CN110592232B - 一种与猪肉pH值性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与猪肉pH值性状相关的分子标记及应用，所述分子标记为ssc‑miR‑152，所述ssc‑miR‑152的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本申请研究发现ssc‑miR‑152与猪PKM基因存在潜在结合位点，利用双荧光素酶报告系统和猪原代细胞转染试验验证了ssc‑miR‑152与猪PKM基因的靶标关系。活体水平的关联性分析发现ssc‑miR‑152与猪PKM基因呈极显著负相关，与屠宰后猪肉45min、24h和48h的猪肉pH值均显著正相关。ssc‑miR‑152可作为猪肉pH值性状的分子标记，对猪肉质遗传改良有较好的应用前景。

Description

一种与猪肉pH值性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及家畜分子标记制备技术领域，特别是指一种与猪肉pH值性状相关的分子标记及应用。

背景技术

全球大多数国家和地区的人民都有食用猪肉的传统，全球猪肉产量和消费均长期超过肉类总产量和总消费的30％以上。猪肉也是我国最主要的消费肉类品种，我国消费者的猪肉消费量占肉类消费量的比重长期维持在60％以上。传统育种方法通过表型进行选择，耗时长、选种准确性差，育种进展缓慢。随着以BLUP(Best Linear UnbiasedPrediction)法和分子辅助标记选择为代表的现代育种科学和技术的应用，猪的育种工作取得到了快速发展。

猪肉质性状是育种者、食品开发人员和消费者都关心的重要经济性状。猪肉pH值是一个重要的肉质性状指标，与猪肉的新鲜度、肉色、剪切力等密切相关。因此，与猪肉pH值相关的基因可作为提高肉质性状的候选基因。 microRNA(miRNA)是一类长度大约22nt的非编码RNA，miRNA通过与靶基因mRNA碱基互补配对的方式，并根据互补程度的不同抑制靶基因的翻译或导致其降解，实现对基因的转录后表达调控从而发挥生物学作用。大量研究表明miRNA在骨骼肌的生长发育和代谢过程中发挥着重要的调控作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种与猪肉pH值性状相关的分子标记及应用，为猪肉pH值性状的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记。

基于上述目的，本发明提供的一种与猪肉pH值性状相关的分子标记，所述分子标记为ssc-miR-152，所述ssc-miR-152的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。

在本发明的一些实施例中，所述ssc-miR-152用于调控PKM基因表达，所述PKM基因的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一些实施例中，所述PKM基因与所述ssc-miR-152的结合位点为(1)～(4)中的至少一种：

(1)位于PKM 3'UTR区460bp-474bp处，序列为：5'-TCCCCCTTTGTTG TGCACTGT-3'；

(2)位于PKM CDS区1318bp-1326bp处,序列为：5'-CAGCTGAAGTTC ATGCACACC-3'；

(3)位于PKM 5'UTR区399bp-413bp处，序列为：5'-AGGGGTGCTGCC TAGCACTGA-3'；

(4)位于PKM CDS区1091bp-1097bp处,序列为：5'-TTCTGTGGTGGAC CCCACTGA-3'。

在本发明的一些实施例中，扩增PKM基因的引物对为：

PKM的上游引物：5'-CCTGATAGCTCGTGAGGCTG-3'；

PKM的下游引物：5'-AGGTCTGTGGAGTGACTGGA-3'。

在本发明的一些实施例中，用于扩增ssc-miR-152的引物对为：

ssc-miR-152的上游引物：5'-UCAGUGCAUGACAGAACUUGG-3'；

ssc-miR-152的下游引物为通用下游引物。

基于相同的发明构思，本发明还提供了上述分子标记在作为猪肉pH值性状的分子标记中的应用。

本发明还提供了上述分子标记在猪肉质性状遗传改良中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本申请分析PKM与ssc-miR-152的结合位点，并使用双荧光素酶报告系统进行验证结合关系。利用ssc-miR-152模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor) 转染细胞进行细胞水平验证，进而在动物体水平进行ssc-miR-152及其靶基因 PKM表达量与猪肉pH值性状之间的关联分析的应用，为猪肉pH值性状的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记。ssc-miR-152可作为猪肉pH值性状的分子标记，利用ssc-miR-152表达量预测猪肉pH值，对猪肉质遗传改良有较好的应用前景。

附图说明

图1为PKM和ssc-miR-152的潜在结合位点①(PKM 3'UTR区460-474) 及结合自由能情况；

图2为PKM和ssc-miR-152的潜在结合位点②(PKM CDS区1318-1326) 及结合自由能情况；

图3为PKM和ssc-miR-152的潜在结合位点③(PKM 5'UTR区399-413) 及结合自由能情况；

图4为PKM和ssc-miR-152的潜在结合位点④(PKM CDS区1091-1097) 及结合自由能情况；

图5为ssc-miR-152模拟物(mimic)抑制PKM载体的荧光活性图；n＝3，“*”表示P＜0.05，差异显著；“**”表示P＜0.01，差异极显著；

图6为ssc-miR-152对猪骨骼肌原代细胞的影响图；A：ssc-miR-152在猪原代细胞中的转染效率；B：转染ssc-miR-152后靶基因PKM及糖酵解相关基因的表达图；miR-152M指的是ssc-miR-152mimic，miR-152I指的是inhibitor， n＝3，mimic组和inhibitor组均与对照(MN)相比，“*”表示P＜0.05，差异显著；“**”表示P＜0.01，差异极显著；

图7为ssc-miR-152与PKM表达量关联性分析图；n＝15，“*”表示P＜ 0.05，差异显著；“**”表示P＜0.01，差异极显著；

图8为ssc-miR-152及PKM表达量与猪肉pH值的关联性分析图；A-C： PKM表达量与猪肉pH的相关性；D-E：ssc-miR-152表达量与猪肉pH的相关性；n＝25，“*”表示P＜0.05，差异显著；“**”表示P＜0.01，差异极显著。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

猪肉pH值是一个重要的肉质性状指标，与猪肉的新鲜度、肉色、剪切力等密切相关。因此，与猪肉pH值相关的基因可作为提高肉质性状的候选基因。本申请的发明人研究发现，猪肉pH值的变化主要受肌肉糖酵解代谢产物的影响，因此与肌肉糖酵解相关的基因可作为提高猪肉品质的候选分子标记。同时研究发现，ssc-miR-152与猪PKM基因存在潜在结合位点，有可能成为一种与猪肉pH值性状相关的新的分子标记。ssc-miR-152位于猪的12号染色体，目前尚未有ssc-miR-152与猪肉pH值相关的研究报道。

本申请的具体实施技术方案：研究发现ssc-miR-152与猪PKM基因存在潜在结合位点，利用双荧光素酶报告系统和猪原代细胞转染试验验证了ssc-miR-152与猪PKM基因的靶标关系。活体水平的关联性分析发现 ssc-miR-152与猪PKM基因呈极显著负相关，与屠宰后猪肉45min、24h和48h 的猪肉pH值均显著正相关。

下面结合具体的实施例和对比例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。下述实施例仅用于对本发明进行说明，并不会对本发明的保护范围进行限制。

实施例1体外实验验证

第一部分双荧光素酶报告系统鉴定ssc-miR-152对PKM基因的调控作用

1.1实验方法

1.1.1 PKM与ssc-miR-152的结合位点预测

本申请的发明人从NCBI和miRBase分别下载得到肌肉糖酵解关键基因——肌肉型丙酮酸激酶(pyruvate kinase,muscle(PKM)，)和ssc-miR-152转录本序列(PKM基因的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示，ssc-miR-152的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)进行比对分析，发现ssc-miR-152与PKM存在4 个自由能较高的潜在结合位点，分别见图1-4。

PKM与ssc-miR-152的潜在结合位点①，位于ssc-PKM 3'UTR区 460bp-474bp处(见图1)：

ssc-PKM 3'UTR，5'-TCCCCCTTTGTTGTGCACTGT-3'；

ssc-miR-152，3'-GGUUCAAGACAGUACGUGACU-5'；

PKM与ssc-miR-152的潜在结合位点②，位于ssc-PKM CDS区 1318bp-1326bp处(见图2)：

ssc-PKM CDS1，5'-CAGCTGAAGTTCATGCACACC-3'；

ssc-miR-152，3'-GGUUCAAGACAGUACGUGACU-5'；

PKM与ssc-miR-152的潜在结合位点③，位于ssc-PKM 5'UTR区 399bp-413bp处(见图3)：

ssc-PKM 5'UTR，5'-AGGGGTGCTGCCTAGCACTGA-3'；

ssc-miR-152，3'-GGUUCAAGACAGUACGUGACU-5'；

PKM与ssc-miR-152的潜在结合位点④，位于PKM CDS区1091bp-1097bp 处(见图4):

ssc-PKM CDS2,5'-TTCTGTGGTGGACCCCACTGA-3'；

ssc-miR-152，3'-GGUUCAAGACAGUACGUGACU-5'。

猪PKM转录本信息：

>XM_021099106.1PREDICTED:Sus scrofa pyruvate kinase,muscle(PKM),transcript variant X1,mRNA，如SEQ ID NO:2所示。

ssc-miR-152序列：5'-UCAGUGCAUGACAGAACUUGG-5'，如SEQ ID NO:1所示。

1.1.2双荧光素酶报告载体的构建

分别化学合成包含潜在结合位点①～④的PKM基因片段，并将PKM基因片段和psiCHECK2载体分别进行酶切，PKM基因片段和psiCHECK-2质粒酶切产物纯化，PKM基因片段和psiCHECK-2载体的连接，最后得到4种插入PKM基因片段的psiCHECK-2载体，上述步骤由上海吉玛制药技术有限公司完成。同时ssc-miR-152模拟物(ssc-miR-152mimic)和抑制剂(inhibitor) 均由上海吉玛制药技术有限公司合成。抑制剂的具体序列是本领域技术人员公知，在此不再赘述。

1.1.3细胞转染

PK15细胞(干细胞库，中国科学院)，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养。使用Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM,Gibco,USA)辅以10％(体积分数)胎牛血清(Gibco,美国)配成生长培养基(GM)维持细胞生长。在细胞密度70％左右时进行消化传代，并均匀铺在96孔板中在细胞达到80％融合度时，使用lip3000转染ssc-miR-152mimic和插入PKM基因片段的psiCHECK2载体培养48h。具体的转染步骤为：

ssc-miR-152mimic和插入PKM基因片段的psiCHECK2载体分别稀释于无血清培养基中。脂质体使用前轻轻混匀，然后将脂质体稀释至无血清培养基中，室温孵育5min。完成5min孵育后，将稀释好的ssc-miR-152mimic和插入PKM基因片段的psiCHECK2载体与脂质体混在一起，轻轻混匀，室温孵育20min。把复合物加到含有PK15细胞和培养基的培养孔中，轻轻前后摇动培养皿混匀，每组3孔样品重复。转染后，在37℃、5％CO₂浓度和饱和室温的培养箱中培养6h更换培养液，继续培养48h收集细胞，用于双荧光素酶报告检测。以转染空载体psiCHECK2和ssc-miR-152mimic的PK15细胞作为阴性对照。

1.1.4荧光素酶活性测定

使用PBS清洗3次细胞，裂解细胞并按双荧光检测试剂盒说明书要求检测荧光值。具体步骤如下：

1)吸弃培养液，用PBS洗3遍；

2)加入20μL的PLB裂解液，用移液器吹打混匀，置于振荡器上轻缓晃动20min，使细充分裂解；

3)把裂解好的细胞转移到96孔检测板中；

4)加入100μL的LAR II，用移液器吹打混匀；

5)在微孔发光检测仪上检测萤火虫荧光素酶的活性；

6)加入100μL的Stop&Glo，用移液器吹打混匀(将萤火虫荧光反应淬灭并同时启动海肾荧光素酶反应)；

7)在微孔发光检测仪上检测海肾荧光素酶的活性。

根据5)和7)的结果，计算比值。如荧光素酶活性降低，则证明ssc-miR-152 与靶基因PKM有相互作用，根据荧光素酶活性的高低，判断ssc-miR-152与靶基因PKM的作用程度。

1.1.5统计分析

利用SPSS20.0软件中单因素方差分析以及Dunnett's多重比较统计两组间的差异。*：P＜0.05；**：P＜0.01。

2.1实验结果

实验结果见图5，PK15细胞实验结果显示，ssc-miR-152mimic与插入PKM 序列的4个载体共转染，极显著(P＜0.01)抑制了①、②和③号位点的荧光素酶活性，显著(P＜0.05)抑制了④号位点的荧光素酶活性。

第二部分实时荧光定量PCR鉴定ssc-miR-152对PKM基因的调控作用

1.1实验方法

1.1.1细胞转染

猪骨骼肌原代细胞取自一头2日龄雌性DLY猪背最长肌，II型胶原酶消化，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养。使用Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM,Gibco,USA)辅以15％(体积分数)胎牛血清(Gibco,美国) 配成生长培养基(GM)维持细胞生长。在细胞密度70％左右时进行消化传代，并均匀铺在12孔板中在细胞达到80％融合度时，使用lip3000转染ssc-miR-152 mimic和inhibitor培养48h。具体的转染步骤为：

ssc-miR-152mimic和插入PKM基因片段的psiCHECK2载体分别稀释于无血清培养基中。脂质体使用前轻轻混匀，然后将脂质体稀释至无血清培养基中，室温孵育5min。完成5min孵育后，将稀释好的ssc-miR-152mimic和插入PKM基因片段的psiCHECK2载体与脂质体混在一起，轻轻混匀，室温孵育20min。把复合物加到含有猪骨骼肌原代细胞和培养基的培养孔中，轻轻前后摇动培养皿混匀，每组3孔样品重复。转染后，在37℃、5％CO₂浓度和饱和室温的培养箱中培养6h更换培养液，继续培养48h收集细胞，用于实时荧光定量PCR检测。以转染与PKM基因不同源的miRNA的猪骨骼肌原代细胞作为对照。

1.1.2总RNA的提取

1.1.2.1组织总RNA提取

采用Trizol法按照说明书提取总RNA，总RNA提取方法：

1)取约0.1g左右猪背最长肌迅速转入已装有0.5mL Trizol的1.5mL离心管中，用小型研磨棒研磨至单细胞状态，然后悬浮溶液。

2)研磨好后再加0.5mL Trizol于每管，使所加Trizol的总体积达到1mL (按每1mLTrizol加0.1g的组织样来计算，Trizol最好稍微过量)，然后室温再不断摇动混匀15min。

3)4℃下12000r/min离心15min，将上清液用枪头吸入氯仿润洗过的2mL 离心管中，加200μL氯仿后，剧烈震荡15s，室温静置3min，最后4℃下 11000r/min离心20min。

4)将上清移入用异丙醇润洗过的新2mL离心管中，加入500μl异丙醇，轻轻地颠倒混匀静置10min，4℃下10000g离心10min。

5)轻轻倒掉上清，加1mL75％乙醇勿吹打或剧烈摇动，立即于4℃下 7500r/min离心5min，重复此步骤一次。

6)倒上清，常温放置10min左右，干燥RNA。

7)加150～250μl DEPC处理水溶解RNA，4℃存放使其进一步溶解，-80℃保存备用。

1.1.2.2细胞总RNA提取

使用PBS清洗3次细胞，每孔(12孔板)加入1ml Trizol试剂(TaKaRa, 大连,中国)进行充分裂解，然后从组织总RNA提取第3)步往后继续操作至第7)步。

1.1.3实时荧光PCR检测

qRT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq kit(TaKaRa)试剂在CFX96实时荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad,USA)下使用2^-ΔΔCt法进行检测，使用β-actin 作mRNA内参，使用U6作miRNA内参。所有数据采用“平均值±标准差”形式表示，使用SPSS 20.0软件对不同组间数据进行单因素方差分析，采用T检验法检验组间显著性水平，图中“*”表示P＜0.05。“**”表示P＜0.01，差异极显著。

表1 qRT-PCR引物序列

反应体系：反应总体积为10μL，其中RNA模板1μL，SYBR Premix Ex Taq^TM (2×)5μL，RNA free water 3μL，表1中的正、反向引物(10μM)分别0.5μL，不足部分以双蒸水补足。其中ssc-miR-152的下游引物为通用下游引物，包含在购买的试剂盒中。

反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，T_m(如表1所示)10s，72℃20s， 40个循环。

2.1实验结果

实验结果见图6，猪骨骼肌卫星细胞试验结果显示，猪原代细胞中的 ssc-miR-152水平成功被ssc-miR-152mimic过表达，被inhibitor抑制，均达到极显著(P＜0.01)水平。同时转染ssc-miR-152mimic显著(P＜0.05)抑制 PKM表达，抑制ssc-miR-152的表达极显著(P＜0.01)促进PKM表达。

由此证明，ssc-miR-152可通过结合PKM的特定序列抑制PKM的表达。本实施例研究发现ssc-miR-152与猪PKM基因存在潜在结合位点，利用双荧光素酶报告系统和猪原代细胞转染试验验证了ssc-miR-152与猪PKM基因的靶标关系。

实施例2体内实验

用于进行关联性分析的猪群为15头300日龄青峪猪(8♀，7♂)和10 头DLY猪(5♀，5♂)，使用720A型pH仪(Orion Research Inc，美国)检测猪肉屠宰后45min、24h和48h的pH值。同时采取最后肋骨处背最长肌深部肌肉50mg在Trizol(TaKaRa)中充分裂解，采用Trizol法按照说明书提取总RNA，具体实验步骤参见实施例1。qRT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq kit(TaKaRa)试剂在CFX96实时荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad，美国)下使用2^-ΔΔCt法进行检测，使用β-actin作mRNA内参，使用U6作miRNA内参，具体实验步骤参见实施例1。所有数据采用“平均值±标准差”形式表示，使用SPSS 20.0软件进行相关性分析。

实验结果见图7，实验结果显示：背最长肌中PKM和ssc-miR-152表达量呈极显著(P＜0.01)负相关，拟合的曲线方程为：y＝-0.7557x+2.8753。

实验结果见图8，图A-图C显示：在猪肉屠宰后45min，猪肉pH值与背最长肌中PKM表达量呈显著(P＝0.050)负相关，拟合的曲线方程为： y＝-0.2141x+6.581；在猪肉屠宰后24h，猪肉pH值与背最长肌中PKM表达量呈极显著(P＝0.005)负相关，拟合的曲线方程为：y＝-0.3479x+6.4289；在猪肉屠宰后48h，猪肉pH值与背最长肌中PKM表达量呈极显著(P＝0.009)负相关，拟合的曲线方程为：y＝-0.194x+6.1843。图D-图E显示：在猪肉屠宰后45min，猪肉pH值与背最长肌中ssc-miR-152表达量呈极显著(P＝0.005)正相关，拟合的曲线方程为：y＝0.3076x+5.722；在猪肉屠宰后24h，猪肉pH值与背最长肌中ssc-miR-152表达量呈极显著(P＜0.005)正相关，拟合的曲线方程为：y＝0.4698x+5.0831；在猪肉屠宰后48h，猪肉pH值与背最长肌中 ssc-miR-152表达量呈极显著(P＝0.003)正相关，拟合的曲线方程为： y＝0.2248x+5.4958。

由此证明，背最长肌中PKM和ssc-miR-152表达量呈极显著(P＜0.01) 负相关，ssc-miR-152表达水平与猪肉45min、24h和48h的pH值均极显著(P ＜0.01)正相关。因此，ssc-miR-152可作为猪肉pH值性状的分子标记，利用 ssc-miR-152表达量预测猪肉pH值，对猪肉质遗传改良有较好的应用前景。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种与猪肉pH值性状相关的分子标记及应用

<130> FI190525

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> 人工序列

<223> ssc-miR-152

<400> 1

ucagugcaug acagaacuug g 21

<210> 2

<211> 24

<212> 人工序列

<223> 猪PKM序列

<400> 2

ggtaacagca gaaaccaagc agcaacagcc cttggagaga gactaagctt tcttgacctc 60

tacagtggca cagtggcaaa gagcttgaga aagttggcac ttctgggcta caccattgtc 120

atccaggaca ttaatgcctc cctctttgtt cctctgagac cgtccagatc agcacctgtt 180

tattttcaaa tctcacaaac cccaccccag atcttcatag tttggttctc agctgctctt 240

gaaggacagc gagtgactta ttaccaccac cacaacagag cctgccttct ccagcagatc 300

tccagtcagc tcccgacatc atccccaccc ccttctccct tgtggcctcc taaatgccca 360

tctcgttagc ctgggttcat ccggtggtat ggaggggtgc tgcctagcac tgacctggaa 420

gtgtgtgtga ccctctgacc caatggacat caaaggccag ttctggaatg atgatgattc 480

ggagggagat aatgaatcag aggaatttct ctatggagtt caggggagct gtgcagctga 540

cctctatcga cacccacagc ttgatgcaga cattgaagcc gtgaaggaga tctacagtga 600

gaactctgta ttcatcagag aatatggaac tatcgatgac gtggacattg acctccacat 660

caacatcagc ttcctcgatg aggaagtttc tacagcctgg aaggtcctcc ggacagaacc 720

tattgtgttg aggctgcgat tttctctctc ccagtacctc gatggaccag aaccatcgat 780

tgaagttttc cagccatcga ataaggaagg atttgggttg ggtcttcagt tgaagaagat 840

cctgggtatg tttacatccc aacaatggaa acatctcagc aatgatttcc tcaagaccca 900

gcaggaaaag aggcatagct ggttcaaggc aagtggtacc atcaagaagt tccgagctgg 960

cctcagcatc ttctcaccca tccccaagtc tcccagcttc cctatcatac aggactccat 1020

gctgaaaggc aaactgggtg taccagagct tcgggttgga cgcctcatga accgttccat 1080

ctcctgcacc atgaagaacc ccaaagtgga ggtgtttggc taccctccca gcccccaggc 1140

aggtctcctc tgcccccagc acgcaggcct ccctccccca gcacggacct ctcctttggt 1200

cagtggtcac tgcaagaaca tccccactct ggaatatgga ttccttgttc agatcatgaa 1260

atatgcagag cagaggattc caacattgaa tgagtactgt gtagtgtgtg atgagcagca 1320

tgtctttcag aatgggtcaa tgctcaagcc agctgtttgt actcgcgaac tgtgtgtttt 1380

ctccttctac acattgggag tcatgtctgg agctgcagag gaggtggcca ctggagcaga 1440

ggtggtggat ctgctggtgg ccatgtgtag ggcagctctg gagtccccta gaaagagcat 1500

catctttgag ccttatcctt ctgtggtgga ccccactgat cccaagactc tggcctttaa 1560

ccctaagaag aagaattatg agcgacttca aaaagctctg gatagtgtga tgtccatccg 1620

ggagatgacc cagggctcat atctggaaat caagaagcag atggacaagc tggatcccct 1680

ggcccatcct ctcctgcagt ggatcatctc tagcaacagg tcacacattg tcaaactacc 1740

tctcagcagg cagctgaagt tcatgcacac ctcacaccag ttcctcctgc tgagcagccc 1800

tcctgctaag gaggctcggt tccggaccgc caagaagctc tatggcagca cctttgcctt 1860

ccatgggtcc cacattgaga actggcattc gatcctgcgc aatgggctgg tcaatgcatc 1920

ctacaccaaa ctgcagctgc atggagcagc ctatggcaaa ggcatctacc tgagccccat 1980

ctccagtatt tcctttggat actcaggaat gggaaaagga cagcacagga tgccctccaa 2040

ggatgagctg gtccagagat ataacagaat gaataccatc ccccagaccc gatccattca 2100

gtcaaggttc ctgcagagtc ggaatctaaa ctgtatagca ctttgtgaag tgattacatc 2160

caaggacctc cagaagcatg ggaacatctg ggtgtgccct gtctctgacc atgtctgcac 2220

acggttcttc tttgtttcct ctggacccaa gacctcagaa gccatgccga agccccacag 2280

tgatgccggg accgccttca ttcagaccca gcagctgcac gcggccatgg ctgacacgtt 2340

cctggagcac atgtgccgcc tggacattga ctcgccaccc atcacggccc ggaacaccgg 2400

catcatctgt accatcggcc cagcttcccg atcagtggag acactgaagg agatgattaa 2460

gtctggaatg aacgtggctc gtttgaactt ctctcacgga actcatgagt accatgcaga 2520

gaccatcaag aacgtgcgtg cggctacaga aagctttgct tcagatccca ttctctaccg 2580

gccagtggct gtggccctgg acactaaagg acctgagatc cgaaccgggc tcatcaaggg 2640

cagcggcact gctgaggtgg agctcaagaa aggagccacg ctcaagatca ccctggataa 2700

tgcctacatg gaaaagtgtg acgagaatgt cctgtggctg gactataaga acatctgcaa 2760

ggtggtggat gtgggcagca aggtctacgt ggatgatgga cttatttctt tgctggtgaa 2820

gcagaaaggt cctgacttcc tggtgacgga ggtggagaac ggcggcttcc tgggcagcaa 2880

gaaaggtgtg aaccttcctg gagctgctgt ggacctgcct gccgtgtccg agaaggacat 2940

ccaggatctg aagtttgggg tggagcagga cgtggatatg gtgttcgcat ctttcatccg 3000

taaggcggcc gacgtccatg aagtcaggaa ggtcctggga gagaaaggaa agaacatcaa 3060

gataatcagc aaaatcgaga atcacgaggg agttcggaga tttgatgaga tcctagaagc 3120

cagcgatggt atcatggtgg ctcgtggtga tctaggcatt gagattcctg cagagaaggt 3180

cttccttgcc cagaagatga tgattgggcg gtgcaaccga gctgggaagc ctgtcatctg 3240

tgccacgcag atgctggaga gcatgatcaa gaagccccgt cccacccggg ctgagggcag 3300

tgatgtggcc aatgcagtct tggatggagc tgactgcatc atgctgtctg gagagacggc 3360

caaaggggac taccccctgg aggctgttcg catgcagcac ctgatagctc gtgaggctga 3420

ggcagccatg ttccaccgca agctgtttga agaacttgtg cgagcctcca gtcactccac 3480

agacctcatg gaagccatgg ccatgggcag cgtggaggct tcttataagt gtttagcggc 3540

agctttgata gttctgacgg agtctggcag gtctgcacat caggtggcta ggtaccgccc 3600

ccgagccccc atcattgctg tgacccggaa tcaccagaca gctcgccagg cccacctgta 3660

ccgcggcatc ttccccgtgg tgtgtaagga cccagtgcag gaggcctggg ccgaggacgt 3720

ggacctccgg gtgaacttgg ccatgaatgt tggcaaagcc cgaggcttct tcaagaaggg 3780

agatgtggtc attgtgctga ccgggtggcg ccctggttcc ggcttcacca acaccatgcg 3840

cgtagtgcct gtgccgtgat gcaccctgca gcccctactc cagccccatc ccatccccct 3900

ccctcaatcc atccattagg ccagaaatgc ttgtagtgct cacttggggc cgtgtgtggc 3960

actggtgggc tgggacccag ggacacctct gtgaaacatg gctgttttta agaccctgct 4020

tgggtggggt agttcagagc tggacctccc atcaagtatc cccatccaag caagggatga 4080

aggaagggtg caggcaggac tggagtcccc agagggcaac agctcctgct tctcttcctt 4140

tgtgtactcc tgtagttctg tagaaaatgg atacccagag aactcccagc cctggcctgg 4200

aatcagcaaa gagcaggggc cttagggcat ggggcatgaa gcagtggttc cagtttaagc 4260

agactctggc cctggccctt acttacttct ccaaccccct tagcctccct cactccccct 4320

ttgttgtgca ctgtgcactt ctgttccttc actccattta gctgccgctg cagacaaaca 4380

ctccaccctc cacctcccat ttccccgact actgcagccg cctccaggcc tgttgctata 4440

gagtctacct gtatgtcaat aaacaacagc tgaagca 4477

Claims (6)

1.检测分子标记表达量的试剂在预测猪肉pH值性状中的应用，其特征在

于，所述分子标记为ssc-miR-152，所述ssc-miR-152的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述ssc-miR-152的表达量与猪肉pH值正相关；

所述ssc-miR-152可通过结合PKM基因的特定序列抑制PKM基因的表达，所述PKM基因与所述ssc-miR-152的结合位点为（1）～（4）中的至少一种：

（1）位于PKM 3'UTR区460bp-474bp处，序列为：5'-TCCCCCTTTGTTGTGCACTGT-3'；

（2）位于PKM CDS区1318bp-1326bp处,序列为：5'-CAGCTGAAGTTC ATGCACACC-3'；

（3）位于PKM 5'UTR区399bp-413bp处，序列为：5'-AGGGGTGCTGCCTAGCACTGA-3'；

（4）位于PKM CDS区1091bp-1097bp处,序列为：5'-TTCTGTGGTGGAC CCCACTGA-3'；

其中，所述PKM为肌肉型丙酮酸激酶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PKM基因的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，扩增PKM基因的引物对为：

PKM的上游引物：5'-CCTGATAGCTCGTGAGGCTG-3'；

PKM的下游引物：5'-AGGTCTGTGGAGTGACTGGA-3'。

4.检测分子标记表达量的试剂在猪肉pH值性状遗传改良中的应用，其特征在于，所述分子标记为ssc-miR-152，所述ssc-miR-152的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述ssc-miR-152的表达量与猪肉pH值正相关；

所述ssc-miR-152可通过结合PKM基因的特定序列抑制PKM基因的表达，所述PKM基因与所述ssc-miR-152的结合位点为（1）～（4）中的至少一种：

（1）位于PKM 3'UTR区460bp-474bp处，序列为：5'-TCCCCCTTTGTTGTGCACTGT-3'；

（2）位于PKM CDS区1318bp-1326bp处,序列为：5'-CAGCTGAAGTTC ATGCACACC-3'；

（3）位于PKM 5'UTR区399bp-413bp处，序列为：5'-AGGGGTGCTGCCTAGCACTGA-3'；

（4）位于PKM CDS区1091bp-1097bp处,序列为：5'-TTCTGTGGTGGAC CCCACTGA-3'；

其中，所述PKM为肌肉型丙酮酸激酶。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PKM基因的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，扩增PKM基因的引物对为：

PKM的上游引物：5'-CCTGATAGCTCGTGAGGCTG-3'；

PKM的下游引物：5'-AGGTCTGTGGAGTGACTGGA-3'。

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