JP2006516151A - 改良された薬力学的特性を有する多価アプタマー治療剤ならびにそれらの作製方法および使用法 - Google Patents

Abstract

改良された薬力学的特性および薬物動態学的特性、ならびに増加した標的原子価を有するアプタマー治療剤を生成するための物質および方法が提供される。本発明の方法によって生成されるアプタマーは、疾患を処置するための治療剤として有用である。本発明は、以下：（ａ）２つ以上のアプタマーを含む核酸、および（ｂ）連結部分を含む安定化部分であって、ここで、該連結部分は、核酸分子ではない、安定化部分を含む、アプタマー組成物を提供する。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的には、核酸の分野に関し、より具体的には、改良された標的原子価、薬力学的特性、および薬物動態学的特性を有するアプタマーの分野に関する。本発明はさらに、アプタマー治療剤の治療有効性を改善することに関する。

アプタマーは、古典的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成以外の相互作用を介して、分子に対する特異的な結合親和性を有する核酸分子である。

アプタマーは、ファージディスプレイにより作製されたペプチドまたはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と同様に、選択された標的に特異的に結合し得、結合を介して、その標的の機能する能力をブロックする。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから、インビトロ選択プロセス（図１）により作製されたアプタマーは、１００を超えるタンパク質（増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよびレセプターが挙げられる）について作製されている。代表的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤのサイズ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル濃度未満の親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的に対して識別する（例えば、代表的には、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質には結合しない）。一連の構造研究は、アプタマーが、抗体抗原複合体において、親和性および特異性を駆動する、同じ型の結合相互作用（水素結合、静電相補性、疎水性接触、立体障害など）を使用することが可能である。

アプタマーは、治療剤としての使用のために所望の多数の特徴を有し、これらとしては、高い特異性および親和性、生物学的効力および優れた薬物動態学的特性が挙げられる。さらに、これらは、例えば、抗体および他のタンパク質の生物学にわたって、特異的な競合上の優位性を提供する。

１）速度および制御。アプタマーは、全体的にインビトロプロセスによって生成され、初期の（治療的な）手がかりの迅速な生成を可能にする。インビトロ選択は、アプタマーの特異性および親和性を厳密に制御させ、かつ、毒性標的および非免疫原性標的の両方に対する手がかりの生成を可能にする。

２）毒性および免疫原性。分類としてアプタマーは、毒性または免疫原性をほとんど示さないか、または全く示さない。高いレベルのアプタマーでのラットまたはマーモットの慢性投薬（毎日１０ｍｇ／ｋｇを９０日間）において、任意の臨床的測定、細胞測定または生化学的測定によって毒性が観察されない。多くのモノクローナル抗体の効率は、抗体自体に対する免疫応答によりかなり制限され得るが、抗体をアプタマーに対して誘発することが非常に困難である（これは、おそらくアプタマーがＭＨＣを介してＴ細胞により提示され得ないから、および、免疫応答が一般に、核酸フラグメントを認識しないように慣らされているからである）。

３）投与。全ての現在認可された抗体治療は、静脈内注入（代表的には２〜４時間にわたる）により投与されるが、アプタマーは、皮下注射により投与され得る。この差は、主に、比較的低い溶解度に起因し、従って、多い量が、たいていの治療用ＭＡｂのために必須となる。良好な溶解度（＞１５０ｍｇ／ｍｌ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤ；抗体：１５０ｋＤ）を有するので、アプタマーの毎週の用量は、０．５ｍｌ未満の容量で注射により送達され得る。皮下投与を介するアプタマーのバイオアベイラビリティは、サルの研究において＞８０％である（Ｔｕｃｋｅｒ，１９９９）。

４）拡張性およびコスト。アプタマーは、化学合成され、結果として、製品需要を満たすように、必要に応じて容易に拡張され得る。拡張生産における問題は、いくつかの生物製剤（例えば、Ｅｂｒｅｌ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ）のアベイラビリティを現在制限していることであり、大規模タンパク質生成プラントの資本コストは巨額（例えば、＄５００ ＭＭ、Ｉｍｍｕｎｅｘ）であり、単一の大規模合成装置は、上向きで年間１００ｋｇのオリゴヌクレオチドを生成し得、比較的ささやかな初期投資（例えば、＜＄１０ ＭＭ，Ａｖｅｃｉａ）を必要とする。ｋｇ規模のアプタマー合成についての、現在の製造原価は、＄５００／ｇと見積もられ、非常に最適化された抗体についての製造原価に匹敵する。プロセス開発における持続的な改善により、５年のうちに、＜１００＄／ｇまで製造原価を低下させることが期待される。

５）安定性。アプタマーは、化学的に頑強である。アプタマーは本質的に、熱、変性剤などへの曝露後に、活性を回復するように、適合されており、凍結乾燥粉末として、室温で長期間（１年以上）保存され得る。対照的に、抗体は、冷蔵保存されなければならない。

治療剤としてのアプタマーの利点を考慮すると、アプタマー治療法の標的原子価、薬力学的特性および薬物動態学的特性を改善するような物質および方法を有することが有益である。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす物質および方法を提供する。

（発明の要旨）
本発明は、改善された薬力学的特性および薬物動態学的特性を有する高分子量ＰＥＧ誘導体化核酸（例えば、アプタマー）結合体、ならびにそのような結合体を生成するための方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、高分子量ＰＥＧ核酸（例えば、アプタマー）結合体、およびそのような結合体をホモ−二官能性ＰＥＧを使用して生成して、高分子量ダイマー（例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸結合体）を形成するための方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、高分子量ＰＥＧ核酸（例えば、アプタマー）結合体、およびそのような結合体を、単官能性ＰＥＧを有する二反応性核酸（すなわち、２つの反応部位を有する核酸）を使用して生成し、多重ＰＥＧ化結合体（すなわち、ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ結合体）を形成するための方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、増強されたリガンド結合特性を有する、オリゴヌクレオチドを断片化した安定化多価アプタマー、およびそのような結合体を生成するための方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、改善されたリガンド結合特性を有する、オリゴヌクレオチドに連結された多価アプタマー、およびそのような結合体を生成するための方法を提供する。

一実施形態において、本発明の物質および方法は、標的に対して特異性を有するアプタマー分子マルチマーを生成するために使用され得る。

一実施形態において、本発明のアプタマーは、疾患および障害の予防および／または処置における治療剤として使用され得る。

一局面において、本発明の高分子量アプタマー組成物は、２つ以上のアプタマーを有する核酸、および連結部分である安定化部分を含み、ここで、上記連結部分は、核酸分子ではない。一実施形態において、上記連結部分はポリアルキレングリコールである。適切なポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結部分は、多重活性化される。例えば、ＰＥＧ連結部分は、二重活性化される。一実施形態において、高分子量アプタマー組成物としては、第１のアプタマーおよび第２のアプタマーを有する核酸が挙げられる。この実施形態において、上記第１のアプタマーおよび第２のアプタマーは、ＰＥＧ連結部分によって連結され、結果として、上記アプタマー組成物の一次構造は線形配列であり、この線形配列において、上記第１のアプタマーはＰＥＧ連結部分の第１の末端に連結され、上記第２のアプタマーはＰＥＧ連結部分の第２の末端に連結される。いくつかの実施形態において、上記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤより大きい、からなる群より選択される分子量を有する。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る。

本発明の別の局面において、高分子量アプタマー組成物は、リンカードメインによって結合された２つ以上のアプタマードメインを有する核酸部分、および１つ以上のポリアルキレングリコール部分がリンカードメインに結合される安定化部分を含む。一実施形態において、上記安定化部分は、上記リンカードメインに結合された１つ以上のポリアルキレングリコールである。適切なポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤより大きい、からなる群より選択される分子量を有する。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る。

別の局面において、本発明は、高分子量アプタマー組成物を提供し、このアプタマー組成物は、２つ以上のアプタマードメインおよびリンカードメインを有する核酸、ならびにそのリンカードメインの少なくとも一部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド断片（ｓｐｌｉｎｔ）を含む安定化部分を含み、ここで、そのオリゴヌクレオチド断片は、少なくとも４０個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド断片は、上記リンカードメインの少なくとも２０個のヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、上記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤより大きい、からなる群より選択される分子量を有する。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る。

本発明の別の局面において、高分子量アプタマー組成物は、２つ以上のアプタマードメインおよびリンカードメインを有する核酸部分、ならびにそのリンカードメインの少なくとも一部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド断片を含む安定化部分を含み、ここで、そのオリゴヌクレオチド断片は、それに結合される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有する。適切なポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド断片は、上記リンカードメインの少なくとも２０個のヌクレオチドにハイブリダイズする。一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド断片は、少なくとも４０個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、上記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤより大きい、からなる群より選択される分子量を有する。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る。

別の局面において、本発明は、高分子量アプタマー組成物を提供し、そのアプタマー組成物は、２つ以上のアプタマードメインおよびリンカードメインを有する核酸部分、ならびにそのリンカードメインの少なくとも一部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド断片を含む安定化部分を含み、ここで、その２つ以上のアプタマードメインのうちの少なくとも１つは、非結合状態（すなわち、特定のアプタマー標的と結合していない）である。一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド断片は、上記リンカードメインの少なくとも２０個のヌクレオチドにハイブリダイズする。一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド断片は、少なくとも４０個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド断片は、それに結合される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有する。適切なポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤより大きい、からなる群より選択される分子量を有する。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る。本発明のこの局面に従ういくつかの高分子量アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る。

別の局面において、本発明は、高分子量アプタマー組成物を提供し、そのアプタマー組成物は、アプタマー、および２つ以上の非核酸安定化部分を含む。適切な安定化部分としては、例えば、ポリアルキレングリコールが挙げられる。一実施形態において、上記安定化部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一実施形態において、上記アプタマーは多重活性化される。例えば、上記アプタマーは、二重活性化される。

本発明はまた、治療用組成物を提供する。本発明に従う治療用組成物としては、本明細書中に記される高分子量アプタマー組成物が挙げられる。

別の局面において、本発明は、アプタマー治療用組成物の薬力学的特性または薬物動態学的特性を改善する方法を提供し、その方法は、反応基を核酸アプタマーに導入し、そしてそのアプタマーにおける反応基を安定化部分における反応基と反応させ、それによって、安定化した高分子量治療用組成物を形成する工程を包含する。一実施形態において、上記アプタマー組成物における反応基は、改変型ホスホロアミダイト合成によって導入されたアプタマーの５’末端または３’末端でのアミノ基である。一実施形態において、上記安定化部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。さらなる実施形態において、ＰＥＧは、ホモ−二官能性であり、得られるアプタマーは、ＰＥＧリンカーによって連結されたダイマーである。一実施形態において、上記アプタマーは多重活性化される。例えば、上記アプタマーは二重活性化される。一実施形態において、上記アプタマーは、５’末端および３’末端で二重活性化される。一実施形態において、上記安定化部分は、単活性化されたＰＥＧであり、そして得られるアプタマーは、二ＰＥＧ化される。

別の局面において、本発明は、被験体における疾患を処置する方法を提供し、その方法は、本明細書中に記載される高分子量アプタマー組成物の治療有効量を投与する工程を包含する。

（発明の詳細な説明）
本発明の１以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本明細書中に記載される方法および物質と類似かまたは等価な任意の方法または物質が、本発明の実施または試験で使用され得、好ましい方法および物質がここで記載される。本発明の他の特徴、主題、および利点が、説明から明らかである。本明細書において、他に明示的に指定しない限り、単数形は、複数形もまた包含する。他に規定されない限り、本明細書中で使用さえるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野における一般の知識を有する者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。コンフリクトの場合は、本明細書が管理される。

（ＰＥＧ誘導体化核酸）
高分子量非免疫原性ポリマーを用いる核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態学的特性および薬力学的特性を変化させて、それらをより有効な治療剤にする可能性を有する。望ましい活性の変化としては、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗の増加、腎臓を通した濾過の減少、免疫系への曝露の減少、および身体を通じた治療剤の分布の変化が挙げられ得る。

本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）部分を用いて誘導され得る。本発明で使用される代表的なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、あるいはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールが挙げられる）が挙げられる。さらに、様々なアルキレンオキシドのランダムコポリマーまたはブロックコポリマー（例えば、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド）が、多くの適用で使用され得る。その最も一般的な形態において、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）は、ヒドロキシル基を有する各末端で終端となる線形ポリマー：ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨである。このポリマー（α−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）、ω−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール））はまた、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表され得、ここで、−ＰＥＧ−の記号が、以下：−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−の構造単位を表すことが理解され、ここで、ｎは代表的に、約４〜約１０，０００の範囲である。

示されるように、ＰＥＧ分子は、二官能性であり、しばしば「ＰＥＧジオール」と称される。ＰＥＧ分子の末端部分は、相対的に非反応性のヒドロキシル部分（−ＯＨ基）であり、これは、その化合物における反応部位で、ＰＥＧが他の化合物と結合するために活性化され得るか、または機能性部分に変換され得る。そのように活性化されたＰＥＧジオールは、本明細書中で二活性化ＰＥＧ（ｂｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＥＧ）と称される。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、アミノ部分との選択的反応のために、相対的に非反応性のヒドロキシル基（−ＯＨ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミドに由来するスクシンイミジル活性エステル部分で置換することによって、活性な炭酸エステルとして官能化される。

多くの適用において、本質的に非反応性の部分を有する一端におけるＰＥＧ分子をキャップして、その結果、そのＰＥＧ分子が単官能性（または単活性化される）であることが望ましい。一般的に活性化ＰＥＧに対して複数の反応部位を示すタンパク質治療剤の場合において、ニ官能性の活性化ＰＥＧは、広範な架橋をもたらし、不完全な機能的凝集を生じる。単活性化ＰＥＧを生成するために、代表的には、ＰＥＧジオール分子の末端における一方のヒドロキシル部分が、非反応性のメトキシ末端部分（−ＯＣＨ_３）で置換される。ＰＥＧ分子の他方のキャップされていない末端は、代表的には、反応性末端部分に変換され、その反応性末端部分は、表面または分子（例えば、タンパク質）における反応部位での結合のために活性化され得る。

ＰＡＧは、代表的には、水および多くの有機溶媒への可溶性、毒性の欠如、および免疫原性の欠如の特性を有するポリマーである。ＰＡＧの一用途は、ポリマーを不溶性分子に共有結合させて、得られるＰＡＧ−分子「結合体」を可溶性にすることである。例えば、水不溶性の薬物であるパクリタキセルは、ＰＥＧと結合した場合、水可溶性になることが示されている。（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６（１９９５））。ＰＡＧ結合体は、多くの場合、可溶性および安定性を増強するためだけでなく、分子の血液循環半減期を延長するために使用される。本発明のポリアルキル化化合物は、代表的には、サイズが５と８０ｋＤとの間である。本発明の他のＰＡＧ化合物は、サイズが１０と８０ｋＤとの間である。本発明のさらに他のＰＡＧ化合物は、サイズが１０と６０ｋＤとの間である。例えば、ＰＡＧポリマーは、サイズが少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤである。このようなポリマーは、直鎖であるか分枝であり得る。

生物学的に発現されたタンパク質治療剤とは対照的に、核酸治療剤は、代表的には、活性化されたモノマーヌクレオチドから化学合成される。ＰＥＧ−核酸結合体は、同一の繰り返しモノマー合成を使用してＰＥＧを導入することによって調製され得る。例えば、ホスホロアミダイト形態への変換によって活性化されたＰＥＧは、固相オリゴヌクレオチド合成に組み込まれ得る。あるいは、オリゴヌクレオチド合成は、反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的導入を備え得る。最も一般的には、このことは、５’末端での遊離の一級アミンの付加によって達成されている（固相合成の最後のカップリング工程において修飾因子のホスホロアミダイトを使用して導入される）。このアプローチを使用して、反応性ＰＥＧ（例えば、アミンと反応し結合を形成するように活性化されたもの）が、精製したオリゴヌクレオチドを結合され、そしてカップリング反応が溶液中で実行される。

ＰＥＧ結合が治療剤の体内分布を変化させる能力は、因子の数（結合体の見かけのサイズを含む）に関係する。より大きい結合体（＞１０ｋＤａ）は、腎臓を介する濾過をより効果的にブロックすること、および小さな高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を結果的に増加させることが公知である。ＰＥＧ結合体が濾過をブロックする能力は、約５０ｋＤａまでのＰＥＧのサイズとともに増加することが示されている（さらなる増加は、半減期が腎臓を介する排除ではなくマクロファージ媒介性代謝によって規定されるようになるという最小限の有益な効果を有する）。

高分子量ＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の生成は、困難で、非効率的で、そして高価である。高分子量ＰＥＧ−核酸結合体の合成のための経路として、これまでの研究は、高分子量の活性化ＰＥＧの生成に焦点が当てられていた。そのような分子を生成するための１つの方法としては、２つ以上のＰＥＧが活性基を有する中央の核に結合する分枝した活性化ＰＥＧの形成が挙げられる。これらの高分子量ＰＥＧ分子の末端部分（すなわち、相対的に非反応性のヒドロキシル（−ＯＨ）部分）は、１つ以上のＰＥＧをその化合物における反応性部位で他の化合物に結合させるために活性化されるか、または機能性部分に変換される。分枝の活性化ＰＥＧは、２つよりも多い末端を有し、２つ以上の末端が活性化されている場合には、このような活性化高分子量ＰＥＧ分子は、本明細書中で多重活性化ＰＥＧと称される。いくつかの場合において、分枝のＰＥＧにおけるすべての末端が活性化されているのではない。分枝ＰＥＧ分子の任意の２つの末端が活性化されている場合には、このようなＰＥＧ分子は、二重活性化ＰＥＧと称される。分枝ＰＥＧ分子の１つの末端のみが活性化されている場合には、このようなＰＥＧ分子は単活性化と称される。このアプローチの例として、リジン核への２つのモノメトキシＰＥＧの結合によって調製された活性化ＰＥＧ（その後、反応のために活性化される）が、記載されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．２：２１４〜２２１、２００３）。

本発明は、高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）結合体（（例えば、図２に示されるような）多重ＰＥＧ化核酸を含む）の合成のための、費用効率のよい別の経路を提供する。本発明はまた、ＰＥＧで連結されたマルチマーオリゴヌクレオチド（例えば、（例えば、図２にもまた示されるような）二量化アプタマー）を包含する。

本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０ｋＤの分子量を有する高分子量組成物を包含する。組成物は、代表的には、サイズが１０ｋＤと８０ｋＤとの間の分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、サイズが少なくとも１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ、５０ｋＤ、６０ｋＤ、または８０ｋＤである。

安定化部分は、分子であるか、または分子の一部であり、本発明の高分子量アプタマーの薬力学的特性および薬物動態学的特性を改善する。いくつかの場合において、安定化部分は、分子または分子の一部であり、それは、２つ以上のアプタマー、またはアプタマードメインを近位に至らせるか、または本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転自由度を減少させる。安定化部分は、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）であり得、それは、直鎖でも分枝鎖でも、ホモポリマーでもヘテロポリマーでもよい。他の安定化部分としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のようなポリマーが挙げられる。オリゴヌクレオチドもまた、安定化部分であり得；このようなオリゴヌクレオチドとしては、修飾ヌクレオチド、および／または修飾連結物（例えば、ホスホチオエート）が挙げられる。安定化部分は、アプタマー組成物の不可欠な部分であり得る（すなわち、それはアプタマーに共有結合している）。あるいは、安定化部分は、アプタマー組成物と非共有的に（例えば、２つのオリゴヌクレオチド間の水素結合またはハイブリダイゼーション相互作用を介して）結合し得る。

（アプタマーのＰＥＧ媒介性二量化）
二官能性のＰＥＧを介する二量化は、複数の潜在的な利益を提供し、以下：
（１）ダイマーの標的に対する結合における親和性の増加、
（２）すべての標的に対する結合における結合力の増加および解離の減少、および
（３）濾過による除去に対する抵抗性の増加に対応する、有効な分子量の増加
が挙げられる。

本発明の組成物は、高分子量アプタマー組成物を包含し、そのアプタマー組成物は、２つ以上のアプタマーが少なくとも１つのポリアルキレングリコール部分に共有結合している。ポリアルキレングリコール部分は、安定化部分としての役割を果たす。ポリアルキレングリコール部分が、アプタマーのいずれかの末端で共有結合し、その結果ポリアルキレングリコールがアプタマーと一緒に一分子になる組成物では、そのポリアルキレングリコールは、連結部分と呼ばれる。このような組成物において、共有分子の一次構造は、アプタマー−ＰＡＧ−アプタマーの直鎖配列を含む。１つの例は、アプタマー−ＰＡＧ−アプタマーの一次構造を有する組成物である。

核酸−ＰＥＧ−核酸結合体を生成するために、核酸は、もともとは、単一の反応部位を有する（例えば、単活性化である）ように合成される。好ましい実施形態において、この反応部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成における最後の工程として、修飾因子のホスホロアミダイトの付加によって５’末端に導入されたアミノ基である。修飾オリゴヌクレオチドの脱保護および精製の後、活性化ＰＥＧの自発的な加水分解を最小限にする溶液中で、高濃度にて再構成される。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は、「１ｍＭであり、再構成した溶液は、２００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ８．３）を含む。結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧのゆっくりとした段階的付加によって開始される。好ましい実施形態において、ＰＥＧジオールは、スクシンイミジルプロピオネートを用いる誘導体化によって両方の末端で活性化される（二重活性化）。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体は、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製されて、完全に結合した種、部分的に結合した種、および結合していない種に分離される。連結された複数のＰＡＧ分子（例えば、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマー）またはより小さいＰＡＧ鎖は、種々の長さ（または分子量）を達成するように連結され得る。非ＰＡＧリンカーは、種々の長さのＰＡＧ鎖間で使用され得る。

（反応性核酸のＰＡＧ誘導体化）
高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ結合体は、単官能性活性化ＰＥＧと１つよりも多い反応部位を含む核酸との反応によって調製され得る。好ましい実施形態において、核酸は、二反応性であるかまたは二重活性化され、２つの反応部位：従来のホスロホアミダイト合成を通してオリゴヌクレオチドに導入された５’アミノ基および３’アミノ基：を含む（例えば、図２に示されるような３’−５’−ジ−ＰＥＧ化）。代替的実施形態において、反応部位は、一級アミンの結合のための部位として例えばピリミジンの５位、プリンの８位、またはリボースの２’位を使用して、内部の位置に導入される。このような実施形態において、核酸は、いくつかの活性化部位または反応性部位を有し得、多重活性化されていると呼ばれる。合成および精製の後、その修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド反応部位との選択的反応を促進するが自発的な加水分解を最小限にする条件下で、単活性化ＰＥＧと結合される。好ましい実施形態において、モノメトキシ−ＰＥＧは、スクシンイミジルプロピオネートを用いて活性化され、カップリング反応は、ｐＨ８．３で実施される。二置換ＰＥＧの合成を行うために、化学量論的に過剰なＰＥＧが、オリゴヌクレオチドに対して提供される。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体は、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製されて、完全に結合した種、部分的に結合した種、および結合していない種に分離される。図２は、ＰＥＧ化核酸アプタマーを合成するための２つの戦略を示す。

（多価アプタマー）
また、本明細書中で、断片化された多価アプタマーおよび断片化されていない多価アプタマー（例えば、二価アプタマーまたは二量化アプタマー）が開示される。（例えば、図４Ａに記載される）断片化二価アプタマーは、２つのオリゴヌクレオチドからなる。第１のオリゴヌクレオチドは、２つ以上のアプタマードメイン（例えば、標的結合ドメイン）からなり、そのドメインは、以前に同定されたアプタマー、または一本鎖リンカードメインによって連結された以前に同定されたアプタマーの領域であり得る。第２のオリゴヌクレオチド（または「断片オリゴヌクレオチド」）は、第１のオリゴヌクレオチドのリンカードメインの部分に相補的であり、それに結合する。オリゴヌクレオチド断片は、少なくとも４０個のヌクレオチドを含む核酸配列を有し得る。連結ドメインに結合した場合、そのオリゴヌクレオチド断片は、好ましくは、連結ドメインにハイブリダイズした少なくとも２０個のオリゴヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチド断片はまた、それに結合される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有し得る。いくつかの断片化された二価アプタマー組成物において、２つ以上のアプタマードメインのうちの少なくとも１つが、結合していない（すなわち、特定の標的に結合していない）状態である。第１のオリゴヌクレオチドに対する断片オリゴヌクレオチド（好ましくは、ＤＮＡ）の結合は、以下：
（１）第１のオリゴヌクレオチドにいくらかの剛性を提供すること、
（２）一本鎖領域が標的結合領域と相互作用することを阻止すること、および／または
（３）回転自由度を減少させること
によって安定性を増加させると考えられる。

（例えば、図６に示されるような）断片化されていない二価アプタマーは、一本鎖のリンカードメインによって連結された２つの標的結合ドメイン（例えば、以前に同定されたアプタマー、または以前に同定されたアプタマーの領域）を含む単一のオリゴヌクレオチドからなる。これらの断片化されていない二価アプタマーの連結ドメインは、それに結合される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有し得る。このようなＰＡＧは、種々の長さであり得、適切な組み合わせで使用されて、所望の分子量の組成物をもたらし得る。

キレートリガンド（代表的には、二価または多価）は、それらの対応する一座リガンドまたは一価リガンドよりも、それらの結合相手とより安定な相互作用を形成することが公知である。本発明において、オリゴヌクレオチドリンカーは、複数のアプタマーを連結して、二座アプタマーまたは多座アプタマーとのキレート効果をもたらすために使用される。リンカー領域は、「断片オリゴヌクレオチド」とともにかまたはそれなしで使用されて、構築物をさらに安定化し得る。組成物のオリゴヌクレオチドリンカーは、異種配列であるか、または種々の配列および／もしくは長さのポリＵ／ＣまたはポリＡ／Ｇであり得る。種々のリンカー配列および組成物の効果は、実施例２および実施例３に記載されるようなアプタマーリガンド特性における望ましい効果を有する。

多価アプタマーは、モノマーアプタマーと比較して改善された薬力学的特性および／または薬物動態学的特性を有する。エンタルピー効果およびエントロピー効果の両方が、キレート剤様多価アプタマーの親和性の増強に寄与する。エンタルピーの獲得は、二価リガンドとその標的との間で形成されるいくつかの付加的な相互作用から生じる。エントロピーの獲得は、標的に対する２つの一価リガンドの結合形成と比較して、部分的に、二価リガンドと標的との間の１：１複合体の形成に関連するエントロピー的不利の減少を反映する。さらに、リガンドの「有効濃度」が増加される。例えば、モノマーリガンドがその標的から解離される場合、リガンドはバルク溶液に放出される；しかし、キレートの連結部分の１つが解離する場合、その動きは、結合した同族部分への束縛によって標的の近接内に制約される。

特定のリンカー配列の効果は、その化学組成および長さの両方に影響され得る。短すぎるリンカーは、キレートの形成を明確に妨害する。しかし、標的と望まれない立体的相互作用および／またはイオン性相互作用を形成するリンカーもまた、キレート化の安定化効果を打ち消す。一方、結合部位間の距離を広げるのに必要なものを超えるリンカーの延長は、リガンドの有効濃度を減少させることによって結合安定性を低下させ得る。従って、多くの場合、キレート化リガンドの親和性を最大限にするためにリンカーの組成および長さを最適化することが必要である。それにもかかわらず、実施例２および実施例３に記載されるように、２つのサイトカインホモダイマー（ＰＤＧＦおよびＴＧＦβ２）に特異的な二座アプタマーを用いる予備測定は、連結アプタマーが、アプタマー結合特性において望ましい効果を有することを示す。改善された薬力学的特性および薬物動態学的特性を有する誘導体化アプタマーは、以下に記載されるような「指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化」（「ＳＥＬＥＸ^ＴＭ」）法によって最初に得られ得る。

（ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法）
アプタマーを生成するための適切な方法は、一般的に図１に示される、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」（「ＳＥＬＥＸ^ＴＭ」）との表題が付けられているプロセスを用いることである。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、標的分子に対して高度に特異的な結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、例えば、米国特許出願番号０７／５３６，４２８（１９９０年６月１１日出願、現在は放棄されている）、米国特許第５，４７５，０９６号（発明の名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）および米国特許第５，２７０，１６３号（また、ＷＯ９１／１９８１３も参照のこと）（発明の名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）に記載されている。各ＳＥＬＥＸ^ＴＭが同定した核酸リガンドは、所定の標的化合物または標的分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、核酸が、種々の二次元構造および三次元構造を形成するために十分な能力を有し、単量体であっても、多量体であっても、実質的にいかなる化合物とも（特異的な結合対を形成する）リガンドとして機能するために、その単量体内に利用可能な十分な化学的汎用性を有するという独特な見識に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として機能し得る。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、開始点として、標準的なＤＮＡ合成器での化学合成に由来するランダム化配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドテンプレートの大きなライブラリーに依存する。いくつかの実施例において、１００％ランダムなオリゴヌクレオチドの集団がスクリーニングされる。他の実施例において、集団中の各オリゴヌクレオチドは、ランダム配列、ならびにその５’末端および／または３’末端に少なくとも１つの固定配列を含み、その固定配列は、そのオリゴヌクレオチド集団のすべての分子によって共有される配列を含む。固定配列としては、ＰＣＲプライマーに対するハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ４ｍＴ７、ＳＰ６など）に対するプロモーター配列、制限部位、またはホモポリマー配列（例えば、ポリＡ領域またはポリＴ領域）、触媒核（以下にさらに記載される）、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位、および目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にする他の配列のような配列が挙げられる。

オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の長さであり得、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得、そして修飾ヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドアナログまたは非天然のヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；同第５，６６０，９８６号；同第５，９５８，６９１号；同第５，６９８，６８７号；同第５，８１７，６３５号；および同第５，６７２，６９５号、ＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７０６５を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成を使用して、ホスホジエステル連結したヌクレオチドから合成され得る（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４６７（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５〜５５７８（１９８６））。オリゴヌクレオチドはまた、液相の方法（例えば、トリエステル合成方法）を使用して合成され得る（Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）；Ｈｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、２８：２４４９（１９７８））。代表的な合成は、１０^１５〜１０^１７分子を生じる自動ＤＮＡ合成装置で行われる。配列設計におけるランダム配列の十分に大きい領域は、各々の合成分子が独特の配列を示すようだという可能性を増加させる。

ランダム化配列を合成するために、４つすべてのヌクレオチドの混合物を、合成プロセス中の各ヌクレオチド添加工程にて加えて、ヌクレオチドのランダム導入を可能にする。一実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、完全にランダムな配列を含む；しかし、他の実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでない配列または部分的にランダムな配列の広がりを含む。部分的にランダムな配列は、４つのヌクレオチドを各添加工程にて様々なモル比で加えることによって作製され得る。

テンプレート分子は、代表的には、固定した５’末端配列および３’末端配列を含み、これらは、３０〜５０個のランダムヌクレオチドの内部領域に隣接する。標準的な（１モル）スケール合成は、１０１５〜１０１６個の個々のテンプレート分子を生じ、これはたいていのＳＥＬＥＸ^ＴＭ実験に対して十分である。ＲＮＡライブラリーは、この開始ライブラリーから、組換えＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって生成される。次いで、このライブラリーは、結合に有利な条件下で標的と混合され、そして同じ一般的選択スキームを使用して結合、分離、および増幅の段階的な反復に供されて、実質的に結合親和性および選択性に関する任意の所望の基準を達成する。核酸の混合物（好ましくは、ランダム化配列のセグメントを含む）から開始して、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、その混合物を結合に有利な条件下で標的と接触させる工程、結合してない核酸を標的分子に特異的に結合した核酸から分離する工程、核酸−標的複合体を解離させる工程、その核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅して核酸のリガンド富化混合物を得る工程、次いで、結合工程、分離工程、解離工程および増幅工程を、標的分子に対して高度に特異的な高親和性核酸を得るのに望ましいほど多くのサイクルだけ繰り返す工程を包含する。

多数の可能性のある配列および構造を含む核酸混合物内において、所定の標的に対して、広範囲の結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸混合物は、４^２０の候補の可能性を有し得る。標的に対する高親和性定数を有するものは、標的に結合する可能性が最も高い。群分離、解離および増幅の後、第２の核酸混合物を作製し、より高い結合親和性の候補について富化する。選択の追加のラウンドは、得られる核酸混合物が主に１つのみまたは２〜３の配列から構成されるようになるまで、最適なリガンドを漸次的に追い求める。次いで、これらがクローニングされ、配列決定され、そして、純粋なリガンドとして、結合親和性について個々に試験され得る。

選択および増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。多くの一般的な場合において、選択／増幅は、サイクルの反復において結合強度に有意な改善が達成されなくなるまで継続される。この方法は、約１０^１８個程度の核酸種のサンプルに対して使用され得る。試験混合物の核酸は、好ましくは、ランダム化された配列位置ならびに十分な増幅のために必須の保存された配列を含む。核酸配列改変体は、多数の方法（ランダム化された核酸配列の合成およびランダムに切断された細胞核酸のサイズ選択を含む）で産生され得る。利用可能な配列部分は、完全または部分的にランダムな配列を含み得；この配列部分はまた、ランダム化された配列を組み込まれた保存的配列の一部分を含み得る。試験核酸における配列改変は、選択／増幅相互作用の前またはその間に、変異誘発によって導入または増加され得る。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭの１つの実施形態において、選択プロセスは、選択された標的に最も強力に結合するこれらの核酸リガンドを単離する際に非常に効率的であるので、１サイクルのみの選択および増幅を必要とする。このような効率的な選択は、例えば、クロマトグラフ型のプロセス（核酸の標的に会合する能力が、カラムが最も高親和性の核酸リガンドの分離および単離を十分に可能にする様式で、カラムの操作と結び付けられる）において生じ得る。

多くの場合において、単一の核酸リガンドが同定されるまで、反復性のＳＥＬＥＸ^ＴＭ工程を実施することは必ずしも望ましくない。標的特異的な核酸リガンド溶液は、多数の保存的配列と、核酸リガンドの標的への親和性に有意に影響を及ぼすことなく置換または追加され得る多数の配列とを有する、核酸構造または核酸モチーフのファミリーを含み得る。完了する前にＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスを終了させることによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能である。

種々の核酸の一次構造、二次構造および三次構造が存在することが知られている。非Ｗａｔｏｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称の隆起であり、偽性ノットおよびこれらの無数の組み合わせであると言われている。このようなモチーフのほとんど全ての公知の場合は、たった３０ヌクレオチドの核酸配列で形成され得ることが示唆される。この理由から、隣接するランダム化セグメントを用いるＳＥＬＥＸ手順が、約２０〜５０の間のヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸配列を用いて開始されることが、しばしば好ましい。

基本的なＳＥＬＥＸ^ＴＭ方法は、多数の特異的な目的を達成するために改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、特異的な構造特性（例えば、湾曲したＤＮＡ）を有する核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ^ＴＭの使用を記載する。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子に結合し、そして／または光架橋し、そして／または光不活性化し得る光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸ^ＴＭベースの方法を記載する。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許出願番号０８／７９２，０７５（１９９７年１月３１日出願、発明の名称「Ｆｌｏｗ Ｃｅｌｌ ＳＥＬＥＸ」）は、標的分子に対して高い親和性を持つオリゴヌクレオチドと低い親和性を持つオリゴヌクレオチドとを非常に効率的に分割することを達成する、ＳＥＬＥＸ^ＴＭベースの方法を記載する。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスが実施された後に、改善された核酸リガンドを得るための方法を記載する。米国特許第５，７０５，３３７号は、その標的に対するリガンドの共有結合のための方法を記載する。これらの特許および出願の各々は、本明細書中に参考として具体的に援用される。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭはまた、標的分子上の１つ以上の部位に結合する核酸リガンドを得るために、そして、標的上の特異的な部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために使用され得る。ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、任意の想定され得る標的（タンパク質（核酸結合タンパク質、そして、その生物学的機能の部分として核酸に結合することが知られていないタンパク質の両方を含む）補因子を含む高分子および低分子ならびに他の低分子が挙げられる）に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。ＳＥＬＥＸ^ＴＭによって同定された、カフェインおよびその密接に関連するアナログであるテオフィリンに対して高い親和性で結合し得る核酸配列の議論については、米国特許第５，５８０，７３７を参照のこと。

カウンター−ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、１つ以上の非標的分子への交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善するための方法である。カウンター−ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、以下の工程から構成される：ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；ｂ）候補混合物を標的に接触させ、候補混合物と比較して、標的に対して増加した親和性を有する核酸が、候補混合物の残りから分離され得る、工程；ｃ）候補混合物の残りから増加した親和性の核酸を分離する工程；ｄ）増加した親和性の核酸を１つ以上の非標的分子と接触させ、その結果、非標的核酸分子に対して特異的な親和性を有する核酸リガンドが除去される、工程；ならびにｅ）標的分子に対して特異的な親和性を有する核酸を増幅して、標的分子に結合するために、比較的高い親和性と特異性とを有する核酸配列を富化された核酸の混合物を得る工程。

治療剤およびワクチンとしての核酸の使用において遭遇する１つの潜在的な問題は、オリゴヌクレオチドが、そのホスホジエステル形態において、所望の効果が現れる前に細胞内酵素および細胞外酵素（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）によって体液中で素早く分解され得るということである。従って、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、リガンドにおける特性の改善（例えば、インビボ安定性の改善または送達特性の改善）を与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例としては、リボース位および／またはリン酸位および／または塩基位での化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸ^ＴＭで同定された修飾ヌクレオチドを含む核酸は、米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、それは、リボースの２’位、ピリミジンの５位およびプリンの８位にて化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許第５，７５６，７０３号は、種々の２’修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ置換基（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ置換基（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル置換基（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む、高度に特異的な核酸を記載する。

本発明において意図される核酸リガンドの修飾としては、核酸リガンド塩基もしくは全体としての核酸リガンドに追加の電荷、極性、疎水性、水素結合、静電相互作用、および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を導入する他の化学基を提供する修飾が挙げられるが、これらに限定されない。このような修飾としては、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモウラシルもしくは５−ヨードウラシルの置換；骨格修飾、ホスホロチオエート修飾もしくはアルキルホスフェート修飾、メチル化、異常な塩基対の組み合わせ（例えば、イソ塩基（ｉｓｏｂａｓｅ）であるイソシチジンおよびイソグアノシンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾としてはまた、３’修飾および５’修飾（例えば、カップリング）が挙げられ得る。本発明の好ましい実施形態において、核酸リガンドは、ＲＮＡ分子であり、これは、ピリミジン残基の糖部分で２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている。

修飾は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾またはＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾であり得る。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ標的に対する特異性および改善されたインビボでの安定性の両方を有する核酸リガンドを生じる。２’−ＯＨ核酸リガンドに対してなされるＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾は、その核酸リガンドの結合能に不利に影響することなく、インビボでの安定性の改善を生じ得る。

他の修飾は、当該分野で公知である。このような修飾は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾（以前に同定された修飾されていないリガンドの修飾）を構成し得るか、またはＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスへの組み込みによってなされ得る。

ＳＥＬＥＸ方法は、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチドの機能単位と合わせる工程を包含する。ＳＥＬＥＸ方法はさらに、米国特許第６，０１１，０２０号に記載されるように、選択された核酸リガンドを、診断用または治療用複合体中の親油性または非免疫原性の高分子量化合物と合わせる工程を包含する。診断用または治療用複合物中の親油性化合物と結合されるＶＥＧＦ核酸リガンド（例えば、ジアシルグリセロールまたはジアルキルグリコール）が、米国特許第５，８５９，２２８号に記載される。

親油性化合物（例えば、グリセロール脂質）または非免疫原性高分子量化合物（例えば、ポリアルキレングリコール）と結合されるＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許第６，０５１，６９８号にさらに記載される。非免疫原性の高分子量化合物または親油性化合物と結合されるＶＥＧＦ核酸リガンドはさらに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９８／１８４８０に記載される。これらの特許および特許出願は、形状および他の特性のアレイの広範な組み合わせ、ならびに、他の分子の所望の特性を有するオリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製特性を可能にする。上記の参考文献の各々（これらは、基本的なＳＥＬＥＸ手順の改変を記載する）は、その全体が参考として具体的に援用される。

ＳＥＬＥＸ方法による、小さな可撓性特性に対する核酸リガンドの同定が探索されている。低分子ペプチドは、可撓性構造を有し、通常は、多数の配座異性体が平衡した状態で溶液中に存在し、従って、最初は、結合親和性が可撓性ペプチドを結合する際に失われるその立体構造エントロピーによって制限され得ると考えられた。しかし、溶液中の低分子ペプチドに対する核酸リガンドの同定の可能性が、米国特許第５，６４８，２１４号に示された。この特許において、サブスタンスＰに対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンド（１１アミノ酸ペプチド）が同定された。この参考文献は、その全体が参考として具体的に援用される。

ヌクレアーゼおよび加水分解に対して抵抗性であるオリゴヌクレオチド集団を作製するために、修飾オリゴヌクレオチドが使用され得、これらとしては、１つ以上の置換ヌクレオチド間結合、改変糖、改変塩基、またはこれらの組み合わせが挙げられ得る。１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）、または３’−アミン（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）により置換されたオリゴヌクレオチドが提供され、各ＲまたはＲ’は独立してＨまたは置換もしくは非置換アルキルである。結合基は、−Ｎ−結合または−Ｓ−結合を介して近接するヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。

さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾糖基を含み、例えば、１つ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン、脂肪族基で置換されるか、または、エステルもしくはアミンとして官能化される。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位が、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリルまたはハロ基のいずれかにより置換される。２’−修飾糖の合成方法は、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載される。２−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマー分子の使用は、置換されていないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを使用して作製されたものよりも１０倍〜１００倍、標的分子についての核酸センサー分子の感受性を増加させ得（Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３（１９９７））、標的分子とのさらなる結合相互作用を提供し、かつ、核酸センサー分子の二次構造の安定性を増加する（Ｋｒａｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：５２０９−５２１２（１９９８）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７（１９９１）；Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５５２９−５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：６８−７３（１９９７））。

核酸アプタマー分子は一般に、５〜２０サイクルの手順で選択される。１つの実施形態において、異質性は、最初の選択段階においてのみ導入され、複製手順の間では生じない。

ＤＮＡ配列の出発ライブラリーは、ＤＮＡ合成装置での自動化化学合成により作製される。この配列ライブラリーは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＲＮＡへと転写され、精製される。１つの実施形態において、５’固定：ランダム：３’固定の配列が、３０〜５０のヌクレオチドを有するランダム配列により分離される。

（薬学的組成物）
本発明はまた、本発明のアプタマー分子を含む薬学的組成物を包含する。いくつかの実施形態において、その組成物は、内用に適しており、有効量の薬理学的に活性な本発明の化合物を、単独もしくは１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。その化合物は、たとえ毒性があるにしても非常に低いという点で特に有用である。

本発明の組成物は、患者における病理（例えば、疾患または障害）を処置もしくは予防するためか、またはそのような疾患または障害を軽減するために使用され得る。本発明の組成物は、アプタマーもしくはアプタマードメインが特異的に結合する標的に関連するかもしくは由来する、疾患もしくは障害を有するかまたはそれらの疾患もしくは障害にかかりやすい被験体への投与のために有用である。

例えば、標的は、病理に関連するタンパク質（例えば、その病理を引き起こす標的タンパク質）である。

本発明の組成物は、病理を有する患者を処置するための方法において使用され得る。その方法は、その患者に、その病理に関連する標的（例えば、タンパク質）に結合するアプタマーを含む組成物を投与する工程を包含し、その結果、その標的への組成物の結合が、標的の生物学的機能を変化させ、それによって、その病理を処置する。

病理を有する患者（例えば、本発明の方法によって処置される）は、哺乳動物であり得るか、またはより詳細にはヒトであり得る。

実際には、化合物またはその薬学的に受容可能な塩は、それらの所望の生物学的活性を発揮するのに十分な量で投与される。

例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与のために、活性薬物成分は、経口、非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と合わされ得る。さらに、所望される場合または必要な場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤がまた、混合物中に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン、天然糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース、コーン甘味料（ｃｏｒｎ ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ））、天然および合成ガム（例えば、アラビアゴム、トラガントまたはアルギン酸ナトリウム）、ポリエチレングリコール、蝋などが挙げられる。これらの投薬形態において使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、珪素、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または、発泡性混合物などが挙げられるがこれらに限定されない。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンが挙げられる。

注射可能な組成物は、好ましくは、等張の水溶液または水性懸濁液であり、坐剤は、有利には、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から調製される。この組成物は、滅菌であり得、そして／または、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液のようなアジュバントを含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。この組成物は、それぞれ、従来の混合法、造粒法またはコーティング法に従って調製され、約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５．０％の活性成分を含む。

本発明の化合物はまた、時限放出および持続放出の錠剤またはカプセル、丸剤、散剤、顆粒、エリキシル剤、チンキ、懸濁液、シロップおよびエマルジョンとしてのこのような経口投薬形態で投与され得る。

液体（特に、注射可能な組成物）は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの薬学的に純粋な溶媒中に溶解されるかこのような溶媒と混合され、それによって、注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射前に液体に溶解するために適切な固体形態が処方され得る。注射可能な組成物は、好ましくは、水性等張溶液または懸濁液である。この組成物は、滅菌され得、そして／または保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、ならびに／もしくは緩衝液のようなアジュバントを含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。

本発明の化合物は、静脈内（大量および注入の両方）、腹腔内、皮下または筋肉内形態で投与され得、使用する全ての形態は薬学分野の当業者に周知である。注射用剤は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして従来の形態で調製され得る。特に、本発明の材料は、以下に記載される方法を用いて眼窩に送達され得る。さらに、本発明の材料は、以下に記載されるように、当該分野で公知の様式で被験体に投与され得る。

非経口注射投与は、一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書中に参考として援用される）に従って遅速放出または持続性放出系の移植物を使用し、これは、一定レベルの投薬量が維持されることを保証する。

さらに、本発明の好ましい化合物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所使用を介する鼻腔内形態か、または、当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態を使用する経皮経路を介して投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬投与は当然、投薬レジメンの間中、断続的ではなく連続的である。他の好ましい局所調製物としては、クリーム、軟膏、ローソン、エアロゾルスプレーおよびゲルが挙げられ、活性成分の濃度は、０．１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲である。

固形組成物について、賦形剤としては以下が挙げられる：マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの薬学的グレードが使用され得る。上記で定義された活性化合物がまた、例えば、キャリアとしてポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）を使用して、坐剤として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐剤は、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。

本発明の化合物はまた、リポソーム送達系（例えば、小さな単層小胞、大きな単層小胞および多層小胞）の形態で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含有する種々のリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態において、脂質成分のフィルムが、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、薬物の水溶液で水和されて薬物をカプセル化する脂質層を形成する。例えば、本明細書中に記載されるアプタマー−毒素および／またはリボレセプター分子は、当該分野で公知の方法を使用して構築された親油性化合物または非免疫原性、高分子量化合物との複合体として提供され得る。核酸結合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供される。

本発明の化合物はまた、標的化可能な薬物キャリアとして溶解性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラス（例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー）とカップリングされ得る。

所望される場合、投与される薬学的組成物はまた、少量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤）および他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。

化合物を利用する投薬レジメンは、患者の型、種、年齢、体重、性別および病状；処置される状態の重篤度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに使用される特定の化合物またはその塩を含む種々の因子に従って選択される。当業者である医師または獣医は、状態の進行を予防、対応または停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定し、処方し得る。

本発明の経口投薬量は、所定の効果について使用される場合、１日あたり経口で約０．０５〜１０００ｍｇの間の範囲である。組成物は好ましくは、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００．０ｍｇ、２５０．０ｍｇ、５００．０ｍｇおよび１０００．０ｍｇの活性成分を含有する分割錠の形態で提供される。本発明の化合物の有効血漿レベルは、１日あたり０．０２ｍｇ〜５０ｍｇ／体重（ｋｇ）の範囲である。

本発明の化合物は、１日に１回の用量で投与され得るか、または、合計１日投薬量が１日に２回、３回または４回の分割用量で投与され得る。

本明細書中に引用されるすべての刊行物および特許文献は、あたかも各々のそのような刊行物または文献が、特異的かつ一義的に本明細書中に参考として援用されると示していたかのように、本明細書中で参考として援用される。刊行物および特許文献の引用は、いずれかが妥当な先行技術であるという承認として意図されず、また内容または同一の日付に関していかなる承認も構成しない。本発明は、書面による明細書を目的としてここで記載されており、当業者は、本発明が、種々の実施形態で実行され得ること、および上記説明および以下の実施例が、例示目的であり、添付の特許請求の範囲の限定ではないことを理解する。

（実施例１）
（３’−５’−ジ−ＰＥＧ化アプタマーの調製）
配列番号１−−５’−ＮＨ_２−２’ＯＭｅ［ＧＧＧＧＵＵＡＵＵＡＣＡＧＡＧＵＣＵＧＵＡＵＡＧＣＵＧＵＡＣＣＣ］−［３’Ｔ］−３’−−、および配列番号２−−５’−ＮＨ_２−２’ＯＭｅ［ＧＧＧＧＵＵＡＵＵＡＣＡＧＡＧＵＣＵＧＵＡＵＡＧＣＵＧＵＡＣＣＣ］−ＮＨ_２−３’−−（ここで、「２’ＯＭｅ」は、２’位にメトキシ基を有する修飾ヌクレオチドを示し、そして「３’Ｔ」は、反転したチミジン残基をいう）の配列を有する２つのオリゴヌクレオチドを、市販の２’−ＯＭｅ ＲＮＡホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用して、推奨される製造業者の手順に従って、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成器（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で合成した。５’−アミン官能基を、アミノ修飾因子Ｃ６試薬で結合させ、３’−アミンをアミノ修飾因子Ｃ３ ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用して導入した。脱保護後、そのオリゴヌクレオチドを、エバポレートして乾燥させ、エタノール沈殿を２回して残留したアンモニアを除去し、そして水に再溶解させて１ｍＭの濃度にした。結合反応のために、７．５μＬのオリゴヌクレオチドを、等しい容積の２００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ８．３）、および１５μＬのｍＰＥＧ−ＳＰＡ ２０ｋＤａ（アセトニトリル中で４０ｍｇ／ｍＬの濃度で）もしくはｍＰＥＧ−ＮＨＳ ４０ｋＤａ（アセトニトリル中で８０ｍｇ／ｍＬの濃度で）を加えた。室温で６０分間反応した後、反応物の５μＬアリコートを、４μＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）でクエンチした。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を、ＤＮＡ−Ｐｒｅｐ ＨＣカラム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）（溶媒Ａ １００ｍＭ ＴＥＡＡ、溶媒Ｂ ９０％ ｖ／ｖのアセトニトリル中の１００ｍＭ ＴＥＡＡ、１８分で５〜１００％のＢ、カラム温度 ８０℃、注入 １０μＬ、２６０ｎｍで吸光度検出）で実施した。精製ＨＰＬＣ追跡は、図３に示されており、これは、８０ｋＤａのＰＥＧまでの分子量を有するジ−ＰＥＧ化結合体に関して首尾よい調製を示す。

（実施例２）
（オリゴヌクレオチド断片安定化剤を有する二座ＰＤＧＦアプタマー）
、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る高分子量アプタマー組成物を、以下の方法を使用して生成した。図４（Ａ）に示される配列を有するダイマーかまたは二座のＰＤＧＦアプタマーを、標準的な試薬（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｓｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡにより提供されたオリゴヌクレオチド）を使用して合成した。図４（Ｂ）に示されるように、標的（ＰＤＧＦ ＢＢまたはＡＢのいずれか）に対する二座アプタマーの親和性の増強は、より高いタンパク質濃度でもっとも大きく、その濃度での結合条件は、１０ｐＭ未満のＲＮＡリガンド濃度を有する１×ＰＢＳ中で２５℃の温度であった。さらに、図５に示されるように、図４（Ａ）に示されるようなリンカー領域に相補的なＤＮＡ断片の使用は、オリゴヌクレオチド断片を含むＰＤＧＦ−ＢＢおよびオリゴヌクレオチド断片を含まないＰＤＧＦ−ＢＢに対する二座アプタマーの割合のプロットに示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する二座アプタマーリガンドの親和性における増強効果を有した。この増強は、リンカー領域内の回転の自由度における断片依存性低下を反映し、二座リガンドの有効濃度における増加をもたらし得た。ＰＤＧＦ−ＢＢに対する一座アプタマーへの断片ＤＮＡの付加は、結合親和性における効果は有さなかった（図５）。

配列番号３−断片オリゴヌクレオチド（ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）

配列番号４−−ＰＤＧＦ二座アプタマー

（実施例３）
（ホモリマー（ｈｏｍｏｌｙｍｅｒｉｃ）オリゴヌクレオチドリンカーを有するＴＧＦβ２キレート化アプタマー）
ＴＧＦβ２に結合し得る高分子量アプタマー組成物を、以下の方法を使用して生成した。以下の配列番号４に示される配列を有するＴＧＦβ２アプタマーに基づくＴＧＦβ２二座アプタマーのいくつかの構築物を、図６に示されるような種々の長さおよび配列組成のポリＵ／Ｃリンカーを用いて合成した。アプタマーを連結する場合に、そのアプタマーの３’末端に二重らせんの伸長物を加えて、不適切な配座異性体を分裂させた。表１は、ＴＧＦβ２二座アプタマーの合成に使用した種々のスペーサーの長さおよび配列を示す。

（表１．リンカー配列、Ｎ＝オリゴヌクレオチドの長さ）

図７（Ａ）は、種々のリンカー長およびリンカー組成を有する二座アプタマーの割合、ならびにＴＧＦβ２への結合におけるそれらの効果を示す結合プロットである。リンカーの付加は、Ｋ_Ｄにおける２倍未満の変化に反映されるように、結合親和性においてほとんど効果を有さないが、高いＴＧＦβ２濃度では、結合における相違が観察される。これらの条件下で、結合は、リンカー長に依存性であり、２０ヌクレオチド以下のリンカーについて結合の増強が観察される。

図７（Ｂ）は、競合アッセイであり、そのアッセイにおいて、すべての二座アプタマー構築物が、放射標識したＡＲＣ７７を有するＴＧＦβ２に対する結合について競合している。５塩基対末端伸長（図６における陰影を付けた領域）を含む非標識ＡＲＣ７７および非標識ＡＲＣ７７は、一座コントロール競合相手として含める。同様の競合が、コントロールアプタマーおよび３０ヌクレオチド以上のリンカー領域を含む二座アプタマーの濃度の増加について観察される。しかし、より短いリンカー配列（２０ヌクレオチド以下）を有する二座アプタマーは、約１０分の１のＫ_ｃｏｍｐを示し、結合親和性の増強と一致する。まとめると、図７Ａおよび７Ｂに示される結果は、単一の二座アプタマーを形成するためのアプタマーの連結は、リガンド結合安定性において望ましい効果を有し得ることを示す。

配列番号５（「ｆ」は、２’位にフルオロ基を有する修飾ヌクレオチドを示す）

図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからの、インビトロアプタマー選択（ＳＥＬＥＸ^ＴＭ）プロセスを示す。 図２は、高分子量ＰＥＧ−核酸結合体の合成のための、種々のストラテジーを示す。 図３は、３’−５’−ジＰＥＧ化核酸の合成に関するクロマトグラフィー追跡である。 図４（Ａ）は、オリゴヌクレオチド断片で安定化された二座アプタマーリガンドに結合したＰＤＧＦを示す；図４（Ｂ）は、モノマーのコントロールに対して、ＰＤＧＦ−ＢＢに結合した二座アプタマーの割合を示す結合プロットである。 図５（Ａ）は、ＰＤＧＦ−ＢＢ二座アプタマーの親和性における１０ｎＭの断片ＤＮＡの効果を示す結合プロットである；図５（Ｂ）は、ＰＤＧＦ−ＢＢ二座アプタマーの親和性における１００ｎＭの断片ＤＮＡの効果を示す結合プロットである。 図６は、種々のスペーサー組成物および種々の長さを有するＴＧＦβ２二座アプタマーの設計を示す。 図７（Ａ）は、ＴＧＦβ２二座アプタマーの結合における種々のリンカー長および種々の組成物の効果を示す結合プロットである。図７（Ｂ）は、種々のヌクレオチドリンカー長を有する、^３２Ｐ標識化ＴＧＦβ２アプタマーと、ＴＧＦβ２二座アプタマーとの競合アッセイのプロットである。５〜２０ｎｔのリンカーは、Ｋ_ｃｏｍｐ＝０．３ｎＭを示し、３０〜５０ｎｔのリンカーは、Ｋ_ｃｏｍｐ＝３〜４ｎＭを示し、およそ１０分の１であった。

【配列表】

Claims (57)

1. 高分子量アプタマー組成物であって、以下：
   （ａ）２つ以上のアプタマーを含む核酸、および
   （ｂ）連結部分を含む安定化部分であって、ここで、該連結部分は、核酸分子ではない、安定化部分
   を含む、アプタマー組成物。
2. 前記連結部分は、ポリアルキレングリコールを含む、請求項１に記載のアプタマー組成物。
3. 前記連結部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項２に記載のアプタマー組成物。
4. 前記核酸は、第１のアプタマーおよび第２のアプタマーを含む、請求項３に記載のアプタマー組成物。
5. 請求項４に記載のアプタマー組成物であって、前記第１のアプタマーおよび第２のアプタマーは、前記ＰＥＧ連結部分によって連結されており、さらにここで、該アプタマー組成物の一次構造は線形配列を含み、該配列において、該第１のアプタマーが該ＰＥＧ連結部分の第１の末端に連結され、そして該第２のアプタマーが該ＰＥＧ連結部分の第２の末端に連結される、アプタマー組成物。
6. 前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結部分は、多重活性化される、請求項３に記載のアプタマー組成物。
7. 前記ＰＥＧ連結部分は、二重活性化される、請求項６に記載のアプタマー組成物。
8. 請求項１に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る、アプタマー組成物。
9. 請求項１に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る、アプタマー組成物。
10. 前記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤよりも大きいからなる群より選択される分子量を有する、請求項１に記載のアプタマー組成物。
11. 高分子量アプタマー組成物であって、以下：
    （ａ）リンカードメインによって連結される２つ以上のアプタマードメインを含む核酸部分、および
    （ｂ）該リンカードメインに結合される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を含む安定化部分
    を含む、アプタマー組成物。
12. 前記安定化部分は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、請求項１１に記載のアプタマー組成物。
13. 請求項１１に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る、アプタマー組成物。
14. 請求項１１に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る、アプタマー組成物。
15. 前記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤよりも大きいからなる群より選択される分子量を有する、請求項１１に記載のアプタマー組成物。
16. 高分子量アプタマー組成物であって、以下：
    （ａ）２つ以上のアプタマードメインおよびリンカードメインを含む核酸、および
    （ｂ）該リンカードメインの少なくとも一部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド断片を含む安定化部分であって、ここで、該オリゴヌクレオチド断片は、少なくとも４０個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む、安定化部分
    を含む、アプタマー組成物。
17. 前記オリゴヌクレオチド断片は、前記リンカードメインの少なくとも２０個のヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項１６に記載のアプタマー組成物。
18. 請求項１６に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る、アプタマー組成物。
19. 請求項１６に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る、アプタマー組成物。
20. 前記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤよりも大きいからなる群より選択される分子量を有する、請求項１６に記載のアプタマー組成物。
21. 高分子量アプタマー組成物であって、以下：
    （ａ）２つ以上のアプタマードメインおよびリンカードメインを含む核酸部分、および
    （ｂ）該リンカードメインの少なくとも一部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド断片を含む安定化部分であって、ここで、該オリゴヌクレオチド断片は、それに結合される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有する、安定化部分
    を含む、アプタマー組成物。
22. 前記オリゴヌクレオチド断片は、前記リンカードメインの少なくとも２０個のヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項１６に記載のアプタマー組成物。
23. 前記オリゴヌクレオチド断片は、それに結合される１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有する、請求項２１に記載のアプタマー組成物。
24. 前記オリゴヌクレオチド断片は、少なくとも４０個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のアプタマー組成物。
25. 請求項２１に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る、アプタマー組成物。
26. 請求項２１に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る、アプタマー組成物。
27. 前記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤよりも大きいからなる群より選択される分子量を有する、請求項２１に記載のアプタマー組成物。
28. 高分子量アプタマー組成物であって、以下：
    （ａ）２つ以上のアプタマードメインおよびリンカードメインを含む核酸部分、および
    （ｂ）該リンカードメインの少なくとも一部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド断片を含む安定化部分
    含み、ここで、該２つ以上のアプタマードメインは、非結合状態である、アプタマー組成物。
29. 前記オリゴヌクレオチド断片は、前記リンカードメインの少なくとも２０個のヌクレオチドにハイブリダイズする、請求項２８に記載のアプタマー組成物。
30. 前記オリゴヌクレオチド断片は、少なくとも４０個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載のアプタマー組成物。
31. 前記オリゴヌクレオチド断片は、それに結合される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有する、請求項３０に記載のアプタマー組成物。
32. 前記オリゴヌクレオチド断片は、それに結合される１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有する、請求項３１に記載のアプタマー組成物。
33. 請求項２８に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に結合し得る、アプタマー組成物。
34. 請求項２８に記載のアプタマー組成物であって、該アプタマー組成物は、ＴＧＦβ２に結合し得る、アプタマー組成物。
35. 前記高分子量アプタマー組成物は、１０ｋＤよりも大きい、２０ｋＤよりも大きい、４０ｋＤよりも大きい、および８０ｋＤよりも大きいからなる群より選択される分子量を有する、請求項２８に記載のアプタマー組成物。
36. 請求項１に記載のアプタマー組成物を含む、治療用組成物。
37. 請求項１１に記載のアプタマー組成物を含む、治療用組成物。
38. 請求項１６に記載のアプタマー組成物を含む、治療用組成物。
39. 請求項２１に記載のアプタマー組成物を含む、治療用組成物。
40. 請求項２８に記載のアプタマー組成物を含む、治療用組成物。
41. 高分子量アプタマー組成物であって、以下：
    （ａ）アプタマー、および
    （ｂ）２つ以上の非核酸安定化部分
    を含む、アプタマー組成物。
42. 前記安定化部分は、ポリアルキレングリコールを含む、請求項４１に記載のアプタマー組成物。
43. 前記安定化部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項４２に記載のアプタマー組成物。
44. 前記アプタマーは、多重活性化される、請求項４１に記載のアプタマー組成物。
45. 前記アプタマーは、二重活性化される、請求項４４に記載のアプタマー組成物。
46. アプタマー治療用組成物の薬物動態学的特性または薬物動力学的特性を改良する方法であって、該方法は、核酸アプタマーに反応基を導入し、該アプタマーにおける該反応基を、安定化部分における反応基と反応させ、それによって、安定化した高分子量治療用アプタマーを形成する工程を包含する、方法。
47. 請求項４６に記載の方法であって、前記アプタマー組成物における前記反応基は、改変型ホスホロアミダイト合成によって導入されるアプタマーの５’または３’末端でのアミノ基である、方法。
48. 前記安定化部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項４６に記載の方法。
49. 前記ＰＥＧはホモ−二官能性であり、得られるアプタマーは、ＰＥＧリンカーによって連結されたダイマーである、請求項４８に記載の方法。
50. 前記アプタマーは、多重活性化される、請求項４６に記載の方法。
51. 前記アプタマーは、５’末端および３’末端で二重活性化される、請求項５０に記載の方法。
52. 前記安定化部分は、単活性化されたＰＥＧであり、得られるアプタマーは、二重ＰＥＧ化される、請求項５０に記載の方法。
53. 被験体における疾患を処置する方法であって、請求項１に記載の高分子量アプタマー組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
54. 被験体における疾患を処置する方法であって、請求項１１に記載の高分子量アプタマー組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
55. 被験体における疾患を処置する方法であって、請求項１６に記載の高分子量アプタマー組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
56. 被験体における疾患を処置する方法であって、請求項２１に記載の高分子量アプタマー組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
57. 被験体における疾患を処置する方法であって、請求項２８に記載の高分子量アプタマー組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。

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