KR20170055474A - 길항 pd-1 압타머 및 암 요법 관련 적용에서의 그의 적용 - Google Patents

길항 pd-1 압타머 및 암 요법 관련 적용에서의 그의 적용 Download PDF

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판-치르 양
이-청 창
웨이-윤 라이
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아카데미아 시니카
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Abstract

PD-1에 결합하여 이를 길항시키는 압타머 및 T 세포 증식의 촉진, 암 또는 감염성 질환, 예컨대 HIV 감염의 치료에서의 그의 용도가 제공된다.

Description

길항 PD-1 압타머 및 암 요법 관련 적용에서의 그의 적용 {AN ANTAGONISTIC PD-1 APTAMER AND ITS APPLICATIONS IN CANCER THERAPY RELATED APPLICATIONS}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2014년 7월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 62/031,427을 우선권 주장하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
암 세포는 면역 감시를 회피하기 위해 숙주 면역계를 조절할 수 있다. 종양 미세환경에서 면역계를 재활성화시키고 암 세포를 근절시키는 T 세포 능력을 복구시키기 위한 여러 접근법이 개발되었다. 이들 접근법 중 하나가 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4) 및 프로그램화된 사멸 1 (PD1)과 같은, 면역 반응을 정상적으로 억제하는 수용체의 차단에 기초한 면역-체크포인트 표적화이다. CTLA-4에 대한 길항 항체 (mAb)인 이필리무맙은 진행성 흑색종의 치료를 위해 2011년에 FDA에 의해 승인받았다. 최근, PD-1에 대한 억제 항체가 임상 시험에서 흑색종 및 비소세포 폐암 (NSCLC)의 치료에 효과적인 것으로 증명되었다.
PD-1은 이것이 죽어가는 세포 상에서 높게 발현되어 이와 같이 명명되고, 프로그램화된 세포 사멸의 과정에 관여한다. PD-1은 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 세포외 도메인 및 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유하는 세포내 도메인을 함유하는 유형 I 막횡단 단백질이다. CTLA-4 수용체와 유사하게, PD-1은 또한 T 세포 활성화를 억제하는 강력한 억제 수용체이다. 그러나 신호전달 경로 분석에서 PD-1 및 CTLA-4가 별개의 메카니즘에 의해 T 세포 활성화를 억제하고 CTLA-4 및 PD-1 길항 항체의 이중 치료가 상승작용적 효과를 유도할 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 오직 T 세포 상에서 발현하는 CTLA-4에 비하여, PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 대식세포 상에서 주로 발현된다. PD-1 수용체의 보다 넓은 분포는 이것이 면역 조절에서 보다 광범위한 역할에 관여할 수 있음을 시사한다. 이들 모든 발견은 PD-1 경로를 차단할 수 있는 분자가 항암 면역요법에서 큰 잠재력을 보유할 수 있음을 보여주었다.
압타머는 2차 구조 또는 심지어는 복잡한 3차원 구조를 형성할 수 있는 짧은 DNA 또는 RNA 분자이다. 압타머 기술은 1990년대 초반에서의 그의 발견 이후로 크게 진전되었다. 압타머는 항체보다 조직을 통한 침투를 더 용이하게 하는 보다 낮은 분자량, 화학적 합성시의 낮은 비용, 확립된 변형 방법 및 높은 안정성을 포함한, 이를 치료적 적용에 적합하게 하는 여러 이점을 갖는다. 따라서 표적 단백질에 대해 높은 친화도를 갖는 적합한 압타머의 개발이 큰 관심을 받고 있다.
본 개시내용은 성공적으로 시험관내 T 세포 증식을 증가시키고 생체내 종양 성장을 억제하는 다수의 항-PD-1 핵산 압타머의 개발에 기초한다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면은 PD-1에 결합하여 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 핵산 압타머 (항-PD-1 압타머)를 특색으로 한다. 항-PD-1 압타머는 핵산 서열 CCATCTCCC (서열식별번호: 1), TATATTGTWC (서열식별번호: 2), GTACAGTTX (서열식별번호: 3), GCACTACA (서열식별번호: 4), GTACATCAY (서열식별번호: 5), YGCTACTGTZ (서열식별번호: 6), 또는 CCATCTCCCGTCC (서열식별번호: 7)를 포함할 수 있다. 각각의 서열에서 적용가능한 경우, W는 C 또는 G이고/거나, X는 C, A이거나 또는 부재하고/거나, Y는 A, T이거나 또는 부재하고/거나 Z는 T, C이거나 또는 부재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항-PD-1 압타머는 20nM 미만의 해리 상수 (Kd)로 PD-1에 결합한다.
일부 실시양태에서, 핵산 압타머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 접합된다. 일부 예에서, PEG는 핵산 압타머의 3' 말단에 접합된다. 대안적으로 또는 추가로, PEG 모이어티는 10kDa 내지 30kDa 범위의 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, PEG 모이어티는 20kDa의 분자량을 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 제1 항-PD-1 압타머, 제2 항-PD-1 압타머, 및 제1 항-PD-1 압타머 및 제2 항-PD-1 압타머를 연결하는 중합체 모이어티를 포함하는 항-PD-1 압타머 이량체를 제공한다. 제1 및 제2 항-PD-1 압타머는 본원에 제공된 임의의 압타머일 수 있다. 일부 예에서, 제1 및 제2 항-PD-1 압타머는 동일할 수 있다. 다른 예에서, 이들은 상이할 수 있다. 한 예로서, 제1 및 제2 항-PD-1 압타머는 둘 다 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 항-PD-1 압타머 이량체에서, 제1 및 제2 항-PD-1 압타머를 연결하는 중합체 모이어티는 10kDa 내지 30kDa 범위, 예를 들어 20kDa의 분자량을 가질 수 있는 PEG일 수 있다. 제1 압타머, 제2 압타머, 또는 둘 다는 일부 경우에 링커를 통해 중합체 모이어티 (예를 들어, PEG)에 연결될 수 있다. 일부 예에서, 링커는 5 내지 20개 티민 (T) 잔기를 함유할 수 있는 폴리T 단편이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 압타머는 (i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC (서열식별번호: 8); 또는 (ii) TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT (서열식별번호: 9)에 대해 적어도 85% (예를 들어, 90% 또는 95%) 동일한 핵산 서열을 포함한다. 한 예에서, 압타머는 (i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC (서열식별번호: 8); 또는 (ii) TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT (서열식별번호: 9)의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 압타머는 (i) TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 10); (ii) TCCCTACGGCGCTAACTGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCTGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 11); 또는 TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 12)이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 압타머 또는 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 압타머 이량체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 특색으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 암 (예를 들어, 흑색종, 비소세포 폐암, 결장직장암, 또는 신세포암)을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 또한 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 항-PD-1 핵산 압타머를 포함하는 본원에 기재된 임의의 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 앓고 있거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 인간 환자이다.
또한, 본 개시내용은 면역 활성의 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량 (예를 들어, T 세포 활성화를 증가시키는데 효과적인 양)의 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-PD-1 압타머-함유 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 활성을 증진시키는 방법을 제공한다. 대상체는 암 (예를 들어, 흑색종, 비소세포 폐암, 결장직장암, 또는 신세포암)을 앓고 있거나, 이를 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 이에 걸릴 위험이 있는 인간 환자일 수 있다. 대안적으로, 대상체는 HIV 감염을 앓고 있거나 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다.
또한 본 개시내용의 범위 내에 (a) 본원에 기재된 바와 같은 항-PD-1 핵산 압타머, 항-PD-1 압타머 이량체, 또는 그의 PEG 접합체, 예를 들어 CCATCTCCC (서열식별번호: 1) 또는 본원에 기재된 다른 것의 핵산 서열을 포함하는 핵산, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암 (예를 들어, 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암) 또는 감염성 질환, 예컨대 HIV 감염을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물; 및 (b) 암 (예를 들어, 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암) 또는 감염성 질환, 예컨대 HIV 감염을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 항-PD-1 압타머, 항-PD-1 압타머 이량체, 및/또는 그의 PEG 접합체의 용도가 포함된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세내용이 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특색 또는 이점은 하기 도면 및 여러 실시양태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 SELEX를 통해 PD-1에 대한 핵산 압타머 결합을 선택하는 과정을 보여주는 개략도이다. 개략도에서 "S"는 PD1 특이적 압타머를 나타내고, "NS"는 비-특이적 압타머를 나타낸다.
도 2는 지시된 바와 같은 SELEX 스크리닝의 상이한 라운드로부터 수득된 압타머 풀의 친화도 분석을 보여주는 차트이다.
도 3은 SELEX 스크리닝으로부터 단리된 PD-1-결합 핵산 압타머의 서열 분석을 보여준다. 패널 A는 단리된 PD-1-결합 압타머의 상관관계를 보여주는 트리뷰이다. 패널 B는 클러스터링 PD-1 압타머의 상세 서열을 보여준다. PD-1 압타머 내에 보존된 뉴클레오티드, CCATCTCCC (서열식별번호: 1)는 박스로 강조표시된다. 도 3, 패널 B에 제공된 압타머의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다: PD1-1 (서열식별번호: 16); PD1-2 (서열식별번호: 24); PD1-3 (서열식별번호: 25); PD1-4 (서열식별번호: 24); PD1-5 (서열식별번호: 26); PD1-6 (서열식별번호: 16); PD1-7 (서열식별번호: 10); PD1-8 (서열식별번호: 24); PD1-9 (서열식별번호: 18); PD1-11 (서열식별번호: 27); PD1-12 (서열식별번호: 28); PD1-13 (서열식별번호: 15); PD1-14 (서열식별번호: 10); PD1-15 (서열식별번호: 29); PD1-16 (서열식별번호: 11); PD1-17 (서열식별번호: 31); PD1-18 (서열식별번호: 15); PD1-19 (서열식별번호: 11); PD1-20 (서열식별번호: 11); PD1-21 (서열식별번호: 18); PD1-22 (서열식별번호: 11); PD1-23 (서열식별번호: 11); PD1-24 (서열식별번호: 19); PD1-25 (서열식별번호: 11); PD1-26 (서열식별번호: 32); PD1-28 (서열식별번호: 11); PD1-29 (서열식별번호: 10); PD1-31 (서열식별번호: 11); PD1-32 (서열식별번호: 33); PD1-33 (서열식별번호: 34); PD1-34 (서열식별번호: 35); PD1-36 (서열식별번호: 36); PD1-37 (서열식별번호: 11); PD1-39 (서열식별번호: 11); PD1-40 (서열식별번호: 11); PD1-41 (서열식별번호: 37); PD1-42 (서열식별번호: 38); PD1-44 (서열식별번호: 39); PD1-45 (서열식별번호: 11); PD1-46 (서열식별번호: 40); PD1-47 (서열식별번호: 41); PD1-48 (서열식별번호: 42).
도 4는 2가지 예시적인 항-PD-1 압타머 PD16 및 PD7의 결합 활성 및 예측된 구조를 보여준다. 패널 A는 PD16의 PD-1 결합 친화도를 보여주는 차트이고, 패널 B는 PD7의 PD-1 결합 친화도를 보여주는 차트이다. PD7 및 PD16의 해리 상수 (Kd)는 각각 9.7nM 및 2.1nM이다. 패널 C는 엠폴드(Mfold)에 의해 결정된 바와 같은 PD-1 압타머 PD16 (서열식별번호: 11) 및 PD7 (서열식별번호: 10)의 예측된 2차 구조를 보여준다. 보존된 CCATCTCCC (서열식별번호: 1)는 점선 경계 내에 강조표시된다. PD7 및 PD16의 예측된 구조에 대한 ΔG는 각각 -1.7 및 -0.8이다.
도 5는 예시적인 항-PD-1 압타머 PD7이 T 세포 증식을 촉진시킨다는 것을 보여주는 차트를 포함한다. PD7 압타머 치료는 T 세포 증식을 촉진시켰으며, 효과는 PD-1 길항 항체의 치료보다 더 유의하다. 패널 A는 CD3/CD28 자극 없이 수행된 실험으로부터의 실험 결과를 보여주는 차트이다. 패널 B는 CD3/CD28 자극 하에 수행된 실험으로부터의 실험 결과를 보여주는 차트이다.
도 6은 코어 1, 코어 1 (최적화됨), 코어 2, 코어 3, 코어 4, 코어 5 및 코어 6의 압타머 코어 뉴클레오티드 서열을 사용한 PDL1 경쟁 검정의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 코어 1을 사용한 PDL1 경쟁 검정에서 PDL1과 PD1 사이의 상호작용의 용량-의존성 억제를 보여주는 그래프이다. PDL1/PD1 상호작용의 50%를 억제하는데 필요한 코어 1 핵산의 양을 나타내는 코어 1의 IC50은 31.18nM이다.
도 8은 PDL1 경쟁 검정의 개략적 표현을 보여준다. 패널 A는 니켈 니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 코팅된 플레이트 상에 고정된 히스티딘 태그부착된 PD1 단백질 (His 태그-PD1 단백질)을 보여준다. 히스티딘 태그부착된 PD1 단백질은 PD1 길항 압타머의 부재 하에 비오틴-태그부착된 PDL1 (비오틴-PDL1)에 결합하고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 스트렙타비딘에 의해 검출될 수 있다. 패널 B는 길항 PD1 압타머의 존재 하에, PD1과 PDL1 사이의 상호작용이 경쟁을 벗어나고, HRP가 신호 (예를 들어, ECL 첨가시의 화학발광 신호)를 생성하기 위해 결합하지 않는다는 것을 보여준다.
도 9는 PD1 압타머 결합 검정의 개략적 표현이다. 히스티딘 태그부착된 PD1 단백질 (His 태그-PD1 단백질)은 니켈 니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 코팅된 플레이트에 고정된다. 비오틴에 접합된 길항 PD1 압타머 (비오틴-BD1 압타머)의 고정된 PD1에 대한 결합은 스트렙타비딘-접합된 양고추냉이 퍼옥시다제 (스트렙타비딘/HRP)를 사용하여 검출될 수 있다. 결합된 HRP는 HRP (예를 들어, ECL)와 접촉하는 경우에 발광하는 기질의 첨가시에 검출될 수 있다.
도 10은 (i) PD-1 길항 항체, (ii) 무작위 대조군 서열, (iii) PD7 압타머 (서열식별번호: 10), (iv) 서열식별번호: 1에 제시된 코어 핵산 서열을 포함하는 코어 서열 (서열식별번호: 13), 및 (v) 도 11에 제시된 PEG화 PD7 이량체 (코어 서열)의 존재 하의 림프구 증식 활성을 보여주는 그래프이다.
도 11은 이량체 압타머 분자의 비제한적 예의 개략도이다. 개략도는 PEG 분자의 각각의 말단에서 2개의 별개의 압타머 서열- 서열식별번호: 1의 코어 핵산 서열 및 폴리T 링커를 포함하는 CCATCTCCCATTTTTTTTTTT (서열식별번호: 14) -과 접합된 선형 20kDa PEG 분자를 보여준다.
도 12는 예시적인 CD4+ 및 CD8+ T-세포 증식 검정의 개략적 표현이다.
도 13은 CD4+ (패널 D) 및 CD8+ (패널 C) T-세포 증식에 대한 예시적인 압타머 PD7 및 코어 1 서열의 활성 및 CD4+ (패널 B) 및 CD8+ (패널 A) T-세포 증식에 대한 길항 PD-1 항체 및 무작위 서열 음성 대조군의 활성을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 14는 동계 폐암 마우스 모델에서 예시적인 압타머 (PD7)의 종양 성장 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 15는 예시적인 압타머 (PD7)로 치료된 인간화 폐암 마우스 모델의 치료 스케줄의 개략적 표현이다.
도 16은 생체내 폐암 성장에 대한 PD-1 길항 압타머 PD7의 억제 활성을 입증하는데 사용된 인간화 폐암 마우스 모델의 결과를 보여준다. 패널 A는 대조군 마우스 239, 226 및 233에서 시간 경과에 따른 종양 성장을 보여주는 그래프이며, 각각 제25일, 제32일 및 제38일에 대해서는 패널 B-D에 도시한다. 패널 E는 PD7 치료된 마우스 240, 234 및 235에서 시간 경과에 따른 종양 성장을 보여주는 그래프이며, 각각 제25일, 제32일 및 제38일에 대해서는 패널 F-H에 도시한다.
도 17은 폐암 성장에 대한 PD-1 길항 압타머 PD7의 평균 억제 활성을 대조군 마우스와 비교하여 보여주는 그래프이다.
본 개시내용은 다수의 항-PD-1 핵산 압타머의 개발 및 예시적인 항-PD-1 압타머에 의한 T 세포 증식의 성공적 증진에 기초한다. 결과는 놀랍게도, 압타머 (예를 들어, PD7) 치료가 (i) PD-1 길항 항체보다 더 강한 T 세포 증식 (예를 들어, CD+ T 세포 증식)에 대한 효과, 및 (ii) 동계 및 인간화 마우스 종양 모델 둘 다에서의 종양 성장의 현저한 감소를 발생시켰다는 것을 보여주었다. 또한, 결과는 압타머 치료가 PD-1과 PDL-1 사이의 결합을 방지한다는 것을 보여주었다. 따라서, 항-PD-1 압타머, 예컨대 본원에 기재된 것은 면역 활성의 증진 및 종양 성장의 방지에 효과적이고, 이에 의해 질환, 예컨대 암 및 감염성 질환 (예를 들어, HIV 감염)의 치료에 효과적일 것이다.
따라서, 항-PD-1 압타머, 이를 포함하는 제약 조성물, 및 본원에 개시된 항-PD-1 압타머를 사용하여 면역 활성을 증진시키고/거나 질환, 예컨대 암 및 HIV 감염을 치료하는 방법이 본원에 기재된다.
항-PD-1 압타머
PD-1에 결합하여 그의 활성을 억제하고, 이에 의해 면역 활성, 예컨대 T 세포 활성을 증진시키는 핵산 압타머 (항-PD-1 압타머)가 본원에 기재된다. 본원에 기재된 바와 같은 핵산 압타머는 특정한 표적 분자 (예를 들어, PD-1)에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자 (DNA 또는 RNA)를 지칭한다. 압타머는 특정한 표적 분자에 결합함으로써 특정한 표적 분자의 활성을 억제할 수 있다. 본 개시내용의 항-PD-1 압타머는, 선형 또는 원형 형태이며, RNA, DNA (예를 들어, 단일 가닥 DNA), 변형된 핵산, 또는 그의 혼합물일 수 있다. 항-PD-1 압타머는 비-천연 분자 (예를 들어, 천연 유전자에 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 또는 자연에 존재하지 않는 변형된 뉴클레오티드를 함유함)일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-PD-1 압타머는 기능적 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않을 수 있다.
프로그램화된 세포 사멸 단백질 1로 지칭되는 PD-1 (또한 CD279로도 공지됨)은 T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 단백질이다. 이는 T 세포 및 B 세포 사멸 및 분화에서 역할을 수행한다. 인간에서, PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 코딩된다. 인간 PD-1의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_005009 하에 찾아볼 수 있다.
본원에 개시된 항-PD-1 핵산 압타머는 CCATCTCCC (서열식별번호: 1); W가 C 또는 G인, TATATTGTWC (서열식별번호: 2); X가 C, A이거나, 또는 부재하는 것인, GTACAGTTX (서열식별번호: 3); GCACTACA (서열식별번호: 4); Y가 A, T이거나, 또는 부재하는 것인, GTACATCAY (서열식별번호: 5); Y가 A, T이거나, 또는 부재하고, Z가 T, C이거나, 또는 부재하는 것인, YGCTACTGTZ (서열식별번호: 6); 또는 CCATCTCCCGTCC (서열식별번호: 7)의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 항-PD-1 압타머의 다른 예는 도 3, 패널 B에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항-PD-1 핵산 압타머는 5'-CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC-3' (서열식별번호: 8), 또는 5'-TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT-3' (서열식별번호: 9)에 대해 적어도 85% (예를 들어, 90%, 95%, 또는 98%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
2개의 핵산의 "동일성 퍼센트"는 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)로 도입되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드길이-12를 사용하여 수행할 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 곳에서, 갭드(Gapped) BLAST를 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PD-1 압타머는 5'-CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC-3' (서열식별번호: 8), 또는 5'-TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT-3' (서열식별번호: 9)의 뉴클레오티드 서열에 비하여 최대 8개 (예를 들어, 최대 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 뉴클레오티드 변이를 함유할 수 있다. 이러한 변이가 도입될 수 있는 위치는, 예를 들어 참조 뉴클레오티드 서열을 포함하는 PD16 (서열식별번호: 11) 및 PD7 (서열식별번호: 10)의 2차 구조에 기초하여 결정될 수 있다 (도 4B 참조).
일부 예에서, 항-PD-1 압타머는 5' 말단, 3' 말단, 또는 둘 다에 프라이머 부위(들)를 함유할 수 있다. 한 예에서, 항-PD-1 압타머는
Figure pct00001
의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 여기서 밑줄표시/이탤릭체 플랭킹 서열은 5' 및 3' 프라이머 부위를 지칭한다.
본원에 개시된 임의의 항-PD-1 압타머는 최대 200개 뉴클레오티드 (nt), 예를 들어, 150개 nt, 100개 nt, 80개 nt, 70개 nt, 60개 nt, 50개 nt, 40개 nt, 또는 30개 nt를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 항-PD-1 압타머는 30-150개 nt, 30-100개 nt, 30-80개 nt, 30-70개 nt, 30-60개 nt, 30-50개 nt, 또는 30-40개 nt 범위의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PD-1 압타머는 20nM 미만 (예를 들어, 15 nM, 10 nM, 5 nm, 1 nm, 또는 그 미만)의 해리 상수 (Kd)로 PD-1 (예를 들어, 인간 PD-1)에 결합할 수 있다. 항-PD-1 압타머는 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 대안적으로, 압타머는 상이한 종 (예를 들어, 인간 및 마우스)으로부터의 PD-1 분자에 결합할 수 있다. T 세포 표면 상에서 발현된 PD-1 분자에 대한 결합시에, 이러한 압타머는 PD-1의 활성을 적어도 20% (예를 들어, 40%, 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 100배, 또는 1,000배)만큼 억제할 수 있다 (이에 따라 T 세포 활성이 증가함). PD-1에 대한 항-PD-1 압타머의 억제 활성 (및 이에 따른 T 세포 활성 증진의 활성화)은, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바에 따라 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PD-1 압타머는 비-자연-발생 핵염기, 당, 또는 공유 뉴클레오시드간 연결 (백본)을 함유할 수 있다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오티드는 바람직한 특성, 예컨대 증진된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 개선된 친화도, 및 증가된 생체내 안정성을 부여한다.
한 예에서, 본원에 기재된 압타머는 인 원자를 보유하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 5,321,131; 5,399,676; 및 5,625,050 참조) 및 인 원자를 갖지 않는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 및 5,792,608 참조)을 포함한 변형된 백본을 갖는다. 인-함유 변형된 백본의 예는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함한 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함한 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 3'-5' 연결 또는 2'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 백본은 또한 역극성, 즉 3' → 3', 5' → 5' 또는 2' → 2' 연결을 갖는 것을 포함한다. 인 원자를 포함하지 않는 변형된 백본은, 짧은 쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 짧은 쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된다. 이러한 백본은 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 것; 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 일부를 갖는 다른 것을 포함한다.
또 다른 예에서, 본원에 기재된 압타머는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함한다. 이러한 치환된 당 모이어티는 그의 2' 위치에 하기 기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-알킬, S-알킬, N-알킬, O-알케닐, S-알케닐, N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐, N-알키닐, 및 O-알킬-O-알킬. 이들 기에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬 또는 C2-C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 이들은 또한 그의 2' 위치에 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약역학적 특성을 개선시키기 위한 기를 포함할 수 있다. 바람직한 치환된 당 모이어티는 2'-메톡시에톡시, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시를 갖는 것을 포함한다. 문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]을 참조한다.
대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 압타머는 하나 이상의 변형된 천연 핵염기 (즉, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실)를 포함할 수 있다. 변형된 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, CRC Press, 1993]에 기재된 것을 포함한다. 이들 핵염기 중 특정한 것은 압타머 분자의 그의 표적화 부위에 대한 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린 (예를 들어, 2-아미노프로필-아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신)을 포함한다. 문헌 [Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]을 참조한다.
본원에 기재된 임의의 압타머는 통상적인 방법, 예를 들어 화학적 합성 또는 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 그의 의도되는 생물활성은 예를 들어 하기 실시예에 기재된 것에 의해 검증될 수 있다. 임의의 항-PD-1 압타머의 발현을 위한 벡터가 또한 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
본원에 기재된 임의의 압타머는 하나 이상의 폴리에테르 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 공유 연결, 비-공유 연결 또는 둘 다를 통해 접합될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 압타머는 PEG화된다. 본 개시내용은 특정 분자량의 PEG 모이어티와 관련하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 5kDa 내지 100kDa, 10kDa 내지 80kDa, 20kDa 내지 70kDa, 20kDa 내지 60kDa, 20kDa 내지 50kDa, 10kDa 내지 40kDa, 10kDa 내지 30kDa, 또는 15kDa 내지 25kDa 범위의 분자량을 갖는다. 일부 예에서, PEG 모이어티는 20kDa의 분자량을 갖는다. 본원에 기재된 항-PD-1 압타머에 접합된 PEG 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있다. 이는 핵산 압타머의 5' 말단, 압타머의 3' 말단, 또는 둘 다에 접합될 수 있다. 필요한 경우에, PEG 모이어티는 핵산 압타머의 3' 말단에 공유 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 압타머는 뉴클레오티드 서열 CCATCTCCCA (서열식별번호: 13) 또는 CCATCTCCCATTTTTTTTTTT (서열식별번호: 14)를 포함한다. 서열식별번호: 14 내의 폴리T 단편은 스페이서이고, 이 단편의 길이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 달라질 수 있다.
PEG 모이어티를 핵산에 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2009/073820 A2 (그의 관련 교시내용이 본원에 참조로 포함됨)에 이전에 기재된 바 있다. PEG 접합된 핵산 압타머 및 PEG를 본원에 기재된 핵산 압타머에 접합시키는 방법은 예시적인 것이며 제한하고자 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 핵산 압타머의 이량체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 압타머 이량체는 본원에 기재된 것과 같은 PEG 모이어티일 수 있는 적합한 중합체 모이어티에 의해 연결된 2개의 항-PD-1 압타머를 포함한다. 이량체 내의 2개의 압타머 중 하나 또는 둘 다는 서열식별번호: 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 2개의 항-PD-1 압타머는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 항-PD-1 압타머 중 하나 또는 둘 다는 (서열식별번호: 13) 또는 (서열식별번호: 14)를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-PD-1 압타머 이량체는 (서열식별번호: 1)을 포함하는 하나의 압타머 및 (서열식별번호: 2)를 포함하는 또 다른 압타머를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-PD-1 압타머 이량체의 중합체 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 분자량을 가질 수 있는 PEG이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 압타머 이량체는 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결된 압타머를 포함한다. 한 예에서, 제1 압타머는 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결된다. 또 다른 예에서, 제2 압타머는 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결된다. 또 다른 예에서, 제1 압타머 및 제2 압타머는 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결된다. 본원에 사용된 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티를 연결하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 일부 예에서, 링커는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있는 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서 핵산 링커는 1 내지 50개 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 링커는 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 30, 1 내지 40, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 20 내지 30, 20 내지 40, 20 내지 50, 30 내지 40, 30 내지 50, 또는 40 내지 50개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 예에서, 링커는 11개 뉴클레오티드 길이이다. 링커는 아데닌 (A), 시토신 (C), 티민 (T) 및/또는 구아닌 (G)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 링커는 폴리T 단편을 포함한다. "폴리T 단편"은 2개 이상의 연속 티민 (T) 뉴클레오티드 잔기의 스트레치를 지칭한다. 예를 들어, 폴리T 링커는 2 내지 50개 T 잔기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 폴리T 링커는 2 내지 40, 2 내지 35, 2 내지 30, 2 내지 25, 2 내지 20, 5 내지 15, 또는 10 내지 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 폴리T 링커는 11개의 연속 티민 (T) 뉴클레오티드를 포함한다.
제약 조성물
본원에 기재된 바와 같은 항-PD-1 압타머, 압타머 이량체 또는 그의 PEG 접합체 중 하나 이상은 제약상 허용되는 담체 (부형제)와 혼합되어 표적 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물을 형성할 수 있다. "허용되는"은 담체가 조성물의 활성 성분과 상용성이어야 하고 (그리고 바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있음) 치료된 대상체에게 해롭지 않다는 것을 의미한다. 완충제를 비롯한 제약상 허용되는 부형제 (담체)는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다.
본 발명의 방법에 사용될 제약 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 PD-1 결합 압타머 (또는 압타머를 생성하기 위한 벡터)를 함유하는 리포솜을 포함하고, 이는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 것에 의해 제조될 수 있다. 증진된 순환 시간을 갖는 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법으로 생성될 수 있다. 리포솜은 정해진 세공 크기의 필터를 통해 압출되어, 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다
본원에 기재된 바와 같은 항-PD-1 압타머는 또한, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 내의, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]을 참조한다.
다른 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 지속-방출 포맷으로 제제화될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 PD-1 결합 압타머를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제약 조성물은 멸균되어야 한다. 이는 예를 들어, 멸균 여과 막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 달성된다. 치료 PD-1 결합 압타머 조성물은 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘이 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣을 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한, 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액 또는 좌제일 수 있다.
정제와 같은 고체 조성물의 제조를 위해, 주요 활성 성분을 제약 담체, 예를 들어 통상의 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약 희석제, 예를 들어, 물과 혼합하여, 본 발명의 화합물 또는 그의 비독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성할 수 있다. 이들 예비제제 조성물이 균질한 것으로서 지칭되는 경우, 이는 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 고르게 분산되어 조성물이 동등하게 유효한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제 및 캡슐로 용이하게 세분될 수 있다는 것을 의미한다. 이어서, 이러한 고체 예비제제 조성물을, 본 발명의 활성 성분을 0.1 내지 약 500 mg 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분한다. 신규 조성물의 정제 또는 환제를 코팅하거나 또는 달리 배합하여, 지속 작용의 장점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 외부 투여 성분은 내부 투여 성분 상의 외피의 형태일 수 있다. 2개의 성분은 위에서의 붕괴에 저항하는 작용을 하고 내부 성분이 무손상 상태로 십이지장을 통과되게 하거나 또는 방출 지연될 수 있도록 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 이러한 장용 층 또는 코팅에 다양한 물질을 사용할 수 있고, 이러한 물질은 수많은 중합체 산, 및 중합체 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성 작용제는 특히 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스판(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성 작용제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5% 표면-활성 작용제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 필요에 따라 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리 혼합된 에멀젼 조성물 중에 용해시킬 수도 있고, 또는 대안적으로는 활성 성분을 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 중에 용해시키고 인지질 (예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합시에 에멀젼이 형성될 수도 있다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스를 첨가하여, 에멀젼의 장성을 조정할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20% 오일, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 .im, 특히 0.1 내지 0.5 .im의 지방 액적을 포함하고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
에멀젼 조성물은 항-PD-1 압타머를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하여 제조될 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 제약 조성물은 제약상 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 그의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 구강 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.
바람직하게는 멸균 제약상 허용되는 용매 중의 조성물은 기체의 사용에 의해 분무될 수 있다. 분무되는 용액은 분무 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나, 또는 이러한 분무 장치를 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착시킬 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 제제를 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터, 바람직하게 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.
치료 방법
본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-PD-1 압타머, 그의 이량체 또는 PEG 접합체는 면역 활성을 증진시켜, 특히 T 세포 증식을 촉진시켜, 암 또는 감염성 질환, 예컨대 바이러스 (예를 들어, HIV) 감염 또는 박테리아 감염을 치료하는데 유효하도록 하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 적어도 하나의 항-PD-1 압타머를 함유하는 본원에 기재된 제약 조성물의 유효량이 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 포함한 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 분무될 수 있고, 동결건조 분말은 재구성 후에 분무될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 항-PD-1 압타머-함유 조성물은 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화되거나, 또는 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
본원에 사용된 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합되어 대상체에 대해 치료 효과를 부여하는데 요구되는 각각의 활성제의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료 효과는 감소된 종양 부담, 암 세포의 감소, 또는 증가된 면역 활성이다. PD-1 결합 압타머의 양이 치료 효과를 달성하는지 여부의 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 분명할 것이다. 유효량은, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지하고 있는 바와 같이, 건강 관리자의 지식 및 전문기술 내에서 치료될 구체적 병태, 병태의 중증도, 연령, 신체 조건, 신장, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 파라미터, 치료 기간, 병용 요법 (존재할 경우)의 특성, 특정 투여 경로 등의 인자에 따라 달라진다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 단지 상용 실험만으로 다룰 수 있다. 개별 성분 또는 그의 조합의 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 가장 높은 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다.
경험적 고려사항, 예컨대 반감기가 일반적으로 투여량을 결정하는데 기여할 것이다. 투여 빈도는 요법의 진행에 따라 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만 일반적으로 표적 질환/장애의 치료 및/또는 억제 및/또는 완화 및/또는 지연을 기초로 한다. 대안적으로, PD-1 결합 압타머의 지속 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-PD-1 압타머에 대한 투여량은 PD-1 결합 압타머의 1회 이상의 투여(들)를 받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 증분 투여량의 길항제를 제공받는다. 길항제의 효능을 평가하기 위해, 질환/장애의 지표를 따를 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 압타머의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 것이다. 수일 또는 그 초과에 걸친 반복 투여를 위해, 병태에 따라, 치료는 원하는 증상 억제가 발생할 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 표적 질환 또는 장애, 또는 그의 증상이 완화될 때까지 지속된다. 예시적인 투여 요법은 PD-1 결합 압타머를 초기 용량 약 2 mg/kg으로 투여한 후에 매주 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하거나 또는 격주로 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 1주 1-4회 투여가 고려된다. 일부 실시양태에서, 약 3 μg/mg 내지 약 2 mg/kg (예컨대 약 3 μg/mg, 약 10 μg/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300 μg/mg, 약 1 mg/kg, 및 약 2 mg/kg) 범위의 투여량이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 1주마다, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 1개월마다, 2개월마다, 또는 3개월마다, 또는 그 초과마다 1회이다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용되는 PD-1 결합 압타머 포함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 환자에 대해, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정한 투여 요법, 즉 용량, 타이밍 및 반복은 특정한 개체 및 그 개체의 병력 뿐만 아니라 개별 작용제의 특성 (예컨대 작용제의 반감기, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 기타 고려사항)에 좌우될 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 결합 압타머의 적절한 투여량은 특정 PD-1 결합 압타머, 질환/장애의 유형 및 중증도, PD-1 결합 압타머가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 길항제에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 임상의는 PD-1 결합 압타머를 목적하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 목적하는 결과는 종양 부담의 감소, 암 세포의 감소, 또는 증가된 면역 활성이다. 투여량이 목적하는 결과를 발생시키는지 여부를 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 하나 이상의 PD-1 결합 압타머의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료인지 또는 예방인지, 및 숙련된 진료의에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적이거나 또는 간헐적일 수 있다. PD-1 결합 압타머의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는 일련의 분할된 투여, 예를 들어 표적 질환 또는 장애의 발생 전, 그 동안 또는 그 후의 투여일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 장애, 질환의 증상, 또는 질환 또는 장애에 대한 소질을 관리하거나, 치유하거나, 완화시키거나, 호전시키거나, 변경시키거나, 구제하거나, 경감시키거나, 개선시키거나 또는 효과를 주기 위한 목적으로 표적 질환 또는 장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환/장애에 대한 소질을 갖는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.
표적 질환/장애를 완화시키는 것은 질환의 발병 또는 진행의 지연, 또는 질환 중증도의 감소를 포함한다. 질환을 경감시키는 것이 반드시 치유적 결과를 요구하지는 않는다. 본원에 사용된 표적 질환 또는 장애의 발병을 "지연"시키는 것은 질환의 진행을 미루고/거나, 지체시키고/거나, 느리게 하고/거나, 저지하고/거나, 안정화시키고/거나, 지연시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질환의 병력 및/또는 치료될 개체에 따라 다양한 기간의 지연일 수 있다. 질환의 발병을 "지연" 또는 완화시키거나, 또는 질환의 개시를 지연시키는 방법은 방법을 사용하지 않은 경우와 비교하였을 때 주어진 시간 프레임에서 질환의 하나 이상의 증상이 발생할 가능성을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 수의 대상체를 사용하는 임상 연구에 기초한다.
질환의 "발병" 또는 "진행"은 질환의 초기 발현 및/또는 이어지는 진행을 의미한다. 질환의 발병은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 임상 기술을 사용하여 검출되고 평가될 수 있다. 그러한, 발병은 또한 검출될 수 없는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 발병 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발병"은 발생, 재발, 및 개시를 포함한다. 본원에 사용된 표적 질환 또는 장애의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 PD-1 결합 압타머는 치료를 필요로 하는 대상체에게 생체내에서 종양 부담 또는 암 세포 성장, 또는 HIV 증식을 적어도 5% (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)만큼 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 다른 실시양태에서, PD-1 결합 압타머는 PD-1의 활성 수준을 적어도 5% (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)만큼 감소시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 다른 실시양태에서, PD-1 결합 압타머는 면역 활성을 적어도 5% (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)만큼 증가시키기에 효과적인 양으로 투여된다.
치료될 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 의약 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제약 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 다른 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있고, 예를 들어 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질내로, 또는 이식된 저장소를 통해 투여된다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 이는 1-, 3-, 또는 6-개월 데포 주사가능한 또는 생체분해성 물질 및 방법을 이용하는 것과 같은 주사가능한 데포 투여 경로를 통해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 제약 조성물은 안구내로 또는 유리체내로 투여된다.
주사가능한 조성물은 다양한 담체, 예컨대 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사를 위해, 수용성 PD-1 결합 압타머는 점적 방법에 의해 투여될 수 있고, 이에 의해 PD-1 결합 압타머 및 생리학상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 제제가 주입된다. 생리학상 허용되는 부형제는 예를 들어 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어 PD-1 결합 압타머의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제제는 제약상 부형제, 예컨대 주사용수, 0.9% 염수 또는 5% 글루코스 용액에 용해되어 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, PD-1 결합 압타머는 부위-특이적 또는 표적화 국부 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화 국부 전달 기술의 예는 PD-1 결합 압타머의 다양한 이식가능한 데포 공급원 또는 국부 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 유치 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외피 랩, 션트 및 스텐트 또는 기타 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568을 참조한다.
안티센스 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은 예를 들어 문헌 [Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338]에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 기재된 PD-1 결합 압타머 또는 이를 생성하기 위한 벡터)를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서의 국부 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA 범위로 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg의 DNA 또는 그 초과의 농도 범위가 또한 유전자 요법 프로토콜 동안 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 예컨대 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트일 수 있다. 한 예에서, 대상체는 인간이다. 항-PD-1 압타머-함유 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에서 면역 활성, 예를 들어 T 세포 활성을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 암, 예컨대 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암을 앓고 있거나, 이를 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 이에 걸릴 위험이 있는 인간 환자일 수 있다. 다른 예에서, 대상체는 HIV 감염을 앓고 있거나 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 이러한 환자는 또한 통상의 의료 행위에 의해 확인될 수 있다.
표적 질환 또는 장애 (예를 들면, 암 또는 바이러스 감염, 예컨대 HIV 감염 또는 박테리아 감염)를 앓고 있는 대상체는 통상의 의학적 검사, 예를 들어 실험실 검사, 기관 기능 검사, CT 스캔 또는 초음파에 의해 확인될 수 있다. 임의의 이러한 표적 질환/장애를 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체는 질환/장애의 하나 이상의 증상을 나타낼 것이다. 질환/장애에 걸릴 위험이 있는 대상체는 그 질환/장애와 연관된 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 대상체일 수 있다. 이러한 대상체는 또한 통상의 의료 행위에 의해 확인될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용되는 특정한 투여 요법, 즉 용량, 타이밍 및 반복은 특정한 대상체 (예를 들면, 인간 환자) 및 대상체의 병력에 좌우될 것이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 압타머는 또 다른 적합한 치료제 (예를 들어, 항암제 또는 항-HIV 작용제)와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-PD-1 압타머는 또한 작용제의 효과를 증진 및/또는 보완하는 역할을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.
표적 질환/장애에 대한 치료 효능은 예를 들어 하기 실시예에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.
표적 질환을 완화시키기 위한 키트
본 개시내용은 또한 면역 활성 (예를 들어, T 세포 활성)의 증진, 암 (예를 들어, 폐암, 흑색종, 결장직장암, 또는 신세포암)의 완화, 및/또는 HIV 감염의 치료 또는 이에 대한 위험의 감소에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 PD-1에 결합하는 압타머, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 것을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 본원에 기재된 것과 같은 표적 질환의 치료, 개시 지연, 또는 완화를 위해 압타머를 투여하는 설명을 포함할 수 있다. 키트는 개체가 표적 질환을 보유하고 있는지를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지침서는 압타머를 표적 질환에 걸릴 위험이 있는 개체에게 투여하는 설명을 포함한다.
PD-1 결합 압타머의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로, 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 작성된 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 수반된 지침서)가 또한 허용된다.
라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 암과 연관된 질환 또는 장애, 예컨대 본원에 기재된 것의 치료, 개시 지연 및/또는 완화를 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 지침서는 본원에 기재된 임의의 방법을 실시하기 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합하게 포장된다. 적합한 포장은 바이알, 병, 용기, 유연한 포장 (예를 들면, 실링된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들면, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와의 조합에 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본원에 기재된 것과 같은 PD-1 결합 압타머이다.
키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반적 기술
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]. 추가의 상술 없이도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 그의 최대 범위까지 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 나머지의 본 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 언급된 목적 또는 대상에 대해 참조로 포함된다.
실시예 1: SELEX를 통한 항-PD-1 압타머의 확인
PD1 세포외 도메인을 비특이적 압타머의 수를 감소시키기 위한 선택에 사용하였다. 본 발명자들이 본원에서 사용한 SELEX 전략은 도 1에 도시된 바와 같은 막 SELEX이다. 간략하게, PD1 단백질을 우선 압타머 라이브러리와 인큐베이션하고, 진공 흡인에 의해 니트로셀룰로스 막을 통해 유동시켰다. 수회 세척한 후에, PD1 결합된 압타머는 막 상에 포획되고, PCR 반응에 의해 추가로 증폭될 것이다. 단일 가닥 압타머로 구성된 새로운 압타머 풀은 PCR 생성물로부터 단리될 것이며, PD1 단백질의 새로운 배치와 인큐베이션되어 SELEX의 새로운 라운드를 시작한다. 압타머 풀의 성공적 진화를 보여주기 위해, PD1 선택의 라운드 4, 8, 12, 및 16으로부터의 압타머 풀을 선택하여 분석하였다. 결합 친화도 및 특이성을 RT-qPCR과 커플링된 총 결합 검정에 의해 측정하였다 (도 2). 이들 데이터는 친화도가 SELEX 라운드의 증가에 따라 상승되었다는 것을 나타내었다. 예를 들어, 친화도는 120.7 nM (라운드 4)에서 6.6 nM (라운드 16)으로 증가하였다 (도 2). 이들 데이터는 본 발명자들의 SELEX 절차가 고친화도 및 특이적 압타머를 선택하는데 효율적으로 작업하였다는 것을 시사한다. 선택의 16개의 라운드 후에, 압타머 풀을 서열분석하였다.
실시예 2: 상이한 SELEX 라운드로부터의 압타머 풀의 친화도 분석
PD-1에 대한 라운드 4, 8, 12, 및 16에서의 압타머 풀을 증폭시킨 후에, 500 nM으로부터 출발하여 2배 연속 희석하였다. 10개 투여량 포인트를 PD-1 단백질과의 인큐베이션에 의해 선택된 각각의 풀에 대해 분석하였다. 결합된 압타머를 셀룰로스 막 결합에 의해 단리하고, RT-qPCR에 의해 정량하였다. 결과는 XY 플롯으로 나타내었다. 흑색 원은 라운드 4에 대한 결과를 나타내고, 녹색 사각형은 라운드 8에 대한 결과를 나타내고, 청색 삼각형은 라운드 12에 대한 결과를 나타내고, 적색 역삼각형은 라운드 16에 대한 결과를 나타낸다. 파선은 각각의 풀에 대한 핏 곡선을 나타내었다. 라운드 4, 8, 12, 16에 대한 해리 상수는 각각 493.7nM, 245.7nM, 18.5nM 및 6.8nM이었다.
실시예 3: PD1 압타머의 서열 분석
도 3의 패널 A는 PD-1 압타머의 트리뷰 결과를 보여준다. 도 3의 패널 B는 PD-1에 결합하는, 클러스터링 PD-1 압타머의 상세 서열을 보여준다. 박스표시된 영역은 PD-1 압타머 내의 보존 영역을 나타낸다. 라운드 16으로부터의 압타머 풀은 TA 클로닝이었고, 서열분석을 위해 50개 클론을 선택하였다. 서열을 클러스터링 소프트웨어에 의해 분석하였다. 트리뷰 결과는 우세 집단이 풀 16에서 진화되었음을 나타낸다 (도 3. 패널 A). 도 3, 패널 B는 9개의 뉴클레오티드 염기를 포함하는 보존된 영역을 포함하는, PD1 압타머에 대한 상세 서열 정보를 보여준다. 9개의 뉴클레오티드 염기는 CCATCTCCC (서열식별번호: 1)이다. 이러한 코어 서열을 포함하는 핵산은 PD-1에 결합할 것으로 예상된다. 서열식별번호: 24-42의 핵산 서열은 하기 제시된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 4: 항-PD-1 압타머 PD7 및 PD16의 친화도 및 구조 분석
PD-1 압타머 풀 내의 2가지 주요 서열 집단을 제시하기 위해 PD7 및 PD16을 선택하였다. 총 결합 검정은 PD7 (도 4, 패널 B) 및 PD16 (도 4, 패널 A)의 결합 친화도가 각각 9.7nM 및 2.1nM임을 나타낸다. PD7 및 PD16 압타머의 2차 구조를 예측하기 위한 엠폴드 소프트웨어를 사용하여, 결과는 PD7 및 PD16의 2차 구조 사이에 유의한 유사성이 존재하지 않는다는 것을 나타낸다 (도, 패널 C). 또한 PD7 및 PD16 내의 보존된 영역은 상이한 부분에 위치하고, 스템/루프 구조에 관여한다 (도 4, 패널 C). 이러한 결과는 2차 구조가 PD-1 단백질에 대한 그의 결합을 담당하는 주요 인자일 수 있음을 시사한다.
실시예 5: PD-1 길항 압타머의 확인
PD-1 압타머 중 7개를 T 세포 증식 검정을 위해 선택하여 7개의 주요 서열군을 제시하였다. 본 연구에서 시험된 7개의 PD-1 압타머는 PD16, PD13, PD6, PD7, PD8, PD9, 및 PD24였으며, 그의 뉴클레오티드 서열은 하기 제시된다. 이들 모든 압타머는 대조군에 비하여 T 세포 증식을 증가시켰다. 압타머 중 하나인 PD7은 T 세포 증식의 유도에서 가장 강한 효과를 나타내었고, CD3/CD28 자극의 부재 (도 5, 패널 A) 또는 존재 (도 5, 패널 B) 하에 PD-1 길항 항체보다 더 강한 T 세포 활성화제이다. 결과는 PD-1 길항 항체에 비하여 PD7가 신호를 30% 초과로 증가시킨다는 것을 나타낸다 (도 5, 패널 A).
Figure pct00004
실시예 6: 항-PD-1 압타머 서열의 길항제 활성
실시예 1에 기재된 바와 같이 SELEX를 통해 단리된 항-PD-1 압타머의 추가의 압타머 뉴클레오티드 서열을 차세대 서열분석 (NGS) 데이터를 사용하는 통계적 분석에 기초하여 확인하였다:
코어 1 - CCATCTCCC (서열식별번호: 1) ;
최적화된 코어 1 - CCATCTCCCGTCC (서열식별번호: 7)
코어 2 - TATATTGTCC (서열식별번호: 20);
코어 3 - GTACAGTT (서열식별번호: 21);
코어 4 - GCACTACA (서열식별번호: 4);
코어 5 - GTACATCA (서열식별번호: 22); 및
코어 6 - GCTACTGT (서열식별번호: 23).
각각의 상기 압타머 뉴클레오티드 서열을 시험관내 경쟁 검정을 사용하여 PD-1 길항 활성에 대해 시험하였다. 간략하게, 200ng의 히스티딘-태그 표지된 PD-1 수용체 (His 태그-PD1 단백질)를 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 코팅된 플레이트 상에 코팅하고, Fc-표지된 PDL-1 단백질/압타머 혼합물로 처리하였다. 단백질 G-HRP 및 ECL 기질을 사용하여 결합 신호를 결정하였다. PD-1 길항 항체 J116을 양성 대조군으로 사용하였고, 음성 대조군은 압타머 또는 항체의 부재 하에 수행하였다. 경쟁 검정의 개략적 표현은 도 8, 패널 A 및 B에 제시된다. 각각의 압타머 서열 (코어 1-6 및 코어 1 (최적화됨))을 시험관내 경쟁 검정에서 200nM의 농도로 시험하였다. 경쟁 검정에서, 각각의 압타머 뉴클레오티드 서열은 도 6에 나타난 바와 같이 PD-1과 PDL-1 사이의 상호작용을 억제하였다. 또한, 코어 1, CCATCTCCC (서열식별번호: 1)에 대한 PD-1/PDL-1 결합을 길항하는 것에 대한 IC50은 시험관내 경쟁 검정을 사용하여 31.18nM인 것으로 결정되었다 (도 7). 이들 데이터는 압타머 뉴클레오티드 서열이 PDL-1에 대한 PD-1 결합을 길항할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 항-PD-1 압타머는 상이한 종의 PD-1과 교차-반응한다
시험관내 PD-1 압타머 결합 검정을 사용하여 PD-1 결합의 다른 종과의 교차 반응성을 입증하기 위해 압타머를 사용하였다. 간략하게, 200ng의 히스티딘-태그 표지된 PD-1 수용체 (His 태그-PD1 단백질)를 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 코팅된 플레이트 상에 코팅하고, 그의 5' 말단에서 비오틴에 접합된 압타머 (비오틴-PD-1 압타머)로 처리하였다. PD-1에 대한 압타머의 결합을 스트렙타비딘-HRP 및 ECL 기질을 사용하여 검출하였다. 시험관내 PD-1 결합 검정의 개략적 표현은 도 9에 제시된다. 시험된 압타머는 다음과 같았다:
PD7 - TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 10; 볼드체는 코어 서열임);
PD100 - TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 12; 볼드체는 코어 서열임).
코어 1 - CCATCTCCC (서열식별번호: 1); 및
코어 2 - TATATTGTCC (서열식별번호: 20).
상기 압타머를 도 9에 도시된 시험관내 PD-1 결합 검정을 사용하여 인간, 마우스, 래트, 레서스 원숭이 및/또는 개 PD-1에 대한 결합에 대해 시험하였다. (각각의 종으로부터의) PD-1에의 압타머 결합에 대한 해리 상수를 결정하였고, 이를 표 1에 나타낸다. 이들 데이터는 이들 압타머가 인간, 마우스, 래트, 원숭이 및 개를 포함한 매우 다양한 종에서 PD-1에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00005
Kd 값: +++: 20 nM 미만 ++: 20 nM ~ 100nM ND: 결정되지 않음
표 1. 상이한 종 (인간, 마우스, 래트, 레서스 원숭이 및 개)의 PD-1에 대한 압타머 PD7, PD100, 코어 1 및 코어 2의 결합 친화도.
실시예 8: 항-PD-1 압타머는 림프구 증식 및 CD8+ T-세포 증식을 유도하였다
유리 압타머 및 PEG-접합된 압타머 (PEG 접합체) 둘 다를 포함한 항-PD-1 압타머가 림프구 증식을 촉진하는 능력을 입증하기 위해 림프구 증식 검정을 사용하였다. 간략하게, 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 피콜-파크(Ficoll-paque)에 의해 단리하고, 완전 RPMI 배지에서 밤새 배양하여 세포를 안정화시켰다. 안정화된 PBMC를 상이한 농도의 PD-1 압타머, PEG화 압타머, 길항 PD-1 항체, 또는 무작위 대조군 서열로 48시간 동안 처리하였다. 총 세포 수를 프로메가(Promega) 사로부터의 셀타이터(CellTiter)® 증식 키트를 사용하여 평가하였다. 시험된 압타머는 PD7 (서열식별번호: 10), CCATCTCCCA (서열식별번호: 13; 코어 서열), 및 PEG화 PD7 이량체 (도 11에 나타냄)였다.
각각의 상기 압타머는 PD-1 길항 항체보다 더 큰 정도로 림프구 증식을 증가시켰다 (도 10). 이들 데이터는 압타머, 및 PEG-코어 서열 이량체가 면역 활성을 증진시키는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
또한, 예로서 PD7 및 코어 1을 사용하여 항-PD-1 압타머가 CD4+ 및 CD8+ T-세포 증식을 촉진하는 능력을 입증하기 위해 세포 유동측정법을 사용하였다. 간략하게, 마우스 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 자기 비드를 사용하여 마우스 비장으로부터 단리하였다. 세포를 형광 지시 염료, 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 염색하였다. CFSE 염색된 세포를 항원 제시 세포 (APC; 마우스 PBMC로부터 단리된 단핵구 및 대식세포)와 함께 배양하고, 40nM의 PD7 또는 40nM의 압타머 뉴클레오티드 서열 CCATCTCCC (서열식별번호: 1)로 72시간 동안 처리하였다. 길항 PD-1 항체로의 처리를 양성 대조군으로 사용하고, 무작위 DNA 서열로의 처리를 음성 대조군으로 사용하였다. 유동 세포측정법을 사용하여 세포 집단의 형광 강도를 모니터링하였으며, 여기서 보다 약한 형광 신호는 증가된 증식을 나타내었다. 검정의 개략적 표현이 도 12에 제시된다. 결과는 길항 PD-1 항체, PD7 압타머가 CD8+ T-세포 증식을 증가시켰으나 CD4+ T-세포 증식은 증가시키지 않은 반면 (도 13, 패널 A-D), 음성 대조군은 어떠한 세포 유형에서도 세포 증식에 영향을 미치지 않는다는 것 (도 13, 패널 A 및 B)을 나타내었다. 이들 데이터는 본원에 제시된 코어 서열을 포함하는 압타머가 CD8+ T-세포 증식을 촉진시킴으로써 면역 활성을 증진시키는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 9: 항-PD-1 압타머는 생체내 동계 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하였다
예로서 PD-1 길항 압타머 PD7 (서열식별번호: 10)을 사용하여 생체내 폐암 성장에 대한 본원에 기재된 항-PD-1 압타머의 억제 활성을 입증하기 위해 동계 폐암 마우스 모델을 사용하였다. 간략하게, 마우스 루이스 폐암 세포 (ATCC, CRL1642)를 제0일에 C57BL/6J 마우스에 피하로 이식하였다 (마우스당 2X105개 루이스 폐 세포). 종양이 100mm3에 도달한 후에, 마우스를 대조군, PBS 치료군 (n=7) 또는 PD-1 압타머 치료군 (n=7)으로 나누었다. 복강내 주사에 의해 PD-1 압타머 치료된 마우스에게 PBS 중 40 nmol의 PD7을 투여하고, 대조군 마우스에게 PBS를 투여하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, 루이스 폐 세포 동계 마우스에게 PD-1 압타머를 제0일 및 제5일에 주입하였다 (도 14; 화살표는 주입 시점을 나타냄). 종양 크기를 제0일, 제3일, 제5일, 제7일, 제9일 및 제11일에 측정하였다. PD7 치료된 마우스에서의 종양 크기가 종양 세포 주입 후 제11일에 대조군 PBS로 치료된 마우스의 종양 크기에 비하여 대략 50%만큼 감소하였다 (도 14). 이들 데이터는 PD7 압타머가 폐암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 항-PD-1 압타머는 생체내 인간화 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하였다
한 예로서 PD-1 길항 압타머 PD7 (서열식별번호: 10)을 사용하여, 생체내 폐암 성장에 대한 본원에 기재된 항-PD-1 압타머의 억제 활성을 입증하기 위해 인간화 폐암 마우스 모델을 사용하였다. 간략하게, 인간 A549 폐암 세포를 제0일에 NOD 마우스에 피하로 이식하였다 (마우스당 1.5X106개 A549 세포). A549 세포를 마우스에 이식하고 1주 후에 인간 말초 혈액 백혈구 (PBL)를 마우스에 주입하였다. 마우스를 대조군, 스크램블드 DNA 치료군 (n=3; 마우스 226, 233 및 239) 또는 PD-1 압타머 치료군 (n=3; 마우스 234, 235 및 240)으로 나누었다. 마우스에게 복강내 주사에 의해 150ul의 8μM PD-1 압타머 또는 스크램블드 DNA 대조군을 투여하였다. A549 폐 세포 인간화 마우스에게 PD-1 압타머 또는 스크램블드 DNA 대조군을 3주 동안 1주 1회 주입하였다. 치료 스케줄의 개략적 표현이 도 15에 도시된다. 종양 크기를 제25일, 제32일 및 제38일에 IVIS 스펙트럼 시스템을 사용하여 측정하였다. PD7 치료된 마우스에서의 종양 크기 (도 16, 패널 A-D)는 종양 세포 주입 후 제38일에 스크램블드 DNA 대조군으로 치료된 마우스의 종양 크기 (도 16, 패널 E-H)에 비해 현저하게 감소하였다. 이들 데이터의 평균은 마우스를 PD7로 치료하였을 때 제38일에 스크램블드 DNA 대조군으로 치료된 마우스에 비하여 종양 크기가 80% 초과만큼 감소하였음을 보여준다 (도 17). 이들 데이터는 항-PD7 압타머가 인간 폐암을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특색은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특색은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특색으로 대체될 수 있다. 따라서, 분명하게 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특색은 단지 일련의 포괄적인 동등하거나 유사한 특색의 예이다.
상기 기재로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 특색을 용이하게 파악할 수 있을 것이며, 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 용법 및 조건에 적합하도록 본 발명에 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태도 청구범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Academia Sinica <120> AN ANTAGONISTIC PD-1 APTAMER AND ITS APPLICATIONS IN CANCER THERAPY RELATED APPLICATIONS <130> A0988.70057WO00 <150> US 62/031,427 <151> 2014-07-31 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 ccatctccc 9 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is c or g <400> 2 tatattgtnc 10 <210> 3 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, or absent <400> 3 gtacagttn 9 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 gcactaca 8 <210> 5 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, t, or absent <400> 5 gtacatcan 9 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, t, or absent <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is c, t, or absent <400> 6 ngctactgtn 10 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 7 ccatctcccg tcc 13 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 cttccatctc ccatgcttag tcaaacatac 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 9 tgatcacaag aataactatc ccatctccct 30 <210> 10 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 10 tccctacggc gctaaccttc catctcccat gcttagtcaa acatacgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 11 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 11 tccctacggc gctaactgat cacaagaata actatcccat ctccctgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 12 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 12 tccctacggc gctaaccctc ccctagtata tattgtcctc gtctatgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 13 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 13 ccatctccca 10 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 14 ccatctccca tttttttttt t 21 <210> 15 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 15 tccctacggc gctaaccatc atcgatattg acacaaccat ctccctgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 16 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 16 tccctacggc gctaactcct gcatccatct ccctctgtta gttttggcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 17 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 17 tccctacggc gctaacgtaa ttccatctcc ctcacagatt gctaacgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 18 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 18 tccctacggc gctaactcca tctcccttgt aacgttgctt cctcttgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 19 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 19 tccctacggc gctaaccgtc atcgttaata tattgtcctc gcataagcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 20 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 20 tatattgtcc 10 <210> 21 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 21 gtacagtt 8 <210> 22 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 22 gtacatca 8 <210> 23 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 23 gctactgt 8 <210> 24 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 24 tccctacggc gctaacgtaa ttccatctcc ctcacagatt gctaacgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 25 tccctacggc gctaacttcc atctccttgc caccgtgcta caac 44 <210> 26 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 26 tccctacggc gctaactgcc accgtgctac aacatcccta cggcgctaac tctccatctc 60 ccttgccacc gtgctacaac 80 <210> 27 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 27 tccctacggc gctaacccta cgcatccatc tccctatgta tgtcccgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 28 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 28 tccctacggc gctaacatcc atctccctgc caccgtgcta caacatccct acggcgctaa 60 ctgccaccgt gctacaac 78 <210> 29 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 29 tccctacggc gctaactatt ccatctccct cgccaccgtg ctacaac 47 <210> 30 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 30 tctttccgcg gcggggggac tgggatcttc ttattgtgaa atcaaccccg tagga 55 <210> 31 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 31 tccctacggc gctaactcct gcatccatct ccctctgtta gaagctgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 32 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 32 tccctacggc gctaaccttc catctcccat gcttggtcaa acatacgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 33 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 33 tccctacggc gctaaccttc catctcccat gcttactcaa acatacgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 34 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 34 tccctacggc gctaacgaat tccatctccc tccactcaca gtcccggcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 35 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 35 ttcctacggc gctaactcct gttcccctca caacacccct gggcaggcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 36 tccctacggc gctaaccatc tccctgccac cgtgctacaa c 41 <210> 37 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 37 tccctacggc gctaactgtc ctcgcatccc atctccctac ggcgctaact gccaccgtgc 60 tacaac 66 <210> 38 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 38 tccctacggc gctaacgttg tgataagagg ttacaagttt ttcaccgcca ccgtgctaca 60 ac 62 <210> 39 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 39 tccctacggc gctaactgcc accgtgctac aacatcccta cggcgctaac catctccctg 60 ccaccgtgct acaac 75 <210> 40 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 40 tccctacggc gctaacctgg catttcctga ttgtttaacg cggccggcca tcgtgctaca 60 ac 62 <210> 41 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 41 tccctacggc gctaacaatg gtccatacta ccgacatcaa gtccccgcca tcgtgctaca 60 ac 62

Claims (34)

  1. (i) CCATCTCCC (서열식별번호: 1),
    (ii) W가 C 또는 G인, TATATTGTWC (서열식별번호: 2),
    (iii) X가 C, A이거나, 또는 부재하는 것인, GTACAGTTX (서열식별번호: 3),
    (iv) GCACTACA (서열식별번호: 4),
    (v) Y가 A, T이거나, 또는 부재하는 것인, GTACATCAY (서열식별번호: 5),
    (vi) Y가 A, T이거나, 또는 부재하고, Z가 T, C이거나, 또는 부재하는 것인, YGCTACTGTZ (서열식별번호: 6), 및
    (vii) CCATCTCCCGTCC (서열식별번호: 7)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1)에 결합할 수 있는 핵산 압타머.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC (서열식별번호: 8); 또는
    (ii) TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT (서열식별번호: 9)
    에 대해 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 압타머.
  3. 제2항에 있어서,
    (i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC (서열식별번호: 8); 또는
    (ii) TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT (서열식별번호: 9)
    에 대해 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 압타머.
  4. 제3항에 있어서,
    (i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC (서열식별번호: 8); 또는
    (ii) TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT (서열식별번호: 9)
    에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 압타머.
  5. 제4항에 있어서,
    (i) CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC (서열식별번호: 8); 또는
    (ii) TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT (서열식별번호: 9)
    의 핵산 서열을 포함하는 핵산 압타머.
  6. 제1항에 있어서,
    (i) TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 10);
    (ii) TCCCTACGGCGCTAACTGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCTGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 11); 또는
    (iii) TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATGCCACCGTGCTACAAC (서열식별번호: 12)
    의 핵산 서열로 이루어진 핵산 압타머.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 20nM 미만의 해리 상수 (Kd)로 PD-1에 결합하는 핵산 압타머.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 접합된 핵산 압타머.
  9. 제8항에 있어서, PEG가 핵산 압타머의 3' 말단에 접합되는 것인 핵산 압타머.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, PEG가 10 kDa 내지 30kDa 범위의 분자량을 갖는 것인 핵산 압타머.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가 20kDa의 분자량을 갖는 것인 핵산 압타머.
  12. 제1 항-PD-1 압타머, 제2 항-PD-1 압타머, 및 제1 항-PD-1 압타머 및 제2 항-PD-1 압타머를 연결하는 중합체 모이어티를 포함하는 항-PD-1 압타머 이량체.
  13. 제12항에 있어서, 제1 항-PD-1 및 제2 압타머 중 적어도 하나가 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 제시된 핵산 압타머인 항-PD-1 압타머 이량체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제1 항-PD-1 압타머가 제2 항-PD-1 압타머와 동일한 것인 항-PD-1 압타머 이량체.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제1 항-PD-1 압타머가 제2 항-PD-1 압타머와 상이한 것인 항-PD-1 압타머 이량체.
  16. 제12항에 있어서, 제1 압타머 및 제2 압타머가 둘 다 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 항-PD-1 압타머.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 모이어티가 PEG인 항-PD-1 압타머 이량체.
  18. 제17항에 있어서, PEG가 10 kDa 내지 30 kDa 범위의 분자량을 갖는 것인 항-PD-1 압타머 이량체.
  19. 제18항에 있어서, PEG가 20 kDa의 분자량을 갖는 것인 항-PD-1 압타머 이량체.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 압타머, 제2 압타머, 또는 둘 다가 링커를 통해 중합체 모이어티에 연결되는 것인 항-PD-1 압타머 이량체.
  21. 제20항에 있어서, 링커가 폴리T 단편을 포함하는 것인 항-PD-1 압타머 이량체.
  22. 제21항에 있어서, 폴리T 단편이 5-20개 T 잔기를 함유하는 것인 항-PD-1 압타머 이량체.
  23. (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 압타머 또는 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항-PD-1 압타머 이량체; 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  24. (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 압타머 또는 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항-PD-1 압타머 이량체; 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암 또는 감염을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
  25. 암 또는 감염을 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 압타머 또는 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항-PD-1 압타머 이량체의 용도.
  26. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제23항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 대상체가 암을 앓고 있거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 인간 환자인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 암이 흑색종, 비소세포 폐암, 결장직장암 또는 신세포암인 방법.
  29. 면역 활성의 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제23항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 활성을 증진시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 대상체가 암을 앓고 있거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 인간 환자인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 암이 흑색종, 비소세포 폐암, 결장직장암 또는 신세포암인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 대상체가 HIV 감염을 앓고 있거나 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 인간 환자인 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물의 양이 T 세포 활성화를 증가시키는데 효과적인 것인 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물의 양이 CD8 양성 T 세포의 증식을 증가시키는데 효과적인 것인 방법.
KR1020177005533A 2014-07-31 2015-07-31 길항 pd-1 압타머 및 암 요법 관련 적용에서의 그의 적용 KR20170055474A (ko)

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