcggtgg cgccggcgaa cgatatttat aacgaacgcg aactgctgaa cagcatgggc 420

attagccagc cgaccgtggt gtttgtgagc aaaaaaggcc tgcagaaaat tctgaacgtg 480

cagaaaaaac tgccgattat tcagaaaatt attattatgg atagcaaaac cgattatcag 540

ggctttcaga gcatgtatac ctttgtgacc agccatctgc cgccgggctt taacgaatat 600

gattttgtgc cggaaagctt tgatcgcgat aaaaccattg cgctgattat gaacagcagc 660

ggcagcaccg gcctgccgaa aggcgtggcg ctgccgcatc gcaccgcgtg cgtgcgcttt 720

agccatgcgc gcgatccgat ttttggcaac cagattattc cggataccgc gattctgagc 780

gtggtgccgt ttcatcatgg ctttggcatg tttaccaccc tgggctatct gatttgcggc 840

tttcgcgtgg tgctgatgta tcgctttgaa gaagaactgt ttctgcgcag cctgcaggat 900

tataaaattc agagcgcgct gctggtgccg accctgttta gcttttttgc gaaaagcacc 960

ctgattgata aatatgatct gagcaacctg catgaaattg cgagcggcgg cgcgccgctg 1020

agcaaagaag tgggcgaagc ggtggcgaaa cgctttcatc tgccgggcat tcgccagggc 1080

tatggcctga ccgaaaccac cagcgcgatt ctgattaccc cggaaggcga tgataaaccg 1140

<210> 8

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

ggcgcggtgg gcaaagtggt gccgtttttt gaagcgaaag tggtggatct ggataccggc 60

aaaaccctgg gcgtgaacca gcgcggcgaa ctgtgcgtgc gcggcccgat gattatgagc 120

ggctatgtga acaacccgga agcgaccaac gcgctgattg ataaagatgg ctggctgcat 180

agcggcgata ttgcgtattg ggatgaagat gaacattttt ttattgtgga tcgcctgaaa 240

agcctgatta aatataaagg ctatcaggtg gcgccggcgg aactggaaag cattctgctg 300

cagcatccga acatttttga tgcgggcgtg gcgggcctgc cggatgatga tgcgggcgaa 360

ctgccggcgg cggtggtggt gctggaacat ggcaaaacca tgaccgaaaa agaaattgtg 420

gattatgtgg cgagccaggt gaccaccgcg aaaaaactgc gcggcggcgt ggtgtttgtg 480

gatgaagtgc cgaaaggcct gaccggcaaa ctggatgcgc gcaaaattcg cgaaattctg 540

attaaagcga aaaaaggcgg caaaattgcg gtg 573

<210> 9

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

atgggcgtgc acgagtgccc cgcctggctg tggctgctgc tgagcctgct gagcctgccc 60

ctgggcctgc ccgtgctggg cgcccccccc aggctgatct gcgacagcag ggtgctggag 120

aggtacctgc tggaggccaa ggaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180

agcctgaacg agaacatcac cgtgcccgac accaaggtga acttctacgc ctggaagagg 240

atggaggtgg gccagcaggc cgtggaggtg tggcagggcc tggccctgct gagcgaggcc 300

gtgctgaggg gccaggccct gctggtgaac agcagccagc cctgggagcc cctgcagctg 360

cacgtggaca aggccgtgag cggcctgagg agcctgacca ccctgctgag ggccctgggc 420

gcccagaagg aggccatcag cccccccgac gccgccagcg ccgcccccct gaggaccatc 480

accgccgaca ccttcaggaa gctgttcagg gtgtacagca acttcctgag gggcaagctg 540

aagctgtaca ccggcgaggc ctgcaggacc ggcgacagg 579

Claims (9)

1.T7RNA聚合酶突变体，其特征在于，该突变体是如SEQ ID No:1所示的野生型T7 RNA聚合酶通过突变氨基酸突变所得的突变体，所述突变氨基酸为Y639T、M635V、R632Q、K631L、Y571T、R627E、K472S的组合。

2.基因，其特征在于，该基因编码权利要求1所述的T7RNA聚合酶突变体，该基因是在编码如SEQ ID No:1所示的野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列的DNA序列基础上，通过突变根据权利要求1所述的突变氨基酸组合所相应的DNA密码子序列所得到的。

3.基因表达载体，其特征在于，载体为将运载体插入权利要求2所述的基因从而表达权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体。

4.根据权利要求3所述的基因表达载体，其特征在于，所述运载体包括pET21a(+)或pET28a(+)或pET30(+)。

5.细胞，其特征在于，所述细胞能够根据权利要求2所述的基因从而表达权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为将权利要求3-4任一所述的基因表达载体转染到感受态细胞得到。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述感受态细胞包括DH5-alpha感受态细胞或TOP10感受态细胞或BL21感受态细胞或Hela细胞。

8.根据权利要求5-7任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞其表达温度为16-30℃。

9.根据权利要求5-7任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞其表达为在0.2-1mM浓度的IPTG环境下进行。

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