JP2017523781A - アンタゴニストic pd−1アプタマー及びその癌治療関連用途への応用 - Google Patents
アンタゴニストic pd−1アプタマー及びその癌治療関連用途への応用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(i)CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC(配列番号8)又は
(ii)TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT(配列番号9)に対して少なくとも85%(例えば、90%又は95%)同一の核酸配列を含む。一例によれば、前記アプタマーは、
(i)CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC(配列番号8)又は
(ii)TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT(配列番号9)の核酸配列を含む。別の例によれば、アプタマーは、
(i)TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC(配列番号10);
(ii)TCCCTACGGCGCTAACTGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCTGCCACCGTGCTACAAC(配列番号11);又は
TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATGCCACCGTGCTACAAC(配列番号12)である。
本明細書では、PD−1に結合してその活性を阻害し、それによって免疫活性(例えば、T細胞活性)を高める核酸アプタマー(抗PD−1アプタマー)について記載される。
5’-TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC-3’(配列番号10)、
5’-TCCCTACGGCGCTAACTGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCTGCCACCGTGCTACAAC-3’(配列番号11)、又は
5’-TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATGCCACCGTGCTACAAC-3’(配列番号12)のヌクレオチド配列を有する。ここで下線/イタリックのフランキング配列は、5’及び3’末端のプライマー部位を示す。
本明細書で記載される抗PD−1アプタマー、アプタマーダイマー、又はそれらのPEGコンジュゲートのうち1又は2以上を、医薬的に許容可能な担体(賦形剤)と混合して、例えば、標的の病気の治療に用いられる医薬組成物を形成することができる。「許容可能」とは、前記担体が前記組成物の薬効成分と相溶でなければならず(及び前記薬効成分を安定化させることができることが好ましい)、治療対象に有害ではないことを意味する。医薬的に容認可能な賦形剤(担体)としては、当該分野で周知の緩衝液が挙げられる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed(レミントン:薬学の科学と実践、第20版). (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照のこと。
本明細書で記載される抗PD−1アプタマー、ダイマー、又はそのPEGコンジュゲートの何れかを用いて、免疫活性の亢進、特にT細胞増殖の促進を図ってもよく、これによって癌又は伝染病(例えば、ウイルス(例えば、HIV)感染又は細菌感染)の治療に有効になる。
本開示はまた、免疫活性(例えば、T細胞活性)を高め、癌(例えば、肺癌、メラノーマ、結腸直腸癌、又は腎細胞癌)を軽減し、かつ/又はHIV感染のリスクを低減するキットを提供する。そのようなキットは、CTLA4に結合するアプタマー(例えば、本明細書で記載されるアプタマーの何れか)を含む1つ以上の容器を含んでいてもよい。
本発明を実施するに当たっては、別途記載しない限り、従来の分子生物学(組換技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術が含まれる。これらは技術常識の範囲内である。Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
非特異的アプタマー数を低減するべくPD1細胞外ドメインを選択に用いた。発明者等が用いたSELEXストラテジーは、図1に示すような膜SELEXである。要約すると、PD1タンパク質をアプタマーライブラリーと共にインキュベートし、真空吸引によりニトロセルロース膜を通過させた。数回の洗浄を行うと、PD1を結合したアプタマーが膜にトラップされ、更にPCR反応で増幅される。単鎖アプタマーからなる新たなアプタマープールがPCR産物から単離され、これをPD1タンパク質の新たなバッチとインキュベートして、SELEXの新規ラウンドを開始する。アプタマープールが首尾良く進化したことを示すために、PD1選択のラウンド4、8、12、及び16からのアプタマープールを選択し、分析した。RT−qPCRを連結した総結合アッセイによって、結合親和性及び特異性を測定した(図2)。これらのデータによれば、SELEXラウンド数の増加に伴って、親和性が増大していた。例えば、親和性は120.7nM(ラウンド4)〜6.6nM(ラウンド16)に増加した(図2)。これらのデータは、本発明者等のSELEX手順が、高親和性且つ特異的なアプタマーを選択する上で効率的に機能したことを示している。16回の選択ラウンドの後、前記アプタマープールの配列を決定した。
ラウンド4、8、12、及び16におけるアプタマープールをPD−1に対して増幅し、続いて500nMから開始して2倍ずつ連続希釈を行った。選択されたプールの各々について、10の用量点でPD−1タンパク質とインキュベートすることにより分析した。結合されたアプタマーをセルロース膜結合によって単離し、RT−qPCRで定量した。結果をXYプロットで示した。黒丸はラウンド4、緑四角はラウンド8、青三角はラウンド12、赤逆三角はラウンド16の結果を示す。点線は各プールの適合曲線を示す。ラウンド4、8、12、及び16の解離定数は、それぞれ493.7nM、245.7nM、18.5nM、及び6.8nMであった。
図3のパネルAは、PD−1アプタマーの結果のツリー表示を示す。図3のパネルBは、PD−1に結合した、クラスタ化PD−1アプタマーの配列詳細を示す。囲み領域は、PD−1アプタマー内の保存領域を示す。ラウンド16のアプタマープールはTAクローニングであり、50クローンを選択して配列決定に供した。配列はクラスタ化ソフトウェアで分析した。ツリー表示の結果は、プール16で進化した優勢な群を示す(図3、パネルA)。図3のパネルBは、9ヌクレオチド塩基の保存領域を含む、PD1アプタマーの詳細な配列情報を示す。これら9ヌクレオチド塩基はCCATCTCCC(配列番号1)である。このコア配列を含む核酸はPD−1に結合すると予想される。配列番号24〜42の核酸配列を以下に示す。
PD−1アプタマープール内の2つの主要な配列群として、PD7及びPD16を選択した。総結合アッセイの示すところによれば、PD7(図4、パネルB)及びPD16(図4、パネルA)の結合親和性は、それぞれ9.7nM及び2.1nMであった。Mfoldソフトウェアを用いてPD7及びPD16アプタマーの二次構造を予測したところ、結果が示すところでは、PD7とPD16との間で二次構造に有意な類似性は観られなかった(図、パネルC)。更に、PD7及びPD16内の保存された領域は、異なる部位に存在し、幹/ループ構造に関与していた(図4、パネルC)。この結果は、これらのアプタマーの二次構造が、PD−1タンパク質への結合に関与する主要因子ではないことを示している。
7つの主要な配列群として、7つのPD−1アプタマーを選択し、T細胞増殖アッセイに供した。本試験で検討したPD−1アプタマーは、PD16、PD13、PD6、PD7、PD8、PD9、及びPD24である。これらのヌクレオチド配列を以下に示す。これらのアプタマーは何れも、対照群と比較してT細胞増殖を増加させた。前記アプタマーの一つであるPD7は、CD3/CD28刺激の不在下(図5、パネルA)又は存在下(図5、パネルB)の何れでも、T細胞増殖の誘導に関して最も強い効果を示し、PD−1アンタゴニスト抗体よりも強いT細胞活性因子であった。これらの結果が示すところでは、PD7により、PD−1アンタゴニスト抗体と比較して、シグナルが30%超も増大した(図5、パネルA)。
例1に記載のSELEXで単離された抗PD−1アプタマーの更なるアプタマーヌクレオチド配列を、次世代配列決定(NGS)データを用いた統計分析で同定した。
コア1 − CCATCTCCC(配列番号1);
最適化コア1 − CCATCTCCCGTCC(配列番号7)
コア2 − TATATTGTCC(配列番号20);
コア3 − GTACAGTT(配列番号21);
コア4 − GCACTACA(配列番号4);
コア5 − GTACATCA(配列番号22);及び
コア6 − GCTACTGT(配列番号23)。
アプタマーを用いて、他の生物種とのPD−1結合の交差反応性を、インビトロPD−1アプタマー結合アッセイにより検証した。要約すると、200ngのヒスチジンタグ標識PD−1受容体(His tag −PD1タンパク質)によって、ニッケル−ニトリロ三酢酸(Ni−NTA)被覆プレートを被覆し、5’末端にビオチンをコンジュゲートしたアプタマー(ビオチン−PD−1アプタマー)で処理した。前記アプタマーのPD−1への結合は、ストレプトアビチン−HRP及びECL基質を用いて検出した。インビトロPD−1結合アッセイの模式図を図9に示す。試験したアプタマーは以下のとおりである。
PD7 − TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC(配列番号10;コア配列を下線で示す);
PD100 − TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATG CCACCGTGCTACAAC(配列番号12;コア配列を下線で示す)。
コア1 − CCATCTCCC(配列番号1);及び
コア2 − TATATTGTCC(配列番号20)。
リンパ球増殖アッセイを用いて、遊離アプタマー及びPEGコンジュゲート化アプタマー(PEGコンジュゲート)の双方を含む抗PD−1アプタマーによる、リンパ球増殖の促進能を検証した。要約すると、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll−paqueで単離し、完全RPMI培地で一晩培養して、細胞を安定化させた。安定化されたPBMCを、種々の異なる濃度のPD−1アプタマー、PEG化アプタマー、アンタゴニストPD−1抗体、又はランダム対照配列で、48時間処理した。Promega社CellTiter(登録商標)増殖キットを用いて総細胞数を評価した。試験したアプタマーは、PD7(配列番号10)、CCATCTCCCA(配列番号13;コア配列)、及びPEG化PD7ダイマー(図11に示す)である。
同系肺癌マウスモデルを用いて、本明細書に記載の抗PD−1アプタマーによる、インビボでの肺癌成長の阻害活性を、PD−1アンタゴニストアプタマーPD7(配列番号10)を例に用いて検証した。要約すると、0日目において、マウスLewis肺癌細胞(ATCC、CRL1642)を、C57BL/6Jマウスに皮下移植した(1マウス当たりLewis肺細胞2×105個)。腫瘍が100mm3に達した後、マウスを対照群、PBS処理群(n=7)、又はPD−1アプタマー処理群(n=7)に分けた。PD−1アプタマー処理マウスには、PBS中40nmolのPD7を、対照マウスにはPBSを、腹腔内注射により投与した。図14に示すように、Lewis肺細胞同系マウスに、0日目及び5日目にPD−1アプタマーを投与した(図14;投与時を矢印で示す)。腫瘍サイズは0、3、5、7、9、及び11日目に測定した。腫瘍細胞注入後11日目の時点で、PD7処理マウスの腫瘍サイズは、対照PBS処理マウスの腫瘍サイズと比較して、約50%も減少した(図14)。これらのデータは、PD7アプタマーが肺癌の治療に使用できることを示している。
ヒト化肺癌マウスモデルを用いて、本明細書に記載の抗PD−1アプタマーによる、インビボでの肺癌成長の阻害活性を、PD−1アンタゴニストアプタマー PD7(配列番号10)を例として検証した。要約すると、0日目において、ヒトA549肺癌細胞を、NODマウスに皮下移植した(1マウス当たりA549細胞1.5×106)。A549細胞のマウスへの移植から1週間後に、ヒト末梢血白血球(PBL)をマウスに注射した。マウスを対照群、スクランブル化DNA処置群(n=3;マウス226、233、及び239)、又はPD−1アプタマー処理群(n=3;マウス 234、235、及び240)に分けた。マウスに150μlの8μM PD−1アプタマー又はスクランブル化DNA対照を、腹腔内注射した。A549肺細胞ヒト化マウスに、PD−1アプタマー又はスクランブル化DNA対照を週一回、三週間に亘って投与した。処置スケジュールを模式的に図15に示す。腫瘍サイズの測定は25、32、及び38日目に、IVISスペクトル系を用いて行った。腫瘍細胞注入後38日目の時点で、PD7処理マウスの腫瘍サイズ(図16、パネルA〜D)は、スクランブル化DNA対照で処理したマウスの腫瘍サイズ(図16、パネルE〜H)と比較して、顕著に縮小していた。これらのデータの平均によれば、PD7で処理したマウスは、スクランブル化DNA対照で処理したマウスと比較して、38日目の腫瘍サイズは80%庁も減少していた(図17)。これらのデータは、PD7アプタマーがヒト肺癌の治療に使用できることを示している。
本明細書に記載の任意の特徴を、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書に記載の特徴は各々、同一・同等・又は同様の目的を果たす代替的な特徴で置換してもよい。即ち、別途明記しない限り、開示される各特徴は、包括的な同等又は同様の特徴の群の一例に過ぎない。
Claims (34)
- プログラム細胞死タンパク質1(programmed cell death protein 1:PD−1)への結合能を有する核酸アプタマーであって、前記アプタマーは:
(i) CCATCTCCC (配列番号1)、
(ii)TATATTGTWC(配列番号2)(ここでWはC又はGである)、
(iii)GTACAGTTX (配列番号3)(ここでXはC又はAであるか、或いは存在しない)、
(iv)GCACTACA (配列番号4)、
(v) GTACATCAY (配列番号5)(ここでYはA又はTであるか、或いは存在しない)、
(vi)YGCTACTGTZ(配列番号6)(ここでYはA又はTであるか、或いは存在せず、ZはT又はCであるか、或いは存在しない)、及び
(vii)CCATCTCCCGTCC(配列番号7)
からなる群より選択される核酸配列を含む。 - 前記アプタマーが、
(i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC(配列番号8);又は
(ii)TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT(配列番号9)
に対して少なくとも85%同一の核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸アプタマー。 - 前記アプタマーが、
(i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC(配列番号8);又は
(ii)TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT(配列番号9)
に対して少なくとも90%同一の核酸配列を含む、請求項2に記載の核酸アプタマー。 - 前記アプタマーが、
(i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC(配列番号8);又は
(ii)GATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT(配列番号9)
に対して少なくとも95%同一の核酸配列を含む、請求項3に記載の核酸アプタマー。 - 前記アプタマーが、
(i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC(配列番号8);又は
(ii)TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT(配列番号9)
の核酸配列を含む、請求項4に記載の核酸アプタマー。 - 前記アプタマーが、
(i) TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC(配列番号10);
(ii)TCCCTACGGCGCTAACTGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCTGCCACCGTGCTACAAC(配列番号11);又は
(iii)TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATGCCACCGTGCTACAAC(配列番号12)
の核酸配列からなる、請求項1に記載の核酸アプタマー。 - 前記アプタマーが、PD−1に対して20nM未満の解離定数(Kd)で結合する、請求項1〜6の何れか一項に記載の核酸アプタマー。
- 前記核酸アプタマーが、ポリエチレングリコール(PEG)にコンジュゲートされてなる、請求項1〜7の何れか一項に記載の核酸アプタマー。
- 前記PEGが、前記核酸アプタマーの3’末端にコンジュゲートされてなる、請求項8に記載の核酸アプタマー。
- 前記PEGの分子量が、10kDa〜30kDaの範囲である、請求項8又は9に記載の核酸アプタマー。
- 前記PEGの分子量が20kDaである、請求項8〜10の何れか一項に記載の核酸アプタマー。
- 第1の抗PD−1アプタマー、第2の抗PD−1アプタマー、及び、前記第1の抗PD−1アプタマーと前記第2の抗PD−1アプタマーとを連結するポリマー部分を含む、抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記第1の抗PD−1アプタマー及び前記第2のアプタマーのうち少なくとも一方が、請求項1〜7の何れか一項に記載の核酸アプタマーである、請求項12に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記第1の抗PD−1アプタマーが、前記第2の抗PD−1アプタマーと同一である、請求項12又は13に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記第1の抗PD−1アプタマーが、前記第2の抗PD−1アプタマーと異なる、請求項12又は13に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記第1のアプタマー及び前記第2のアプタマーの双方が、配列番号1の核酸配列を含む、請求項12に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記ポリマー部分がPEGである、請求項12〜16の何れか一項に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記PEGの分子量が10kDa〜30kDaの範囲である、請求項17に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記PEGの分子量が20kDaである、請求項18に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記第1のアプタマー、前記第2のアプタマー、又はその双方が、リンカーを介して前記ポリマー部分と連結されている、請求項12〜19の何れか一項に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記リンカーがポリT断片を含む、請求項20に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- 前記ポリT断片が5〜20のT残基を含む、請求項21に記載の抗PD−1アプタマーダイマー。
- (i)請求項1〜11の何れか一項に記載の核酸アプタマー、又は、請求項12〜22の何れか一項に記載の抗PD−1アプタマーダイマーと、(ii)医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
- 癌又は感染を治療するのに用いられる医薬組成物であって、(i)請求項1〜11の何れか一項に記載の核酸アプタマー、又は、請求項12〜22の何れか一項に記載の抗PD−1アプタマーダイマーと、(ii)医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
- 癌又は感染を治療するための薬剤の製造のための、請求項1〜11の何れか一項に記載の核酸アプタマー、又は、請求項12〜22の何れか一項に記載の抗PD−1アプタマーダイマーの使用。
- 癌を治療するための方法であって、請求項23に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
- 前記対象が、癌を有する、癌を有すると疑われる、又は癌のリスクを有するヒト患者である、請求項26に記載の方法。
- 前記癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌、大腸癌、又は腎細胞癌である、請求項26又は27に記載の方法。
- 対象の免疫活性を強化する方法であって、請求項23に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
- 前記対象が、癌を有する、癌を有すると疑われる、又は癌のリスクを有するヒト患者である、請求項29に記載の方法。
- 前記癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌、大腸癌、又は腎細胞癌である、請求項30に記載の方法。
- 前記対象が、HIV感染を有する、又はHIV感染を有すると疑われるヒト患者である、請求項30に記載の方法。
- 前記医薬組成物の量が、T細胞活性化の増強に有効な量である、請求項29〜32の何れか一項に記載の方法。
- 前記医薬組成物の量が、CD8陽性T細胞の増殖の増強に有効な量である、請求項29〜33の何れか一項に記載の方法。
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