JP5349323B2 - 修飾ヌクレオチドを含む転写物を生成させるための材料および方法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
この本特許出願は、米国特許法§119(e)の下、以下の仮出願への利益を主張する:2006年12月22日に出願された米国仮特許出願第60/876,780号および2007年1月10日に出願された米国仮特許出願第60/879,830号。これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
本発明は、核酸を転写するための材料および方法、特に、テンプレート指向性重合において修飾酵素を用いて核酸、特にアプタマーへの修飾ヌクレオチドの導入を増加させるための、修飾酵素および材料および方法に関する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
核酸を転写する方法であり、
a)(i)2’―OMe ATP、2’―OMe GTP、2’―OMe CTP、2’―OMe TTPおよび2’―OMe UTPより選択される2’―OMe修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―OMe NTP)のいずれかを導入することが可能な修飾T7RNAポリメラーゼであり、上記修飾RNAポリメラーゼが、対応する非修飾RNAポリメラーゼの2’―修飾NTPを導入する能力と比較して、上記2’―修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―修飾NTP)を導入する能力が増加している、修飾T7RNAポリメラーゼと、(ii)少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、(iii)ヌクレオチド三リン酸であり、上記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、上記グアニジン三リン酸が全て2’―OMe修飾されている、ヌクレオチド三リン酸とを含む、転写反応混合物を調製するステップと;
b)一本鎖核酸が生じる条件下で、上記転写反応混合物を転写するステップであり、上記生じる一本鎖核酸の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、2’―OMe修飾されている、ステップと
を含む、方法。
(項目2)
上記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオン、またはマグネシウムおよびマンガンイオンの両方をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、項目1に記載の方法。
(項目4)
上記核酸転写テンプレートが、完全二本鎖である、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記生じた一本鎖核酸における最初のグアノシヌクレオチドが、2’―OMe修飾されている、項目1に記載の方法。
(項目6)
上記修飾T7RNAポリメラーゼが、野生型T7ポリメラーゼに対して639位および784位で改変されたアミノ酸を含み、上記784位の改変アミノ酸がアラニンであるときには、上記639位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでない、項目1に記載の方法。
(項目7)
上記修飾T7RNAポリメラーゼが、639位にロイシン、784位にアラニンを含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
上記二本鎖オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、上記オリゴヌクレオチド転写テンプレートの5’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、項目3に記載の方法。
(項目9)
上記リーダー配列が、全てプリンのリーダー配列である、項目8に記載の方法。
(項目10)
上記全てプリンのリーダー配列が、少なくとも8ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長;少なくとも12ヌクレオチド長;および少なくとも14ヌクレオチド長より選択される長さを有する、項目9に記載の方法。
(項目11)
上記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が、マンガンイオンの濃度より3.0〜3.5倍高い、項目2に記載の方法。
(項目12)
各NTP、2’―修飾NTPまたは2’―OMe NTPが、約0.5mMの濃度で存在し、上記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約5.0mMであり、マンガンイオンの濃度が約1.5mMである、項目2に記載の方法。
(項目13)
各NTP、2’―修飾NTPまたは2’―OMe NTPが、約1.0mMの濃度で存在し、上記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約6.5mMであり、マンガンイオンの濃度が約2.0mMである、項目2に記載の方法。
(項目14)
各NTP、2’―修飾NTPまたは2’―OMe NTPが、約2.0mMの濃度で存在し、上記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約9.6mMであり、マンガンイオンの濃度が約2.9mMである、項目2に記載の方法。
(項目15)
上記転写反応混合物が、置換グアノシンまたはグアノシンをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
上記置換グアノシンまたはグアノシンが、GMPである、項目15に記載の方法。
(項目17)
上記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
上記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、項目17に記載の方法。
(項目19)
上記転写反応混合物が、無機ピロホスファターゼをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
上記転写反応混合物が、2’―デオキシシチジン三リン酸(2’―デオキシCTP)、2’―O―Meアデノシン三リン酸(2’―OMe ATP)、2’―OMeグアノシン三リン酸GTP(2’―OMe GTP)、および2’―OMeウリジン三リン酸(2’―OMe UTP)または2’―OMeチミジンヌクレオチド三リン酸(2’―OMe TTP)の混合物をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目21)
上記転写反応混合物が、2’―デオキシチミジン三リン酸(2’―デオキシTTP)または2’―デオキシウリジン三リン酸(2’―デオキシUTP)および2’―O―Meアデノシン三リン酸(2’―OMe ATP)、2’―OMeグアノシン三リン酸GTP(2’―OMe GTP)、および2’―OMeシチジン三リン酸(2’―OMe CTP)の混合物をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目22)
上記転写反応混合物が、2’―OHチミジン三リン酸(2’―OH TTP)または2’―OHウリジン三リン酸(2’―OH UTP)および2’―O―Meアデノシン三リン酸(2’―OMe ATP)、2’―OMeグアノシン三リン酸GTP(2’―OMe
GTP)、および2’―OMeシチジン三リン酸(2’―OMe CTP)の混合物をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目23)
上記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目24)
上記核酸塩基が、ウリジンの5―および6―位、チミジンの5―および6―位、シチジンの5および6―位および環外アミン、アデノシンの2―、7―および8―位および環外アミン、グアノシンの7―および8―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、項目23に記載の方法。
(項目25)
修飾核酸塩基が、ウラシル、シトシンまたはチミジンである、項目24に記載の方法。
(項目26)
上記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、項目23に記載の方法。
(項目27)
上記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、項目26に記載の方法。
(項目28)
アプタマーを同定する方法であり、上記アプタマーが2’―OMe修飾ヌクレオチドを含む、方法であり、
a)(i)2’―OMe ATP、2’―OMe GTP、2’―OMe CTP、2’―OMe TTPおよび2’―OMe UTPより選択される2’―OMe修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―OMe NTP)のいずれかを導入することが可能な修飾T7RNAポリメラーゼであり、上記修飾RNAポリメラーゼが、対応する非修飾RNAポリメラーゼの2’―修飾NTPを導入する能力と比較して、上記2’―修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―修飾NTP)を導入する能力が増加している、修飾T7RNAポリメラーゼと、(ii)少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、(iii)ヌクレオチド三リン酸であり、上記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、上記グアニジン三リン酸が全て2’―OMe修飾されている、ヌクレオチド三リン酸とを含む、転写反応混合物を調製するステップと;
b)上記修飾T7RNAポリメラーゼにより、一本鎖核酸の候補混合物の上記核酸分子に、少なくとも一つの修飾2’―OMeヌクレオチド三リン酸(2’―OMe NTP)が導入される条件下で、上記転写反応混合物を転写することにより、上記一本鎖核酸の候補混合物を調製するステップであり、上記候補混合物の上記一本鎖核酸分子の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、2’―OMe修飾されている、ステップと;
c)上記候補混合物を上記標的分子と接触させるステップと、
d)上記候補混合物の親和性と比較して、標的分子に対する親和性が増加した上記核酸を、上記候補混合物から分離するステップと、
e)アプタマーが濃縮された混合物を生じるために、上記親和性が増加した核酸を増幅するステップを含み、それによって、アプタマーの上記グアニジンヌクレオチドの一つを選択的に除いて、全て2’―OMe修飾されたグアニジンヌクレオチドを含む、上記標的分子に対する上記アプタマーが、同定される、
方法。
(項目29)
上記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオンまたはマグネシウムおよびマンガンイオンの両方をさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
上記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、項目28に記載の方法。
(項目31)
上記核酸転写テンプレートが、完全二本鎖である、項目28に記載の方法。
(項目32)
上記生じた一本鎖核酸における最初のグアノシヌクレオチドが、2’―OMe修飾されている、項目28に記載の方法。
(項目33)
上記修飾T7RNAポリメラーゼが、野生型T7ポリメラーゼに対して639位および784位で改変されたアミノ酸を含み、上記784位の改変アミノ酸がアラニンであるときには、上記639位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでない、項目28に記載の方法。
(項目34)
上記修飾T7RNAポリメラーゼが、639位にロイシン、784位にアラニンを含む、項目33に記載の方法。
(項目35)
上記二本鎖オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、上記オリゴヌクレオチド転写テンプレートの5’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、項目30に記載の方法。
(項目36)
上記リーダー配列が、全てプリンのリーダー配列である、項目35に記載の方法。
(項目37)
上記全てプリンのリーダー配列が、少なくとも8ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長;少なくとも12ヌクレオチド長;および少なくとも14ヌクレオチド長より選択される長さを有する、項目36に記載の方法。
(項目38)
上記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が、マンガンイオンの濃度より3.0〜3.5倍高い、項目29に記載の方法。
(項目39)
各NTP、2’―修飾NTPまたは2’―OMe NTPが、約0.5mMの濃度で存在し、上記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約5.0mMであり、マンガンイオンの濃度が約1.5mMである、項目29に記載の方法。
(項目40)
各NTP、2’―修飾NTPまたは2’―OMe NTPが、約1.0mMの濃度で存在し、上記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約6.5mMであり、マンガンイオンの濃度が約2.0mMである、項目29に記載の方法。
(項目41)
各NTP、2’―修飾NTPまたは2’―OMe NTPが、約2.0mMの濃度で存在し、上記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約9.6mMであり、マンガンイオンの濃度が約2.9mMである、項目29に記載の方法。
(項目42)
上記転写反応混合物が、置換グアノシンまたはグアノシンをさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目43)
上記置換グアノシンまたはグアノシンが、GMPである、項目42に記載の方法。
(項目44)
上記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目45)
上記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、項目44に記載の方法。
(項目46)
上記転写反応混合物が、無機ピロホスファターゼをさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目47)
上記転写反応混合物が、2’―デオキシシチジン三リン酸(2’―デオキシCTP)、2’―O―Meアデノシン三リン酸(2’―OMe ATP)、2’―OMeグアノシン三リン酸GTP(2’―OMe GTP)、および2’―OMeウリジン三リン酸(2’―OMe UTP)または2’―OMeチミジンヌクレオチド三リン酸(2’―OMe TTP)の混合物をさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目48)
上記転写反応混合物が、2’―デオキシチミジン三リン酸(2’―デオキシTTP)または2’―デオキシウリジン三リン酸(2’―デオキシUTP)および2’―O―Meアデノシン三リン酸(2’―OMe ATP)、2’―OMeグアノシン三リン酸GTP(2’―OMe GTP)、および2’―OMeシチジン三リン酸(2’―OMe CTP)の混合物をさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目49)
上記転写反応混合物が、2’―OHチミジン三リン酸(2’―OH TTP)または2’―OHウリジン三リン酸(2’―OH UTP)および2’―O―Meアデノシン三リン酸(2’―OMe ATP)、2’―OMeグアノシン三リン酸GTP(2’―OMe
GTP)、および2’―OMeシチジン三リン酸(2’―OMe CTP)の混合物をさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目50)
上記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目51)
上記核酸塩基が、ウリジンの5―および6―位、チミジンの5―および6―位、シチジンの5および6―位および環外アミン、アデノシンの2―、7―および8―位および環外アミン、グアノシンの7―および8―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、項目50に記載の方法。
(項目52)
修飾核酸塩基が、ウラシル、シトシンまたはチミジンである、項目51に記載の方法。
(項目53)
上記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、項目50に記載の方法。
(項目54)
上記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、項目53に記載の方法。
アプタマーを生成する好ましい方法は、概して図1に示され、in vitro選択と呼もばれる、“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment(試験管内人工進化法)”(「SELEX(商標)」)と称されるプロセスによる。SELEX(商標)プロセスは、標的分子に対する高特異性結合をもつ核酸分子のin vitro進化のための方法であり、例えば、1990年6月11日出願の、現在は放棄されている米国特許出願第07/536428号、“Nucleic Acid Ligands”という題の米国特許第5,475,096号、および“Nucleic Acid Ligands”という題の米国特許第5,270,163号(WO91/19813も参照)に記載されている。SELEX(商標)は、選択および増幅の反復的サイクルを実行することにより、任意の所望のレベルの標的結合親和性をもつ、本明細書において「核酸リガンド」とも称されるアプタマーを得るために使用できる。
一実施形態においては、P(O)O基がP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、P(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COまたはCH2(「ホルムアセタール」)、または3’―アミン(―NH―CH2―CH2―)により置換されたオリゴヌクレオチドが提供され、各RまたはR’は、独立してHであるか置換もしくは非置換アルキルである。―O―、―N―、または―S―結合を介して、隣接するヌクレオチドに結合基が結合され得る。オリゴヌクレオチドにおける全ての結合が同一である必要はない。
アプタマーが、治療薬および/または特定の種類の診断薬としての使用に適するためには、合成が安価であり、in vivoで安全および安定していることが好ましい。野生型RNAおよびDNAアプタマーは通常、ヌクレアーゼにより分解されやすいため、in vivoで安定してない。2’―位における修飾基の導入により、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗が大きく高められうる。
本発明の2’修飾アプタマーは、野生型ポリメラーゼ、例えば野生型T7ポリメラーゼより高い、フラノース2’位に大きな置換基を有する修飾ヌクレオチドの導入率を有する修飾ポリメラーゼ、例えば変異T7ポリメラーゼを用いてつくられる。例えば、639位のチロシン残基がフェニルアラニンに変えられている(Y639F)変異T7ポリメラーゼは、2’デオキシ、2’アミノ―、および2’フルオロ―ヌクレオチド三リン酸(NTPs)を容易に基質として利用し、様々な用途のために修飾RNAsを合成するために広く使われている。しかし、この変異T7ポリメラーゼは、2’―OMeまたは2’―アジド(2’―N3)置換基等の大きな2’―置換基を伴うNTPsを容易に利用(すなわち導入)できないことが報告されている。大きな2’置換基の導入のために、Y639F変異に加えて、784位のヒスチジンがアラニン残基に変えられた変異T7ポリメラーゼが、記載されており(Y639F/H784A)、修飾ピリミジンNTPsを導入するために、限られた状況において使われている。Padilla,R.およびSousa,R.,Nucleic Acids Res.,2002,30(24):138を参照。639位のチロシン残基がフェニルアラニンに変えられ、784位のヒスチジン残基がアラニンに変えられ、378位のリジン残基がアルギニンに変えられている変異T7RNAポリメラーゼ(Y639F/H784A/K378R)が、修飾プリンおよびピリミジンNTPs、例えば2’―OMe NTPsを導入するために、限られた状況において使用されているが、転写のための2’―OH GTPのスパイクを含む。Burmeister等、(2005)Chemistry and Biology,12:25―33を参照。転写のための2’―OH GTPスパイクの包含により、完全に2’―OMeではなく2’―OH GTPの存在に依存しうるアプタマーが生じうる。
2’―修飾SELEX(商標)法の転写条件に、多数の因子が重要であると決定されている。2’修飾、特に2’―OMe修飾ヌクレオチドを含む転写混合物による転写条件のために記載される因子は、2’修飾および側鎖核酸塩基修飾ヌクレオチド三リン酸を含む転写混合物による本発明の転写方法と関連しても用いられる。本発明に用いられる側鎖修飾ヌクレオチド三リン酸が、説明されている。例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Vaught JD,Dewey T,Eaton BE.J Am Chem Soc.2004;126:11231―11237;Nieuwlandt D,West M,Cheng X,Kirshenheuter G,Eaton BE.Chembiochem.2003,4,651―654;Ito T,Ueno Y,Komatsu Y,Matsuda A.Nucleic Acids Res.2003;31,2514―2523;Dewey,TM,Mundt,AA,Crouch,GJ,Zyzniewyski,MC,Eaton,BE.J Am Chem Soc 1995,117,8474―8475;Jager S,Rasched G,Kornreich―Leshem H,Engeser M,Thum O,Famulok M.J Am Chem Soc.2005,127,15071―15082;Tarasow TM,Tarasow SL,Eaton BE.Nature.1997,389,54―57;Liu D,Gugliotti LA,Wu T,Dolska M,Tkachenko AG,Shipton MK,Eaton BE,Feldheim DL.Langmuir.2006,22,5862―5866;Gugliotti LA,Feldheim DL,Eaton BE.J Am Chem Soc.2005,127,17814―17818;Gugliotti LA,Feldheim DL,Eaton BE.Science.2004,304,850―852;Kuwahara M,Hanawa K,Ohsawa K,Kitagata R,Ozaki H,Sawai H.Bioorg Med Chem.2006,14,2518―2526;Saitoh H,Nakamura A,Kuwahara M,Ozaki H,Sawai H.Nucleic Acids Res Suppl.2002,2,215―216;Kuwahara M,Ohbayashi T,Hanawa K,Shoji A,Ozaki AN,Ozaki H,Sawai H.Nucleic Acids Res Suppl.2002,2,83―84.Mehedi Masud M,Ozaki―Nakamura A,Kuwahara M,Ozaki H,Sawai H Chembiochem.2003,4,584―548;Masud MM,Ozaki―Nakamura A,Satou F,Ohbayashi T,Ozaki H,Sawai H.Nucleic Acids Res Suppl.2001;(l):21―2;Obayashi T,Masud MM,Ozaki AN,Ozaki H,Kuwahara M,Sawai H.Bioorg Med Chem Lett.2002,12,1167―70;Sawai H,Ozaki―Nakamura A,Mine M,Ozaki H..Bioconjug Chem.2002,2,309―316;Ohbayashi T,Kuwahara M,Hasegawa M,Kasamatsu T,Tamura T,Sawai H Org Biomol Chem.2005,3,2463―2468;Shoji A,Hasegawa T,Kuwahara M,Ozaki H,Sawai H.Bioorg Med Chem Lett.2006 Oct 28;[Epub ahead of print]Kuwahara M,Nagashima J,Hasegawa M,Tamura T,Kitagata R,Hanawa K,Hososhima S,Kasamatsu T,Ozaki H,Sawai H.Nucleic Acids Res.2006,34,5383―5394;Ito Y.Nucleic Acids Symp Ser.997,37,259―260;Schoetzau T,Langner J,Moyroud E,Roehl I,Vonhoff S,Klussmann S.Bioconjug Chem.2003,5,919―926;Mehedi Masud M,Ozaki―Nakamura A,Kuwahara M,Ozaki H,Sawai H.Chembiochem.2003,4,584―588;およびEbara Y,Kaihatsu K,Ueji S.Nucleic Acids Symp Ser.1999,42,175―176を参照。
所望の標的に結合するアプタマーが同定されたら、同定されたアプタマー配列の結合および/または機能的特性をさらに増加させるために、いくつかの技術が選択的に実行されうる。SELEX(商標)プロセス(例えば2’―修飾SELEX(商標))により同定される所望の標的に結合するアプタマー、例えばMNA、dCmD、dTmV、rUmV、dUmVアプタマーが、所望の結合および/または機能的特性を有する最小のアプタマー配列(本明細書において「最小化コンストラクト」とも称される)を得るために、選択的に切断されうる。これを達成する一つの方法は、最小化コンストラクトのデザインを知るための、フォールディングプログラムおよび配列分析(例えば保存モチーフおよび/または共変動を探すための、選択から得られるクローン配列のアライニング)の使用による。最小化コンストラクトのデザインを知るために、アプタマー配列の5’および3’境界を決定するために、生化学的プロービング実験も行われうる。その後、最小化コンストラクトが化学合成され、それらが得られた非最小化配列と比較して、結合および機能的特性につき試験されうる。一連の5’、3’および/または内部欠損を含むアプタマー配列の変異体も、直接化学合成され、それらが得られた非最小化アプタマー配列と比較して、結合および/または機能的特性につき試験されうる。
(1)すでに体内に存在する置換基、例えば2’―デオキシ、2’―リボ、2’―O―メチルプリンまたはピリミジンまたは5―メチルシトシン。
脊椎動物の免疫系による細菌DNAの認識は、特定の配列コンテキストにおける非メチル化CGジヌクレオチドの認識に基づく(「CpGモチーフ」)。このようなモチーフを認識する一つのレセプターは、異なる微生物成分を認識することにより先天性の免疫反応に関与するToll―likeレセプター(〜10メンバー)のファミリーのメンバー、Toll―likeレセプター9(「TLR9」)である。TLR9は、非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド(「ODN」)CpG配列を配列特異的様式で結合する。CpGのモチーフの認識が防御機構を誘発し、先天性および最終的に後天性の免疫反応につながる。例えばマウスにおけるTLR9の活性化は、抗原提示細胞の活性化、MHCクラスIおよびII分子のアップレギュレーション、および重要な共刺激分子およびIL―12およびIL―23を含むサイトカインの発現を誘導する。この活性化は、TH1サイトカインIFN―ガンマの強いアップレギュレーションを含めて、直接および間接的にBおよびT細胞反応を増強する。CpG配列に対する反応は、集合的に、感染症からの保護、ワクチンに対する免疫反応の改善、喘息に対する有効な反応、および抗体依存―細胞媒介細胞傷害の改善につながる。したがって、CpG ODNsは、感染症からの保護を提供し、免疫アジュバントまたは癌治療薬(単独療法またはmAbや他の療法と組み合わせて)として機能し、喘息およびアレルギー反応を減少させうる。
アプタマーを含む全てのオリゴヌクレオチドベースの治療薬の薬物動態学的特性が、所望の薬学的用途に適合するように調整されることが重要である。細胞外標的に対するアプタマーには(アンチセンスおよびRNAiベースの治療薬の場合のように)細胞内送達と関連した問題がないが、このようなアプタマーはなお、標的器官および組織に分布され、所望の薬剤投与計画と整合した一定期間体内にとどまることが可能でなければならない。
上述の通り、高分子量の非免疫原性ポリマーによる核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態学的および薬力学的特性を変更し、それらをより有効な治療剤とする可能性を有する。活性の好ましい変化には、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗の増加、腎臓による濾過の減少、免疫系に対する曝露の減少、および治療薬の体内分布の変更を含みうる。
高分子量PAG―核酸―PAG結合体は、二つ以上の反応部位を含む核酸と単官能性活性化PEGの反応により調製されうる。一実施形態においては、核酸は二反応性または二活性化され、二つの反応部位:従来のホスホラミダイト合成によりオリゴヌクレオチドに導入された5’―アミノ基および3’―アミノ基、例えば図2に示されるような3’―5’―ジ―PEG化を含む。代替的実施形態では、例えばピリミジンの5―位、プリンの8―位またはリボースの2’―位を一級アミンの付着のための部位として用いて、内部の位置に反応部位が導入されうる。このような実施形態においては、核酸がいくつかの活性化または反応性部位を有することができ、多重活性化されていると言われる。合成および精製の後、修飾オリゴヌクレオチドは、自発的加水分解を最小化しながら、オリゴヌクレオチド反応部位との選択反応を促進する条件下で、単活性化PEGと組み合わせられる。好ましい実施形態においては、モノメトキシ―PEGがスクシンイミジルプロピオン酸で活性化され、pH8.3で共役反応が行われる。二置換PEGの合成を誘発するために、オリゴヌクレオチドに対して化学量論的過剰のPEGが提供される。反応の後、完全、部分的、および非結合種を分離するために、PEG―核酸結合体がゲル電気泳動または液体クロマトグラフィにより精製される。
本発明の方法に用いられる変異T7RNAポリメラーゼは、以下のように調製されうる。T7RNAポリメラーゼ(図3Aおよび3Bにそれぞれ示され、Bull,J.J等、J.Mol.Evol.,57(3),241―248(2003)に記載される核酸およびアミノ酸配列を変異させて、LA変異体(Y639L/H784A)、LAR変異体(Y639L/H784A/K378R)、LLA変異体(P266L/Y639L/H784A)またはLLAR変異体P266L/Y639L/H784A/K378R)を生じうる。T7RNAポリメラーゼが、発現ベクター(T7RNAポリメラーゼ発現ベクターの例が、参照により全体として本明細書組み込まれるに米国特許出願第5,869,320号に記載される)に含まれ、または変異誘発後に発現ベクターに挿入されうる。変異T7RNAポリメラーゼは、タンパク質精製の間の容易性のためにHis―tagを選択的に含むために、操作されうる。
変異T7ポリメラーゼ核酸配列を含む発現ベクターは、BL21(DE3)コンピテント細胞(Stratagene、カリフォルニア州)に形質転換され、20分間氷上でインキュベートされる。チューブを2分間42℃に入れることにより、熱ショックが行われる。チューブを1分間氷に置いた後、1mlのLブロス(「LB」)が加えられ、37℃のシェーカで45分間インキュベートされる。100ulの培養液が、LB+Amp寒天プレートにプレートされ、一晩37℃でインキュベートされる。
実施例2A:2’―OH GTPを伴わない2’―O―メチル転写
2’―OH GTPの滴定を用いて、2’―OH GTPの濃度に対するY639L/H784A/K378R変異ポリメラーゼの感受性をテストするために、実験が行われた。
Y639L/H784A/K378R変異T7RNAポリメラーゼを用い、2’―OH GTPを用いないMNA転写の忠実度およびバイアスを評価するために、追加的な実験が行われた。忠実度をテストするために、単一のクローン配列がPCRにより増幅され、Y639L/H784A/K378Rポリメラーゼを用いた2’―OH GTPを伴わないMNA転写をプログラムするために使用され、PAGEにより精製され、RQl DNアーゼを用いて残りのDNAテンプレートが消化され(そしてDNAテンプレートの非存在がPCRによりアッセイされ)、転写物が逆転写され(Thermoscript、Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)、PCRにより増幅された。このPCR産物が配列決定された後、欠失、挿入および置換の数が計算された。この実験で配列決定された1300の塩基のうちに、欠失および挿入は観察されず、三つの置換が観察された(図7を参照)。これらの数は、30―ヌクレオチド縮重領域内にコードされる配列情報がSELEX(商標)の次のラウンドに忠実に伝達されるチャンスが、93%であることを示唆し、この数は非常に高いため、野生型RNAにつき測定される数を上回る。
二本鎖転写テンプレートを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応をプログラムするために以下のDNAテンプレートおよびプライマが用いられた。Nは、ATGCの各々である確率がほぼ等しい縮重位置を示し、全ての配列が3’から5’方向にリストされる:PCRテンプレート(ARC2118)
in vitro転写を用いて2’―O―メチルヌクレオチドおよび2’―デオキシヌクレオチドの両者を導入するY639L/H784A/K378R変異ポリメラーゼの能力をテストするために実験が行われた。
2’―OMeプリンおよびピリミジンヌクレオチド(以下に「MNA」)からなるプールを用いて、ヒトAng2(以下に「h―Ang2」)に対するアプタマーを同定するために、選択が実行された。選択戦略は、h―Ang2に特異的な高親和性アプタマーをもたらした。
プール調製
配列
100μLの最終的体積の選択バッファー(1X DulbeccoのPBS(DPBS))において100pmolのタンパク質と330pmol(2×1014分子)のMNA ARC2118プールを1時間室温でインキュベートすることにより、選択が開始された。RNA―タンパク質複合体および未結合RNA分子が、0.45ミクロンニトロセルローススピンカラム(Schleicher and Schuell、ニューハンプシャー州キーン)を用いて分離された。カラムはKOHで前処置され(1mL 0.5M KOH中にカラムフィルタ浸漬、15分RT;スピン。1mL dH2O中にフィルタ浸漬 5分RT;スピン)、1mL 1X PBSで二回洗浄されてから、プール:Ang2複合体を含む溶液がカラムに加えられ、2分間1500xgで遠心分離された。フィルタは、非特異的結合物を除去するために、500μL DPBSにより二回洗浄された。2×100μL溶離バッファー(7M尿素、100mM酢酸ナトリウム、3mMEDTA、95℃に予熱)の添加によりRNAが溶出されてから、エタノールにより沈殿させられた。プライマ配列番号27を用いて、製造者の指示に従って、ThermoScript RT―PCR(商標)システム(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)により、RNAが逆転写された。配列番号26および配列番号27を用いて、製造者の指示に従って、Taqポリメラーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州ベヴァリー)によるPCRにより、cDNAが増幅された。プール調製のために上述のようにテンプレートが転写され、変性ポリアクリルアミドゲルで精製された。
プールのタンパク質結合親和性をモニタするために、選択の全体にわたりドットブロット結合アッセイが行われた。トレース32P―エンド標識したプールRNAが、h―Ang2と組み合わされ、DPBSバッファー中で30μLの最終的体積で、30分間室温でインキュベートされた。混合物がドットブロット装置に適用され(Minifold―1Dot Blot、Acrylic、Schleicher and Schuell、ニューハンプシャー州キーン)、(上から下へ)ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロット膜とアセンブルされた。タンパク質に結合されたRNAはニトロセルロースフィルタに捕らえられ;非タンパク結合RNAはナイロンフィルタに捕らえられる。ラウンド9でh―Ang2結合の濃縮の開始が見られた。ラウンド9、10および12のプールテンプレートが、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)を使用して製造者の指示に従ってクローニングされ、化学合成のために26のユニーククローンが選択され、解離定数(KD)が決定された。簡単にいうと、合成RNAsがγ―32P ATPで5’末端標識され、ドットブロットアッセイおよび1X DPBS(w/Ca2+およびMg2+)(Gibco、Catalog#14040、Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)のバッファー条件を用いてKD値が決定された。式:RNA結合画分=振幅*(((AptConc+[h―Ang2]+KD)−SQRT((AptConc+[h―Ang2]+KD)2−4(AptConc*[h―Ang2])))/(2*AptConc))+バックグラウンドにデータをあてはめてKDsが推定された。結果は、下表5にレポートされる。
Elisaアッセイ
いくつかアプタマーが、Tie2レセプターに対するAng2結合を妨げる能力を測定するために準備されたELISAアッセイにおいてテストされた。Tie2レセプターを捕捉するために、100μLのPBS(pH7.4)中の150ngのTie2―Fc(R&D systems 313―TI―100―CF、ミネソタ州ミネアポリス)が、96ウェルMaxisorbプレート(NUNC#446612、ニューヨーク州ロチェスター)に置かれ、4℃で一晩インキュベートされた。捕捉の間、様々な濃度の合成RNA50μLが、50μLの3.6nM Ang2(200ng/mL)(R&D systems、623―AN―025/CF、ミネソタ州ミネアポリス)(0.2% BSAを伴うPBS中)と、0.1% BSAを伴うPBS中1.8nM(100ng/mL)の最終Ang2濃度で混合され、1時間室温でインキュベートされた。一晩のインキュベーション後に捕捉溶液が除去され、200μLのTBST(25mM Tris―HCl pH7.5、150mM NaClおよび0.01% Tween20)によりプレートが三回洗浄された。そして、プレートが、5%脱脂粉ミルクを含む200μL TBSTにより室温で30分間ブロックされた。ブロッキングの後、プレートが200μLのTBSTで再び室温で三回洗浄され、合成RNA:Ang2混合物がプレートに加えられ、1時間室温でインキュベートされた。そして、プレートが200μLのTBSTで三回洗浄され、100μLのビオチン化ヤギ抗Ang2抗体(1:1000;R&D Systems BAF623、ミネソタ州ミネアポリス)が加えられ、室温で1時間インキュベートされた。200μLのTBSTにより三回洗浄したあと、100μLのHRP連結ストレプトアビジン(1:200;R&D systems#DY998、ミネソタ州ミネアポリス)が加えられ、0.5時間室温でインキュベートされた。そして、プレートが再び200μLのTBSTにより三回洗浄され、100μLのTMP溶液(Pierce、#34028)が加えられ、暗所で、室温で5分間インキュベートされた。2N H2SO4を含む100μLの溶液が加えられて反応が停止され、プレートがSpectroMaxで、450nmで読み取られた。結果は、下表5の最終的欄に与えられる。
ヒト臍静脈内皮細胞(「HUVEC」)(ATCC)およびK293細胞、ヒトTie2レセプターを過剰発現する細胞系統を用いて、細胞膜上のTie2レセプターに対するAng2の結合を阻害する特異的MNA Ang2アプタマーのIC50が決定された。簡単にいうと、組換え哺乳類発現ベクターpCDNA3.1―Tie2が293細胞(ATCC、ヴァージニア州マナサス)にトランスフェクションされ、G418(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)による選択の後、安定したクローンが得られた。フローサイトメトリは、HUVECおよびK293細胞の両方のTie2タンパク質の発現を示した。Ang2滴定アッセイにより、HUVECおよびK293細胞に対する細胞アプタマー阻害アッセイのAng2(R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)の量がさらに決定され、それぞれ1および0.1μg/mLであった。
2’―OMeプリンおよびピリミジンヌクレオチドからなるプール(以下に「mRmY」)を用いて、ヒトIgE(以下に「h―IgE」)に対するアプタマーを同定するために、選択が行われた。選択戦略は、h―IgEに特異的な高親和性アプタマーをもたらした。
プール調製
配列
330pmol(2×1014分子)のMNA ARC2118プールを、BSAブロックされた疎水性プレート(Maxisorpプレート、Nunc、ニューヨーク州ロチェスター)に結合した24pmolのタンパク質とともに100μLの最終体積の選択バッファー(1X DulbeccoのPBS(DPBS))中で、室温で1時間インキュベートすることにより選択が開始されれた。ウェルは、非特異的結合物を除去するために、120μL DPBSにより四回洗浄された。RNAが溶出され、プライマ配列番号27を用いて、ThermoScript RT―PCR(商標)システム(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)により、製造者の指示に従って逆転写された。配列番号26および配列番号27を用いて、製造者の指示に従って、Taqポリメラーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州ベヴァリー)を使用したPCRによりcDNAが増幅された。プール調製で上述したようにテンプレートが転写され、変性ポリアクリルアミドゲルで精製された。
プールのタンパク質結合親和性をモニタするために、選択の全体にわたりドットブロット結合アッセイが行われた。トレース32P―エンド標識したプールRNAが、h―IgEと組み合わされ、DPBSバッファー中で30μLの最終体積で、30分間室温でインキュベートされた。混合物がドットブロット装置に適用され(Minifold―1 Dot Blot、Acrylic、Schleicher and Schuell、ニューハンプシャー州キーン)、(上から下へ)ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロット膜とアセンブルされた。タンパク質に結合されたRNAは、ニトロセルロースフィルタに捕らえられ;非タンパク結合RNAは、ナイロンフィルタに捕らえられる。ラウンド8でh―IgE結合の濃縮の開始が見られた。ラウンド5、8および12のプールテンプレートが、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)を使用して製造者の指示に従ってクローニングされた。配列決定データから、ラウンド8のプールが全配列の59%を含む単一の主要クローンに収束したことが明らかになった。この主要クローンと三つの可能性のあるミニマーが化学合成のために選択され、解離定数(KD)が決定された。簡単にいうと、合成RNAsがγ―32P ATPで5’末端標識され、ドットブロットアッセイおよび1X DPBS(w/Ca2+およびMg2+)(Gibco、Catalog#14040、Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)のバッファー条件を用いてKD値が決定された。式:RNA結合画分=振幅*(((AptConc+[h―IgE]+KD)−SQRT((AptConc+[h―IgE]+KD)2−4(AptConc*[h―IgE])))/(2*AptConc))+バックグラウンドにデータをあてはめてKDsが推定された。主要クローンは、約800pMのKDを有した。最善の結合のミニマーの、サルIgE(m―IgE)に対する結合もテストされたが、サルIgEタンパク質に対する交差反応結合は示されなかった。この交差反応性の欠如は、ELISAによっても確認された。3’末端に逆方向dTを伴うミニマーが、医薬品化学プロセスの親分子として用いられた。
IgE特異的MNAミニマーの一つの化学組成(図9)が、化合物の血漿安定性を維持しながら親和性および能力を改善するために変更された。プロセスは、最小化IgEアプタマーの一連の誘導体の設計、合成および評価を含み、一連の各誘導体は、いずれの残基が置換に耐えるかを決定するため、各所定のヌクレオチドで単一の修飾を含んだ。第一修飾組は、各ユニーク2’―OMeヌクレオチドへのデオキシヌクレオチドの置換であった。別個の修飾ラウンドにおいては、各誘導体が異なるヌクレオチド間結合位置で単一のホスホロチオエート修飾を含む一連の誘導体が合成された。これらの修飾の最初の段階において生成されたデータを用いて、最小化アプタマーの構造活性相関(SAR)が確立された。後の修飾段階においては、最初のSARデータに基づいて設計された複合置換組でアプタマーが合成され、テストされた。複合置換パネルから、2’―OMeから2’―デオキシへの置換がその組成に導入された、39ヌクレオチドの長さのアプタマーが同定された。さらに、2’―OMeから2’―デオキシへの一つの置換およびリン酸塩からホスホロチオエートへの四つの置換がその組成に導入された、39ヌクレオチドの長さの、得られた最小化修飾アプタマーが同定された。図10に示すように、このデオキシ/ホスホロチオエート修飾アプタマーは、最小化非修飾親アプタマーならびに二つの2’―OMeからデオキシへの置換を有する最小化親アプタマーの両方と比較して、結合親和性の増加を示す。
最小化非修飾親アプタマーおよびデオキシ/ホスホロチオエート修飾アプタマーが、ヒト、ラットおよびサル血清における安定性を決定するためにアッセイされた。各アプタマーが、90%血清中5μMの最終濃度になるように、1mlのプール血清に加えられた。アプタマーは振盪を伴って37℃でインキュベートされ、0、0.5、1、4、24、48、72、および98時間でタイムポイントがとられた。各タイムポイントで、インキュベート試料からの90μlのストックが、10μlの0.5M EDTAに加えられ、BIACORE 2000システムを用いた後の安定性分析のために−20℃で冷凍された。
2’―OMe ATP、GTP、およびUTPヌクレオチド、および2’―デオキシCTPヌクレオチド(以下に「dCmD」)からなるプールを用いて、ヒトフォンビルブラント因子(以下に「h―vWF」)に対するアプタマーを同定するために、選択が行われた。選択戦略から、h―vWFに特異的な高親和性アプタマーが生じた。
プール調製
配列
100μLの最終体積の選択バッファー(1X DulbeccoのPBS(DPBS)において、HSAブロックされた疎水性プレート(Maxisorpプレート、Nunc、ニューヨーク州ロチェスター)に結合された20pmolのタンパク質とともに330pmol(2×1014分子)のdCmD ARC4218プールを1時間室温でインキュベートすることにより、選択が開始された。非特異的結合物を除去するために、200μL DPBSによりウェルが五回洗浄された。RNAが溶出され、プライマARC4208(配列番号30)を用いて、製造者の指示に従ってThermoScript RT―PCR(商標)システム(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)により逆転写された。プライマARC4219(配列番号29)およびARC4208(配列番号30)を用いて、製造者の指示に従って、Taqポリメラーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州ベヴァリー)によるPCRによりcDNAが増幅された。プール調製につき上述したようにテンプレートが転写された。エタノール沈殿によりテンプレートが精製され、その後Micro Bio―spinカラム(Cat.#732―6250、Bio−Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を用いた脱塩ステップが行われた。
プールのタンパク質結合親和性をモニタするために、選択の全体にわたりドットブロット結合アッセイが行われた。トレース32P―エンド標識したプールRNAが、h―vWFと組み合わされ、DPBSバッファー中で30μLの最終体積で、室温で30分間インキュベートされた。混合物がドットブロット装置に適用され(Minifold―1 Dot Blot、Acrylic、Schleicher and Schuell、ニューハンプシャー州キーン)、(上から下へ)ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロット膜とアセンブルされた。タンパク質に結合されたRNAは、ニトロセルロースフィルタに捕らえられ;非タンパク結合RNAは、ナイロンフィルタに捕らえられる。ラウンド5でh―vWF結合の濃縮の開始が見られた。ラウンド5およびラウンド6プールの解離定数(KD)が決定された。簡単にいうと、プールRNAsがγ―32P ATPで5’末端標識され、ドットブロットアッセイおよび1X DPBS(w/Ca2+およびMg2+)(Gibco、Catalog#14040、Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)のバッファー条件を用いてKD値が決定された。式:RNA結合画分=振幅*(((AptConc+[h―vWF]+KD)−SQRT((AptConc+[h―vWF]+KD)2−4(AptConc*[h―vWF])))/(2*AptConc))+バックグラウンドにデータをあてはめてKDsが推定された。ラウンド6プールは、約2nMのKDを有した。プールは、Alドメインに対する結合についてもテストされ、約4nMのKDを有した。
2’―OMe ATP、GTP、およびUTPヌクレオチド、および2’―デオキシCTPヌクレオチド(以下に「dCmD」)からなるプールを用いて、ヒトIgE(以下に「h―IgE」)に対するアプタマーを同定するために選択が行われた。選択戦略から、h―IgEに特異的な高親和性アプタマーが生じた。
プール調製
配列
330pmol(2×1014分子)のdCmD ARC4218プールを、HSAブロックされた疎水性プレート(Maxisorpプレート、Nunc、ニューヨーク州ロチェスター)に結合した20pmolのタンパク質とともに100μLの最終体積の選択バッファー(1X DulbeccoのPBS(DPBS))中で、室温で1時間インキュベートすることにより選択が開始されれた。ウェルは、非特異的結合物を除去するために、200μL DPBSにより五回洗浄された。RNAが溶出され、プライマARC4208(配列番号30)を用いて、ThermoScript RT―PCR(商標)システム(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)により、製造者の指示に従って逆転写された。プライマARC4219(配列番号29)およびARC4208(配列番号30)を用いて、製造者の指示に従って、Taqポリメラーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州ベヴァリー)を用いたPCRにより、cDNAが増幅された。プール調製につき上述したように、テンプレートが転写された。エタノール沈殿によりテンプレートが精製された後、Micro Bio―spinカラム(Cat.#732―6250、Bio―Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を用いて脱塩ステップが行われた。
プールのタンパク質結合親和性をモニタするために、選択の全体にわたりドットブロット結合アッセイが行われた。トレース32P―エンド標識したプールRNAが、h―IgEと組み合わされ、DPBSバッファー中で30μLの最終体積で、室温で30分間インキュベートされた。混合物がドットブロット装置に適用され(Minifold―1 Dot Blot、Acrylic、Schleicher and Schuell、ニューハンプシャー州キーン)、(上から下へ)ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロット膜とアセンブルされた。タンパク質に結合されたRNAはニトロセルロースフィルタに捕らえられ;非タンパク結合RNAはナイロンフィルタに捕らえられる。ラウンド5でh―IgE結合の濃縮の開始が見られた。ラウンド5および6プールの解離定数(KD)が決定された。簡単にいうと、プールRNAsがγ―32P ATPで5’末端標識され、ドットブロットアッセイおよび1X DPBS(w/Ca2+およびMg2+)(Gibco、Catalog#14040、Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)のバッファー条件を用いてKD値が決定された。式:RNA結合画分=振幅*(((AptConc+[h―IgE]+KD)−SQRT((AptConc+[h―IgE]+KD)2―4(AptConc*[h―IgE])))/(2*AptConc))+バックグラウンドにデータをあてはめてKDsが推定された。ラウンド6プールは、約80nMのKDを有した。
Y639L/H784A/K378R変異ポリメラーゼが、in vitro転写を用いて2’―O―メチルA、C、Gおよび2’―O―メチル―5インドリルメチレンUを転写産物に導入するために用いられる。修飾ウリジンが、以下にヌクレオシドとして示される:
治療目的のタンパク質標的に対するSELEXが、複数の縮重位置および上の実施例7に記載のMNA―I転写条件を含む転写テンプレートを用いて実行される。
200nMの40ヌクレオチドの内側の連続縮重領域を伴う二本鎖転写テンプレート、200mM HEPES、40mM DTT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX―100、各1.5mMの2’―OMe TTP、2’―OMe ATP、2’―OMe CTP、2’―OMe GTP、8mM MgCl2、2.5mM MnCl2、1mM GMP、10%PEG 8000、2.5単位/ml無機ピロホスファターゼ、pH7.5およびK378R/Y639F/H784A変異T7ポリメラーゼにより、400ul転写が準備された。溶液が37℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性PAGEを用いて分析された後、UVシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するMNA転写産物と共移動したバンドが観察された。2’―OMe TTPを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
200nMの二本鎖転写テンプレートARC3205、200mM HEPES、40mM DTT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX―100、各1.5mMの2’―デオキシTTP、2’―OMe ATP、2’―OMe CTP、2’―OMe GTP、8mM MgCl2、2.5mM MnCl2、1mM GMP、10%PEG8000、2.5単位/ml無機ピロホスファターゼ、pH7.5およびK378R/Y639F/H784A変異T7ポリメラーゼにより、400ul転写が準備された。溶液が37℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性PAGEを用いて分析された後、UVシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するMNA転写産物と共移動したバンドが観察された。2’―デオキシTTPを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
200nMの40ヌクレオチドの内側の連続縮重領域を伴う二本鎖転写テンプレート、200mM HEPES、40mM DTT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX―100、各1.5mMの2’―OH TTP、2’―OMe ATP、2’―OMe CTP、2’―OMe GTP、8mM MgCl2、2.5mM MnCl2、1mM GMP、10%PEG8000、無機ピロホスファターゼ2.5単位/ml、pH7.5およびK378R/Y639F/H784A変異T7ポリメラーゼにより、400ul転写が準備された。溶液が37℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性PAGEを用いて分析された後、UVシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するMNA転写産物と共移動したバンドが観察された。2’―OH TTPを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
200nMの二本鎖転写テンプレートARC3205、200mM HEPES、40mM DTT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX―100、各1.5mMの2’―デオキシUTP、2’―OMe ATP、2’―OMe CTP、2’―OMe GTP、8mM MgCl2、2.5mM MnCl2、1mM GMP、10%PEG8000、無機ピロホスファターゼ2.5単位/ml、pH7.5およびK378R/Y639F/H784A変異T7ポリメラーゼにより、400ul転写が準備された。溶液が37℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性PAGEを用いて分析された後、UVシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するMNA転写産物と共移動したバンドが観察された。2’―デオキシUTPを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
200nMの二本鎖転写テンプレートARC3205、200mM HEPES、40mM DTT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX―100、各1.5mMの2’―OH UTP、2’―OMe ATP、2’―OMe CTP、2’―OMe GTP、8mM MgCl2、2.5mM MnCl2、1mM GMP、10%PEG8000、無機ピロホスファターゼ2.5単位/ml、pH7.5およびK378R/Y639F/H784A変異T7ポリメラーゼにより、400ul転写が準備された。溶液が37℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性PAGEを用いて分析された後、UVシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するMNA転写産物と共移動したバンドが観察された。2’―OH UTPを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写物は、観察可能なバンドを生成しなかった。
200nMの二本鎖転写テンプレートARC3205、200mM HEPES、40mM DTT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX―100、各1.5mMの2’―デオキシTTP、2’―OMe ATP、2’―OMe CTP、2’―OH GTP、8mM MgCl2、2.5mM MnCl2、1mM GMP、10%PEG8000、無機ピロホスファターゼ2.5単位/ml、pH7.5およびK378R/Y639F/H784A変異T7ポリメラーゼにより、400ul転写が準備された。溶液が37℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性PAGEを用いて分析された後、UVシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。隣接するウェルにロードされた対応するMNA転写産物と共移動したバンドが観察された。2’―デオキシTTPを伴わずにインキュベートされた陰性対照転写は、観察可能なバンドを生成しなかった。
200nMの40ヌクレオチドの内側の連続縮重領域を伴う二本鎖転写テンプレート、200mM HEPES、40mM DTT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX―100、各1.5mMの2’―OMe QTP、2’―OMe ATP、2’―OMe CTP、2’―OH GTP、8mM MgCl2、2.5mM MnCl2、1mM GMP、10%PEG8000、無機ピロホスファターゼ2.5単位/ml、pH7.5およびK378R/Y639F/H784A変異T7ポリメラーゼにより、400ul転写が準備された。2’―OMe QTP(mQ)が下に示される:
50nMの30ヌクレオチドの内側の連続縮重領域を伴う二本鎖転写テンプレート、200mM HEPES、40mM DTT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX―100、各1.5mMの2’―OMe UTP、2’―OMe ATP、2’―OMe CTPおよび2’―OMe GTP、または各1.5mMの2’―OH UTP、2’―OH ATP、2’―OH CTPおよび2’―OH GTP、8mM MgCl2、2.5mM MnCl2、1mM GMP、10%PEG8000、無機ピロホスファターゼ2.5単位/ml、pH7.5および以下に示される変異または野生型T7ポリメラーゼ(WTがK378R、FがK378R/Y639F、LがK378R/Y639L、FAがK378R/Y639F/H784A、LAがK378R/Y639L/H784A)により、400ulの転写が準備された。溶液が37℃で一晩インキュベートされ、沈殿され、変性ローディングバッファーに溶解され、変性PAGEを用いて分析された後、UVシャドウイングを用いて蛍光板上で可視化された。図11に示されるように、異なる転写の収率が観察された。
Claims (16)
- 核酸を転写する方法であり、
a)転写反応混合物を調製するステップであって、前記転写反応混合物は、
(i)2’―OMe ATP、2’―OMe GTP、2’―OMe CTP、2’―OMe TTPおよび2’―OMe UTPより選択される2’―OMe修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―OMe NTP)のいずれかを導入することが可能な修飾T7 RNAポリメラーゼであり、前記修飾T7 RNAポリメラーゼが、対応する非修飾RNAポリメラーゼの2’―修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―修飾NTP)を導入する能力と比較して、前記2’―修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―修飾NTP)を導入する能力が増加しており、前記修飾T7 RNAポリメラーゼは、野生型T7 RNAポリメラーゼに対してアミノ酸639位および784位において変異を含み、前記639位におけるアミノ酸はロイシンに変化し、前記784位におけるアミノ酸はアラニンに変化している、修飾T7 RNAポリメラーゼと、
(ii)少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、
(iii)ヌクレオチド三リン酸の混合物であり、前記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、前記グアニジン三リン酸が全て2’―OMe修飾されており、前記ヌクレオシド三リン酸の混合物は、2’−デオキシシチジン三リン酸(2’−デオキシCTP)、2’−OMeアデノシン三リン酸(2’−OMe ATP)、2’−OMeグアノシン三リン酸GTP(2’−OMe GTP)、および2’−OMeウリジン三リン酸(2’−OMe UTP)または2’−OMeチミジンヌクレオチド三リン酸(2’−OMe TTP)の混合物である、ヌクレオチド三リン酸の混合物と
を含む、転写反応混合物を調製するステップと;
b)一本鎖核酸が生じる条件下で、前記転写反応混合物を転写するステップであり、前記生じる一本鎖核酸の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、2’―OMe修飾されている、ステップと
を含む、方法。 - 前記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸塩基が、ウリジンの5―および6―位、チミジンの5―および6―位、シチジンの5および6―位および環外アミン、アデノシンの2―、7―および8―位および環外アミン、グアノシンの7―および8―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、請求項2に記載の方法。
- 前記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、請求項2に記載の方法。
- 前記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、請求項4に記載の方法。
- 前記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方、GMP、ポリエチレングリコール、または無機ピロホスファターゼの1または複数をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも部分的に二本鎖の核酸転写テンプレートが、前記核酸転写テンプレートの5’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- アプタマーを同定する方法であり、前記アプタマーが2’―OMe修飾ヌクレオチドを含む、方法であり、
a)転写反応混合物を調製するステップであって、前記転写反応混合物は、
(i)2’―OMe ATP、2’―OMe GTP、2’―OMe CTP、2’―OMe TTPおよび2’―OMe UTPより選択される2’―OMe修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―OMe NTP)のいずれかを導入することが可能な修飾T7 RNAポリメラーゼであり、前記修飾T7 RNAポリメラーゼが、対応する非修飾RNAポリメラーゼの2’―修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―修飾NTP)を導入する能力と比較して、前記2’―修飾ヌクレオチド三リン酸(2’―修飾NTP)を導入する能力が増加しており、前記T7 RNAポリメラーゼは、野生型T7 RNAポリメラーゼに対してアミノ酸639位および784位において変異を含み、前記639位におけるアミノ酸はロイシンに変化し、前記784位におけるアミノ酸はアラニンに変化している、修飾T7RNAポリメラーゼと、
(ii)少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、
(iii)ヌクレオチド三リン酸の混合物であり、前記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、前記グアニジン三リン酸が全て2’―OMe修飾されており、前記ヌクレオシド三リン酸の混合物は、2’−デオキシシチジン三リン酸(2’−デオキシCTP)、2’−OMeアデノシン三リン酸(2’−OMe ATP)、2’−OMeグアノシン三リン酸GTP(2’−OMe GTP)、および2’−OMeウリジン三リン酸(2’−OMe UTP)または2’−OMeチミジンヌクレオチド三リン酸(2’−OMe TTP)の混合物である、ヌクレオチド三リン酸の混合物と
を含む、転写反応混合物を調製するステップと;
b)前記修飾T7RNAポリメラーゼにより、一本鎖核酸の候補混合物の前記核酸分子に、少なくとも一つの修飾2’―OMeヌクレオチド三リン酸(2’―OMe NTP)が導入される条件下で、前記転写反応混合物を転写することにより、前記一本鎖核酸の候補混合物を調製するステップであり、前記候補混合物の前記一本鎖核酸分子の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、2’―OMe修飾されている、ステップと;
c)前記候補混合物を前記標的分子と接触させるステップと、
d)前記候補混合物の親和性と比較して、標的分子に対する親和性が増加した前記核酸を、前記候補混合物から分離するステップと、
e)アプタマーが濃縮された混合物を生じるために、前記親和性が増加した核酸を増幅するステップを含み、それによって、アプタマーの前記グアニジンヌクレオチドの一つを選択的に除いて、全て2’―OMe修飾されたグアニジンヌクレオチドを含む、前記標的分子に対する前記アプタマーが、同定される、
方法。 - 前記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸塩基が、ウリジンの5―および6―位、チミジンの5―および6―位、シチジンの5および6―位および環外アミン、アデノシンの2―、7―および8―位および環外アミン、グアノシンの7―および8―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、請求項10に記載の方法。
- 前記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、請求項10に記載の方法。
- 前記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、請求項12に記載の方法。
- 前記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方、GMP、ポリエチレングリコール、または無機ピロホスファターゼの1または複数をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項9に記載の方法。
- 前記少なくとも部分的に二本鎖の核酸転写テンプレートが、前記核酸転写テンプレートの5’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、請求項15に記載の方法。
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