JP2007534339A - 免疫グロブリンｅに特異的な核酸リガンドおよびアトピー性疾患治療としてのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、アトピー性疾患および／またはＩｇＥが関係している他の疾患もしくは障害の治療剤として、およびそれの診断剤として有用である、免疫グロブリンＥ（「ＩｇＥ」）に結合可能であるアプタマーを開示する。本発明はさらに、ＩｇＥに結合可能であるアプタマーの投与のための材料および方法に関する。ＩｇＥが病因に関与する疾患を治療するためにＩｇＥの生物学的機能を破壊するための材料および方法を有することは有益であり、本発明は、これらおよび他の必要性に合致する材料および方法を提供する。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的に、アトピー性疾患および／またはＩｇＥが関係している他の疾患もしくは障害の治療剤として、およびそれの診断剤として有用である、免疫グロブリンＥ（「ＩｇＥ」）に結合可能である核酸、そしてより具体的にはアプタマーの分野に関する。本発明はさらに、ＩｇＥに結合可能であるアプタマーの投与のための材料および方法に関する。

（発明の背景）
アプタマーは、古典的なワトソン−クリック塩基対形成以外の相互作用を通した分子に対する特異的結合親和性を有する核酸分子である。

アプタマーは、ファージディスプレイまたはモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）によって生成されるペプチドと同様に、選択された標的の特異的結合および標的の活性を調節することが可能であり、例えば、結合することを通して、アプタマーは、標的が機能する能力をブロックし得る。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロ選択プロセスによって作製されるので、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、およびレセプターを含む１００個を超えるタンパク質についてのアプタマーが生成されてきた。代表的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａのサイズ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル濃度以下の親和性でその標的を結合し、そして密接に関連する標的に対して区別する（例えば、アプタマーは、代表的には、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質を結合しない）。一連の構造研究は、アプタマーが、抗体−抗原複合体において親和性および特異性を駆動するものと同じ型の結合相互作用（例えば、水素結合、静電的相補性、疎水的接触、立体的排除）を使用することが可能であることを示してきた。

アプタマーは、高い特異性および親和性、生物学的効力、ならびに優れた薬物動態学的特性を含む、治療剤および診断剤としての使用のために所望される多数の特性を有する。加えて、アプタマーは、抗体および他のタンパク質生物製剤を超えた特定の競合的な利点、例えば、以下を含む：
１）速度および制御。アプタマーは、完全なインビトロプロセスによって産生され、これは、治療剤リード化合物を含む初期のリード化合物の迅速な生成を可能にする。インビトロ選択は、アプタマーの特異性および親和性がしっかりと制御されることを可能にし、毒性の標的と非免疫学的標的の両方に対するリード化合物を含むリード化合物の生成を可能にする。

２）毒性および免疫原性。クラスとしてのアプタマーは、毒性または免疫原性であることがほとんど実証されていないか、または全く実証されていない。高レベルのアプタマー（９０日間毎日、１０ｍｇ／ｋｇ）を用いるラットまたはマーモット属の長期的投薬において、毒性は、いかなる臨床的測定、細胞測定、または生化学的測定によっても観察されていない。多くのモノクローナル抗体の効力は、抗体それ自体に対する免疫応答によって厳しく制限され得るのに対して、アプタマーに対する抗体を誘発することは極度に困難である。最も考えられる原因としては、アプタマーはＭＨＣを介してＴ細胞によって提示されることができず、免疫応答は、一般的に、核酸フラグメントを認識しないように向けられているからである。

３）投与。大部分の現在認可されている抗体治療剤は静脈内注入によって投与されるが（代表的には２〜４時間にわたって）、アプタマーは、皮下注射によって投与され得（皮下投与を介するアプタマーの生物学的利用能は、サルの研究において＞８０％である（非特許文献１）。この違いは、主として比較的低い溶解度に起因し、従って、大きな体積が大部分の治療用ｍＡｂのために必要である。良好な溶解度（＞１５０ｍｇ／ｍＬ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）で、週１回の用量のアプタマーが、０．５ｍＬ未満の体積での注射によって送達され得る。加えて、小さなサイズのアプタマーは、抗体または抗体フラグメントが透過することが許容されないコンホメーション的な収縮の領域にそれらが透過することを可能にし、アプタマーに基づく治療剤または予防剤におけるなお別の利点を提示する。

４）拡大縮小性（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）およびコスト。治療用アプタマーは化学合成され、そして結果として、製造の需要に合致するために必要とされるように容易に拡大縮小され得る。製造を拡大縮小する際の困難さは、いくつかの生物製剤の利用可能性を現在制限しており、大スケールタンパク質産生プラントの資本コストが莫大であるのに対して、単一の大スケールオリゴヌクレオチド合成装置は、１００ｋｇ／年より多くを産生し得、比較的控えめな初期投資を必要とする。キログラムスケールのアプタマー合成のための物品の現在のコストは５００ドル／ｇと見積もられており、高く最適化された抗体のそれと比較可能である。プロセス開発において継続している改善は、５年間以内に＜１００ドル／ｇまで物品のコストを低下させると予測されている。

５）安定性。治療用アプタマーは化学的に強固である。これらは、熱および変性剤などの因子への曝露後に活性を回復するように内因的に適合されており、凍結乾燥粉末として室温で長時間（＞１年間）保存可能である。

（ＩｇＥおよびアトピー性疾患）
アトピーはアレルゲン特異的ＩｇＥを産生する遺伝的素因であり、喘息および他のアレルギー性疾患の発症のための最も重要な素因の１つである。アレルギー性鼻炎（花粉症）、喘息、およびアトピー性皮膚炎のようなアトピー性疾患は、米国の人口の間で流行しており、上昇中である。アレルギー性疾患の徴候には、血管拡張、平滑筋収縮、局所的炎症および血管透過性が含まれる。一般的な環境アレルゲンに応答したＩｇＥの産生の増加は、アトピー性疾患の顕著な特徴である。一般的なアレルゲンには、ホコリ中のダニの排出物、花粉、食品、動物の鱗屑および真菌胞子が含まれる。マスト細胞は、ヒスタミン、ロイコトリエン、およびプロスタグランジンのような種々の化学伝達物質のＩｇＥ媒介性の放出を通して、アレルギー性疾患の中間相反応において中心的な役割を果たすことが知られている。Ｔリンパ球、好塩基球および好酸球は、後期相応答を誘導する際の原因であると考えられている。抗原とのアレルギー特異的ＩｇＥの接触の際にマスト細胞および好塩基球の刺激によって引き起こされる即時型過敏性は、強力な哺乳動物免疫エフェクター系である。これらのＩｇＥ媒介性反応は、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、じん麻疹、食物アレルギー、喘息、および最も深刻な症例において、死をもたらし得るアナフィラキシーショックなどの疾患を引き起こし得る。

いかなる理論によっても束縛されることを意図しないが、ＩｇＥがそれによってアレルギー性応答を媒介するメカニズムが決定されてきた。手短に述べると、ＩｇＥは、マスト細胞および好塩基球上の高親和性ＩｇＥレセプターのアルファ鎖、ＦｃεＲＩに結合する。これらの細胞型上のＦｃεＲＩは、１つのα鎖、１つのβ鎖およびホモダイマー性γ鎖からなるテトラマー性である。β鎖およびγ鎖は、ＦｃεＲＩのシグナル伝達ドメインである。マスト細胞に結合したＩｇＥのアレルゲン架橋は、ＦｃεＲＩの刺激、ならびにヒスタミン、ロイコトリエンおよび種々の他のサイトカインなどの気管支収縮物質および血管作用性物質（図１を参照のこと）を含む、一連の範囲の炎症誘発性メディエーターおよびサイトカインの放出をもたらす多数のシグナル伝達経路の活性化を生じる。ＩｇＥおよびＦｃ_εＲＩおよびマスト細胞の役割はアナフィラキシーの動物モデルにおいて確認されてきた：ＩｇＥプラス特異的抗原の全身性送達（または抗ＩｇＥ単独での処置）は、正常なマウスにおいてアナフィラキシー反応を引き起こすが、マスト細胞欠損またはＦｃεＲＩ−欠損マウスにおいては即時型の全身性応答を誘発しない。

現在、アレルゲン誘導性生理学の根底にある免疫学的メカニズムと干渉する、臨床的評価の下にある治療用アプローチ、例えば、ＩｇＥ血清抗体を直接的に標的とし、従って、即時型超過敏反応の中心的なメカニズムを阻害する抗ＩｇＥ免疫グロブリンが存在している。加えて、アレルギー性疾患を治療するその潜在能力に起因して、アレルゲン特異的免疫治療を開発することの関心が存在してきた。しかし、抗ＩｇＥ免疫グロブリンとアレルゲン特異的免疫治療の両方が、永続的または毎期の治療のための高いコストおよび必要性によって制限されている。

新規なクラスの治療剤としてのアプタマーの以前に記載された利点に加えて、アプタマーが核酸であるために、これらは、アトピー性疾患および他の免疫疾患のための治療剤において望ましくかつ有益である免疫刺激効果を有するモチーフを取り込み得る。これらのモチーフには、ＩＩ型Ｔヘルパー（Ｔ_Ｈ２）細胞によって媒介されるアレルギー性応答の抑制のような免疫調節効果を有するＣｐＧモチーフが含まれる。ＣｐＧは、精製されたＢ細胞におけるＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの発現を迅速に誘導することが示されてきた（非特許文献２）。

従って、ＩｇＥが病因に関与する疾患を治療するためにＩｇＥの生物学的機能を破壊するための材料および方法を有することが有益である。本発明は、これらおよび他の必要性に合致する材料および方法を提供する。
Ｔｕｃｋｅｒら，「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．」１９９９年，第７３２巻：２０３−２１２ Ｌｉｕら，「Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎ．」２００３年，Ｖｏｌ．４，ｎｏ．７，ｐ．６８７−６９３

（発明の要旨）
本発明は、アトピー性疾患の治療、予防および／または寛解のための材料および方法を提供する。１つの実施形態において、ＰＥＧ部分に結合体化された以下の配列：

（配列番号２９８）
を含むアプタマーが提供される。ある実施形態において、上記ＰＥＧ部分は、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａおよび２０ｋＤａからなる群より選択される。ある実施形態において、上記ＰＥＧ部分は分枝状であるが、他の実施形態においては、これは直鎖状である。

特定の実施形態において、本発明のアプタマーは、以下に示される構造：

を含み、ここで、

はリンカーを示し、
アプタマー＝

であり、
ここで、それぞれ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、以下に示される構造：

を含み、ここで、

はリンカーを示し、
アプタマー＝

であり、
ここで、それぞれ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、以下に示される構造：

を含み、ここで、

はリンカーを示し、
アプタマー＝

であり、
ここで、それぞれ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、以下に示される構造：

を含み、ここで、

はリンカーを示し、
アプタマー＝

であり、
ここで、それぞれ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、非アルキルリンカーを含む。ある実施形態において、本発明のアプタマーはアルキルリンカーを含む。ある実施形態において、上記アルキルリンカーは２〜１８個の連続するＣＨ_２基、特に２〜１２個の連続するＣＨ_２基、およびより好ましくは３〜６個の連続するＣＨ_２基を含む。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、以下に示される構造：

を含み、
アプタマー＝

であり、
ここで、それぞれ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、以下に示される構造：

を含み、
アプタマー＝

であり、
ここで、それぞれ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、以下に示される構造：

を含み、
アプタマー＝

であり、
ここで、それぞれ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、以下に示される構造：

を含み、
アプタマー＝

であり、
ここで、それぞれ、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩｇＥまたはその改変体の機能を調節、特に阻害する。ある実施形態において、アプタマーは、インビトロでＩｇＥまたはその改変体の機能を阻害する。ある実施形態において、アプタマーは、インビボでＩｇＥまたはその改変体の機能を阻害する。ある実施形態において、本発明のアプタマーは、そのレセプターへのＩｇＥの結合を妨害する。ある実施形態において、本発明のアプタマーまたはその塩を、脊椎動物（好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒト）に投与する工程を包含する、ＩｇＥによって媒介される疾患を治療、予防および／または寛解する方法が提供される。

ある実施形態において、本発明は、上記のアプタマーまたはその塩のいずれかの治療有効量を含む治療組成物を提供する。ある実施形態において、上記治療組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤をさらに含む。

１つの実施形態において、本発明のアプタマーを投与する工程、特に治療組成物を脊椎動物（好ましくは哺乳動物、特にヒト）に投与する工程を包含する、ＩｇＥによって媒介される疾患を治療する方法が提供される。ある実施形態において、治療される疾患はアトピー性疾患である。特定の実施形態において、上記治療される疾患は、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、喘息、急性じん麻疹、食物アレルギー、ピーナッツアレルギー、全身性アナフィラキシー、アレルギー性結膜炎、春季カタル、萎縮性角結膜炎、巨大乳頭性結膜炎、および好酸球性胃腸炎からなる群より選択される。特定の実施形態において、上記治療される疾患は喘息である。

ある実施形態において、本発明の抗ＩｇＥアプタマーは、ＣｐＧモチーフを含む第２のアプタマーなどの免疫刺激性核酸配列とともに、被験体（例えば、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）に投与される。

ある実施形態において、上記アプタマーは、皮下投与、静脈内投与および鼻内投与からなる群より選択される経路を介して被験体に投与される。特定の実施形態において、上記治療組成物は、アトピー性疾患を有するか、そのリスクがあるヒト被験体に皮下投与される。

ある実施形態において、ＩｇＥまたはその改変体を含むことが疑われる組成物と、ＰＥＧ結合体化された本発明のアプタマーを接触させる工程、およびＩｇＥまたはその改変体の存在または非存在を検出する工程を包含する診断方法が提供される。ある実施形態において、インビトロ診断剤としての使用のための本発明のアプタマーが提供される。さらに他の実施形態において、インビボ診断剤としての使用のための本発明のアプタマーが提供される。ある実施形態において、インビボでの疾患の治療、予防および／または寛解における使用のための本発明のアプタマーが提供される。

ある実施形態において、ＩｇＥに特異的に結合するアプタマーは、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、および９８〜１０２からなる群より選択されるいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％同一、特に少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。

ある実施形態において、ＩｇＥに特異的に結合するアプタマーは、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、および５６〜８９からなる群より選択されるいずれか１つの配列の独特な配列領域に対して少なくとも８０％同一、特に少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。

ある実施形態において、ＩｇＥに結合可能であるアプタマーは、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０および５６〜９６の群より選択されるいずれか１つのアプタマー酸配列における３０個の連続するヌクレオチドの配列に対して同一である３０個の連続するヌクレオチドの配列を含む。特定の実施形態において、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２の群より選択されるいずれか１つのアプタマー配列の独特な配列領域における２０個の連続するヌクレオチドの配列に対して同一である２０個の連続するヌクレオチドを含むアプタマーが提供される。さらにより特定の実施形態において、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２からなる群より選択されるいずれか１つのアプタマー配列の独特な配列領域における８個の連続するヌクレオチドの配列に対して同一である８個の連続するヌクレオチドを含むアプタマーが提供される。好ましくは、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２からなる群より選択されるアプタマー配列の独特な配列に対して同一である８個の連続するヌクレオチドを含むアプタマーは、ＩｇＥ、好ましくはヒトＩｇＥに特異的に結合し、ある実施形態においては、ＩｇＥ、好ましくはヒトＩｇＥの機能を調節する。ある実施形態において、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２、１１９〜１２４、１２６〜１３６、１３９〜１５７、１５８〜１７６、１７８〜１９０、１９４〜２０１、２０６〜２４３、２４７、２４９〜２５９、２６１〜２６７、２６９〜２９０および２９２からなる群より選択されるアプタマーが提供される。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、一本鎖核酸である。ある実施形態において、本発明のアプタマーは、高分子量の、非免疫原性化合物または親油性化合物に結合体化されている。ある実施形態において、本発明のアプタマーは、ポリアルキレングリコール部分、特にポリエチレングリコール部分に結合体化されている。ある実施形態において、上記ポリエチレングリコール部分は分枝状であるが、他の実施形態においてはこれは直鎖状である。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、糖の位置における化学置換；リン酸の位置における化学置換；核酸の塩基の位置における化学置換；逆位ヌクレオチドを伴う３’キャッピング；および逆位ヌクレオチドを伴う５’キャッピングからなる群より選択される化学修飾を含む。ある実施形態において、本発明のアプタマーは、ＣｐＧモチーフのような免疫刺激性核酸配列をさらに含む。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩｇＥまたはその改変体の機能を調節、特に阻害する。ある実施形態において、上記アプタマーは、インビトロでＩｇＥまたはその改変体の機能を阻害する。ある実施形態において、上記アプタマーは、インビボでＩｇＥまたはその改変体の機能を阻害する。ある実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩｇＥのそのレセプターへの結合を妨害する。ある実施形態において、本発明のアプタマーまたはその塩を、脊椎動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）に投与する工程を包含する、ＩｇＥによって媒介される疾患を治療、予防、および／または寛解する方法が提供される。

ある実施形態において、本発明のアプタマーまたはその塩、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤の治療有効量を含む治療組成物が提供される。ある実施形態において、本発明のアプタマー、好ましくは本発明の治療組成物を、脊椎動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）に投与する工程を包含する、ＩｇＥによって媒介される疾患を治療、予防、および／または寛解する方法が提供される。

本発明のある実施形態において、上記治療される疾患は、アトピー性疾患、特に、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、喘息、急性じん麻疹、食物アレルギー、ピーナッツアレルギー、全身性アナフィラキシー、アレルギー性結膜炎、春季カタル、萎縮性角結膜炎、巨大乳頭性結膜炎、および好酸球性胃腸炎からなる群より選択される疾患である。

ある実施形態において、本発明の抗ＩｇＥアプタマーは、ＣｐＧモチーフを含む第２のアプタマーなどの免疫刺激性核酸配列とともに、被験体（例えば、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）に投与される。ある実施形態において、上記免疫刺激性核酸配列は、本発明の抗ＩｇＥアプタマーに取り込まれるか、または付加される。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、皮下投与、静脈内投与および鼻内投与からなる群より選択される経路によって被験体に投与される。

ある実施形態において、ＩｇＥまたはその改変体を含むことが疑われる組成物と、本発明のアプタマーを接触させる工程、およびＩｇＥまたはその改変体の存在または非存在を検出する工程を包含する診断方法が提供される。ある実施形態において、インビトロ診断剤としての使用のための本発明のアプタマーが提供される。さらに他の実施形態において、インビボ診断剤としての使用のための本発明のアプタマーが提供される。ある実施形態において、インビボでの疾患の治療、予防および／または寛解における使用のための本発明のアプタマーが提供される。

本発明の別の態様において、標的へのアプタマーの結合親和性を増加させるための方法が提供され、ここで、アプタマーは、マルチマー凝集物を形成可能である。１つの実施形態において、上記方法は、凝集物の形成を妨害するように選択されたヌクレオチドで、凝集物を形成するアプタマー中のヌクレオチドを置換する工程を包含し、それによって、得られる置換されたアプタマーのその標的に対する結合親和性が親のアプタマーと比較して増加し、この親のアプタマーは、同じ核酸配列を有するが、ヌクレオチド置換を欠いている。ある実施形態において、凝集物形成を妨害するように選択されたヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。ある実施形態において、上記修飾ヌクレオチドはイノシンである。

本発明の別の態様において、標的に対するアプタマーの結合親和性を増加させるための方法が提供され、上記方法は、同じ標的に対する親のアプタマーの結合親和性と比較して、イノシン置換されたアプタマーの結合親和性を増加させる位置において少なくとも１つのヌクレオチドの代わりにイノシンで置換し、親のアプタマーは、同じヌクレオチド配列を有するがイノシン修飾を欠く、工程を包含する。提供される方法の１つの実施形態において、置換工程は、それぞれ４つ、３つまたは２つのヌクレオチドの代わりに、わずか４つ、３つまたは２つのイノシンで置換する工程を包含し、ここで、得られるアプタマーは、親のアプタマーの結合親和性と比較して、標的に対する結合親和性の増加を含む。ある実施形態において、イノシン置換ヌクレオチドはプリンである。特定の実施形態において、イノシン置換プリンはグアノシンである。別の実施形態において、本発明の方法は、糖の位置における化学置換；リン酸の位置における化学置換および核酸の塩基の位置における化学置換からなる群より選択される第２の化学修飾を含む。特定の実施形態において、さらに置換されたアプタマーは、第２の化学置換を欠く以外はさらに置換されたアプタマーと同一であるアプタマーと比較して、標的に対する結合親和性の増加を含む。

ある実施形態において、置換工程は、所望の置換を有するアプタマーを化学合成する工程を包含する。

ある実施形態において、イノシン置換されたアプタマーの標的に対する結合親和性は、親のアプタマーと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８５倍、少なくとも９５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍増加する。ある実施形態において、置換工程は、アプタマーを化学合成する工程を包含する。

本発明の１つの態様において、本発明の置換方法によって得られるその標的についての結合親和性の増加を有するアプタマーが提供される。特定の実施形態において、上記アプタマーは、ＩｇＥ、特にヒトＩｇＥについての結合親和性の増加を含む。

（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の付随する説明に示される。本明細書に記載されるものに対して類似のまたは等価な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料がここで説明される。本発明の他の特徴、対象物、および利点もまた、この説明から明らかである。本明細書において、単数形は、文脈が明確に他を指示していない限り、複数形を含む。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書が優先する。

（ＳＥＬＥＸ（商標）法）
アプタマーを生成するための適切な方法は、図２におけるリボ核酸選択のために一般的に示される「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」（「ＳＥＬＥＸ（商標）」）という表題のプロセスを用いてである（デオキシリボ核酸プールを使用する選択については、図２において記載される逆転写および転写の工程が省略される）。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、標的分子への高度に特異的な結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、例えば、１９９０年６月１１日に出願され、現在は放棄されている米国特許出願番号第０７／５３６，４２８号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４７５，０９６号、および「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ ９１／１９８１３号もまた参照のこと）に記載されている。各々のＳＥＬＥＸ（商標）で同定された核酸リガンド、すなわち、それぞれのアプタマーは、所定の標的化合物または分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、核酸が、種々の二次元構造および三次元構造を形成する十分な能力を有し、ならびにモノマー性であるかまたはポリマー性であるかに関わらず、実質的に任意の化学化合物とのリガンドとして作用する（すなわち、特異的結合対を形成する）ためにそれらのモノマー内に利用可能である十分な化学的多用途性を有するという独特な洞察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が標的として働き得る。

ＳＥＬＥＸ（商標）は、ランダム化配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに、出発点として依存する。このオリゴヌクレオチドは、修飾されたか、または修飾されていないＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。ある例において、このプールは、１００％ランダムであるか、または部分的にランダムであるオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、このプールは、ランダム化配列中に取り込まれた少なくとも１つの固定配列および／または保存配列を含む、ランダムまたは部分ランダムオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、このプールは、オリゴヌクレオチドプールのすべての分子によって共有される配列を含み得る、その５’および／または３’末端において少なくとも１つの固定配列および／または保存配列を含む、ランダムまたは部分ランダムオリゴヌクレオチドを含む。固定配列は、あらかじめ選択された目的のために取り込まれた、プール中のオリゴヌクレオチドに一般的である配列、例えば、以下にさらに説明されるＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７およびＳＰ６）、制限部位、またはホモポリマー性配列、例えば、ポリＡもしくはポリＴトラクト、触媒コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位、ならびに目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／もしくは配列決定を容易にするための他の配列である。保存配列は、同じ標的に結合する多数のアプタマーによって共有される、以前に記載された固定配列以外の配列である。

プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、効率的な増幅のために必要である固定配列と同様に、ランダム化配列部分を含む。代表的には、開始プールのオリゴヌクレオチドは、３０〜５０個のランダムヌクレオチドの内部流域に隣接する固定された５’および３’末端配列を含む。このランダムヌクレオチドは、化学合成およびランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含む多数の方法で産生され得る。試験核酸における配列のバリエーションもまた、選択／増幅反復の前またはその間に、変異誘発によって導入または増加され得る。

オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は任意の長さであり得、ならびにリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得、ならびに修飾されたヌクレオチドまたは非天然のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；同第５，６６０，９８５号；同第５，９５８，６９１号；同第５，６９８，６８７号；同第５，８１７，６３５号；同第５，６７２，６９５号およびＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０７０６５号を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野において周知である固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、ホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成され得る。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法のような液相法を使用して合成され得る。例えば、Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照のこと。自動ＤＮＡ合成装置上で実行される代表的な合成は、１０^１４〜１０^１６の個々の分子を生じ、これは、大部分のＳＥＬＥＸ（商標）実験のために十分な数である。配列設計におけるランダム配列の十分に大きな領域は、各合成された分子が独特な配列を表しそうな可能性を増加する。

オリゴヌクレオチドの開始ライブラリーは、ＤＮＡ合成装置上での自動化学合成によって生成され得る。ランダム配列を合成するために、４種すべてのヌクレオチドの混合物が、合成プロセスの間の各ヌクレオチド付加工程で加えられ、ヌクレオチドのランダムな取り込みを可能にする。上記に言及したように、１つの実施形態においてランダムオリゴヌクレオチドは、完全にランダムな配列を含むが、しかし、他の実施形態においては、ランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでないか、または部分的にランダムである配列のストレッチを含み得る。部分的にランダムである配列は、各付加工程において、異なるモル比の４種のヌクレオチドを加えることによって作製され得る。

オリゴヌクレオチドの開始ライブラリーは、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであり得る。ＲＮＡライブラリーが開始ライブラリーとして使用される例において、これは、代表的には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたは修飾Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＤＮＡライブラリーを転写することによって生成され、そして精製される。次いで、ＲＮＡまたはＤＮＡライブラリーは、結合のために好ましい条件下で標的と混合され、同じ一般的選択スキームを使用して、結合、分配および増幅の段階的反復に供せられ、結合親和性および選択性の実質的に任意の所望の判断基準を達成する。より詳細には、核酸の開始プールを含む混合物を用いて開始して、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、以下の工程を含む：（ａ）結合のために好ましい条件下で混合物を標的と接触させる工程；（ｂ）標的分子に特異的に結合した核酸から未結合の核酸を分配する工程；（ｃ）核酸−標的複合体を解離させる工程；（ｄ）核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を生じる工程；ならびに（ｅ）所望される回数のサイクルを通しての結合、分配、解離および増幅の工程を再反復して、標的分子に対して高度に特異的な、高度に親和性の核酸リガンドを生じる工程。ＲＮＡアプタマーが選択される場合において、ＳＥＬＥＸ（商標）法は以下の工程をさらに含む：（ｉ）工程（ｄ）における増幅の前に核酸−標的複合体から解離した核酸を逆転写する工程；ならびに（ｉｉ）プロセスを再開する前に工程（ｄ）からの増幅した核酸を転写する工程。

多数の可能な配列および構造を含む核酸混合物の中で、所定の標的についての広範な結合親和性が存在する。例えば、２０個のヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は、４^２０の候補の可能性を有し得る。標的についてより高い親和性定数を有するものは、標的に対して最も結合する可能性が高い。分配、解離および増幅後、第２の核酸混合物が生成され、より高い結合親和性候補について富化される。得られる核酸混合物が１つまたは数個の配列から優先的に構成されるまで、さらなるラウンドの選択が、最良のリガンドを選択的に支持する。次いで、これらはクローニングされ、配列決定され、および純粋なリガンドまたはアプタマーとして結合親和性について個々に試験され得る。

選択および増幅のサイクルは、所望の目的が達成されるまで反復される。最も一般的な場合において、選択／増幅は、結合強度の有意な改善がサイクルの反復において達成されるまで継続される。この方法は、代表的には、およそ１０^１４の異なる核酸種をサンプリングするために使用されるが、約１０^１８の異なる核酸種と同じ多さをサンプリングするために使用されてもよい。一般的に、核酸アプタマー分子は、５〜２０サイクル手順において選択される。１つの実施形態において、異質性が、初期の選択段階においてのみ導入され、複製プロセス全体を通しては起こらない。

ＳＥＬＥＸ（商標）の１つの実施形態において、選択プロセスは、選択された標的に最も強力に結合する核酸リガンドを単離する際に効率的であるので、選択および増幅の１サイクルのみが必要である。このような効率的な選択は、例えば、クロマトグラフィー型のプロセスにおいて起こり得、ここで、カラム上に結合した標的に付随する核酸の能力は、カラムが最高の親和性の核酸リガンドの分離および単離を可能にするために十分であるような様式で作動する。

多くの場合において、単一の核酸リガンドが同定されるまで、ＳＥＬＥＸ（商標）の反復工程を実行することは必ずしも必要ではない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多数の保存配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意な影響を与えることなく置換または付加され得る多数の配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。完了の前にＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを終了することによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能である。

種々の核酸の一次構造、二次構造、および三次構造が存在することが公知である。非ワトソン−クリック型相互作用に関与することが最も一般的に示されてきた構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称バルジ（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｂｕｌｇｅ）、シュードノットならびにそれらの種々の組み合わせと呼ばれる。ほとんどすべての既知のこのようなモチーフの場合が、これらは３０ヌクレオチドを超えない核酸配列中で形成され得ることを示唆する。この理由のために、連続するランダム化セグメント用いるＳＥＬＥＸ（商標）手順が、約２０から約５０ヌクレオチド、およびある実施形態においては、約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間のランダム化セグメントを含む核酸配列を用いて開始されることがしばしば好ましい。１つの例において、５’固定：ランダム：３’固定配列は、約３０〜約５０ヌクレオチドのランダム配列を含む。

コアＳＥＬＥＸ（商標）法は、多数の特異的対象物を達成するように改変されてきた。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、ベント（ｂｅｎｔ）ＤＮＡのような特異的な構造の特徴を有する核酸分子を選択するために、ゲル電気泳動と併せたＳＥＬＥＸ（商標）の使用を記載している。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子を結合および／または光架橋および／または光不活性化することが可能である光反応性基を含む核酸リガンドを選択するための、ＳＥＬＥＸ（商標）に基づく方法を記載している。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許第５，８６１，２５４号は、標的分子についての高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの間の高い効率の分配を達成する、ＳＥＬＥＸ（商標）に基づく方法を記載している。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスが実行された後で改善された核酸リガンドを入手するための方法を記載している。米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドをその標的に共有結合するための方法を記載している。

ＳＥＬＥＸ（商標）はまた、標的分子上の１つより多くの部位に結合する核酸リガンドを入手するため、および標的上の特異的部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを入手するために使用され得る。ＳＥＬＥＸ（商標）は、核酸結合タンパク質およびそれらの生物学的機能の一部として核酸を結合することが知られていないタンパク質、ならびにコファクターおよび他の小分子のような大分子および小分子の生体分子を含む、任意の想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。例えば、米国特許第５，５８０，７３７号は、カフェインおよび密接に関連するアナログ、テオフィリンに対して高い親和性で結合することが可能である、ＳＥＬＥＸ（商標）を通して同定された核酸配列を開示する。

カウンターＳＥＬＥＸ（商標）は、１つ以上の非標的分子に対して交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善するための方法である。カウンターＳＥＬＥＸ（商標）は以下の工程から構成される：（ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；（ｂ）候補混合物を標的と接触させる工程、ここで、候補混合物と比較して標的に対して親和性の増加を有する核酸は、候補混合物の残りから分配されてもよい；（ｃ）候補混合物の残りから親和性の増加した核酸を分配する工程；（ｄ）親和性の増加した核酸を標的から解離させる工程；（ｅ）非標的分子について特異的親和性を有する核酸リガンドが除去されるように、親和性の増加した核酸を１つ以上の非標的分子と接触させる工程；および（ｆ）標的分子に対してのみ特異的親和性を有する核酸分子を増幅して、標的分子に対する結合のために比較的より高い親和性および特異性を有する核酸配列について富化された核酸の混合物を生じる工程。ＳＥＬＥＸ（商標）について上記に説明されるように、選択および増幅のサイクルは、所望の目的が達成されるまで必要に応じて反復される。

治療剤およびワクチンとしての核酸の使用において遭遇する１つの潜在的な問題は、それらのホスホジエステル型のオリゴヌクレオチドが、所望の効果が明らかになる前に、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの細胞内および細胞外酵素によって、体液中で迅速に分解される得ることである。従って、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、改善されたインビボ安定性または改善された送達特性のような改善された特性をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置における化学置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ（商標）で同定された核酸リガンドは、例えば、リボースの２’位、ピリミジンの５位、およびプリンの８位において化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，６６０，９８５号、種々の２’−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，７５６，７０３号、ならびに２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載する米国特許第５，５８０，７３７号に記載されている。

本発明において意図される核酸リガンドの修飾には、核酸リガンド塩基または全体としての核酸リガンドに、さらなる電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電的相互作用、および流動性を組み込む他の化学基を提供するものが含まれるがこれらに限定されない。ヌクレアーゼに対して抵抗性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するための修飾にはまた、１つ以上の置換ヌクレオチド間連結、糖の変化、塩基の変化、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。このような修飾には、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモウラシルまたは５−ヨードウラシルの置換；バックボーン修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルリン酸修飾、メチル化、およびイソ塩基、イソシチジンおよびイソグアノシンなどの通常でない塩基対の組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。修飾にはまた、キャッピングなどの３’および５’の修飾が含まれ得る。

１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）によって置換され、ここで、各ＲまたはＲ’が独立してＨまたは置換されたかもしくは置換されていないアルキルであるオリゴヌクレオチドが提供される。連結基は、−Ｏ−、−Ｎ−、または−Ｓ−連結を通して隣接するヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチドにおけるすべての連結が同一である必要はない。

さらなる実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、例えば、１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置き換えられるか、またはエーテルもしくはアミンとして官能基化されている修飾糖基を含む。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル基、Ｏ−アルキル基、Ｏ−アリル基、Ｓ−アルキル基、Ｓ−アリル基、またはハロ基のいずれかによって置換される。２’−修飾糖の合成の方法は、例えば、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載されている。他の修飾は当業者に公知である。このような修飾は、ＳＥＬＥＸ（商標）前プロセス修飾またはＳＥＬＥＸ（商標）後プロセス修飾（以前に同定された未修飾リガンドの修飾）であり得るか、またはＳＥＬＥＸ（商標）プロセスへの組み込みによって作製され得る。

ＳＥＬＥＸ（商標）前プロセス修飾またはＳＥＬＥＸ（商標）プロセスへの組み込みによって作製される修飾は、それらのＳＥＬＥＸ（商標）標的についての特異性と、改善された安定性、例えば、インビボ安定性の両方を有する核酸リガンドを産生する。核酸リガンドに対して作製されるＳＥＬＥＸ（商標）後プロセス修飾は、核酸リガンドの結合能力に有害な影響を与えることなく、改善された安定性、例えば、インビボ安定性を生じ得る。

ＳＥＬＥＸ（商標）法は、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能的単位と組み合わせる工程を包含する。ＳＥＬＥＸ（商標）法はさらに、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、米国特許第６，０５１，６９８号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ ９８／１８４８０号において記載されるように、選択された核酸リガンドを、診断剤または治療剤複合体中の親油性または非免疫原性高分子量化合物と組み合わせる工程を包含する。これらの特許および出願は、広範な形状のアレイおよび他の特性の、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製の特性、ならびに他の分子の所望の特性との組み合わせを教示している。

ＳＥＬＥＸ（商標）法を介して、小さな、柔軟性のあるペプチドに対する核酸リガンドの同定もまた、探索されている。小さなペプチドは柔軟性のある構造を有し、通常、溶液中では複数の配座異性体の平衡状態で存在し、従って、結合親和性は、柔軟性のあるペプチドを結合する際に失われたコンホメーションのエントロピーによって制限され得る。しかし、溶液中での小さなペプチドに対する核酸リガンドを同定することの実行可能性は、米国特許第５，６４８，２１４号において実証された。この特許において、１１アミノ酸ペプチドであるサブスタンスＰに対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが同定された。

本発明の標的に対して特異性および結合親和性を有するアプタマーは、代表的には、本明細書に記載されるようなＳＥＬＥＸ（商標）プロセスによって選択される。次いで、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの一部として、標的に結合することが選択される配列は、所望の結合親和性を有する最小配列を決定するために任意に最小化される。この選択された配列および／または最小化された配列は、結合親和性を増加させるために、または代替的には、配列中のどの位置が結合活性のために必須であるかを決定するために、配列のランダム変異誘発または部位特異的変異誘発を実行することによって任意に修飾される。加えて、選択は、インビボでの分解に対してアプタマー分子を安定化するために、修飾ヌクレオチドを取り込む配列を用いて実行され得る。

（２’修飾ＳＥＬＥＸ（商標））
治療剤としての使用のためにアプタマーが適切であるために、アプタマーは、好ましくは、安価に合成され、安全であり、かつインビボで安定である。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは、代表的には、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感受性のためにインビボで安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、２’位において基の修飾を組み込むことの組み込みによって非常に増加され得る。

フルオロ基およびアミノ基は、アプタマーがそこから引き続いて選択されるオリゴヌクレオチドプールに首尾よく組み込まれている。しかし、これらの修飾は、得られるアプタマーの合成のコストを非常に増大させ、ある場合においては、修飾ヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの分解およびＤＮＡ合成のための基質としてのヌクレオチドの引き続く使用によって、宿主ＤＮＡによってリサイクルされ得る可能性のために、安全性の関心を持ち込み得る。

本発明で提供されるような、２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含むアプタマーは、これらの多くの欠点を克服する。２’−ＯＭｅヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性であり、合成することが高価ではない。２’−ＯＭｅヌクレオチドは生物学的系において遍在しており、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下で２’−ＯＭｅ ＮＴＰを基質として受容せず、従って、宿主ＤＮＡへの２’−ＯＭｅヌクレオチドのリサイクルに対する安全性の懸念は存在しない。２’−修飾アプタマーを生成するために使用されるＳＥＬＥＸ（商標）法は、例えば、２００２年１２月３日に出願された米国仮特許出願シリアル番号第６０／４３０，７６１号、２００３年７月１５日に出願された米国仮特許出願シリアル番号第６０／４８７，４７４号、２００３年１１月４日に出願された米国仮特許出願シリアル番号第６０／５１７，０３９号、２００３年１２月３日に出願された米国仮特許出願シリアル番号第１０／７２９，５８１号、および「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」という表題の２００４年６月２１日に出願された米国特許出願第１０／８７３，８５６号において記載されており、これらはその全体が本明細書において参考として援用される。

本発明は、熱および物理的な分解と同様に酵素的および化学的な分解に対して未修飾オリゴヌクレオチドよりも安定であるオリゴヌクレオチドを作製するために、修飾ヌクレオチド（例えば、２’位に修飾を有するヌクレオチド）を含む、ＩｇＥに結合しかつその機能を調節するアプタマーを含む。文献中には２’−ＯＭｅ含有アプタマーのいくつかの例が存在するが（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，６８３−６９５，１９９５を参照のこと）、これらは、Ｃ残基およびＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換され、Ａ残基およびＧ残基が２’−ＯＨであった修飾転写物のライブラリーのインビトロ選択によって生成された。一旦機能的配列が同定されると、次いで各Ａ残基およびＧ残基が２’−ＯＭｅ置換に対する耐容性について試験され、２’−ＯＭｅ残基として２’−ＯＭｅ置換に耐容性であったすべてのＡ残基およびＧ残基を有するアプタマーが再合成された。この２段階様式において生成されたアプタマーのＡ残基およびＧ残基の大部分は、２’−ＯＭｅ残基を有する置換に耐容性であるが、平均して、およそ２０％がそうではない。結果として、この方法を使用して生成されたアプタマーは、２〜４個の２’−ＯＨ残基を含む傾向があり、安定性および合成のコストは、結果として損なわれる。アプタマーがそこから選択され、そしてＳＥＬＥＸ（商標）（ならびに／またはそのバリエーションおよび改善、本明細書に記載されるものを含む）によって富化されるオリゴヌクレオチドプールにおいて使用される安定化されたオリゴヌクレオチドを生成する転写反応に、修飾したヌクレオチドを取り込むことによって、本発明の方法は、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化する必要性を除外する（例えば、修飾ヌクレオチドを用いてアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することによって）。

１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、および２’−ＯＭｅ修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ_２、および２’−メトキシエチル修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ_２、および２’−メトキシエチル修飾の５^６の組み合わせを含むアプタマーを提供する。

本発明の２’修飾アプタマーは、修飾ポリメラーゼ、例えば、野生型ポリメラーゼよりも高い、フラノース２’位においてかさ高い置換基を有する修飾ヌクレオチドの取り込みの割合を有する、修飾Ｔ７ポリメラーゼを使用して作製される。例えば、６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化した変異型Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は、基質として２’デオキシ、２’アミノ−、および２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を容易に利用し、種々の適用のために広く使用されて修飾ＲＮＡを合成してきた。しかし、この変異型Ｔ７ポリメラーゼは、報告によれば、２’−ＯＭｅまたは２’−アジド（２’−Ｎ_３）置換基などのかさ高い２’−置換基を有するＮＴＰを容易には利用する（すなわち、取り込む）ことができない。かさ高い２’置換基の取り込みのために、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化したＴ７ポリメラーゼ変異型（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が記載されており、修飾ピリミジンＮＴＰを取り込むための限られた状況で使用されてきた。Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．およびＳｏｕｓａ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００２，３０（２４）：１３８を参照のこと。７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化した変異型Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載されている。Ｐａｄｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４ＡとＨ７８４Ａの両方の変異型Ｔ７ポリメラーゼにおいて、アラニンなどのより小さなアミノ酸残基への変化は、よりかさ高いヌクレオチド基質、例えば、２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの取り込みを可能にする。

一般的に、本明細書に開示される条件下で、Ｙ６９３Ｆ変異型が、ＧＴＰ以外のすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの取り込みのために使用され得、そしてＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異型がＧＴＰを含むすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの取り込みのために使用され得ることが見い出されてきた。Ｈ７８４Ａ変異型は、本明細書に開示される条件下で使用された場合に、Ｙ６３９ＦおよびＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異型と類似した特性を保有することが予測される。

２’−修飾オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドから完全に合成され得るか、または修飾ヌクレオチドのサブセットとともに合成され得る。修飾は、同じであっても異なっていてもよい。すべてのヌクレオチドは修飾され得、すべてが同じ修飾を含み得る。すべてのヌクレオチドは修飾され得るが、異なる修飾を含み、例えば、同じ塩基を含むすべてのヌクレオチドが１つの型の修飾を有し得るのに対して、他の塩基を含むヌクレオチドは、異なる型の修飾を有し得る。すべてのプリンヌクレオチドが１つの型の修飾を有し得（または修飾されない）のに対して、すべてのピリミジンヌクレオチドは、別の異なる型の修飾を有する（または修飾されない）。このようにして、転写物または転写物のプールは、例えば、リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆ、および２’−ＯＭｅヌクレオチドを含む修飾の任意の組み合わせを使用して生成される。２’−ＯＭｅ Ｃおよび２’−ＯＭｅ Ｕならびに２’−ＯＨ Ａおよび２’−ＯＨ Ｇを含む転写混合物は「ｒＲｍＹ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｒＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡおよびデオキシＧならびに２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ｃを含む転写混合物は「ｄＲｍＹ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｄＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｃ、および２’−ＯＭｅ Ｕ、ならびに２’−ＯＨ Ｇを含む転写混合物は「ｒＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｒＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ｇならびに２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ｃならびに２’−Ｆ Ｇを交互に含む転写混合物は、「交互混合物」と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「交互混合物」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｕ、２’−ＯＭｅ Ｃ、および２’−ＯＭｅ Ｇを含む転写混合物は、Ｇの１０％までがリボヌクレオチドである場合には、「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｒ／ｍＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ｃ、ならびに２’−Ｆ Ｇを含む転写混合物は「ｆＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｆＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、２’−ＯＭｅ Ｕ、および２’−ＯＭｅ Ｃ、ならびにデオキシＧを含む転写混合物は「ｄＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｄＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡ、ならびに２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇおよび２’−ＯＭｅ Ｕを含む転写混合物は「ｄＡｍＢ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｄＡｍＢ」アプタマーと呼ばれ、そしてすべての２’−ＯＨヌクレオチドを含む転写混合物は、「ｒＮ」混合物と呼ばれ、そこから選択されたアプタマーは「ｒＮ」または「ｒＲｒＹ」アプタマーと呼ばれる。「ｍＲｍＹ」アプタマーは、すべての２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むものであり、可能な場合、任意の２’−ＯＨ Ｇの、２’−ＯＭｅ ＧでのＳＥＬＥＸ（商標）後置き換えによってｒ／ｍＧｍＨオリゴヌクレオチドから通常誘導される。

好ましい実施形態は、２’−ＯＨ、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。より好ましい実施形態は、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。さらにより好ましい実施形態は、ピリミジンが２’−ＯＭｅ（例えば、ｄＲｍＹ、ｍＲｍＹまたはｄＧｍＨ）である、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせである。

本発明のアプタマーへの修飾ヌクレオチドの取り込みは、選択プロセスの以前（前）に達成される（例えば、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾）。選択的に、修飾ヌクレオチドがＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾によって取り込まれた本発明のアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス後修飾（すなわち、ＳＥＬＥＸ（商標）前修飾の後のＳＥＬＥＸ（商標）プロセス後修飾）によってさらに修飾され得る。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾は、ＳＥＬＥＸ（商標）標的についての特異性を有する修飾核酸リガンドを生じ、またインビボ安定性を改善した。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス後修飾、すなわち、修飾（例えば、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾によって組み込まれたヌクレオチドを有する以前に同定されたリガンドの短縮、欠失、置換、またはさらなるヌクレオチド修飾）は、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセス前修飾によって取り込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に有害な影響を与えることなく、インビボ安定性のさらなる改善を生じ得る。

ポリメラーゼが２’−修飾ＮＴＰを受け取る条件で２’−修飾（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物のプールを生成するために、好ましいポリメラーゼはＹ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異型またはＹ６９３Ｆ変異型である。他のポリメラーゼ、特に、かさ高い２’−置換基について高い耐容性を示すものもまた、本発明において使用され得る。このようなポリメラーゼは、本明細書に開示される転写条件下で修飾ヌクレオチドを取り込むそれらの能力をアッセイすることによって、この能力についてスクリーニングされ得る。

多数の要因が、本明細書に開示される方法において有用である転写条件のために重要であることが決定されてきた。例えば、修飾された転写物の収率の増加は、リーダー配列がＤＮＡ転写鋳型の５’末端における固定化配列の５’末端に取り込まれた場合に、得られる転写物の少なくともほぼ最初の６残基がすべてプリンであるように観察される。

修飾ヌクレオチドを取り込んでいる転写物を得る際の別の重要な要因は、２’−ＯＨ ＧＴＰの存在または濃度である。転写は２つの相に分けられ得る：第１の相は開始であり、その間、ＮＴＰがＧＴＰ（または別の置換グアノシン）の３’−ヒドロキシル末端に加えられ、次には約１０〜１２ヌクレオチド伸長されるジヌクレオチドを生じる；第２の相は伸長であり、その間、転写は、最初の約１０〜１２ヌクレオチドの付加の向こうに進行する。過剰の２’−ＯＭｅ ＧＴＰを含む転写混合物に加えられた少量の２’−ＯＨ ＧＴＰは、ポリメラーゼが２’−ＯＨ ＧＴＰを使用する転写を開始することを可能にするために十分であるが、一旦転写が伸長相に入ると、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨ ＧＴＰの間の区別の減少、および２’−ＯＨ ＧＴＰを超えた過剰の２’−ＯＭｅ ＧＴＰは、２’−ＯＭｅ ＧＴＰの優先的な取り込みを可能にすることが見い出されてきた。

２’−ＯＭｅ置換されたヌクレオチドの転写物への取り込みにおける別の重要な要因は、転写混合物中の二価マグネシウムとマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの濃度の異なる組み合わせが、２’−Ｏ−メチル化転写物の収率に影響を与えることが見い出されており、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンと錯体を形成するＮＴＰの転写反応混合物の濃度に依存する。最大限の２’置換Ｏ−メチル化転写物の最高の収率を得るために（すなわち、すべてのＡ、Ｃ、およびＵならびに約９０％のＧヌクレオチド）、およそ５ｍＭの塩化マグネシウムおよび１．５ｍＭの塩化マンガンの濃度が、各ＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在するときに好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、およそ６．５ｍＭの塩化マグネシウムおよび２．０ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、およそ９．６ｍＭの塩化マグネシウムおよび２．９ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合においても、これらの濃度から出発して２倍までが、修飾転写物の顕著な量をなお与える。

ＧＭＰまたはグアノシンを用いて転写を開始することもまた重要である。この効果は、開始ヌクレオチドについてのポリメラーゼの特異性から生じる。結果として、この様式で生成された任意の転写物の５’−末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ Ｇである可能性がある。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、なおより好ましくは１ｍＭである。転写反応にＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を含めることは、修飾ヌクレオチドの取り込みを最大化するために有用であることもまた見い出されている。

転写物への２’−ＯＭｅ ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）およびＧＴＰ（〜９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の最大の取り込みのために以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２ １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は２．０ｍＭ）、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨ ＧＴＰ ３０μＭ、２’−ＯＨ ＧＭＰ ５００μＭ、ｐＨ ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてのプリンのリーダー配列。本明細書に記載されるように、１単位のＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（また本明細書で特定される任意の他のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）は、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で１ｎモルの２’−ＯＭｅ ＮＴＰが転写物に取り込まれるために必要である酵素の量として定義される。本明細書に記載されるように、１単位の無機ピロホスファターゼは、ｐＨ ７．２および２５℃で１分間あたり１．０モルの無機オルトリン酸を遊離させる酵素の量として定義される。

転写物への２’−ＯＭｅ ＡＴＰ、２’−ＯＭｅ ＵＴＰおよび２’−ＯＭｅ ＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大の取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２ １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ ７．５、Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてのプリンのリーダー配列。

転写物への２’−ＯＭｅ ＵＴＰおよび２’−ＯＭｅ ＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大の取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２ １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてのプリンのリーダー配列。

転写物へのデオキシＡＴＰおよびＧＴＰならびに２’−ＯＭｅ ＵＴＰおよび２’−ＯＭｅ ＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の最大の取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミン ２ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ ７．５、Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてのプリンのリーダー配列。

転写物への２’−ＯＭｅ ＡＴＰ、２’−ＯＭｅ ＵＴＰ、および２’−ＯＭｅ ＣＴＰならびに２’−Ｆ ＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の最大の取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ ７．５、Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてのプリンのリーダー配列。

転写物へのデオキシＡＴＰならびに２’−ＯＭｅ ＵＴＰ、２’−ＯＭｅ ＧＴＰおよび２’−ＯＭｅ ＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の最大の取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ ７．５、Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ １５単位／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてのプリンのリーダー配列。

上記の各々について、（ａ）転写は、好ましくは、約２０℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜４５℃、および最も好ましくは約３７℃の温度で、少なくとも２時間の時間実行され、ならびに（ｂ）５０〜３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ転写鋳型が使用される（２００ｎＭ鋳型がラウンド１においては多様性を増加させるために使用され（３００ｎＭ鋳型がｄＲｍＹ転写においては使用される）、引き続くラウンドについては最適化ＰＣＲ反応の１／１０希釈である約５０ｎＭが、本明細書に記載される条件を使用して、使用される）。好ましいＤＮＡ転写鋳型は以下に記載される（ＡＲＣ２５４およびＡＲＣ２５６がすべての２’−ＯＭｅ条件下で転写し、ならびにＡＲＣ２５５がｒＲｍＹ条件下で転写する場合）。

本発明のｒＮ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−ＯＨウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を使用して産生される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジン、および２’−ＯＨウリジンを含む。ｒＮ転写の好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写のより好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。

本発明のｒＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を使用して産生される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。

本発明のｄＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−デオキシグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＲｍＹ転写条件を使用して産生される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。

本発明のｒＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸を含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を使用して産生される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、および２’−Ｏ−メチルアデノシンを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、およびすべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、およびすべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、およびすべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。

本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、および２’−ＯＨグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を使用して産生される得られる修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを含み、ここで、グアノシンヌクレオチドの集団は最大で約１０％の２’−ＯＨグアノシンを有する。好ましい実施形態において、得られる本発明のｒ／ｍＧｍＨ修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、およびすべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、およびすべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、およびすべてのグアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。

本発明のｆＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｆグアノシン三リン酸を含む。本発明のｆＧｍＨ転写条件を使用して産生される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｆグアノシンを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、およびすべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆ−グアノシンである配列を含む。

本発明のｄＡｍＢ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を使用して産生される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、およびすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。

各々の場合において、次いで、転写生成物は、アプタマーを同定するため、および／または所定の標的に対して結合特異性を有する配列の保存モチーフを決定するために、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスにおけるライブラリーとして使用され得る。得られる配列は既に部分的に安定化されており、修飾アプタマー配列に到達するためのプロセスからこの工程を排除し、そしてより高度に安定化されたアプタマーを結果として与える。２’−ＯＭｅ ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの別の利点は、得られる配列が、配列中に必要とされる２’−ＯＨヌクレオチドをほとんど有さない、おそらく全く有さないらしいことである。２’ＯＨヌクレオチドが残っている程度まで、これらは、ＳＥＬＥＸ（商標）後修飾を実行することによって取り除かれ得る。

以下に記載されるように、２’置換ヌクレオチドを完全に取り込んでいるより低いがなお有用である転写物が、上記の最適化された条件以外の条件下で得られ得る。例えば、上記の転写条件に対するバリエーションは以下を含む。

ＨＥＰＥＳ緩衝液濃度は、０〜１Ｍの範囲であり得る。本発明はまた、５から１０の間のｐＫａを有する他の緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ−ヒドロキシメチル−アミノメタンの使用を意図する。

ＤＴＴ濃度は０〜４００ｍＭの範囲であり得る。本発明の方法はまた、例えば、メルカプトエタノールを含む他の還元剤の使用を提供する。

スペルミジンおよび／またはスペルミンは、０〜２０ｍＭの範囲であり得る。

ＰＥＧ−８０００濃度は、０〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、例えば、他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールを含む、他の親水性ポリマーの使用を提供する。

Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００濃度は、０〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、例えば、他のＴｒｉｔｏｎ Ｘ界面活性剤を含む他の界面活性剤を含む、他の非イオン性界面活性剤の使用を提供する。

ＭｇＣｌ_２濃度は、０．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり得る。ＭｎＣｌ_２濃度は、０．１５ｍＭ〜１５ｍＭの範囲であり得る。ＭｇＣｌ_２とＭｎＣｌ_２の両方は記載された範囲内で存在しなくてはならず、好ましい実施形態においては、約１０対約３のＭｇＣｌ_２：ＭｎＣｌ_２の比率で存在し、好ましくは、この比率は約３〜５：１であり、より好ましくは、この比率は約３〜４：１である。

２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（各ＮＴＰ）濃度は、５μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。

２’−ＯＨ ＧＴＰ濃度は、０μＭ〜３００μＭの範囲であり得る。

２’−ＯＨ ＧＭＰ濃度は、０〜５ｍＭの範囲であり得る。

ｐＨはｐＨ６〜ｐＨ９の範囲であり得る。本発明の方法は、修飾ヌクレオチドを取り込む大部分のポリメラーゼの活性のｐＨ範囲内で実施され得る。加えて、本発明の方法は、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＴＴを含む、転写反応条件におけるキレート剤の選択的な使用を提供する。

（アプタマー医薬品化学）
アプタマー医薬品化学は、改変体アプタマーのセットが化学合成されるアプタマー改善技術である。これらの改変体のセットは、代表的に、単一の置換基の導入によって親のアプタマーとは異なり、この置換基の位置によって互いとは異なる。次いで、これらの改変体は、互いに対して、および親に対して比較される。特徴の改善は十分に深刻であり得、単一の置換基の包含が、特定の治療的判断基準を達成するために必要であるすべてであり得る。

代替的に、単一の改変体のセットから拾い集められる情報は、１つより多くの置換基が同時に導入されるさらなる改変体のセットを設計するために使用され得る。１つの設計ストラテジーにおいて、すべての単一の置換基改変体が階級付けされ、上の４つが選択され、これらの４つの単一の置換基改変体のすべての可能な二重（６通り）、三重（４通り）および四重（１通り）の組み合わせが合成されかつアッセイされる。第２の設計ストラテジーにおいて、最良の置換基改変体が新規な親と見なされ、この最高に階級付けされた単一の置換基改変体を含むすべての可能な二重置換基が、合成されかつアッセイされる。他のストラテジーが使用され得、これらのストラテジーは、さらなる改善された改変体を同定することを継続しながら、置換基の数が次第に増加されるように反復して適用され得る。

アプタマー医薬品化学は、全体的であるよりはむしろ、局所的な、置換基の導入を探索するために特に使用され得る。アプタマーは、転写によって生成されるライブラリー中で発見されるので、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスの間に導入される任意の置換基が、全体的に導入されるに違いない。例えば、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を導入することが所望されるならば、これらは、すべてのＡ（またはすべてのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）でのみ導入され得る（全体的に置換される）。あるＡ（またはあるＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）においてホスホロチオエートを必要とするが（局所的に置換される）、他のＡにおいてはそれを許容することができないアプタマーは、このプロセスによっては容易に発見することができない。

アプタマー医薬品化学プロセスによって利用され得る置換基の種類は、固相合成試薬としてそれらを生成し、およびオリゴマー合成スキームにそれらを導入する能力によってのみ制限される。このプロセスは、ヌクレオチド単独に対しては制限されない。アプタマー医薬品化学スキームは、立体的なかさ高さ、疎水性、親水性、親油性、疎油性、正電荷、負電荷、中性電荷、双性イオン、分極性、ヌクレアーゼ耐性、コンホメーションの強固さ、コンホメーションの柔軟性、タンパク質結合特性、分子量などを導入する置換基を含み得る。アプタマー医薬品化学スキームは、塩基修飾、糖修飾またはホスホジエステル結合修飾を含み得る。

治療用アプタマーの状況において有益である可能性がある置換基の種類を考慮する場合、以下のカテゴリーの１つ以上に当てはまる置換基を導入することが所望され得る。

身体中にすでに存在している置換基、例えば、２’−デオキシ、２’−リボ、２’−Ｏ−メチルプリンもしくはピリミジン、または５−メチルシトシン。

すでに認可された治療剤の一部である置換基、例えば、ホスホロチオエート−連結オリゴヌクレオチド。

上記の２つのカテゴリーの１つに加水分解または分解される置換基、例えば、メチルホスホネート連結オリゴヌクレオチド。

本発明の抗ＩｇＥアプタマーには、本明細書に記載されるようなアプタマー医薬品化学を通して開発されたアプタマーが含まれる。

（ＩｇＥ特異的結合アプタマー）
本発明の材料は、ＩｇＥに対して特異的に結合する２０〜５０ヌクレオチド長の一連の核酸アプタマーを含み、ある実施形態においては、これは、細胞に基づくアッセイのようなインビボおよび／または機能的アッセイにおいてＩｇＥの活性を機能的に調節、例えば、ブロックする。

ＩｇＥに特異的に結合し、かつこれを調節することが可能であるアプタマーは本明細書に記載されている。これらのアプタマーは、ＩｇＥによって引き起こされること、またはさもなくばＩｇＥと関連することが知られているアレルギー性鼻炎（花粉症）、アトピー性皮膚炎、喘息、急性じん麻疹（膨疹−紅斑）、食物アレルギー、および全身性アナフィラキシーのようなアトピー性疾患および障害を治療および／または予防する低毒性、安全、かつ有効な様式を提供する。

治療剤および／または診断剤としての使用のためのＩｇＥ特異的結合アプタマーの例には以下の配列が含まれる：配列番号１１〜１５、１８〜１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２、１１９〜１２４、１２６〜１３６、１３９〜１７６、１７８〜１９０、１９４〜２０１、２０６〜２４３、２４７、２４９〜２５９、２６１〜２６７、２６９〜２９０、２９２〜２９５、および２９６；特に、配列番号２９、３３、４１〜４４、４６、５０、９８〜１０２、１５７〜１７６、１７８〜１９０、１９４〜２０１、２０６〜２１９、２９３〜２９５および２９６からなる群より選択され；より特には、配列番号１０１、１５７、１８１、２１６、２９３〜２９５および２９６から選択されるものが提供される。

ＩｇＥを結合する他のアプタマーは、実施例１〜４において以下に記載される。

これらのアプタマーは、例えば、ＰＥＧのような親水性または高分子量化合物への結合体化、ＣｐＧモチーフの取り込み、キャッピング部分の取り込み、修飾ヌクレオチドの取り込み、リン酸バックボーンにおける置換を含む、本明細書に記載される修飾を含み得る。

本明細書の１つの実施形態において、ＩｇＥに結合する、単離された、天然に存在しないアプタマーが提供される。ある実施形態において、単離された、天然に存在しないアプタマーは、ＩｇＥについて、１００μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、または１ｐＭ未満の解離定数（「Ｋ_Ｄ」）を有する。本発明のある実施形態において、この解離定数は、以下の実施例１に記載されるような条件下でヒトＩｇＥの滴定を使用するドットブロットアッセイによって決定される。特定の実施形態において、この解離定数は、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を有する）プラス０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中、室温で３０分間のヒトＩｇＥの滴定を使用する、標準的なドットブロットアッセイによって決定される。

別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩｇＥの機能を調節する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＩｇＥの機能を阻害する。本発明のなお別の実施形態において、このアプタマーは、ＩｇＥ改変体に結合し、および／またはその機能を調節する。本発明で使用されるようなＩｇＥ改変体は、ＩｇＥ機能と本質的に同じ機能を実行する改変体を包含し、好ましくは、実質的に同じ構造を含み、ある実施形態においては、ＩｇＥのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、およびより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む。本発明のある実施形態において、標的改変体の配列同一性は、以下に記載されるＢＬＡＳＴを使用して決定される。

用語「配列同一性」または「同一性％」は、２つ以上の核酸またはタンパク質の配列の状況において、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視の検査によって測定されるように、比較され、および最大の一致のためにアラインされたときに、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列またはサブ配列をいう。配列比較のために、代表的には、１つの配列は参照配列として働き、試験配列がこれに対して比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、サブ配列座標が必要な場合に指定され、および配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性についての検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、ならびに目視的な検査によって（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，下記を参照のこと）によって実施され得る。

配列同一性パーセントを決定するために適切であるアルゴリズムの１つの例は、基本局所的アラインメント検索ツール（本明細書以下では「ＢＬＡＳＴ」）において使用されるアルゴリズムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照のこと。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（本明細書以下では「ＮＣＢＩ」）を通して公的に利用可能である。ＮＣＢＩから利用可能であるソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を使用して配列同一性を決定する際に使用されるデフォルトパラメーターは、ＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３２：Ｗ２０−Ｗ２５（２００４）に記載されている。

本発明の別の実施形態において、アプタマーは、配列番号１１〜１５、１８〜１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２、１１９〜１２４、１２６〜１３６、１３９〜１７６、１７８〜１９０、１９４〜２０１、２０６〜２４３、２４７、２４９〜２５９、２６１〜２６７、２６９〜２９０、２９２〜２９５、および２９６のいずれか１つに従うアプタマーのそれと実質的に同じである、ＩｇＥに結合する能力を有する。本発明の別の実施形態において、アプタマーは、配列番号１１〜１５、１８〜１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２、１１９〜１２４、１２６〜１３６、１３９〜１７６、１７８〜１９０、１９４〜２０１、２０６〜２４３、２４７、２４９〜２５９、２６１〜２６７、２６９〜２９０、２９２〜２９５、および２９６の配列番号のいずれか１つを含むアプタマーのそれと実質的に同じである、ＩｇＥを結合する構造および／または能力を有する。別の実施形態において、配列番号１１〜１５、１８〜１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２、１１９〜１２４、１２６〜１３６、１３９〜１７６、１７８〜１９０、１９４〜２０１、２０６〜２４３、２４７、２４９〜２５９、２６１〜２６７、２６９〜２９０、２９２〜２９５、および２９６の配列番号のいずれか１つに従うアプタマーが提供される。特定の実施形態において、配列番号１０１、１５７、１８１、２１６、２９３〜２９５および２９６のいずれか１つに従うアプタマーが提供される。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、薬学的組成物中の活性成分として使用される。別の実施形態において、本発明のアプタマーまたは本発明のアプタマーを含む組成物は、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アトピー性皮膚炎、喘息、急性じん麻疹（膨疹−紅斑）、食物アレルギー、ピーナッツアレルギー、全身性アナフィラキシー、アレルギー性結膜炎、春季カタル、萎縮性角結膜炎、巨大乳頭性結膜炎、および好酸球性胃腸炎のようなアトピー性疾患または障害を治療するために使用される。

ある実施形態において、本発明のアプタマー治療剤は、このアプタマー治療剤が患者または被験体の身体中で分解する場合に、天然には存在しないヌクレオチド置換からの有害な副作用を減少しながら、それらの標的に対する高い親和性および特異性を有する。ある実施形態において、本発明のアプタマー治療剤を含む治療組成物は、フッ化ヌクレオチドを含まないか、またはフッ化ヌクレオチドが減少している。

本発明のアプタマーは、当該分野において周知である固相オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと）およびトリエステル合成法のような液相法（例えば、Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照のこと）を含む、当該分野において公知である任意のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して合成され得る。

（免疫活性化モチーフを有するアプタマー）
本発明は、ＩｇＥに結合し、それらの生物学的機能を調節するアプタマーを提供する。より詳細には、本発明は、ＩｇＥレセプター、ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合に干渉し、それによってＩｇＥが媒介するアレルギー反応を妨害するアプタマーを提供する。このようなアプタマーの治療的潜在能力は、ＩｇＥに結合し、かつ免疫活性化モチーフもしくは免疫調節モチーフを含むアプタマーを選択することによって、または免疫活性化配列および／もしくは免疫調節配列に結合することが知られている標的に対するアプタマーとともに、ＩｇＥに結合するアプタマーを用いて処理することによって、さらに増強され得る。

脊椎動物免疫系による細菌ＤＮＡの認識は、特定の配列の状況において、メチル化されていないＣＧジヌクレオチドの認識に基づく（「ＣｐＧモチーフ」）。このようなモチーフを認識する１つのレセプターは、Ｔｏｌｌ様レセプター９（「ＴＬＲ９」）であり、これは、別個の微生物成分を認識することによって、生得的な免疫応答に関与するＴｏｌｌ様レセプターのファミリー（約１０メンバー）の１つのメンバーである。ＴＬＲ９は、配列特異的な様式で、メチル化されていないオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）ＣｐＧ配列を結合する。ＣｐＧモチーフの認識は、生得的かつ最終的に獲得された免疫応答に導く防御メカニズムをトリガーする。例えば、マウスにおけるＴＬＲ９の活性化は、抗原提示細胞の活性化、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の調節、ならびに重要な同時刺激分子およびＩＬ−１２およびＩＬ−２３を含むサイトカインの発現を誘導する。この直接的と間接的の両方の活性化は、ＴＨ１サイトカインＩＦＮγの強固なアップレギュレーションを含む、Ｂ細胞およびＴ細胞の応答を増強する。集合的に、ＣｐＧ配列に対する応答は以下をもたらす：感染性疾患に対する防御、ワクチンに対する免疫応答の改善、喘息に対する効果的な応答、および抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害性の改善。従って、ＣｐＧ ＯＤＮは、感染性疾患に対する防御を提供することができ、免疫アジュバントまたは癌治療剤として機能し（単独治療またはｍＡｂもしくは他の治療剤と組み合わせて）、ならびに喘息およびアレルギー性応答を減少することができる。

１つ以上のＣｐＧまたは他の免疫活性化配列を含む本発明のアプタマーは、例えば、本明細書に記載されるＳＥＬＥＸ（商標）プロセスを使用する種々のストラテジーによって、同定または生成され得る。一般的に、これらのストラテジーは、２つのグループに分けられ得る。グループ１においては、ストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫活性化配列ならびに標的のための結合部位の両方を含むアプタマーを同定または生成することに向けられ、ここで、標的（本明細書以下では、「非ＣｐＧ標的」）は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫活性化配列を認識することが知られており、およびＣｐＧモチーフに結合する際に免疫応答を刺激することが知られているもの以外の標的である。本発明のある実施形態において、非ＣｐＧ標的はＩｇＥである。このグループの第１のストラテジーは以下を包含する：特異的非ＣｐＧ標的、好ましくは、免疫応答が疾患の発症と関連する標的、例えば、ＩｇＥに対するアプタマーを得るために、オリゴヌクレオチドプールを使用してＳＥＬＥＸ（商標）を実行することであって、ここで、ＣｐＧモチーフは、固定領域として、または固定領域の一部としてのプールの各メンバーに取り込まれ、例えば、ある実施形態において、プールのメンバーのランダム化領域は、そこに取り込まれたＣｐＧモチーフを有する固定領域を含むこと、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定すること。このグループの第２のストラテジーは、以下を包含する：特異的非ＣｐＧ標的、好ましくは、免疫応答が疾患の発症と関連する標的、例えば、ＩｇＥに対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を実行すること、ならびに選択後に５’末端および／もしくは３’末端にＣｐＧモチーフを付加すること、またはＣｐＧモチーフを、アプタマーの領域、好ましくは、非必須領域に操作すること。このグループの第３のストラテジーは、以下を包含する：特異的非ＣｐＧ標的、好ましくは、免疫応答が疾患の発症と関連する標的、例えば、ＩｇＥに対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を実行し、ここで、プールの合成の間、種々のヌクレオチドのモル濃度比は、プールの各メンバーのランダム化された領域がＣｐＧモチーフ中で富化されるように、１つ以上のヌクレオチド付加工程において偏向されること、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定すること。このグループの第４のストラテジーは、以下を包含する：特異的非ＣｐＧ標的、好ましくは、免疫応答が疾患の発症と関連する標的、例えば、ＩｇＥに対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を実行すること、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定すること。このグループの第５のストラテジーは、以下を包含する：特異的非ＣｐＧ標的、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連する標的、例えば、ＩｇＥに対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を実行すること、および、結合の際に、免疫応答を刺激するが、ＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定すること。

グループ２においては、ストラテジーは、ＣｐＧモチーフならびに／またはＣｐＧモチーフについてのレセプター（例えば、ＴＬＲ９または他のｔｏｌｌ様レセプター）によって結合され、および結合の際に免疫応答を刺激する他の配列を含むアプタマーを同定または生成することに向けられる。このグループの第１のストラテジーは、このグループの第１のストラテジーは以下を包含する：ＣｐＧモチーフまたは他の免疫活性化配列に結合することが知られており、結合の際に、免疫応答を刺激する標的に対するアプタマーを得るために、オリゴヌクレオチドプールを使用してＳＥＬＥＸ（商標）を実行することであって、ここで、ＣｐＧモチーフは、固定領域として、または固定領域の一部としてのプールの各メンバーに取り込まれ、例えば、ある実施形態において、プールのメンバーのランダム化領域は、そこに取り込まれたＣｐＧモチーフを有する固定領域を含むこと、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定すること。このグループの第２のストラテジーは、以下を包含する：ＣｐＧモチーフまたは他の免疫活性化配列に結合することが知られており、結合の際に、免疫応答を刺激する標的に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を実行すること、ならびに５’末端および／もしくは３’末端にＣｐＧモチーフを付加すること、またはＣｐＧモチーフを、アプタマーの領域、好ましくは、非必須領域に操作すること。このグループの第３のストラテジーは、以下を包含する：ＣｐＧモチーフまたは他の免疫活性化配列に結合することが知られており、結合の際に、免疫応答を刺激する標的に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を実行し、ここで、プールの合成の間、種々のヌクレオチドのモル濃度比は、プールの各メンバーのランダム化された領域がＣｐＧモチーフ中で富化されるように、１つ以上のヌクレオチド付加工程において偏向されること、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定すること。このグループの第４のストラテジーは、以下を包含する：ＣｐＧモチーフまたは他の免疫活性化配列に結合することが知られており、結合の際に、免疫応答を刺激する標的に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を実行すること、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定すること。このグループの第５のストラテジーは、以下を包含する：ＣｐＧモチーフまたは他の免疫活性化配列に結合することが知られている標的に対するアプタマーを得るために、ＳＥＬＥＸ（商標）を実行すること、および、結合の際に、免疫応答を刺激するが、ＣｐＧモチーフを含まないアプタマーを同定すること。

種々の異なるクラスのＣｐＧモチーフが同定されており、各々が異なるカスケードの事象における認識、サイトカインおよび他の分子の放出、ならびに特定の細胞型の活性化を生じる。例えば、参照により本明細書に援用されるＣｐＧ Ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，２０：７０９−７６０を参照のこと。さらなる免疫活性化モチーフは、参照により本明細書に援用される以下の米国特許において開示される：米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許６，２３９，１１６号；米国特許第６，４２９，１９９号；米国特許第６，２１４，８０６号；米国特許第６，６５３，２９２号；米国特許第６，４２６，４３４号；米国特許第６，５１４，９４８号および米国特許第６，４９８，１４８号。これらのＣｐＧまたは他の免疫活性化モチーフのいずれかがアプタマーに取り込まれ得る。アプタマーの選択は、治療される疾患または障害に依存する。好ましい免疫活性化モチーフは、「ｒ」がプリンを示し、「ｙ」がピリミジンを示し、および「Ｘ」が任意のヌクレオチドを示す場合、以下の通りである（左から右に５’から３’で示す）：ＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧ（配列番号４）；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＣＧＴ；ｒＣＧｙ、ｒｒＣＧｙｙ、ＸＣＧＸ、ＸＸＣＧＸＸおよびＸ_１Ｘ_２ＣＧＹ_１Ｙ_２、ここでＸ_１はＧまたはＡであり、Ｘ_２はＣではなく、Ｙ_１はＧではなく、Ｙ_２は好ましくはＴである。

ＣｐＧモチーフが、ＣｐＧモチーフに結合されることが知られている標的以外の特異的標的（「非ＣｐＧ標的」）に結合し、結合の際に免疫応答を刺激するアプタマーに取り込まれる場合において、このＣｐＧは、好ましくは、アプタマーの非必須領域に位置する。アプタマーの非必須領域は、部位特異的変異誘発、欠失分析および／または置換分析によって同定され得る。しかし、非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力に有意に干渉しない任意の位置が使用され得る。アプタマー配列中に埋め込まれることに加えて、ＣｐＧモチーフは、５’末端と３’末端のいずれかもしくは両方に付加され得るか、またはさもなくばアプタマーに結合され得る。非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力が有意に干渉されない限り、結合の任意の位置または手段が使用され得る。

本明細書で使用されるように、「免疫応答の刺激」は、（１）特異的応答（例えば、Ｔｈ１応答の誘導）もしくは特定の分子の産生の誘導、または（２）特異的応答（例えば、Ｔｈ２応答の阻害もしくは抑制）もしくは特定の分子の阻害もしくは抑制のいずれかを意味し得る。

（薬学的組成物）
本発明はまた、ＩｇＥに結合するアプタマー分子を含む薬学的組成物を含む。ある実施形態において、この組成物は、内服のために適切であり、本発明の薬学的に活性な化合物の有効量を、単独で、または１種以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。この化合物は、これらが、もしあれば、非常に低い毒性を有するという点で、とりわけ有用である。

本発明の組成物は、患者における、疾患または障害のような病理を治療、予防および／もしくは寛解するため、またはこのような疾患もしくは障害の徴候を軽減するために使用され得る。例えば、本発明の組成物は、ＩｇＥによって引き起こされること、またはさもなくばＩｇＥと関連することが知られている、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アトピー性皮膚炎、喘息、急性じん麻疹（膨疹−紅斑）、食物アレルギー、および全身性アナフィラキシーのようなアトピー性疾患および障害と関連した病理を治療、予防および／または寛解するために使用され得る。

本発明の組成物は、本発明のアプタマーが特異的に結合する標的と関連するか、またはそれに由来する疾患または障害に罹患しているか、またはその素因がある被験体への投与のために有用である。本発明の組成物は、病理を有する患者または被験体を治療するための方法において使用され得る。この方法は、ＩｇＥへのアプタマーの結合が標的の生物学的機能を変化させ、それによって病理を治療するように、ＩｇＥを結合するアプタマーまたはアプタマーを含む組成物を、患者または被験体に投与する工程を包含する。

病理を有する患者または被験体、すなわち、本発明の方法によって治療される患者または被験体は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、またはより好ましくはヒトであり得る。

実務上、アプタマーまたはそれらの薬学的に受容可能な塩は、それらの所望される生物学的活性を発揮するため、例えば、ＦｃεＲＩへのＩｇＥアプタマーの結合を阻害するために十分な量で投与される。

本発明の１つの態様は、ＩｇＥ媒介性障害のための他の治療と組み合わせた本発明のアプタマー組成物を含む。本発明のアプタマー組成物は、例えば、１種より多くのアプタマーを含み得る。ある例において、１種より多くの本発明の化合物を含む本発明のアプタマー組成物は、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤などのような別の有用な組成物と組み合わせて投与される。一般的に、このような組み合わせにおける使用のための、既知の治療剤の現在利用可能な投薬量が適切である。

「併用療法（または「同時治療」）」には、これらの治療剤の共同作用からの有益な効果を提供することが意図される特定の治療レジメンの一部としての、本発明のアプタマー組成物および少なくとも第２の薬剤の投与が含まれる。組み合わせの有益な効果には、治療剤の組み合わせから生じる薬物動態学的または薬力学的共同作用が含まれるがこれに限定されない。組み合わせたこれらの治療剤の投与は、代表的には、所定の時間の間（通常、選択された組み合わせに依存して、分、時間、日または週）にわたって実行される。

「併用療法」は、本発明の組み合わせを偶発的にまたは任意に生じる別々の単独治療レジメンの一部として、２種以上のこれらの治療剤の投与を包含することが意図されてもよいが、一般的にはそうではない。「併用療法」は、逐次的な様式でのこれらの治療剤の投与、すなわち、各治療剤が異なる時点で投与される投与、ならびに実質的に同時の様式にあるこれらの治療剤、または少なくとも２種の治療剤の投与を包含することが意図される。実質的に同時の投与は、例えば、固定された比率の各々の治療剤を有する単一のカプセル、または各々の治療剤についての単一のカプセルの複数を、被験体に投与することによって達成され得る。

各治療剤の逐次的または実質的に同時的な投与は、局所的経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を通しての直接的吸収を含むが、これらに限定されない任意の適切な経路などによってもたらされ得る。治療剤は、同じ経路または異なる経路によって投与され得る。例えば、選択された組み合わせの第１の治療剤が注射によって投与され得るのに対し、組み合わせの他方の治療剤が局所的に投与され得る。

代替的には、例えば、すべての治療剤が局所的に投与され得るか、またはすべての治療剤が注射によって投与され得る。治療剤が投与される順番は、他に注記されない限りは、狭義に決定的ではない。「併用療法」はまた、他の生物学的に活性な成分とのさらなる組み合わせにおける、上記のような治療剤の投与を包含し得る。併用療法が非薬物治療をさらに包含する場合、非薬物治療は、治療剤および非薬物治療の組み合わせの共同作用からの有益な効果が達成される限り、任意の適切な時点で実施され得る。例えば、適切な例において、有益な効果は、非薬物治療が一時的に治療剤の投与から除かれたとき、おそらく、数日間または数週間でまででさえ、なお達成される。

本発明の治療組成物または薬学的組成物は、一般的には、薬学的に受容可能な媒体中に溶解または分散された、活性成分の治療有効量を含む。薬学的に受容可能な媒体またはキャリアには、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および剤の使用は当該分野において周知である。補充的な活性成分もまた、本発明の治療組成物に取り込まれ得る。

薬学的組成物または薬理学的組成物の調製は、本開示に鑑みて、当業者には公知である。代表的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射液として；注射の前の液体中への溶液、または懸濁液のために適切である固体形態；経口投与のための錠剤もしくは他の固形物として；時限放出カプセルとして；または点眼液、クリーム、ローション、軟膏、吸入剤などを含む現在使用されている任意の他の形態において調製され得る。滅菌製剤の使用、例えば、手術分野における特定の領域を処置するための外科医、内科医または保健医療従事者による生理食塩水ベースの洗浄もまた、特に有用であり得る。組成物はまた、マイクロデバイス、微粒子またはスポンジを介して送達され得る。

製剤の際に、治療剤は、投薬量製剤と適合可能な様式で、および薬学的に有効である量で投与される。製剤は、種々の投薬量形態で、例えば、上記の注射可能溶液の型で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた、利用され得る。

この状況において、投与される組成物の活性成分の量および組成物の体積は、治療される宿主動物に依存する。投与のために必要とされる活性化合物の正確な量は、実務者の判断に依存し、各個体に固有である。

活性化合物を分散するために必要である組成物の最小量が代表的に利用される。投与のための適切なレジメもまた変動性であるが、しかし、これは、化合物を最初に投与すること、および結果をモニタリングすること、および次いで、さらなる間隔でさらに制御された用量を与えることによって代表される。

例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与のために、活性薬物成分は、経口、非毒性、薬学的に受容可能な不活性キャリア、例えば、エタノール、グリセロール、水などと組み合わされ得る。さらに、所望されるか、または必要である場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤もまた、この混合物に取り込まれ得る。適切な結合剤には、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、グルコースまたはβ−ラクトース、トウモロコシ甘味料などの天然の糖、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成のガム、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの投薬量形態において使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコールなどが含まれる。崩壊剤には、非限定的に、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または沸騰性混合物などが含まれる。希釈剤には、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンが含まれる。

本発明の化合物はまた、時限放出および持続放出錠剤またはカプセル、丸薬、散剤、顆粒剤、エリキシル、チンキ剤、懸濁剤、シロップおよびエマルジョンのような経口投薬量形態で投与され得る。坐剤は、脂肪性エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。

薬学的組成物は、滅菌され得、ならびに／またはアジュバント、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩および／もしくは緩衝剤を含み得る。加えて、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。これらの組成物は、従来の混合、顆粒化、または被覆方法に従って調製され、代表的には、活性成分の約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％を含む。

液体、特に注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどのような薬学的に純粋な溶媒中に溶解し、またはそれらとともに混合され、それによって、注射可能な溶液または懸濁液を形成する。加えて、注射の前に液体に溶解するために適切である固体形態が製剤化され得る。

本発明の化合物は、静脈内（ボーラスと注入の両方）、腹腔内、皮下または筋肉内の形態で投与され得、すべてが薬学分野における当業者に周知である形態を使用する。注射液は、従来的な形態で、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され得る。

非経口的注射投与は、一般的に、皮下、筋肉内または静脈内の注射および注入のために使用される。加えて、非経口投与のための１つのアプローチは、参照により本明細書に援用される米国特許第３，７１０，７９５号に従う、一定のレベルの投薬量が維持されることを保証する、徐放系または持続放出系の埋め込みを利用する。

さらに、本発明の好ましい化合物は、適切な鼻内ビヒクル、吸入剤の局所的使用を介する鼻内形態において、または当業者に周知である経皮皮膚パッチの形態を使用する経皮的経路を介して投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬量投与は、当然、投薬量レジメンの全体を通して断続的であるよりはむしろ連続的である。他の好ましい局所的調製物には、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレーおよびゲルが含まれ、ここで、活性成分の濃度は、代表的には、０．０１％〜１５％、ｗ／ｗまたはｗ／ｖの範囲である。

固体組成物のために、賦形剤には、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。上記に定義した活性化合物もまた、キャリアとして、例えば、ポリアルキレングリコール、例えば、プロピレングリコールを使用して、坐剤として製剤化され得る。ある実施形態において、坐剤は、脂肪性エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。

本発明の化合物は、小さな単層ベシクル、大きな単層ベシクルおよび多層ベシクルなどのリポソーム送達系の形態で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む種々のリン脂質から形成され得る。ある実施形態において、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、脂質成分のフィルムが、薬物の水溶液で水和されて、薬物をカプセル化する脂質層を形成する。例えば、本明細書に記載されるアプタマー分子が、当該分野において公知である方法を使用して構築される、親油性化合物または非免疫原性、高分子量化合物との複合体として提供され得る。核酸結合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号において提供される。

本発明の化合物はまた、標的化可能な薬物キャリアとして、可溶性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが含まれ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成する際に有用である生物分解可能なポリマーのクラス、例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびハイドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーにカップリングされ得る。

所望される場合、投与される薬学的組成物はまた、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および例えば、酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミンなどの他の物質を含み得る。

アプタマーを利用する投薬量レジメンは、患者の型、人種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療される状態の重篤度；投与の経路；患者の腎臓および肝臓の機能；ならびに利用される特定のアプタマーまたはその塩を含む種々の要因に従って選択される。通常の技能を有する医師または獣医師は、状態を治療し、予防し、それに対抗し、またはその進行を停止するために必要とされる薬物の有効量を容易に決定しかつ処方し得る。

本発明の経口投薬量は、示される効果のために使用される場合、経口で約０．０５〜７５００ｍｇ／日の間の範囲である。この組成物は、好ましくは、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０および１０００．０ｍｇの活性成分を含む、記録された錠剤の形態で提供される。注入投薬量、鼻内投薬量および経皮投薬量は、０．０５〜７５００ｍｇ／日の間の範囲である。皮下、静脈内および腹腔内の投薬量は、０．０５〜３８００ｍｇ／日の間の範囲である。

本発明の化合物の効果的な血漿レベルは、０．００２ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲である。

本発明の化合物は、単独の一日用量で投与され得、または全体の一日用量は、一日に２回、３回、もしくは４回の分割用量で投与され得る。

（アプタマー治療剤の薬物動態学および生物分布の調節）
アプタマーを含む、すべてのオリゴヌクレオチドベースの治療剤について、薬物動態学特性が、所望の薬学的適用に一致するように仕立てられることが重要である。細胞外標的に対して指向されるアプタマーは、細胞内送達に付随する困難さ（アンチセンスおよびＲＮＡｉベースの治療剤によくあることである）を問題としないが、このようなアプタマーは、標的の器官および組織に分布すること、および所望の投薬レジメンと一致する時間の間、身体に残存すること（未修飾で）がなお可能でなくてはならない。

従って、本発明は、アプタマー組成物の薬物動態学、特に、アプタマーの薬物動態学を調整する能力に影響を与える材料および方法を提供する。アプタマーの薬物動態学の調整能力（すなわち、調節する能力）は、アプタマーへの修飾部分（例えば、ＰＥＧポリマー）の結合体化、および／または核酸の化学組成を変化させるための修飾ヌクレオチド（例えば、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル）の取り込みを通して達成される。アプタマー薬物動態学を調整する能力は、既存の治療的適用の改善において、または代替的には、新規な治療的適用の開発において使用される。例えば、ある治療的適用において、例えば、迅速な薬物クリアランスまたはターンオフが所望され得る、抗新生物または救急設定において、循環中でのアプタマーの滞留時間を減少することが所望される。代替的には、他の治療的適用、例えば、治療剤の全身性循環が所望される維持治療において、循環中のアプタマーの滞留時間を増加させることが所望され得る。

加えて、アプタマーの薬物動態学の調整能力は、被験体におけるアプタマー治療剤の生物分布を改変するために使用される。例えば、ある治療的適用において、特定の組織または特定の器官（または器官のセット）を標的とするための取り組みにおいて、アプタマー治療剤の生物分布を変化させることが所望され得る。これらの適用において、アプタマー治療剤は、特定の組織または器官に優先的に蓄積する。他の治療的適用において、アプタマー治療剤が罹患した組織に優先的に蓄積するように、所定の疾患、細胞の損傷、または他の異常な病理と関連する細胞マーカーまたは徴候を示す組織を標的とすることが所望され得る。例えば、２００４年３月５日に出願され、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｔａｍｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」という表題の米国仮出願第６０／５５０７９０号において記載されるように、ならびに２００５年３月７日に出願され、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｔａｍｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」という表題の米国非仮出願第１０／−−−，−−−号において記載されるように、アプタマー治療剤のＰＥＧ化（２０ｋＤａ ＰＥＧポリマーを用いるＰＥＧ化）が、炎症組織を標的とするために使用され、その結果、ＰＥＧ化されたアプタマー治療剤が炎症組織に優先的に蓄積する。

アプタマー治療剤（例えば、アプタマー結合体または変化した化学成分、例えば、修飾ヌクレオチドを有するアプタマー）の薬物動態学および生物分布プロフィールを決定するために、種々のパラメーターがモニタリングされる。このようなパラメーターには、例えば、アプタマー組成物の、半減期（ｔ_１／２）、血漿クリアランス（Ｃ１）、分布の体積（Ｖｓｓ）、濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ）、最大の観察された血清または血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）、および平均滞留時間（ＭＲＴ）が含まれる。本明細書で使用されるように、用語「ＡＵＣ」は、アプタマー投与後の時間に対する、アプタマー治療剤の血漿濃度のプロットの下の面積をいう。ＡＵＣ値は、与えられたアプタマー治療剤のバイオアベイラビリティー（すなわち、アプタマー投与後の循環中での投与されたアプタマー治療剤のパーセンテージ）および／または全体のクリアランス（Ｃ１）（すなわち、アプタマー治療剤が循環から除去される速度）を見積もるために使用される。分布の体積は、アプタマー治療剤の血漿濃度を、身体中に存在するアプタマーの量に関連付ける。Ｖｓｓがより大きければ、より多くのアプタマーが血漿の外側で見い出される（すなわち、より多くの溢血）。

本発明は、低分子、ペプチド、もしくはポリマー末端基などの調節部分にアプタマーを結合体化することによって、またはアプタマーに修飾ヌクレオチドを取り込むことによって、制御された様式で、安定化されたアプタマー組成物の薬物動態学的および生物分布をインビボで調節するための材料および方法を提供する。本明細書に記載されるように、修飾部分の結合体化および／またはヌクレオチドの化学組成を変化させることは、循環中でのアプタマー滞留時間および組織への分布の基本的な局面を変化させる。

ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療剤は、腎臓濾過を介する排出に供される。このようなものとして、静脈内投与されるヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、濾過がブロックできない限り、代表的には、＜１０分間のインビボ半減期を示す。これは、血流から組織への迅速な分布を容易にすることによって、または糸球体についての有効なサイズのカットオフより上にオリゴヌクレオチドの見かけの分子量を増加させることによってのいずれかで達成され得る。ＰＥＧポリマーへの小さな治療剤の結合体化（ＰＥＧ化）は、以下に記載されるように、循環中でのアプタマーの滞留時間を劇的に延長することができ、それによって、投薬の頻度を減少させ、および血管の標的に対する有効性を増強する。

アプタマーは、高分子量ポリマー、例えば、ＰＥＧ；ペプチド、例えば、Ｔａｔ（ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質の１３アミノ酸フラグメント（Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアホメオティックタンパク質の第３へリックスから誘導された１６アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｖａｃｃｉｎｅ １９（１１−１２）：１３９７−４０５）およびＡｒｇ_７（ポリアルギニン（Ａｒｇ_７）から構成される短い、正に荷電した細胞透過ペプチド（Ｒｏｔｈｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８））；ならびに低分子、例えば、コレステロールなどの親油性化合物などの種々の修飾部分に結合され得る。本明細書に記載される種々の結合体の中で、アプタマーのインビボ特性は、ＰＥＧ基との複合体形成によって最も深刻に変化される。例えば、２’Ｆおよび２’−ＯＭｅ修飾アプタマー治療剤の２０ｋＤａ ＰＥＧポリマーとの複合体形成は、腎臓濾過を妨害し、健常組織と炎症を有する組織の両方へのアプタマーの分布を促進する。さらに、２０ｋＤａ ＰＥＧポリマー−アプタマー結合体は、アプタマーの腎臓濾過を妨害する際に、４０ｋＤａ ＰＥＧポリマーとほぼ同程度に有効であることが判明している。ＰＥＧ化の１つの効果はアプタマークリアランスに対してであるが、２０ｋＤａ部分の存在によって許容される全身的な露出の延長はまた、組織へのアプタマーの分布、特に、高度に灌流された器官の分布、および炎症の部位における分布を容易にする。アプタマー−２０ｋＤａ ＰＥＧポリマー結合体は、アプタマー分布を、炎症の部位に方向付け、その結果、ＰＥＧ化されたアプタマーが炎症を有する組織に優先的に蓄積する。ある例において、２０ｋＤａ ＰＥＧ化アプタマー結合体は、例えば、腎臓細胞などの細胞の内部に接近することが可能である。

修飾ヌクレオチドはまた、アプタマーの血漿クリアランスを調節するために使用され得る。例えば、２’−Ｆと２’−ＯＭｅの両方の安定化化学物質を取り込んでおり、インビトロおよびインビボでの高度なヌクレアーゼ安定性を示す現在の世代のアプタマーに特有である、結合体化されていないアプタマーは、未修飾のアプタマーと比較した場合に、血漿からの迅速な喪失（すなわち、迅速な血漿クリアランス）および組織、主として腎臓への迅速な分布を示す。

（ＰＥＧ誘導体化核酸）
上記に記載されたように、高分子量非免疫原性ポリマーを用いる核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態学的および薬力学的特性を変化させる潜在能力を有し、それらをより有効な治療剤にする。活性の好ましい変化は、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性の増加、腎臓を通しての濾過の減少、免疫系に対する露出の減少、および身体を通しての治療剤の分布の変化を含み得る。

本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化され得る。ＰＡＧ誘導体化された核酸の例は、その全体が参照により本明細書に援用される、２００３年１１月２１日に出願された米国特許出願第１０／７１８，８３３号に見い出される。本発明において使用される代表的なポリマーには、ポリエチレンオキサイド（「ＰＥＯ」）としても知られるポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）が含まれる。加えて、異なるアルキレンオキサイド（例えば、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド）のランダムまたはブロックコポリマーが多くの応用において使用され得る。最も一般的な形態において、ＰＥＧなどのポリアルキレングリコールは、各末端においてヒドロキシル基で終わっている直鎖状ポリマー：

である。このポリマー、α−、ω−ジヒドロキシポリエチレングリコールはまた、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表され得、ここで、−ＰＥＧ−記号は以下の構造単位：

を表し、ｎは代表的には約４から約１０，０００までの範囲であることが理解される。

示されるように、ＰＥＧ分子は、二官能性であり、時折、「ＰＥＧジオール」と呼ばれる。ＰＥＧ分子の末端部分は、比較的非反応性のヒドロキシル部分、−ＯＨ基であり、これは、化合物上の反応性部位において他の化合物へのＰＥＧの結合のために、活性化され得るか、または官能基部分に転換され得る。このような活性化されたＰＥＧジオールは、本明細書では二活性化ＰＥＧと呼ばれる。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、比較的非反応性ヒドロキシル部分である−ＯＨの、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドからのスクシニミジル活性エステル部分での置換により、アミノ部分との選択的反応のための活性カーボネートエステルとして官能基化されてきた。

多くの応用において、ＰＥＧ分子が一官能性（または一活性化）であるように、本質的に非反応性である部分を用いて、一方の末端においてＰＥＧ分子をキャップすることが所望される。活性化ＰＥＧについて複数の反応部位を一般的に示すタンパク質治療剤の場合において、二官能基活性化ＰＥＧは広範な架橋を導き、乏しい機能的凝集物を生じる。一活性化ＰＥＧを生成するために、ＰＥＧジオール分子の末端上の１つのヒドロキシル部分は、代表的に、非反応性メトキシ末端部分、−ＯＣＨ_３で置換される。他方のキャップされていないＰＥＧ分子の末端は、代表的には、反応性の末端部分に転換され、これは、表面またはタンパク質のような分子上の反応性部位における結合のために活性化され得る。

ＰＡＧは、代表的には、水および多くの有機溶媒における溶解性の特性を有し、毒性を欠き、および免疫原性を欠くポリマーである。ＰＡＧの１つの用途は、得られるＰＡＧ−分子「結合体」を可溶性にするために、不溶性分子にポリマーを共有結合させることである。例えば、水不溶性薬物パクリタキセルは、ＰＥＧにカップリングされたときに、水溶性になることが示されてきた。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧ結合体は、しばしば、溶解性および安定性を増強するために使用されるのみならず、分子の血液循環半減期を延長するためにも使用される。

本発明のポリアルキル化化合物は、代表的には、５〜８０ｋＤａの間のサイズであるが、しかし、任意のサイズが使用され得、その選択はアプタマーおよび用途に依存する。本発明の他のＰＡＧ化合物は、１０〜８０ｋＤａの間のサイズである。本発明のなお他のＰＡＧ化合物は、１０〜６０ｋＤａの間のサイズである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤａのサイズであり得る。このようなポリマーは、直鎖状または分枝状であり得る。ある実施形態において、ポリマーはＰＥＧである。ある実施形態において、ポリマーは分枝状ＰＥＧである。なお他の実施形態において、ポリマーは、図３に示されるような４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧである。ある実施形態において、４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧは、図４に示されるようなアプタマーの５’末端に結合される。

生物学的に発現されたタンパク質治療剤とは対照的に、核酸治療剤は、代表的には、活性化されたモノマーヌクレオチドから化学合成される。ＰＥＧ−核酸結合体は、同じ反復モノマー合成を使用してＰＥＧを取り込むことによって調製され得る。例えば、ホスホルアミダイト型への転換によって活性化されたＰＥＧは、固相オリゴヌクレオチド合成に組み込まれ得る。代替的には、オリゴヌクレオチド合成は、反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的な取り込みを用いて完了され得る。最も一般的には、これは、５’末端における遊離の一級アミンの付加によって達成されてきた（固相合成の最後のカップリング工程において修飾因子のホスホルアミダイトを使用して取り込む）。このアプローチを使用して、反応性ＰＥＧ（例えば、それがアミンと反応し、かつアミンと結合を形成するように活性化されるもの）が精製したオリゴヌクレオチドと合わされ、カップリング反応が溶液中で実行される。

ＰＥＧ結合体化が治療剤の生物分布を変化させる能力は、結合体の見かけのサイズ（例えば、流体力学的半径によって測定される）を含む多数の要因に関連する。より大きな結合体（＞１０ｋＤａ）は、腎臓を介する濾過をより効果的にブロックすること、および結果として小さな高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を増加させることが知られている。ＰＥＧ結合体が濾過をブロックする能力は、およそ５０ｋＤａまでのＰＥＧサイズを用いて増加することが示されてきた（さらなる増加は、半減期が腎臓を介する除去よりはむしろマクロファージ媒介性の代謝によって規定されるようになるために、最小限の有益な効果を有する）。

高分子量（＞１０ｋＤａ）ＰＥＧの産生は、困難、非効率的、かつ高価であり得る。高分子量ＰＥＧ−核酸結合体の合成に向けた経路として、以前の研究は、より高分子量の活性化ＰＥＧの生成に向けて焦点が当てられていた。このような分子を生成するための１つの方法は、２つ以上のＰＥＧが活性化基を有する中心コアに結合されている分枝状活性化ＰＥＧの形成を含む。これらのより高分子量のＰＥＧ分子の末端部分、すなわち、比較的非反応性のヒドロキシル（−ＯＨ）部分は、化合物上の反応性部位における、１つ以上のＰＥＧの他の分子への結合のために、活性化され得るか、または官能基部分に転換され得る。分枝状活性化ＰＥＧは２つより多くの末端を有し、２つ以上の末端が活性化された場合においては、このような活性化されたより高分子のＰＥＧ分子は、本明細書では、多活性化ＰＥＧと呼ばれる。ある場合において、分枝状ＰＥＧ分子におけるすべての末端が活性化されるわけではない。分枝状ＰＥＧ分子の任意の２つの末端が活性化される場合において、このようなＰＥＧ分子は、二活性化ＰＥＧと呼ばれる。分枝状ＰＥＧ分子における１つの末端のみが活性化される場合において、このようなＰＥＧ分子は、一活性化と呼ばれる。このアプローチの例として、反応のために引き続き活性化されるリジンコアへの２つのモノメトキシＰＥＧの結合によって調製される活性化ＰＥＧが記載されている（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２：２１４−２２１，２００３）。

本発明は、多層ＰＥＧ化核酸を含む、高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）結合体の合成のための別のコスト的に効率的な経路を提供する。本発明はまた、ＰＥＧ−連結マルチマー性オリゴヌクレオチド、例えば、ダイマー性アプタマーを包含する。本発明はまた、ＰＥＧ安定化部分がアプタマーの異なる部分を分離するリンカーである高分子量組成物に関し、例えば、ＰＥＧが単一のアプタマー配列中に結合体化され、その結果、高分子量アプタマー組成物の直鎖状配置が、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）_ｎであり、ここで、ｎは１以上である。

本発明の高分子量組成物には、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものが含まれる。組成物は、代表的には、１０〜８０ｋＤａの間のサイズの分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤａのサイズである。

安定化部分は、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態学的および薬力学的特性を改善する、分子または分子の部分である。ある場合において、安定化部分は、２つ以上のアプタマー、またはアプタマードメインを近接に導き、または本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転自由度の減少を提供する分子または分子の部分である。安定化部分は、直鎖状または分枝状の、ホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得る、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコールであり得る。他の安定化部分には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のようなポリマーが含まれる。オリゴヌクレオチドもまた安定化部分であり得；このようなオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、および／または修飾連結、例えば、ホスホロチオエートを含み得る。安定化部分は、アプタマー組成物の不可欠な部分であり得、すなわち、これはアプタマーに共有結合される。

本発明の組成物は、２つ以上の核酸部分が少なくとも１つのポリアルキレングリコール部分に共有結合的に結合体化されている高分子量アプタマー組成物を含む。このポリアルキレングリコール部分は安定化部分として働く。ポリアルキレングリコールが１つの分子中で一緒に核酸分子を連結するように、ポリアルキレングリコール部分がいずれかの末端でアプタマーに共有結合されている組成物において、このポリアルキレングリコールは連結部分と呼ばれる。このような組成物において、共有結合分子の一次構造は、直鎖状配置の核酸−ＰＡＧ−核酸を含む。１つの例は、一次構造、核酸−ＰＥＧ−核酸を有する組成物である。別の例は、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸の直鎖状配置である。

核酸−ＰＥＧ−核酸結合体を産生するために、核酸は、それが単一の反応部位を有する（例えば、これが一活性化されている）ように、もともと合成される。好ましい実施形態において、この反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成における最後の工程として、修飾因子ホスホルアミダイトの付加によって５’−末端において導入されるアミノ基である。脱保護および修飾オリゴヌクレオチドの精製の後、これは、活性化ＰＥＧの自発的な加水分解を最小化する、溶液中の高濃度で再構築される。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再構築された溶液は、２００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３−緩衝液、ｐＨ ８．３を含む。結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧのゆっくりとした、段階的な付加によって開始される。好ましい実施形態において、ＰＥＧジオールが、スクシニミジルプロピオネートを用いる誘導体化によって、両方の末端（二活性化されている）において活性化される。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体は、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製され、完全に結合体化された種、部分的に結合体化された種、および結合体化されていない種を分離する。連結された複数のＰＡＧ分子（例えば、ランダムまたはブロックコポリマーとして）またはより小さなＰＡＧ鎖が種々の長さ（または分子量）を達成するために連結され得る。非ＰＡＧリンカーは、種々の長さのＰＡＧ鎖間で使用され得る。

２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロおよび他の修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化し、およびそのインビボでの半減期を増加させる。３’−３’−ｄＴキャップもまた、エキソヌクレアーゼ耐性を増加させる。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号；および同第６，２２９，００２号を参照のこと。

（反応性核酸のＰＡＧ誘導体化）
高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ結合体は、１つより多くの反応部位を含む核酸との一官能性活性化ＰＥＧの反応によって調製され得る。１つの実施形態において、核酸は、二反応性または二活性化され、従来的なホスホロアミダイト合成、例えば：図５において図示される３’−５’−ジ−ＰＥＧ化を通してオリゴヌクレオチドに導入された２つの反応部位：５’−アミノ基および３’−アミノ基を含む。代替的な実施形態において、反応部位は、一級アミンの結合のための部位として、例えば、ピリミジンの５位、プリンの８位、またはリボースの２’位を使用して、内部の位置において導入され得る。このような実施形態において、核酸は、いくつかの活性化された部位または反応部位を有し得、多活性化されるといわれる。合成および精製の後、修飾オリゴヌクレオチドは、自発性加水分解を最小化しながら、オリゴヌクレオチド反応部位を用いる選択的反応を促進する条件下で、一活性化ＰＥＧと合わせられる。好ましい実施形態において、モノメトキシ−ＰＥＧは、スクシニミジルプロピオネートを用いて活性化され、カップリング反応はｐＨ ８．３で実行される。二置換ＰＥＧの合成を駆動するために、オリゴヌクレオチドと比較して化学量論的に過剰なＰＥＧが提供される。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体はゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製され、完全に結合体化された種、部分的に結合体化された種、および結合体化されていない種を分離する。

連結ドメインもまた、そこに結合された１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有し得る。このようなＰＡＧは、種々の長さであり得、および組成物の所望の分子量を達成するために適切な組み合わせで使用され得る。

特定のリンカーの効果は、その化学組成と長さの両方によって影響され得る。長すぎるか、短すぎるか、またはＩｇＥと好ましくない立体的および／もしくはイオン的相互作用を形成するリンカーは、アプタマーとＩｇＥの間の複合体の形成を妨げる。核酸の間の距離にわたるよりも長いリンカーは、リガンドの有効濃度を減少することによって結合安定性を減少し得る。従って、標的へのアプタマーの親和性を最大化するために、リンカーの組成および長さを最適化することがしばしば必要である。

本明細書に引用されるすべての刊行物および特許文書は、各々のこのような刊行物および文書が、参照により本明細書に援用されることが具体的にかつ個別に示されるように、参照により本明細書に援用される。刊行物および特許文書の引用は、いずれも適切な先行技術であることの認可として意図されず、またこれらの内容または日付に関してのいかなる認可も構成しない。本発明は、書かれた記載によって本明細書で説明されてきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、および前述の記載および以下の実施例が例示の目的のためであり、以下の特許請求の範囲の限定ではないことを認識している。

（実施例１：アプタマー選択および配列）
（実施例１Ａ：ｒＲｆＹ ＩｇＥアプタマーのｈ−ＩｇＥ選択）
ヒト骨髄腫血漿から精製したヒトＩｇＥ（本明細書以下「ｈ−ＩｇＥ」）を、Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）から購入した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を発現させ、および精製した。２’−Ｆピリミジンヌクレオチド、ならびに２’−ＯＭｅプリンおよびピリミジンオリゴヌクレオチドを、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。すべての他の一般的な試薬は、商業的な供給業者から購入した。１回の選択を、２’−ＯＨプリンおよび２’−Ｆピリミジンヌクレオチド（ｒＲｆＹ）からなるプールを使用して、ｈ−ＩｇＥに対するアプタマーを同定するために実行した。ｈ−ＩｇＥに対する直接的選択を実行し、ｈ−ＩｇＥに特異的な高親和性アプタマーを産生した。

プール調製。配列５’−

（配列番号５）を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。この鋳型を、プライマー５’

を用いて増幅し、次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を用いるインビトロ転写のための鋳型として使用した。転写を、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、０．００２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、４％ ＰＥＧ−８０００、１２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３ｍＭ ２’−Ｆ−ＣＴＰ、３ｍＭ ２’−Ｆ−ＵＴＰ、３ｍＭ ＧＴＰ、３ｍＭ ＡＴＰ、０．０１単位／ｍＬ 無機ピロホスファターゼ、およびＴ７ ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）、および約０．５μＭ 鋳型ＤＮＡを使用して行った、
選択。選択を、２×１０^１４分子の２’−Ｆピリミジン修飾ＡＲＣ２１２プール

（配列番号８）を１００ｐモルのｈ−ＩｇＥタンパク質とともに、最終容量１００μＬ選択緩衝液（１×ＳＨＭＣＫ：２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ ７．４）中で、室温にて１時間インキュベートすることによって開始した。ＲＮＡタンパク質複合体および未結合ＲＮＡ分子を、０．４５ミクロンニトロセルローススピンカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を使用して分離した。このカラムを１ｍＬ １×ＳＨＭＣＫ緩衝液でプレ洗浄し、次いで、プール：ＩｇＥ複合体を含む溶液をこのカラムに加え、そして１５００×ｇで２分間遠心分離した。フィルターを４００μＬ １×ＳＣＨＭＫで２回洗浄し、非特異的結合物を除去した（ラウンド１、２×４００μＬ １×ＳＨＭＣＫ；その後のラウンド、２×５００μＬ １×ＳＣＨＭＫ）。ＲＮＡを、２×２００μＬ溶出緩衝液（７Ｍ 尿素、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、あらかじめ９５℃に加熱）の添加により溶出した。その後のラウンドにおいて、ＲＮＡは２×１００μＬ溶出緩衝液で溶出した。

溶出したタンパク質を、ＲＮＡ混合物から、フェノール：クロロホルムを用いて抽出し、このプールＲＮＡを沈殿させた（２μＬ グリコーゲン、１体積イソプロパノール）。ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、配列番号７に従う３’プライマーを使用して、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡをＰＣＲ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５μＭ ５’プライマー（配列番号６）、０．５μＭ ３’プライマー（配列番号７）、０．５ｍＭ 各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））によって増幅した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。鋳型を、３７℃で一晩のα^３２Ｐ ＡＴＰボディー標識（４％ ＰＥＧ−８０００、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、１２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ スペルミジン、０．００２％ Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００、３ｍＭ ２’ＯＨプリン、３ｍＭ ２’−Ｆ ＣＴＰおよびＵＴＰ、２５ｍＭ ＤＴＴ、無機ピロホスファターゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）５μＣｉ α^３２Ｐ ＡＴＰ）を使用して転写した。反応物を、製造業者の説明書に従って、Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐ Ｓｐｉｎカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）を使用して脱塩し、１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ 尿素、１０％ アクリルアミド；１９：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド）上で精製した。

引き続くラウンドは、ネガティブ選択工程を加える以外は、ラウンド１と同じ方法を使用して反復した。タンパク質標的とのインキュベーションの前に、プールＲＮＡを、０．４５ミクロンニトロセルロースフィルターカラムに通して、フィルターに結合する配列を除去し、次いで、濾液を続いてポジティブ選択工程に供する。

代替的なラウンドにおいて、プールＲＮＡをゲル精製した。転写反応を５０ｍＭ ＥＤＴＡでクエンチし、およびエタノール沈殿させ、次いで、１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。プールＲＮＡを、電気溶出によって、Ｅｌｕｔｒａｐ（登録商標）装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）中で、２２５Ｖにて１時間、１×ＴＢＥ（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ、９０ｍＭ ホウ酸、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）中でゲルから取り出した。溶出した物質を、３００ｍＭ 酢酸ナトリウムおよび２．５体積のエタノールの付加によって沈殿させた。

ＲＮＡ濃度は、選択の全体を通してｈ−ＩｇＥ濃度を超えたままであった。タンパク質濃度は、最初の２ラウンドについては１μＭであり、次いで、引き続くラウンドの間により低い濃度に低下した（表１）。競合ｔＲＮＡをラウンド４の始めに０．１ｍｇ／ｍＬで結合反応に加えた。１０ラウンドの選択が完了した後で、プールを２つに分けた。ラウンド１１ａは、１０：１のプール対ｈ−ＩｇＥ濃度比率を有するポジティブ選択を用いて行った。ラウンド１１ｂおよび１２ｂにおいて、１００：１のＲＮＡ対ｈ−ＩｇＥ濃度比率を使用した。これは、より高い親和性の結合物に向けた選択を駆動する試みにおいてストリンジェンシーを増加させるために行った。表１は、各ラウンドについて使用したプールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度、およびｔＲＮＡ濃度、（もしあれば）使用したネガティブ選択工程、ならびに製造業者の推奨（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログ番号Ｎ３２３１Ｌ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に従ってロードした場合に１００ｂｐ ＤＮＡラダー（約４８ｎｇのＤＮＡ量）の１００ｂｐマーカーレーンの強度に等しい４％アガロースゲルＥ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上でのＰＣＲバンドを得るために必要とされるＰＣＲサイクルの数を含む選択の詳細を含む。

選択の進行は、ポジティブ選択の間にニトロセルロースフィルターから溶出したインプットプールＲＮＡのパーセンテージを測定することを介してモニタリングした。

（表１．（ｒＲｆＹ）を使用する選択の各ラウンドで使用した条件）

ｈ−ＩｇＥ結合分析。プールのタンパク質結合親和性をモニタリングするために、選択の全体を通してドットブロットアッセイを実行した。痕跡量の^３２Ｐ−標識プールＲＮＡをｈ−ＩｇＥと合わせ、最終容量２５μＬの１×ＳＨＭＣＫ緩衝液プラス０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ中で、３０分間、室温でインキュベートした。この混合物を、（上端から下端で）ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロットメンブレンを用いて組み立てた、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１ Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ，アクリル製）に適用した。タンパク質に結合するＲＮＡはニトロセルロースフィルター上に捕捉され；一方タンパク質に結合しないＲＮＡはナイロンフィルター上に捕捉される。ｈ−ＩｇＥの非存在下に対して、ｈ−ＩｇＥの存在下でのＲＮＡの結合の顕著な正の比率が見られた場合、製造業者の説明書に従ってＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してクローニングした。ラウンド１１ａプール鋳型をクローニングおよび配列決定し、８個の独特なクローンを、１点のドットブロットスクリーニング（＋／−２０ｎＭ ｈ−ＩｇＥ）においてアッセイした。ラウンド１２ｂプールをクローニングおよび配列決定し、４個の独特なクローンを、１点のドットブロットスクリーニング（＋／−２０ｎＭ ｈ−ＩｇＥ）におけるタンパク質結合についてアッセイした。スクリーニングされたクローンの各々について、２０ｎＭ ｈ−ＩｇＥにおける結合パーセント（バックグラウンドの上のシグナル）を、以下の表２における最も右のカラムに列挙する。これらの１２個のクローンについての配列を表３に列挙する。１点ドットブロットスクリーニングに基づいて、いくつかのクローンをＫ_Ｄ決定のために選択した。クローン転写物を、γ−^３２Ｐ ＡＴＰを用いて５’末端標識した。結合反応を上記のようなプール親和性をスクリーニングために使用したのと同じ条件下で調製した：痕跡量の^３２Ｐ−標識クローンをｈ−ＩｇＥの滴定と合わせ、最終容量２５μＬの１×ＳＣＨＭＣＫ緩衝液プラス０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ中で、３０分間、室温でインキュベートした。Ｋ_Ｄ値を、ドットブロットアッセイを使用して、式（ａｍｐｌ．１／（１＋Ｋ_Ｄ１／［ｈ−ＩｇＥ］）＋ａｍｐｌ．２／（１＋Ｋ_Ｄ２／［ｈ−ＩｇＥ］））＋バックグラウンドにフィットさせることによって、初期のスクリーニングにおける＋／−ｈ−ＩｇＥ結合比率＞２を有するすべての独特な配列について決定し；ここで、ａｍｐｌ．１およびａｍｐｌ．２は二相性飽和プロットの２つのフェーズについてのプラトー値を表し、Ｋ_Ｄ１およびＫ_Ｄ２は、得られるデータについての各相互作用についての解離定数を表す（カレイダグラフ（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ））。タンパク質結合特徴の結果を、表２において集計する。

（表２．クローン結合活性）

表３において特徴付けられたｒＲｆＹアプタマーの核酸配列を以下に示す。各アプタマーの独特な配列は、配列

の直後のヌクレオチド２５で開始し、３’固定核酸配列

に到達するまで続く。

他に注記されない限り、以下に列挙された個々の配列は、５’から３’の方向で表され、ｒＲｆＹ ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択した。ここで、プリン（ＡおよびＧ）は２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−フルオロである。ある実施形態において、本発明は、以下の表３に記載される核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、表３に記載されるアプタマーの核酸配列は、高分子量、非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴ（３Ｔ））修飾、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。

（表３．ｒＲｆＹアプタマーについての配列情報）

（実施例１Ｂ：ｄＲｍＹ ＩｇＥアプタマーの選択）
選択を、デオキシ−Ａ残基、デオキシ−Ｇ残基および２’Ｏ−メチルＣ残基、２’Ｏ−メチルＵ残基を含むＩｇＥアプタマー（ｄＲｍＹ組成物）を同定するために実行した。これは、疎水性プレート上に固定化されたｈ−ＩｇＥに対する直接的選択であった。この選択は、未処理の選択されていないプールに対する、ｈ−ＩｇＥ結合について有意に富化されたプールを産生した。

プール調製。配列５’−

（配列番号２３）を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。この鋳型を、

を用いて増幅し、次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を用いるインビトロ転写のための鋳型として使用した。転写を、２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％ ＰＥＧ−８０００、９．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．９ｍＭ ＭｎＣｌ_２、３０μＭ ＧＴＰ、２ｍＭ ｍＣＴＰ、２ｍＭ ｍＵＴＰ、２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＧＭＰ、２ｍＭ スペルミン、０．０１単位／μｌ 無機ピロホスファターゼ、およびＴ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を使用して行った。

（選択）１００μＬの１×ＰＢＳ中で、室温で１時間、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）疎水性プレートの表面に、２０ｐモルのｈ−ＩｇＥを固定化することによって、選択の各ラウンドを開始した。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡ）で５回洗浄した。ラウンド１において、１００ｐモルのプールＲＮＡ（６×１０^１３の独特な分子）を、ウェル中の１００μＬ結合緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡ）中で、固定化されたタンパク質標的とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液で５回洗浄した。引き続くラウンドにおいて、ネガティブ選択工程が含まれた；ポジティブ選択工程の前に、プールＲＮＡはまた、空のウェル中で室温で１時間インキュベートされ、プールから任意のプラスチック結合配列を除去した。ラウンド３を開始して、第２のネガティブ選択工程を導入して、非特異的結合物に対してさらに選択した；プールを、１００μｌブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で事前にブロックしたウェル中で１時間インキュベートした。前のラウンド３から、ポジティブ選択工程の前に、標的固定化ウェルを、１００μｌブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中で、室温で１時間ブロックした。すべての場合において、固定化したｈ−ＩｇＥに結合したプールＲＮＡを、ＲＴミックス（３’プライマー（配列番号２５）およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加、その後の６５℃で１時間のインキュベーションによって、選択プレート中で直接的に逆転写した。得られるｃＤＮＡをＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のための鋳型として使用した。６８℃アニーリング温度と共役した「ホットスタート」ＰＣＲ条件を、プライマー−ダイマー形成を最小化するために使用した。ＰＣＲ増幅は、製造業者の推奨（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログ番号Ｎ３２３１Ｌ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に従ってロードした場合に、４％アガロースゲルＥ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で１００ｂｐ ＤＮＡラダー（〜４８ｎｇのＤＮＡ量）の１００ｂｐマーカーレーンの強度に等しいＰＣＲバンドを得るために必要とされるサイクルの数（以下の表４の最後のカラムに報告される）で実行した。増幅したプール鋳型ＤＮＡを、製造業者の推奨する条件に従ってＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて脱塩し、次のラウンドの選択のためのプールＲＮＡの転写をプログラムするために使用した。転写したプールは、各ラウンドにおいて、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用してゲル精製した。以下の表４は、ｄＲｍＹアプタマー選択の各ラウンドについて使用される条件を示す。

（表４：ｄＲｍＹ組成物を使用する選択の各ラウンドにおいて使用される条件）

ｈ−ＩｇＥ結合分析：選択の進行は、サンドイッチフィルター結合アッセイを使用してモニターした。５’−^３２Ｐ標識プールＲＮＡ（痕跡濃度）を、ｈ−ＩｇＥ、１×ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡとともに、室温で３０分間インキュベートし、次いで、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）中のニトロセルロースおよびナイロンフィルターサンドイッチに適用した。ニトロセルロースに結合したプールＲＮＡのパーセンテージを、ラウンド６および７の後で、７点のスクリーニング（０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、４ｎＭ、１６ｎＭ、６４ｎＭおよび１２８ｎＭ ｈ−ＩｇＥ、標的なしのコントロールもまた実行した）を用いて計算した。プールＫ_Ｄ測定を、上記のように、タンパク質の滴定およびドットブロット装置を使用して測定した。

ｄＲｍＹ ｈ−ＩｇＥ選択は、６ラウンド選択後に、未処理のプールに対して、ｈ−ＩｇＥ結合について富化された。ラウンド６およびラウンド７において、プールＫ_Ｄはほぼ４ｎＭであった。ラウンド６プールは、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローニングし、３１個の個別の配列を生成した。３１個の配列、および２１個のシングルトンのうち８および３によって表される２つのドミナントクローンが存在した。図６は、ラウンド６および７のプールについてのｈ−ＩｇＥ濃度に対する結合した画分のプロットを示す。

（クローンのスクリーニング）Ｋ_Ｄ決定のために、２３個の独特な配列の各々のクローン転写物は、５’末端標識γ−^３２Ｐ ＡＴＰであった。Ｋ_Ｄ値をドットブロットアッセイにおいて８点のスクリーニング（０〜３００ｎＭ ｈ−ＩｇＥ、３倍の段階希釈）、および１×ダルベッコＰＢＳ；１．０ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ；０．１ｍｇ／ｍＬ 剪断サケ精子ＤＮＡ；および０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡの緩衝液条件を使用して決定した。解離定数（Ｋ_Ｄ）を、式：結合した画分ＲＮＡ＝振幅／（１＋Ｋ_Ｄ／［ｈ−ＩｇＥ］）＋バックグラウンドにデータをフィットさせて見積もった。これらの結合アッセイ条件下で、２３個の独特な配列からの２０個は有意な結合を示さなかった。配列番号４３および配列番号４６に従うクローンは、それぞれ、８７．７ｎＭおよび１０９．７ｎＭの解離定数を示した。

２３個の独特なクローンの各々は、異なるアッセイ条件下で、ｈ−ＩｇＥへの結合について続けて再試験した。クローンは、標準的な化学合成および脱保護の方法を使用して合成的に作製した。次いで、クローンを、ゲル電気泳動によって精製した。痕跡量の５’−^３２Ｐ−標識アプタマーを、３００ｎＭから開始するヒトＩｇＥの７つの減少濃度（３倍希釈）およびタンパク質なしのサンプルと合わせ、そしてｄＰＢＳ（Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含む）および０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中で、室温で３０分間インキュベートした。Ｋ_Ｄ値を、以前に記載されたようにドットブロットアッセイを使用して決定した。このアッセイを、各クローンについて３回反復した。平均結合パーセントを、各タンパク質濃度について計算し、平衡解離定数を式：

ここで、Ａ＝［アプタマー］_全体、Ｐ＝［タンパク質］_全体およびＢ＝バックグランドシグナル、を使用して計算した。

これらのアッセイ条件下で、配列番号４３および配列番号４６に従う核酸配列を有するクローンは、顕著に改善されたｈ−ＩｇＥへの結合を示し、２３個の独特な配列からの６個のさらなるクローンが、低いナノモル濃度範囲におけるｈ−ＩｇＥへの高親和性結合を示した。タンパク質結合特徴の結果は表５Ａに集計され、生成された２２個すべてのクローンは以下の表５Ｂに列挙される。

（表５Ａ：ｄＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を有する）、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中でのｄＲｍＹクローン結合活性）

表５Ｂにおける各アプタマーの独特な配列は、配列

（配列番号２６）の直後のヌクレオチド２３で開始し、
３’固定核酸配列

（配列番号２７）に到達するまで続く。

他に注記されない限り、以下に列挙された個々の配列は、５’から３’の方向で表され、ｄＲｍＹ ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択した。ここで、プリン（ＡおよびＧ）はデオキシであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−ＯＭｅである。ある実施形態において、本発明は、以下の表５Ｂに記載される核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、表５Ｂに記載されるアプタマーの核酸配列は、高分子量、非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴ（３Ｔ））修飾、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。

（表５Ｂ．ラウンド６プール（すべてｄＲｍＹ組成物）からの独特な配列）

（実施例１Ｃ：ｒＲｍＹ ｈ−ＩｇＥアプタマーの選択）
選択を、２’−リボＧ残基および２’−リボＡ残基ならびに２’−ＯメチルＣ残基および２’−ＯメチルＵ残基を含むｈ−ＩｇＥアプタマー（ｒＲｍＹ組成物）を同定するために選択を実行した。これは、疎水性プレート上に固定化されたｈ−ＩｇＥに対する直接的選択であった。この選択は、未処理の選択されていないプールに対する、ｈ−ＩｇＥ結合について有意に富化されたプールを産生した。

（プール調製。）配列５’−

（配列番号５１）を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。この鋳型を、

を用いて増幅し、次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を用いるインビトロ転写のための鋳型として使用した。転写を、２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％ ＰＥＧ−８０００、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、５００μＭ γＧＴＰ、５００μＭ γＡＴＰ、５００μＭ ｍＣＴＰ、５００μＭ ｍＵＴＰ、５００μＭ ＧＭＰ、０．０１単位／μＬ 無機ピロホスファターゼ、およびＴ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を使用して行った。

選択。１００μＬの１×ダルベッコＰＢＳ中で、室温で２時間、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に、２０ｐモルのｈ−ＩｇＥを固定化することによって、選択の各ラウンドを開始した。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液（１×ＤＰＢＳ、０．２％ ＢＳＡ、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。プールＲＮＡを３分間９０℃に加熱し、１０分間室温まで冷却して、再フォールディングした。ラウンド１において、ポジティブ選択工程を実施した。手短に述べると、１×１０^１４分子（０．２ｎモル）のプールＲＮＡを、ウェル中の１００μＬ結合緩衝液（１×ＤＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、固定化されたタンパク質標的ともに室温で１時間インキュベートした。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄した。引き続くラウンドにおいて、ネガティブ選択工程が含まれた。ポジティブ選択工程の前に、プールＲＮＡはまた、空のウェル中で室温で３０分間インキュベートされ、プールから任意のプラスチック結合性配列を除去した。洗浄の回数は、ストリンジェンシーを増加させるために、ラウンド４の後では、２回のさらなる１２０μｌの洗浄により増加された（全体で６×１２０μｌの洗浄）。すべての場合において、固定化したｈ−ＩｇＥに結合したプールＲＮＡを、ＲＴミックス（３’プライマー（配列番号５３）およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加、その後の６５℃で１時間のインキュベーションによって、選択プレート中で直接的に逆転写した。得られるｃＤＮＡをＰＣＲ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のための鋳型として使用した。６０℃アニーリング温度と共役した「ホットスタート」ＰＣＲ条件を、プライマー−ダイマー形成を最小化するために使用した。増幅したプール鋳型ＤＮＡを、製造業者の推奨する条件に従ってＣｅｎｔｒｉｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて脱塩し、次のラウンドの選択のためのプールＲＮＡの転写をプログラムするために使用した。転写したプールは、各ラウンド毎に、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用してゲル精製した。以下の表６は、ラウンドあたりのｒＲｍＹ選択プールｈ−ＩｇＥ使用を示す。

（表６：ラウンドあたりのｒＲｍＹプールおよびｈ−ＩｇＥ使用）

選択の進行は、サンドイッチフィルター結合アッセイを使用してモニターした。５’−^３２Ｐ標識プールＲＮＡを、９０℃で３分間再フォールディングし、１０分間、室温まで冷却した。次に、プールＲＮＡ（痕跡濃度）を、１×ＤＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ中のｈ−ＩｇＥとともに室温で３０分間インキュベートし、次いで、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）中のニトロセルロースおよびナイロンフィルターサンドイッチに適用した。ニトロセルロースに結合したプールＲＮＡのパーセンテージを、ほぼ３ラウンド毎に、単一の点のスクリーニング（＋／−２５０ｎＭ ｈ−ＩｇＥ）を用いて計算およびモニターした。プールＫ_Ｄ測定を、上記のように、タンパク質の滴定およびドットブロット装置を使用して測定した。

選択は、４ラウンド後に、未処理のプールに対して富化された。選択のストリンジェンシーは、２回のさらなる１２０μｌの洗浄によって増加され、選択は２回のさらなるラウンド継続した。ラウンド６において、プールＫ_Ｄはほぼ５００ｎＭであった。このプールは、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローニングし、個々のクローン配列を得た。ラウンド６プールは、配列決定した２４個のクローンの７１％を構成する、配列番号５６に従う核酸配列を有する１つのドミナントクローンを含んだ。このドミナントクローンは、複製で見られた３つのクローンと同様に、１２点のスクリーニング（２倍の段階希釈での０〜２５０ｎＭ ｈ−ＩｇＥ）を使用して、ｈ−ＩｇＥへの結合について試験した。３個の複製クローンは、ドミナントクローンよりも高い結合の程度を示したが、しかし、すべてのＫ_Ｄがほぼ５００ｎＭであった。９６個の配列のさらなるセットが得られ、ドミナントクローンは、第１の配列セットにおいては明らかではなかった８個の他の配列ファミリーとともに、９６クローンの４０％を構成する配列番号５６に従う核酸配列を有した。単一の点のスクリーニングを、さらなる独特な配列に対して実行した（＋／−２００ｎＭ ｈ−ＩｇＥ）。単一の点のスクリーニングに基づいて、Ｋ_Ｄは、１２点のスクリーニング（０〜４００ｎＭ ｈ−ＩｇＥ、２倍の段階希釈）を使用して、さらなる２４個のＫ_Ｄの配列について決定した。これらのクローンの各々についてのＫ_Ｄは１００ｎＭを超えており、これらのクローンに対するさらなる取り組みは終了した。以下の表７は、選択したｒＲｍｙクローンのヌクレオチド配列を示す。

各アプタマーの独特な配列は、配列

（配列番号５４）の直後のヌクレオチド２２で開始し、
３’固定核酸配列

（配列番号５５）に到達するまで続く。

他に注記されない限り、以下に列挙された個々の配列は、５’から３’の方向で表され、ｒＲｍＹ ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択した。ここで、プリン（ＡおよびＧ）は２’−ＯＨであり、ピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−ＯＭｅである。ある実施形態において、本発明は、以下の表７に記載されるような核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、表７に記載されるアプタマーの核酸配列は、高分子量、非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴ（３Ｔ））修飾、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。

（表７．ｒＲｍＹの独特なクローン配列の情報）

（実施例２：アプタマー修飾）
（実施例２Ａ：ｒＲｆＹ ＩｇＥクローンの最小化）
結合親和性を維持しながら、好ましくは、改善しながら、実施例１Ａにおいて上記に記載されたＩｇＥアプタマーを最小化するための取り組みを行った。ｈ−ＩｇＥ結合のために必要とされるコア構造エレメントを同定するために、高親和性ｈ−ＩｇＥ結合物のいくつかの３’境界を決定した。ＲＮＡ転写物を、γ−^３２Ｐ ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’−末端で標識した。放射性標識したリガンドを、部分的アルカリ加水分解に供し、次いで、５００ｎＭの溶液中でｈ−ＩｇＥに選択的に結合させ、ニトロセルロースフィルター上に分配した。保持されたオリゴヌクレオチドを、８％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ｈ−ＩｇＥに結合した最小のオリゴヌクレオチドは３’境界を規定した。選択されたクローンの３’−境界は表８に記載する。境界実験ならびに予想倍率の視覚的検査に基づいて、短縮型構築物を調製し、オリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に発注した。配列番号１１、配列番号１８、および配列番号２１に従う核酸配列を有する親のクローンの最小化バージョンは、以前に記載されたサンドイッチフィルター結合アッセイによって測定された、有意なタンパク質結合を示した。ミニマーの結合データは表８に示し、対応する配列を表９に示す。

（表８：ミニマー結合活性）

他に注記されない限り、以下に列挙された個々の配列は、５’から３’の方向で表され、ｒＲｆＹ ＳＥＬＥＸ（商標）条件下で選択した。ここで、すべてのプリン（ＡおよびＧ）は２’−ＯＨであり、すべてのピリミジン（ＣおよびＵ）は２’−フルオロである。ある実施形態において、本発明は、以下の表９に記載されるような核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、表９に記載されるアプタマーの核酸配列は、高分子量、非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴ（３Ｔ））修飾、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。

（表９：ｒＲｆＹ最小化アプタマーの配列）

（実施例２Ｂ：ｄＲｍＹ ＩｇＥクローンの最小化）
結合親和性を維持しながら、好ましくは、改善しながら、実施例１Ｂにおいて上記に記載されたｄＲｍＹ ＩｇＥアプタマーを最小化するための取り組みを行った。配列番号４３および配列番号４６に従う核酸配列を有するクローンについての予想倍率の視覚的検査に基づいて、最小化配列のパネルを設計した。最高の親和性分子、ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）は２３ヌクレオチド長であり、２２ｎＭのＫ_Ｄでｈ−ＩｇＥを結合した。データを表１０に要約する。表１１は、ＡＲＣ４４１〜ＡＲＣ４４７（配列番号９７〜１０３）、ならびに配列番号４３および配列番号４６に従う核酸配列を有するクローンから誘導された短縮型のヌクレオチド配列を示す。

（表１０：最小化されたｄＲｍＹ ｈ−ＩｇＥ結合物）

Ｋ_Ｄ測定は、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡの存在下で、２５℃で３０分間、１×ＰＢＳ中で実行した。

他に注記されない限り、以下に列挙された個々の配列は、５’から３’の方向で表され、ｄＲｍＹ ＳＥＬＥＸ（商標）で選択した。ここで、すべてのプリン（ＡおよびＧ）はデオキシであり、すべてのピリミジン（ＵおよびＣ）は２’−Ｏ−メチルである。ある実施形態において、本発明は、以下の表１１に記載されるような核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、表１１に記載されるアプタマーの核酸配列は、高分子量、非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴ（３Ｔ））修飾、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。

（表１１：配列番号４３および配列番号４６に従う核酸配列を有するクローンの短縮型）

（実施例２Ｃ：ドープ再選択：ＡＲＣ４４５）
ドープ再選択は、活性クローンまたはミニマー中での配列の要求性を探索するために使用する。ドープ再選択の間、選択は、単一の配列に基づいて設計された合成の縮重プールを用いて実行する。縮重のレベルは、通常、７０〜８５％までの野生型ヌクレオチドを変化させる。一般的に、ニュートラルな変異が観察され、ある場合において、配列の変化は、親和性の改善を生じ得る。次いで、複合性の配列情報を使用して、最小結合モチーフを同定し、およびアプタマー医薬品化学の取り組みを補助し得る。

最小化ｈ−ＩｇＥ結合配列ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）（実施例２Ｂに記載される）に基づくドーププールを使用する選択を、より高い親和性結合物を同定するために実行した。選択は、疎水性プレートの表面に固定化されたｈ−ＩｇＥに対してであり、複数のより長い洗浄（例えば、３０分間、６０分間、一晩）の組み合わせのようなより高い親和性のアプタマーに対して選択を駆動するように設計された技術を利用した。

（プール調製。）配列５’−

（配列番号１０４）を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。太字のヌクレオチドは、示された残基の８５％の可能性、および他の３つのヌクレオチドの１つである５％の可能性を有した。鋳型は、

で増幅され、次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６９３Ｆ）を用いるインビトロ転写のための鋳型として使用した。転写を、２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％ ＰＥＧ−８０００、９．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．９ｍＭ ＭｎＣｌ_２、３０μＭ ＧＴＰ、２ｍＭ ｍＣＴＰ、２ｍＭ ｍＵＴＰ、２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＧＭＰ、２ｍＭ スペルミン、０．０１単位／μｌ 無機ピロホスファターゼ、およびＴ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を使用して行った。

（選択。）１００μＬの１×ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中で、室温で１時間、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に、２０ｐモルのｈ−ＩｇＥを固定化することによって、選択の各ラウンドを開始した。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬ １×ダルベッコＰＢＳで２回洗浄した。ウェルを、１００μＬブロッキング緩衝液（１×ダルベッコＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ サケ精子ＤＮＡ、および０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）を加えること、および室温で１時間インキュベートすることによってブロックした。上清を除去し、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液で２回洗浄した。ラウンド２で開始して、空のウェルへのネガティブ結合インキュベーション、およびＢＳＡでブロックしたウェルへのネガティブ結合インキュベーションを、両方とも、ＲＮＡプールのために実行した。ポジティブ選択を、１００μＬ １×ダルベッコＰＢＳ中の１００ｐモルのプールＲＮＡを標的ウェルに加えることによって実行した。０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡおよび０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡもまた、ポジティブ選択に加えた。室温で１時間のインキュベーション後、上清を除去し、以下の表１２に概説されるように、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液（１×ＤＰＢＳ）を用いて５回洗浄した。さらなる選択を、ラウンド３およびラウンド４において選択されたプールを分岐することによって加えた。これらは、選択のストリンジェンシーを増加させるためにより長い洗浄を用いて行った。

ＲＮＡを、１００μｌ反応量のＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、配列番号５に従う３’プライマー配列を使用して、６５℃で３０分間逆転写した。ｃＤＮＡを、ＰＣＲ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５μＭ ５’プライマー（配列番号５２）、０．５μＭ ３’プライマー（配列番号１０５）、０．５ｍＭ 各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））によって、製造業者の推奨（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログ番号Ｎ３２３１Ｌ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に従ってロードした場合に、４％アガロースゲルＥ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で、１００ｂｐ ＤＮＡラダー（約４８ｎｇのＤＮＡ量）の１００ｂｐマーカーレーンの強度に等しいＰＣＲバンドを得るために必要とされるＰＣＲサイクルの数を使用して増幅した（表１２、最後のカラム）。次いで、ＰＣＲ産物を、Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐ Ｓｐｉｎカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を使用して脱塩した。鋳型を、２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％ ＰＥＧ−８０００、９．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．９ｍＭ ＭｎＣｌ_２、３０μＭ ＧＴＰ、２ｍＭ ｍＣＴＰ、２ｍＭ ｍＵＴＰ、２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＧＭＰ、２ｍＭ スペルミン、０．０１単位／μｌ 無機ピロホスファターゼ、およびＴ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）を使用して、３７℃で一晩転写した。引き続くラウンドのためのＲＮＡは、１０％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。以下の表１２は、ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）についてのドープ再選択プロフィールの要約を示す。

（表１２．ＡＲＣ４４５ドープ再選択プロフィール）

すべての洗浄条件からの最終選択ラウンドからのＤＮＡ、ならびに非ストリンジェント選択からのラウンド２および３からのＤＮＡを、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を使用してクローニングした。合成しおよびｈ−ＩｇＥへの特異的結合について試験するために、上記の実施例１Ｂにおいて以前に記載されたドットブロットアッセイおよび条件を使用して７個の配列を選択した。試験した７個のクローンのいずれも、ｈ−ＩｇＥへのいかなる有意な結合も示さなかった。表１３は、ＡＲＣ４４５ドープ再選択からのクローンの配列を示す。

他に注記されない限り、以下に列挙された個々の配列は、５’から３’の方向で表され、ｄＲｍＹ ＳＥＬＥＸ（商標）下で選択した。ここで、すべてのプリン（ＡおよびＧ）はデオキシであり、ピリミジン（ＣおよびＵ）は２’−Ｏ−メチルである。ある実施形態において、本発明は、以下の表１３に記載されるような核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、表１３に記載されるアプタマーの核酸配列は、高分子量、非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴ（３Ｔ））修飾、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。

（表１３．ＡＲＣ４４５ドープ再選択からのクローンの配列）

（実施例２Ｄ：ＤＮＡ ＩｇＥアプタマーのドープ再選択）
ｈ−ＩｇＥ結合配列Ｄ．１７．４

（配列番号１１３）（その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，６８６，５９２号）に基づくドーププールを使用する選択を、より高い親和性結合物を同定するために実行した。選択は、疎水性プレートの表面に固定化されたｈ−ＩｇＥに対してであり、複数のより長い洗浄（例えば、３０分間、６０分間、一晩）の組み合わせのようなより高い親和性のアプタマーに対して選択を駆動するように設計された技術を利用した。この実験は、ｈ−ＩｇＥについて親和性の増加を有する多数のＤ１７．４誘導体を生じた。

（プール調製。）配列

（配列番号１１４）を有するＤＮＡ鋳型（ＡＲＣ２７３）、ここで、プライマー結合部位が小文字で表され、太字のヌクレオチドは、示された残基の８５％の可能性、および他の３つのヌクレオチドの１つである５％の可能性を有した。この鋳型をＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。プールを、

を用いて、標準的な条件を使用して増幅した（ここで、リボアデノシンについてのｒＡ鎖はＰＣＲ後のプライマー切断を可能にし、鋳型のバンドおよびプールのバンドがゲルによって分離されることを可能にする）。この産物をアルカリ加水分解（２００ｍＭ ＮａＯＨ、９０℃、１５分間）に供し、続いてイソプロパノールを用いる沈殿を行った。鎖を８％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、より低い移動度で移動したｓｓＤＮＡプールをゲルから切り出した。

１００μＬの選択緩衝液（１×ＳＣＨＭＫ；実施例１Ａを参照のこと）中で、室温で１時間、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に、２０ｐモルのｈ−ＩｇＥを固定化することによって、選択の各ラウンドを開始した。次いで、上清を除去し、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液（１×ＳＣＨＭＫ、０．２％ ＢＳＡおよび０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。ウェルを、１００μＬブロッキング緩衝液（１×ＳＣＨＭＣＫ、１％ ＢＳＡ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えること、および室温で１時間インキュベートすることによってブロックした。上清を除去し、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄した。ラウンド１において、１００μＬ選択緩衝液中の８０ｐモルのプールＤＮＡ（１．５×１０^１３の独特な分子）を、ネガティブ選択工程として、室温で１時間、ブランクウェル中でインキュベートして、非特異的結合物を排除した。次いで、上清を除去し、１×ＳＣＨＭＫ中の１２μＬの９．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを加え、この混合物を、標的タンパク質を含むウェルに移した。室温で１時間のインキュベーション後、上清を除去し、ウェルを１２０μＬ洗浄緩衝液で複数回洗浄した。以下の表１４は、ドープ再選択についての選択条件を示す。

（表１４．ラウンドおよび洗浄の関数としての選択ストリンジェンシー）

すべての場合において、固定化したｈ−ＩｇＥに結合したプールＤＮＡを、ホット溶出緩衝液（７Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ ５、３ｍＭ ＥＤＴＡ）の２×１５０μＬ洗浄で溶出し、イソプロパノールの添加によって沈殿させ、次いで、ＰＣＲにより増幅した。ラウンド１の後に溶出したＤＮＡを、標準的な条件を使用して、配列番号１１５および配列番号１１６に従って５’プライマーおよび３’プライマーを使用して、初期のＤＮＡドーププール増幅のために上記のように、増幅および精製した。ラウンド２〜４については、溶出したＤＮＡは、配列番号１１５および

（配列番号１１７）に従う５’プライマーおよび３’プライマーを使用して増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をフェノールで抽出し、エタノールで沈殿した。次いで、ＤＮＡを、３００ｐモルのニュートラビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の添加を伴う５〜１０μｌの１×ＳＣＨＭＫ緩衝液中に再懸濁し、３０分間室温でインキュベートし、続いて１０μｌのホルムアミドローディング色素の添加、および８％変性ポリアクリルアミドゲル上での分離を行った。ビオチン−ニュートラビジン複合体は変性を通してインタクトなままであり、センスＤＮＡ鎖と比較して、アンチセンスＤＮＡ鎖の移動度を顕著に減少させる。従って、これらの鎖は分離され、より高い移動度で移動する所望のｓｓＤＮＡプールメンバーをゲルから切り出し、次のラウンドの選択に供する。

選択ラウンド３および５の後で、プール鋳型を、配列番号１１５および

（配列番号１１８）（これは完全に未修飾のＤＮＡである）に従う５’プライマーおよび３’プライマーを使用して再増幅し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローニングした。８４個の個別の配列が生成した。プライマー結合配列を有さない個々のクローンを調製し、実施例１Ａにおいて以前に記載されたドットブロットアッセイの設定および条件を使用して、５ｎＭおよび５０ｎＭで、ｈ−ＩｇＥ結合についてスクリーニングした。この初期のスクリーニングにおける以下の配列番号：配列番号１２５、配列番号１３７、および配列番号１３８に従う核酸配列を有する３つのクローンは、ｈ−ＩｇＥへのいかなる結合も示さなかった。初期のスクリーニングにおいて同定された最良の結合物についてのＫ_Ｄを、ｈ−ＩｇＥの滴定（３０ｐＭ〜３０ｎＭ、３倍希釈）を使用して決定した（表１５）。いくつかのクローンは、親の配列、Ｄ１７．５（配列番号１１３）に対して改善された結合を示した。配列番号１４０に従う核酸配列を有するクローンは、親の配列Ｄ１７．４（配列番号１１３）と比較して、最も顕著な親和性の改善を示した。興味深いことに、配列番号１４０に従う核酸配列を有するクローンとクローンＤ１７．４（配列番号１１３）に従う核酸配列を用いるクローンとの間の違いは全くわずかであり、これは、Ｄ１７．４アプタマー（配列番号１１３）のループ領域に直接的に隣接する、提案されたワトソン／クリックステムにおいてのみの変化を含んだ。再選択からの独特なクローンのほぼすべてが（配列番号１４０に従う核酸配列を有するクローンを含む）、Ｄ１７．４のＧ８−Ｃ３０塩基対において変異を獲得した。この変異は、Ａ８−Ｔ３０またはＣ８−Ｇ３０のいずれかになった。このことは、Ｇ８−Ｃ３０の場合における５’−鎖−カルボニル／３’鎖−アミノから、Ａ８−Ｔ３０とＣ８−Ｇ３０の両方の場合における５’−鎖−アミノ／３’−鎖カルボニルまでの対合する位置において、へリックスの主溝において提示される官能基に効果的にスイッチを入れさせる。次いで、最高の親和性クローン（配列番号１４０に従うクローン以外）を、それら自体のループ配列（残基９〜２９）および配列番号１４０（残基１〜８および３０〜３７）に従う核酸配列を有するクローンのステムに基づく最適ステム配列を用いて、再設計した。Ｃ４−Ｃ３４誤対合は、最適化された配列番号１４０ステム中でＧ４−Ｇ３４に戻った。以下の表１５は、選択したＤＮＡアプタマーのヌクレオチド配列の長さおよび親和性を示す。表１６は、選択したＤＮＡアプタマーのヌクレオチド配列を示す。

（表１５．選択したＤＮＡアプタマーの長さおよび結合親和性）

以下に記載されたＤＮＡアプタマーについては、ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）はデオキシである。他に注記されない限り、個々の配列は５’から３’の方向で表される。ある実施形態において、本発明は、以下の表１６に記載される核酸配列を有するアプタマーを含む。他の実施形態において、表１６に記載されるアプタマーの核酸配列は、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴ（３Ｔ））修飾、修飾、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。

（表１６．ＤＮＡ ｈ−ＩｇＥドープ再選択アプタマー配列情報（クローン配列はプライマー領域なしで列挙される））

（実施例２：血漿安定性の増加およびインビトロ親和性の増加のためのＡＲＣ４５５のアプタマー医薬品化学）
ＡＲＣ４５５（配列番号１０１）の高度に安定かつ強力な改変体を、アプタマー合成、精製および結合活性のアッセイの複数のフェーズを含む、系統的合成アプローチを通して同定した。２’−デオキシ含有残基の２’−Ｏメチル含有残基での系統的置き換えなどの修飾は、血漿のヌクレアーゼ耐性および全体的な安定性の顕著な増加を達成するために使用される基本的アプローチであった。

ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）に導くクローンのスクリーニングおよび最小化のプロセスの間、結合（以前に記載されたドットブロットアッセイによって測定される）、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよびヒスタミン放出アッセイ（以下の実施例３において記載される）におけるアプタマーの相対的強度の間に優秀な一致が存在した。従って、試験改変体の大部分を、相対的強度の指標として、ドットブロット結合アッセイにおいてｈ−ＩｇＥ結合親和性について試験した。Ｋ_Ｄ決定のために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２Ｐ ＡＴＰを用いて５’末端標識し、そして完全なヒトｈ−ＩｇＥへの直接的結合について試験した。８点のタンパク質滴定（｛１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、０ｐＭ｝または｛１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、０ｐＭ｝のいずれか）を、以前に記載されたドットブロット結合アッセイにおいて、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含む）中で、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを用いて、室温で３０分間使用した。Ｋ_Ｄ値を、カレイダグラフ（カレイダグラフｖ．３．５１，Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、式 ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔにフィットさせることによって計算した。合成され、精製されおよびｈ−ＩｇＥへの結合についてアッセイされたＡＲＣ４４５誘導体の配列、ならびにタンパク質結合の特徴付けの結果を、表１７において以下に集計する。

デオキシ含有残基の２’−Ｏメチル含有残基を有する残基での置き換えのプロセスにおける第１の工程は、ＡＲＣ１２５０〜ＡＲＣ１２６４（配列番号１５８〜１７２）の合成およびその結合活性についてのアッセイであった。これらの各々は、３’−逆位−ｄＴ（３Ｔ）の付加および単一の２’−デオキシ残基の２’−Ｏメチル残基での置き換えを有するＡＲＣ４４５に等価である。表１７における結合データから見られ得るように、ある位置は、デオキシ残基の２’−Ｏメチル残基に対する置換を容易に許容するのに対して、他の位置はそうではない。興味深いことに、２’−デオキシ残基の２’−Ｏメチル残基による置き換えは、１０位における親和性の顕著な改善を付与した（ＡＲＣ１２５６）（配列番号１６４）。

アプタマー医薬品化学プロセスのフェーズ１からの構造活性相関（ＳＡＲ）の結果に基づいて、第２のシリーズのアプタマーを設計し、合成し、精製し、およびｈ−ＩｇＥへの結合について試験した。これらおよびすべての続く分子について、１ｎＭ未満またはよりよい親和性（Ｋ_Ｄ）を保持した分子を、さらなるアプタマー設計ストラテジーに到達する際に使用した。ＡＲＣ１３３２〜ＡＲＣ１３３７（配列番号１７３〜１７８）を生じたフェーズ２において、フェーズ１からのデータを使用して、もっぱら２’−Ｏメチル置換を使用するより高度に修飾された複合分子を設計した。安定化ホスホロチオエート含有連結の付加もまた試験した。単純な結合親和性によるこれらの最良のものは、ＡＲＣ１３３５（配列番号１７６）であった。

アプタマー医薬品プロセスのフェーズ３（ＡＲＣ１３８２〜ＡＲＣ１３８４、配列番号１７９〜１８１）およびフェーズ４（ＡＲＣ１５７２〜１５７３、配列番号１８２〜１８３）において、ＡＲＣ１３３５（配列番号１７６）の関係におけるさらなるホスホロチオエート修飾の効果を試験した。ホスホロチオエートの中間体の数と最高の親和性の間の最良のバランスをとるように見えるこれらの制限されたシリーズからの分子は、ＡＲＣ１３８４（配列番号１８１）であった（図７を参照のこと）。

ＡＲＣ４４５およびその誘導体の合成の間、ＡＲＣ４４５のマルチマー凝集物に対応するように見えるピークが、イオン交換ＨＰＬＣ上で観察された。図８は、ＡＲＣ４４５およびいくつかの誘導体のＨＰＬＣ追跡分析の例であり、これは、アプタマー凝集物に起因する複数のピークを示す。ＡＲＣ４４５は、６〜９位および１６〜２１位のグアノシン残基の２つのランを含む。理論によって束縛されることを意図しないが、これらのランのいずれかまたは両方は、アプタマー凝集の原因であり得る。臭化エチジウム蛍光が二重鎖ＲＮＡおよびＤＮＡへの結合の際に増加されるほとんど同じやり方で、Ｎ−メチルメソポルフィリンＩＸ（ＮＭＭ）蛍光は、Ｇカルテット構造への結合の際に増加されることが報告されている（Ａｒｔｈａｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（１６）：３７２４（１９９６）；Ｍａｒａｔｈａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（９）：１９６９（２０００）；Ｊｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，５８（７）：８３１（２００４））。従って、図９に示されるように、本発明者らは、ＡＲＣ４４５が実際にＧカルテット構造を採用することを確立するためにＮＭＭ蛍光を使用した。文献のプロトコールに従って、マグネシウムおよびカルシウムを含むダルベッコＰＢＳ中の約１μＭ ＮＭＭおよび約２μＭアプタマーを含む１００μｌ反応を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ蛍光プレートリーダーを使用して分析した。蛍光発光スペクトルを、４０５ｎｍの励起波長を用いて、５５０〜７５０ｎｍで収集した。抗トロンビンＤＮＡアプタマーＡＲＣ１８３のＧカルテット構造は、文献中で長い間確立されており（Ｍａｃａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：３７４５（１９９３））、従って、この実験におけるポジティブコントロールとして使用した（図１０）。図１０に示すＡＲＣ１３４６は、Ｇカルテット構造を有することが予想されないＡＲＣ４４５の類似のサイズおよびヌクレアーゼ組成のアプタマーであり、それゆえに、実験におけるネガティブコントロールである（図１０）。図９および１０において見られ得るように、ＡＲＣ１８３およびＡＲＣ４４５は、ＮＭＭ単独と比較してＮＭＭ蛍光の顕著な増加を示したのに対して、ネガティブコントロール、ＡＲＣ１３４６はそのような増加を示さなかった。

ｄＧをｄＧアナログで置換すること、およびＮＭＭ蛍光アッセイにおいて「Ｇカルテット」シグナルの最小化についてスクリーニングすることに加えて、アプタマーは、ｄＧアナログがｈ−ＩｇＥについての親和性を改善し、およびこれによる効力を改善したか否かを試験するために、ドットブロットアッセイおよび以前に記載された結合条件（ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）＋０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、室温で３０分間）を使用して、結合についてスクリーニングした。試験した第１のアナログは、デオキシ−７−デアザＧであった。プリン塩基上の７位の窒素を炭素によって置き換えて、Ｇカルテット中でのＧ：Ｇ対合のために必要である水素結合アクセプターを効率的に除去する。フェーズ５．１（配列番号１８４〜２０１）において、ＡＲＣ４４５における各々の個々のＧを７−デアザＧで置き換える。図８および図９において見られ得るように、１８〜２０位におけるＧ Ｎ−７の除去は（ＡＲＣ９０９〜９１１、配列番号１９１〜１９３）、ＨＰＬＣおよびＮＭＭ蛍光によって観察されるアプタマー凝集を完全に除去した。しかし、これらの置換はまた、図１１において示される結合曲線によって実証されるように（表１７において報告されるＫ_Ｄ値もまた参照のこと）、ｈ−ＩｇＥへの結合を完全に除去する。ＡＲＣ９１２（配列番号１９４）はまた、ＨＰＬＣ凝集の顕著な減少を示し、ｈ−ＩｇＥへのある程度の結合を保持した。ＡＲＣ１９２（配列番号１９４）についての結合の結果およびＨＰＬＣに基づいて、３：２１位におけるｍＣ：ｄＧ対は、マルチマー性凝集を減少させるための試みにおいて、２１位においてｄＧを有さない別のワトソン／クリック対合で置換した。これは、ＡＲＣ１２４４〜ＡＲＣ１２４９（配列番号１９５〜２００）において行ったが、ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）になお比較可能である親和性を有するいかなるアプタマーも産生せず、従って、ＡＲＣ４４５の修飾についてのオプションとして取り下げた。

いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、ｄＧの７−デアザ−Ｇでの置換は、凝集現象の可能性のある原因は１６〜２１位のより長いＧランであること、および試験された残基の多くにおけるＮ−７位が、直接的水素結合相互作用を通して、またはアプタマーの機能的フォールディングを促進するアプタマーそれ自体における他の残基との相互作用を通してのいずれかで、ｈ−ＩｇＥへの高親和性結合のために必要とされ得ることの洞察を提供した。

アプタマー医薬品化学プロセスのフェーズ５．２において（配列番号２０１〜２１１）、ｄＧは、ＡＲＣ１３３５（配列番号１７６）の状況でデオキシイノシンで置換した。デオキシイノシンは、デオキシグアノシンにおいて見い出される環外アミンを欠くので、単一のアミノ〜Ｎ７の水素結合は、各ｄＧについて、潜在的なＧカルテットから、ｄＩ置換まで除去される。ＡＲＣ１５４８、１５５２〜１５５５、および１５６２〜１５６７（それぞれ配列番号２０１〜２１１）についての結合アッセイは、ｄＧの、ｄＩ置換へのＳＡＲ関連性が、ｄＧの７−デアザ−Ｇ置換へのその関連性からほぼ完全に逆転したことを明らかにした。ｄＩシリーズにおいて、置換は、６〜９位で許容されなかったのに対し、これらは１６〜２１位では中程度〜非常に良好に許容された。

フェーズ５．２からの結果は、ＡＲＣ１３８４の状況において、複数のｄＧからｄＩへの置換を含む複合分子の設計に導いた。フェーズ５．３（配列番号２１２〜２１９）からの結果は、ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）およびＡＲＣ１３８４（配列番号１８１）を比較して、非常に改善された親和性を有する多数のアプタマーを産生した。例えば、ＡＲＣ１６６６（配列番号２１６）は、図１２において示されるように、ＮＭＭ蛍光によってアッセイされるようなＧカルテット形成を顕著に減少することも示した。

ある実施形態において、本発明は、以下の表１７に記載されるような核酸配列を有するアプタマーを含む。ある実施形態において、以下の表１７に記載されるアプタマーの核酸配列は、欠いている場合、高分子量、非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））修飾、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表１７に記載される核酸配列は、示される３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））を欠く。小文字「ｆ」、「ｍ」および「ｄ」は、２’−フルオロ、２−Ｏ−メチル、およびデオキシ修飾をそれぞれ示す。「ｓ」は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート置換を示し、「Ｉ」はグアノシン代わりのイノシン置換を示す。

（表１７：ＡＲＣ４４５修飾誘導体の配列および結合親和性）

（実施例２Ｆ：ＡＲＣ６５６アプタマー医薬品化学）
ＡＲＣ６５６（配列番号１５７）の高度に安定かつ強力な改変体（実施例２Ｄにおいて記載される）を、アプタマー合成、精製および結合活性のアッセイの複数のフェーズを含む、系統的合成アプローチを通して同定した。２’−デオキシ含有残基の２’−Ｏメチル含有残基での系統的置き換えは、血漿ヌクレアーゼ耐性および全体的な安定性の顕著な増加を達成するために使用される基本的アプローチであった。

ＡＲＣ６５６（配列番号１５７）に導くクローンのスクリーニングおよび最小化のプロセスの間、結合（以前に記載されたドットブロットアッセイによって測定される）、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよびヒスタミン放出アッセイ（以下の実施例３において記載される）におけるアプタマーの相対的強度の間に優秀な一致が存在した。従って、ドットブロットアッセイ結合アッセイにおいて測定したｈ−ＩｇＥについての試験改変体の結合親和性を使用して、合成したアプタマーの大部分の相対的効力を特徴付けした。Ｋ_Ｄ決定のために、化学合成されたアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２Ｐ ＡＴＰを用いて５’末端標識し、そして完全なヒトｈ−ＩｇＥへの直接的結合について試験した。８点のタンパク質滴定｛３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭ、０ｐＭ｝を、ドットブロット結合アッセイにおいて、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含む）中で、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを用いて使用した。Ｋ_Ｄ値を、カレイダグラフ（カレイダグラフｖ．３．５１，Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、式 ｙ＝（ｍａｘ／（１＋Ｋ／タンパク質））＋ｙｉｎｔにフィットさせることによって計算した。合成され、精製されおよびｈ−ＩｇＥへの結合についてアッセイされたＡＲＣ６５６誘導体の配列、ならびにタンパク質結合の特徴付けの結果を、表１８において以下に集計する。

デオキシ含有残基の２’−Ｏメチル含有残基を有する残基での置き換えのプロセスにおける第１の工程は、ＡＲＣ１２６５〜ＡＲＣ１３０６（配列番号２２０〜２６１）の合成およびその結合活性についてのアッセイであった。これらの各々は、単一の２’−デオキシ残基の２’−Ｏメチル残基での置き換えを有するＡＲＣ６５６に等価である。表１８における結合データから見られ得るように、ある位置は、２’−Ｏメチル残基に関するデオキシ残基の置換を容易に許容するのに対して、他の位置はそうではない。ＡＲＣ６５６の提案されたステム領域は、デオキシ含有残基の２’−Ｏメチル残基での置換を最高に許容した。加えて、フェーズ１は、アプタマーのステム領域中で、デオキシから２’−Ｏメチルへのいくつかのブロック置換を含んだ。

アプタマー医薬品化学設計のフェーズ１からの構造活性相関（ＳＡＲ）の結果に基づいて、第２のシリーズのアプタマーを設計し、合成し、精製し、およびｈ−ＩｇＥへの結合について試験した。安定化ホスホロチオエート含有連結の付加（ＡＲＣ１３９１（配列番号２６６）およびＡＲＣ１４１７（配列番号２９２））もまた試験した。単純な結合親和性によるこれらの最良のものは、ＡＲＣ１４１０（配列番号２８５）であった。試験した多くの構築物は、ｈ−ＩｇＥについての比較的高い親和性結合を保持することが明らかであるが、それらのいくつかは親の化合物ＡＲＣ６５６（配列番号１５７）に対して等価である親和性を保持する。

ある実施形態において、本発明は、以下の表１８に記載されるような核酸配列を有するアプタマーを含む。ある実施形態において、以下の表１８に記載されるアプタマーの核酸配列は、欠いている場合、高分子量、非免疫原性化合物（例えば、ＰＥＧ）への化学カップリングおよび／または結合体化を容易にするための、３’キャップ（例えば、逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））、および／または５’アミン（ＮＨ_２）修飾をさらに含む。他の実施形態において、表１８に記載される核酸配列は、示される３’キャップ（例えば、３’逆位ｄＴキャップ（３Ｔ））を欠く。ヌクレオチドの略号Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴに先行する小文字「ｆ」「ｍ」および「ｄ」は、２’−フルオロ、２−Ｏ−メチル、およびデオキシ修飾をそれぞれ示し、「ｓ」は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート置換を示す。

（表１８：ＡＲＣ６５６修飾誘導体の配列および結合親和性）

（実施例２Ｇ：アプタマー−５’−ＰＥＧ結合体の合成）
オリゴヌクレオチド

（ＡＲＣ１６６６、配列番号２１６）は、ＡＫＴＡ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００合成装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で、推奨される製造業者の手順に従って、標準的な市販の２’−ＯＭｅ ＲＮＡ、デオキシイノシンおよびＤＮＡホルホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）ならびに逆位デオキシチミジンＣＰＧ支持体を使用して合成した。末端アミン官能基は、５’−アミノ−修飾剤Ｃ６−ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて結合した。脱保護後、オリゴヌクレオチドを、Ｓｕｐｅｒ Ｑ ５ＰＷ（３０）レジン（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、そしてエタノール沈殿した。

５’−アミン修飾アプタマーのアリコートを、異なるＰＥＧ部分（例えば、４０ｋＤａ、６０ｋＤａのＰＥＧ部分）に、合成後に結合体化した。アプタマーを、１．５〜３ｍＭの間の濃度まで、水／ＤＭＳＯ（１：１）溶液中に溶解した。炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ８．５を、１００ｍＭの最終濃度まで加え、オリゴを、等容量のアセトニトリルに溶解した所望のＰＥＧ試薬（例えば、４０ｋＤａ Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＧＬ２−４００ＮＰ ｐ−ニトロフェニル炭酸エステル［ＮＯＦ Ｃｏｒｐ，Ｊａｐａｎ］、４０ｋＤａまたは６０ｋＤａ ｍＰＥＧ２−ＮＨＳエステル［Ｎｅｋｔａｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ］）の１．７〜３倍モル濃度過剰とともに一晩反応させた。得られる４０ｋＤａまたは６０ｋＤａ ＰＥＧ化生成物を、Ｓｕｐｅｒ Ｑ ５ＰＷ（３０）レジン（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ３００−Ｓレジン（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）上で実行される逆相クロマトグラフィーを使用して脱塩し、そして凍結乾燥した。

得られるＰＥＧ化アプタマー配列を以下の表１９に列挙する。小文字「ｆ」、「ｍ」、および「ｄ」は、それぞれ、２’−フルオロ、２−Ｏ−メチル、およびデオキシ修飾を示し、「ｓ」はヌクレオチド間ホスホロチオエート置換を示す。「Ｉ」は、グアノシンの代わりのイノシン置換を示し、「ＮＨ」は化学カップリングを容易にするためのアミンを示し、および「３Ｔ」は３’逆位ｄＴを示す。

（表１９．抗ＩｇＥアプタマーＡＲＣ１６６６の５’ＰＥＧ結合体）

５’ＰＥＧ化は、以下の実施例３において記載される細胞ベースのアッセイによって測定されるアプタマー機能に対して、ほとんど効果を有さないか、または全く効果を有さなかった。

（実施例２Ｈ：アプタマー−３’−５’−ＰＥＧ結合体の合成）
オリゴヌクレオチド

（ＡＲＣ１７８４、配列番号２９７）は、ＡＫＴＡ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００合成装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で、推奨される製造業者の手順に従って、標準的な市販の２’−ＯＭｅ ＲＮＡ、デオキシイノシンおよびＤＮＡホルホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）ならびに３’−フタルイミド−アミノ−修飾剤Ｃ６ ＣＰＧ支持体（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用して合成した。末端アミン官能基は、５’−アミノ−修飾剤Ｃ６−ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて結合した。脱保護後、オリゴヌクレオチドを、Ｓｕｐｅｒ Ｑ ５ＰＷ（３０）レジン（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、そしてエタノール沈殿した。

３’−５’−ジアミン修飾アプタマーのアリコートを、異なるＰＥＧ部分（例えば、２０ｋＤａおよび３０ｋＤａのＰＥＧ部分）に、合成後に結合体化した。アプタマーを、１．５〜３ｍＭの間の濃度まで、水／ＤＭＳＯ（１：１）溶液中に溶解した。炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ８．５を、１００ｍＭの最終濃度まで加え、オリゴを、等容量のアセトニトリルに溶解した所望のＰＥＧ試薬（例えば、２０ｋＤａまたは３０ｋＤａ Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＧＬ２−４００ＮＰ ｐ−ニトロフェニル炭酸エステル［ＮＯＦ Ｃｏｒｐ，Ｊａｐａｎ］）の２．７〜３．５倍モル濃度過剰とともに一晩反応させた。得られる２×２０ｋＤａまたは２×３０ｋＤａ ＰＥＧ化生成物を、Ｓｕｐｅｒ Ｑ ５ＰＷ（３０）レジン（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ３００−Ｓレジン（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）上で実行される逆相クロマトグラフィーを使用して脱塩し、そして凍結乾燥した。

得られる二ＰＥＧ化アプタマー配列を以下の表２０に列挙する。小文字「ｆ」、「ｍ」、および「ｄ」は、それぞれ、２’−フルオロ、２−Ｏ−メチル、およびデオキシ修飾を示し、「ｓ」はヌクレオチド間ホスホロチオエート置換を示す。「Ｉ」は、グアノシンの代わりのイノシン置換を示し、および「ＮＨ」は化学カップリングを容易にするためのアミンを示す。

（表２０．抗ＩｇＥアプタマーＡＲＣ１６６６の３’−５’ＰＥＧ結合体）

３’−５’ＰＥＧ化は、以下の実施例３において記載される細胞ベースのアッセイによって測定されるアプタマー機能に対して、ほとんど効果を有さないか、または全く効果を有さなかった。

（実施例３：機能的細胞アッセイ）
（実施例３Ａ：レセプター（ＦｃεＲ１）結合阻害ＥＬＩＳＡ）
ｒＲｆＹ ＩｇＥアプタマーのパネル（実施例１Ａにおいて上記に記載される）を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ｈ−ＩｇＥと可溶性モノマーＦｃεＲ１_α（研究室内で精製）の間の複合体形成を阻害する能力について試験した。１×ＰＢＳ中のＦｃεＲ１（１００μＬ、１０μｇ／ｍＬ）を、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルプレートのウェル中で、４℃で一晩インキュベートして、ウェルの表面をコートした。上清を除去し、ウェルを１２０μｌ １×ＰＢＳで３回洗浄し、そして３００ｍＬ １×ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０で４℃にて２時間ブロックした。ブロッキング後、ウェルを３回、１×ＰＢＳで洗浄した。次に、種々の濃度のアプタマーを、１００μＬ ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０中の０．５ｎＭ ｈ−ＩｇＥとともに、室温で３０分間インキュベートし、次いで、この混合物をアッセイウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを、１２０μＬ １×ＰＢＳで５回洗浄した。結合したｈ−ＩｇＥを、ＨＲＰ−標識した抗ｈ−ＩｇＥポリクローナル抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＥ−ＨＲＰ（０７４−１００４）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））の添加によって検出した。Ｑｕａｎｔａｂｌｕｅ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ペルオキシダーゼ活性を検出した。１００μｌのＱｕａｎｔａｂｌｕｅ基質を各ウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。次に、１００μｌの供給される停止溶液を各ウェルに加え、プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ９６ウェルプレートリーダー上で、それぞれ３２５ｎｍおよび４２０ｎｍの励起／発光で読み取った。各ウェルの相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）を使用してＩＣ５０を計算した。以下の表２１は、ｒＲｆｙ選択からの種々のアプタマーを用いるＦｃεＲＩ_αレセプター阻害について計算されたＩＣ_５０を示す。

（表２１．レセプター（ＦｃεＲ１）結合阻害−ｒＲｆＹアプタマー）

（実施例３Ｂ：ＦＡＣＳによるレセプター（ＦｃεＲ１）結合阻害）
ｒＲｆＹ、ｄＲｍＹおよびＤＮＡ組成物を表すアプタマーのパネルを、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞の表面上に発現されたＦｃεＲ１へのｈ−ＩｇＥの結合を阻害する能力について試験した。ｈ−ＩｇＥレセプターのヒトα鎖、β鎖、およびγ鎖を安定に発現するＳＸ３８細胞、ＲＢＬ細胞株（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、フローサイトメトリーｈ−ＩｇＥ結合アッセイにおいて使用した。細胞を、１６％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および０．０３％ アジ化ナトリウム（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を伴う１×ＤＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中の１００万個のＳＸ３８細胞を、９６ウェルプレート中で適切な数のウェルにアリコートとし、氷上で３０分間インキュベートした。各アプタマー濃度について、アプタマー＋ｈ−ＩｇＥ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）の２×混合物を氷上で３０分間インキュベートした。アプタマーおよびｈ−ＩｇＥの混合物を、ＳＸ３８細胞に加えて、最終的な１×濃度を得、さらに３０分間氷上でインキュベートした。０〜１μＭの範囲の最終的なアプタマー濃度を、３μｇ／ｍＬ ｈ−ＩｇＥ（１５ｎＭ）に対してスクリーニングした。次いで、細胞を、ＦＡＣｓ緩衝液で３回洗浄し、レセプターに結合しなかった任意のｈ−ＩｇＥを除去する。ｈ−ＩｇＥ結合を検出するために、抗ｈ−ＩｇＥ−ＦＩＴＣ抗体（ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣｓ緩衝液で３回洗浄し、任意の未結合抗体を除去した。細胞をＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣＡＮ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析した。ｈ−ＩｇＥ単独および未処理プールに対するｈ−ＩｇＥを、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含めた。ｈ−ＩｇＥアプタマー活性を、細胞へのｈ−ＩｇＥ結合の阻害パーセントによって測定した。平均蛍光強度値を使用して、阻害パーセントを計算した。表２２は、ＦＡＣＳアッセイによって計算されるように選択された、種々のｒＲｆＹ、ｄＲｍＹ、およびＤＮＡクローンについてのＩＣ_５０を示す。

（表２２．ＦＡＣＳアッセイによるｒＲｆＹ、ｄＲｍＹ、ＤＮＡクローン：レセプター（ＦｃｅＲ１）結合阻害）

ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）（実施例２Ｅに記載される）ならびにＡＲＣ６５６（配列番号１５７）（実施例２Ｄに記載される）のいくつかの修飾誘導体もまた、以下の改変を伴う上記に記載されるＦＡＣＳアッセイを使用して、ｈ−ＩｇＥレセプター（ＦｃｅＲ１）結合阻害について試験した：各アプタマー濃度について、アプタマー＋ｈ−ＩｇＥ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）の２×混合物を、氷上で３０分間インキュベートし；このアプタマーおよびｈ−ＩｇＥの混合物をＳＸ３８細胞に加えて、最終的な１×濃度を得て、さらに２時間氷上でインキュベートし；そして０〜１μＭの範囲の最終アプタマー濃度を、０．５μｇ／ｍＬ ｈ−ＩｇＥ（２．５ｎＭ）に対してスクリーニングした。計算したＩＣ_５０値を表２３に要約する。

（表２３：ＦＡＣＳアッセイによる、ＡＲＣ４４５修飾誘導体；ＡＲＣ６５６：レセプター（ＦｃｅＲ１）結合阻害）

実施例２Ｇおよび２Ｈにおいて記載されるＰＥＧ結合体化アプタマーは、上記に直接的に記載される条件下で、ＦＡＣＳアッセイにおいてすべて活性であった。計算したＩＣ_５０値を以下の表２４に要約する。表２４におけるデータから見られ得るように、種々の型のＰＥＧ結合体化は、アプタマー機能にほとんど効果を有さなかった。

（表２４）

（実施例３Ｃ：カニクイザルＩｇＥとのアプタマー交差反応性）
アプタマーを、カニクイザルＩｇＥとＦｃεＲ１_α−Ｆｃの間の複合体形成を阻害する能力について、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験した。ＰＢＳ中のＦｃεＲ１_α−Ｆｃ（１００ｍＬ、５μｇ／ｍＬ）を、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレートのウェル中で４℃にて一晩インキュベートし、ウェルの表面をコートした。上清を除去し、ウェルを１２０μｌ １×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてウェルを、３００μＬ ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて、４℃で２時間ブロックした。このウェルを１２０μｌ １×ＰＢＳで３回洗浄した。次に、種々の濃度のアプタマーを、１００μＬ ＰＢＳ中の０．５ｎｇ ｈ−ＩｇＥ（またはＰＢＳで１０％に希釈したカニクイザル血清（Ｓｉｇｍａ））とともに、室温で３０分間インキュベートし、次いで、この混合物をアッセイウェルに加えて、室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを１２０μＬ ＰＢＳで５回洗浄した。結合したＩｇＥ（サルとヒトの両方）を、ＨＲＰ−標識抗ＩｇＥポリクローナル抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＥ−ＨＲＰ（０７４−１００４）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））の添加によって検出した。Ｑｕａｎｔａｂｌｕｅ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、ペルオキシダーゼ活性を検出するために使用した。１００μｌのＱｕａｎｔａｂｌｕｅ基質を各ウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。次に、１００μｌの提供された停止溶液を各ウェルに加え、プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ９６ウェルプレートリーダー上で、それぞれ３２５ｎｍおよび４２０ｎｍの励起／発光で読み取った。各ウェルの相対的蛍光単位（ＲＦＵ）を、ＩＣ_５０を計算するために使用した。

配列番号１４９（３’逆位デオキシチミジンを有する）および配列番号１５１（３’逆位デオキシチミジンを有する）に従う核酸配列を有するＤＮＡに従うアプタマーの存在、または配列番号９０および配列番号９３に従う核酸配列を有するｒＲｆＹアプタマーの存在は、それぞれ２５０ｎＭおよび１μＭまでの濃度で、ＦｃεＲ１−Ｆｃへのサルの結合を阻害しなかったのに対して、ｄＲｍＹアプタマーＡＲＣ４４５（配列番号１０１）およびＡＲＣ１６６６（配列番号２１６）は、相互作用をブロックする際に全く強力であり（ＡＲＣ４４５、ＩＣ_５０サル＝１６１ｎＭ；ＩＣ_５０ヒト＝６３ｎＭ；ＡＲＣ１６６６、ＩＣ_５０サル＝８ｎＭ；ＩＣ_５０ヒト＝５ｎＭ）、この分子が、カニクイザルＩｇＥおよびヒトＩｇＥと交差反応性であることを示す。さらなるコントロール実験は、ＡＲＣ４４５が、このアッセイ形式においてサルＩｇＥの検出を示さなかったことを示した。

図１３は、ＦＡＣＳによって、ＩｇＥ：ＦｃεＲ１結合阻害において最高の効力を示す、ｒＲｆＹ、ｄＲｍＹおよびＤＮＡ最小化アプタマーについての可能性のある二次構造を示す。左：配列番号９１（ｆＲｆＹ）、縁取り文字の残基は２’−Ｆである；中央：ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）（ｄＲｍＹ）、下線を付した残基は２’−デオキシであり、縁取り文字の残基は２’−ＯＭｅである；右：ＡＲＣ４７５（配列番号１５１）（ＤＭＡ）、下線を付した残基は２’−デオキシである。

（実施例３Ｄ：ヒスタミン放出の阻害）
ＩｇＥアプタマーの細胞ベースの活性を、ｈ−ＩｇＥレセプターのヒトα鎖、β鎖、およびγ鎖を安定して発現するＲＢＬ細胞株である、ＳＸ３８細胞（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用するヒスタミン放出アッセイを使用して測定した。ＳＸ３８細胞の上清は、ｈ−ＩｇＥおよび抗ｈ−ＩｇＥ架橋抗体の存在下で、アプタマーブロックされた細胞よりも多くのヒスタミンを含むので、競合ヒスタミンＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、ｈ−ＩｇＥおよびｈ−ＩｇＥ架橋抗体＋／−ＩｇＥアプタマーで処理されたＳＸ３８細胞の上清に放出されたヒスタミンのレベルを定量した。

実験の１日前に、ウェルあたり２０万（２００，０００）個のＳＸ３８細胞を、２４ウェルプレート中のＭＥＭ＋１６％ＦＢＳにプレートした。翌日、適切な濃度のアプタマー（１μＭで開始する、２倍の段階希釈の８点滴定）＋３μｇ／ｍＬのｈ−ＩｇＥ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）を、ＭＥＭ＋１６％ＦＢＳ中で３０分間、一緒にインキュベートした。次いで、この混合物をＳＸ３８細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした。各濃度を４連で試験した。細胞をＭＥＭ＋１６％ＦＢＳで３回洗浄し、次いで、ＭＥＭ＋１６％ＦＢＳ中でさらに５．５時間インキュベートした。ｈ−ＩｇＥ架橋抗体（ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、１μｇ／ｍＬの濃度で、細胞上の培地に加え、さらに２時間インキュベートした。上清を収集し、ヒスタミンＥＬＩＳＡにおける使用まで−２０℃で凍結した。ヒスタミンＥＬＩＳＡを、製造業者の推奨に従って使用した。ｈ−ＩｇＥ単独および未処理プールに対するｈ−ＩｇＥを、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含めた。ＩｇＥアプタマー活性を、図１４において示されるように、上清へのヒスタミンの放出の阻害パーセントによって測定した（ここで、ＡＲＣ４４５は配列番号１０１であり、ＡＲＣ６５６は配列番号１５７であり、そしてＡＲＣ７１４は非結合ネガティブコントロールである）。

ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）のいくつかの修飾誘導体（実施例２Ｅに記載される）もまた、ＤＮＡアプタマー、ＡＲＣ６５６（配列番号１５７）（実施例２Ｄに記載される）とともに、上記のようにＳＸ３８細胞におけるヒスタミン放出を阻害する能力について試験した。試験したＡＲＣ４４５誘導体についての計算したＩＣ_５０を表２５に要約する。

（表２５：ＡＲＣ４４５修飾誘導体；ＡＲＣ６５６：ＳＸ３８細胞におけるヒスタミン放出の阻害）

（実施例４：ＰＫ研究）
実施例４において、この実施例におけるすべての分子量に基づく濃度データは、ＰＥＧ結合体化によって付与される分子量に関わらず、アプタマーのオリゴヌクレオチド部分の分子量のみをいう。

（実施例４Ａ：抗ＩｇＥアプタマーの血漿安定性）
アプタマー医薬品化学プロセスにおいて同定されたアプタマーのサブセットを、ヒトとラットの両方の血漿中でのヌクレオチド安定性についてアッセイした。血漿ヌクレアーゼ分解は、以下に記載されるように、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で測定した。手短に述べると、血漿安定性の決定のために、化学合成したアプタマーを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、γ−^３２Ｐ ＡＴＰで５’末端標識し、次いで再度ゲル精製した。痕跡量の^３２Ｐ−標識アプタマーを、２００マイクロリットル結合反応において、９５％ヒト血漿（または９５％ラット血漿）中の１００ｎＭの未標識アプタマーの存在下でインキュベートした。０時点での反応を、血漿がＰＢＳで置き換えられた以外は、同じ成分を用いて別々に作製した。これは、ゲル上にロードされた量または放射能が実験にわたって一貫していたことを保証した。反応は、他に特定されない限り、１時間、３時間、１０時間、３０時間および１００時間、サーモサイクラー中で３７℃にてインキュベートした。各時点において、２０マイクロリットルの反応を取り出し、２００マイクロリットルのホルムアミドローディング色素と合わせ、液体窒素中ですばやく凍結し、そして−２０℃で保存した。取られた最後の時点の後、凍結サンプルを融解し、２０マイクロリットルを各時点から取り出した。次いで、ＳＤＳを、０．１％の最終濃度まで、この少ないサンプルに加えた。次いで、サンプルを９０℃で１０〜１５分間インキュベートし、１５％変性ＰＡＧＥゲル上に直接的にロードし、そして１２Ｗで３５分間泳動した。ゲル上の放射能を、Ｓｔｏｒｍ ８６０ホスホロイメージャーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して定量した。各時点における全長アプタマーのパーセンテージを、全長アプタマーバンドを定量すること、およびレーン中の全体の計数を分割することによって決定した。次いで、各時点における全長アプタマーの画分を、０時間の時点の全長アプタマーのパーセンテージに対して標準化した。時間の関数としての全長アプタマーの画分を式：

に対してフィットさせた。ここで、ｍ１は最大全長アプタマー％であり（ｍ１＝１００）；そしてｍ２は分解の速度である。
アプタマーの半減期（Ｔ_１／２）は（ｌｎ２）／ｍ２に等しい。

サンプルデータを図１５ａおよび１５ｂに示し、試験したアプタマーについての結果を表２６に要約する。本発明者らの予想と一致して、アプタマーは、ラット血漿中よりもヒト血漿中でより安定であり、糖−リン酸バックボーンへの安定化修飾の数を増加させることは、血漿安定性の増加と相関する。

（表２６：ＡＲＣ４４５およびＡＲＣ６５６誘導体の血漿安定性）

（実施例４Ｂ：ＰＥＧ化に対する抗ＩｇＥの薬物動態学：１０ｍｇ／ｋｇでのマウスへのＩＶ投与後のＡＲＣ１７８５、ＡＲＣ１７８７、ＡＲＣ１７８８、およびＡＲＣ１７９０）
静脈内（ＩＶ）投与を介するＡＲＣ１７８５、ＡＲＣ１７８７、ＡＲＣ１７８８、およびＡＲＣ１７９０のマウス薬物動態学研究のための設計を、図１６に示す。手短に述べると、この研究は３つの群（全体で３３匹の動物）からなった。各サンプル収集時点において、３匹の動物を最終的に屠殺し、０．５ｍＬの全血を、血漿の収集のために心臓穿刺を介して収集した。アプタマーを、注射のために、凍結乾燥粉末から標準的な０．９％生理食塩水中の１０ｍｇ／ｍＬ（オリゴ重量）の最終濃度に製剤化し、そして投薬の前に滅菌濾過（０．２μｍ）した。使用した投与の経路は、１０ｍｇ／ｋｇの用量の単回の静脈内ボーラス注射であった。特定の時点、ｔ＝投薬前、０．０８、０．５、１、２、４、８、１６、２４、３２、４８、および７２時間において、全血サンプルを得て、Ｋ２ＥＤＴＡコートしたチューブに直接的に移し、ひっくり返して混合し、そして湿らせた氷上に配置した。

血漿を、３５００ｒｐｍで５分間の血液−ＥＤＴＡチューブの遠心分離によって収集した。血漿サンプルを新鮮に標識した１．５ｍＬチューブに移し、分析の時点まで−８０℃に保存した。アプタマー濃度についての血漿サンプルの分析を、市販の蛍光核酸検出試薬Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含むアッセイウェルへの血漿アリコートの直接的付加を利用する均一アッセイ形式を使用して達成した。室温での短いインキュベーション時間（５分間）の後、光から保護し、アッセイプレートを、蛍光プレートリーダーによって読み取った。各ウェルからの蛍光シグナルはウェル中のアプタマーの濃度に比例し、サンプル濃度は、蛍光−濃度標準曲線（２連の曲線からの平均値）からの蛍光値の内挿によって計算した。平均血漿濃度は、各群における３匹の動物から、各時点において得、図１７において投薬後の時間に対してプロットする。

現れた時間のデータに対する血漿濃度は、工業用標準的薬物動態学モデリングソフトウェアＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、非区分化分析（ｎｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＮＣＡ）に供した。以下の主要な薬物動態学的パラメーター：最大血漿濃度、Ｃｍａｘ；濃度−時間曲線の下の面積、ＡＵＣ；末端半減期、ｔ１／２；末端クリアランス、Ｃ１；および定常状態における分布の体積，Ｖｓｓについての見積もりを得た。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用するデータの非区分化分析（ＮＣＡ）は、図２０に列挙される主要な薬物動態学的パラメーターについての見積もりを生じた。

（実施例４Ｃ：ＰＥＧ化に対する抗ＩｇＥアプタマーの薬物動態学および生物学的利用能：１０ｍｇ／ｋｇでのマウスへのＳＣ投与後のＡＲＣ１７８５、ＡＲＣ１７８７、ＡＲＣ１７８８、およびＡＲＣ１７９０）
皮下経路投与を介するＡＲＣ１７８５、ＡＲＣ１７８７、ＡＲＣ１７８８、およびＡＲＣ１７９０の生物学的利用能のマウス薬物動態学研究のための設計を、図１８に示す。手短に述べると、この研究は３つの群（全体で３３匹の動物）からなった。各サンプル収集時点において、３匹の動物を最終的に屠殺し、０．５ｍＬの全血を、血漿の収集のために心臓穿刺を介して収集した。アプタマーを、注射のために、凍結乾燥粉末から標準的な０．９％生理食塩水中の１０ｍｇ／ｍＬ（オリゴ重量）の最終濃度に製剤化し、そして投薬の前に滅菌濾過（０．２μｍ）した。使用した投与の経路は、１０ｍｇ／ｋｇの用量の単回の皮下ボーラス注射であった。特定の時点、ｔ＝投薬前、０．０８、０．５、１、２、４、８、１６、２４、３２、４８、および７２時間において、全血サンプルを得て、Ｋ２ＥＤＴＡコートしたチューブに直接的に移し、ひっくり返して混合し、そして湿らせた氷上に配置した。

血漿を、３５００ｒｐｍで５分間の血液−ＥＤＴＡチューブの遠心分離によって収集した。血漿サンプルを新鮮に標識した１．５ｍＬチューブに移し、分析の時点まで−８０℃に保存した。アプタマー濃度についての血漿サンプルの分析を、市販の蛍光核酸検出試薬Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含むアッセイウェルへの血漿アリコートの直接的付加を利用する均一アッセイ形式を使用して達成した。室温での短いインキュベーション時間（５分間）の後、光から保護し、アッセイプレートを、蛍光プレートリーダーによって読み取った。各ウェルからの蛍光シグナルはウェル中のアプタマーの濃度に比例し、サンプル濃度は、蛍光−濃度標準曲線（２連の曲線からの平均値）からの蛍光値の内挿によって計算した。平均血漿濃度は、各群における３匹の動物から、各時点において得、図１９において投薬後の時間に対してプロットする。

現れた時間のデータに対する血漿濃度は、工業用標準的薬物動態学モデリングソフトウェアＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０を使用して、非区分化分析（ＮＣＡ）に供した。以下の主要な薬物動態学的パラメーター：最大血漿濃度、Ｃｍａｘ；濃度−時間曲線の下の面積、ＡＵＣ；末端半減期、ｔ１／２；末端クリアランス、Ｃ１；および定常状態における分布の体積，Ｖｓｓについての見積もりを得た。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用するデータの非区分化分析（ＮＣＡ）は、図２０に列挙される主要な薬物動態学的パラメーターについての見積もりを生じた。図２０の表から見られ得るように、試験したすべてのＰＥＧ結合体化アプタマーは、皮下の生物学的利用能を示した。

本発明は、書かれた説明および実施例によって本明細書で説明されてきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、および前述の説明および前述の実施例が例示の目的のためであり、以下の特許請求の範囲の限定ではないことを認識している。

図１は、ＩｇＥ媒介シグナル伝達事象の図式である。 図２は、リボ核酸から構成されるランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロアプタマー選択（ＳＥＬＥＸ（商標））プロセスの模式図である。デオキシリボ核酸から構成されるランダム配列オリゴヌクレオチドのプールを使用するインビトロアプタマーＳＥＬＥＸプロセスについては、逆転写および転写の工程が省略される。 図３は、４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧの図である。 図４は、アプタマーの５’末端に取り付けられた４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧの図である。 図５は、標準的な一ＰＥＧ化、複数ＰＥＧ化、およびＰＥＧ化を介する二量体化を表す種々のＰＥＧ化ストラテジーを示す図である。 図６は、ｄＲｍＹクローン選択のラウンド６および７の後のｈ−ＩｇＥに対するプールの結合活性のプロットである。 図７は、ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）およびその誘導体についての直接的結合曲線および結合親和性を示し、修飾がｈ−ＩｇＥに対する結合の割合の増加を生じたことを描写している。 図８は、抗ＩｇＥアプタマーＡＲＣ４４５（配列番号１０１）およびいくつかのそれらの誘導体のイオン交換ＨＰＬＣ痕跡分析を描写する。 図９は、ＡＲＣ４４５（配列番号１０１）におけるＮＭＭ蛍光の増加、およびｄＧの代わりに７−デアザ−Ｇ置換を含む、ＡＲＣ４４５誘導体、ＡＲＣ９０９−９１１（配列番号１９１〜１９３）におけるＮＭＭ蛍光の減少を示すグラフである。 図１０は、ＡＲＣ１８３（ポジティブ実験コントロール）におけるＮＭＭ蛍光の増加、およびＡＲＣ１３４６（ネガティブ実験コントロール）におけるＮＭＭ蛍光の減少を示すグラフである。 図１１は、その誘導体に対して比較したＡＲＣ４４５（配列番号１０１）についての直接的結合曲線を示し、これは、７−デアザ−Ｇ（ＡＲＣ９０９〜９１１（配列番号１９１〜１９３）において示されるようなもの）でのｄＧの置換がｈ−ＩｇＥへの結合比率を有意に減少することを描写する。 図１２は、２’−Ｏ−メチル置換およびホスホロチオエート置換を含むがｄＧの代わりにイノシン置換を含まないＡＲＣ１３８４（配列番号１８１）、ＡＲＣ４４５誘導体（配列番号１０１）と比較したときに、ｄＧの代わりにイノシン置換を含むＡＲＣ４４５誘導体ＡＲＣ１６４１、１６４２、および１６６６（それぞれ配列番号２１２、２１３、および２１６）におけるＮＭＭ蛍光の減少を示すグラフである。 図１３は、ＦＡＣＳによるＩｇＥ：ＦｃεＲ１結合阻害における最高の効力を示すｒＲｆＹ、ｄＲｍＹおよびＤＮＡ最小化アプタマーについての予測された二次構造の図式である。図１３（Ａ）は、配列番号９１に従うｒＲｆＹクローンを示し、要点となる残基は２’−Ｆである；図１３（Ｂ）はＡＲＣ４４５（配列番号１０１）、ｄＲｍＹクローンを示し、黒い残基は２’−デオキシであり、灰色の残基は２’−ＯＭｅである；図１３（Ｃ）はＡＲＣ４７５（配列番号１５１）、ＤＮＡクローンを示し、下線を付した残基は２’−デオキシである。 図１４は、ＳＸ３８細胞におけるｈ−ＩｇＥ誘導ヒスタミン放出をブロックするＡＲＣ４４５（配列番号１０１）およびＡＲＣ６５６（配列番号１５７）を示すプロットである。 図１５Ａは、インキュベーション時間の関数としての、ヒトおよびラットの血漿中に存在する全長ＡＲＣ１３８４およびＡＲＣ１６６６の％を示すグラフである。 図１５Ｂは、インキュベーション時間の関数としての、ヒトおよびラットの血漿中に存在する全長ＡＲＣ１３８４、ＡＲＣ１５７２およびＡＲＣ１５７３の％を示すグラフである。 図１６は、１０ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与されたＰＥＧ化抗ＩｇＥアプタマーＡＲＣ１７８５（配列番号２９５）、ＡＲＣ１７８７（配列番号２９３）、ＡＲＣ１７８８（配列番号２９４）、およびＡＲＣ１７９０（配列番号２９６）の薬物動態学研究の設計を概説する表である。 図１７は、１０ｍｇ／ｋｇでのマウスへの静脈内（ＩＶ）投与後のＰＥＧ化抗ＩｇＥアプタマーＡＲＣ１７８５（配列番号２９５）、ＡＲＣ１７８７（配列番号２９３）、ＡＲＣ１７８８（配列番号２９４）、ＡＲＣ１７９０（配列番号２９６）の薬物動態学プロフィールを示すグラフである。 図１８は、１０ｍｇ／ｋｇでマウスに皮下投与されたＰＥＧ化抗ＩｇＥアプタマーＡＲＣ１７８５（配列番号２９５）、ＡＲＣ１７８７（配列番号２９３）、ＡＲＣ１７８８（配列番号２９４）、およびＡＲＣ１７９０（配列番号２９６）の薬物動態学研究の設計を概説する表である。 図１９は、１０ｍｇ／ｋｇでのマウスへの皮下（ＳＣ）投与後のＰＥＧ化抗ＩｇＥアプタマーＡＲＣ１７８５（配列番号２９５）、ＡＲＣ１７８７（配列番号２９３）、ＡＲＣ１７８８（配列番号２９４）およびＡＲＣ１７９０（配列番号２９６）の薬物動態学プロフィールを示すグラフである。 図２０は、１０ｍｇ／ｋｇでのマウスへの静脈内（ＩＶ）および皮下（ＳＣ）投与後のＰＥＧ化抗ＩｇＥアプタマーＡＲＣ１７８５（配列番号２９５）、ＡＲＣ１７８７（配列番号２９３）、ＡＲＣ１７８８（配列番号２９４）およびＡＲＣ１７９０（配列番号２９６）についての非区画化ＰＫプロフィールを要約する表である。

Claims (40)

1. ＰＥＧ部分に結合体化されたアプタマーであって、該アプタマーは以下の核酸配列：
   

   

   を含む、アプタマー。
2. 前記ＰＥＧ部分が、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａおよび２０ｋＤａからなる群より選択される分子量を含む、請求項１に記載のアプタマー。
3. 前記ＰＥＧ部分が分枝状ＰＥＧである、請求項２に記載のアプタマー。
4. 以下に示される構造：
   

   

   を有し、ここで、
   

   

   はリンカーを示し、
   アプタマー＝
   

   

   であり、
   ここで、それぞれｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである、請求項３に記載のアプタマー。
5. 前記リンカーがアルキルリンカーである、請求項４に記載のアプタマー。
6. 前記アルキルリンカーが２〜１８個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項５に記載のアプタマー。
7. 前記アルキルリンカーが２〜１２個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項６に記載のアプタマー。
8. 前記アルキルリンカーが３〜６個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項７に記載のアプタマー。
9. 以下に示される構造：
   

   

   を有し、
   アプタマー＝
   

   

   であり、
   ここで、それぞれｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである、請求項８に記載のアプタマー。
10. 以下に示される構造：
    

    

    を有し、ここで、
    

    

    はリンカーを示し、
    アプタマー＝
    

    

    であり、
    ここで、それぞれｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである、請求項３に記載のアプタマー。
11. 前記リンカーがアルキルリンカーである、請求項１０に記載のアプタマー。
12. 前記アルキルリンカーが２〜１８個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項１１に記載のアプタマー。
13. 前記アルキルリンカーが２〜１２個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項１２に記載のアプタマー。
14. 前記アルキルリンカーが３〜６個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項１３に記載のアプタマー。
15. 以下に示される構造：
    

    

    を有し、
    アプタマー＝
    

    

    であり、
    ここで、それぞれｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである、請求項１４に記載のアプタマー。
16. 以下に示される構造：
    

    

    を有し、ここで、
    

    

    はリンカーを示し、
    アプタマー＝
    

    

    であり、
    ここで、それぞれｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである、請求項２に記載のアプタマー。
17. 前記リンカーがアルキルリンカーである、請求項１６に記載のアプタマー。
18. 前記アルキルリンカーが２〜１８個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項１７に記載のアプタマー。
19. 前記アルキルリンカーが２〜１２個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項１８に記載のアプタマー。
20. 前記アルキルリンカーが３〜６個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項１９に記載のアプタマー。
21. 以下に示される構造：
    

    

    を有し、
    アプタマー＝
    

    

    であり、
    ここで、ｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである、請求項１７に記載のアプタマー。
22. 以下に示される構造：
    

    

    を有し、ここで、
    

    

    はリンカーを示し、
    アプタマー＝
    

    

    であり、
    ここで、それぞれｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである、請求項２に記載のアプタマー。
23. 前記リンカーがアルキルリンカーである、請求項２２に記載のアプタマー。
24. 前記アルキルリンカーが２〜１８個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項２３に記載のアプタマー。
25. 前記アルキルリンカーが２〜１２個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項２４に記載のアプタマー。
26. 前記アルキルリンカーが３〜６個の連続するＣＨ_２基を含む、請求項２５に記載のアプタマー。
27. 以下に示される構造：
    

    

    を有し、
    アプタマー＝
    

    

    であり、
    ここで、それぞれｍＣ、ｍＧ、ｍＵおよびｍＡ＝２’−ＯＭｅ Ｃ、２’−ＯＭｅ Ｇ、２’−ＯＭｅ Ｕおよび２’−ＯＭｅ Ａ、ｄＧ＝デオキシＧ、ｄＩ＝デオキシイノシン、ｓ＝ホスホロチオエートバックボーン置換、および３Ｔ＝３’逆位デオキシチミジンである、請求項２６に記載のアプタマー。
28. 配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、および９８〜１０２からなる群より選択されるいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％同一である核酸配列を含む、ＩｇＥに特異的に結合するアプタマー。
29. 前記アプタマーの核酸配列が、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、および９８〜１０２からなる群より選択されるいずれか１つの配列に対して少なくとも９０％同一である、請求項２８に記載のアプタマー。
30. 配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０および５６〜８９からなる群より選択されるいずれか１つの配列の独特な配列領域に対して少なくとも８０％同一である核酸配列を含む、ＩｇＥに特異的に結合するアプタマー。
31. 前記アプタマーの核酸配列が、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０および５６〜８９からなる群より選択されるいずれか１つの配列の独特な配列領域に対して少なくとも９０％同一である、請求項３０に記載のアプタマー。
32. 配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０および５６〜９６の群より選択されるいずれか１つのアプタマー酸配列における３０個の連続するヌクレオチドの配列に対して同一である３０個の連続するヌクレオチドの配列を含む、ＩｇＥに結合可能であるアプタマー。
33. 前記アプタマーが、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２の群より選択されるいずれか１つのアプタマー配列の独特な配列領域における２０個の連続するヌクレオチドの配列に対して同一である２０個の連続するヌクレオチドを含む、請求項３２に記載のアプタマー。
34. 前記アプタマーが、配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２の群より選択されるいずれか１つのアプタマー配列の独特な配列領域における８個の連続するヌクレオチドの配列に対して同一である８個の連続するヌクレオチドを含み、該アプタマーはＩｇＥに特異的に結合する、請求項３３に記載のアプタマー。
35. 配列番号１１〜１５、１８、１９、２１、２９、３３、４１〜４４、４６、５０、５６〜９６、９８〜１０２、１１９〜１２４、１２６〜１３６、１３９〜１５７、１５８〜１７６、１７８〜１９０、１９４〜２０１、２０６〜２４３、２４７、２４９〜２５９、２６１〜２６７、２６９〜２９０および２９２からなる群より選択されるアプタマー。
36. 前記アプタマーが一本鎖核酸である、請求項３５に記載のアプタマー。
37. 高分子量の、非免疫原性化合物または親油性化合物に結合体化されている、請求項３６に記載のアプタマー。
38. 前記高分子量の、非免疫原性化合物がポリアルキレングリコールである、請求項３７に記載のアプタマー。
39. 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項３８に記載のアプタマー。
40. 糖の位置における化学置換；リン酸の位置における化学置換；核酸の塩基の位置における化学置換；逆位ヌクレオチドを伴う３’キャッピング；および逆位ヌクレオチドを伴う５’キャッピングからなる群より選択される化学修飾を含む、請求項３５に記載のアプタマー。

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