TWI654996B - 微核糖核酸let-7及轉形生長因子β第三類受體調控軸作為心臟損傷標的之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種改善心臟損傷(如心肌梗塞)的方法，其係藉由促進微核糖核酸let-7的活性、或者抑制轉形生長因子β第三類受體(transformation growth factor beta receptor III, TGFBR3) 的活性所達成。本發明另提供一種測量生物樣品內TGFBR3含量、微核糖核酸let-7的含量、或兩者的檢測方法。

Description

微核糖核酸let-7及轉形生長因子β第三類受體調控軸作為心臟損傷標的之用途

本案主張於2016年9月30日提交美國臨時申請號62/402,255之效益，其全部內容併入本文作為參考。

本發明係關於一種治療心臟損傷的方法，尤指一種藉由促進微核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA) let-7的活性、或者抑制轉形生長因子β第三類受體(transformation growth factor beta receptor III, TGFBR3) 的活性進而達成治療目的之方法。

心臟損傷可由阻斷正常心肌細胞膜的完整性所導致。目前可藉由偵測多種生物性代謝物、微核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA)、及蛋白質(例如：心臟旋轉素(troponin)、mir-1、mir-133a/b、mir-499 a、miR-22、miR-101、miR-103和miR-199a-3p、肌胺酸激酶(creatine kinase)、肌紅素(myoglobin)、心臟型脂肪酸結合蛋白(heart-type fatty acid binding protein)、及/或乳酸去氫脢(lactate dehydrogenase))來判定心肌細胞膜的完整性缺失。

心臟損傷可能由創傷、毒素和病毒感染所引起。最常見的心臟損傷為心臟缺血或心肌梗塞，其係由氧氣(及營養物)供需失衡所導致。

由冠狀動脈阻塞所引起的心肌梗塞(Myocardial infarction，MI)是全球性的主要死因之一。可用多種生物標記(例如心臟旋轉素和腦利鈉激素(BNP))來評估心肌梗塞後的心臟功能。然而，心臟旋轉素雖然可於發病14天內偵測到，但其表現高峰值僅在3天內顯現，因此難以評估疾病的發展(參考Morrow et al. Circulation, 115(13):e356-375; 2007)。需結合多種標記來協助心臟損傷的診斷。

本發明提供一種治療心臟損傷的方法，包括：對一有需要之個體投予有效量之let-7促進劑或轉形生長因子β第三類受體(transformation growth factor beta receptor III, TGFBR3)抑制劑。在部分實施方式中，心臟損傷包括心肌梗塞(myocardial infarction)、急性冠狀動脈綜合症(acute coronary syndrome)、心肌炎(myocarditis)、心肌病變(cardiomyopathy)、術後損傷(post-operation injury)、或其之組合。

在部分實施方式中，TGFBR3抑制劑可為：一結合至TGFBR3之抗體、或一抑制TGFBR3表現之干擾核糖核酸(interfering ribonucleic acid，RNAi)。此種抗體可與醣基化的TGFBR3作專一性結合，例如：與TGFBR3的N端抗原表位(epitope)作專一性結合，其中TGFBR3可經過醣基化處理。在部分實施方式中，抗體結合至TGFBR3的穿膜質區(transmembrane-cytoplasmic region)，例如結合至序列編號：2。本揭示內容方法中使用的抗體可為一全長抗體或其抗原結合片段。或者或再者，該抗體為一人類抗體、一人源化抗體、一嵌合抗體、或一單鏈抗體。

在部分實施方式中，本揭示內容方法中所使用的抗-TGFBR3抗體結合至與抗-RIII-1抗體(將於下文描述5之)相同的TGFBR3抗原表位、或該抗-TGFBR3抗體與抗-RIII-1抗體競爭結合至TGFBR3。在部份實例中，抗-TGFBR3抗體包括與抗-RIII-1抗體相同的一重鏈互補決定區(complementary determining regions, CDRs)及/或一輕鏈互補決定區(CDRs)。在一實施方式中，抗-TGFBR3抗體包括與抗-RIII-1抗體相同的重鏈變異區(V_H )及/或輕鏈變異區(V_L )；該重鏈變異區的胺基酸序列為序列編號：95，而該輕鏈變異區的胺基酸序列為序列編號：96。

在部分實施方式中，let-7促進劑為一let-7核酸，此類核酸可包括序列編號： 94之核苷酸序列。在另一實施方式中，let-7促進劑可為一Lin28抑制劑。

在本揭示內容本文所述之任何方法中，待治療的個體可為一具有心臟損傷或可能具有心臟損傷之人類患者；其中心臟損傷係如上所述。在部分實施方式中，該個體為一具有心肌梗塞或可能具有心肌梗塞之人類患者。在部分實施方式中，與一沒有心臟損傷的個體相比，前述個體可具有增高的TGFBR3含量、降低的let-7含量、或同時具有兩者。

在本文所述之本揭示內容任何方法中，該let-7促進劑及/或該TGFBR3抑制劑係透過一全身性路徑或一局部性路徑輸送，例如心肌內注射或冠狀動脈內注射。

本揭示內容的另一態樣提供一種測量生物樣品內TGFBR3存在的方法。該方法可包括：(i)提供一可能含有TGFBR3的生物樣品；(ii)將該生物樣品與一抗體接觸，該抗體與一切割型(cleaved form) TGFBR3結合，該切割型TGFBR3可為序列編號： 3之胺基酸序列，以形成抗體與該切割型TGFBR3的複合體；(iii) 以該複合體的含量為基準，測量該生物樣品內的切割型TGFBR3的含量；以及(iv) 判定該生物樣品內為存在TGFBR3或不含TGFBR3。在部分實施方式中，本揭示內容之任何檢測方法中所使用的抗體可與醣基化之序列編號： 3序列作專一性結合。該抗體可與序列編號： 3之序列的N端抗原表位結合。該抗原表位可經過醣基化處理。

該生物樣品可來自一可能具有心臟損傷之人類個體。此類生物樣品可為一血清樣品或一血漿樣品。

本揭示內容之任何檢測方法中，可更包括：測量該生物樣品內的let-7含量。或者或再者，該方法可更包括：基於該生物樣品內的切割型TGFBR3的含量、let-7的含量、或兩者，以評估該生物樣品的來源個體是否具有心臟損傷或具有心臟損傷的風險。若判定該個體具有心臟損傷或具有心臟損傷的風險，可對該個體進行一心臟損傷療法。

本揭示內容的範圍中，亦包括：(i)用於治療於本文所述心臟損傷之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包括：一TGFBR3抑制劑、一let-7促進劑、或兩者；以及一藥學上可接受之載體。(ii) TGFBR3抑制劑或let-7促進劑任一者於製備治療心臟損傷藥物上之用途。

下列敘述詳細記載本發明之一個以上實施方式，由附加圖示和多個實施方式的詳細說明，再參照依附之申請專利範圍，可明顯推知本發明之其他特徵和優點。

急性心肌梗塞起因於冠狀動脈阻塞，並導致缺血心肌細胞死亡(參考Senter et al.,Cleve Clin J Med 76 , 159-166 (2009))。本研究利用次世代定序(next-generation sequencing，NGS)，在豬的心肌梗塞模式中證實微核糖核酸(miRNA) let-7(例如let-7a和let-7f)為顯著效應子(effector)。 雖然let-7為早期發現的miRNA中之一者，含量豐富且在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans )至哺乳動物上皆可觀察到(參考Roush et al.,Trends Cell Biol 18, 505-516 (2008))，然而對於let-7在心肌梗塞中的功能卻知之甚少。此外，本研究顯示let-7的下游基因TGFBR3以及let-7的潛在功能。令人驚艷的是，在血漿let-7及TGFBR3兩者皆發現到對心肌梗塞的反應。這些結果指出miRNA let-7/TGFBR3調控軸在心臟損傷(如心肌梗塞)上扮演重要角色，故而推測let-7及TGFBR3，單獨一者或兩者，皆可做為心臟損傷的治療及診斷/預測兩者之可靠疾病標的。

據此，本發明提供一種治療心臟損傷的方法，其係藉由阻斷TGFBR3活性及/或促進let-7活性；另提供一種測量生物樣品內TGFBR3及/或let-7含量的檢測方法，由此檢測方法中得到的結果可用於多種目的，包含評估心臟損傷的存在及/或風險。

I. 治療心臟損傷

本揭示內容提供一種治療心臟損傷的方法，該方法包括：將有效量之TGFBR3抑制劑、let-7促進劑或其之組合注入一有需要之個體。

(A) TGFBR3抑制劑

TGFBR3，亦稱為β聚醣(betaglycan)，為一種膜蛋白聚醣，其透過肝素硫酸鹽鏈進而結合至配體TGF-β超家族的多種成員，常作為TGF-β超家族成員的輔助受體(coreceptor)。TGFBR3參予滑膜纖維母細胞(synovial fibroblasts)的細胞凋亡路徑和G蛋白偶連受體(G Protein-Coupled Receptors, GPCR)路徑，TGFBR3蛋白和基因編碼來自本技術領域中已知的合適品種(例如人類、大鼠、小鼠及豬)。舉例來說，實驗例用的人類TGFBR3蛋白和基因序列可在GenBank資料庫編號Nos. Q03167及 XM_006710868.2中找到，相關的揭露內容併入本文作為參考。

例示性成年人類TGFBR3，其胺基酸序列如下所示(序列編號：1)：GPEPGALCELSPVSASHPVQALMESFTVLSGCASRGTTGLPQEVHVLNLRTAGQGPGQLQREVTLHLNPISSVHIHHKSVVFLLNSPHPLVWHLKTERLATGVSRLFLVSEGSVVQFSSANFSLTAETEERNFPHGNEHLLNWARKEYGAVTSFTELKIARNIYIKVGEDQVFPPKCNIGKNFLSLNYLAEYLQPKAAEGCVMSSQPQNEEVHIIELITPNSNPYSAFQVDITIDIRPSQEDLEVVKNLILILKCKKSVNWVIKSFDVKGSLKIIAPNSIGFGKESERSMTMTKSIRDDIPSTQGNLVKWALDNGYSPITSYTMAPVANRFHLRLENNAEEMGDEEVHTIPPELRILLDPGALPALQNPPIRGGEGQNGGLPFPFPDISRRVWNEEGEDGLPRPKDPVIPSIQLFPGLREPEEVQGSVDIALSVKCDNEKMIVAVEKDSFQASGYSGMDVTLLDPTCKAKMNGTHFVLESPLNGCGTRPRWSALDGVVYYNSIVIQVPALGDSSGWPDGYEDLESGDNGFPGDMDEGDASLFTRPEIVVFNCSLQQVRNPSSFQEQPHGNITFNMELYNTDLFLVPSQGVFSVPENGHVYVEVSVTKAEQELGFAIQTCFISPYSNPDRMSHYTIIENICPKDESVKFYSPKRVHFPIPQADMDKKRFSFVFKPVFNTSLLFLQCELTLCTKMEKHPQKLPKCVPPDEACTSLDASIIWAMMQNKKTFTKPLAVIHHEAESKEKGPSMKEPNPISPPIFHGLDTLTV MGIAFAAFVIGALLTGALWYIYSHTGETAGRQQVPTSPPASENSSAAHSIGSTQSTPCSSSSTA

C端的斜體字部分指的是穿膜質區(transmembrane-cytoplasmic domain)(序列編號：2)，以及N端粗體字部分指的是細胞外區域(序列編號：3)。

本揭示內容本揭示內容方法使用的TGFBR3抑制劑(TGFBR3 inhibitors)是能夠阻斷、抑制、或減少(包含顯著阻斷、抑制或減少)) TGFBR3的生物活性，包含經TGFBR3調控的下游路徑。「抑制劑」(inhibitor)一詞沒有限制於特定生物作用的機制，而是表示包括所有可能與TGFBR3直接或間接有關的藥學、生理學和生化學交互作用。就本發明之目的而言，可清楚了解「抑制劑」一詞(包含先前記載的所有名詞、標題、及功能性狀態與特性)，係指對TGFBR3本身(例如人類TGFBR3)、TGFBR3生物活性(包含但不限於：調節心肌細胞死亡的能力)、或生物活性的序列，以任何有意義程度上(例如至少20%、50%、70%、85%、90%、100%、150%、200%、300%、或500%、或10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、或10⁴ 倍)進行實質無效化、降低、或中和。

TGFBR3抑制劑的例子包括但不限於：抗-TGFBR3抗體、導向TGFBR3的反向(antisense)核酸(包含：導向「能編碼出TGFBR3的核酸」的反向核酸)、導向TGFBR3核酸的小分子干擾核糖核酸(small interfering ribonucleic acid，siRNA或RNAi)、導向TGFBR3核酸的miRNA、TGFBR3核酸適體(aptamer)、或TGFBR3抑制性化合物。

結合至TGFBR3的抗體

在部分實施方式中，TGFBR3抑制劑係為結合至TGFBR3的抗體，其抑制TGFBR3生物活性及/或TGFBR3訊號調控的下游路徑。在部分實施方式中，用於本發明方法中的抗-TGFBR3抗體，抑制TGFBR3相關的訊號路徑至少20%、至少40%、至少50%、至少75%、至少90%、至少100%、或至少2倍、至少5倍、至少10倍 、至少20倍 、至少50倍 、至少100倍或至少1000倍。在部分實施方式中，抗-TGFBR3抗體結合至TGFBR3的胞外區域(例如序列編號： 3)。在其他實施方式中，抗-TGFBR3抗體結合至TGFBR3的穿膜質區內位置(例如序列編號： 2)。

抗體是一種免疫球蛋白分子，能夠透過位於免疫球蛋白分子之變異區之至少一抗原辨識位置，進而專一性結合至標的(例如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等)。在此使用的「抗體」(antibody)一詞不僅包括完整的(即：全長)多株或單株抗體，亦包括其之抗原結合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv)、單鏈(scFv)、其變異體、融合蛋白(具有抗體部分)、人源化抗體、嵌合抗體、雙鏈抗體(diabodies)、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及任何他種具有所需專一性抗原辨識位置的免疫球蛋白分子的修飾構型，包括抗體的醣基化變異體、抗體的胺基酸序列變異體、及經共價修飾的抗體。「抗體」包含所有層級的抗體，例如IgD、IgE、IgG、IgA、或IgM(或其次單位)，且不需限定至任一特定層級。根據抗體重鏈穩定區(constant domain)的胺基酸序列，免疫球蛋白可區分成不同層級。免疫球蛋白有五種主要層級：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且這些當中多數可再進一步分成次單位(亞型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。重鏈穩定區係對應至免疫球蛋白的不同層級，分別稱為α、δ、ε、γ及μ。免疫球蛋白的不同層級的次單位結構和三維構型皆為已知。

本發明所述方法中使用的抗體可為小鼠、大鼠、人類、或其他來源(包含嵌合抗體或人源化抗體)。在部分實施方式中，抗體包含經修飾的穩定區，例如呈免疫惰性(immunologically inert)的穩定區，例如：不會啟動補體介導的溶解作用、或不會激發抗體依賴型細胞調控的細胞毒殺性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)。可利用美國專利號5,500,362案件中所揭露的方法來檢測ADCC活性。在其他實施方式中，穩定區可修飾成下列參考文件：文獻Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624、國際專利申請號 PCT/GB99/01441、及/或英國專利申請號9809951.8中所述者。

本揭示內容本揭示內容的任何抗體可為單株抗體或多株抗體其中一者。「單株抗體」(monoclonal antibody)指的是同源抗體群集，以及「多株抗體」(polyclonal antibody)指的是異種抗體群集。這兩種名詞不會限制抗體來源或其製備方式。

在一實施方式中，本發明所述方法中使用的抗體為人源化抗體。人源化抗體係指非人類(例如小鼠)的抗體型式，其為專一嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈、或其抗原結合片段(包含來自非人類免疫球蛋白的最小序列)。一般而言，人源化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體(recipient antibody))，其中受體的互補決定區(complementary determining region，以下以CDR稱之)部分由非人類物種(供體抗體(donor antibody))之CDR所取代，非人類物種可舉例如：具有所需專一性、親和力及容載力的小鼠、大鼠、或兔子。在部分例子中，人類免疫球蛋白的Fv骨架區(FR)部分由對應的非人類部分取代。此外，人源化抗體可不包括從受體抗體中或引入CDR或骨架序列中所發現的部分，而是包含能夠進一步提升及最佳化抗體性能的部分。通常，人源化抗體包括實質上全部的變異區，變異區至少為一個、且常見為兩個。全部或實質上全部的CDR區對應至這些非人類免疫球蛋白，且全部或實質上全部的FR區為這些人類免疫球蛋白的共通序列(consensus sequence)。人源化抗體也可包含：至少一部分免疫球蛋白穩定區或結晶區域片段(Fragment crystallizable region, 以下以Fc稱之) ，免疫球蛋白一般為人類的免疫球蛋白。抗體可具有經修飾的Fc區域(如WO 99/58572所述)。其他種的人源化抗體具有一個以上(一個、兩個、三個、四個、五個、或六個)的CDR，其根據原始抗體而變化，也可以說是一個以上的CDR「衍生自」(derived from)原始抗體的一個以上CDR。人源化抗體亦可參予親和力成熟(affinity maturation)過程。

在另一實施方式中，本揭示內容本揭示內容抗體為嵌合抗體，其可包括來自人類抗體的重鏈穩定區和輕鏈穩定區。嵌合抗體係指抗體具有：來自第一種源的變異區或部分變異區、以及來自第二種源的穩定區。一般而言，這些嵌合抗體中，輕鏈與重鏈兩者的變異區是衍生自一種哺乳動物(例如非人類哺乳動物，如小鼠、兔子、及大鼠)抗體的變異區，並且穩定區係與來自另一哺乳動物(如人類)的抗體序列同源。在部分實施方式中，可對於變異區及/或穩定區之胺基酸進行修飾。

本揭示內容本揭示內容之抗體可專一性結合至標的或抗原表位(epitope)，例如人類TGFBR3。抗體「專一性結合」(specifically bind)至標的或抗原表位係為本技術領域中已熟知的用詞，且用來判定此種「專一性結合」的方法亦為本技術領域中所熟知。當分子與特定標的抗原比其他標的能夠更頻繁、更快速地反應或連結，且能持續一段時間及/或具有較佳的親和力，即稱為展現「專一性結合」的分子。若抗體結合至標的抗原時，相較於結合至其他物質能具有較佳的親和力、結合力、更快速、及/或更長的持續時間，即稱該抗體「專一性結合」至該抗原標的。例如，抗體專一性(或優先)地結合至TGFBR3抗原表位，即為該抗體結合至該TGFBR3抗原表位時，相較於其他TGFBR3抗原表位或非TGFBR3抗原表位，能具有較佳的親和力、結合力、更快速、及/或具有更長的持續時間。參閱此定義亦能了解，例如：抗體專一性結合至第一標的抗原，可以或不可以專一地或優先地結合至第二標的抗原。因此，「專一性結合」或「優先性結合」(preferential binding)並非絕對必需是(雖然可包含)排他性的結合。通常提到結合係表示優先性結合，但本發明不限於此。

在部分實施方式中，本揭示內容本揭示內容之方法使用的抗體可專一性結合至膜連型(membrane-bound)TGFBR3。此種抗體能夠辨識並結合至細胞(表現此受體)表面顯露的TGFBR3抗原表位。在部分實施方式中，本揭示內容本揭示內容之方法使用的抗-TGFBR3抗體可專一性結合至TGFBR3的胞外區域，例如序列編號：3。在其他實施方式中，本揭示內容本方法使用的抗-TGFBR3抗體可專一性結合至TGFBR3的穿膜質區，例如序列編號： 2。另一實施方式中，本揭示內容本揭示內容方法使用的抗-TGFBR3抗體可專一性結合至TGFBR3或其醣基化片段。例如，抗體可專一性結合至TGFBR3的N端糖基片段。在部分實施方式中，醣基化作用位置包含但不限於：141 氮連結位 (GlcNAc...)、369 氧連結位、 (GalNAc...) 、492 氮連結位(GlcNAc...)、534 氧連結位(Xyl...) (葡萄糖胺聚醣) 、545 氧連結位(Xyl...) (葡萄糖胺聚醣)、571 氮連結位(GlcNAc...)、590 氮連結位 (GlcNAc...) 、及697 氮連結位 (GlcNAc...)。

抗-TGFBR3抗體對TGFBR3(例如人類TGFBR3)的結合親和力可少於約100 nM、約50 nM、約10 nM、約1 nM、約 500 pM、約 100 pM、或約50 pM 至約2 pM。在部分實施方式中，抗體為人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、或單鏈抗體。結合親和力可表示為K_D 或解離常數，且增加的結合親和力對應至下降的K_D 。判定抗體對TGFBR3的結合親和力的一種方法為：測量抗體的單功能Fab片段的結合親和力。要取得單功能Fab片段，可使用木瓜蛋白酶(papain)切割抗體(例如IgG)或重組表現。抗TGFBR3的Fab片段對抗體的親和力可由表面電漿共振儀(BIACORE3000^TM surface plasmon resonance (SPR) system, BIAcore, INC, Piscaway N.J.)來判定。求得動力結合速率(k_on )和解離速率(k_off )(一般於25 ℃測量)，k_off /k_on 可計算出平衡解離常數(K_D )值。

在部分實施方式中，抗體結合至人類TGFBR3，且不顯著結合至另一哺乳類品種的TGFBR3。在部分實施方式中，抗體結合至人類TGFBR3以及一種或多種其他哺乳類品種的TGFBR3。抗體結合的抗原表位可為連續或不連續的。在部分實施方式中，抗體可與TGFBR3及醣基(glycosyl group)結合。

於此提供抗-TGFBR3抗體之一實施範例，抗-RIII-1，其包括重鏈變異區(V_H )和輕鏈變異區(V_L )，其分別具有以下胺基酸序列： 抗-RIII-1 V_H 的胺基酸序列： VVESGGGLVK PGGSLKLSCA AS GFTFSDYY MYWVRQTPEK RLEWVAT ISD GGSYT YYPDS VKGRFTISRD NAKNNLYLQM SSLKSEDTAM YYC ARDGNYW YFDV WGAGTT VTVSS (序列編號：95) 抗-RIII-1 V_L 的胺基酸序列： QSVQSPSSLS ASLGGKVTIT CKAS QDINKY IAWYQHKPGK GPRLLIH YTS TLQPGIPSRF SGSGSGRDYS FSISNLEPED IATYYC LQYD NLRT FGGGTK LEIK (序列編號：96) 粗體字部分為V_H 和V_L 的互補決定區。

在部分實施方式中，本揭示內容本揭示內容的抗-TGFBR3抗體結合至與抗-RIII-1抗體相同的抗原表位、或與抗-RIII-1抗體競爭結合至TGFBR3。

當第一抗體結合至標的化合物上與第二抗體相同的結合位置，或者與第二抗體結合位置重疊(例如50%、60%、70%、80%、90%、或100%重疊，就胺基酸序列或其他分子特徵(例如醣基、磷酸酯基或硫酸鹽基)來說)的位置，即可稱為第一抗體與第二抗體「結合至相同的抗原表位」(bind to the same epitope)。

假使第一結合蛋白與抗原表位的結合會降低結合至抗原表位的第二結合蛋白數量 (例如降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或以上)，即為第一抗體與第二抗體「競爭結合」(competes for binding)。競爭可為直接(例如第一抗體結合的抗原表位係與第二抗體結合的抗原表位相同或重疊)或間接(例如第一抗體結合至抗原表位引發標的化合物的立體變化，降低第二抗體結合至抗原表位的可能性)。

在其他的例子中，抗-TGFBR3抗體可包括與本揭示內容抗-RIII-1相同的V_H CDRs及/或V_L CDR。可利用本技術領域中已知的方法檢測抗-RIII-1的重鏈/輕鏈的胺基酸序列(如上所示)，判定出負責抗原結合的區域。可參考網站www.bioinf.org.uk/abs；或文獻Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)及 Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1987)。第一抗體具有與第二抗體相同的V_H 及/或V_L CDRs表示：利用本技術領域中相同的已知方法，可檢測出第一抗體與第二抗體具有相同的對應V_H 及/或V_L CDR。

測定抗體中CDR區域的方法是本技術領域所熟知的。至少有兩種測定CDRs的方法：(1)基於跨物種序列的變異性的方法(即依照Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)所揭示之方法)；以及(2)基於抗原-抗體複合物之晶體學的方法(Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948))。於此，可由其中一種方法或綜合兩種方法來判定CDR。

本發明所揭露的範圍內亦包括抗-RIII-1的功能性變異體，其可具有與抗-RIII-1實質上相同的對抗原表位的結合親和力，並展現出相對於抗-RIII-1，至少20%(例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或以上)的中和TGFBR3活性能力。

在部分實施方式中，抗-RIII-1的功能性變異體包括：V_H 鏈，其包含與抗-RIII-1對應之V_H CDRs具至少75% (例如80%、85%、90%、95%、或98%)相似度的 V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3；以及V_L 鏈，其包含與抗-RIII-1對應之V_H CDRs75%具至少 (例如80%、85%、90%、95%、或98%)相似度的V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3。或者，抗-RIII-1的功能性變異體包括：與抗-RIII-1之V_H 鏈(成熟體或前驅物)具至少75% (例如80%、85%、90%、95%、或98%)之相似度的V_H 鏈、以及與抗-RIII-1之V_L 鏈(成熟體或前驅物)至少75% (例如80%、85%、90%、95%、或98%)相似度的V_L 鏈。

兩胺基酸序列的「相似百分比」(percent identity)，係利用Karlin及Altschul發表(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990)，後經Karlin及Altschul修改(Proc. Natl. Acad. Sci . USA 90:5873-77, 1993)的運算法。此種運算法併入NBLAST及XBLAST程式(2.0版)(Altschulet al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)。使用XBLAST程式(分數=50, 字串長度=3)進行 BLAST^® 蛋白質搜尋，得到胺基酸序列與指定蛋白質分子的同源性。兩序列之間存在的空缺(gaps)，可利用Altschulet al. ,Nucleic Acids Res . 25(17):3389-3402, 1997中所述的Gapped BLAST來處理。當使用BLAST^® 及Gapped BLAST程式時，可使用各別程式的預設參數(例如XBLAST及NBLAST)。

在部分實施方式中，抗-RIII-1的功能性變異體包括：V_H 鏈及/或V_L 鏈，在V_H CDR(V_H CDR1、CDR2、及/或CDR3)中包含最多5個(例如1、2、3、4、或5)相較於抗-RIII-1之V_H CDRs的胺基酸基團變異，在V_L CDR (V_L CDR1、CDR2、及/或CDR3)中包含最多5個(例如1、2、3、4、或5)相較於抗-RIII-1之V_L CDRs的胺基酸基團變異。

本揭示內容本揭示內容能夠抑制TGFBR3相關序號路徑的抗體，可由本技術領域中任何已知方法所製成。例如，可參考Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。

在部分實施方式中，對標的抗原(例如人類TGFBR3)呈專一性的抗體可由傳統的融合瘤(hybridoma)技術所製備而成。選擇性結合至載體蛋白(例如KLH)的全長標的抗原或其片段，可用於使產生抗體(與抗原結合)的宿主動物免疫化。一般將宿主動物免疫化的路徑和流程符合抗體激發和製造所建構的常規技術，下文將進一步說明。一般來說，本文描述用於製造小鼠、人源化、及人類抗體的技術為本技術領域中所熟知的。已知任何哺乳類物種(包含人類)或來自哺乳類物種的抗體產生細胞，可用作為製造哺乳類(包含人類)融合瘤細胞株的基礎。一般而言，本揭示內容描述的宿主動物從腹腔內、肌肉內、口內、皮下、足底內及/或皮內注射一定含量的免疫原。

利用Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497中所述的、或Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)所修改的常規體細胞雜交技術，由淋巴細胞和永久骨髓瘤細胞可製造出融合瘤。雜交可用的骨髓瘤細胞株包含但不限於：X63-Ag8.653及可購自Salk研究所的細胞分配中心(San Diego, Calif., USA)。一般而言，常規技術包括：利用本技術領域中通常知識者熟知的融合劑(例如聚乙二醇(polyethylene glycol))或電性方法融合骨髓瘤細胞和淋巴細胞。融合後，從融合液中分離出細胞，並使其於選擇性生長培養液(例如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT)培養液)內生長，用以清除未雜交成功的母細胞。本文之任何培養液(添加或不添加血清)，可用於培養融合瘤，使其分泌單株抗體。另一種替代的細胞融合技術，可使用EBV(Epstein-Barr病毒)永久化B細胞來製造本發明的抗TGFBR3單株抗體。若有需要，融合瘤可被擴增及次選殖，以及可利用傳統的免疫檢測流程(例如放射免疫分析法、酵素免疫分析法、或螢光免疫分析法)檢測上清液的抗免疫原活性。

可作為抗體的來源的融合瘤包括所有母代融合瘤的衍生物及子代細胞，母代融合瘤可製造出能夠干擾TGFBR3相關訊號路徑的單株抗體。利用已知流程，融合瘤製造出的抗體可於體外或體內生長。若有需要，透過傳統的免疫球蛋白純化流程(例如硫酸銨沉澱、凝膠電泳、透析、層析和超濾)，可將單株抗體從培養液或體液中分離出。也可藉由在免疫原貼附至固體製成的吸附劑上執行製備過程，並且從免疫原析出或釋出所需抗體，來移除不需要的活性(若存在的話)。藉由雙功能或衍生試劑(舉例來說：馬來醯亞胺苯甲醯磺基琥珀醯亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通過半胱胺酸殘基共軛)、-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide(透過離胺酸殘基))、戊二醛(glutaraldehyde)、琥珀酸酐(succinic anhydride 0、SOCl、或R1N=C=NR，其中R和R1為不同的烷基)，以標的抗原或含標的胺基酸序列的片段共軛至物種內待免疫化的免疫性蛋白質(例如匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白(serum albumin)、牛甲狀腺球蛋白(bovine thyroglobulin)、或大豆胰蛋白酶抑製劑(soybean trypsin inhibitor))對宿主動物進行免疫作用，則可製造出大量抗體(例如單株抗體)。

若有需要，可定序所需的(例如由融合瘤所製造的)抗體(單株抗體或多株抗體)，且多核苷酸序列可接續被植入載體(vector)用以表現或增殖。編碼出所需抗體的序列可保存在宿主細胞的載體中，並且宿主細胞可以接續被擴增及冷凍待未來使用。替代方案是，多核苷酸序列可用於基因操作使抗體「人源化」(humanize)、或提升親和力(親和力成熟)或其他抗體性質。例如，穩定區可被改造成與人類穩定區更相似，以防抗體用於臨床試驗及人類治療時發生免疫反應。抗體序列可能需要進行基因操作，進而得到對標的抗原的較佳親和力、以及在抑制TGFBR3相關訊號路徑上有更好的效果。本技術領域中具有通常知識者可清楚明白：抗體可進行一個以上的多核苷酸變化，並且仍保持其對標的抗原的結合專一性。

在其他實施方式中，利用表現特定人類免疫球蛋白的市售基因轉殖小鼠，可得到全長人類抗體。設計成可製造更多所需抗體(例如全長人類抗體)或更穩健免疫反應的基因轉殖動物，亦可用於產生人源化或人類抗體。此種技術的範例如：Amgen公司的XENOMOUSE^RTM (Fremont, Calif.)以及Medarex公司的HUMAB-MOUSE^RTM 與TC MOUSE^TM (Princeton, N.J.)。或者，可透過噬菌體展示技術來重組製造出抗體。例如：可參考美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、及6,265,150案件以及文獻Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455。或者，噬菌體展示技術(McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553)可將來自未經免疫化供體的免疫球蛋白變異區(V)基因，於體外製造出人類抗體及抗體片段。

可經由常規方法製得完整抗體(全長抗體)的抗原結合片段。例如，可使用木瓜酶分解抗體分子以製備出F(ab')2片段，以及還原F(ab')2片段的雙硫鍵可生成Fab片段。

可透過如傳統重組技術製造出基因改造抗體，例如人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、及雙特異性抗體。在一實施方式中，能編碼出對標的抗原專一性的單株抗體的DNA，可利用傳統流程(例如利用寡核苷酸探針，其能專一性結合至編碼出單株抗體重鏈及輕鏈的基因)快速分離出來並定序。融合瘤細胞是這種DMA的較佳來源。一旦分離出來，DNA可置入一個以上的表現載體，在轉染到不會額外製造免疫球蛋白的宿主細胞內(如大腸桿菌(E. coli )細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、或骨髓瘤細胞)，以得到在重組宿主細胞內合成的單株抗體。可參考如國際專利申請號WO 87/04462案件。可對DNA進行後續修飾，例如將人類重鏈及輕鏈穩定區的編碼序列置換成同源小鼠序列(Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851)，或者共價結合至全部的免疫球蛋白編碼序列、或部分非免疫球蛋白多肽的編碼序列。在此方式下，基改抗體，例如「嵌合」(chimeric)或 「雜交」(hybrid)抗體，可製備成具有結合專一性的標的抗原。

發展「嵌合抗體」(chimeric antibodies)之技術係為本技術領域中所熟知的，參考文獻Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851、Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604、以及Takeda et al. (1984) Nature 314:452。

建構人源化抗體的方法亦為本技術領域中所熟知的，參考文獻Queen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86:10029-10033 (1989)。在一實施方式中，母代非人類抗體的變異區V_H 及V_L 係利用下列本技術領域中已知的方法進行三維分子模型分析。接著，要形成正確的CDR結構，胺基酸的骨架部分相當重要，需利用相同的分子模型分析胺基酸的骨架部分。同時，利用任何抗體基因資料庫，以母代V_H 及V_L 序列進行搜尋，可判定具有胺基酸序列的人類V_H 及V_L 鏈與親代非人類抗體的V_H 及V_L 鏈是同源的。然後，接著將人類V_H 及V_L 受體基因篩選出。

在篩選出的人類受體基因中，CDR可置換成母代非人類抗體的CDR或其功能性變異體。若必要的話，親鏈骨架區內的基團對於與CDR的交互作用相當重要(如上所述)，可用於取代人類受體基因中的對應基團。

透過重組技術，將編碼出重鏈變異區的核苷酸序列連接至編碼出輕鏈變異區的核苷酸序列，藉此可製備出單鏈抗體。較佳為在兩個變異區之間插入軟性連接劑(flexible linker)。或者，在美國專利號4,946,778及4,704,692 案件中所述的製備單鏈抗體技術，可用於製造噬菌體scFv抗體庫，以及按照常規程序從資料庫中能判定出對TGFBR3專一性的scFv群落。陽性群落(Positive clones)可進一步進行掃描判斷其抑制TGFBR3的活性。

依照本技術領域中習知方法及本揭示內容方法得到的抗體，可利用本技術領域中已知的方法來定性。例如，有一種方法是判別抗原結合的抗原表位(或「抗原表位圖譜」(epitope mapping))。本技術領域中已知用於定位和定性蛋白質上抗原表位位置的方法很多，其包含解出抗體-抗原複合物的晶體結構、競爭試驗、基因片段表現試驗、及合成胜肽類試驗(synthetic peptide-based assays)，如上所述，例如Harlow and Lane第11章(Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999)。在另一實施方式中，可用抗原表位圖譜決定抗體結合的序列。抗原表位可為線性抗原表位(即為一簡單延伸的胺基酸)、或由胺基酸的三維交互作用所形成的構象抗原表位(conformational epitope)，構象抗原表位不一定是簡單延伸的結構(一級結構為線性序列)。可由抗體分離出來或合成多種長度(例如至少4-6個胺基酸長)的胜肽，且該些胜肽可用於結合試驗。在另一實施方式中，可利用來自標的抗原序列的重疊胜肽進行系統掃描並決定抗體的結合，進而判定出抗體結合的抗原表位。根據基因片段表現試驗，編碼出標的抗原之開啟讀碼框(open reading frame)可被隨機分割或透過特定基因建構來分割，接著再測試判定該表現抗原片段對抗體的反應性。例如，在放射活性胺基酸的存在下，藉由PCR於體外轉錄及轉譯出蛋白質，以製造出基因片段。然後，抗體結合至具放射活性標誌的抗原片段，可利用免疫沉積法和電泳凝膠法所測定之。亦可利用噬菌體顆粒表面上展現的隨機胜肽序列之龐大資料庫(噬菌體資料庫)確認出精準的抗原表位。或者，也可藉由重疊胜肽片段的精確資料庫來進行簡易結合試驗以測試其對待測抗體的結合性。在另一實施方式中，可進行抗原結合部分的突變、結構域交換試驗(domain swapping experiments)及丙胺酸掃描突變(alanine scanning mutagenesis)來確認抗原表位結合所需的、足夠的、及/或必需的基團。舉例來說，可利用標的抗原的突變體來進行結構域交換試驗，突變體中多種TGFBR3多肽的片段已置換/交換成一序列極度相近的但抗原性不同的蛋白(例如神經營養素蛋白家族的其他成員)。藉由測定抗體對突變TGFBR3的結合性，可判定出特定抗原片段對抗體結合的重要性。

或者，可利用其他已知結合至相同抗原的抗體來進行競爭試驗，藉此決定抗體是否結合至與其他抗體相同的抗原表位。本技術領域中具有通常知識者已熟知競爭試驗。

其他TGFBR3抑制劑

本揭示內容本揭示內容之方法可使用前述能夠干擾TGFBR3訊號路徑的抗體以外的其他TGFBR3抑制劑。

在本發明部分實施方式中，TGFBR3抑制劑包括至少一個反向核酸分子，其能夠阻斷或減少功能性TGFBR3表現。TGFBR3的核苷酸序列為本技術領域中已知的。根據常規方法製備出能夠專一性結合標的傳訊核糖核酸(messanger ribonucleic acid，mRNA)而不會與其他多核苷酸交叉反應之反向寡核苷酸分子。標的位置的範例包含但不限於：起始密碼子、5'調控區、密碼序列及3'非轉譯區。在部分實施方式中，寡核苷酸之長度為約10至100個核苷酸、約15至50個核苷酸、約18至25個核苷酸、或更長。寡核苷酸可包括主幹修飾，例如本技術領域中已知的硫代磷酸化(phosphorothioate)連結鍵、及2'- O端糖修飾。

或者，利用本技術領域中已知的方法，如基因減量、嗎啉寡核苷酸(morpholino oligonucleotides)、siRNA或RNAi、miRNA或核糖酶(ribozymes)，以減少TGFBR3表現及/或釋放。RNA干擾(RNAi)的過程中，雙股核糖核酸(double-stranded RNA， dsRNA)直接被mRNA進行同源的專一序列降解。在哺乳類細胞中，無需活化宿主的干擾素反應便可利用siRNA之21個核苷酸雙鏈體啟動RNA干擾。本揭示內容方法中使用的dsRNA可為siRNA (含兩個分開的互補RNA鏈)或短髮夾(short hairpin) RNA(即形成緊密髮夾結構的RNA鏈)，兩種都可以基於標的基因序列來設計。或者，也可以是miRNA。

非必要性地，本揭示內容本揭示內容方法中使用的核酸分子(例如反向核酸、siRNA或miRNA)可選擇包含非自然發生的核鹼基、糖類或共價性核苷酸間連結鍵(主幹)。此種經修飾的核苷酸賦予所需的性質，例如提高細胞攝入量、增強對標的核酸的親和力、以及增加體內穩定性。

在一實施方式中，核酸具有經修飾的主幹，包含保留磷原子(例如參考美國專利號3,687,808、4,469,863、5,321,131、5,399,676、及 5,625,050)以及不具有磷原子(例如參考美國專利號5,034,506、5,166,315、及5,792,608)。含磷修飾主幹的例子包含但不限於：硫代磷酸酯(phosphorothioates)、掌性硫代磷酸酯(chiral phosphorothioates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、磷酸三酯(phosphotriesters)、氨烷基 - 磷酸三酯(aminoalkyl-phosphotriesters)、甲基和其他烷基膦酸酯(alkyl phosphonates)(包含3'-亞烷基磷酸酯、5'-亞烷基磷酸酯及掌性磷酸酯)、亞磷酸鹽(phosphinates)、磷醯胺酯(phosphoramidates)(包含3'-氨基磷醯胺酯及氨烷基磷醯胺酯)、硫代磷醯胺酯(thionophosphoramidates)、硫代烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)、硒代磷酸酯(selenophosphates)和硼烷磷酸酯(boranophosphates)(具有3'-5'連結鍵或2'-5'連結鍵)。此種主幹亦包含具有相反極性者，即3'至3'、5'至5'或2'至2'連結鍵。可透過短鏈烷基或環烷基的核苷酸間連結鍵、混合雜原子及烷基或環烷基的核苷酸間連結鍵、或一個以上短鏈雜原子或雜環的的核苷酸間連結鍵以形成不包含磷原子的經修飾主幹。此種主幹包含具有嗎啉(morpholino)連結鍵(生成在核苷酸的糖部)者；矽氧烷主幹；硫化物、亞碸(sulfoxide)及碸(sulfone)主幹；甲醯基(formacetyl)及硫代甲醯基(thioformacetyl) 主幹；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基主幹；核糖乙醯基(riboacetyl)主幹；含烯烴主幹；氨基磺酸(sulfamate)主幹；亞甲基亞氨基(methyleneimino)和亞甲基肼基(methylenehydrazino)主幹；磺酸鹽(sulfonate)和磺醯胺(sulfonamide)主幹；醯胺主幹；及其他具有混合N、O、S及CH₂ 組成者。

在另一實施方式中，用於本發明方法中的核酸包含一個以上的經取代糖部分(moieties)。此種經取代糖部分在其2'位置可包含下列群組中之一者：OH、F、O-烷基、 S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O- 炔基、S-炔基、N-炔基、及O-烷基-O-烷基。在這些基團中，烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代的C₁ 至C₁₀ 烷基或烯基及C₂ 至C₁₀ 炔基。糖基在其2'位置也可包含雜環烷基(heterocycloalkyl)、雜環烷芳基(heterocycloalkaryl)、氨基烷基氨基(aminoalkylamino)、聚烷氨基(polyalkylamino)、經取代矽烷基(substituted silyl)、RNA切割基團(RNA cleaving group)、報導者基團(reporter group)、嵌合劑(intercalator)、增加寡核苷酸的藥物動力學(pharmacokinetic)特性的基團、或增加寡核苷酸的藥效動力學(pharmacodynamic)特性的基團。經取代的糖基較佳包含：具有2'-甲氧乙氧基(2'-methoxyethoxy)、 2'-二甲基氨氧乙氧基(2'-dimethylaminooxyethoxy)、以及 2'-二甲基氨乙氧乙氧基(2'-dimethylaminoethoxyethoxy)者。可參考文獻Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504。

再一實施方式中，核酸可包含一個以上的經修飾天然核鹼基(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。經修飾的核鹼基可參考美國專利號3,687,808及文獻：The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, CRC Press, 1993.所述者。上述特定核鹼基對於增加反向寡核苷酸與其標的核酸的結合親和力特別有效。這些包含5-經取代嘧啶、6-氮雜嘧啶(azapyrimidines)及N-2、N-6及O-6經取代嘌呤 (例如2-氨基丙基-腺嘌呤(2-aminopropyl-adenine)、5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)及5-丙炔基胞嘧啶(5-propynylcytosine))。可參考文獻Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)。

任何核酸皆可由本技術領域中已知方法來合成。例如，可參考文獻Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19、Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684、Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio. 74, 59、Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45以及Brennan的美國專利號6,001,311。亦可由表現載體轉錄出核酸以及利用標準技術分離出核酸。

在其他實施方式中，TGFBR3抑制劑包括至少一個TGFBR3或TGFBR3次單位抑制化合物。在此使用的「TGFBR3抑制化合物」(TGFBR3 inhibitory compound)或「TGFBR3次單位抑制化合物」(TGFBR3 subunit inhibitory compound)係指除了抗TGFBR3以外的化合物，其直接或間接降低、抑制、中和、或消除TGFBR3的生物活性。TGFBR3抑制化合物應展現下列任一特性：(a) 結合至TGFBR3並抑制其生物活性及/或TGFBR3訊號功能調控的下游路徑；(b)預防、改善、或治療任何形式的心臟損傷；(c) 阻斷或減少TGFBR3受體活化；(d) 增加TGFBR3清除率；(e) 抑制(降低) TGFBR3合成、製造或釋放，本技術領域中具有通常知識者可製備出其他小分子抑制化合物。

在部分實施方式中，TGFBR3抑制化合物是TGFBR3突變體，其結合至TGFBR3受體但不會引起訊號傳導。此種突變體可阻斷野生型TGFBR3與TGFBR3受體間的結合，進而抑制TGFBR3訊號傳導。

在其他實施方式中，本揭示內容的TGFBR3抑制化合物為小分子，其分子量為約100至20,000道爾頓(daltons)、500至15,000道爾頓、或1000至10,000道爾頓中任一者。可於市面上購得小分子資料庫。可利用本技術領域中已知方式注射小分子，包含吸入、腹腔內、靜脈內、肌肉內、皮下、鞘內(intrathecally) 、心室內(intraventricularly) 、口內、腸內、腸胃外、鼻內或皮內。一般而言，當本發明的TGFBR3抑制劑為小分子時，以病患每公斤0.1至300 mg/kg的給藥速率對病患、分成一至三次以上之劑量給藥。對於正常體重的成年患者，可給予每劑1 mg至5 g的劑量。

可從化合物資料庫中得到上述小分子。資料庫在空間上可分成平行的固相或液相資料庫。例如可參考文獻Zuckermann et al. J. Med .Chem. 37, 2678-2685, 1994以及Lam Anticancer Drug Des. 12:145, 1997。本技術領域中已知合成化合物資料庫的方法，例如文獻DeWitt et al. PNAS USA 90:6909, 1993、Erb et al. PNAS USA 91:11422, 1994、Zuckermann et al. J. Med. Chem. 37:2678, 1994、Cho et al. Science 261:1303, 1993、Carrell et al. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994、Carell et al. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994、及Gallop et al. J. Med. Chem. 37:1233, 1994。化合物資料庫中的呈現方式可為溶液(例如文獻Houghten Biotechniques 13:412-421, 1992)、或顆粒(文獻Lam Nature 354:82-84, 1991)、片體(文獻Fodor Nature 364:555-556, 1993)、菌體(美國專利號5,223,409)、孢子(美國專利號No. 5,223,409)、質體(文獻Cull et al. PNAS USA 89:1865-1869, 1992)、或噬菌體(文獻Scott and Smith Science 249:386-390, 1990、Devlin Science 249:404-406, 1990、Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382, 1990、Felici J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991、及美國專利號5,223,409)。

在其他實施方式中，TGFBR3抑制劑可為多肽，包括TGFBR3受體的胞外部分，其中多肽專一性結合至TGFBR3配體並阻斷其與一個以上TGFBR3受體作用。在部分實施方式中，TGFBR3受體的胞外部分係與抗體的Fc部分融合。可溶性受體的範例係如國際專利號WO 01/46232中所述。

鑑定TGFBR3抑制劑

TGFBR3抑制劑可利用本技術領域中已知方法來鑑定或定性，藉此偵測及/或測量其降低、減少、或中和TGFBR3的生物活性。舉例來說，藉由測量TGFBR3相關級聯反應(cascade)活化的蛋白質磷酸化，ELISA類型的試驗偵測可適合用於TGFBR3調控激酶活化之定性或定量測量。也可將TGFBR3與預設試劑(candidate agent)作用後，偵測下列任一或多種特性：(a) 結合至TGFBR3並抑制其生物活性及/或TGFBR3訊號功能調控的下游路徑；(b)預防、改善、或治療任何心臟損傷之形式；(c) 阻斷或減少TGFBR3受體活化；(d) 增加TGFBR3清除率；(e) 抑制(降低) TGFBR3的合成、製造或釋放，藉此以鑑定TGFBR3抑制劑。在部分實施方式中，係將TGFBR3與預設試劑作用後，透過偵測與TGFBR3的結合以及伴隨的TGFBR3的生物活性降低或中和之情形來進行TGFBR3抑制劑的鑑定。可使用純化的TGFBR3多肽、或天然表現TGFBR3多肽的細胞、或轉染至表現TGFBR3多肽的細胞來進行結合試驗。在一實施方式中，結合試驗是競爭結合試驗，其評估預設抗體與已知TGFBR3抑制劑競爭結合至TGFBR3的能力。該試驗可以多種形式進行，包含ELISA的形式。在其他實施方式中，鑑定TGFBR3抑制劑係將TGFBR3與預設試劑作用後，偵測產生的TGFBR3抑制效果。根據最初的鑑定結果，可再利用生物試驗確認及精量預設TGFBR3抑制劑的活性，已知的方式為測量標的生物活性。或者，生物試驗可用於直接掃描預設試劑。

下文提供的實施方式係提出：多種可用於掃描預設TGFBR3抑制劑的試驗。生物試驗包含但不限於：流式細胞儀，判定在預設TGFBR3抑制劑存在下TGFBR3對細胞的競爭性結合；以及在心肌細胞中對TGFBR3誘導細胞凋亡的抑制情形。此外，可使用反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)或即時聚合酶連鎖反應(real time PCR)直接測量TGFBR3表現、或測量TGFBR3正調控的基因表現。

(B)Let-7 促進劑

微核糖核酸(micro ribonucleic acid，microRNA/miRNA)為小的非編碼RNA，其最初由RNA聚合酶II轉錄出來，然後經由兩個核酸內切酶系統處理後，形成成熟的單股RNA (參考文獻Ha et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 15, 509-524 (2014))。RISC (RNA誘導沉默)複合物使miRNA導向mRNA的3’-UTR，透過序列互補性，進而抑制蛋白質轉譯、mRNA降解及去腺苷酸化(參考文獻Meister et al.,Nat Rev Genet 14, 447-459 (2013))。

let-7是一種演化上保留的miRNA，遍佈於所有哺乳類組織中並且具有豐富表現量(參考文獻Roush et al.,Trends Cell Biol 18, 505-516 (2008))。miRNA let-7在心臟發展上(參考Rustagi et al.,PLoS One 10, e0139359 (2015)、Caoet al. ,Int J Mol Med 30, 1095-1104 (2012)) 及心肌細胞成熟上(參考Kuppusamyet al. ,Proc Natl Acad Sci U S A 112, E2785-2794 (2015))扮演重要角色。雖然let-7為早期發現的miRNA中之一者，且可於C. elegans 至哺乳動物上觀察到其高量表現(參考Roush et al.,Trends Cell Biol 18, 505-516 (2008))，然而對於let-7在心肌梗塞中的功能卻知之甚少。作為範例，以下提供人類前驅let-7a及let-7f的核苷酸序列(序列編號:89至93)，斜體字為成熟區(序列編號：94)： hsa-let-7a-1 UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU UUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA (序列編號：89) hsa-let-7a-2 AGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU UAGAAUUACAUCAAGGGAGAUAACUGUACAGCCUCCUAGCUUUCCU (序列編號：90) hsa-let-7a-3 GGGUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU UGGGGCUCUGCCCUGCUAUGGGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCU (序列編號：91) hsa-let-7f-1 UCAGAGUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU GUGGGGUAGUGAUUUUACCCUGUUCAGGAGAUAACUAUACAAUCUAUUGCCUUCCCUGA (序列編號：92) hsa-let-7f-2 UGUGGGAUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU UUAGGGUCAUACCCCAUCUUGGAGAUAACUAUACAGUCUACUGUCUUUCCCACG (序列編號：93)

本揭示內容方法中使用的let-7促進劑係用以提升、活化、或增加(包含顯著增加)內生性miRNA let-7 (包含let-7的任何亞型，例如let-7a或let-7f)的生物活性。「促進劑」(enhancer)一詞未限定生物行為的機制，應視為明確包含及涵蓋：與內生性let-7、或其直接或間接的下游基因相關之所有可能的藥學、生理學和生物化學的交互作用。就本發明的目的而言，可清楚了解「促進劑」一詞(包含先前記載的所有名詞、標題、及功能性狀態與特性)，係指任何有意義程度上(例如至少20%、50%、70%、85%、90%、100%、150%、200%、300%、或500%、或10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、或10⁴ 倍)對let-7自身(例如人類let-7)實質提升、活化、或增強。

在部分實施方式中，本揭示內容方法中使用的let-7促進劑為let-7核酸，泛指所有與天然miRNA let-7具有相似生物活性的核酸，例如let-7a或let-7f。此種let-7核酸可包括miRNA let-7的成熟核苷酸序列(序列編號：94)。或者，let-7核酸可為前驅let-7分子，其可進一步生成可抑制其下游基因表現的功能性、成熟miRNA。在部分實施方式中，let-7核酸包含一個以上的經修飾核苷酸，例如於本文中所述的經修飾核苷酸。

在其他實施方式中，本揭示內容方法中使用的let-7促進劑可為LIN28抑制劑，LIN28是一個RNA結合蛋白的家族，其可經由調控 miRNA let-7進而促進多能性(pluripotency)。LIN28蛋白可藉由與let-7結合並且去除對let-7標的之抑制作用，進而抑制let-7成熟。LIN28蛋白的範例包括：LIN28A (也被稱為：CSDD1、LIN-28、LIN28、ZCCHC1、lin-28A、或lin- 28同源物A)、及LIN28B (也被稱為：CSDD2、或Lin-28.2)。在Genbank資料庫之編號NC_000001.11 (LIN28A)及Genbank資料庫之編號NC_000006.12 (LIN28B)可取得人類LIN28蛋白。本揭示內容本揭示內容之方法中，可使用任一LIN28抑制劑作為let-7促進劑。LIN28抑制劑可為抑制LIN28活性的抗LIN28抗體。或者，LIN28抑制劑可為：標的LIN28基因及/或mRNA的小分子干擾RNA (siRNA或RNAi)或反向RNA，進而阻斷其轉錄/轉譯(例如透過RNA干擾)。在其他實施方式中，LIN28抑制劑可為抑制蛋白質活性的小分子，例如N-甲基-N-[3-(3-甲基[1,2,4] 三唑[4,3-b] 噠嗪-6-基)苯基]乙醯胺 (參考Roos et al., A Small-Molecule Inhibitor of Lin28.ACS Chem Biol. 2016 Aug 22)、以及硫代葡萄糖水合物(Aurothioglucose hydrate)。此種小分子抑制劑可透過常規作法，利用掃描合併式化合物資料庫(combinatory compound library)而得。

任一核酸類let-7促進劑可包含非自然發生的核鹼基、糖類、或共價核苷酸間連結鍵(主幹)。此種經修飾的寡核苷酸賦予所需性質，如提高細胞攝入量、增強對標的核酸的親和力、以及增加體內穩定性。

在一實施方式中，核酸類的let-7促進劑可具有經修飾的主幹，包含保留磷原子(例如參考美國專利號3,687,808、4,469,863、5,321,131、5,399,676、及 5,625,050)以及不具有磷原子(例如參考美國專利號5,034,506、5,166,315、及5,792,608)。含磷修飾主幹的例子包含但不限於：硫代磷酸酯(phosphorothioates)、掌性硫代磷酸酯(chiral phosphorothioates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、磷酸三酯(phosphotriesters)、氨烷基 - 磷酸三酯(aminoalkyl-phosphotriesters)、甲基和其他烷基膦酸酯(alkyl phosphonates)(包含3'-亞烷基磷酸酯、5'-亞烷基磷酸酯及掌性磷酸酯)、亞磷酸鹽(phosphinates)、磷醯胺酯(phosphoramidates)(包含3'-氨基磷醯胺酯及氨烷基磷醯胺酯)、硫代磷醯胺酯(thionophosphoramidates)、硫代烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)、硒代磷酸酯(selenophosphates)和硼烷磷酸酯(boranophosphates)(具有3'-5'連結鍵或2'-5'連結鍵)。此種主幹亦包含具有相反極性者，即3'至3'、5'至5'或2'至2'連結鍵。形成不包含磷原子的經修飾主幹，可透過短鏈烷基或環烷基的核苷酸間連結鍵、混合雜原子及烷基或環烷基的核苷酸間連結鍵、或一個以上短鏈雜原子或雜環的的核苷酸間連結鍵。此種主幹包含具有嗎啉連結鍵(生成在核苷酸的糖部)者；矽氧烷主幹；硫化物、亞碸(sulfoxide)及碸(sulfone)主幹；甲醯基(formacetyl)及硫代甲醯基(thioformacetyl) 主幹；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基主幹；核糖乙醯基(riboacetyl)主幹；含烯烴主幹；氨基磺酸(sulfamate)主幹；亞甲基亞氨基(methyleneimino)和亞甲基肼基(methylenehydrazino)主幹；磺酸鹽(sulfonate)和磺醯胺(sulfonamide)主幹；醯胺主幹；及其他具有混合氮、氧、硫及CH₂ 組成者。

在另一實施方式中，用於本發明方法中的核酸類let-7促進劑可包含一個以上的經取代糖基。此種經取代糖基在其2'位置可包含下列群組中之一者：OH、F、O-烷基、 S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O- 炔基、S-炔基、N-炔基、及O-烷基-O-烷基。在這些基團中，烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代的C₁ 至C₁₀ 烷基或烯基及C₂ 至C₁₀ 炔基。糖基在其2'位置也可包含雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷氨基、經取代矽烷基、RNA切割基(RNA cleaving group)、報導者基(reporter group)、嵌合劑(intercalator)、增加寡核苷酸的藥物動力學(pharmacokinetic)特性的基團、或增加寡核苷酸的藥效動力學(pharmacodynamic)特性的基團。經取代的糖基較佳包含：具有2'-甲氧基乙氧基、 2'-二甲基氨基氧基乙氧基、以及 2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基者。可參考文獻Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504。

再一實施方式中，核酸類let-7促進劑可包含一個以上的經修飾天然核鹼基(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。經修飾的核鹼基包含如美國專利號3,687,808及文獻：The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, CRC Press, 1993 所述。上述特定核鹼基對於增加反向寡核苷酸與其標的核酸的結合親和力特別有效。這些包含5-經取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6經取代嘌呤 (例如2-氨基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶)。可參考文獻Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278。

任何核酸類let-7促進劑皆可由本技術領域中已知方法來合成。例如，可參考文獻Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19、Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684、Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio. 74, 59、Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45以及Brennan的美國專利號6,001,311。核酸類let-7促進劑亦可由表現載體轉錄出來以及利用標準技術分離出來。

(C)藥物組合物

本揭示內容的一種以上TGFBR3抑制劑(例如抗體)、及/或一種以上let-7促進劑可與藥學上可接受之載劑(賦形劑)混合，以形成用於治療目標疾病、損傷或病症的醫藥組合物。在部分實施方式中，該組合物係用於治療心臟損傷。在部分實施方式中，本揭示內容的TGFBR3抑制劑及let-7促進劑或聚乙二醇(PEG)共軛物皆可與藥學上可接受之載劑(賦形劑)混合，以形成用於治療目標疾病的醫藥組合物。「可接受的」(acceptable)表示該載劑必須具備與組合物中活性成分的相容性(較佳為能夠穩定活性成分)，且不會對待治療個體造成傷害。藥學上可接受之賦形劑(載劑)包含本技術領域中已知的緩衝劑。例如：可參考文獻Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。。

本發明方法中所使用的醫藥組合物可包括藥學上可接受之載劑、賦形劑、或穩定劑(凍乾製劑或水溶液型式)。例如：可參考文獻Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。可接受之載劑、賦形劑、或穩定劑所使用的劑量和濃度對接受者無毒性，且可包括：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑，如十八烷基二甲基芐基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、氯化六甲銨(hexamethonium chloride)、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、芐索氯銨(benzethonium chloride)、苯酚(phenol)、丁基或苯甲醇(butyl or benzyl alcohol)、烷基對羥基苯甲酸酯(alkyl parabens)(例如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯)、鄰苯二酚(catechol)、間苯二酚(resorcinol)、環己醇(cyclohexanol)、3-戊醇(3-pentanol)、及間甲酚(m-cresol)；低分子量多肽(約低於10個殘基)；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；胺基酸，例如甘胺酸(glycine)、穀胺酸(glutamine)、天冬門胺酸(asparagine)、組胺酸(histidine)、精胺酸(arginine)、或離胺酸(lysine)；單醣類、雙糖類、及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖(mannose)或葡聚醣(dextrans)；螯合劑，例如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetracetic acid, EDTA)；糖類，例如蔗糖、甘露糖、海藻糖(trehalose)或山梨糖醇(sorbitol)；形成鹽類的抗衡離子(counter-ions)，例如鈉；金屬複合物(例如鋅(Zn)蛋白複合物)；及/或非離子性界面活性劑，例如TWEEN^TM 、PLURONICS^TM 、或聚乙二醇(PEG)。

在部分實施方式中，本揭示內容的醫藥組合物包括：含抗-TGFBR3抗體的脂質體，其可由本技術領域中已知的方法所製備出來，例如文獻Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)、Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)、及美國專利號4,485,045及4,544,545中所述之。美國專利號5,013,556中記載脂質體可促進循環時間。逆向揮發法(Reverse Phase Evaporation)可生產出特別有用的脂質體，其具有脂質組成分，包括磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)、膽固醇和PEG衍生的磷脂醯乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine, PEG-PE)。透過精準孔徑的過濾器，可擠壓出具有所需尺寸的脂質體。

本揭示內容的抗-TGFBR3抗體及/或let-7促進劑亦可包埋至微囊中，製備方法如凝聚技術或介面聚合，微囊例如羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)或明膠微囊及聚甲基甲基丙烯酸甲酯(poly-(methylmethacylate))微囊，分別於膠體藥物輸送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒和奈米膠囊)或粗乳液(macroemulsion)。此類技術為本技術領域中已知的，例如可參考文獻Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)。

在其他實施方式中，本揭示內容的醫藥組合物可以為持續釋放的劑型。適當的持續釋放製備範例包含：固態疏水性聚合物之半滲透性基材，其中固態疏水性聚合物包含抗-TGFBR3抗體，且基材是成型物品如薄膜或微囊。持續釋放基材的範例包含：聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)( poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(如美國專利號3,773,919)、L-穀胺酸及7乙基-L-穀胺酸的共聚物、不可分解的乙烯-乙酸乙烯酯、可分解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOT^TM (注射性微球，由乳酸-乙醇酸共聚物及利普安(leuprolide acetate)所組成)、蔗糖乙酸異丁酸酯(sucrose acetate isobutyrate)及聚-D-(-)-3-羥丁酸(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)。

用於體內注射的醫藥組合物必須為無菌的。利用如無菌過濾膜進行過濾即可快速達成。具療效的抗-TGFBR3抗體組合物可置入具有無菌入口的容器內，例如具封口的靜脈注射液體袋或小瓶，可利用皮下注射針刺穿封口。

本揭示內容的醫藥組合物可為單位劑量形式，例如片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、顆粒、溶液或懸浮液、或栓劑，用於口服、腸胃外或直腸給藥，或通過吸入或吹入給藥。

製備如片劑之固體組合物時，主要的活性成分可與藥學載劑以及其他醫藥稀釋劑(如水)混合，藥學載劑例如傳統的片劑成分，如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹脂(gums)；以形成含本發明化合物之勻相混合物、或其藥學上可接受之無毒性鹽類之固體預配方(preformulation)組合物。當這些預配方組合物為勻相時，表示活性成分均勻分散在組合物整體中，使組合物可快速分成等量的有效單位劑量形式，例如片劑、丸劑、或膠囊。此固態預配方組合物接續可分成：包含本發明活性成分約0.1至500 mg之上述單位劑量形式。該新穎化合物的錠劑或丸劑可經塗佈處理或其他複合處理，以提供具有長時間反應之優點的劑型。例如，錠劑或丸劑可包括內部劑量(inner dosage)和外部劑量(outer dosage)成份，後者為包覆前者的包膜形式。兩種成分可藉由腸溶層(enteric layer)分隔開來，腸溶層係用以抵抗在腸胃中解體，使內部成份通過胃進而完整進入十二指腸或延遲釋放。可使用各種材料作為此腸溶層或塗層，此種材料包含多種聚合酸以及聚合酸的混合物(例如含蟲膠(shellac)、鯨蠟醇(cetyl alcohol)和醋酸纖維素(cellulose acetate))。

適合的界面活性劑特別包括：離子性試劑，例如聚氧乙烯山梨聚醣(polyoxyethylenesorbitans)(例如TWEEN^TM 20、40、60、80或85)及其他山梨聚醣(例如SPAN^TM 20、40、60、80或85)。包含界面活性劑的組合物可適當包括介於0.05至5%之間、及介於0.1至2.5%之間的界面活性劑。視需要也可以添加其他成份，例如甘露醇或其他藥學上可接受之媒介物。

可利用市購的脂肪乳液(例如INTRALIPID^TM 、LIPOSYN^TM 、INFONUTROL^TM 、LIPOFUNDIN^TM 及LIPIPHYSAN^TM )製備出適合的乳液。活性成份亦可溶於事先混合好的乳狀組合物、或可溶解於油中(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)，且可混合磷脂質(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水進而形成乳液。亦可添加其他成份，例如甘油或葡萄糖，藉以調整乳液的張力(tonicity)。適當的乳液一般包含最多20%的油，例如介於5至20%之間。脂肪乳液可包括介於0.1及1.0 .im之間、尤其是0.1及0.5 .im之間的脂肪滴(fat droplet)，且其pH值介於5.5至8.0之範圍內。

透過混合抗TGFBR3或let-7促進劑與INTRALIPID^TM 或其成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水) ，可製備乳狀組合物。

吸入性或吹入性的醫藥組合物包括藥學上可接受之溶液及懸浮液、水性或有機溶劑、或其混合物、以及粉末。液態或固態組合物可包含適當的藥學上可接受賦形劑(如上述)。在部分實施方式中，經口給予或經鼻呼吸路徑給予組合物，可伴隨局部或全身的效果。

較佳地，可將組合物置於無菌之藥學上可接受溶劑中，並以氣體霧化之。霧化的溶液可直接從霧化裝置吸入，或霧化裝置可與一面罩、帳幕、或間歇性正壓呼吸機連接。較佳地，溶液、懸浮液或粉末組合物可以合適方法從輸送藥劑的裝置經口或鼻給藥。

(D)心臟損傷之治療

心臟損傷包括但不限於：心臟急性冠狀動脈綜合症、心肌梗塞(包含MI及其他非MI的由冠狀動脈疾病引起的急性心臟損傷)、心肌炎、心肌病變、及術後心臟保護(post-operation cardio-protection)。「心臟損傷」(cardiac injury)定義為引發心肌細胞死亡(例如細胞凋亡)。在部分實施方式中，p38 MAPK路徑活化的心肌細胞凋亡可引起心肌細胞死亡。在其他實施方式中，壓力因素可引起心肌細胞死亡。心臟損傷的壓力因素包括但不限於：外傷、毒素、血塊形成、血栓、缺氧、營養匱乏。

兩大冠狀動脈及其分支供應血流至心肌。冠狀動脈阻塞(即使只有一個以上的血管阻塞)是引發心肌梗塞的主因之一。在部分實施方式中，當動脈粥樣化血栓破裂，穿過血管分層，造成血塊突然生成，進而導致阻塞發生。在其他實施方式中，硬化動脈窄化且內壁粗糙，導致形成血栓。MI的其他因素可歸因於心臟的供血需求不足量的驟增，例如休克、出血、及嚴重體力消耗，並限制血流通過主動脈(aorta)(例如主動脈瓣狹窄(aortic stenosis))。

本揭示內容的抗-TGFBR3抗體、或let-7促進劑中任一者可用於改善心臟損傷，例如本發明中所述。執行本揭示內容之方法，經由適當路徑對一有需要之個體投予有效量之含抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑之醫藥組合物，適當路徑例如靜脈注射(單次推進(bolus)或持續一段時間的連續輸入)、肌肉內注射、腹腔內注射、腦脊髓內(intracerebrospinal)注射、皮下注射、關節內(intra-articular)注射、滑膜內(intrasynovial)注射、鞘內注射、口服、吸入或局部途徑。市售用於液體劑型的噴霧器(包含噴射式噴霧器及超音波噴霧器)均可有效地給藥。液體劑型可直接霧化，且凍乾粉末經重組後可被霧化。或者，本揭示內容之含抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑的組合物，可利用氟碳化合物及定量吸入器進行霧化，或者吸入凍乾後經研磨的粉末。

在此使用的「有效量」(an effective amount)一詞表示：各活性劑給予個體治療效果所需要的含量，不論是單獨或與一種以上他種活性劑之組合皆適用。在部分實施方式中，醫療效果係指降低心臟損傷及/或增加免疫活性。對本技術領域中具有通常知識者而言，判斷抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑的含量是否達到治療效果係為顯而易見的。本技術領域中具有通常知識者，考量特定的待處理病症、病症嚴重性、病患個別條件(包含年齡、健康狀況、身高、性別及體重)、治療期間、合併治療的性質(若有的話)、具體給藥路徑等因素，根據醫療就業者的專業知識及經驗，進而改變有效量。對本技術領域中具有通常知識者而言，這些因素都是已知的，不需額外進行常規實驗即可處理。個別成份或其組合使用的最大劑量一般較佳為：根據合理醫療判斷(sound medical judgment)之最高安全劑量。

經驗上的考量，例如半衰期，通常可助於決定劑量。給藥的頻率可視療程調整，通常(但非必需)以治療及/或抑制及/或改善及/或延遲目標疾病/症候群為基準作考量。或者，抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑的持續連續釋放劑型也很合適。本技術領域中已知達到持續釋放的各種劑型及裝置。

在一實施方式中，所述抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑的劑量，可根據已經接受過一種以上抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑的個體經驗來決定。個體可給予增加劑量的拮抗劑。可追蹤疾病/症候群的指標，以評估拮抗劑的效果。

一般而言，給予所述抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑任一者的初始預設劑量可為約每公斤2 毫克。就本發明之目的而言，典型的每日劑量可介於約每公斤0.1微克至3微克、每公斤0.1微克至30微克、每公斤0.1微克至300微克、每公斤0.1微克至3 毫克、每公斤0.1微克g至30毫克、每公斤0.1微克至100毫克以上之範圍內，每日劑量可依據上述因素而加以變化。多日或更長時間的重複給藥係根據病症來決定，治療持續到顯現出理想的症狀抑制、或持續到達成足夠的療效，用以減緩目標疾病或症候群或其症狀。抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑的給藥方案範例包括：給予約每公斤2毫克的初始劑量；接著為約每公斤1毫克的一週維持劑量、或約每公斤1毫克的隔週維持劑量。然而，依據藥物動力學衰退的模式，其他給藥方案也可能有效達成病患所需。例如，可考慮一個禮拜給予一到四次的劑量。在部分實施方式中，可使用約每毫克3微克至約每公斤2毫克的劑量(例如每毫克3微克、約每毫克10微克、約每毫克30微克、約每毫克100微克、約每毫克300微克、約每公斤1毫克、及約每公斤2毫克)。在部分實施方式中，給藥頻率為一週一次、兩週一次、四週一次、五週一次、六週一次、七周一次、八週一次、九週一次、或十週一次；或一個月一次、兩個月一次、或三個月一次、或更長時間給予一次。可利用傳統的技術和試驗輕易監控療程的進度。在部分實施方式中係使用ELISA試驗。可隨時變化給藥方案(包含抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑)。

在部分實施方式中，正常體重的成年病患，可給予介於約每公斤0.3至5.00毫克之間的劑量。特定的給藥方案(即劑量、時程及處方)可依照特定的個人狀況及其用藥歷史、以及個別藥劑的特性(例如藥劑半衰期、及本技術領域中已知的其他考量)而決定。

就本發明的目的而言，上述抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑的適當劑量係依據特定的抗-TGFBR3抗體/let-7促進劑、疾病/症候群的類型和嚴重程度(不論給予抗-TGFBR3抗體/let-7是預防還是治療用途)、先前的療程、病患的臨床病史及對拮抗劑的反應、以及主治醫生的評估而決定。臨床醫生可給予抗-TGFBR3抗體/let-7促進劑，直到達到期望效果所需的計量。在部分實施方式中，期望效果是指減少心臟損傷及/或增加免疫活性。本技術領域中具有通常知識者可輕易得知：劑量是否能達到期望效果的判定方法。不論給藥目的是治療或預防，給予一種以上的抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑可為連續或間歇性給藥，例如可依據接受者的健康條件及其他專業醫護人員已知因素來決定。例如：在目標疾病或症候群發展之前、之中或之後，給予抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑可為實質上連續進行一預選時期、或可為一列列的間隔劑量。

在此所使用的「治療」(treating)一詞係指：對具有目標疾病或症候群、疾病/症候群之症狀、或傾向疾病/症候群之個體，在治愈、治療、緩解、減輕、改變、補救、改善、改進或影響該症候群、疾病之症狀、或傾向疾病或症候群之目的下，應用或給予包含一種以上活性試劑之組合物。

減緩目標疾病/症候群包含：延遲疾病的發展或進展、或減輕疾病的嚴重程度。減緩疾病不一定需要達到治癒性的結果。在此所使用的「延遲」(delaying或delay)目標疾病或症候群的發展係指：推遲、阻礙、緩速、延緩、固定和/或推延疾病的進展。根據待治療個體的疾病史，延遲可能為多種時間長度。「延遲」或減緩疾病發展、或延遲疾病發作的方法，相較於未使用該方法，係為在預設時間內降低一種以上疾病症狀發展的可能性、及/或在預設時間內降低症狀程度。此種比較通常以臨床研究為基礎，利用大量受試者才夠得到統計上具顯著意義的結果。

疾病的「發展」(development)或「進展」(progression)表示疾病初始表現及/或後續進展。可利用本技術領域中已知的指標性臨床技術偵測或評估疾病的發展。然而，發展亦指偵測不到的進展。就本發明的目的而言，發展或進展係指症狀的生物時程。「發展」包含發生、復發、及發作。在此所使用的目標疾病或症候群「發作」(onset)或「發生」(occurrence)，包含初始發作及/或復發。

在部分實施方式中，對有治療需要之個體給予在活體內足夠降低至少5%(例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或以上)心肌細胞死亡的有效量之抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑。在其他實施方式中，是投予有效降低TGFBR3或促進let-7活性至少5%(例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或以上)之有效量的抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑。

根據待治療的疾病/損傷類型或疾病/損傷位置，可使用醫藥技術領域中具有通常知識者已知的傳統方法，將醫藥組合物注射至個體內。組合物也可透過其他傳統路徑給予，例如利用經口、腸胃外、吸入噴霧、局部、直腸、鼻腔、口腔、陰道給藥或植入儲存庫(reservoir)。在此使用的「腸胃外」(parenteral)一詞包含：皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內(intrasternal)、鞘內、病灶內(intralesional)和顱內(intracranial)注射或輸入技術。在部分實施方式中，醫藥組合物係經由局部注射。在部分實施方式中，局部注射係為心肌內注射或冠狀動脈內注射。此外，可透過注射補給(depot)的給藥方式供應至個體，例如使用1、3、或6個月的補給注射或生物性可分解材料及方法。在部分實施方式中，醫藥組合物係透過眼內(intraocularlly)或玻璃體內(intravitreally)給藥。

注射用組合物可包含各種載體，例如植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乙酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等)。用於靜脈注射，可利用滴注法(drip method)注入水溶性抗-TGFBR3抗體，進而注入含抗-TGFBR3抗體及生理上可接受之賦形劑的藥物組合物。生理上可接受之賦形劑可包括：例如5%右旋糖(dextrose)、0.9%生理食鹽水、Ringer’s溶液及其他適當的賦形劑。製備用於肌肉內注射者，例如抗-TGFBR3抗體的適當水溶性鹽類型式的無菌劑型，可溶解於醫藥賦形劑(例如注射用水、0.9%食鹽水、或5%葡萄糖溶液)中並注射之。

在一實施方式中，抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑係透過位點專一性(site-specific)或目標局部輸送(targeted local delivery)技術。位點專一性或目標局部輸送技術包括多種可植入的抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑之儲存庫來源、或局部輸送導管，例如輸液導管、留置導管(indwelling catheter)或針導管、合成移植物(synthetic grafts)、外膜覆膜(adventitial wraps)、分流器及支架或其他可植入性裝置、位點專一性載體、直接注入或直接供給。例如，可參考世界專利號WO 00/53211及美國專利號5,981,568案件。

亦可使用包含反向多核苷酸、表現載體、或次基因多核苷酸(polynucleotides)的醫藥組合物作標靶輸送。受體調控的DNA傳輸技術係描述於：例如文獻Findeis et al., 生物技術趨勢 (1993) 11:202、Chiou et al., 基因療法: 直接基因轉移之方法及應用 (J. A. Wolff, ed.) (1994) 、Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621、Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542、Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655、Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338。

在基因療法的指南中，局部注射包含多核苷酸(例如核酸類TGFBR3抑制劑或核酸類let-7促進劑)的醫藥組合物，係注入介於約100 奈克至約200 毫克範圍內的DNA。在部分實施方式中，基因療法的指南中亦可使用濃度範圍介於500奈克至約50毫克、約 1 微克至約2毫克、約 5 微克至約500微克、及約20 微克至約100 微克之間、或更高濃度的DNA。

本揭示內容的待治療個體可為哺乳類，例如農場動物、運動動物(sport animals)、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠和大鼠。在一實施方式中，個體為人類。含抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑的組合物可用於保護心肌細胞免於多種因素導致的心肌細胞死亡。在部分實施方式中，個體可為具有心臟損傷、預期具有心臟損傷、或存在心臟損傷風險的病患，心臟損傷可舉例如心臟急性冠狀動脈綜合症、心肌梗塞(包含MI及其他非MI的由冠狀動脈疾病引起的急性心臟損傷)、心肌炎、心肌病變、及術後心臟保護(post-operation cardio-protection)。此種病患亦可由常規醫藥實驗判斷出來。

可由常規醫藥實驗判斷出來具有目標疾病或症候群(例如心血管疾病)的個體，常規醫藥實驗可舉例如：實驗室測試、器官功能性測試、電腦斷層掃描(CT)、或超音波。預期具有任一目標疾病/症候群的個體可能顯示出一種以上的疾病/症候群症狀。存在疾病/症候群風險的個體可為：具有一種以上與疾病/症候群相關的風險因子的病患。可由常規醫藥實驗判斷出該些個體。

本揭示內容方法中使用的具體劑量方案(即劑量、時間及重複性)，可根據特定個體(例如人類病患)的狀況及其醫藥歷史來決定。

在部分實施方式中，抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑可與其他適當的心臟損傷療法(例如本文中所述者)併用。或者或此外，抗-TGFBR3抗體或let-7促進劑亦可與其他作為促進及/或補充效果的試劑共同使用。

目標疾病/症候群的治療效果可經由如下方實施方式中所述方法進行檢測。

II. 用於減緩目標疾病的套組

本發明亦提供用於減緩心臟損傷的套組，該套組可包含：一種以上含TGFBR3抑制劑(例如結合TGFBR3的抗體，如本文中所述中任一者)或let-7促進劑(例如let-7核酸)的容器。

在部分實施方式中，該套組可包括：根據本文中所述方法中任一者的使用說明書。包含的說明書中可包括：注射適體(aptamer)以達到治療、延遲發病、或減緩目標疾病(如本文中所述)的描述。該套組可更包括：基於判別個體是否具有目標疾病，進而挑選出適合治療的個體之敘述。再一實施方式中，說明書包括：將適體注入一存在目標疾病風險的個體之敘述。

關於使用TGFBR3抑制劑或let-7促進劑的說明，一般包含治療所需的劑量、給藥流程、及給藥路徑等資訊。該容器可為單位劑量、大量包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。本發明套組中提供的說明書一般為：在標籤或仿單(package insert)(例如包含於套組內的紙張)上印刷指示說明，亦可接受為需要機器判讀的說明書(例如磁性或光學性儲存碟片所攜帶的說明書)。

標籤或仿單指出：組合物係用於治療、延遲發作及/或減緩與心臟損傷相關的疾病或損傷(如本文中所述)。說明書可用於執行本文中所述方法中的任一者。

本發明的套組位於適當包裝中。適當的包裝包含但不限於：小瓶、瓶子、罐子、軟性包材(例如密封的Mylar或塑膠袋)等。用於與特定裝置併用的包材同樣需要考慮，裝置可舉例如：吸入器、經鼻給藥裝置(例如噴霧器)或如微型泵的注入裝置。套組可具有無菌入口部(例如該容器可為具封口的靜脈注射液體袋或小瓶，可利用皮下注射針刺穿封口)。該容器亦可具有無菌入口部(例如該容器可為具封口的靜脈注射液體袋或小瓶，可利用皮下注射針刺穿封口)。組合物中至少一活性試劑為本文中所述之TGFBR3抑制劑及/或let-7促進劑。

套組可選擇性提供：額外構件，例如緩衝液及解釋資訊。正常來說，該套組包括：一容器；及一位於容器上(或與容器相關)的標籤或仿單。在部分實施方式中，本發明亦提供：包括上述套組內容的製造敘述。

III. 用於測量TGFBR3及/或Let-7的試驗

本揭示內容亦提供測量生物樣品中的TGFBR3含量、let-7含量、或兩者的試驗方法。此種方法可包括：(i)提供一預期含有TGFBR3、let-7、或兩者的生物樣品；(ii) 將該生物樣品與一試劑(例如抗體)接觸，該試劑與一切割型TGFBR3(例如序列序列編號：3)、let-7、或兩者結合；(iii)測量該生物樣品內的切割型TGFBR3、let-7、或兩者的含量；以及(iv) 判定該生物樣品內為存在或不含TGFBR3、let-7、或兩者。可使用任何傳統方法來測量生物樣品中的TGFBR3、let-7、或兩者的含量，例如ELISA、雜交技術、或PCR。

合適的生物樣品可經由常規實驗從上述個體中取得，生物樣品的範例包括但不限於：液態樣品，如血液(例如全血、血漿、血清)、尿液、及唾液；固態樣品，如組織(例如皮膚、肺臟、鼻腔)及糞便。可利用本技術領域中已知方法或上述方法中任一者來蒐集此種樣品，例如口腔擦拭取樣、鼻腔擦拭取樣、靜脈穿刺、切片、尿液採集或糞便採集。在特定實施方式中，所述試驗方法中使用的生物樣品為血漿樣品或血清樣品。

用於測量TGFBR3的試劑(例如抗體)可專一性結合至切割型(可溶型)受體。在部分實施方式中，此種抗體不會結合至膜連型TGFBR3。用於試驗方法中的抗體可專一性結合至經醣基化的切割型TGFBR3。例如，抗體可結合至經醣基化的N端抗原表位。

測量let-7的試劑可為核酸分子(DNA或RNA)，其包括與let-7互補或部分互補的核甘酸序列。在此所使用的「互補」(complementary)一詞係指本技術領域中已知的核鹼基互補。例如：腺嘌呤在DNA中與胸腺嘧啶互補、在RNA中與尿嘧啶互補；以及鳥嘌呤與胞嘧啶互補。在此使用的「序列互補」(sequence complementarity)或「核酸序列彼此互補」(nucleic acid sequences being complementary to one another)表示：當兩個核酸分子彼此呈反向平行排列時，序列中每一位置、或大部分位置的核苷酸鹼基為互補的，以及該兩核酸分子在適當條件(例如雜交溫度)下可融合並形成雙鏈體(duplex)。本技術領域中已知：融合形成雙鏈體的兩核酸分子不一定必須為100%序列互補。擷取探針(或上述偵測探針)及標的核酸之間的序列互補性可為：與標的核酸中對應區域至少80%互補。在部分實施方式中，擷取探針包含：一與標的核酸之第一節段至少80% (例如85%、90%、95%、98%、或100%)互補的片段。在部分實施方式中，擷取探針包含：一與標的核酸之第一節段完全互補(100%互補)的片段。從實質相同核酸中分化出標的核酸可使用此種擷取探針，實質相同核酸可舉例如：具有1、2、或3個與標的核酸不同的鹼基的核酸。

用於測量let-7的核酸類試劑最多可包含100個核苷酸(例如最多80 nt、60 nt、50 nt、或30 nt)。在部分實施方式中，核酸的長度可為8-50個核苷酸，例如長度為8-40、8-30、10-30、15-30、或15-20個核苷酸。在其他實施方式中，核酸可包含：用於連接至支撐件(如下述)的連接劑(例如poly A或poly T連接劑)。或者或此外，核酸可與標誌試劑直接共軛結合或透過連接劑結合。

所述測量let-7的試劑可由傳統方法固定在支撐件上。在此所使用的「固定」(immobilized)表示共價性或非共價性的黏結、附加、或綁定，藉此防止擷取探針脫落或遺失，但不需要絕對固定至擷取探針或支撐件。支撐件可為具有表面的固態或半固態元件，該表面係用以具體貼附、結合、甚至擷取一核苷酸探針(例如本發明所述的擷取探針)，進而使核苷酸探針固定至支撐件上。用於測量let-7的試劑可與標誌試劑共軛結合。在此使用的「共軛」(Conjugated)一詞表示：標誌試劑共價性或非共價性的附加至偵測探針上。標誌試劑可為任何分子、粒子、或類似物，用以輔助直接或間接性的偵測(利用合適的偵測技術)。在直接性偵測的例子中，標誌試劑可為：能夠釋放訊號的分子或基團，而該訊號可被直接判讀及/或偵測(例如螢光標誌或染劑)。在間接性偵測的第一個非限定例子中，標誌試劑可為能夠將基質(例如酵素)轉換成產物的分子或基團，該產物能夠釋放可偵測的訊號。例如：標誌試劑可為螢光素酶(luciferase)，其將螢光素轉換成氧基螢光素，藉以發出可偵測的光線。在間接性偵測的另一個非限定例子中，標誌試劑為結合至分子或基團的結合配體，該分子或基團能夠轉換基質(例如酵素)，其中轉換後的基質會釋放可偵測的訊號。

結合至切割型TGFBR3的抗體或用於測量let-7的試劑，在適當條件下可與上述生物樣品作用一段適當時間，使切割型TGFBR3結合至抗體、或let-7結合至試劑。然後，透過常規技術可偵測到此結合。

在生物樣品中，由所述試驗方法中任一者所判定的TGFBR3及/或let-7的存在及/或含量，可具有多種臨床及非臨床應用。

如上所述，具MI病患的樣品中，已發現let-7 (例如let-7a及let-7f)的下調現象。此外，在損傷心臟組織中，心肌梗塞24小時後已發現TGFBR3(miRNA let-7標的基因)的上調情形。因TGFBR3可被切割並釋放至胞外基質，血漿TGFBR3可用於作為檢測MI及其他心臟損傷的生物標劑。let-7含量下降及/或血漿TGFBR3含量上升可作為心臟損傷的指標。

不同於心臟旋轉素，TGFBR3在血漿中有基礎表現量。根據實施方式1中的豬體實驗，每一個別豬體中的血漿TGFBR3濃度相當一致。因此，可建立出診斷用的標準濃度範圍。

如上所述，來自個體(例如人類病患)之生物樣品中，可溶性TGFBR3、let-7、或兩者的含量可用於判定個體是有具有心臟損傷(如MI)的風險。在部分實施方式中，TGFBR3/Let-7的含量可與所述預定值作比較。與預定值相比，生物樣品中增高的TGFBR3含量及/或降低的let-7含量指出：個體具有心臟損傷或存在心臟損傷的風險。

在此使用的「增高的TGFBR3含量」(an elevated level of TGFBR3)表示TGFBR3的含量高於預定值(例如TGFBR3的預定閾值或控制組含量)。於此詳述控制組含量。增高的TGFBR3含量包含如：比預定值高1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或以上的TGFBR3含量。增高的TGFBR3含量也包含：從零狀態(zero state)(例如控制組中沒有或偵測不到TGFBR3)到非零狀態(non-zero state)(例如樣品中少量TGFBR3或可偵測到TGFBR3)的現象增加。

在此使用的「降低的let-7含量」(a decreased level of let-7)表示let-7的含量低於預定值(例如let-7的預定閾值或控制組含量)。降低的let-7含量包含如：比預定值低1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更低的let-7含量。降低的let-7含量也包含：從可偵測狀態到無法偵測狀態。

預定值可為控制組中的TGFBR3或let-7的含量(控制組含量)，預定值可使用所述本技術領域中已知方法中任一者來測量。在部分實施方式中，預定值係利用相同的方法測量生物樣品中的TGFBR3或let-7的含量。控制組含量可為控制組樣品、控制組個體、或控制組個體群集中的TGFBR3或let-7的含量。

控制組可為一正常個體、或可來自正常個體群集。於此使用的「正常個體」(normal subjects)係指明顯健康且未表現出心臟損傷跡象或症狀的個體。控制組個體的群集可為正常個體的群集。

應了解本文所述方法不需要在每次測量個體時重新測量控制組含量。或者，在部分實施方式中，得到控制組含量並記錄下來，然後任一測試含量皆與此控制組含量相比。預設值可為單一斷值(single-cutoff value)或範圍值。

將來自個體的生物樣品的TGFBR3及/或let-7值與所述預定值作比較，可判斷個體是否具有心臟損傷或存在心臟損傷的風險。

常見技術 除非額外說明，可採用本技術領域中已知的分子生物學(包含重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的傳統技術實行本發明。可參考下列文獻：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。

不需深入闡述，相信本技術領域中具有通常知識者可以基於上述說明，最大程度地詮釋本發明。因此，下方具體實施方式僅用於說明本發明，並未以任何方式限制本發明所揭露範圍。關於本發明目的或申請標的，本文中引用的所有出版物皆合併至此作為參考。

實施方式

多種動物模式係用以模擬心肌梗塞(MI)(心肌梗塞是全球死亡及心臟衰竭的主因)。為了觀察MI的重點機制或探討潛在治療策略，在費用、基因操作技術及簡易操作考量下，常使用小動物模式。然而，小動物的心率、收縮蛋白表現、代謝等係與人類大不相同(參考Zaragozaet al. ,J Biomed Biotechnol 2011, 497841 (2011))，因此難以直接將小動物研究轉換到人類臨床用。不同於小的實驗室動物，在人類冠狀動脈疾病方面，因豬體的心血管解剖學及疾病進展與人類相似，故豬體提供了理想的動物模式(參考Munz et al.,Comp Med 61, 445-452 (2011))。因此，豬的MI模式利於在早期MI階段顯現多種小分子非編碼RNA的功能。

其中，豬被認為是最具代表性的模式。在本案研究中，豬體MI模式及次世代定序技術係應用至探討早期MI中不同miRNA的表現。本案研究的主旨在於：利用豬體MI模式確認miRNA對早期心肌梗塞的反應。採集心肌梗塞的豬心臟組織。使用RNA進行次世代定序(NGS)。由即時qPCR確認個別表現量，並利用掃描判定潛在標的基因。利用獲得功能(gain of function)及喪失功能(loss of function)的方法研究miRNA及標的基因的功能。再者，為了將實驗結果延伸至潛在臨床應用，從實驗豬體和臨床病患中採集血漿樣本作進一步觀察。

實驗發現：在心臟組織中miRNA let-7a及let-7f含量豐富，並在MI後24小時內顯現顯著的下調。它們的下游標的基因TGFBR3及HMGA2相對上調。在壓力下，由TuD RNA抑制let-7可促進心肌細胞凋亡。TGFBR3過量表現活化p38 MAPK並導致心肌內細胞凋亡。抑制p38 MAPK可回復TGFBR3引起的凋亡蛋白酶3活化。這些實驗數據推論出：let-7 (包含let-7a及let-7f)的下調將透過TGFBR3及p38 MAPK訊號路徑促進心肌細胞死亡。let-7過量表現或TGFBR3抑制能降低p38 MAPK活性並回復無血清所引發的細胞死亡，此結果同樣支持上述論點。最後，在急性MI病患 (n=25)中，血漿let7含量相較於正常控制組(n=9)顯著下降(P＞0.05)。本項研究確認早期MI中不同miRNA的表現，揭露let-7及TGFBR3在心血管疾病中的角色，同時提供用於心臟損傷(如MI)的潛在生物標記和治療標的。在早期心肌梗塞中，miRNA let-7/TGFBR3調控軸引起心肌細胞死亡，且血漿let-7及TGFBR3兩者皆對心臟損傷有反應。

材料及方法

(i) 豬體模式的LAD結紮

在插管前，對約22 Kg的蘭嶼迷你豬導入Zoletil (12.5 mg/kg; Virbac，法國)、Rompun (0.2 ml/kg; Bayer 健康中心，德國)、及atropine (0.05 mg/kg; TBC，台灣)進行麻醉。將豬體貼覆至呼吸器，給予間歇性正壓通入氧氣、空氣、及異氟醚(1.5至2%; Baxter 健康中心, Guayama, PR)的混合物。在手術過程中，於耳靜脈設置一靜脈留置導管，持續注入食鹽水或麻醉劑。手術後，給予抗生素(Ampolin, YSP)防止感染，以及鎮痛藥(Keto, YSP)用以緩解疼痛。MI手術係於左前下行動脈中段(midleft anterior descending artery)進行永久性閉塞處理。

(ii) 總RNA及血漿miRNA萃取

使用Trizol反應試劑(Invitrogen)，從組織及細胞中萃取總RNA。透過離心周邊血液得到豬血漿；然後利用mirVana PARIS套組(Ambion)，按照使用說明，從200 µl血漿中萃取出miRNA。取5 飛摩耳(femto-moles)之合成miRNA：cel-mir-39添加至樣品中，作為校正操作誤差的內控制組。

(iii) 以次世代定序(NGS)進行miRNA分析

在MI後1、2、及4小時，從梗塞組織和遠端組織抽取RNA樣品。按照TRUSEQ® Small RNA (Illumina)說明書製備miRNA資料庫，並根據HiSeq 2000平台的Illumina方法進行定序。產生的原始fastq數據係利用miRSeq (Panet al. ,Biomed Res Int 2014, 462135 (2014))進行分析，以檢驗全部的定序品質以及導出miRNA表現的特性。

(iv) miRNA莖環即時聚合酶連鎖反應(stem-loop real-time PCR)

利用Taqman miRNA反轉錄套組(Applied Biosystems)，使用合成的寡核苷酸(生成莖環結構)及反向 miRNA(作為RT引子)，將50 奈克總RNA進行反轉錄。使用普遍引子(辨認莖環序列)及miRNA專一性引子(位於OmicsGreen qPCR 主混合試劑(Omics Bio)中)，在ABI 7500 即時PCR系統(Applied Biosystems)進行定量PCR。表1條列出RT引子、通用引子及miRNA專一性引子。同時利用TaqMan miRNA偵測系統進行定量PCR。莖環RT引子及每一miRNA的偵測探針係由TaqMan提供。按照TaqMan miRNA試驗(Applied Biosystems)提供的操作手冊，使用普遍PCR主混合試劑(Applied Biosystems)執行定量PCR步驟。

表1：莖環qPCR引子列表

(v) 即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)

利用SuperScript III (Invitrogen)進行總RNA之反轉錄，使用OmicsGreen qPCR 主混合試劑(Omics Bio)，在ABI 7500 即時PCR系統(Applied Biosystems)進行定量即時PCR。使用的引子係列於表2中。

表2：qPCR引子

(vi) 分離初生大鼠之心肌細胞

分離初生大鼠的心肌細胞係如先前所述。從初生大鼠(P1-P3)中取出心臟，置入冷的HBSS/PBS (1:1)緩衝液中洗去血液。將心室搗碎後加入濃度為1 mg/ml之胰蛋白酶(Sigma)，於4℃下進行4小時切割前處理。切割前處理後移除胰蛋白酶，添加濃度為0.8 mg/ml膠原酶第II型(Worthington)，於37℃下分解剩餘組織(15分鐘)。分解後，使用含血清的培養液中和酵素活性，然後將細胞通過篩目為40-微米的細胞過濾器。在1200 rpm轉速下離心5分鐘，用以移除酵素。將細胞團塊重新懸浮在電度培養液中(含10% FBS的低葡萄糖DMEM培養液)，在培養箱中進行1小時電鍍前處理，以移除纖維母細胞。將細胞團塊置於1%明膠塗盤中，待心肌細胞貼覆後，將細胞維持於培養液中(含1% FBS的低葡萄糖DMEM培養液)，供後續實驗使用。

(vii) 慢病毒調控let-7過量表現、抑制let-7及TGFBR3基因減量

Let-7a及let-7f基因序列係利用正向引子及反向引子擴增。正向引子：5’-CCAAAAGGCCTGGTCCTAGA (序列編號：84)及反向引子：5’-CCA AAAGGCCTGGTCCTAGA (序列編號：85)。將大鼠TGFBR3的shRNA設計成標靶CTGTAGACAAAGACTCTTTC (序列編號：86; shTGFBR3-2)及CATTGCATTTGCAGCATTTG (序列編號：87; shTGFBR3-3)。使用AgeI和EcoRI，將不規則shRNA及shTGFBR3序列插入至 pLKO_TRC014。自Sigma購得攜帶let-7 及TuD RNA的慢病毒。

實驗結果

(i) 於豬體模式下MI後24小時內let-7a及let-7f對心肌梗塞的反應

為了探討早期心肌梗塞的miRNA表現變化，豬體進行左前下行動脈(LAD) 結紮1、2、及4小時。為了最小化個體差異，除了梗塞區域以外，採集遠端區域作為內部控制組。請參照圖1之A小圖，使用MI之後經1、2、及4小時的樣品進行次世代定序(NGS)。圖6之A小圖指出LAD結紮位置及梗塞區域。為了確認手術確實成功，進行心電圖(ECG)(圖6之B小圖)以及Tunel試驗(圖1之B小圖)。將心臟內含量豐富的miRNA篩選出並列於下表3中。根據它們的豐富性及不同表現量，挑選miRNA let-7a、let-7f、miR-22、miR-101、miR-103及miR-199a-3p進行莖環定量聚合酶連鎖反應 (Stem-loop qPCR)以再次分析。在MI之後4小時，這些miRNA全部呈現下調趨勢，並在MI之後24小時達到顯著下調(如圖1之C小圖至G小圖所示)。miR-22為壓力下心臟重塑(cardiac remodeling)的調節子(regulator)。過量表現miR-22會導致心臟肥厚(cardiac hypertrophy)，且在小鼠中，缺乏miR-22會現心臟衰竭及纖維化(可參考Huanget al. ,Circ Res 112, 1234-1243 (2013); and Gurhaet al. ,Circulation 125, 2751-2761 (2012)。miR-101在心肌梗塞後之抗纖維化中扮演重要的角色(可參考Panet al. ,Circulation 126, 840-850 (2012))。近年來，報導指出miR-103可調控心肌細胞的程序性壞死(programmed necrosis)(可參考Wanget al. ,Circ Res 117, 352-363 (2015)。miR-199a調節心臟代謝及自噬作用(可參考el Azzouziet al. ,Cell Metab 18, 341-354 (2013);Liet al. ,Cell Death Differ , (2015)。在這些miRNA中，含量非常豐富的let-7a及let-7f在MI後1天內顯著下降。為了進一步確認此結果，使用TaqMan專一性探針偵測let-7a及let-7f的表現量。如圖1之H小圖所示：證實let-7a及let-7f專一性探針在MI後24小時皆呈現顯著下調。

表3：miRNA序列(每百萬次的轉錄數(TPM)＞1000)

根據本項研究得到的NGS結果(圖1之I小圖)，在豬心臟中，let-7a及let-7f為含量最豐富的let-7成員。在人類中，含量最豐富的let-7成員同樣為let-7a及let-7f(圖6之D小圖)。而在小鼠中，含量最豐富的let-7成員為let-7a、let-7b、let-7c及let-7f (圖6之E小圖) (可參考Meunieret al. ,Genome Res 23, 34-45 (2013))。請參照圖6之C小圖，在小鼠模式中心臟內的let-7a/f表現與心臟發展呈現相關性，此結果證實let-7在心臟發展中佔重要一環。

為了檢驗let-7下調是否起因於遠端區域內的let-7上調，發明人進一步比較梗塞區域和遠端區域的let-7a及let-7f表現量。請參照圖1之J小圖，let-7a及let-7f的下調現象僅在豬心臟梗塞區域中發現，而並未於豬心臟遠端區域中觀察到此現象。在小鼠MI模式中也檢測到相似結果。請參照圖1之K小圖，在MI之後1天及2天，let-7a顯著下調，並在MI之後6天逐漸上升。

(ii) Hmga2、Tgfbr1、TGFBR3及Trappc1為心肌細胞中let-7之潛在標的

在心肌細胞和非心肌細胞內皆存在豐富含量的miRNA let-7(可參考Seegeret al. ,J Mol Cell Cardiol 94, 145-152 (2016))。請參照圖2之A小圖，為了證明let-7的標的基因，比較心臟RISC-seq資料庫(參考Matkovich et al.,Circ Res 108, 18-26 (2011)) 及TargetScan軟體(參考Shinet al. ,Mol Cell 38, 789-802 (2010))。請見圖7，發明人篩選出29個指標基因及Hmga2(正控制組)於心肌細胞中進行後續驗證。請見圖2之B小圖至E小圖及圖7，於初生大鼠心肌細胞轉染let-7a及let-7f抑制劑後，多種潛能標的基因(包含Hmga2 、Tgfbr1 、TGFBR3 及Trappc1 )呈現上調現象。Hmga2為let-7的已知標的(可參考Mayr et al.,Science 315, 1576-1579 (2007); Copleyet al. ,Nat Cell Biol 15, 916-925 (2013))。Tgfbr1及TGFBR3也分別被證實為let-7之標的(可參考Tzuret al. ,PLoS One 4, e7511 (2009); Tay et al.,Cell Res 24, 259-260 (2014))。另外，圖2之F小圖及G小圖則呈現心肌細胞內Hmga2及TGFBR3的蛋白表現量。

在豬的MI模式中，HMGA2 顯著上調(如圖2之H小圖所示)。雖然TGFBR1 和TGFBR3 只有少量增加(如圖2之I小圖和J小圖所示)，但在豬的梗塞組織中，HMGA2、TGFBR1及TGFBR3的蛋白表現是呈現上調(如圖2之M小圖所示)。為了探討可能的let-7上游調控子，發明人進一步評估let-7初級轉錄及LIN28表現。LIN28為疾病發展時抑制let-7成熟的RNA結合蛋白(請參考Thornton et al.,Trends Cell Biol 22, 474-482 (2012))，且參予多種生物反應(請參考Zhuet al. ,Cell 147, 81-94 (2011); Iliopoulos et al.,Cell 139, 693-706 (2009))。本結果顯示：在梗塞區域中，let-7初級轉錄並未減少(如圖2之K小圖所示)，而LIN28A 則相對增加(如圖2之L所示)。這樣的結果指出：在梗塞區域中，let-7的下調可能是受到LIN28的表現所影響，並非單純由本身轉錄的減少所致。

此外，為了確認在豬梗塞組織中的HMGA2及TGFBR3表現，進行免疫化學分析實驗。HMGA2的表現在健康組織和壞死組織邊界中，而在被免疫細胞環繞的心肌細胞中發現TGFBR3(如圖2之N小圖和O小圖所示)。這些實驗數據可推論出：在梗塞區域中，抑制let-7會誘發Hmga2及TGFBR3表現，如此Hmga2及TGFBR3在缺血性損傷的進展中可能扮演重要的角色。

(iii) TGFBR3活化非典型TGFβ訊號- p38 MAPK並促進心肌細胞凋亡

為了進一步了解let-7在心肌梗塞中的重要機轉，製備可過量表現Hmga2及TGFBR3的腺病毒。有趣的是，Hmga2過量表現會引發自噬體指標-LC3B的裂解(如圖3之A小圖所示)，且TGFBR3過量表現會引發細胞凋亡指標(凋亡蛋白酶3)被切割(如圖3之A小圖所示)。TGFBR3，亦稱為β聚醣，是一種TGF-β超家族成員的輔助受體，在不同組織中有多種功能(可參考Bilandzic et al.,Mol Cell Endocrinol 339, 180-189; 2011)。為了觀察心肌細胞中TGFBR3的下游訊號，使用不同感染單位(MOI)之TGFBR3過量表現的腺病毒感染初生大鼠心肌細胞。檢測典型和非典型TGFβ訊號。請見圖3之B小圖，結果顯示：在心肌細胞中，p38 MAPK之活化呈現明顯的劑量依賴性，可說明在心肌細胞內TGFBR3過量表現後，如何引發細胞凋亡。請參見圖3之C小圖，在心肌細胞中，以p38 MAPK抑制劑SB239063處理能夠部分回復Tgfbr3所誘發的細胞凋亡。請參見圖3之D小圖，在活體實驗中，經TGFBR3過量表現的腺病毒感染小鼠心臟後2天，亦發現p38 MAPK的活化作用。為了在初生大鼠心肌細胞中抑制let-7，利用腺病毒表現TuD RNA。TuD RNA充分抑制let-7a及let-7f兩者表現，並引起TGFBR3的表現量增加(如圖8之A小圖至C小圖所示)。在葡萄糖及血清去除後24小時，TuD RNA對let-7表現的抑制會促進心肌細胞凋亡(如圖3之E小圖所示)。p38 MAPK的活化對心臟重塑及心肌細胞凋亡相當重要(可參考Ren et al.,J Mol Cell Cardiol 38, 617-623 (2005))。MI後2天的小鼠梗塞組織中也偵測到p38 MAPK活化(如圖3之F小圖所示)，以及在無血清誘發的大鼠胚胎細胞株H9C2中也偵測到p38 MAPK活化 (如圖3之G小圖所示)。這些結果指出：let-7/TGFBR3調控軸參予由p38 MAPK活化引起的心肌細胞凋亡。除了所述TGFBR3抑制劑或let-7促進劑以外，可預期p38 MAPK抑制劑也可以用於減緩心臟損傷。

(iv)過量表現Let-7及抑制TGFBR3可回復無血清引發的細胞凋亡

為了觀察let-7在壓力下的心臟保護(cardiac protection)中是否具有功能，利用慢病毒感染及抗生素篩選製造出過量表現Let-7的H9C2細胞株。請參見圖4之A小圖和B小圖，過量表現let-7的H9C2細胞株顯著表現let-7a和let-7f兩者。在體外實驗中，血清去除24小時後降低let-7a表現(如圖4之A小圖所示)，其可能由Lin28表現所導致(如圖3之G小圖所示)，並且引發細胞凋亡(如圖4之C小圖和G小圖所示)。請參照圖4之C小圖和G小圖，就subG1比例及經切割之凋亡蛋白酶3表現量而言，過量表現let-7能回復將血清去除所引發的細胞凋亡。請參照圖4之D小圖、H小圖及J小圖，就RNA和蛋白質表現而言，血清去除的壓力會誘發TGFBR3，而let-7表現可抑制TGFBR3。雖然過量表現Let-7能顯著抑制Hmga2及Tgfbr1的mRNA表現，然而在血清去除壓力下，抑制效果並未顯著(如圖4之E小圖及F小圖)。

為了檢測TGFBR3是否主宰血清去除所引發的細胞凋亡，製造兩個shRNA調控的TGFBR3基因減量細胞株。如圖4之J小圖所示，在血清去除確認減量效果(knockdown efficiency)。兩種shRNA調控的TGFBR3基因減量細胞株皆顯著回復24小時無血清所引發的細胞凋亡(如圖4之I小圖所示)。在兩種shRNA調控的TGFBR3基因減量細胞株中，血清去除壓力下也觀察到活化的p38 MAPK及經切割凋亡蛋白酶3之減少(如圖4之J小圖所示)。這些體外實驗結果指出：let-7在透過抑制TGFBR3-p38 MAPK訊號路徑的心臟保護上扮演重要的角色。

(v)循環性let-7及TGFBR3對缺血性心臟損傷之反應

由於循環性miRNA的穩定性和可及性(accessibility)，循環性miRNA為多種疾病的重要指標(參考Cortezet al. ,Nat Rev Clin Oncol 8, 467-477 (2011))。因此，評估血漿let-7是否對缺血性損傷有反應。在LAD手術之前、24小時之後及一週之後採集豬的血漿樣品，從這些樣品中萃取出血漿miRNA，測量let-7a及let-7f兩者。有趣的是，在MI後一週，let-7a及let-7f兩者皆顯著下降(如圖5之A小圖和B小圖所示)；從豬個體來看，亦觀察到下調情形(如圖5之C小圖和D小圖所示)。

為了進一步確認這些結果在臨床上之應用，分析從急性MI病患上取得的血漿。相較於控制組，病患的血漿let-7a及let-7f表現明顯較低(如圖5之E小圖及F小圖所示)。這些結果指出：循環性let-7a及let-7f對心肌梗塞後的組織損傷可能有反應。

TGFBR3是一種膜蛋白，但也可被切割並釋放到胞外基質(參考Bilandzic et al.,Mol Cell Endocrinol 339, 180-189 (2011))。在組織中TGFBR3的上調，可能導致血漿中TGFBR3的濃度增加。因此，分析豬血漿TGFBR3的濃度。請參照圖5的G小圖和H小圖，豬血漿中的TGFBR3基礎量大約10 ng/ml。經MI之後24小時及1週之後，血漿TGFBR3的含量顯著上調(如圖5之G小圖所示)。就每一豬個體而言，同樣觀察到血漿TGFBR3增加(如圖5之H小圖所示)。這些實驗結果推論出：在血漿中所偵測到miRNA let-7a和let-7f的表現差異性，及其標的基因TGFBR3之表現，可以作為治療標靶或深入研究用之生物標記。

藉由使用大型動物模式及次世代定序技術，本案研究證實let-7a及let-7f為缺血性心臟損傷的效應子。這些miRNA的下調可去除TGFBR3表現的抑制作用。在心肌細胞中，TGFBR3調控p38 MAPK活化及細胞凋亡。let-7表現及抑制TGFBR3兩者都能回復壓力引起的細胞凋亡。令人驚艷的是，在MI後的血漿中可偵測到let-7下調和TGFBR3上調，指出此類的miRNA可做為早期MI檢測用的可靠生物標記。

本案研究的結果指出：miRNA let-7/TGFBR3可透過p38 MAPK活化來調控缺血誘導的細胞凋亡。血漿miRNA let-7a和let-7f、以及血漿TGFBR3皆對心臟損傷反應。因此，這些miRNA及其標的基因(例如TGFBR3)不僅期望成為潛在醫療標靶，同時期望作為診斷用的潛力生物標記。

其他實施方式

本案說明書中所揭露的所有特徵可利用任何方式合併，說明書中揭露的每一個特徵可置換成相同、對等或相似目的之替換特徵。因此，除非額外陳述，於此揭露的每一個特徵僅為一系列對等或相似特徵中的一個範例。

如上所述，本技術領域中具有通常知識者可以輕易了解本發明的必要特徵，在不背離其精神及範圍下，本發明可以進行多種變化和改良，適用於多種用途及狀況。因此，本案申請專利範圍同樣涵蓋其他實施方式。

無

圖1繪示早期心肌梗塞所對應之miRNA let-7a及let-7f。A小圖為實驗設計：對豬體進行左前下行(left anterior descending, LAD)冠狀動脈結紮1、2、及4小時；從梗塞組織和遠端組織兩處抽取核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，進行次世代定序(next-generation sequencing , NGS)。B小圖為豬組織的終端去氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，Tunel)染色結果，其展現在心肌梗塞(MI)後24小時(圖示中以H或h表示，以下其餘圖示均同)心臟梗塞區域的凋亡細胞；比例尺：100 毫米。C小圖至G小圖為莖環定量聚合酶連鎖反應 (Stem-loop qPCR)之 結果，其繪示在豬心臟心肌梗塞(MI)發生1、2、4及24小時(另有假手術組(以sham表示)1、24小時) 之後檢測miRNA之表現情形；I/R比率係指梗塞區域對遠端區域的miRNA表現量比值；遠端區域作為每一豬體個別的內部控制組；在心臟梗塞後24小時，miRNA let-7a.f、miR-101、miR-103及miR199a-3p顯著下調，miR-22則從心臟梗塞後4小時開始下調。H小圖為以TaqMan為探針之定量聚合酶連鎖反應(qPCR)結果，檢測豬心臟中let-7a及let-7f 表現情形。I小圖為三隻個別豬體中豬心臟遠端區域的次世代定序結果，其繪示let-7家族的表現情形；TPM：每百萬次的轉錄數(transcripts per million)。J小圖：在心臟梗塞後24小時，於梗塞區域和遠端區域相較於U6的let-7a及let-7f表現量。K小圖：在小鼠模式中心臟梗塞1天(1D)及2天(2D)後發現let-7a及let-7f的下調現象。

圖2為驗證let-7標的基因之結果。A小圖係標的基因驗證的方式；從同時有心臟RISC-seq資料庫驗證及TargetScan 6.0預測的188個基因中篩選出29個基因。B小圖至E小圖為於初生大鼠心肌細胞轉染let-7a及let-7f抑制劑後之潛力標的基因表現結果；柱狀條和誤差線係指三個獨立實驗下的平均值和標準差(SEM)。F小圖至G小圖為西方墨點法結果，其展現初生大鼠心肌細胞轉染let-7a及let-7f抑制劑後的Hmga2和Tgfbr3表現量。H小圖至J小圖則分別展現在心臟梗塞後24小時豬心臟的HMGA2 、TGFBR1 及TGFBR3 之RNA表現量。K小圖為在心臟梗塞後24小時豬心臟的初代let-7a.f轉錄表現量。L小圖顯示為在心臟梗塞後24小時豬心臟的LIN28A 表現量；I/R比率係指梗塞區域對遠端區域的RNA表現量比值。M小圖為西方墨點法結果圖，其分別展現在豬體梗塞及遠端組織中的TGFBR3、TGFBR1及HMGA2表現量。N小圖為豬體梗塞組織中對HMGA2及TGFBR3的免疫化學染色結果圖。O小圖為在心臟梗塞後24小時，豬體梗塞心臟組織中對TGFBR3及心肌心臟旋轉素T (troponin T)的免疫螢光染色結果圖；TGFBR3表現於心肌細胞中。

圖3為Tgfbr3透過p38 MAPK來誘發心肌細胞凋亡之結果。A小圖為在初生大鼠心肌細胞中腺病毒調控Hmga2及Tgfbr3的表現情形；轉染後1天收集細胞，經切割的LC3B是自噬體指標品且經切割的(活化的)凋亡蛋白酶3(caspase3)係代表細胞凋亡。B小圖為在劑量依賴性Tgfbr3表現下的Smad2及p38 MAPK訊號活化情形；MOI：感染多重性(multiplicity of infection)。C小圖為在初生大鼠心肌細胞中，以p38 MAPK抑制劑SB239063處理後，可部分回復Tgfbr3所誘發的細胞凋亡之結果；細胞以腺病毒感染1天，然後於培養液中添加SB239063再處理1天。D小圖：以心肌內注射腺病毒(該病毒攜帶GFP 和Tgfbr3)至小鼠心臟作用2天，從心臟組織中萃取出蛋白質，Tgfbr3過量表現會引發p38 MAPK活化。E小圖：在初生大鼠心肌細胞中，利用慢病毒(lentivirus)介導強誘餌(Tough Decoy，TuD)RNA抑制let-7之表現，以增進因血清及葡萄糖耗竭所引起的細胞凋亡現象；細胞以慢病毒感染並利用嘌呤黴素(puromycin)篩選1週，待回復4天後，從培養液中移除血清和葡萄糖後再培養1天，去除血清和葡萄糖1天後收集細胞。F小圖為心肌梗塞活化p38 MAPK活性之結果；從心肌梗塞後2天的小鼠心臟中萃取遠端區域和梗塞區域的蛋白質。G小圖為在H9C2細胞株中，去除血清後誘發p38 MAPK活化之結果。

圖4顯示為let-7過量表現和Tgfbr3抑制能回復血清去除所引發的細胞凋亡。A小圖至B小圖繪示去除血清24小時之下調let-7表現以及慢病毒介導let-7過量表現，呈現出let-7顯著增加；柱狀條和誤差線係指三個獨立實驗下的平均值和標準差(SEM)。C小圖：藉由subG1的分析得知，去除血清24小時後會誘發細胞凋亡，然let-7過量表現能回復此現象；柱狀條和誤差線係五個獨立實驗下的平均值和標準差(SEM)。D小圖至F小圖為血清去除及let-7過量表現下的Tgfbr3 、Hmga2 、及Tgfbr1 表現量；let-7表現顯著抑制Tgfbr3 、Hmga2 、及Tgfbr1 之表現；血清去除誘發Tgfbr3 和Tgfbr1 表現；在去除血清下let-7過量表現能夠抑制Tgfbr3 的增加量；柱狀條和誤差線係四個獨立實驗下的平均值和標準差(SEM)。G小圖為let-7表現能夠回復無血清所誘發的凋亡蛋白酶3活化之結果。H小圖展現let-7表現可抑制經去除血清所誘發的Tgfbr3。I小圖為流式細胞儀之結果圖，其展現經短髮夾核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid，shRNA)調控的Tgfbr3基因減量(knockdown)細胞中所減少的subG1數量；柱狀條和誤差線係三個獨立實驗下的平均值和標準差(SEM)。J小圖係為西方墨點法之結果，展現在血清去除的壓力下，Tgfbr3基因減量能夠降低p38 MAPK和經切割凋亡蛋白酶3的活化。

圖5為循環性let-7 及TGFBR3對應心肌梗塞之結果。A小圖至D小圖繪示：經LAD結紮1週後的豬血漿中，let-7a及let-7f為顯著下調；於心肌梗塞之前、心肌梗塞之後24小時及1週後收集血漿樣品；Cel-mir-39 RNA用作為探針式控制組(spike-in control)。E小圖及F小圖：在25名急性心肌梗塞病患中，相較於9名健康受試者，人類血漿之let-7a及let-7f為顯著下調。G小圖及H小圖則展現出，心肌梗塞24小時後及1週後，透過免疫酵素測定法(ELISA)可測量出豬血漿TGFBR3表現量顯著上調。

圖6為在人類及小鼠心臟中，心臟發展期間的miRNA let-7表現以及let-7家族含量之結果。A小圖為豬體的左前下行動脈(LAD)結紮手術；箭號所指為結紮處且箭頭所指為結紮後的梗塞區域。B小圖為手術後評估所測量的心電圖(Electrocardiogram，EKG)。C小圖為莖環定量聚合酶連鎖反應結果，顯示在小鼠心臟發展期間的Let-7a.f表現；柱狀條和誤差線係指平均值和標準差(SEM) (n≧3)。D小圖及E小圖為根據NGS資料庫所得的人類及小鼠心臟中的let-7 家族之表現(參考Meunieret al ,Genome Res 23 , 34-45 (2013))。

圖7為let-7a及let-7f標的基因之掃描結果。根據心臟RISC(RNA引發的靜默複合物(RNA-induced silencing complex))定序及TargetScan挑選出29個基因，Hmga2用作為正控制組；let-7a及let-7f抑制劑短暫轉染至初生大鼠心肌細胞，轉染後1天收集其RNA；柱狀條和誤差線係指三個以上獨立實驗的平均值和標準差(SEM)。

圖8為TuD RNA抑制let-7a及let-7f表現以及對Tgfbr3表現去除抑制作用之結果圖。以攜帶TuD RNA的慢病毒感染初生大鼠心肌細胞，待抗生素篩選以後，移除未感染的細胞，萃取出RNA和蛋白質之後，進行TaqMan qPCR和西方墨點法分析。A小圖繪示為TuD RNA表現會抑制let-7a (n=2)。B小圖繪示TuD RNA表現抑制let-7f(n=2)。C小圖繪示TuD RNA表現後能夠增加Tgfbr3表現量。

Claims (25)

1. 一種let-7促進劑或轉形生長因子β第三類受體(transformation growth factor beta receptor III，TGFBR3)抑制劑於製備一藥物之用途，其中該藥物係用以抑制TGFBR3之表現，以治療一個體之心臟損傷。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該心臟損傷包括心肌梗塞(myocardial infarction)、一急性冠狀動脈綜合症(acute coronary syndrome)、心肌炎(myocarditis)、心肌病變(cardiomyopathy)、術後損傷(post-operation injury)或其組合。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該TGFBR3抑制劑係為：一結合至TGFBR3之抗體、或一抑制TGFBR3表現之干擾核糖核酸(interfering ribonucleic acid，RNAi)。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該TGFBR3抑制劑係為一結合至TGFBR3之抗體。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該抗體與一醣基化TGFBR3作專一性結合。
6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該抗體與該醣基化TGFBR3的N端抗原表位作專一性結合。
7. 如申請專利範圍第4至5項所述之任一用途，其中該抗體結合至細胞表面的一膜連型TGFBR3。
8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該抗體結合至序列編號：2之序列。
9. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該抗體結合至與抗-RIII-1抗體相同的TGFBR3抗原表位、或該抗體與抗-RIII-1抗體競爭結合至TGFBR3；且其中抗-RIII-1包括一重鏈變異區及一輕鏈變異區，該重鏈變異區的胺基酸序列為序列編號：95，該輕鏈變異區的胺基酸序列為序列編號：96。
10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該抗體包括：與胺基酸序列為序列編號：95相同的重鏈互補決定區(complementary determining regions，CDRs)、以及與胺基酸序列為序列編號：96相同的輕鏈互補決定區。
11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該抗體包括：胺基酸序列為序列編號：95的重鏈變異區、以及胺基酸序列為序列編號：96的輕鏈變異區。
12. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該抗體為一全長抗體或一其抗原結合片段。
13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該抗體為一人類抗體、一人源化抗體、一嵌合抗體、或一單鏈抗體。
14. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該let-7促進劑係為一let-7核酸。
15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該let-7核酸包括序列編號：94之一核苷酸序列。
16. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該個體為一具有心臟損傷或可能具有心臟損傷之人類患者。
17. 如申請專利範圍第1項所述之用途方法，其中該個體為一具有心肌梗塞或可能具有心肌梗塞之人類患者。
18. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，與一沒有心臟損傷的個體相比，該個體具有增高的TGFBR3含量、降低的let-7含量、或同時具有兩者。
19. 如申請專利範圍第1項所述之用途方法，其中，該let-7促進劑或該TGFBR3抑制劑係透過一全身性路徑或一局部性路徑遞送。
20. 如申請專利範圍第19項所述之用途，其中該局部性路徑為心肌內注射或冠狀動脈內注射。
21. 一種用以檢驗一個體是否具有心臟損傷或存在心臟損傷的風險之方法，包括：(i)取得該個體之一離體生物樣品；(ii)將該離體生物樣品與一抗體接觸，該抗體與一切割型TGFBR3結合，該切割型TGFBR3包括序列編號：3之胺基酸序列；(iii)測量該離體生物樣品內切割型TGFBR3的含量；以及(iv)基於該離體生物樣品內的切割型TGFBR3的含量，評估該個體是否具有心臟損傷或存在心臟損傷的風險。
22. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該抗體與醣基化的該序列編號：3之胺基酸序列作專一性結合。
23. 如申請專利範圍第22項所述之方法，其中該抗體與序列編號：3之該序列的N端抗原表位結合，其中該抗原表位係經醣基化處理。
24. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該離體生物樣品係為一血清樣品或一血漿樣品。
25. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該方法更包括：測量該離體生物樣品內的let-7含量。