KR20080042091A - 고 친화도로 트롬빈에 결합하는 앱타머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 응혈 관련 질환 및/또는 트롬빈이 연루된 기타 질환 또는 질병의 치료제로서, 그리고 진단제로서 유용한, 트롬빈에 결합할 수 있는 앱타머를 제공한다. 본 발명은 또한 트롬빈에 결합할 수 있는 앱타머 투여를 위한 물질 및 방법을 제공한다.

트롬빈에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer), 응혈 관련 질환, 항응혈제, 관상 동맥 우회 이식(CABG)술, 활성 응혈 시간(ACT)

Description

고 친화도로 트롬빈에 결합하는 앱타머{APTAMERS THAT BIND THROMBIN WITH HIGH AFFINITY}

본 발명은 일반적으로 핵산 분야 그리고 더욱 구체적으로는 응혈 관련 질환 및/또는 트롬빈(thrombin)이 연루된 기타 질병 또는 질환의 치료제 및 진단제로서 유용한, 트롬빈에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 트롬빈에 결합할 수 있는 앱타머의 투여를 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.

앱타머는 고전적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 이외의 상호작용을 통하여 분자에 대해 고도의 특이적 결합 친화도를 보이는 핵산 분자이다.

파아지 디스플레이 또는 모노클로날 항체("mAbs")에 의하여 생성된 펩티드와 마찬가지로, 앱타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합하여 표적의 활성을 조정할 수 있는 것으로서, 예를 들면 앱타머 결합을 통해 표적의 작용 능력을 차단할 수 있다. 랜덤한 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 생체외 선별 과정에 의해, 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린 및 수용체를 비롯한 100 종 이상의 단백질에 대한 앱타머가 생성된 바 있다. 전형적인 앱타머는 크기가 10∼15 kDa(30∼45 뉴클레오티드)으로서, 나노 몰 이하의 친화도로 그 표적에 결합하며, 밀접하게 관련된 표적들에 대해 차별성을 나타낸다(일례로, 앱타머는 통상적으로 동일한 유전자군에 속하는 다른 단백질에는 결합하지 않을 것이다). 일련의 구조학적 연구 결과, 앱타머는 항체-항원 복합체에서 친화도와 높은 선택적 결합을 부여하는 동일한 유형의 결합 상호작용(예를 들면, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion))을 이용할 수 있는 것으로 나타났다.

앱타머는 고 선택성 및 친화도, 생물학적 효능 및 우수한 약동학적 특성을 포함하여, 치료제 및 진단제로서 사용하기에 바람직한 다수의 특징들을 가지고 있다. 또한, 앱타머는 항체 및 기타 생물학적 단백질을 능가하는, 다음에 예시한 바와 같은 특이적인 경쟁적 이점을 제공한다 :

1) 속도 및 제어 : 앱타머는 치료학적 리드를 포함하여, 초기의 신속한 리드를 가능하게 하는 생체외 방법에 의해 전적으로 생산된다. 생체외 선별은 앱타머의 선택성 및 친화도를 엄격하게 제어할 수 있으며, 독성 및 비-면역원성 표적 양자 모두에 대한 리드를 비롯하여 리드의 발생을 가능하게 한다.

2) 독성 및 면역원성 : 앱타머 군은 치료학적으로 허용가능한 독성을 나타내며, 면역원성은 결여된 것으로 입증되었다. 랫 또는 우드척(woodchucks)에게 다량의 앱타머(90 일간 1 일 10 mg/kg 씩)를 상습적으로 투여하면, 어떠한 임상적, 세포적 또는 생화학적 측정에 의해서도 독성이 전혀 목격되지 않는다. 대다수의 모노클로날 항체 효능은 항체 자체에 대한 면역 반응에 의하여 엄격하게 제한될 수 있는 반면에, 앱타머는 MHC 를 통해 T-세포 에 의해 제시될 수 없고, 면역 반응이 일반적으로 핵산 단편은 인지하지 못하도록 적응되어 있기 때문에, 앱타머에 대하여 항체를 유도하는 것은 극도로 어려운 것으로 보인다.

3) 투여 : 최근에 승인된 항체 치료제 대부분은 정맥내 주입(통상적으로 2∼4 시간에 걸침)에 의해 투여되는 반면에, 앱타머는 피하 주사에 의해 투여할 수 있다(원숭이 연구 결과, 피하 투여에 의한 앱타머의 생체적합성은 > 80 % 이었다(참조 : Tucker 외 다수, J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). 이러한 차이는 일차적으로 용해도가 비교적 낮고 대부분의 치료용 mAb 에 필요한 용적이 크다는 사실에 기인한다. 앱타머는 용해도가 양호하고(> 150 ㎎/㎖) 분자량이 비교적 낮기 때문에(앱 타머 : 10∼50 kDa ; 항체 : 150 kDa), 0.5 ㎖ 미만의 용량으로 매주 주사에 의해 투여할 수 있다. 또한, 소형의 앱타머는 항체 또는 항체 단편의 경우 침투가 불가능한, 형태적 협착 부위로의 침투도 가능하다는 점도, 앱타머-의거한 치료법 또는 예방법의 또 다른 이점으로 제시된다.

4)확장성( scalability ) 및 비용 : 치료용 앱타머는 화학적으로 합성되므로, 결과적으로 생산 요구에 부합하도록 필요에 따라 용이하게 확장 가능하다. 현재는 확장 생산시의 난점들이 몇몇 생물학적 물질의 이용가능성을 제한하고 대규모 단백질 생산 플랜트에 막대한 자본금이 드는 상황이지만, 단일의 대규모 올리고뉴클레오티드 합성기는 매년 100 ㎏ 씩 증량 생산할 수 있어 비교적 적절한 초기 투자를 필요로 한다.

5)안정성 : 치료용 앱타머는 화학적으로 견고하다. 앱타머는 본질적으로 열과 변성제 같은 인자로의 노출 후, 활성을 재습득하도록 적응되어 있어, 동결 건조된 분말의 형태로 실온에서 장기간 동안(1 년 이상) 보관 가능하다.

트롬빈

트롬빈은 전응혈제 및 항응혈제 활성을 가진 다기능성 세린 프로테아제이다. 전응혈제 효소로서, 트롬빈은 피브리노겐을 응고시키고, 응혈 인자 V, VIII 및 XIII 를 활성화시키며, 또 혈소판을 활성화시킨다. 트롬빈에 의한 피브리노겐의 특이적 절단은 혈병 형성의 1 차적 사건이라 할 수 있는 피브린 단량체의 중합을 개시한다. 혈소판 혈전 형성의 중심적 사건은 "비결합" 에서 "결합" 방식으로 혈소판을 활성화시키는 것이다. 트롬빈은 혈소판 응집의 생리학적 활성인자이다. 따라서, 전응혈제로서 트롬빈은 출혈 저지(생리학적 지혈) 및 혈관-폐색성 혈전의 형성(병리학적 혈전증)에 중요한 역할을 한다.

항응혈제로서 트롬빈은 혈관 내피 세포의 표면 상에 발현되는 당단백질인 트롬보모듈린(TM)에 결합한다. TM 은 활성 부위 형태의 알로스테릭 변화 및 트롬빈 상의 TM 과 피브리노겐 결합 부위 간의 중첩의 조합을 통해 피브리노겐 및 혈소판으로부터 단백질 C 로 기질 특이성을 변화시킨다. 활성화된 단백질 C 는 인지질 표면, Ca^{2 +} 및 제 2 비타민 K-의존성 단백질 보조인자인 단백질 S 의 존재 하에서 인자 Va 및 VIIIa 를 단백질분해적으로 분해함으로써 응혈을 저해한다. 즉, 트롬빈-TM 복합체의 형성으로 트롬빈은 전응혈제로부터 항응혈제 효소로 전환되며, 이들 상반되는 활성 간의 정상적인 균형이 지혈 조절에 결정적 역할을 한다.

응혈 질환

혈관 상해 및 혈전 형성은 아테롬성 동맥경화증을 비롯하여 각종 혈관 질환의 발병에서 중요한 사건을 나타낸다. 각종 질병 상태 및 관상 동맥, 심실 및 심장 판막과 같은 각종 부위에서 혈전증을 야기시키는 응혈 시스템 및/또는 혈소판의 활성화의 병인적 과정은 다른 것으로 보인다. 그러므로, 폐쇄된 혈관을 개방시키고 재폐색을 방지하기 위해서는 혈전용해제와 함께 혈소판 저해제, 항응혈제 또는 이들의 배합물의 사용이 요구될 수 있다.

응혈 다단과정(cascade)의 화합물에 의한 단백질분해 제어가 지혈에 있어서 중요하다. 결과적으로, 일련의 고 특이성 프로테아제 저해제를 일부 기반으로 하는 다양한 복합적 조절 시스템이 존재한다. 병리학적 상황에서, 기능적 저해 활성은 활성 프로테아제의 과도한 생성 또는 저해 활성의 불활성화에 의해 방해받을 수 있다. 다발성 외상(조직 손상) 또는 감염(패혈증)에 대한 반응으로 일어나는 염증의 영속화는 트롬빈을 포함한 혈장 다단 시스템 및 리소좀 기원 둘 다의 단백질분해성 효소에 의해 좌우된다. 이러한 경우에서 다발성 장기 부전증(MOF)은 프로테아제와 이들의 저해 조절인자 간에 동시 발생하는 불균형에 의해 진전된다. 더 나아가, 대뇌에서 트롬빈 활성의 불균형은 신경퇴행성 질환을 초래할 수도 있다.

관상 동맥 우회 이식( CABG ) 수술

2001 년, 미국 심장 협회의 보고에 따르면, 미국 내 12.4 M 추정 환자가 어떠한 형태이든 관상 동맥 질환으로 진단되었다고 한다. 응혈 과정에서의 트롬빈의 중대성을 감안하여, 항-트롬빈제 또는 트롬빈 활성을 감소 또는 저해하는 약제가 예를 들면 관상 동맥 우회 이식(이후, "CABG" 로 지칭) 수술, 경피적 관상동맥 중재술(이후, "PCI" 로 지칭) 및 급성 관상동맥 증후군 중에 항응혈제로 사용된다. 2001 년 이후, 570,000 건 이상의 CABG 시술이 매년 미국에서 시행되었으며, 전 세계적으로는 700,000 건 이상의 시술이 시행되고 있는 것으로 추정된다. 현재, 가장 보편적으로 사용되는 항응혈제는 헤파린으로, 이는 해독제 프로파민과 함께 사용해야만 한다. 그러나, 헤파린-프로타민 처치는 출혈 및 가끔은 자각증상이 없이 생명을 위협하는 동맥성 또는 정맥성 혈전증과 연관될 수도 있는 혈소판감소증(혈소판 수 저하)을 비롯하여 다수의 심각한 부작용을 초래한다. 이외에도, 헤파린-프로타민 처치는 혈장 단백질에 대한 비-특이적 결합이 일부 환자에게서 내성을 야기시킨다는 점 ; 헤파린은 혈병-결합된 트롬빈을 저해할 수 없다는 점 ; 헤파린은 투여시 제어를 어렵게 하는 비-선형 동역학을 가지고 있다는 점 ; 그리고 헤파린은 바이러스 및/또는 프리온(prion)의 전달 가능성으로부터 제기되는 본질적인 안전 위험성을 내포하고 있는 소 또는 돼지 조직으로부터 제조된다는 점을 포함하여 다수의 다른 단점들을 가지고 있다. 결과적 으로, 저 분자량의 헤파린 및 안지오맥스®(Angiomax®) 같은 다수의 새로운, 고가의 항응혈제가 이 분야의 시장으로 상당부분 침투되고 있다. 그러나, 이들 화합물 또한 유사한 부작용들을 가지고 있으며, 이들의 항응혈 활성은 신속한 전환이 이루어질 수 없다.

따라서, 별도의 역행 제제를 필요로 하지 않으면서, 전술한 부작용 및 단점들과 관련되지 않은 적정-가격의 안전한 항응혈제에 대한 채워지지 않는 요구가 의료계에서 계속되고 있다. 이에 따라, 응혈-관련 질환의 치료에 있어서 치료제의 용도로, 트롬빈의 활성을 감소 또는 저해하는 약제를 보유하는 것이 도움이 될 것이다.

발명의 요약

본 발명은 트롬빈 매개 질환, 예를 들면 급성 및 만성 응혈-관련 질환의 치료를 위한 물질 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 트롬빈 조정 용도의, 구체적으로는 대상 및 환자에서 항응혈을 위해 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 용도의, 치료용 조성물 및 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 트롬빈 표적에 결합하는 앱타머, 이때 이 앱타머는 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 것으로, ARC2172 (SEQ ID NO 294)이거나, ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 트롬빈 매개된 응혈의 감소 또는 저해 능력과 실질적으로 동일한 능력을 가진 앱타머이며, 이때 이 앱타머는 인체 트롬빈에, 1 nM 미만, 바람직하게는 300 pM 미만, 더욱 바람직하게는 250 pM 미만, 더욱 더 바람직하게는 200 pM 미만의 K_D 값으로 결합하며, 이때 이 앱타머의 길이가 56 뉴클레오티드 또는 그 미만, 55 뉴클레오티 드 또는 그 미만, 50 뉴클레오티드 또는 그 미만, 45 뉴클레오티드 또는 그 미만, 40 뉴클레오티드 또는 그 미만, 35 뉴클레오티드 또는 그 미만, 30 뉴클레오티드 또는 그 미만, 28 뉴클레오티드 또는 그 미만, 26 뉴클레오티드 또는 그 미만인 것이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 앱타머의 길이는 적어도 22 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서는, 트롬빈 표적에 결합하는 앱타머, 이때 이 앱타머가 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 것으로, ARC2172 (SEQ ID NO 294)이거나, ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 트롬빈 매개된 응혈의 감소 또는 저해 능력과 실질적으로 동일한 능력을 가진 앱타머이며, 이때 이 앱타머가 티미딘 또는 우리딘 잔기의 대부분에서 5-브로모데옥시우리딘 변형을 포함하지 않는 것이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 앱타머는 인체 트롬빈에, 1 nM 미만, 바람직하게는 300 pM 미만, 더욱 바람직하게는 250 pM 미만, 더욱 더 바람직하게는 200 pM 미만의 K_D 값으로 결합한다. 몇몇 실시형태에서는, 길이가 56 뉴클레오티드 또는 그 미만, 55 뉴클레오티드 또는 그 미 만, 50 뉴클레오티드 또는 그 미만, 45 뉴클레오티드 또는 그 미만, 40 뉴클레오티드 또는 그 미만, 35 뉴클레오티드 또는 그 미만, 30 뉴클레오티드 또는 그 미만, 28 뉴클레오티드 또는 그 미만 또는 26 뉴클레오티드 또는 그 미만인 앱타머가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 앱타머는 길이가 적어도 22 뉴클레오티드이다. 몇몇 실시형태에서, 해리 상수는 이하 실시예 1 에 기술된 도트 블롯 적정법(dot blot titration)에 의해 측정할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 본 발명 앱타머의 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해하는 능력은 활성 응혈 시간(ACT), 프로트롬빈 시간(PT) 및/또는 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 감소 또는 저해하는 앱타머의 능력을 측정함으로써 평가한다. 트롬빈 매개 응혈은 ACT 를 단축시키는 앱타머의 능력을 측정함으로써 평가하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명 앱타머의 응혈 감소 또는 저해 능력은 하기 실시예 3B 에 기술된 바와 같이 헤모크론 주니어 기구(Hemochron Jr. instrument, ITC Med, Edison, NJ)를 사용하여 ACT 를 측정함으로써 평가한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 앱타머는 생체내에서, 특히 인체에서 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 앱타머는 생체외에서 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해한다.

특정 실시형태에서는, 트롬빈에 결합하는 것으로, SEQ ID NOs 9-41, 43-191, 193-204, 208-304, 307-329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400 및 402-440 으로 이루어진 군 중에서 선택된 앱타머가 제공된다. 하나의 실시형태에서는, 트롬빈에 결합하는 것으로, 다음의 핵산 서열을 포함하는 앱타머가 제공된다 : CCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGG. 특정 실시형태에서는 다음의 핵산 서열들로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 포함하는 앱타머가 제공된다 : ACTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGT(ARC2169 (SEQ ID NO 283)), GCTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGC(ARC2170 (SEQ ID NO 292)), CTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAG(ARC2171 (SEQ ID NO 293)) 및 CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG(ARC2172 (SEQ ID NO 294)).

다른 실시형태에서는, 다음의 핵산 서열을 포함하는 것으로, 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해하는 앱타머가 제공된다: N₁N₂N₃TAGGTTGGGTAGGGTGGT'₃N'₂N'₁, 여기에서, N₁, N₂ 또는 N₃ 은 N'₁, N'₂ 또는 N'₃ 과 각각 염기쌍을 형성하는 임의의 뉴클레오티드이며, 각각의 N₁, N₂ 및 N₃ 은 동일한 뉴클레오티드이거나 또는 상이한 뉴클레오티드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서는, N₁, N₂ 또는 N₃ 이 데옥시 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서는, N₁, N₂ 및 N₃ 중 적어도 두 개가 2'OMe 변형을 포 함한다.

다른 실시형태에서는, 다음의 핵산 서열을 포함하는 것으로, 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해하는 앱타머가 제공된다: N₁N₂N₃N₄TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'₄N'₃N'₂N'₁, 여기에서, N₁, N₂, N₃ 또는 N₄ 는 N'₁, N'₂, N'₃ 또는 N'₄ 와 각각 염기쌍을 형성하는 임의의 뉴클레오티드이며, 각각의 N₁, N₂, N₃ 및 N₄ 는 동일한 뉴클레오티드이거나 또는 상이한 뉴클레오티드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서는, N₁, N₂, N₃ 또는 N₄ 가 데옥시 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서는, N₁, N₂, N₃ 및 N₄ 중 적어도 두 개가 2'OMe 변형을 포함한다.

다른 실시형태에서는, 다음의 핵산 서열을 포함하는 것으로, 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해하는 앱타머가 제공된다: N₁N₂N₃N₄N₅TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'₅N'₄N'₃N'₂N'₁, 여기에서, N₁, N₂, N₃, N₄ 또는 N₅ 는 N'₁, N'₂, N'₃, N'₄ 또는 N'₅ 와 각각 염기쌍을 형성하는 임의의 뉴클레오티드이며, 각각의 N₁, N₂, N₃, N₄ 및 N₅ 는 동일한 뉴클레오티드이거나 또는 상이한 뉴클레오티드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서는, N₁, N₂, N₃, N₄ 또는 N₅ 가 데옥시 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서는, N₁, N₂, N₃, N₄ 및 N₅ 중 적어도 두 개가 2'OMe 변형을 포함한다.

다른 실시형태에서는, 다음의 핵산 서열을 포함하는 것으로, 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해하는 앱타머가 제공된다: N₁N₂N₃N₄N₅N₆TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'₆N'₅N'₄N'₃N'₂N'₁, 여기에서, N₁, N₂, N₃, N₄, N₅ 또는 N₆ 은 N'₁, N'₂, N'₃, N'₄, N'₅ 또는 N'₆ 과 각각 염기쌍을 형성하는 임의의 뉴클레오티드이며, 각각의 N₁, N₂, N₃, N₄, N₅ 및 N₆ 는 동일한 뉴클레오티드이거나 또는 상이한 뉴클레오티드일 수 있다.

몇몇 실시형태에 있어서, 전술한 앱타머의 N 은 구아노신 또는 시티딘 뉴클레오티드 잔기이다. 본 발명의 상기한 양태에 대한 다른 실시형태에서, 앱타머는 트롬빈에 1 nM 미만의 K_D 값으로 결합한다. 본 발명의 상기한 양태에 대한 다른 실시형태에서, 앱타머는 ARC2172(SEQ ID NO 294)의 트롬빈 매개 응혈의 감소 또는 저해 능력과 실질적으로 동일한 능력을 가진다. 상기한 양태의 몇몇 실시형태에서, 트롬빈 표적은 인체 트롬빈이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명 앱타머의 대다수 뉴클레오티드는 데옥시리보핵산이다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 앱타머는 데옥시리보핵산, 구체적으로는 단일 가닥형 데옥시리보핵산이다. 본 발명의 몇몇 실시형태에서는, 적어도 14 개, 바람직하게는 적어도 16 개, 더욱 바람직하게는 적어도 18 개의 뉴클레오티드가 데옥시뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 앱타머는 데옥시 핵산 서열 TAGGTTGGGTAGGGTGGT 를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 앱타머는 적어도 하나의 화학적 변형, 구체적으로는 핵산 내 당 위치에서의 화학적 치환 ; 인산염 위치에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로 이루어진 군 중에서 선택된 화학적 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 화학적 변형은 앱타머의 티미딘 또는 우리딘 잔기의 대부분에서 5-브로모데옥시우리딘 변형을 허용하지 않는다. 몇몇 실시형태에서는, 변형 뉴클레오티드의 혼입(incorporation), 3' 캡핑, 고 분자량의 비-면역원성 화합물로의 콘쥬게이트화 및 친유성 화합물로의 콘쥬게이트화로 이루어진 군 중에서 이러한 변형이 선택되며, 특히 이때 고 분자량의 비-면역원성 화합물은 폴리알킬렌 글리콜, 구체적으로는 폴리에틸렌 글리콜이다.

몇몇 실시형태에서, 전술한 본 발명의 항-트롬빈 앱타머(예. ARC2172)는 어혈에서, 구체적으로 실온에서 적어도 약 30 분 동안, 더욱 구체적으로 5 μM 의 농도로 실온에서 적어도 약 30 분 동안 응혈을 감소 또는 저 해한다.

몇몇 실시형태에서는, 실험대상, 특히 인체 또는 체외 순환로에 본 발명의 항-트롬빈 앱타머를, 상기 실험대상에게서 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해하는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

몇몇 실시형태에서는, 본 발명의 항-트롬빈 앱타머 또는 이의 염을, 실험대상 내에서 트롬빈 매개 응혈을 감소 또는 저해하는데 효과적인 양으로, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 조성물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 포함된 항-트롬빈 앱타머는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)이다. 본 발명의 조성물을 실험대상, 특히 이를 필요로 하는 인체에 투여하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 인체라 함은 신장 기능 손상 환자를 이르며, 본 발명의 방법으로 투여하는 본 발명의 항-트롬빈 앱타머는 PEG 에 콘쥬게이트화된 것이 아니다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 앱타머를 본 발명의 방법으로 투여하고자 하는 인체는 헤파린 유도된 혈소판감소증 환자, 헤파린 내성 환자 및/또는 간 기능 손상 환자이다.

본 발명의 방법에 대한 몇몇 실시형태에서는, 본 발명의 항-트롬빈 앱타머를, 실험대상에 대한 외과적 시술 이전, 도중, 이후 또는 이들을 병합한 시기에, 실험대상, 특히 인체에 투여한다. 몇몇 실시형태에서, 상기한 외과적 시술이라 함은 심장 수술을 이른다. 몇몇 실시형태에서, 상기 외과적 시술은 심폐 우회술(심폐 바이패스라고도 함), 관상 동맥 우회 이식술, 경피적 관상동맥 중재술, 혈관형성술, 심혈관 및 말초 혈관 절개 및 혈관내 수술, 스텐트 설치술, 심장 판막 치환술, 정맥 또는 동맥의 관상 질환 및/또는 혈관 질환 치료를 위한 수술 및 말초 동맥 폐색성 질환 치료를 위한 수술로 이루어진 군 중에서 선택된다. 본 발명의 방법에 대한 몇몇 실시형태에서, 항-트롬빈 앱타머는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)이다. 본 발명의 방법에 대한 특정 실시형태에서, 앱타머는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)이며, 외과적 시술은 관상 동맥 우회 이식술이다. 본 발명의 방법에 대한 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 앱타머는 ARC2172 이고, 외과적 시술은 심폐 우회술로, 시술 중에 비-헤파린 결합된 순환로가 사용된다. 본 발명의 방법에 대한 다른 특정 실시형태에서는, 앱타머가 ARC2172 (SEQ ID NO 294)이며, 외과적 시술이 경피적 관상동맥 중재술이다.

도 1 은 랜덤한 올리고뉴클레오티드 서열 풀로부터 앱타머를 선별하는 생체외 앱타머 선별(셀렉스(SELEX™)) 방법을 나타내는 개요도이다.

도 2 는 40 kDa 분지형 PEG 의 구조식을 나타내는 도면이다.

도 3 은 앱타머의 5' 단부에 부착된 40 kDa 분지형 PEG 의 구조식을 나타내는 도면이다.

도 4 는 표준 단일-PEG 화(페그화), 다중 PEG 화 및 PEG 화를 통한 이합체화 과정을 나타내는 다양한 PEG 화 기술을 도시한 도면이다.

도 5 는 트롬빈 앱타머 ARC2169 (SEQ ID NO 283), ARC2171 (SEQ ID NO 293) 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)에 대한 추정 2 차 구조를 도시한 도면이다.

도 6 은 니트로셀룰로즈 필터 결합 분석법을 이용하여 측정한, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 인체 트롬빈에 대한 결합 곡선을 도시한 그래프이다.

도 7 은 니트로셀룰로즈 필터 결합 분석법을 이용하여 측정한, ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 인체, 돼지 및 랫 트롬빈에 대한 결합 곡선을 도시한 그래프이다.

도 8 은 시트레이트화된 인체 혈장을 이용하여 생체외에서 분석한, 프로트롬빈 시간(PT)에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 효과를 비교한 그래프이다.

도 9 는 인체 전혈을 이용하여 생체외에서 분석한, 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 효과를 비교한 그래프이다.

도 10 은 인체 혈장을 이용하여 생체외에서 분석한, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 효과를 비교한 그래프이다.

도 11 은 인체 전혈을 이용한 분석에서 어혈의 응고에 미치는 ARC2172 및 ARC183 의 효과를 비교한 그래프이다.

도 12 는 실시예 4A 에 기술된, 항-트롬빈 앱타머의 랫 정맥내 일시투여(Bolus ; 볼루스) 연구에 대한 실험 연구 디자인을 나타내는 표이다.

도 13 은 정맥내 일시 주사를 통해 1.5 μmole/kg 의 앱타머를 제공받은 랫에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 다양한 크기의 PEG 기가 부착된 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 효과를 비교한 그래프이다.

도 14 는 실시예 4B 에 기술된, 항-트롬빈 앱타머의 랫 정맥내 일시투여 연구에 대한 실험 연구 디자인을 나타내는 표이다.

도 15 는 정맥내 일시 주사를 통해 12.2 mg/kg(ARC2172 (SEQ ID NO 294)) 또는 30 mg/kg(ARC183)의 앱타머를 제공받은 랫에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 효과를 비교한 그래프이다.

도 16 은 정맥내 일시 주사를 통해 12.2 mg/kg(ARC2172 (SEQ ID NO 294)) 및 30 mg/kg(ARC183)의 앱타머를 제공받은 랫에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 효과를 요약한 표이다.

도 17 은 실시예 4C 에 기술된, 랫 신장 결찰 모델에서 항-트롬빈 앱타머의 실험 연구 디자인을 나타내는 표이다.

도 18 은 정맥내 일시 주사를 통해 12.2 mg/kg(ARC2172 (SEQ ID NO 294))을 투여했을 때, 신장 결찰 랫과 샴 수술한 랫 둘 다에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 효과를 비교한 그래프이다.

도 19 는 정맥내 일시 주사를 통해 30 mg/kg(ARC183)을 투여했을 때, 신장 결찰 랫과 샴 수술한 랫 둘 다에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 ARC183 의 효과를 비교한 그래프이다.

도 20 은 정맥내 일시 주사를 통해 0.46 μmole/kg 의 앱타머를 제공받은 사이노몰구스 원숭이에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 항-트롬빈 앱타머 ARC2172 (SEQ ID NO 294), ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2169 (SEQ ID NO 283) 및 ARC2840 (SEQ ID NO 423)의 효과를 요약한 표이다.

도 21 은 정맥내 일시 주사를 통해 0.46 μmole/kg 의 앱타머를 제공받은 사이노몰구스 원숭이에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 항-트롬빈 앱타머 ARC2172 (SEQ ID NO 294), ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2169 (SEQ ID NO 283) 및 ARC2840 (SEQ ID NO 423)의 효과를 비교한 그래프이다.

도 22 는 실시예 4E 에 기술된, 항-트롬빈 앱타머의 원숭이 정맥내 일시 및 점적(infusion) 투여 연구에 대한 실험 연구 디자인을 나타내는 표이다.

도 23 은 1 회 정맥내 일시 주사 후, 1 시간 지속 점적 주사를 통해 투여했을 때, 사이노몰구스 원숭이에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)(2 종의 투여용량) 및 ARC183 의 효과를 비교한 그래프이다.

도 24 는 1 회 정맥내 일시 주사 후, 1 시간 지속 점적 주사를 통해 투여했을 때, 사이노몰구스 원숭이에서 활성 응혈 시간(ACT)에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)(2 종의 투여용량) 및 ARC183 의 효과를 요약한 표이다.

도 25 는 트롬빈-유도된 혈소판 응집 및 ADP-유도된 혈소판 응집에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 효과를 비교한 그래프이다.

도 26 은 혈소판 응집의 아스피린 및 인테그릴린-의존성 저해에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 효과를 비교한 그래프이다.

도 27 은 실시예 5A 에 기술된, 돼지의 심폐 우회 모델에서 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 헤파린에 대한 실험 연구 디자인을 나타내는 표이다.

도 28 은 돼지의 심폐 우회 연구 프로토콜에 대한 개요도이다.

도 29 는 실시예 5A 에 기술된, 개방되고 비-헤파린 결합된 돼지의 심폐 우회 연구에서 사용된 대조용 동물(항응혈제 무처리군)에서 활성 응혈 시간(ACT)을 나타내는 그래프이다.

도 30 은 실시예 5A 에 기술된, 개방되고 비-헤파린 결합된 심폐 우회 연구에 있어 ACT 를 > 400 초로 유지하고자 정맥내 일시 주사를 통해 헤파린을 제공받은 돼지에서 활성 응혈 시간(ACT)을 나타내는 그래프이다.

도 31 은 실시예 5A 에 기술된, 개방되고 비-헤파린 결합된 심폐 우회 연구에 있어 ACT 를 > 400 초로 유지하고자 정맥내 일시 및 점적 주사를 통해 ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 제공받은 돼지에서 활성 응혈 시간(ACT)을 나타내는 그래프이다.

도 32 는 실시예 5A 에 기술된, 개방되고 비-헤파린 결합된 심폐 우회 순환로를 이용한 심폐 우회 모델에서 활성 응혈 시간(ACT)(세로축 상 에 초로 표시)에 미치는 헤파린 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 효과를 비교한 그래프이다.

도 33 은 실시예 5A 에 기술된, 개방되고 비-헤파린 결합된 돼지의 심폐 우회 연구에 사용된 대조용 동물(항응혈제 무처리군)에서 혈장 TAT 복합체의 농도를 나타내는 그래프이다.

도 34 는 실시예 5A 에 기술된, 개방되고 비-헤파린 결합된 심폐 우회 연구에 있어 ACT 를 > 400 초로 유지하고자 정맥내 일시 주사를 통해 헤파린을 제공받은 돼지에서 혈장 TAT 복합체의 농도를 나타내는 그래프이다.

도 35 는 실시예 5A 에 기술된, 개방되고 비-헤파린 결합된 심폐 우회 연구에 있어 ACT 를 > 400 초로 유지하고자 정맥내 일시 및 점적 주사를 통해 ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 제공받은 돼지에서 혈장 TAT 복합체의 농도를 나타내는 그래프이다.

이하 상세한 설명에서는 본 발명의 하나 이상의 실시형태에 관한 세부적인 사항들이 기술되어 있다. 본 발명을 실시 또는 시험함에 있어서, 본원에 개시된 것과 유사하거나 균등한 범위에 속하는 임의의 방법 및 재료들도 사용할 수는 있으나, 이하에서는 바람직한 방법 및 재료에 관하여 설명하고 있다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점들은 본 상세한 설명을 통하여 파악하게 될 것이다. 본 명세서에서 달리 명확하게 특정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 또한 복수 형태를 포함한다. 달리 규정하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 업계의 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 분쟁이 일어날 경우, 그 문제는 본 발명의 명세서에 의해 조정될 것이다.

셀렉스 ™( SELEX ™) 방법

앱타머 제조에 적당한 방법으로는, 일반적으로 도 1 에 도시된 "지수 증식에 의한 리간드의 계통적 진화(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)"("SELEX™")라는 방법을 이용하는 것이 있다. 상기 셀렉스™ 방법은 표적 분자에 고 특이적 결합성을 가진 핵산 분자의 생체외 진화에 대한 방법으로, 이는 예를 들어, 1990 년 6 월 11 일자 제출된 미국 특허 출원 제 07/536,428 호(현재 포기), 미국 특허 제 5,475,096 호(발명의 명칭 : "Nucleic Acid Ligands") 및 미국 특허 제 5,270,163 호(제 WO 91/19813 호 참조)(발명의 명칭 : "Nucleic Acid Ligands")에 개시되어 있다. 앱타머는 이전에 표적에 노출된 바 없는 출발 핵산 라이브러리 또는 풀의 결합 친화도보다 큰 수준의 결합 친화도를 표적 순서별로 보유하고 있으므로, 앱타머는 표적 분자들에 대해 고 특이적 결합성을 가지는 것으로 간주된다. 각각의 셀렉스™-확인 핵산 리간드 즉, 앱타머는 각각 소정의 표적 화합물 또는 분자의 특이적 리간드이다. 셀렉스™ 방법은, 핵산이 다양한 2 차원 및 3 차원 구조를 형성하기에 충분한 능력과, 실질적으로 임의의 화학적 화합물과 함께(단량체 또는 중합체 상관없이) 리간드로서 작용(즉, 특이적 결합 쌍을 형성)하기에 충분한, 단량체 내에서 이용가능한 화학적 다기능성(chemical versatility)을 보유한다는 독특한 통찰력을 바탕으로 한다. 임의의 크기 또는 조성을 갖는 분자가 표적으로 이용될 수 있다.

셀렉스™ 실행의 출발점은 랜덤화된 서열을 포함하는 단일 가닥형 올리고뉴클레오티드의 거대한 라이브러리 또는 풀에 의거한다. 올리고뉴클레오티드는 변형 또는 비변형된 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 풀은 100 % 랜덤하거나 또는 부분적으로 랜덤한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서는, 풀이 랜덤화된 서열 내에 적어도 하나의 고정 서열(fixed sequence) 및/또는 보존 서열(conserved sequence)이 혼입된 랜덤하거나 부분적으로 랜덤한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 풀은 5' 및/또는 3' 단부에 적어도 하나의 고정 서열 및/또는 보존 서열을 함유하는 랜덤하거나 부분적으로 랜덤한 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이 고정 서열 및/또는 보존 서열은 올리고뉴클레오티드 풀의 모든 분자가 공유하는 서열을 포함할 수 있다. 고정 서열은 사전선별용으로 혼입된 풀에 존재하는 올리고뉴클레오티드에 공통된 서열로서, 예를 들어 이하에 추가로 기술되어 있는 CpG 모티프, PCR 프라이머에 대한 하이브리드화 부위, RNA 중합효소(예, T3, T4, T7 및 SP6)에 대한 프로모터 서열, 제한 부위 또는 단일중합체 서열, 예를 들어 폴리 A 또는 폴리 T 트랙, 촉매 중심부, 친화성 컬럼에 선별 결합하는 부위 및 관심 올리고뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 서열결정을 촉진하는 기타 서열이 있다. 보존 서열이란, 전술한 고정 서열 이외에 동일한 표적에 결합하는 다수의 앱타머가 공유하는 서열을 말한다.

풀에 속하는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 효율적인 증폭에 필요한 랜덤화된 서열 부분과 고정된 서열을 포함한다. 통상적으로, 상기 출발 풀의 올리고뉴클레오티드는 30∼50 개의 랜덤한 뉴클레오티드로 이루어진 내부 영역의 측면에 존재하는 고정된 5' 및 3' 말단 서열을 함유한다. 상기 랜덤화된 뉴클레오티드는 화학적 합성 및 랜덤하게 절단된 세포내 핵산의 크기별 선별을 포함한 다수의 방법으로 생산할 수 있다. 시험 핵산 내 서열 변이는 또한 선별/증폭 과정을 반복 실시하기 이전 또는 도중에 돌연 변이 유발법으로 도입하거나 또는 증가시킬 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 랜덤한 서열 부분은 임의의 길이를 가질 수 있으며, 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한 변형 또는 비-천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 참조예 : 미국 특허 제 5,958,691 호 ; 미국 특허 제 5,660,985 호 ; 미국 특허 제 5,958,691 호 ; 미국 특허 제 5,698,687 호 ; 미국 특허 제 5,817,635 호 ; 미국 특허 제 5,672,695 호 및 PCT 공보 제 WO 92/07065호. 랜덤한 올리고뉴클레오티드는 해당 업계에 널리 공지된 고상 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-결합 뉴클레오티드로부터 합성할 수 있다. 참조예 : 문헌[Froehler 외 다수, Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) 및 Froehler 외 다수, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)]. 랜덤한 올리고뉴클레오티드는 또한 트리에스테르 합성 방법과 같은 용액 상 방법을 이용하여 합성할 수도 있다. 참조예 : 문헌[Sood 외 다수, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) 및 Hirose 외 다수, Tet. Lett., 28:2449 (1978)]. 자동화된 DNA 합성 장비를 사용하여 수행한 통상의 합성 결과, 10¹⁴-10¹⁶ 개(대부분의 셀렉스™ 실험에 사용하기에 충분한 수)의 개별 분자들이 생산된다. 서열 디자인에 있어서 랜덤한 서열의 충분히 거대한 영역은 각각의 합성 분자가 독특한 서열을 나타낼 가능성을 높여준다.

올리고뉴클레오티드의 출발 라이브러리는 DNA 합성기 상에서 자동화된 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 랜덤화된 서열을 합성하기 위해서는, 모두 4 종의 뉴클레오티드 혼합물을 합성 과정 중의 각 뉴클레오티드 부가 단계에 첨가하여, 뉴클레오티드가 랜덤하게 혼입될 수 있도록 한다. 전술한 바와 같이, 하나의 실시형태에서, 랜덤한 올리고뉴클레오티드는 전부 랜덤한 서열을 포함하지만 ; 다른 실시형태에서는, 랜덤한 올리고뉴클레오티드가 랜덤하지 않거나 또는 부분적으로 랜덤한 서열 부분을 포함할 수 있다. 부분적으로 랜덤한 서열은 각 부가 단계에서 4 가지 뉴클레오티드를 상이한 몰 비로 첨가함으로써 제조할 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 출발 라이브러리는 RNA 또는 DNA 일 수 있다. RNA 라이브러리를 출발 라이브러리로 사용한 경우에는 통상적으로 T7 RNA 중합효소 또는 변형된 T7 RNA 중합효소를 사용하여 DNA 라이브러리를 시험관 내에서 전사시켜 출발 라이브러리를 생산하고 정제한다. 이후 RNA 또는 DNA 라이브러리는 결합에 유리한 조건 하에서 표적과 혼합하고, 동일한 일반 선별 과정을 이용한 결합, 분획화 및 증폭으로 이루어진 단계별 과정을 반복 수행함으로써, 실질적으로 목적하는 임의 기준의 결합 친화도 및 선택성을 달성한다. 더욱 구체적으로, 핵산의 출발 풀을 함유하는 혼합물로 출발하는, 셀렉스™ 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 결합에 유리한 조건 하에서 표적과 상기 혼합물을 접촉시키는 단계 ; (b) 표적 분자에 특이적으로 결합한 핵산으로부터 미결합 핵산을 분획화하는 단계 ; (c) 핵산-표적 복합체를 해리시키는 단계 ; (d) 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭시켜 핵산의 리간드-풍부 혼합물을 수득하는 단계 ; 및 (e) 표적 분자에 대하여 고 특이적, 고 친화성인 핵산 리간드를 수득할 수 있을 정도로 결합, 분획화, 해리 및 증폭 단계들을 수회 반복하는 단계. RNA 앱타머를 선별하고자 하는 경우, 셀렉스™ 방법은 다음과 같은 단계들을 추가로 포함하게 된다 : (i) 상기 (d) 단계에서 증폭 이전에 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 역 전사시키는 단계 ; 및 (ii) 본 방법을 재개하기 이전에 상기 (d) 단계로부터 수득한 증폭 핵산을 전사시키는 단계.

다수의 가능한 서열 및 구조를 포함하는 핵산 혼합물 내에는, 소정의 표적에 대해 광범위한 결합 친화도가 존재한다. 예를 들어, 20 개의 뉴클레오티드 랜덤화 절편을 포함하는 핵산 혼합물은 4²⁰ 가지의 후보자가 가능하다. 표적에 대해 상대적으로 높은 친화도를 가진 것들이 표적에 가장 잘 결합하게 된다. 분획화, 해리 및 증폭 이후, 결합 친화도가 높아진 후보자로 제 2 핵산 혼합물이 생성되고, 풍부해진다. 생성된 핵산 혼합물이 주로 1 종 또는 소수 종으로만 구성될 때까지 선별 과정을 추가 실시하는 것이 점진적으로 최상의 리간드를 수득하는데 유리하다. 이후 리간드를 클로닝하고, 서열결정한 후, 이를 정제된 리간드 또는 앱타머로서 결합 친화도에 대해 개별 시험할 수 있다.

선별 및 증폭 주기는 원하는 목적을 달성할 때까지 반복 수행한다. 대부분의 경우에 있어서는, 주기의 반복 수행으로 결합 강도의 유의적 증가가 달성되지 않는 시점까지 선별/증폭 과정을 계속 수행한다. 이 방법은 통상적으로 대략 10¹⁴ 개의 상이한 핵산 종의 샘플을 얻을 수 있을 때까지 수행되지만, 약 10¹⁸ 개의 상이한 핵산 종의 샘플을 얻을 수 있을 때까지도 사용될 수 있다. 일반적으로, 핵산 앱타머 분자는 5 내지 20 주기 반복 수행시 선별된다. 하나의 실시형태에서, 이종성은 초기의 선별 단계에서만 도입되며, 방법을 반복 수행하는 동안에는 나타나지 않는다.

셀렉스™ 에 대한 하나의 실시형태에서, 선별 과정은 선별된 표적에 매우 강력하게 결합하는 핵산 리간드를 분리하는 데에 효율적이어서, 선별 및 증폭 과정은 단지 1 회 주기만이 요구된다. 이와 같이 효율적인 선별은 예를 들면, 크로마토그래피-형 방법에서 이루어질 수 있는데, 이때 컬럼에 결합된 표적과 결합할 수 있는 핵산의 능력은, 최고의 친화도를 가진 핵산 리간드를 충분히 분리 및 단리할 수 있는 컬럼의 능력에 따른 방식으로 발휘된다.

대다수의 경우, 단일의 핵산 리간드가 확인될 때까지 셀렉스™ 단계들을 반복 수행하는 것이 반드시 바람직하다고는 할 수 없다. 고 표적-특이성의 핵산 리간드 용액은 다수의 보존 서열과 핵산 리간드의 표적에 대한 친화도에 거의 영향을 미치지 않도록 치환 또는 부가될 수 있는 다수의 서열을 보유하는 핵산 구조 또는 모티프 군을 포함할 수 있다. 셀렉스™ 과정을 완결 전에 종료함으로써, 핵산 리간드 용액 군에 속하는 일원의 서열을 다수 결정할 수 있다.

핵산은 다양한 1 차, 2 차 및 3 차 구조가 존재하는 것으로 공지되어 있다. 비 왓슨-크릭형 상호작용에 관여하는 것으로 가장 보편적으로 규명된 구조 또는 모티프를 헤어핀 루프, 대칭 및 비대칭 돌출부(bulge), 유사매듭(pseudoknot) 구조 및 이들의 다수 조합 구조라 지칭한다. 이러한 모티프 중 공지된 거의 대부분은 30 개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 핵산 서열로서 형성될 수 있다고 한다. 이러한 이유로, 약 20 내지 약 50 개의 뉴클레오티드로 이루어진 그리고, 몇몇 경우에 있어서는 약 30 내지 약 40 개의 뉴클레오티드로 이루어진 랜덤화 절편을 함유하는 핵산 서열을 사용하여, 연속 랜덤화 절편을 이용한 셀렉스™ 방법을 개시하는 것이 종종은 바람직하다. 하나의 실시예에서, 5'-고정:랜덤:3'-고정 서열은 약 30 내지 약 50 개의 뉴클레오티드로 이루어진 랜덤한 서열을 포함한다.

코어 셀렉스™ 방법은 다수의 특정 목적을 달성하고자 변형되었다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,707,796 호에는 셀렉스™ 를 겔 전기영동법과 함께 병행함으로써 만곡형 DNA(bent DNA)와 같이 특이한 구조적 특성을 갖는 핵산 분자를 선별하는 것이 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,763,177 호는 표적 분자에 결합 및/또는 광-가교되고/되거나 이 표적 분자를 광-불활성화시킬 수 있는 광 반응성 기를 함유하는 핵산 리간드를 선별하는데에 사용되는 셀렉스™ 에 의거한 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제 5,567,588 호 및 미국 특허 제 5,861,254 호에는 표적 분자에 대한 친화도가 높고 낮은 올리고뉴클레오티드를 매우 효율적으로 분획화할 수 있는 셀렉스™ 의거한 방법이 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,496,938 호는 셀렉스™ 방법을 수행한 이후에 향상된 핵산 리간드를 얻는 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제 5,705,337 호에는 표적에 리간드를 공유 결합시키는 방법이 기술되어 있다.

셀렉스™ 는 또한 표적 분자 상에 하나 이상의 부위에 결합하는 핵산 리간드를 수득하고, 표적 상에 존재하는 특정 부위에 결합하는 비-핵산 종을 포함하는 핵산 리간드를 수득하는데에 사용될 수도 있다. 셀렉스™ 는 임의의 상상가능한 표적 예를 들어, 핵산-결합 단백질 및 생물학적 기능을 갖는 분자의 일부와 보조인자로서 핵산에 결합하는 것으로 공지되어 있지 않은 단백질, 그리고 기타 소형 분자와 같은 대형 및 소형 생체분자에 결합하는 핵산 리간드를 분리 및 확인하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,580,737 호에는 카페인 및 이와 밀접하게 관련된 유사체인 테오필린에 고 친화도로 결합할 수 있는 핵산 서열을 셀렉스™ 를 통하여 확인하는 것이 개시되어 있다.

카운터-셀렉스™ 는 하나 이상의 비-표적 분자에 대한 가교-반응성을 갖는 핵산 리간드 서열을 제거함으로써 표적 분자에 대한 핵산 리간드의 특이성을 개선시키는 방법이다. 카운터-셀렉스™ 는 다음의 단계들로 이루어진다 : (a) 핵산의 후보 혼합물을 제조하는 단계 ; (b) 후보 혼합물과 표적을 접촉시키는 단계로서, 후보 혼합물 대비 표적에 대한 친화도가 증가된 핵산을 나머지 후보 혼합물로부터 분획화할 수 있는 것인 단계 ; (c) 나머지 후보 혼합물로부터 친화도가 증가된 핵산을 분획화하는 단계 ; (d) 표적으로부터 친화도가 증가된 핵산을 해리시키는 단계 ; (e) 친화도가 증가된 핵산과 하나 이상의 비-표적 분자들을 접촉시켜, 비-표적 분자(들)에 대한 고 특이적 친화도를 갖는 핵산 리간드가 제거되도록 하는 단계; 및 (f) 표적 분자에 대해서만 고 특이적 친화도를 갖는 핵산을 증폭시켜, 표적 분자에 대한 결합 친화도 및 특이성이 비교적 높은 핵산 서열이 풍부한 핵산 혼합물을 수득하는 단계. 상기 셀렉스™ 에 관하여 기술된 바와 같이, 선별 및 증폭 주기는 원하는 목적이 달성되는 시점까지 필요에 따라 반복 수행한다.

핵산을 치료제 및 백신으로 사용함에 있어서 당면할 수 있는 문제점 중 하나는, 포스포디에스테르 형태인 올리고뉴클레오티드가 목적하는 효과를 얻기 이전에 세포내 및 세포외 효소 예를 들어, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의해 체액 중에서 급속하게 분해될 수 있다는 점이다. 그러므로, 셀렉스™ 방법은 리간드에 개선된 특징 예를 들면, 개선된 생체 내 안정성 또는 개선된 전달 특성을 부여하는 변형 뉴클레오티드를 함유하는 고-친화성 핵산 리간드를 확인하는 단계를 포함한다. 이러한 변형의 예로는 당 및/또는 인산염 및/또는 염기 위치에서 일어나는 화학적 치환이 포함된다. 변형 뉴클레오티드를 함유하는 셀렉스™-동정된 핵산 리간드에 관하여는 예를 들어, 리보즈의 2 번 위치, 피리미딘의 5 번 위치 및 퓨린의 8 번 위치가 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있는 미국 특허 제 5,660,985 호, 다양한 2'-변형 피리미딘을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있는 미국 특허 제 5,756,703 호 및 2'-아미노(2'-NH₂), 2'-플루오로(2'-F) 및/또는 2'-O-메틸(2'-OMe) 치환체로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 고 특이성 핵산 리간드를 개시하고 있는 미국 특허 제 5,580,737 호에 기술되어 있다.

본 발명에서 고려되는 핵산 리간드의 변형으로는 핵산 리간드 염기 또는 전체 핵산 리간드에 부가 하전, 편극성, 소수성, 수소 결합, 정전기적 상호작용 및 유동성을 부여하는 기타 화학적 작용기를 제공하는 것이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뉴클레아제에 내성인 올리고뉴클레오티드 군집을 생산하는 변형으로는 또한 하나 이상의 치환 뉴클레오티드간 결합, 변형된 당, 변형된 염기 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 이러한 변형으로서는 2'-위치 당 변형, 5'-위치 피리미딘 변형, 8'-위치 퓨린 변형, 외향(exocyclic) 아민의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요도-우라실의 치환, 골격 변형, 포스포로티오에이트 또는 알킬 포스페이트 변형, 메틸화 및 비정상적 염기-쌍 형성 조합 예를 들어, 이소염기(isobase)인 이소시티딘과 이소구아노신의 조합이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 변형은 또한 캡핑과 같은 3' 및 5' 변형을 포함할 수도 있다.

하나의 실시형태에서, P(O)O 기가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), P(O)NR₂("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂("포름아세탈") 또는 3'-아민(-NH-CH₂-CH₂-) (여기에서, 각각의 R 또는 R' 는 독립적으로 H 이거나, 치환 또는 비치환 알킬임)로 치환된 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 결합기는 -O-, -N- 또는 -S- 결합을 통하여 인접 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 본원에 사용된 포스포로티오에이트란 용어는 포스포디에스테르 결합 내에 하나 이상의 비-가교성 산소 원자가 하나 이상의 황 원자로 치환된 것을 의미한다.

추가의 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 기를 포함하는 것으로, 예를 들면 히드록실기 중 하나 이상이 할로겐 또는 지방족 기로 치환되거나, 또는 에테르나 아민으로 작용기화된다. 하나의 실시형태에서는, 푸라노즈 잔기의 2'-위치가 O-메틸, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴 또는 할로 기 중 임의의 것으로 치환된다. 2'-변형 당의 합성 방법에 관하여는 예를 들어, 문헌 [Sproat 외 다수, Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Cotten 외 다수, Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); 및 Hobbs 외 다수, Biochemistry 12:5138-5145 (1973)]에 개시되어 있다. 기타 다른 변형도 해당 업계의 전문가에게 공지되어 있다. 이러한 변형은 사전-셀렉스™ 방법 변형 또는 사후-셀렉스™ 방법 변형(사전 동정된 비변형 리간드의 변형)일 수 있거나, 또는 셀렉스™ 방법으로의 통합에 의해 이루어질 수 있다.

사전-셀렉스™ 방법 변형 또는 셀렉스™ 방법으로의 통합에 의해 이루어진 변형을 통하여, 셀렉스™ 표적에 대한 특이성이 높고 안정성(예, 생체내 안정성)이 개선된 핵산 리간드가 수득된다. 사후-셀렉스™ 방법 변형은 핵산 리간드 적용 결과, 핵산 리간드의 결합능에는 악영향을 미치지 않으면서도 안정성(예, 생체내 안정성)이 개선되는 효과를 얻을 수 있다.

셀렉스™ 방법은 미국 특허 제 5,637,459 호 및 미국 특허 제 5,683,867 호에 개시된 바와 같이, 선별된 올리고뉴클레오티드를 기타 선별된 올리고뉴클레오티드 및 비-올리고뉴클레오티드 작용 단위와 함께 배합하는 것을 포함한다. 셀렉스™ 방법은 또한 예를 들어, 미국 특허 제 6,011,020 호, 미국 특허 제 6,051,698 호 및 PCT 공보 제 WO 98/18480 호에 개시된 바와 같이, 진단용 또는 치료용 복합체 중의 친유성 또는 비-면역원성 고 분자량 화합물과 선별된 핵산 리간드를 배합하는 것을 추가로 포함한다. 상기 특허 및 출원들은, 형태의 광범위한 어레이와 기타 특성들을, 올리고뉴클레오티드의 효율적인 증폭 및 복제 특성, 그리고 기타 분자의 바람직한 특성과 조합하는 것에 관하여 교시하고 있다.

가요성의 소형 펩티드에 대한 핵산 리간드를 동정하는 방법 또한 셀렉스™ 방법을 통하여 개발된 바 있다. 소형 펩티드는 가요성 구조를 가지며, 일반적으로 용액 중에서는 다수의 이형태체(conformer)가 평형을 이루며 존재하므로, 처음에는 가요성 펩티드 결합 시, 형태 엔트로피(conformational entropy) 소실에 의해 결합 친화도가 제한될 수도 있을 것으로 추정되었다. 그러나, 용액 중에서 소형 펩티드에 대한 핵산 리간드를 동정하는 방법에 대한 실행가능성은 미국 특허 제 5,648,214 호에서 입증되었다. 이 특허에 따르면, 11 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드인 물질 P 에 대한 고 친화성 RNA 핵산 리간드가 동정되었다.

본 발명의 표적(들)에 대해 고 특이성 및 결합 친화도를 갖는 앱타머는 통상적으로 본원에 기술된 바와 같이 셀렉스™ 방법에 의해 선별된다. 셀렉스™ 방법의 일환으로, 표적에 결합하는 것으로 선별된 서열은 결합 친화도를 가진 최소 서열 결정을 위해 이후 임의로 최소화된다. 선별된 서열 및/또는 최소화된 서열은 서열의 랜덤 또는 유도된 돌연변이유발을 수행함으로써 임의로 최적화하여 결합 친화도를 증가시키거나 또는 대안적으로 결합 활성에 필수적인 서열 내 위치를 결정한다. 또한, 선별은 생체내에서 앱타머 분자가 분해에 대해 안정하도록 변형된 뉴클레오티드가 혼입된 서열을 이용하여 수행할 수 있다.

2'-변형 셀렉스 ™

앱타머를 치료제로서 사용하기에 적합한 것으로 만들기 위해서는, 합성 비용이 적게 들고, 생체내에서 안전하며 안정된 앱타머가 바람직하다. 야생형 RNA 및 DNA 앱타머는 뉴클레아제에 의한 분해에 민감하므로 통상적으로 생체내에서 불안정하다. 뉴클레아제 분해에 대한 내성은, 2'-위치에 변형 기를 혼입시킴으로써 크게 증대시킬 수 있다.

플루오로 및 아미노 기는 이후 앱타머가 선별되는 올리고뉴클레오티드 풀 내로 성공적으로 혼입되었던 바 있다. 그러나, 이러한 변형은 결과물인 앱타머의 합성 비용을 증가시키며, 변형 올리고뉴클레오티드가 분해되고 이후 DNA 합성에 대한 기질로서 이 뉴클레오티드가 사용됨으로써 변형 뉴클레오티드가 숙주 DNA 로 재활용될 가능성으로 인해, 몇몇 경우에 있어서는 안전성에 관한 문제점이 제기될 수도 있다.

2'-O-메틸("2'-OMe") 뉴클레오티드를 함유하는 앱타머는 본원에서 제공된 바와 같이, 이와 같은 다수의 단점들을 극복한 것이다. 2'-OMe 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제-내성이며, 합성 비용이 저렴하다. 2'-OMe 뉴클레오티드가 생물계에 널리 존재하고는 있지만, 천연 중합효소는 생리적 조건 하에서 기질로서 2'-OMe NTP 를 받아들이지 않기 때문에, 2'-OMe 뉴클레오티드가 숙주 DNA 로 재활용되는 것과 관련한 안전성의 문제점은 발생하지 않는다. 2'-변형된 앱타머를 생산하는 데에 사용되는 셀렉스™ 방법에 관해서는 예를 들어, 2002 년 12 월 3 일자 제출된 미국 가특허 출원 제 60/430,761 호, 2003 년 7 월 15 일자 제출된 미국 가특허 출원 제 60/487,474 호, 2003 년 11 월 4 일자 제출된 미국 가특허 출원 제 60/517,039 호, 2003 년 12 월 3 일자 제출된 미국 특허 출원 제 10/729,581 호 및 2004 년 6 월 21 일자 제출된 미국 특허 출원 제 10/873,856 호(발명의 명칭 : "Method for in vitro Selection of 2'-O-methyl Substituted Nucleic Acids")에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.

본 발명은 트로빈에 결합하여 이의 기능을 감소 또는 저해하는 것으로, 올리고뉴클레오티드를 효소 및 화학적 분해, 그리고 열 및 물리적 분해에 대해 비변형 올리고뉴클레오티드 보다 더 안정적으로 만드는 변형 뉴클레오티드(예, 2' 위치가 변형된 뉴클레오티드)를 함유하는 앱타머를 포함한다. 문헌[참조예, Green 외 다수, Current Biology 2, 683-695, 1995]에 2'-OMe 함유 앱타머의 몇몇 일례가 개시되어 있기는 하지만, 이러한 앱타머는 C 및 U 잔기가 2'-플루오로(2'-F) 치환되고, A 및 G 잔기가 2'-OH 인 변형 전사체 라이브러리를 생체외 선별에 의해 생산한 것이었다. 일단 기능성 서열이 확인되면, 각각의 A 및 G 잔기를 2'-OMe 치환에 대한 내성에 관하여 시험하고, 모든 A 및 G 잔기가 2'-OMe 치환을 2'-OMe 잔기로서 허용하는 앱타머를 재합성하였다. 이와 같은 2-단계 방식으로 생성된 앱타머 중 대부분의 A 및 G 잔기는 평균적으로 대략 20 % 를 제외하고는 2'-OMe 잔기와의 치환을 허용한다. 결과적으로 이 방법을 이용하여 생성된 앱타머는 2 내지 4 개의 2'-OH 잔기를 함유하는 경향이 있으며, 안정성 및 합성 비용도 결과적으로 타협된다. 앱타머가 선별되는 올리고뉴클레오티드 풀에서 사용되어 셀렉스™(및/또는 본원에 기술된 것을 포함한 변형안 및 개선안 중 임의의 방법)에 의해 증량되는, 안정화된 올리고뉴클레오티드를 생산하는 전사 반응 내로 변형 뉴클레오티드를 혼입시킴으로써, 본 발명의 방법에서는 (예, 변형 뉴클레오티드를 사용하여 앱타머 올리고뉴클레오티드를 재합성함으로써) 선별된 앱타머 올리고뉴클레오티드를 안정화시킬 필요성이 없어진다.

하나의 실시형태에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시 및 2'-0Me 변형을 조합하여 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-0Me, 2'-NH₂ 및 2'-메톡시에틸 변형을 조합하여 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-0Me, 2'-NH₂ 및 2'-메톡시에틸 변형을 5⁶ 가지 조합하여 포함하는 앱타머를 제공한다.

본 발명의 2'-변형 앱타머는 푸라노즈 2' 위치에 대형의 치환체를 가진 변형 뉴클레오티드의 혼입율이 야생형 중합효소의 경우보다 높은 변형 중합효소(예, 변형 T7 중합효소)를 사용하여 제작한다. 예를 들어, 639 번 위치에 존재하는 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 변경된 단일 돌연변이 T7 중합효소(Y639F)는 2'-데옥시, 2'-아미노- 및 2'-플루오로-뉴클레오티드 트리포스페이트(NTPs)를 기질로서 용이하게 이용하므로, 다양한 분야에서 변형 RNA 를 합성하는데에 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 이 돌연변이 T7 중합효소는 2'-OMe 또는 2'-아지도(2'-N₃) 치환체 같은 대형의 2'-치환체를 가진 NTP 를 용이하게 이용(즉, 혼입)할 수 없다. 대형의 2'-치환체의 혼입을 위해서는, Y639F 돌연변이 외에, 784 번 위치의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변경된 이중 T7 중합효소 돌연변이체(Y639F/H784A)가 제한된 환경 하에서 변형 피리미딘 NTP 를 혼입하는데에 사용된다고 개시된 바 있다. 참조 문헌 : [Padilla, R. and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138]. 784 번 위치의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변경된 단일 돌연변이 T7 중합효소(H784A)도 또한 개시된 바 있다. 참조 문헌 : [Padilla 외 다수, Nucleic Acids Research, 2002, 30:138]. Y639F/H784A 이중 돌연변이 및 H784A 단일 돌연변이 T7 중합효소 양자 모두에서는 알라닌과 같은 소형 아미노산 잔기로의 변경으로 보다 대형의 뉴클레오티드 기질(예, 2'-OMe 치환 뉴클레오티드)의 혼입이 가능해진다.

일반적으로, 본원에 개시된 조건 하에서, Y693F 단일 돌연변이체가 GTP 를 제외한 모든 2'-OMe 치환 NTP 의 혼입에 사용될 수 있으며, Y639F/H784A 이중 돌연변이체는 GTP 를 포함한 모든 2'-OMe 치환 NTP 의 혼입에 사용될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. H784A 단일 돌연변이체는 본원에 개시된 조건 하에서 사용될 때, Y639F 및 Y639F/H784A 돌연변이체와 유사한 특성을 보유하는 것으로 추정된다.

2'-변형된 올리고뉴클레오티드는 전체가 변형된 뉴클레오티드로 이루어지도록 또는 변형된 뉴클레오티드의 서브세트를 포함하도록 합성할 수 있다. 변형은 동일 또는 상이한 것일 수 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있으며, 또한 동일한 변형을 포함할 수 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있지만, 상이한 변형을 포함할 수도 있는데, 예를 들면 동일한 염기를 함유하는 모든 뉴클레오티드는 한 가지 유형의 변형을 가질 수 있는 반면에, 다른 염기를 함유하는 뉴클레오티드는 상이한 유형의 변형을 보유할 수 있다. 모든 퓨린 뉴클레오티드는 한 가지 유형의 변형을 가질 수 있는 반면에(또는 비변형되는 반면에), 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 기타 상이한 유형의 변형을 보유한다(또는 비변형된다). 이러한 방식으로, 전사체 또는 전사체 풀은, 예를 들어 리보뉴클레오티드(2'-OH), 데옥시리보뉴클레오티드(2'-데옥시), 2'-F 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 변형을 조합 적용함으로써 생산된다. 2'-0Me C 및 U 와 2'-OH A 및 G 를 함유하는 전사 혼합물을 "rRmY" 혼합물이라 지칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "rRmY" 앱타머라 지칭한다. 데옥시 A 및 G 와 2'-0Me U 및 C 를 함유하는 전사 혼합물을 "dRmY" 혼합물이라 지칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "dRmY" 앱타머라 지칭한다. 2'-0Me A, C 및 U 와, 2'-OH G 를 함유하는 전사 혼합물을 "rGmH" 혼합물이라 지칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "rGmH" 앱타머라 지칭한다. 2'-0Me A, C, U 및 G 와, 2'-0Me A, U 및 C, 그리고 2'-F G 를 대안적으로 함유하는 전사 혼합물을 "대안용 혼합물(alternating mixture)"이라 지칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "대안용 혼합물" 앱타머라 지칭한다. 2'-0Me A, U, C 및 G 를 함유하는 전사 혼합물로서, G 의 10 % 이하가 리보뉴클레오티드인 것을 "r/mGmH" 혼합물이라 지칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "r/mGmH" 앱타머라 지칭한다. 2'-0Me A, U 및 C 와, 2'-F G 를 함유하는 전사 혼합물을 "fGmH" 혼합물이라 지칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "fGmH" 앱타머라 지칭한다. 2'-0Me A, U 및 C 와, 데옥시 G 를 함유하는 전사 혼합물을 "dGmH" 혼합물이라 지칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "dGmH" 앱타머라 지칭한다. 데옥시 A 와, 2'-0Me C, G 및 U 를 함유하는 전사 혼합물을 "dAmB" 혼합물이라 지칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "dAmB" 앱타머라 지칭하며, 모든 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하는 전사 혼합물을 "rN" 혼합물이라 지칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "rN" 또는 "rRrY" 앱타머라 지칭한다. "mRmY" 앱타머는 모두 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 함유하는 것으로, 가능한 경우 임의의 2'-OH G 를 2'-OMe G 로 사후-셀렉스™ 치환함으로서 r/mGmH 올리고뉴클레오티드로부터 일반적으로 유도된다.

바람직한 실시형태는 2'-OH, 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 임의로 조합하여 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태는 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 임의로 조합하여 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시형태는 피리미딘이 2'-0Me 인 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 임의로 조합한 것이다(예, dRmY, mRmY 또는 dGmH).

본 발명의 앱타머 내로 변형된 뉴클레오티드를 혼입하는 것은 (사전-) 선별 방법(예, 사전-셀렉스™ 방법 변형) 수행 이전에 이루어진다. 임의로, 변형 뉴클레오티드가 사전-셀렉스™ 방법 변형에 의해 혼입된 본 발명의 앱타머는 사후-셀렉스™ 방법 변형(즉, 사전-셀렉스™ 변형 이후 수행되는 사후-셀렉스™ 방법 변형)에 의해 추가로 변형될 수도 있다. 사전-셀렉스™ 방법 변형 결과, 셀렉스™ 표적에 대한 특이성이 높고, 생체 내 안정성이 개선된 변형 핵산 리간드가 수득된다. 사후-셀렉스™ 방법 변형 즉, 변형(예, 사전-셀렉스™ 방법 변형에 의해 혼입된 뉴클레오티드를 가진 이미 동정된 리간드의 절단, 결실, 치환 또는 부가적 뉴클레오티드 변형)은 사전-셀렉스™ 방법 변형에 의해 혼입된 뉴클레오티드를 가진 핵산 리간드의 결합능에 악영향을 미치지 않으면서 생체내 안정성을 추가로 개선시킬 수 있다.

중합효소가 2'-변형 NTP 를 수용하는 조건 하에서, 2'-변형(예, 2'-0Me) RNA 전사체의 풀을 생성하기 위해, 바람직한 중합효소는 Y639F/H784A 이중 돌연변이체 또는 Y693F 단일 돌연변이체이다. 기타 중합효소, 특히 대형의 2'-치환체에 대해 고 허용성(tolerance)을 나타내는 것도 또한 본 발명에 사용할 수 있다. 이러한 중합효소는 본원에 개시된 전사 조건 하에서 변형 뉴클레오티드의 혼입 능력을 분석함으로써 그 능력을 스크리닝할 수 있다.

다수의 요인들이 본원에 개시된 방법에 유용한 전사 조건에 중요한 것으로 판단되었다. 예를 들면, 결과되는 전사체의 적어도 처음 약 6 개의 잔기가 모두 퓨린이 되도록, 리더 서열이 DNA 전사 주형의 5' 단부에 있는 고정 서열의 5' 단부 내로 혼입될 때, 변형 전사체의 수율이 증가되는 것으로 관찰되었다.

변형 뉴클레오티드가 혼입된 전사체를 수득하는데 있어서 다른 중요한 요인은 2'-OH GTP 의 존재 또는 농도이다. 전사는 2 단계로 구분될 수 있다 : 제 1 기는 NTP 가 GTP 의 3'-히드록실 단부(또는 기타 치환 구아노신)에 첨가되어, 추후 약 10∼12 개의 뉴클레오티드로까지 연장되는 디뉴클레오티드를 생성하는 개시 단계이고 ; 제 2 기는 처음 약 10∼12 개의 뉴클레오티드가 첨가된 이후 전사가 진행되는 연장 단계이다. 과량의 2'-0Me GTP 를 함유하는 전사 혼합물에 첨가되는 2'-OH GTP 는 소량이라도 중합효소가 2'-OH GTP 를 이용하여 전사를 개시할 수 있도록 하는데에 충분하지만, 일단 전사가 연장 단계에 진입하게 되면 2'-0Me GTP 및 2'-OH GTP 간의 구별능력 감소와 2'-OH GTP 와 비교하여 과량으로 존재하는 2'-0Me GTP 로 인해 주로 2'-0Me GTP 의 혼입이 이루어진다.

2'-OMe 치환 뉴클레오티드를 전사체 내로 혼입하는데 있어서 또 다른 중요한 요인은 전사 혼합물 중에 2 가의 마그네슘 및 망간 둘 다를 사용하는 것이다. 염화 마그네슘 및 염화 망간 농도의 상이한 조합은 2'-O-메틸화 전사체의 수율에 영향을 주는 것으로 밝혀졌는데, 이때 염화 마그네슘 및 염화 망간의 최적 농도는 2 가의 금속 이온을 복합체화시키는 NTP 의 전사 반응 혼합물 중의 농도에 따라 좌우된다. 최대한으로 2' 치환된 O-메틸화 전사체(즉, 모든 A, C 및 U 와, G 뉴클레오티드의 약 90 %)의 최고 수율을 얻기 위해서는, 각 NTP 가 0.5 mM 의 농도로 존재시 염화 마그네슘의 농도는 약 5 mM 이고, 염화 망간의 농도는 약 1.5 mM 인 것이 바람직하다. 각 NTP 농도가 1.0 mM 일 때, 염화 마그네슘의 농도는 약 6.5 mM 이고, 염화 망간의 농도는 약 2.0 mM 인 것이 바람직하다. 각 NTP 의 농도가 2.0 mM 인 경우에는, 염화 마그네슘의 농도가 약 9.6 mM 이고, 염화 망간의 농도가 약 2.9 mM 인 것이 바람직하다. 임의의 경우에 있어서, 상기 농도들을 2 배까지 조절하면, 상당량의 변형 전사체가 수득된다.

GMP 또는 구아노신을 사용하여 전사를 프라이밍(priming)하는 것 또한 중요하다. 이러한 효과는 개시 뉴클레오티드에 대한 중합효소의 특이성으로부터 유래한다. 결과적으로, 이러한 방식으로 생성된 전사체의 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-OH G 일 가능성이 높다. GMP(또는 구아노신)의 바람직한 농도는 0.5 mM 이고, 더욱 바람직한 농도는 1 mM 이다. 또한, PEG, 바람직하게는 PEG-8000 이 전사 반응물에서 변형 뉴클레오티드의 혼입을 극대화시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다.

2'-0Me ATP(100%), UTP(100%), CTP(100%) 및 GTP(~ 90%)("r/mGmH")를 전사체 내로 최대 혼입하기 위해서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다 : HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), 트리톤 X-100 0.01 %(w/v), MgCl₂ 5 mM(각 2'-OMe NTP 농도가 1.0 mM 인 경우, 6.5 mM), MnCl₂ 1.5 mM(각 2'-OMe NTP 농도가 1.0 mM 인 경우, 2.0 mM), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(더욱 바람직하게는, 1.0 mM), 2'-OH GTP 30 μM, 2'-OH GMP 500 μM, pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 중합효소 15 유닛/㎖, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 및 적어도 8 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열. 본원에 사용된 Y639F/H784A 돌연변이 T7 RNA 중합효소(또는 본원에 명시된 임의의 기타 돌연변이 T7 RNA 중합효소) 1 유닛은, r/mGmH 조건 하에서 2'-OMe NTP 1 nmole 을 전사체 내로 혼입시키는데 필요한 효소의 양으로서 정의된다. 본원에 사용된, 무기 피로포스파타제 1 유닛은 pH 7.2 및 25 ℃ 에서 1 분 당 무기 오르토포스페이트를 1.0 몰 방출시키게 되는 효소의 양으로서 정의된다.

2'-OMe ATP, UTP 및 CTP("rGmH")를 전사체 내로 최대(100 %) 혼입시키기 위해서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다 : HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10 %(w/v), 트리톤 X-100 0.01%(w/v), MgCl₂ 5 mM(각 2'-OMe NTP 농도가 2.0 mM 인 경우, 9.6 mM), MnCl₂ 1.5 mM(각 2'-OMe NTP 농도가 2.0 mM 인 경우, 2.9 mM), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(더욱 바람직하게는, 2.0 mM), pH 7.5, Y639F T7 RNA 중합효소 15 유닛/㎖, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 및 적어도 8 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열.

2'-0Me UTP 및 CTP("rRmY")를 전사체 내로 최대(100 %) 혼입시키기 위해서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다 : HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10 %(w/v), 트리톤 X-100 0.01 %(w/v), MgCl₂ 5 mM(각 2'-OMe NTP 농도가 2.0 mM 인 경우, 9.6 mM), MnCl₂ 1.5 mM(각 2'-OMe NTP 농도가 2.0 mM 인 경우, 2.9 mM), 2'-0Me NTP(각각) 500μM(더욱 바람직하게는, 2.0 mM), pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 중합효소 15 유닛/㎖, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 및 적어도 8 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열.

데옥시 ATP 및 GTP 와, 2'-0Me UTP 및 CTP("dRmY")를 전사체 내로 최대(100 %) 혼입시키기 위해서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다 : HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10 %(w/v), 트리톤 X-100 0.01%(w/v), MgCl₂ 9.6 mM, MnCl₂ 2.9 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 중합효소 15 유닛/㎖, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 및 적어도 8 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열.

2'-OMe ATP, UTP 및 CTP 와, 2'-F GTP("fGmH")를 전사체 내로 최대(100 %) 혼입시키기 위해서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다 : HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10 %(w/v), 트리톤 X-100 0.01%(w/v), MgCl₂ 9.6 mM, MnCl₂ 2.9 mM, 2'-0Me NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 중합효소 15 유닛/㎖, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 및 적어도 8 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열.

데옥시 ATP 와, 2'-OMe UTP, GTP 및 CTP ("dAmB")를 전사체 내로 최대(100 %) 혼입시키기 위해서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다 : HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10 %(w/v), 트리톤 X-100 0.01%(w/v), MgCl₂ 9.6 mM, MnCl₂ 2.9 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 중합효소 15 유닛/㎖, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 및 적어도 8 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열.

상기 각 조건에 있어서, (a) 전사는 약 20 ℃ 내지 약 50 ℃, 바람직하게는 약 30 ℃ 내지 45 ℃ 및 더욱 바람직하게는 약 37 ℃의 온도에서 적어도 2 시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, (b) 50∼300 nM 의 이중 가닥형 DNA 전사 주형을 사용한다(다양성 증대를 위해 라운드 1 에 200 nM 주형을 사용(dRmY 전사의 경우에는 300 nM 주형을 사용)하고, 후속 라운드에서는 약 50 nM 의 최적화 PCR 반응물의 1/10 배 희석액(본원에 기술된 조건 이용)을 사용한다). 바람직한 DNA 전사 주형이 이하에 제시되어 있다(ARC254 및 ARC256 가 모든 2'-OMe 조건 하에서 전사되며 ARC255 가 rRmY 조건 하에서 전사되는 경우).

본 발명의 rN 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2'-OH 구아노신 트리포스페이트(GTP), 2'-OH 시티딘 트리포스페이트(CTP) 및 2'-OH 우리딘 트리포스페이트(UTP)를 포함한다. 본 발명의 rN 전사 혼합물을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-OH 시티딘 및 2'-OH 우리딘을 모두 포함한다. rN 전사에 대한 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-OH 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사에 대한 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-OH 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사에 대한 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-OH 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다.

본 발명의 rRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트, 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rRmY 전사 혼합물을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-0-메틸 시티딘 및 2'-0-메틸 우리딘을 모두 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.

본 발명의 dRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-데옥시 구아노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dRmY 전사 조건을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 2'-데옥시 아데노신, 2'-데옥시 구아노신, 2'-0-메틸 시티딘 및 2'-0-메틸 우리딘을 모두 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.

본 발명의 rGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-0-메틸 아데노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rGmH 전사 혼합물을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 2'-OH 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-0-메틸 우리딘 및 2'-0-메틸 아데노신을 모두 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 아데노신인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 아데노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-0-메틸 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-0-메틸 아데노신인 서열을 포함한다.

본 발명의 r/mGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-0-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 구아노신 트리포스페이트, 2'-0 메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-OH 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 r/mGmH 전사 혼합물을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 2'-0-메틸 아데노신, 2'-0-메틸 시티딘, 2'-0-메틸 구아노신 및 2'-0 메틸 우리딘을 모두 포함하며, 이때 구아노신 뉴클레오티드 군집은 최대 약 10 % 의 2'-OH 구아노신을 보유한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 결과된 r/mGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 약 10 % 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고 뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 약 10 % 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90 % 가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 약 10 % 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다.

본 발명의 fGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-0-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-F 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 fGmH 전사 조건을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 2'-0-메틸 아데노신, 2'-0-메틸 우리딘, 2'-0-메틸 시티딘 및 2'-F 구아노신을 모두 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-0-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다.

본 발명의 dAmB 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 구아노신 트리포스페이트 및 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dAmB 전사 혼합물을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 2'-데옥시 아데노신, 2'-0-메틸 시티딘, 2'-0-메틸 구아노신 및 2'-0 메틸 우리딘을 모두 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 80 % 가 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 적어도 90 % 가 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 결과된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100 % 가 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.

각 경우에 있어서, 전사 생성물은 이후 앱타머를 동정하고/하거나 소정의 표적에 대해 고 결합 특이성을 갖는 서열의 보존 모티프를 결정하고자 셀렉스™ 방법에서 라이브러리로서 사용될 수 있다. 결과된 서열은 이미 부분적으로 안정화되어 있으므로, 상기 방법으로부터 이 단계를 빼면 최적화된 앱타머 서열에 도달하고, 그 결과, 더욱 안정화된 앱타머를 수득하게 된다. 2'-OMe 셀렉스™ 방법의 다른 이점은 결과된 서열이 서열 내에 필요한 것보다 소수의 2'-OH 뉴클레오티드를 보유하거나, 전혀 보유하지 않을 가능성이 있다는 점이다. 어느 정도 2'-OH 뉴클레오티드가 잔류하게 되면, 이 2'-OH 뉴클레오티드는 사후-셀렉스™ 변형을 수행함으로써 제거할 수 있다.

하기에 기술한 바와 같이, 2'-치환 뉴클레오티드를 완전히 혼입시킨 전사체의 낮지만 여전히 유용한 정도의 수율은 전술한 최적화 조건 이외의 다른 조건 하에서도 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 전사 조건을 변경시킨 것으로 다음과 같은 것들이 포함된다 :

HEPES 완충액 농도는 0 내지 1 M 의 범위가 가능하다. 본 발명에서는 pKa 가 5 내지 10 인 기타 완충제 예를 들어, 트리스-히드록시메틸-아미노메탄을 사용하는 것 또한 허용된다.

DTT 농도는 0 내지 400 mM 의 범위가 가능하다. 본 발명의 방법에서는 환원제 예를 들어, 머캅토에탄올의 사용 또한 허용된다.

스퍼미딘 및/또는 스퍼민의 농도는 0 내지 20 mM 의 범위가 가능하다.

PEG-8000 농도는 0 내지 50 %(w/v)의 범위가 가능하다. 본 발명의 방법에서는 기타 친수성 중합체 예를 들어, 기타 분자량을 갖는 PEG 또는 기타 폴리알킬렌 글리콜의 사용 또한 허용된다.

트리톤 X-100 농도는 0 내지 0.1 %(w/v)의 범위가 가능하다. 본 발명의 방법에서는 기타 비-이온계 세제 예를 들어, 기타 트리톤-X 세제를 비롯한 기타 세제의 사용 또한 허용된다.

MgCl₂ 농도는 0.5 mM 내지 50 mM 의 범위가 가능하다. MnCl₂ 농도는 0.15 mM 내지 15 mM 의 범위가 가능하다. MgCl₂ 및 MnCl₂ 는 모두 기술된 범위 내에 존재해야 하며, 바람직한 실시형태에서 MgCl₂:MnCl₂ 의 비율은 약 10:3, 바람직하게 상기 비율은 약 3∼5:1, 더욱 바람직하게 상기 비율은 약 3∼4:1 로 한다.

2'-0Me NTP 농도 (각 NTP)는 5 μM 내지 5 mM 의 범위가 가능하다.

2'-OH GTP 농도는 0 내지 300 μM 의 범위가 가능하다.

2'-OH GMP 농도는 0 내지 5 mM 의 범위가 가능하다.

pH 는 pH 6 내지 pH 9 의 범위가 가능하다. 본 발명의 방법은 변형 뉴클레오티드를 혼입시키는 대다수 중합효소가 활성을 갖도록 하는 pH 범위 내에서 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에서는 전사 반응 조건 하에서 킬레이트화제 예를 들어, EDTA, EGTA 및 DTT 의 사용도 허용된다.

앱타머 의약 화학

앱타머 의약 화학은 변이체 앱타머 세트를 화학적으로 합성하는 앱타머 개량기술이다. 이와 같은 변이체 세트는 통상적으로 단일 치환체의 도입에 의해 모체 앱타머와 차이가 나게 되며, 이 치환기의 위치에 의해 상호 간에도 달라진다. 이후 이 변이체를 상호 간에 그리고 모체 앱타머와 비교한다. 단일 치환체를 포함시키는 것이 특정 치료 기준의 달성에 필요한 모든 것일 수 있다는 점에서, 특정 면에서의 향상은 충분히 중요하다고 할 수 있다.

대안적으로, 단일 변이체 세트로부터 수집된 정보를 사용하여 하나 이상의 치환체가 동시에 도입된 변이체 세트를 추가로 디자인할 수 있다. 하나의 디자인 기법에서는, 모든 단일 치환 변이체에 순위를 정해, 상위 4 개에 해당하는 것들을 선택해서, 이 4 개의 단일 치환 변이체의 가능한 모든 이중(6) 조합체, 삼중(4) 조합체 및 사중(1) 조합체를 합성 및 분석한다. 두 번째 디자인 기법에서는, 최상의 단일 치환 변이체를 새로운 모체로 간주하여, 최상위에 해당하는 단일 치환 변이체를 포함하는 가능한 모든 이중 치환 변이체를 합성 및 분석한다. 기타 다른 기법도 이용가능한데, 이러한 기법은 치환체의 수가 점진적으로 증가하게 되고, 이러면서 더욱 개선된 변이체를 계속해서 동정할 수 있도록 반복적으로 적용할 수 있다.

앱타머 의약 화학은 특히, 치환체의 광범위한 도입보다는 국소적 도입을 연구하는 방법으로서 사용될 수 있다. 앱타머는 전사에 의해 생성된 라이브러리 내에서 발견되기 때문에, 셀렉스™ 방법 중에 도입된 임의의 치환체가 광범위하게 도입되는 것이다. 예를 들어, 뉴클레오티드 간에 포스포로티오에이트 결합의 도입을 원하는 경우, 이는 A(또는 G, C, T, U 등) 위치마다 도입될 수 있다(광범위 치환). 일부 A(또는 일부 G, C, T, U 등) 위치에서는 포스포로티오에이트를 필요로 하지만 다른 A 위치에서는 허용할 수 없는 앱타머의 경우는 이 방법에 의해서는 발견이 용이하지 않다.

앱타머 의약 화학 방법에 의해 이용가능한 치환체의 종류는, 고상 합성 시약으로서의 생산 능력과, 올리고머 합성 과정으로의 도입 능력에 의해 단지 제한된다. 이 방법은 뉴클레오티드로만 국한되지 않는다. 앱타머 의약 화학 과정은 입체적 부피(steric bulk), 소수성, 친수성, 친유성, 소지성(lipophobicity), 양 전하, 음 전하, 중성 전하, 양쪽성 이온, 편극성, 뉴클레아제-내성, 형태적 강성(rigidity), 형태적 가요성(flexibility), 단백질-결합 특성, 질량 등을 도입하는 치환체를 포함할 수 있다. 앱타머 의약 화학 방안에는 염기-변형, 당-변형 또는 포스포디에스테르 결합-변형이 포함될 수 있다.

치료용 앱타머 내에서 유용할 것으로 보이는 치환체의 종류를 고려해 볼 때, 다음 중 하나 이상의 카테고리에 속하는 치환체를 도입하는 것이 바람직할 수 있다 : (1) 체내에 이미 존재하는 치환체(예, 2'-데옥시, 2'-리보, 2'-O-메틸 퓨린 또는 피리미딘, 또는 5-메틸 시토신). (2) 이미 승인된 치료제의 일부인 치환체(예, 포스포로티오에이트-결합 올리고뉴클레오티드). (3) 상기 2 개의 카테고리 중 하나로 가수분해 또는 분해되는 치환(예, 메틸포스포네이트-결합 올리고뉴클레오티드).

본 발명의 트롬빈 앱타머에는 본원에 기술된 바와 같은 앱타머 의약 화학을 통하여 개발된 앱타머가 포함된다.

트롬빈 결합 앱타머

본 발명의 물질은 트롬빈에 결합하고, 몇몇 실시형태에서는 생체내에서 및/또는 세포-의거한 분석에서 트롬빈의 활성을 감소 또는 저해하는, 길이가 13∼51 뉴클레오티드인 일련의 핵산 앱타머를 포함한다. 본 발명의 앱타머는 트롬빈에, 약 300 pM 미만, 바람직하게는 250 pM 미만 및 더욱 바람직하게는 약 200 pM 미만의 K_D 값의 고 친화도로 결합하는 것이 바람직하다.

본 발명의 앱타머는 트롬빈에 의해 야기되거나, 그렇지 않으면 트롬빈에 연루된 것으로 공지된 특정 응혈 관련 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 저 독성의, 안전하고 효과적인 특성을 제공한다. 본 발명의 앱타머는 또한 외과적 시술, 예를 들어 스텐트 설치술을 포함한 경피적 관상동맥 중재술, 말초 동맥 폐색성 질환(PAOD) 관련 수술, 및 관상 동맥 우회 이식(CABG) 수술을 포함한 심폐 우회(CPB) 시술과 관련하여 응혈 조정, 특히 항응혈을 위한 안전하고 효과적인 특성을 제공한다. 본 발명의 앱타머는 활성 응혈 시간(ACT) 및 기타 일상적인 응혈 기준에 의해 측정가능한, 응혈에 대한 효과를 지니며, 혈소판 활성화(예, 헤파린 투여시 발생)와 같은 원치않는 부차적 효과는 나타내지 않는다. 이외에도, 몇몇 실시형태에서, 항-트롬빈 앱타머는 짧은 약동학적(PK) 및 약력학적(PD) 반감기를 보유하고 있어, 결과적으로 신속하고 가역적인 항-트롬빈 효과를 발생시킨다.

본 발명에 있어서, 치료제 및/또는 진단제로 사용되는 트롬빈 결합 앱타머의 일례로는 다음의 서열들이 포함된다 : SEQ ID NOs 9-41, 43-191, 193-204, 208-304, 307-329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400, 및 402-440.

트롬빈에 결합하는 기타 앱타머는 이하 실시예 1 및 실시예 2 에 개시되어 있다.

이들 앱타머는 본원에 기술된 바와 같은 변형 예를 들어, PEG 같은 친유성 또는 고 분자량 화합물로의 콘쥬게이트화, 캡핑부의 혼입, 변형 뉴클레오티드의 혼입 및 포스페이트 골격 내 치환 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태에서는, 트롬빈에 결합하는 분리된, 비-천연 앱타머가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 분리된, 비-천연 앱타머는 100 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 약 300 pM 미만, 바람직하게는 250 pM 미만 및 더욱 바람직하게는 약 200 pM 미만의 트롬빈에 대한 해리 상수("K_D")를 가진다. 이러한 해리 상수는 하기 실시예 1 에 기술된 바와 같이 도트 블롯 적정법에 의해 측정할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 앱타머는 트롬빈의 기능을 감소 또는 저해한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 앱타머는 트롬빈 변이체에 결합하여 이 기능을 감소 또는 저해한다. 본원에서 사용된 트롬빈 변이체는 트롬빈 기능과 본질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체를 포괄하며, 바람직하게는 트롬빈과 구조가 실질적으로 동일하고, 몇몇 실시형태에서는 트롬빈의 아미노산 서열과 70 % 서열 동일성, 바람직하게는 80 % 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 90 % 서열 동일성 및 더욱 더 바람직하게는 95 % 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 몇몇 실시형태에서, 표적 변이체의 서열 동일성은 하기에 기재한 BLAST 를 이용하여 측정한 것이다.

2 이상의 핵산 또는 단백질 서열과 관련하여 용어 "서열 동일성"이란 이하와 같은 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 육안 조사에 의해 측정되는 최대 대응성(maximum correspondence)에 대해 비교 및 정렬하였을 때, 2 이상의 서열 또는 아서열(subsequence)이 동일하거나 또는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 % 가 동일한 것을 지칭한다. 서열 비교에 있어서, 통상 하나의 서열은 시험 서열의 비교 대상이 되는 참고 서열(reference sequence)로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘 사용시에는, 시험 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 아서열의 좌표와 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 이후 서열 비교 알고리즘에 따라 지정된 프로그램 매개변수를 기초로, 참고 서열에 대비한, 시험 서열(들)의 서열 동일성 % 를 계산한다. 비교용 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 스미스 & 워터맨(Smith & Waternab)의 국소 동일성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2 : 482 (1981)), 니들맨 & 운치(Needleman & Wunsch)의 동일성 정렬 알고리즘(J Mol. Biol. 48 : 443 (1970)), 피어슨 & 리프맨(Pearson & Lipman)의 유사도 탐색법(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85 : 2444 (1988)), 이들 알고리즘들의 전산화된 실행법(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 육안 검사(일반적으로, Ausubel 외 다수, 이하 참조)에 의해 수행될 수 있다.

서열 동일성 % 를 결정하는데 적합한 알고리즘의 일례로, 기본적 국소 정렬 탐색 도구(Basic Local Alignment Search Tool ; 이하 "BLAST")에 사용되는 알고리즘이 있다(참조예, Altschul 외 다수, J Mol. Biol. 215 : 403-410 (1990) 및 Altschul 외 다수, Nucleic Acids Res., 15 : 3389-3402 (1997)). BLAST 분석법 수행을 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터(이하 "NCBI")를 통하여 공개적으로 이용가능하다. NCBI 로부터 입수가능한 소프트웨어(예, BLASTN(뉴클레오티드 서열용) 및 BLASTP(아미노산 서열용))를 이용하여 서열 동일성을 측정하는데에 사용되는 디폴트 매개변수에 관한 것은 문헌 [McGinnis 외 다수, Nucleic Acids Res., 32 : W20-W25 (2004)]에 개시되어 있다.

본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 앱타머는 다음 서열 중 임의의 하나를 포함하는 앱타머와 실질적으로 동일한 트롬빈 결합 능력을 가진다: SEQ ID NOs : 43-44, 48-49, 52, 63, 72, 82, 84, 92, 97, 116, 130, 141, 143, 146, 166, 172, 185, 283, 292-294, 319-329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400, 402-433. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 앱타머는 다음 서열 중 임의의 하나를 포함하는 앱타머와 실질적으로 동일한 구조 및 트롬빈 결합 능력을 가진다 : SEQ ID NOs : 43-44, 48-49, 52, 63, 72, 82, 84, 92, 97, 116, 130, 141, 143, 146, 166, 172, 185, 283, 292-294, 319-329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400, 402-433.

본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 앱타머는 다음 서열 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 응혈 감소 또는 저해 능력을 가진다 : SEQ ID NOs : 11, 15, 21, 23, 32, 34, 84, 86, 92, 94, 116, 191, 197, 200, 283-285, 287, 289-290, 292-304, 307-318, 411, 434-438 및 440. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 앱타머는 다음 서열 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 응혈 감소 또는 저해 능력 및 실질적으로 동일한 구조을 가진다 : SEQ ID NOs : 11, 15, 21, 23, 32, 34, 84, 86, 92, 94, 116, 191, 197, 200, 283-285, 287, 289-290, 292-304, 307-318, 411, 434-438 및 440. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 다음 서열 중 임의의 하나에 따른 서열을 가진다 : SEQ ID NOs 191, 197, 283, 292-294, 411 및 434-440. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 약학 조성물에 활성 성분으로서 사용된다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 앱타머 또는 본 발명의 앱타머를 포함하는 조성물은 응혈 관련 질환(예, 급성 및 만성 트롬빈 매개 응혈 질환)의 치료에 사용된다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 앱타머 또는 본 발명의 앱타머를 포함하는 조성물은 관상 동맥 우회 이식(CABG) 시술 또는 경피적 관상동맥 중재술 같은 외과적 시술 이전, 도중, 이후 또는 이들을 병합한 시기에 항응혈제로서 사용된다.

몇몇 실시형태에서, 본 발명의 앱타머 치료제는 해당 표적에 대해 고 친화도 및 고 특이성을 가지면서도, 이 앱타머 치료제가 환자 또는 실험대상의 체내에서 분해될 경우 비-천연 뉴클레오티드 치환으로부터 발생되는 유해한 부작용들을 감소시킨다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 앱타머 치료제를 함유하는 치료용 조성물은 플루오르화된 뉴클레오티드를 포함하지 않거나 또는 감량을 포함한다.

본 발명의 앱타머는 해당 업계에 공지된 임의의 올리고뉴클레오티드 합성 기술 예를 들어, 해당 업계에 널리 공지된 고상 올리고뉴클레오티드 합성 기술(참조예, Froehler 외 다수, Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) 및 Froehler 외 다수, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)) 및 액상 방법 예를 들어, 트리에스테르 합성 방법(참조예, Sood 외 다수, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) 및 Hirose 외 다수, Tet. Lett, 28:2449 (1978))을 이용하여 합성할 수 있다.

ARC2172(SEQ ID NO 294)는 합성에 의해 제조되며, 분자량(MW)이 8,155.24 달톤인 C₂₅₆H₃₁₉N₁₀₄O₁₅₈P₂₅ (유리산 형태)의 분자식을 가진다. ARC2172(SEQ ID NO 294)의 나트륨 염은 C₂₅₆H₂₉₄Na₂₅N₁₀₄O₁₅₈P₂₅ 의 분자식과 8704.77 달톤의 대응 MW 을 가진다. ARC2172(SEQ ID NO 294)의 나트륨 염에 대한 화학명은 2'-데옥시시티딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시시티딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시시티딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시티미딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시아데노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시티미딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시티미딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시티미딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시아데노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시티미딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시티미딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시시티딜릴-(3'→5'O,O-포스포릴)-2'-데옥시구아노신, 25-나트륨염이다.

약학 조성물

본 발명은 또한 트롬빈에 결합하는 앱타머 분자를 함유하는 약학 조성물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 조성물은 내복용으로 적합하고, 유효량의 본 발명의 약리학적 활성 화합물을 단독으로 또는 1 종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함한다. 본 화합물은, 독성이 있다 하더라도 매우 약하기 때문에 특히 유용하다.

본 발명의 조성물은 환자에게서 질병 또는 질환 같은 병변을 치료 또는 예방하거나, 또는 그러한 질병 또는 질환의 증상을 완화하는데에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 응혈과 연관된 병변 및 구체적으로 트롬빈 관련 응혈에 연루된 병변을 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 앱타머가 고 친화도로 결합하는 표적과 관련 있거나 이로부터 유래된 질병 또는 질환이 발병하였거나, 또는 발병 가능성이 높은 실험대상에 투여하는데에 유용하다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 앱타머가 고 친화도로 결합하는 표적과 관련 있거나 이로부터 유래된 질병 또는 질환이 발병하였거나, 또는 발병 가능성이 높은 실험대상에 투여하는데에 유용하다. 본 발명의 조성물은 병변을 가진 환자 또는 실험대상을 치료하는 방법에 사용할 수 있다. 본 방법은 이 병변과 연관된 표적 단백질(예, 트롬빈)에 결합하는 앱타머 또는 앱타머 함유 조성물을 환자 또는 실험대상에 투여하여, 표적 단백질로의 앱타머 결합이 표적(예, 트롬빈)의 생물학적 기능을 변화시킴으로써 병변을 치료하는 것을 포함한다.

병변을 나타내고/나타내거나 항응혈을 필요로 하는 환자 또는 실험대상 즉, 본 발명의 방법에 의하여 치료되는 환자 또는 실험대상으로는 척추동물, 구체적으로는 포유동물(예, 개, 고양이, 원숭이, 및/또는 말 같은 유제동물), 또는 더욱 구체적으로는 인체가 가능하다.

몇몇 실시형태에서는, 정맥 또는 동맥(예, 신동맥), 복부 대동맥, 경동맥, 말초 동맥 폐색성 질환("PAOD")에서 관상동맥성 질환 및/또는 혈관성 질환을 치료하고자, CABG, PCI, 혈관형성술, 심혈관 및 말초 혈관 절개 및 혈관내 수술 같은 수술적 중재술, 말초/관상 동맥 또는 정맥, 인공 장기, 심장 판막 내 스텐트 설치 시술 이전, 도중, 이후 또는 이들을 병합한 시기에, 본 발명의 앱타머(예, ARC2172 (SEQ ID NO 294))를 투여한다. 본 방법의 몇몇 실시형태에서는, 본 발명의 앱타머를 수술(예, 고관절 치환술, 슬관절 치환술 등) 후 혈전증을 예방하는 차원에서 투여한다. 본 발명의 몇몇 실시형태에서는, 복강경 같은 최소 침습 시술, 부인과 시술 등의 시술 이전, 도중, 이후 또는 이들을 병합한 시기에, 앱타머를 투여한다.

본 발명의 앱타머(예, ARC2172 (SEQ ID NO 294))는 헤파린 유도된 혈소판감소증("HIT") 환자, 헤파린 내성 환자, 신장 기능 손상 환자 및/또는 간 기능 손상 환자의 항응혈제 처치에 사용된다. 추가의 실시형태에 있어서, 본 발명은 트롬빈 감소 또는 저해가 요구되는 증세를 나타내는 인체 또는 기타 포유동물의 치료에 관한 것이다. 본 발명의 앱타머는 인체를 비롯한 포유동물에 있어서, 혈액 및 조직 내 혈전증 및/또는 과응혈상태, 예를 들어 급성 관상동맥 증후군, 울혈성 심부전, 심방 세동, 정맥 혈전증(예, 심부 정맥 혈전증), 폐 색전증, 심근 허혈 및 심근 경색증에서와 같은 동맥 혈전증, 불안정형 협심증, 혈전증-의거 발작 및 말초 동맥 혈전증을 치료 및/또는 예방하는데 사용할 수 있다. 추가로, 앱타머는 관상 동맥 질환, 대뇌 동맥 질환 및 말초 동맥 질환 같은 아테롬성 동맥경화증 질환(질병)의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 앱타머(예, ARC2172(SEQ ID NO 294))는 혈액투석 및 파종성 혈관내 응고시 항응혈제 처치에 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 앱타머는 환자 생체내에서 사용된 카테터, 스텐트 및 기계 장치의 세척 및/또는 코팅 방법에, 그리고 혈액, 혈장 및 기타 혈액 산물의 생체외 보관을 위한 항응혈제로서 사용할 수도 있다.

또한 추가로, 혈액 응고가 전이를 포함하여 암 같은 이차 병증, 관절염을 포함한 염증성 질환, 및 당뇨병의 기초가 되는 과정 또는 원인일 수 있는 기타 질환에 본 앱타머를 사용할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 예를 들어, 심장 수술과 같은 수술 이전, 도중 및/또는 이후에 항응혈을 요하는 환자 또는 실험대상을 처치하는 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시형태에서 응혈을 조정하는 방법에 있어서, 예를 들어 CABG 수술 이전, 도중 및/또는 이후, 항-트롬빈 앱타머는 지속적 정맥내 점적 투여에 의해 또는 정맥내 일시 투여에 의해 투여할 수 있다. 이들 실시형태에 있어서, 본 앱타머는 본 발명의 조성물 내에서 등장성, pH 중성의 염수 용액 중 나트륨 염의 형태로 제공될 수 있다.

실제로, 앱타머 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 앱타머 표적인 트롬빈이 피브리노겐 및 PAR-1 에 결합하는 것을 감소 또는 저해하는, 목적하는 생물학적 활성을 발휘하기에 충분할 양으로 투여한다.

본 발명의 하나의 양태는 본 발명의 앱타머 조성물을 기타 응혈 관련 질환용 치료제와 함께 포함한다. 본 발명의 앱타머 조성물은 예를 들어, 1 종 이상의 앱타머를 함유할 수 있다. 몇몇 실시예에서는, 본 발명의 1 종 이상의 화합물을 함유하는 본 발명의 앱타머 조성물을 항염증제, 면역저해제, 항바이러스제 등과 같은 기타 유용한 조성물과 함께 투여한다. 더 나아가, 본 발명의 화합물은 전술한 바와 같이, 알킬화제, 대사길항물질, 유사분열 저해제 또는 세포독성 항생제와 같은 세포독성 제제, 세포증식억제 제제 또는 화학요법 제제와 함께 투여할 수 있다. 일반적으로, 이러한 병용 투여를 위해서는 공지된 치료제의 현행 투여 형태가 적합할 것이다.

"병행 요법(combination therapy)"(또는 "co-therapy")은 본 발명의 앱타머 조성물과, 공동-작용으로 유리한 효과를 제공하도록 의도된 특정 치료 방식의 일환으로서, 최소한 제 2 의 제제를 투여하는 것을 포함한다. 이와 같이 병행 요법으로부터 얻을 수 있는 유리한 효과로는 치료제를 함께 조합하여 사용함으로써 얻어지는 약동학적 또는 약력학적 공동-작용이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 통상적으로 이러한 치료제의 병행 투여는 한정된 기간(일반적으로, 선택된 병행 투여에 따라 수 분, 수 시간, 수일 또는 수주)에 걸쳐서 수행된다.

"병행 요법"이란, 개별 단독요법 방식의 일환으로서 2 종 이상의 치료제를 투여함으로써, 부수적이고 독단적으로 본 발명을 병행 실시하게 되는 것을 포괄하는 의미일 수도 있으나, 그것이 일반적인 것은 아니다. "병행 요법"은 이들 치료제를 연속적인 방식으로 투여하는 것 즉, 각각의 치료제를 상이한 시점에 투여하는 것 뿐만 아니라, 이 치료제들 모두 또는 적어도 2 종을 실질적으로 동시에 수행하는 방식으로 투여하는 것을 포괄하는 의미이다. 실질적으로 동시에 투여하는 것은 예를 들어, 실험대상에 각 치료제가 일정 비율로 들어있는 단일 캡슐을 투여하거나, 또는 각 치료제가 들어있는 다수의 개별 캡슐들을 투여함으로써 이루어질 수 있다.

각각의 치료제를 연속적으로 또는 실질적으로 동시에 투여하는 것은 임의의 적당한 경로 예를 들어, 국소, 경구, 정맥내, 근육내 투여 경로(이들로만 한정되지 않음) 및 점막 조직을 통한 직접적 흡수에 의해 실행될 수 있다. 치료제는 동일한 경로에 의해 또는 상이한 경로에 의해 투여할 수 있다. 예를 들어, 병행 투여의 제 1 치료제는 주사에 의해 투여하는 반면에, 병행 투여의 기타 치료제는 국소적으로 투여할 수 있다.

대안적으로, 예를 들어, 모든 치료제를 국소 투여하거나, 또는 모든 치료제를 주사에 의해 투여할 수도 있다. 치료제가 투여되는 순서는 달리 언급이 없다면 그다지 문제되지 않는다. "병행 요법"이란, 전술한 치료제들을 기타 생물학적 활성 성분들과 추가로 함께 투여하는 것을 포괄할 수도 있다. 병행 요법이 비-약물 치료를 추가로 포함하는 경우, 이러한 비-약물 치료는 치료제 투여와 비-약물 치료의 병행에 의한 공동-작용으로부터 얻어지는 유리한 효과를 얻을 수 있는 한, 임의의 적합한 시간에 수행할 수 있다. 예를 들어, 적당한 경우에서 유리한 효과는 비-약물 치료가 일시적으로, 아마도 수일 또는 수주 동안 치료제 투여로부터 배제되는 때에도 달성된다.

본 발명의 치료 또는 약리 조성물은 일반적으로, 약학적으로 허용가능한 매질 중에 용해 또는 분산된 유효량의 치료용 활성 성분(들)을 포함하게 된다. 약학적으로 허용가능한 매질 또는 담체에는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항박테리아 및 항진균 제제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 용도는 해당 업계에 널리 공지되어 있다. 보조용 활성 성분도 또한 본 발명의 치료용 조성물에 혼입할 수 있다.

약학 또는 약리 조성물의 제조에 관한 것은 해당 업계의 전문가라면 본원 개시된 내용을 통해 알 수 있을 것이다. 통상적으로 이러한 조성물은 액상 용액 또는 현탁액 같은 주사용 제제 ; 주사 전에 용액 또는 현탁액으로 제조하기 적합한 고체형 ; 경구 투여용 정제 또는 기타 고형분 ; 경시적 방출형 캡슐 ; 또는 현재 사용되는 임의의 기타 형태 예를 들어, 점안액, 크림, 로션, 연고, 흡입제 등으로 제조할 수 있다. 외과 의사, 내과 의사 또는 의료업계 종사자가 작업장에서 특정 부위를 처치하는 데에 염수-계 세척액 같은 멸균 제제를 사용하는 것 또한 특히 유용할 수 있다. 조성물을 또한 마이크로 장치, 미립자 또는 스폰지를 통해 전달하는 것도 가능하다.

제형화 후, 치료제는 투여 제형에 맞는 방식과 약리학적으로 효과적인 양으로 투여된다. 제형은 주사용 용액의 유형과 같은 다양한 투여형으로서 용이하게 투여되지만, 약물 방출형 캡슐 등도 또한 사용될 수 있다.

이와 관련하여, 투여될 조성물의 용량과 활성 성분의 함량은 치료할 숙주 동물에 따라 좌우된다. 투여에 필요한 활성 화합물의 정확한 함량은 의사의 판단에 따라 결정되며, 개개인 별로 다르다.

활성 화합물을 분산시키는데에 필요한 조성물은 통상적으로 최소 용량으로 사용된다. 적당한 투여 방식도 물론 달라질 수 있지만, 우선 상기 화합물을 투여하고, 그 결과를 모니터링한 다음, 이후 간격을 두고 추가 조절하는 것이 전형적인 방법이다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐(예, 젤라틴 캡슐)의 형태로 경구 투여함에 있어서는, 활성 약물 성분을 경구용이고, 무독성이며, 약학적으로 허용가능한 비활성 담체 예를 들어, 에탄올, 글리세롤, 물 등과 함께 배합할 수 있다. 또한, 의도 또는 필요에 따라서는, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제를 혼합물 내로 혼입할 수도 있다. 적합한 결합제로는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 천연 당 예를 들어, 글루코즈 또는 베타-락토즈, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검 예를 들어, 아카시아, 트래가칸트 또는 나트륨 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등이 포함된다. 이러한 투여형에 사용되는 윤활제로는 올레산 나트륨, 스테아르산 나트륨, 스테아르산 마그네슘, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화 나트륨, 실리카, 활석, 스테아르산, 이의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등이 포함된다. 붕해제로는 전분, 메틸 셀룰로즈, 아가, 벤토나이트, 크산탄 검 전분, 아가, 알긴산 또는 이의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물 등이 비-한정을 조건으로 포함된다. 희석제로는 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신이 포함된다.

본 발명의 화합물은 또한 경시적 방출형 및 지연 방출형 정제 또는 캡슐, 환제, 분말, 과립, 엘릭시르, 팅크제, 현탁액, 시럽 및 유제와 같은 경구 투여형으로 투여할 수도 있다. 좌제는 지방질 유제 또는 현탁액으로부터 제조하는 것이 유리하다.

약학 조성물은 멸균된 것일 수 있으며/있거나 애쥬번트, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용액 프로모터(solution promoter), 삼투압 조절용 염 및/또는 완충액을 함유할 수 있다. 이외에도, 상기 조성물은 또한 기타 치료학적으로 중요한 물질을 함유할 수 있다. 조성물은 통상의 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조되며, 통상적으로 활성 성분을 약 0.1 % 내지 75 %, 바람직하게는 약 1 % 내지 50 % 함유한다.

액체 특히, 주사 가능한 조성물은 예를 들어, 용해, 분산 등에 의해 제조할 수 있다. 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매 예를 들어, 물, 염수, 수성 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등에 용해시키거나 또는 이와 혼합함으로써 주사용 용액 또는 현탁액을 형성하게 된다. 또한, 주사 전에 액체 중에 용해시키기 적합한 고체 형태로 제형화시킬 수 있다.

본 발명의 화합물은 정맥내(일시 및 점적), 복강내, 피하 또는 근육내 투여형으로 그리고 제약 업계의 전문가에게 널리 공지된 모든 사용 형태로 투여할 수 있다. 주사제는 액상 용액 또는 현탁액 같이 통상적인 형태로 제조할 수 있다.

비경구 주사 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 및 주입시 사용된다. 이외에, 비경구 투여에 관한 방안 중 하나는, 서방형 또는 지연 방출형 시스템의 체내이식(implantation)을 이용하는 것으로, 이는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 3,710,795 호에 따르면, 투여 수준을 일정하게 유지시킬 수 있다고 한다.

또한, 본 발명의 바람직한 화합물은 적합한 비강 내 비히클, 흡입제의 국소적 사용을 통한 비강 내 형태, 또는 해당 업계의 전문가에게 공지된 경피적 피부 패취제의 형태를 사용한 경피 경로를 통해 투여할 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여함에 있어서, 해당 투여형은 투여 동안 간헐적이라기보다는 지속적으로 투여된다. 기타 바람직한 국소용 제제로는 크림, 연고, 로션, 에어로졸 스프레이 및 겔이 포함되며, 이때 활성 성분의 농도는 통상적으로 0.01 % 내지 15 %(w/w 또는 w/v)이다.

고형 조성물에 있어서, 부형제로는 약학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 수크로즈, 탄산 마그네슘 등이 포함된다. 상기 정의된 활성 화합물은 또한 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜(예, 프로필렌 글리콜)을 담체로 사용하는 좌제의 형태로서 제형화할 수도 있다. 몇몇 실시형태에서, 좌제는 지방질의 유제 또는 현탁액으로 제조하는 것이 유리하다.

본 발명의 화합물은 또한 리포좀 전달 시스템 예를 들어, 소형 단일 라멜라 비히클(unilamellar vehicle), 대형 단일 라멜라 비히클 및 다중 라멜라 비히클(multilamellar vehicle)의 형태로 투여할 수 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 함유하는 다양한 형태의 인지질로부터 형성될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 지질 성분 막은 미국 특허 제 5,262,564 호에 기술된 바와 같이 약물의 수용액을 사용하여 수화시켰을 때, 이 약물을 감싸는 지질 층을 형성한다. 일례로, 본원에 개시된 앱타머 분자는 해당 업계에 공지된 방법을 이용하여 구성된, 친유성 화합물 또는 비-면역원성의 고 분자량 화합물과의 복합체로서 제공될 수 있다. 핵산 관련 복합체에 관한 예시가 미국 특허 제 6,011,020 호에 제공되어 있다.

본 발명의 화합물은 또한 표적가능한 약물 담체로서 가용성 중합체와 커플링시킬 수도 있다. 이러한 중합체로는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스파나미드페놀 또는 폴리에틸렌옥시드폴리리신이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 약물을 제어 방출시키는데에 유용한 생분해성 중합체 군 예를 들어, 폴리락트산, 폴리엡실론 카프롤락톤, 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 히드로겔의 가교형 또는 양친매성 블록 공중합체에 커플링시킬 수도 있다.

목적하는 경우, 투여될 약학 조성물은 소량의 무-독성 보조 물질 예를 들어, 습윤제, 유화제, pH 완충제 및 기타 물질(예, 아세트산 나트륨 및 올레산 트리에탄올아민)을 함유할 수도 있다.

앱타머를 이용한 투여 방식은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태 ; 치료할 증세의 중증도 ; 투여 경로 ; 환자의 신장 및 간 기능 ; 및 사용된 앱타머 또는 이의 염의 종류를 비롯한 다양한 요인들에 따라 선택된다. 통상의 숙련된 의사 또는 수의사라면 증세의 진행을 막거나, 후퇴시키거나 또는 지연시키는데 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

이하 투여량에 제시된 분자량은 단지 앱타머 올리고 중량과 관련한 것으로 PEG 성분으로의 콘쥬게이트화 같은 것에 의해 부가된 질량을 포함하지 않는다. 본 발명의 경구 투여형은, 의도하는 효과를 위해 사용하는 경우, 약 0.05 내지 7500 ㎎/일의 범위로 경구 투여하게 된다. 본 조성물은 활성 성분을 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 및 1000.0 ㎎ 함유하는 분할선이 있는 정제(scored tablet)의 형태로 제공하는 것이 바람직하다. 주입 투여형, 비강 내 투여형 및 경피 투여형은 0.05 내지 7500 ㎎/일 의 범위로 투여될 것이다. 피하, 정맥내 및 복강내 투여형의 투여량은 0.05 내지 12,000 ㎎/일 의 범위일 것이다.

본 발명의 화합물의 유효 혈장 농도는 0.002 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖ 의 범위이다.

본 발명의 화합물은 매일 1 회 투여분으로 투여하거나, 또는 전체 1 일 투여분을 하루에 2 회, 3 회 또는 4 회 분할 투여할 수도 있다.

앱타머 치료제의 약동학 및 생체분배( biodistribution )의 조정

앱타머를 포함하여 모든 올리고뉴클레오티드-계 치료제의 약동학적 특성은 목적하는 약학적 용도에 부합되도록 조정하는 것이 중요하다. 세포외 표적을 지향하는 앱타머는 세포 내 전달과 관련한 문제점은 가지지 않겠지만(안티센스 및 RNAi-계 치료제의 경우와 마찬가지로), 이러한 앱타머는 표적 기관 및 조직에 분배되어, 의도하는 투여 방식에 부합하는 시간 동안 체내에 (비변형 상태로) 남아있을 수 있어야 한다.

그러므로, 본 발명은 앱타머 조성물의 약동학, 구체적으로 앱타머의 약동학을 조율하는 능력에 영향을 미치는 물질과 방법을 제공한다. 길어진 반감기(t_{1 /2})를 가진 본 발명의 트롬빈 결합 앱타머-PEG 콘쥬게이트는 각종 질환, 예를 들면 헤파린-유도된 혈소판감소증(HIT), 급성 관상동맥 증후군(ACS) 및 심부 정맥 혈전증(DVT)의 치료에 사용할 수 있다. 이들 앱타머 콘쥬게이트가 보이는 길어진 t_{1 /2} 는 목적하는 효과를 산출하는데 필요한 용량을 예를 들어 감소시키는 효과를 보인다. 길어진 반감기를 가진 앱타머 콘쥬게이트는 또한 만성적 질환에 사용할 수도 있다. 본 발명의 앱타머 콘쥬게이트 및/또는 안정화된 앱타머를 포함하여, 길어진 반감기(t_{1 /2})를 가진 본 발명의 앱타머는 또한 혈액 수집, 혈액 순환 또는 혈액 보관 장치에서, 이 장치가 본 발명의 항-트롬빈 앱타머 또는 본 발명의 항-트롬빈 앱타머 혼합물을 유효량 포함하는 경우 항응혈제로서 사용할 수도 있다. 이러한 장치의 일례로는 혈액 수집용 백, 혈액 수집용 튜브 및 혈액 수집용 주사기가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정의 실시형태에서는, 혈액을 수일간, 바람직하게는 약 2 주간 약 4 ℃ 에서 보관하는 경우, 혈액 보관 장치(예, 혈액 백)에 유효량의 본 발명의 앱타머를 사용한다.

앱타머의 약동학적 특성의 조정능력(tunability)(즉, 감소 또는 저해 능력)은, 변형부(예, PEG 중합체)의 앱타머로의 콘쥬게이트화 및/또는 변형 뉴클레오티드(예, 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸)의 혼입을 통해 핵산의 화학 조성을 변하게 함으로써 달성된다. 현존하는 치료 방법을 개선하거나, 또는 대안적으로 새로운 치료 방법을 개발하는데에 앱타머의 약동학적 특성에 대한 조정 능력이 사용된다. 예를 들어, 일부 치료 방법, 일례로 신속한 약물 제거 또는 기능 소진이 바람직한 항-신생물 또는 응급 요양 세팅에 있어서는, 혈류 내 앱타머의 체류 시간을 단축하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 다른 치료 방법, 일례로 치료제의 전신 순환이 바람직한 유지 요법(maintenance therapy)에 있어서는, 혈류 내 앱타머의 체류 시간을 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.

이외에도, 실험대상 내 앱타머 치료제의 생체분배를 변형시키는 데에도 앱타머의 약동학적 특성에 대한 조정 능력이 사용된다. 예를 들어, 일부 치료 방법에 있어서는, 특정 유형의 조직 또는 특정 기관(또는 기관 군)을 표적화하기 위해, 앱타머 치료제의 생체분배를 바꾸는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 앱타머 치료제는 특정 조직 또는 기관(들)에 우선적으로 축적된다. 다른 치료 방법에 있어서는, 소정의 질병, 세포 손상 또는 기타 비정상적 병변과 관련된 증상 또는 세포 마커를 제시하는 조직을 표적화하여, 앱타머 치료제가 손상 조직에 우선적으로 축적되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 2004 년 3 월 5 일자 제출된 미국 가출원 제 60/550,790 호(발명의 명칭 : "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics") 및 2005 년 3 월 7 일자로 제출된 미국 비-가출원 제 11/075,648 호(발명의 명칭: "Controlled Molulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics")에 개시된 바와 같이, 앱타머 치료제의 PEG 화(예, 20 kDa PEG 중합체를 이용한 PEG 화)를 이용하여 염증 조직을 표적화하여, 이 PEG 화된 앱타머 치료제가 염증 조직에 우선적으로 축적되도록 한다.

앱타머 치료제(예, 앱타머 콘쥬게이트 또는 변형 뉴클레오티드 같이 화학적 특성이 변경된 앱타머)의 약동학 및 생체분배 프로필을 측정하기 위해서는, 다양한 매개변수를 모니터링한다. 이러한 매개변수로는 예를 들어, 반감기(t_{1 /2}), 혈장 소멸률(plasma clearance ; Cl), 분배 용적(Vss), 농도-시간 곡선하 면적(AUC), 최대 혈청 또는 혈장 농도 관측치(C_max), 및 앱타머 조성물의 평균 체류 시간(MRT)이 포함된다. 본원에서 사용된, "AUC" 란 용어는, 앱타머 치료제의 혈장 농도 대 앱타머 투여 후 경과 시간에 대한 그래프의 아래 부분 면적을 지칭한다. AUC 값은 소정의 앱타머 치료제의 생체이용률(즉, 앱타머 투여 후 혈류 내 투여 앱타머 치료제의 함량) 및/또는 전체 소멸률(Cl)(즉, 혈류로부터 앱타머 치료제가 제거되는 속도)을 추정하는데에 사용된다. 분포 용적은 체내에 존재하는 앱타머의 양에 대한 앱타머 치료제의 혈장 농도와 관련이 있다. Vss 가 클수록, 더 많은 앱타머가 혈장 외에서 발견된다(즉, 더 많은 양의 혈관외 유출이 일어남).

본 발명은 소분자, 펩티드 또는 중합체 말단기 같은 조정부(modulation moiety)에 앱타머를 콘쥬게이트화시키거나, 또는 앱타머 내로 변형 뉴클레오티드를 혼입시킴으로써, 생체내에서 안정화된 앱타머 조성물의 약동학적 특성 및 생체분배를 (제어 방식으로) 조정하는 물질 및 방법을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 변형부의 콘쥬게이트화 및/또는 뉴클레오티드(들) 화학적 조성의 변경은 혈류 내 앱타머 체류 시간과 조직으로의 분배에 대한 근본적인 양태를 변화시킨다.

뉴클레아제에 의한 제거 이외에도, 올리고뉴클레오티드 치료제는 신장 여과를 통해 제거된다. 여과 차단이 불가능하다면, 정맥내 투여된 뉴클레아제-내성 올리고뉴클레오티드는 그 자체로서, 통상적으로 < 10 분의 생체내 반감기를 보인다. 이는 혈류를 빠져 나와서 조직으로 신속하게 분배되는 것을 촉진하거나, 또는 사구체가 걸러내기에 효과적인 크기 이상으로 올리고뉴클레오티드의 겉보기 분자량을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 이하에서 기술된, 소형 치료제의 PEG 중합체로의 콘쥬게이트화(PEG 화)는 혈류 내 앱타머의 체류 시간을 현저히 연장시키고, 그 결과 투여 빈도를 줄이고 혈관 표적에 대한 효능을 증대시킬 수 있다.

앱타머는 고 분자량 중합체(예, PEG) ; 펩티드(예, Tat(HIV Tat 단백질의 13-아미노산 단편(Vives 외 다수, (1997), J. Biol. Chem. 272(25) : 16010-7)), Ant(드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia) 호메오 단백질(homeotic protein)의 세 번째 나선체로부터 유래된 16-아미노산 서열(Pietersz 외 다수, (2001), Vaccine 19(11-12) : 1397-405)) 및 Arg₇(폴리아르기닌(Arg₇)으로 구성된, 단형의 양전하 세포-투과성 펩티드(Rothbard 외 다수, (2000), Nat. Med. 6(11) : 1253-7 ; Rothbard, J 외 다수, (2002), J. Med. Chem. 45(17) : 3612-8)) ; 및 소분자(예, 콜레스테롤 같은 친유성 화합물)와 같은 다양한 변형 성분에 콘쥬게이트화할 수 있다. 본원에 기술된 다양한 콘쥬게이트 중에서, 앱타머의 생체내 특성은 PEG 기와 복합체화함으로써 가장 많이 변화된다. 예를 들어, 혼합형 2'-F 및 2'-OMe 변형 앱타머 치료제는 20 kDa PEG 중합체와 복합체를 형성함으로써 신장 여과를 방해하고 건강한 조직과 염증 조직 모두로 앱타머가 분배되는 것을 촉진시킨다. 더 나아가, 20 kDa PEG 중합체-앱타머 콘쥬게이트는, 앱타머의 신장 여과를 막아주는 데에 있어서 거의 40 kDa PEG 중합체만큼 효과적인 것으로 파악된다. PEG 화로 인한 한 가지 효과는 앱타머 제거에 관한 것인데 반해, 20 kDa 성분의 존재로 인한 전신적 노출의 연장은 또한 앱타머가 조직, 구체적으로 심하게 관류된 기관의 조직 및 염증 위치의 조직으로 분배되는 것을 촉진시킨다. 앱타머-20 kDa PEG 중합체 콘쥬게이트는 앱타머가 염증 위치로 분배되도록 지시하여, PEG 화된 앱타머가 염증 조직에 우선적으로 축적되도록 한다. 일부 경우에 있어서, 20 kDa PEG 화된 앱타머 콘쥬게이트는 세포 예를 들면, 신장 세포의 내부로 접근하는 것이 가능하다.

변형 뉴클레오티드는 또한 앱타머의 혈장 소멸률을 조정하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 2'-F 및 2'-OMe 안정화 화학 기가 혼입되고, 생체외 및 생체내에서 높은 수준의 뉴클레아제 안정성을 나타내는 현재 생성 중인 앱타머의 일례인, 비콘쥬게이트화된 앱타머는, 비변형 앱타머에 비하여 혈장 내 신속한 상실(즉, 신속 혈장 소멸률)과 조직, 주로 신장 내로의 신속한 분배를 나타낸다.

PEG - 유도체화된 핵산

전술한 바와 같이, 고 분자량의 비-면역원성 중합체를 사용한 핵산의 유도체화는 핵산의 약동학적 및 약력학적 특성을 변화시켜, 이 핵산이 보다 효과적인 치료제로서의 역할을 할 수 있도록 만든다. 활성의 유리한 변화로는 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성의 증가, 신장을 통한 여과의 감소, 면역계로의 노출 감소 및 치료제의 체내 분배 변화가 포함될 수 있다.

본 발명의 앱타머 조성물은 폴리알킬렌 글리콜(PAG) 성분으로 유도체화시킬 수 있다. PAG-유도체화 핵산에 대한 예시는 본원에 전문이 참고용으로 인용된 문헌으로, 2003 년 11 월 21 자 제출된 미국 특허 출원 제 10/718,833 호에 개시되어 있다. 본 발명에서 사용되는 통상의 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")(폴리에틸렌 옥시드("PEO")로도 지칭) 및 폴리프로필렌 글리콜(폴리 이소프로필렌 글리콜 포함)이 포함된다. 추가적으로, 상이한 알킬렌 옥시드(예, 에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드)의 랜덤 또는 블록 공중합체도 다양한 분야에서 사용될 수 있다. 가장 보편적인 형태 중에서, PEG 같은 폴리알킬렌 글리콜은 다음과 같이, 각 단부가 히드록실기로 종결되는 선형 중합체이다 : HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH. 이러한 중합체, 알파-, 오메가-디히드록실폴리에틸렌 글리콜은 또한 HO-PEG-OH 로도 나타낼 수 있는데, 여기서 기호 -PEG 는 다음과 같은 구조 단위를 나타내는 것으로 이해된다 : -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-(여기에서, n 은 통상적으로 약 4 내지 약 10,000 의 범위이다).

전술한 바와 같이, PEG 분자는 이중-작용성이며, 종종 "PEG 디올" 로도 지칭된다. PEG 분자의 말단부는 비교적 비-반응성인 히드록실 성분, -OH 기로서, 이는 다른 화합물의 반응성 위치에 PEG 를 부착시키기 위해 활성화시키거나 또는 작용부로 전환시킬 수 있다. 이와 같이 활성화된 PEG 디올은 본원에서 이중-활성화 PEG 로 지칭된다. 일례로, PEG 디올의 말단부는 비교적 비-반응성인 히드록실 성분, -OH 를 N-히드록시 숙신이미드로부터 유래된 숙신이미딜 활성 에스테르 성분으로 치환시킴으로써 아미노 성분과 선택적으로 반응하는 활성 카보네이트 에스테르로 작용기화시킨 바 있다.

적용시 대다수의 경우에 있어서는, PEG 분자의 한쪽 단부를 본질적으로 비-반응성인 성분으로 캡핑시켜, PEG 분자가 단일-작용성이 되도록(즉, 단일-활성화되도록) 하는 것이 바람직하다. 일반적으로 활성화 PEG 에 대한 다수의 반응 부위가 존재하는 단백질 치료제의 경우에는, 이중-작용성 활성화 PEG 가 과도한 가교-결합을 유도하여 작용성이 떨어지는 응집체를 생성하게 된다. 단일-활성화 PEG 를 생성하기 위해서는, PEG 디올 분자의 말단부 상에 존재하는 하나의 히드록실 성분을 통상적으로 비-반응성인 메톡시 단부, -OCH₃ 로 치환시킨다. 캡핑되지 않은 PEG 분자의 다른 말단부는 통상적으로 표면 또는 단백질 같은 분자 상의 반응 위치에 부착되도록 활성화될 수 있는 반응성 단부로 전환된다.

PAG 는 통상적으로 물과 다수의 유기 용매 중에서 가용성을 나타내며, 독성과 면역원성이 없는 중합체이다. PAG 의 용도 중 하나는 중합체를 불용성 분자에 공유 결합시켜 결과된 PAG-분자 "콘쥬게이트" 가 가용성이 되도록 만드는 것이다. 예를 들어, 수-불용성 약품인 파클리탁셀은 PEG 와 커플링될 때, 수용성이 되는 것으로 제시된 바 있다[Greenwald 외 다수, J. Org. Chem., 60:331-336 (1995)]. PAG 콘쥬게이트는 종종 용해도 및 안정성 증대뿐 아니라, 분자의 혈류 내 반감기의 연장에도 사용된다.

본 발명의 폴리알킬화 화합물은 통상적으로 크기가 5 내지 80 kDa 이지만, 임의 크기의 것도 사용될 수 있으며, 그 선택은 앱타머 및 그 적용 용도에 따라 좌우된다. 본 발명의 다른 PAG 화합물의 크기는 10 내지 80 kDa 이다. 본 발명의 또 다른 PAG 화합물의 크기는 10 내지 60 kDa 이다. 일례로, PAG 중합체의 크기는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 80 kDa 가 가능하다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 몇몇 실시형태에서는, 중합체가 분지형 PEG 이다. 또다른 실시형태에서, 중합체는 도 2 에 도시된 바와 같이 40 kDa 의 분지형 PEG 이다. 몇몇 실시형태에서, 40 kDa 의 분지형 PEG 는 도 3 에 도시된 바와 같이 앱타머의 5' 단부에 부착된다.

생물학적으로-발현되는 단백질 치료제와는 대조적으로, 핵산 치료제는 통상 활성화된 단량체 뉴클레오티드로부터 화학적으로 합성된다. PEG-핵산 콘쥬게이트는 동일한 단량체 합성을 반복 수행하여 PEG 를 혼입시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, PEG 는 포스포로아미다이트형으로의 전환에 의해 활성화시켜, 고상 올리고뉴클레오티드 합성에 혼입시킬 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 합성은 반응성 PEG 부착 위치의 위치-특이적 혼입으로 종결될 수 있다. 이는 (고상 합성의 최종 커플링 단계에 변형제인 포스포로아미다이트를 사용하여 혼입된) 5'-말단부에 유리 1 차 아민을 첨가함으로써 수행하는 것이 가장 보편적이다. 이러한 방안을 사용할 때, 반응성 PEG(예를 들면, 활성화시 아민과 반응하여 결합을 형성하는 것)는 정제된 올리고뉴클레오티드와 배합하고, 용액 중에서 커플링 반응을 수행한다.

치료제의 생체분배를 변화시키는 PEG 콘쥬게이트화의 능력은 콘쥬게이트의 겉보기 크기(예를 들면, 수력학적 반경의 관점에서 측정)를 포함한 다수의 요인들과 관련되어 있다. 대형 콘쥬게이트(> 10 kDa)는 신장을 통한 여과를 더욱 효과적으로 차단하여, 결과적으로 소형 거대분자(예, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 혈청 내 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다. PEG 콘쥬게이트의 여과 차단 능력은 약 50 kDa 이하까지는 PEG 크기에 따라 증가하는 것으로 제시되었다(반감기는 신장을 통한 제거보다는 대식세포 - 매개성 대사에 의해 규정되므로, 더 이상의 PEG 크기 증가는 유리한 효과를 아주 적게 제공함).

고 분자량 PEG(> 10 kDa)를 생산하는 것은 어렵고, 비효율적이며 또한 고 비용의 작업일 수 있다. 고 분자량 PEG-핵산 콘쥬게이트의 합성에 관한 방안으로서, 이전의 연구는 고 분자량 활성화 PEG 의 생산에 초점을 맞추어 왔다. 이러한 분자를 생산하는 방법 중 하나는 활성화 기를 보유한 중앙 중심부에 2 이상의 PEG 가 부착되어 있는 분지형의 활성화 PEG 를 형성하는 것을 포함한다. 이러한 고 분자량 PEG 분자의 말단부 즉, 비교적 비-반응성인 히드록실(-OH) 성분은 다른 화합물의 반응성 위치에 하나 이상의 PEG 를 부착시키기 위해 활성화시키거나 또는 작용부로 전환시킬 수 있다. 분지형의 활성화 PEG 는 2 이상의 말단부를 가지게 되며, 2 이상의 말단부가 활성화된 경우, 이와 같이 활성화된 고 분자량의 PEG 분자를 본원에서는 다중-활성화 PEG 로 지칭한다. 몇몇 경우에 있어서는, 분지형 PEG 분자의 모든 말단부가 활성화되는 것은 아니다. 분지형 PEG 분자 중 2 개의 임의 말단부가 활성화된 경우, 이러한 PEG 분자를 이중-활성화 PEG 로 지칭한다. 분지형 PEG 분자 중 하나의 말단부만이 활성화된 몇몇 경우에 있어서, 이러한 PEG 분자는 단일-활성화된 것으로 지칭한다. 이러한 방안에 대한 일례로서, 리신 중심부에 2 개의 모노메톡시 PEG 를 부착시킨 후, 반응을 위해 활성화시킴으로써 제조된 활성화 PEG 가 개시된 바 있다(Harris 외 다수, Nature, vol.2 : 214-221, 2003).

본 발명은 다중 PEG 화 핵산을 포함하는 고 분자량 PEG-핵산(바람직하게는, 앱타머) 콘쥬게이트의 비용-효율적인 다른 합성 방안을 제공한다. 본 발명은 또한 PEG-결합된 다량체 올리고뉴클레오티드(예, 이량체화 앱타머)를 포함한다. 본 발명은 또한 PEG 안정화 성분이 앱타머의 상이한 성분들을 구분하는 링커인 예를 들어, PEG 가 단일의 앱타머 서열 내에 콘쥬게이트화되어, 고 분자량의 앱타머 조성물의 선형 배치(linear arrangement)가 일례로, 핵산-PEG-핵산(-PEG-핵산)_n(여기에서, n 은 1 보다 크거나 동일함)이 되는 고 분자량 조성물에 관한 것이기도 하다).

본 발명의 고 분자량 조성물은 분자량이 적어도 10 kDa 인 것들을 포함한다. 조성물은 통상적으로 분자량의 크기가 10 내지 80 kDa 이다. 본 발명의 고 분자량 조성물의 크기는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 80 kDa 이다.

안정화 성분은 본 발명의 고 분자량 앱타머 조성물의 약동학적 및 약력학적 특성을 개선시키는 분자 또는 이 분자의 일부이다. 몇몇 경우에 있어서, 안정화 성분은 2 이상의 앱타머 또는 앱타머 도메인을 근접하게 위치시키거나, 또는 본 발명의 고 분자량 앱타머 조성물의 전체 회전 자유도(overall rotational freedom)를 감소시키는 분자 또는 이 분자의 일부이다. 안정화 성분으로는 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌 글리콜 같은 폴리알킬렌 글리콜, 동종중합체 또는 이종중합체가 가능하다. 기타 안정화 성분으로는 펩티드 핵산(PNA) 같은 중합체가 포함된다. 올리고뉴클레오티드가 또한 안정화 성분일 수 있으며 : 이러한 올리고뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드 및/또는 포스포로티오에이트 같은 변형 결합을 포함할 수 있다. 안정화 성분은 앱타머에 공유 결합되어 있는, 앱타머 조성물의 필수적인 부분이라 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 2 이상의 핵산 성분이 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 성분에 공유적으로 콘쥬게이트화된 고 분자량의 앱타머 조성물을 포함한다. 이러한 폴리알킬렌 글리콜 성분은 안정화 성분으로서 제공된다. 한 분자 내에서 폴리알킬렌 글리콜이 핵산 성분과 함께 연결되도록, 폴리알킬렌 글리콜 성분이 앱타머의 단부 중 어느 한쪽에 공유 결합되어 있는 조성물에서는, 이 폴리알킬렌 글리콜을 결합 성분으로 언급한다. 이러한 조성물에서, 공유 분자의 1 차 구조는 핵산-PAG-핵산의 선형 배치를 포함한다. 일례가 핵산-PEG-핵산의 1 차 구조를 가진 조성물이다. 다른 예로는 핵산-PEG-핵산-PEG-핵산과 같은 선형 배치가 있다.

핵산-PEG-핵산 콘쥬게이트를 제조하기 위해서는, 우선적으로, 단일 반응 부위(예, 단일-활성화된 경우)를 보유하도록 핵산을 합성한다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 반응 부위는 올리고뉴클레오티드의 고상 합성 과정에서 최종 단계로서 변형제인 포스포로아미다이트를 첨가함으로써 5'-말단부에 도입된 아미노기이다. 변형 올리고뉴클레오티드의 보호기 제거 및 정제 후, 활성화된 PEG 의 자발적 가수분해를 최소화하는 용액 중에서 고 농도로 이를 재구성한다. 바람직한 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 1 mM 이며, 재구성된 용액은 pH 8.3 인 200 mM NaHCO₃-완충액을 함유한다. 콘쥬게이트 합성은 고도로 정제된 이중-작용성 PEG 를 서서히 단계적으로 첨가함으로써 개시된다. 바람직한 실시형태에서는, PEG 디올을 숙신이미딜 프로피오네이트로 유도체화하여, 양쪽 단부를 활성화한다(이중-활성화). 반응 후에는, PEG-핵산 콘쥬게이트를 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제하여, 완전히-, 부분적으로- 및 비-콘쥬게이트화된 종으로 분리해낸다. 연결된 다중 PAG 분자(예, 랜덤 또는 블록 공중합체로서) 또는 소형 PAG 연쇄는 결합을 통해 다양한 길이(또는 분자량)로 될 수 있다. 다양한 길이의 PAG 연쇄 사이에 비-PAG 링커가 사용될 수 있다.

2'-O-메틸, 2'-플루오로 및 기타 변형 뉴클레오티드의 변형은 앱타머를 뉴클레아제에 대하여 안정화시키고 이의 생체내 반감기를 증가시킨다. 3'-3'-dT 캡은 또한 엑소뉴클레아제 내성을 증가시키기도 한다(참조 예, 각각 전문이 본원에 참고로 인용된 문헌인 미국 특허 제 5,674,685 호 ; 제5,668,264 호 ; 제 6,207,816 호 ; 및 제 6,229,002 호).

반응성 핵산의 PAG - 유도체화

고 분자량의 PAG-핵산-PAG 콘쥬게이트는 단일-작용성 활성화 PEG 와 하나 이상의 반응성 부위를 함유하는 핵산과의 반응에 의해 제조할 수 있다. 하나의 실시형태에서는, 핵산이 이중-반응성 또는 이중-활성화되고, 2 개의 반응성 부위 : 통상의 포스포라미다이트 합성을 통하여 올리고뉴클레오티드 내로 도입된 5'-아미노기와 3'-아미노기, 예를 들어 도 4 에 개시된 3'-5'-디-PEG 화를 함유한다. 대안적인 실시형태에서, 반응성 부위는 예를 들어, 1 차 아민 부착을 위한 부위로서, 피리미딘의 5 번 위치, 퓨린의 8 번 위치 또는 리보즈의 2 번 위치를 사용하여 내부 위치에 도입시킬 수 있다. 이러한 실시형태에서, 핵산은 수 개의 활성화 또는 반응성 부위를 보유할 수 있으며, 이러한 경우를 다중적으로 활성화되었다고 말한다. 합성 및 정제 후에는, 자발적 가수분해를 최소화함과 동시에, 변형 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 반응성 위치와의 선택적 반응을 증진시키는 조건 하에서 단일-활성화 PEG 와 배합한다. 바람직한 실시형태에서는, 모노메톡시-PEG 를 숙신이미딜 프로피오네이트로 활성화하며, pH 8.3 에서 커플링 반응을 수행한다. 이중-치환 PEG 합성을 위해서는, 올리고뉴클레오티드에 비하여 PEG 를 화학양론적 과량으로 제공한다. 반응 후, PEG-핵산 콘쥬게이트를 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제하여, 완전히-, 부분적으로- 및 비-콘쥬게이트화된 종으로 분리해낸다.

결합 도메인에는 또한 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜 성분이 부착되어 있을 수 있다. 이러한 PAG 는 그 길이가 다양할 수 있으며, 조성물의 목적 분자량을 얻기 위해 적절히 조합하여 사용할 수도 있다.

특정 링커의 효능은 화학적 조성 및 길이 둘 다에 의하여 영향받을 수 있다. 너무 길거나, 너무 짧거나, 또는 트롬빈과 바람직하지 않은 입체적 및/또는 이온적 상호작용을 형성하는 링커는 앱타머와 표적 간의 복합체 형성에 배제될 것이다. 핵산 간 거리를 확보하는 데 필요한 길이보다 더욱 긴 링커는 리간드의 유효 농도를 감소시킴으로써 결합 안정성을 저하시킬 수도 있다. 그러므로, 앱타머의 표적에 대한 친화도를 최대로 하기 위해서는 링커 조성 및 길이를 최적화하는 것이 종종 필요하다.

본원에 인용된 모든 공보 및 특허 문헌들은, 이러한 문헌들이 각각 본원에 참고용으로 혼입되어 있다고 특정하여 개별적으로 기술되어 있다면 본원에 참고로 혼입된 것이다. 공보 및 특허 문헌에 관한 인용은 임의의 문헌이 관련 선행 기술임을 인정하는 것으로서의 의도가 아니며, 또한 이 문헌의 내용 또는 언급된 날짜가 선행 기술에 관한 것임을 인정하는 것도 아니다. 상기 설명에 의하여 기술된 본 발명과 관련하여, 해당 업계의 전문가라면 본 발명이 다양한 실시형태로 실시될 수 있으며, 상기 설명 및 하기 실시예가 이하 첨부된 청구의 범위를 한정하기 위한 것이 아닌 단지 예시하기 위한 것임을 인지할 것이다.

실시예 1 : 앱타머 선별 및 서열

이 프로그램의 전반적인 목표는 트롬빈 활성을 감소 또는 저해함으로써 강력한 항응혈제로서 작용하는 앱타머를 발견하고자 하는 것이었다. 구체적으로, 강력한 앱타머 항응혈제는 트롬빈의 피브리노겐 결합 엑소사이트(exosite) 1 에 결합하고, 이로써 효소 결합에 대해 기질(피브리노겐)과 경쟁하게 된다.

다음 서열을 가진 것으로 사전 동정된 트롬빈 결합 DNA 앱타머와 연관된 신속-소멸 약력학적 특성을 보존하기 위해, 간단한 DNA 조성물을 사용하여 앱타머 선별을 수행하였다 : 5'GGTTGGTGTGGTTGG3' (SEQ ID NO 4)(ARC183). 앱타머 풀로부터 비-중화 엑소사이트 2 를 효과적으로 차단하고자, 10-100 배 몰 과량의 헤파린을 첨가하면서 니트로셀룰로즈 필터 포획을 수행함으로써, 고 친화성 엑소사이트 1 결합체를 발견하였다. 이외에, 프로트롬빈 결합 앱타머 제거를 위해 디자인된 초기 단계에 프로트롬빈 앱타머 복합체를 포획하고 폐기하는 방법, 그리고 프로트롬빈 및 히루딘/트롬빈 복합체의 혼합물을 앱타머 풀과 접촉시킨 후 프로트롬빈/앱타머 및 트롬빈/히루딘/앱타머 복합체를 포획하고 폐기하는 방법을 포함한 다른 방안들을 본 발명의 셀렉스 과정 내로 도입시켰다. 트롬빈/히루딘 복합체를 포함시키는 것은, 헤파린 경쟁이 단독으로 비효과적인 경우에서도 원치않는 비-저해성 결합체의 풀로부터 포획과 제거를 위해 엑소사이트 2 를 효과적으로 제시하기 위함이었다. 궁극적으로, 이들 선별 방안들은 트롬빈의 활성을 생체외 및 생체내에서 감소 또는 저해하였던 트롬빈에 대해 고 친화도를 가진 일련의 앱타머를 생성시켰다.

실시예 1A : 트롬빈 DNA 선별 #1

데옥시-뉴클레오티드(DNA)로 이루어진 뉴클레오티드 풀을 사용하여 니트로셀룰로즈 필터 컬럼에 의거한 선별을 수행함으로써 인체 트롬빈에 결합하는 앱타머를 동정하고, 인체 트롬빈에 대한 고 친화성 앱타머를 수득하였다.

풀 제조

ABI 엑스퍼다이트™(EXPEDITE™) DNA 합성기를 사용하여 다음 서열을 가진 DNA 주형을 합성하고, 이를 표준 방법에 의해 탈보호시켰다 : 5'-GATCGATCCTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGATTTAGCTTCCTCTTACACGC-3' (ARC1488, SEQ ID NO 5). DNA 주형 중 일련의 N 은 뉴클레오티드의 임의 조합으로서, 결과된 앱타머의 독특한 서열 영역을 생성시킬 수 있다. 주형을 표준 조건 하에서 다음 서열의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다 : 5'-GATCGATCCTCAGCCAC-3' (ARC1489, SEQ ID NO 6) 및 5'-TATACGACTCAGCGTGTAAGAGGAAGCTAArA-3' (ARC1490, SEQ ID NO 7). 증폭 후, PCR 생성물을 에탄올 침전시킨 후, 이를 알칼리 가수분해(333 mM NaOH, 90 ℃, 15 분)시키고, 이어서 정제에 앞서 HCl 을 사용한 중화와 포름아미드 로딩 완충액의 첨가를 수행하였다. 10 % 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 가닥들을 분리하고, 고 이동성을 띄며 이동하는 단일 가닥형 DNA 풀을 겔로부터 절제하여, 수동 용출시키고 이소프로판올을 사용하여 침전시켰다. 결과된 풀 서열은 길이가 50 nt 이고, 다음 서열을 가진 ARC1488 의 절단된 역 상보서열이다 : 5'-TCCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTGGCTGAGGATCGATC-3'(ARC1538, SEQ ID NO 8).

선별

인체 트롬빈에 대해 총 12 라운드의 선별을 수행하였다. 라 운드 1 에서는, 3 mL 의 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Calsbad, CA), 2x10¹⁴ 개 분자의 ARC1538 DNA 풀 및 900 pmoles 의 트롬빈(300 nM 최종 농도)(Enzyme research Labs, South Bend, IN)으로 이루어진 결합 반응물을 제조하였다. 이 결합 반응물을 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 중에, 센트렉스 니트로셀룰로즈 필터 컬럼(Schleicher & Schuell, Keene, NH)을 선별용으로 제조하였다. 각 컬럼을 1 mL 의 0.5M KOH 로 15 분 동안 처리하였다. 처리 후, KOH 를 원심분리(2000 rpm, 1분 동안)에 의해 제거하고, 이후 15 분 동안 컬럼을 1 mL 의 ddH₂O 로 처리하였다. 이후, ddH₂O 를 원심분리(2000 rpm, 1 분 동안)에 의해 제거하였다. 제조된 필터 컬럼에 선별용 결합 반응물을 첨가하고, 이를 원심분리(2000 rpm, 1 분 동안)에 의해 통과 회전시켰다. 1 mL 의 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 상기 컬럼을 세척한 후, 이를 통과 회전시켰다. 세척 후, 90 ℃ 로 예열된 1 mL 의 용출용 완충액(7 M 우레아, 300 mM NaOAc, 5 mM EDTA)을 사용하여 3 분 동안 컬럼을 용출한 후, 이를 원심분리(2000 rpm, 1 분 동안)에 의해 통과 회전시키고 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 수거하였다. 이후, 1 용적의 이소프로판올과 1 μl 의 글리코겐을 사용하여 용출물을 침전시켰다.

라운드 1 이후 선별을 위한 모든 후속 라운드에 있어서, 풀로부터 비-특이적 필터 결합체를 제거하고자 양성 선별에 앞서 음성 선별용 컬럼을 도입하였다. 음성 선별용 컬럼은 전술한 바와 같이 제조하였다. 전술한 결합 반응 단계를 진행하기에 앞서, 200 μl 의 1X DPBS(w/Ca²⁺ 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 선행 선별 라운드에서 얻은 60 pmoles 의 풀을 함유하는 혼합물을 음성 선별용 컬럼을 통해 통과시키고, 이를 수거하였다. 선별압 증대를 위해, 후속 라운드에서 경쟁자 tRNA 를 또한 첨가하고, 후반 라운드에서 엑소사이트 2 에 결합함으로써 앱타머가 트롬빈의 엑소사이트 2 에 결합하지 못하도록 헤파린을 양성 선별 단계에 첨가하였다. 사용된 선별 조건은 하기 표 1 에 제시된 바와 같다.

ARC1538 DNA 풀의 증폭에는 5'-단부에서의 포스포릴화 과정에 이어서, 서열의 5'-단부(즉, 최초 ARC1488 합성 DNA 서열의 증폭에 사용된 3-프라이머)에 불변 영역을 특이적으로 결찰시키는 과정과, 후속되는 표준 PCR 증폭 과정이 요구된다. 따라서, 증폭 후, 선별된 풀을 9 ㎕ 의 ddH₂O 및 10 ㎕ 의 2X 키나제 상용성 완충액(8 ㎕ 1M DTT + 1 mL 2X 급속 리가제 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA)) 중에 재-현탁시키고, 1 ㎕ 의 T4 PNK(New England Biolabs, Beverly, MA)를 반응에 첨가하여 37 ℃ 에서 20 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 100 pmoles 의 3' 프라이머, 5'-TATACGACTCAGCGTGTAAGAGGAAGCTAArA-3' (ARC1490) (SEQ ID NO 7) 및 100 pmoles 의 3' 결찰용 프라이머, 5'-GGGATTTAGCTTCC[3T]-3' (ARC1491) (SEQ ID NO 192)를 1 ㎕ 의 T4 리가제(New England Biolabs, Beverly, MA)와 함께 첨가하고, 이를 실온에서 10 분 동안 항온처리하였다. 5' 프라이머, 5'-GATCGATCCTCAGCCAC-3' (ARC1489) 및 3' 프라이머(ARC1490) 둘 다를 함유하는 PCR 혼합물 중에서 200 ㎕ 까지 반응을 진행시켰다. 다음의 조건을 이용하여 PCR 반응을 반복하였다 : 94 ℃ 에서 1 분 동안 변성, 94 ℃ 에서 30 초 동안, 54 ℃ 에서 30 초 동안 및 72 ℃ 에서 1 분 동안 주기적 반복. 최종 생성물이 4 % E-겔(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 추정하였을 때 대략 10 ng/㎕ 에 이르는 시점까지 PCR 주기를 반복하였다(하기 표 1 의 최우측 란에 "PCR 역가(PCR Threshold)"로 지칭). 차후의 DNA 증폭을 위해 이후, 생성물을 더 큰 PCR 반응으로 시딩(seed)하였다(20 ㎕ 를 총 용적 400 ㎕ 의 PCR 로).

증폭 후, PCR 생성물을 에탄올 침전시킨 후, 이를 알칼리 가수분해(333 mM NaOH, 90 ℃, 15 분)시키고, 이어서 10 % PAGE 겔 상에서의 정제에 앞서 HCL 을 사용한 중화와 포름아미드 로딩 완충액의 첨가를 수행하였다. 정제된 생성물을 수동 용출시키고 침전시키며 다음 선별 라운드로 진입하기에 앞서 정량하였다.

선별이 2 개의 분기과정으로 분할되는 라운드 7 까지는 단일 과정으로 선별을 진행하였다(표 1 참조). 선별의 한 분기과정은 엄중도(stringency)를 증대시키고자, 트롬빈 단백질 농도를 감소시킴으로써 측정을 진행하였다.

선별 진행의 모니터링

풀의 단백질 결합 친화도를 모니터링하기 위해 선별 전반에 걸쳐 도트 블롯 분석을 수행하였다. 미량의 ³²P-표지된 RNA 를 인체 트롬빈의 계열 희석액(1 nM-1000 nM)과 배합하고 이를 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg²⁺)(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 0.1 mg/ml BSA 를 합하여 만든 최종 용적 30 ㎕ 중에서 실온으로 30 분 동안 항온처리하였다. 미니폴드 도트-블롯, 96-웰 진공 여과 매니폴드(Schleicher & Schuell, Keene, NH)를 사용한 니트로셀룰로즈 여과에 의해 결합 반응물을 분석하였다. 프로트란 니트로셀룰로즈(Schleicher & Schuell, Keene, NH), 하이본드-P 나일론(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 및 GB002 겔 블롯 페이퍼(Schleicher & Schuell, Keene, NH)로 이루어진(상부에서 하부 순서) 3-층 여과 매질을 사용하였다. 단백질에 결합된 RNA 는 니트로셀룰로즈 필터 상에서 포획되는 반면, 비-단백질 결합된 RNA 는 나일론 필터 상에 포획된다. 겔 블롯 페이터는 단순히 다른 필터를 위한 지지용 매질로서 포함시켰다. 여과 후, 필터 층을 분리하고, 건조시킨 후, 이를 형광체 스크린(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 상에 노출시키고, 스톰 860 포스포리마거®(Phosphorimager®) 블롯 영상화 시스템(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 사용하여 정량하였다. 인체 트롬빈 존재 하에서의 RNA 결합 대 트롬빈 부재 하에서의 RNA 결합에 대한 유의적 양성 비율을 판정함에 있어서, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 풀을 클로닝하였다.

라운드 9 및 12 클로닝 및 서열결정

풀 결합에 의거하여, 라운드 9 및 라운드 12 의 풀을 클로닝 및 서열결정을 위해 선별하였다. 서열 군에 의한 스크리닝을 목적으로, 선별의 양 분기과정으로부터 얻은 라운드 9 및 12 의 풀을 배합하였다. 독특한 DNA 클론 서열을 모두 25 μmole 합성 규모로 합성하였다. 하기 실시예 3A 에 기술된 프로트롬빈 시간(PT 분석)을 이용하여 라운드 9 로부터 얻은 클론을 트롬빈 활성 감소 또는 저해 능력에 대해 스크리닝하였다. PT 분석 결과가 하기 실시예 3 의 표 17 에 보고되어 있다. 라운드 12 의 풀에는 추적할만한 새로운 독특한 서열이 없는 것으로 밝혀졌다.

합해진 라운드 9 의 풀로부터 결과된 클론의 서열들이 하기 표 2 에 기재되어 있다. 각 클론별로 랜덤한 영역이 서열 5'TCCC 이후 시작되어 서열 GTGGCTGAGGATCGTATC 3' (SEQ ID NO 42) 이전에 종결된다. 그러나, 5'-TCCC 서열은 PCR 프라이머의 일부분이 아니므로, 셀렉스 및 서열결정 과정 중에 일부 돌연변이가 일어난 것으로 추정된다. 따라서, 이러한 영역 내 점 돌연변이가 하기 서열에서 일어난 것으로 추정된다. 달리 특정하지 않았다면, 이하 기재된 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타내는 것으로, 이 서열들은 모든 뉴클레오티드가 데옥시인 DNA 셀렉스™ 조건 하에서 선별되었다.

실시예 1B : 트롬빈 DNA 선별 #2 및 #3

니트로셀룰로즈 필터 컬럼 의거한 2 회의 별도 DNA 선별과정을, 1) 음성 셀렉스 단계에 프로트롬빈을 혼입시킴으로써 프로트롬빈보다 인체 트롬빈에 대해 고 친화도를 갖는 앱타머를 동정하기 위한 목적으로 ; 그리고 2) 트롬빈/히루딘 복합체를 음성 선별 단계 내로 첨가함으로써 엑소사이트 2 결합에 대해 편향된 트롬빈 앱타머를 동정하기 위한 목적으로 수행하였다. 트롬빈/히루딘 복합체는 트롬빈의 엑소사이트 1 및 활성 부위를 효과적으로 배제시키므로, 잠재적 엑소사이트 2 결합체를 포획하고 이를 풀로부터 제거하는 것을 가능하게 한다. 추가로, 선별 1 에서와 같이, 후반 라운드에서 엑소사이트 2 에 결합함으로써 앱타머가 트롬빈의 엑소사이트 2 에 결합하지 못하도록 헤파린을 양성 선별 단계에 첨가하였다.

풀 제조 및 선별

새로운 선별에 사용되는 DNA 풀을 상기 실시예 1A 에 기술된 바와 같이 제조하였다. 인체 트롬빈(Enzyme Research Labs, South Bend, IN)에 대해 총 9 라운드의 선별을 수행하였다. 라운드 1 에서는, 3 mL 의 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA), 2x10¹⁴ 개 분자의 ARC1538 DNA 풀 및 900 pmoles 의 트롬빈(300 nM 최종 농도)으로 이루어진 결합 반응물을 제조하였다. 이 결합 반응물을 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 중에, 센트렉스 니트로셀룰로즈 필터 컬럼(Schleicher & Schuell, Keene, NH)을 선별용으로 제조하였다. 각 컬럼을 1 mL 의 0.5 M KOH 로 15 분 동안 처리하였다. 처리 후, KOH 를 원심분리(2000 rpm, 1 분 동안)에 의해 제거하고, 추후 15 분 동안 컬럼을 1 mL 의 ddH₂O 로 처리하였다. 이후, ddH₂O 를 원심분리에 의해 제거하였다. 제조된 센트렉스에 선별용 결합 반응물을 첨가하고, 이를 통과 회전시켰다(2000 rpm, 1 분 동안). 1 mL 의 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 상기 컬럼을 세척한 후, 이를 원심분리(2000 rpm, 1 분 동안)에 의해 통과 회전시켰다. 세척 후, 2000 rpm 에서 1 분 동안 원심분리하기에 앞서 90 ℃ 로 가열된 1 mL 의 용출용 완충액(7 M 우레아, 300 mM NaOAc, 5 mM EDTA)을 컬럼 상에서 3 분 동안 위치하도록 함으로써 컬럼을 상기 용출용 완충액으로 용출하고, 이를 에펜도르프 튜브에 수거하였다. 1 용적의 이소프로판올과 1 ㎕ 의 글리코겐을 사용하여 용출물을 침전시켰다.

라운드 1 이후 모든 후속 라운드에 있어서, 풀로부터 비-특이적 필터 결합체를 제거하고자 양성 선별에 앞서 음성 선별용 컬럼을 추가하였다. 전술한 바와 같이 이 컬럼을 제조하고, 결합 반응을 진행하기 전에, 200 ㎕ 의 DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 선행 라운드로부터 얻은 60 pmoles 의 풀을 함유하는 혼합물을 여과하고, 이를 수거하였다. 선별압 증대를 위해, 후속 라운드에서 경쟁자 tRNA 를 또한 첨가하고, 후반 라운드에서 엑소사이트 2 에 결합함으로써 앱타머가 트롬빈의 엑소사이트 2 에 결합하지 못하도록 하기 위해 헤파린을 양성 선별 단계에 첨가하였다. 사용된 선별 조건은 하기 표 3 에 제시된 바와 같다. 선별된 풀을 상기 실시예 1A 에서 셀렉스에 대해 기술된 바와 같이 증폭시키고 정제하였다.

선별이 2 개의 분기과정으로 분할되는 라운드 3 까지는 단일 과정으로 선별을 진행하였다(표 3 참조). 한 분기과정(선별 2)은 앞서와 같이, 각 라운드의 음성 선별 단계에서 300 nM 의 인체 프로트롬빈을 사용하여 계속 진행하였다. 다른 분기과정(선별 3)은 150 nM 의 프로트롬빈(Athens Research, Athens, GA)을 음성 선별 단계에서 그리고 150 nM 의 트롬빈 및 히루딘(American Diagnostica, Stamford, CT) 복합체를 사용하여 계속 진행하였다.

선별 진행의 모니터링

풀의 단백질 결합 친화도를 모니터링하기 위해 선별 전반에 걸쳐 도트 블롯 분석을 수행하였다. 미량의 ³²P-표지된 RNA 를 인체 트롬빈의 계열 희석액(1 nM-1000 nM)과 배합하고, 이를 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg²⁺)(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 0.1 mg/ml BSA 를 합하여 만든 최종 용적 30 ㎕ 중에서 실온으로 30 분 동안 항온처리하였다. 미니폴드 도트-블롯, 96-웰 진공 여과 매니폴드(Schleicher & Schuell, Keene, NH)를 사용한 니트로셀룰로즈 여과에 의해 결합 반응물을 분석하였다. 프로트란 니트로셀룰로즈(Schleicher & Schuell, Keene, NH), 하이본드-P 나일론(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 및 GB002 겔 블롯 페이퍼(Schleicher & Schuell, Keene, NH)로 이루어진(상부에서 하부 순서) 3-층 여과 매질을 사용하였다. 단백질에 결합된 RNA 는 니트로셀룰로즈 필터 상에서 포획되는 반면, 비-단백질 결합된 RNA 는 나일론 필터 상에 포획된다. 겔 블롯 페이퍼는 단순히 다른 필터를 위한 지지용 매질로서 포함시켰다. 여과 후, 필터 층을 분리하고, 건조시킨 후, 형광체 스크린(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 상에 노출시키고, 스톰 860 포스포리마거® 블롯 영상화 시스템(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 사용하여 정량하였다.

인체 트롬빈의 존재 하에서의 RNA 결합 대 트롬빈의 부재 하에서의 RNA 결합에 대한 유의적 양성 비율을 판정함에 있어서, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 풀을 클로닝하였다.

DNA 선별 #2 및 # 3 으로부터의 라운드 7 : 서열결정 및 클론 스크리닝

전술한 바와 같이 선별 전반에 걸쳐 모니터링한 풀 결합에 의거하여, 선별 #2 및 #3 둘 다로부터 얻은 라운드 7 의 풀을 클로닝 및 서열결정하고, 샌드위치 필터 결합 분석법을 이용하여 트롬빈 결합 능력에 대해 스크리닝하였다. DNA 클론을 순서대로 IDT 에 의해 25 μmole 합성 규모로 합성하였다. 양쪽 선별에서의 라운드 7 풀로부터 수득한 66 개의 합해진 서열 중에서 20 개의 독특한 서열을 1-포인트 도트 블롯 스크린에서 분석하기 위한 용도로 선별하였다. 클론 전사체의 5' 단부를 γ^-32P ATP 로 표지하고, 이 클론 전사체를 센트리셉(Centrisep) 컬럼(Princeton Separation, Adelphia, NJ)을 사용하여 회전 정제하여 과량의 표지체를 제거하였다. 미량의 표지된 클론을 총 30 ㎕ 용적의 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 +/- 10 nM 트롬빈 및 .1 mg/㎖ BSA 와 함께 30 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 상기 실시예 1A 에 기술된 도트-블롯 결합 분석 장치에 결합 반응물을 적용하였다. 선별 클론에 대한 K_D 측정을 위해, 클론 전사체의 5' 단부를 γ^-32P ATP 로 표지하였다. K_D 값은 도트 블롯 결합 분석에서 인체 트롬빈의 계열 희석액(트롬빈에 대한 특정 클론의 친화도에 따라 1 pM 내지 1000 nM 의 범위)을 사용하고, 결과 데이타에 1:1 RNA:단백질 복합체에 관한 공식(결합된 앱타버 분획 = 크기*([트롬빈]/(K_D + [트롬빈]))(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software, Reading, PA)을 적용하여 결정하였다.

라운드 7 로부터 결과된 서열들이 하기 표 4 에 기재되어 있다. 각 클론별로 해당하는 결합 특성이 하기 표 5 에 표로 제시되어 있다. 하기 표 4 에 기재된 각 서열별로, 각 클론에 대해 랜덤한 영역이 서열 5'TCCC 이후 시작되어, 서열 GTGGCTGAGGATCGTATC 3' (SEQ ID NO 42) 이전에 종결된다. 달리 특정하지 않았다면, 이하 기재된 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타내는 것으로, 이 서열들은 모든 뉴클레오티드가 데옥시인 DNA 셀렉스™ 조건 하에서 선별되었다.

DNA 선별 #2 및 # 3 으로부터의 라운드 9 : 서열결정 및 클론 스크리닝

전술한 바와 같이 선별 전반에 걸쳐 모니터링한 풀 결합에 의거하여, 선별 #2 및 #3 둘 다로부터 얻은 라운드 9 의 풀을 또한 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 클로닝하고, 서열결정하였다. 양쪽 선별의 라운드 9 로부터 수득한 136 개의 서열 중에서 130 개의 독특한 서열을, 트롬빈으로의 선택적 결합에 대해 시험하고자, 트롬빈 및 프로트롬빈에 대해 단일-포인트 도트 블롯 스크린으로 분석하기 위한 용도로 선별하였다. 클론을 IDT(Coralville, IA)로부터 25 μmole 합성 규모로 순서를 정하였다. 클론 전사체의 5' 단부를 γ^-32P ATP 로 표지하고, 이 클론 전사체를 센트 리셉 컬럼(Princeton Separations, Adelphia, NJ)을 사용하여 회전 정제하여 과량의 표지체를 제거하였다. 미량의 표지된 클론을 총 30 ㎕ 용적의 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 +/- 10 nM 트롬빈(또는 +/- 50 nM 프로트롬빈) 및 .1 mg/㎖ BSA 와 함께 30 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 전술한 도트-블롯 결합 분석 장치에 결합 반응물을 적용하였다. 선별 클론에 대한 K_D 측정을 위해, 클론 전사체의 5' 단부를 γ^-32P ATP 로 표지하였다. K_D 값은 도트 블롯 결합 분석에서 인체 트롬빈의 계열 희석액(트롬빈에 대한 특정 클론의 친화도에 따라 1 pM 내지 1000 nM 의 범위)을 사용하고, 결과 데이타에 1:1 RNA:단백질 복합체에 관한 공식(결합된 앱타머 분획 = 크기*([트롬빈]/(K_D + [트롬빈]))(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software, Reading, PA)을 적용하여 결정하였다.

DNA 선별 #2 및 #3 의 라운드 9 로부터 결과된 서열들이 하기 표 6 에 기재되어 있다. 각 클론별로 해당하는 결합 특성이 하기 표 7 에 표로 제시되어 있다. 하기 표 6 에 기재된 각 서열별로, 각 클론에 대해 랜덤한 영역이 서열 5'TCCC 이후 시작되어, GTGGCTGAGGATCGTATC 3' (SEQ ID NO 42) 이전에 종결된다. 달리 특정하지 않았다면, 이하 기재된 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타내는 것으로, 이 서열들은 모든 뉴클레오티드가 데옥시인 DNA 셀렉스™ 조건 하에서 선별되었다.

실시예 2 : 조성물 및 서열 적정화와 서열

실시예 2A : DNA 선별 #2 및 #3 트롬빈 앱타머의 최소화

라운드 7 DNA 선별 #2 및 #3 트롬빈 앱타머의 최소화

상기 실시예 1B 에 기술된 바와 같이 K_D 측정을 실시했던 라운드 7 의 클론에 대한 추정적 이차 접힘구조를 결정하고자 RNA 접힘 프로그램(RNA structureⓒ(1996-204) David H. Mathews, Michael Zuker & Douglas H. Turner)을 사용하였다. 고 친화성 클론은 관련 서열로부터 유래한 것으로, 클론 AMX(395)_C1 (SEQ ID NO 49)을 바탕으로 하며, 최소화된 앱타머 서열을 디자인하고 합성하였다. 상기 실시예 1A 에서 기술한 도트 블롯 결합 분석으로 인체 트롬빈의 계열 희석액(트롬빈에 대한 특정 클론의 친화도에 따라 1 pM 내지 1000 nM 의 범위)을 사용하고, 결과 데이타에 1:1 RNA:단백질 복합체에 관한 공식(결합된 앱타머 분획 = 크기*([트롬빈]/(K_D + [트롬빈]))(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software, Reading, PA)을 적용하여, 각 최소화된 구성체에 대한 K_D 값을 결정하였다. 모체 앱타머 AMX(395)_C1 (SEQ ID NO 49)과 해당 K_D 를 바탕으로 하는 최소화된 구성체의 서열이 하기 표 8 에 기재되어 있다. 제시된 바와 같이, 최소화 중에 동정된 결과물로서 27-합체인 ARC1985 는 DNA 선별 #2 및 #3 의 라운드 7 로부터 동정 및 최소화된 모든 클론 중에서도 트롬빈에 대한 최고의 결합 친화도를 나타냈다.

하기 표 8 에 개시된 최소화 DNA 앱타머에 있어서, 모든 뉴클레오티드(A, T, C 및 G)는 데옥시이다. 달리 특정하지 않았다면, 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타낸다.

라운드 9 DNA 선별 #2 및 # 3 로부터 유래된 클론의 최소화

상기 실시예 1B 에 기술된 도트 블롯 결합 분석에서 최고의 결합 친화도뿐 아니라, 하기 실시예 3A 에 기술된 PT 분석에서 최상의 항-응혈 능력을 나타냈던 DNA 선별 #2 및 #3 의 라운드 9 에서 동정된 클론으로부터 전술한 바와 같이 최소화된 구성체를 디자인하였다. 최소화된 구성체의 서열과 각 구성체별 관련 모체 앱타머가 하기 표 9 에 개시되어 있다. 각 최소화된 구성체의 기능적 활성을 하기 실시예 3A 에 기술된 PT 분석에 의해 관련 모체 앱타머와 비교하였다. 디자인된 절단 구성체 중에서, ARC2091 (SEQ ID NO 197)이 PT 분석 결과 모체 클론에 필적하는 효능을 나타냈다(하기 실시예 3A 참조). ARC2091 (SEQ ID NO 197)은 DNA 선별 #2 및 #3 의 라운드 9 로부터 동정 및 최소화된 모든 클론 중에서 최상의 기능적 활성을 나타냈으며, 이는 하기 실시예 2B 에 기술된 도핑된 재-선별과정에서 기초가 되었다.

하기 표 9 에 개시된 최소화 DNA 앱타머에 있어서, 모든 뉴클레오티드(A, T, C 및 G)는 데옥시이다. 달리 특정하지 않았다면, 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타낸다.

실시예 2B : ARC2091 도핑된 재선별

트롬빈에 대한 고 친화성 결합체를 동정하고자, 최소화된 인체 트롬빈 결합 서열 ARC2091 (SEQ ID NO 197)을 바탕으로 도핑된 풀을 사용하여 선별(실시예 2A 에 기술된)을 수행하였다. 도핑된 재선별 과정을 이용하여 활성 클론 또는 최소체 내에서 서열 요건을 연구한다. 단일 서열을 바탕으로 디자인했던 합성의 변성 풀을 사용하여 선별을 수행한다. 변성도의 수준은 보통 70 % 내지 85 % 야생형 뉴클레오티드 범위이다. 일반적으로, 중립 돌연변이가 관찰되지만, 몇몇 경우에서는 서열 변화로 친화도가 개선되는 결과가 얻어질 수 있다. 이후, 복합 서열 정보를 이용하면 최적화 노력으로 최소 결합 특성과 보조를 동정할 수 있다.

풀 제조 :

ABI 엑스퍼다이트™ DNA 합성기를 사용하여 다음 서열을 가진 DNA 주형을 합성하고, 표준 방법에 의해 보호기를 제거하였다 : 5' ATGCTTTTATACCTTCGGCGATACTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCTGAGGATCGCCGAATTTCCCGAGAGTTCC 3' (ARC2082, SEQ ID NO 205). 굵은 글씨체의 뉴클레오티드는 표시된 잔기일 가능성이 85 % 이고 다른 3 종의 뉴클레오티드 중 하나일 가능성이 5 % 임을 나타낸다. 이 주형을 5' 프라이머, 5' ATGCTTTTATACCTTCGGC 3' (ARC2083, SEQ IN NO 206) 및 3' 프라이머, 5' GGAACTCTCGGGAAATTCG 3' (ARC2084, SEQ ID NO 207)을 사용하여 증폭시켰다. 증폭 후, PCR 생성물을 에탄올 침전시킨 후, 이를 알칼리 가수분해(333 mM NaOH, 90 ℃, 15 분)시키고, 이어서 10 % PAGE 겔 상에서의 정제에 앞서 HCl 을 사용한 중화와 포름아미드 로딩 완충액의 첨가를 수행하였다.

선별

트롬빈(Enzyme Research Labs, South Bend, IN)에 대해 총 3 라운드의 니트로셀룰로즈 컬럼-의거한 도핑된 재선별을 수행하였다. 상기 실시예 1A 에서 기술한 바와 같이 센트렉스 컬럼(Schleicher & Schuell, Keen, NH)을 제조하였다. 라운드 1 에서 출발하여, 다음과 같이 풀로부터 비-특이적 필터 결합체를 제거하고자 음성 선별 단계를 포함시켰다. 각 라운드 별로, 상기 실시예 1 에 기술된 바과 같이 음성 필터를 제조하고, 200 ㎕ 의 1X DPBS(500 nM 풀 농도) 중 100 pmoles 의 ARC2082 를 통과 회전시켜 수거하였다. 음성 선별 단계 후, 20 pmoles 의 트롬빈(100 nM 최종 농도), 0.1 mg/㎖ 의 경쟁자 tRNA 및 0.1 mg/㎖ 헤파린을 여과된 풀에 첨가하고, 이를 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 선별압 증대를 위해 경쟁자 tRNA 를 포함시키고, 엑소사이트 2 에 결합함으로써 앱타머가 트롬빈의 엑소사이트 2 에 결합하지 못하도록 하기 위해 헤파린을 양성 선별 단계에 첨가하였다. 각 라운드별 선별 조건은 하기 표 10 에 제시된 바와 같다. 각 라운드별로, 선별용 결합 반응물을 상기 제조된 센트렉스에 첨가하고, 이를 통과 회전(2000 rpm, 1 분 동안)시켰다. 컬럼을 1X DPBS(w/Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +})(Gibco, Catalog #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 세척한 후, 이를 원심분리(2000 rpm, 1 분 동안)에 의해 통과 회전시켰다. 세척 후, 2000 rpm 에서 1 분 동안 원심분리하기에 앞서 90 ℃ 로 가열된 1 mL 의 용출용 완충액 (7 M 우레아, 300 mM NaOAc, 5 mM EDTA)을 컬럼 상에서 3 분 동안 위치하도록 함으로써 컬럼을 상기 용출용 완충액으로 용출하고, 이를 에펜도르프 튜브에 수거하였다. 1 용적의 이소프로판올과 1 ㎕ 의 글리코겐을 사용하여 용출물을 침전시켰다. 5' 프라이머, 5' ATGCTTTTATACCTTCGGC 3' (ARC2083) (SEQ ID NO 206) 및 3' 프라이머, 5' GGAACTCTCGGGAAATTCG 3' (ARC2084) (SEQ ID NO 2084)를 함유하는 PCR 혼합물 중에서 200 ㎕ 까지 반응을 진행시켰다. 다음의 조건을 이용하여 PCR 반응을 반복하였다 : 94 ℃ 에서 1 분 동안 변성, 94 ℃ 에서 30 초 동안, 54 ℃ 에서 30 초 동안 및 72 ℃ 에서 1 분 동안 주기적 반복과정을 최종 생성물이 4 % E-겔(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 의해 측정하였을 때 대략 10 ng/㎕ 에 이르는 시점까지 수행하였다(하기 표 10 의 최우측 란에 "PCR 역가" 로 지칭). 차후 증폭을 위해 이후, 생성물을 더 큰 PCR 반응으로 시딩하였다(20 ㎕ 를 총 용적 400 ㎕ 의 PCR 용적으로). 증폭 후, PCR 생성물을 에탄올 침전시킨 후, 이를 알칼리 가수분해(333 mM NaOH, 90 ℃, 15 분)시키고, 이어서 10 % PAGE 겔 상에서의 정제에 앞서 HCL 을 사용한 중화와 포름아미드 로딩 완충액의 첨가를 수행하였다. 정제된 생성물을 용출시키고 농축시키며 다음 선별 라운드로 진입하기에 앞서 정량하였다. 후속 침전 및 겔 정제를 전술한 바와 같이 수행하였다.

서열결정 및 스크리닝

3 라운드의 선별 후, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 도핑된 풀을 클로닝하고 서열결정하였다. 하기 표 11 에 제시된 바와 같이 총 75 개의 독특한 서열들이 동정되었다. 도핑된 재선별 완료에 앞서, ARC2091 (SEQ ID NO 197)의 트롬빈 결합 친화도를 모두 보유한 ARC2091 (SEQ ID NO 197)의 30-합체 유도체(ARC2169 (SEQ ID NO 283)로도 지칭)를 디자인하여 합성하였다. 도핑된 재선별로부터 얻은 서열에는 ARC2169 (SEQ ID NO 283)의 서열에 의해 규정된 앱타머에 대한 기능성 특징을 가진 중심부 내부 및 외부에 돌연변이가 포함되어 있었다. 이러한 중심부 외부의 돌연변이는 폐기하고, 중심부 내부의 돌연변이만을 ARC2169 (SEQ ID NO 283) 서열과 관련하여 시험하였다. 따라서, 추가 최소화에 대한 효과와 도핑된 재선별로 부터 결과된 가장 보편적인 돌연변이가 앱타머 기능에 미치는 효과를 시험하고자, 도핑된 재선별로부터 얻어진 데이타를 사용하여, 하기 표 11 에 제시된 서열로부터 ARC2169 (SEQ ID NO 283)를 바탕으로 한 클론의 패널을 디자인하였다(표 12 참조). 앱타머 기능에 미치는 돌연변이의 효과는 PT 분석법을 이용하여 측정하였으며, 이는 하기 실시예 3 에 기술되어 있다.

하기 표 11 및 표 12 에 개시된 DNA 앱타머에 있어서, 모든 뉴클레오티드(A, T, C 및 G)는 데옥시이다. 달리 특정하지 않았다면, 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타낸다.

ARC2091 (SEQ ID NO 197) 및 도핑된 재선별 데이타를 사용하여, 하기 표 13 에 제시된 바와 같이, 트롬빈에 대한 결합 친화도의 감퇴없이 26 뉴클레오티드 앱타머(ARC2172 (SEQ ID NO 294)로 지칭)로의 ARC2169 (SEQ ID NO 283)의 추가 최소화를 수행하였다. 하기 표 13 에 개시된 DNA 앱타머에 있어서, 모든 뉴클레오티드(A, T, C 및 G)는 데옥시이다. ARC2169 (SEQ ID NO 283), ARC2171 (SEQ ID NO 293) 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)에 대한 추정 2 차 구조(RNAstructureⓒ (1996-2004) David H. Mathews, Michael Zuker & Douglas H. Turner)가 도 5 에 제시되어 있다. 달리 특정하지 않았다면, 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타낸다.

상기 실시에 1A 에 기술된 니트로셀룰로즈 필터 결합 분석법을 이용하여, ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 결합 친화도를 사전 동정된 트롬빈 결합 DNA 앱타머인 ARC 183 과 비교하였다. 도 6 에서 알 수 있는 바와 같이, ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 ARC183 에 비해 크게 개선된 트롬빈 친화도를 나타낸다.

ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 또한, 인체, 돼지 및 랫 트롬빈(각기 Enzyme Research Labs, South Bend, IN)에 대한 종별 가교-반응성에 대해, 니트로셀룰로즈 필터 결합 분석법을 이용하여 시험하였다. 도 7 에 제시된 바와 같이, ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 인체 트롬빈 외에도 돼지 및 랫 트롬빈에 결합한다.

실시예 2C : 최소화된 클론 ARC1985 및 ARC2169 의 최적화

최소화에 따라 앱타머의 크기가 감소되는 만큼 ACT 분석법(실시예 3B 참조)에 의해 측정된 앱타머 기능이 감소하는 경우, 미미한 전반적 하향 추세가 관찰되었다. 따라서, 초기 최적화 작업은 추정 스템 구조에 부가적인 염기쌍이나 폴리-T 테일을 추가함으로써 분자의 길이를 연장시키는 것을 포함하였다. 하기 표 14 에 그 서열이 기재된 다음 분자들은 ARC1985 (SEQ ID NO 191) 및 ARC2169 (SEQ ID NO 283)를 기초로 하였으며 : 1 내지 5 개의 부가적인 염기쌍이 추가된 ARC2173-ARC2184 를 디자인하였으며 ; 5' 또는 3' 말단부에 3 또는 6 개의 "T" 가 추가된 ARC2185-ARC2196 을 디자인하였으며 ; ARC2183 및 ARC2184 는 사전 선별된 트롬빈 앱타머, ARC 183 과 본 분자 세트간의 임의 유사성을 측정하기 위한 노력으로, ARC1985(ARC2183 에 대해) 또는 ARC2169(ARC2184 에 대해)의 스템 요소들이 ARC183 상으로 혼입된, 사전 선별된 항-트롬빈 앱타머 (ARC183) (SEQ ID NO 4)를 기초로 하는 앱타머이다. 하기 실시예 3B 에 기술된 ACT 분석법으로 단일 포인트 스크린(10 μM 앱타머 농도)을 사용하여, 이들 최적화된 앱타머들을 작용성에 대해 시험하였다.

하기 표 14 에 개시된 DNA 앱타머에 있어서, 모든 뉴클레오티드(A, T, C 및 G)는 데옥시이다. 달리 특정하지 않았다면, 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타낸다.

기본 분자로서 ARC2169 (SEQ ID NO 283)을 사용하여 추가 최적화를 수행하였으며, 모든 염기를 2'-OMe 또는 포스포로티오에이트 염기로 개별 치환하기 위해 일련의 유도체들을 1 μmole 로 합성하였다. 모든 dG(데옥시 구아노신) 염기는 dI(데옥시 이노신) 또는 mI(2'-OMe) 염기로 개별 치환시켰다. 각 분자를 PAGE 에 의해 정제하고, 상기 실시예 1 에 기술된 조건 하에서 도트 블롯 결합 분석법을 이용하여 트롬빈 결합에 대해 분석하였다. 이들 ARC2169 (SEQ ID NO 283) 유도체의 서열 및 결합 특성이 하기 표 15 에 기재되어 있다. 표 15 에 제시된 결합 데이타에 의거하여 볼 때, 단일 치환은 트롬빈 결합을 크게 증가시키지 않는 것으로 판단되었다.

하기 표 15 에 개시된 앱타머에 있어서, "d" 는 데옥시 뉴클레오티드를, "m" 은 2'-OMe 뉴클레오티드를 나타낸다. "I" 는 이노신을 그리고 "s" 는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합을 나타낸다. 달리 특정하지 않았다면, 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타낸다.

실시예 2D : ARC2169 , ARC2170 , ARC2171 및 ARC2172 의 단계 2

생체내 리드 앱타머의 활성에 대한 지속기간(이 화합물의 경우 프로필의 신속 작동/중지가 요구되는 이유로)을 조정하기 위해 우선적으로 추가 최적화 단계를 수행하였다. 이를 위해, 스템 영역에 허용된 2'-OMe 염기들을 사용하여 일련의 구성체를 디자인하였다. 염기쌍 형성을 약화시키고 간혹은 분자의 안정성을 저하시켜 분해를 가속화시키기 위해 A-T 염기쌍 내로 일부 G-C 염기쌍들이 향하도록 스템을 또한 변화시켰다. 모체 분자로서 ARC2169 (SEQ ID NO 283), ARC2170 (SEQ ID NO 292), ARC2171 (SEQ ID NO 293), 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 사용한, 2'-OMe 치환 및 G-C 내지 A-T 염기쌍 형태의 돌연변이에 대해서 하기에 기술되어 있다. 상기 실시예 1 에 기술된 도트 블롯 분석법에 의해 트롬빈 결합을 분석하기에 앞서, 각 앱타머를 1 μmole 합성 규모로 합성하고, PAGE 정제하였다.

이러한 일련의 최적화된 구성체의 서열 및 결합 특징이 하기 표 16 에 기재되어 있다. 하기 표 16 에 개시된 앱타머에 있어서, "d" 는 데옥시 뉴클레오티드를, "m" 은 2'-OMe 뉴클레오티드를 나타낸다. 달리 특정하지 않았다면, 개별 서열들은 5' 에서 3' 방향을 나타낸다.

실시예 2E : 앱타머 -5'- PEG 콘쥬게이트의 합성

스템 길이연장을 이용한 전술한 1 차 최적화 노력으로 얻어진 예비 결과를 기초로, 항-트롬빈 앱타머 ARC2169 (SEQ ID NO 283) 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 소형 5-PEG 콘쥬게이트를 제조하였다. 소형 PEG 가 생체내 기능적 활성의 지속기간(이 화합물의 경우 프로필의 신속 작동/중지가 요구되는 이유로)을 크게 연장시키지 않으면서 앱타머의 효능을 개선시킬 수 있다는 사실을 개념으로 하였다. 화학적 커플링을 용이하게 하고자 우선 앱타머의 5'-아민 변형된 변형체를 합성함으로써 앱타머를 제조하고, AKTA 올리고파이롯트 100 합성기(GE Healthcare Uppsala, Sweden) 상에서, 추천된 제조업체의 지침에 따라, 시판용 표준 DNA 포스포아미다이트(ChemGenes Corp. Wilmington, MA) 및 다음과 같이 표시된 지지체를 사용하여 5'NH2-dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdAdGT3' (ARC2321, SEQ ID NO 435) 및 5'NH2-dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG 3' (ARC2324, SEQ ID NO 436)을 합성하였다 : ARC2327 (SEQ ID NO 439) 및 ARC2338 (SEQ ID NO 438)의 경우, 프라이머 지지체 200 dG(CAT# 17-5262-02, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) ; ARC2329 (SEQ ID NO 440)의 경우, iBu DMT 데옥시구아노신 CPG 지지체(CAT# CPG60N11DGVN, Prime Synthesis, Aston, PA) ; 및 ARC2323 (SEQ ID NO 437)의 경우, DMT 데옥시티미딘 CPG 지지체(CAT# CPG60N11DTN, Prime Synthesis, Aston, PA).

5'-아미노-변형기 TFA 아미노 C-6 CED 포스포아미다이트(ChemGenes Corp. Wilmington, MA)를 사용하여 말단 아민 작용기를 부착하였다. 보호기 제거 후, 슈퍼 Q 5PW (30) 수지(Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA) 상에서 이온 교환 크로마토그래피함으로써 올리고뉴클레오티드를 정제하고 에탄올 침전시켰다.

5'-아민-변형된 앱타머의 분취량을 PEG 성분(예, 2, 5 및 10 kDa PEG 성분)에 사후-합성방식으로 콘쥬게이트화시켰다. 앱타머를 1.5 내지 3 mM 의 농도가 되도록 물/DMSO(1:1) 용액 중에 용해시켰다. 탄산 나트륨 완충액(pH 8.5)을 최종 농도가 100 mM 가 되도록 첨가하고, 올리고를, 동량의 아세토니트릴 중에 용해시킨 1.7-3 배 몰 과량의 목적 PEG 시약(10 kDa Sunbright GL2-400NP p-니트로페닐 카보네이트 에스테르(NOF Corp, Japan))과 함께 밤새 반응시켰다. 결과된 PEG 화 생성물을 슈퍼 Q 5PW (30) 수지(Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA) 상에서 이온 교환 크로마토그래피함으로써 정제하고, 앰버크롬 CG300-S 수지(Rohm and Haas, Philadelphia, PA) 상에서 역상 크로마토그래피를 수행하여 탈염시킨 후, 동결건조하였다.

결과된 PEG 화 앱타머 서열들은 이하에 기재되어 있다. 5' 아민 상대물과 함께 이들 앱타머를, 인체 전혈 내 앱타머의 농도를 변화시켜 가면서 ACT 분석법으로 시험하였다(실시예 3B 참조).

이하에 기재된 각 서열에 있어서, 소문자 "d" 는 데옥시 뉴클레오티드를(이하 기재된 서열에서 모든 뉴클레오티드는 "dT" 가 아닌 "T" 로 표시되어 있어도 "T" 를 포함한 데옥시임), "NH" 는 화학적 커플링을 용이하게 하는 헥실 아민을 나타낸다.

다음의 구조를 포함하는, ARC2323 (SEQ ID NO 437) (ARC2169 + 5'-아민 + 10 kDa PEG) PEG10K--nh-dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdAdGT :

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다음의 구조를 포함하는, ARC2338 (SEQ ID NO 438) (ARC2172 + 5'-아민 + 2 kDa PEG) PEG2K-nh-dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG :

.

다음의 구조를 포함하는, ARC2327 (SEQ ID NO 439) (ARC2172 + 5'-아민 + 5 kDa PEG) PEG5K-nh-dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG :

.

다음의 구조를 포함하는, ARC2329 (SEQ ID NO 440) (ARC2172 + 5'-아민 + 10 kDa PEG) PEG10K-nh-dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG :

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실시예 3 : 생체외 기능적 분석

실시예 3A : 프로트롬빈 분석

조직 인자는 상처 부위에서 방출되는 외인성 응혈 경로의 강력한 유도인자(inducer)이다. 프로트롬빈 시간("PT")은 과량의 조직 인자를 혈장에 첨가하였을 때, 응혈에 이르는 시간을 측정한 것으로, 외인성 경로 인자 VII 및 "보편적" 경로 인자 I(피브리노겐), II(프로트롬빈), V 및 X 의 수준에 가장 민감하다. 트롬보플라스틴으로 지칭되는 PT 시약은 여러 응혈 인자의 활성화에 필요한 보조인자인, 인지질 및 칼륨과 혼합된 조직 인자로 이루어진다. 인자 부전증에 대한 진단과는 별도로, 임상적 PT 는 경구용 항응혈제인 와파린(warfarin), 비타민 K 길항제를 모니터링하는데 가장 보편적으로 사용된다. PT 가 헤파린의 임상적 모니터링에 사용되지는 않으나, 이는 CAGB 에 사용되는 5 U/mL 에 이르는 고 농도 헤파린에 민감하다(예를 들어, 1U/mL 헤파린에서 PT 시간은 정상 제어 상태의 142 % 임 ; 데이타는 미제시).

PT 분석에서는 코아가메이트(Coag-a-mate) 응혈 분석기(Biomerieux, Durham, NC), 동결건조된 트롬보플라스틴(Fisher Scienctific), 시트레이트화 인체 혈장(Innovative Research, Southfield, MI) 및 기지 농도의 앱타머를 사용한다. 기지 농도의 앱타머를 시험 트레이(Biomerieux, Durham, NC)에서 시트레이트화 혈장과 함께 37 ℃ 로 3 분 동안 예비-항온처리하였다. 200 ㎕ 의 트롬보플라스틴-D(Pacific Hemostasis, Fisher Diagnostics, Middletown, VA)(10 mL 의 ddH₂O 중에 동결건조 형태로부터 재현탁된)를 사용하여 응혈을 개시한 후, 코아가메이트 상에서 시험 샘플을 분석하여 응혈 시간을 측정하였다. 샘플은 이중으로 채취하였으며, 이를 단일 PT 시간으로 평균하였다. 임의의 저해제/앱타머의 부재 하에서는 ~13 초의 응혈 시간이 측정되었는데, 이는 임상적 "정상" 제어 범위인 12-14 초의 범주 내에 속한다. 300 초가 기구에 의해 측정되는 최대 수치이다.

전술한 PT 분석법을 이용하여 트롬빈 활성을 감소 또는 저해하는 능력에 대해 트롬빈 DNA 선별 #1 의 라운드 9 로부터 동정된 앱타머(실시예 1A 참조)를 스크리닝하였다. 피브린 중합체 형성의 광학적 검출을 위해 코아가메이트(Biomerieux, Durham, NC)를 사용하여, 토끼 트롬보플라스틴(Pacific Hemostasis, Fisher Diagnostics, Middletown, VA)을 시트레이트화 인체 혈장에 참가함으로써, 3 또는 10 μM 앱타머의 존재 하에서 PT 값을 측정하였다. DNA 선별 #1 의 라운드 9 로부터 동정된 10 μM 의 트롬빈 결합 앱타머에 대한 PT 값이 하기 표 17 에 기재되어 있다. 표 17 에 기재된 PT 값은 배경값을 공제하지 않은 것이다.

전술한 PT 분석법으로 10 μM 앱타머를 사용하여 트롬빈 활성을 감소 또는 저해하는 능력에 대해, DNA 선별 #2 및 #3 의 라운드 7 중에 동정된 트롬빈 결합 앱타머의 최소화된 구성체(실시예 2A 참조)를 스크리닝하였다. 최소화된 구성체 ARC1985 에 대한 PT 값(배경값 포함)이 하기 표 18 에 제시되어 있다.

전술한 PT 분석법으로 10 μM 앱타머를 사용하여 트롬빈 활성을 감소 또는 저해하는 능력에 대해, 트롬빈에 대하여 고 결합 친화도를 나타냈던 DNA 선별 #2 및 #3 의 라운드 9 중에 동정된 선별 트롬빈 결합 앱타머(실시예 2A 참조)를 또한 스크리닝하였다. 그 결과가 하기 표 19 에 제시되어 있다. 하기 표 19 에서 "N/A" 는 PT 값이 측정되지 않았음을 나타낸다.

전술한 PT 분석법으로 10 μM 앱타머를 사용하여 트롬빈 활성을 감소 또는 저해하는 능력에 대해, DNA 선별 #2 및 #3 의 라운드 9 중에 동정된 트롬빈 고 특이적 앱타머의 최소화된 구성체(실시예 2A 참조)를 또한 스크리닝하였다. 이들 최소화된 앱타머에 대한 PT 값(배경값 포함)을 이 최소화된 구성체의 유래가 되는 모체 앱타머의 PT 값과 비교한 결과가 하기 표 20 에 기재되어 있다.

전술한 PT 분석법으로 트롬빈 활성을 감소 또는 저해하는 능력에 대해, 실시예 2B 에 개시된 도핑된 재-선별을 기초로 디자인한 최소화된 구성체를 또한 스크리닝하였다. 그 결과가 하기 표 21 에 제시되어 있다.

전술한 PT 분석법을 사용하여 ARC183 와 비교하여, 트롬빈 활성을 감소 또는 저해하는 능력에 대해 ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 스크리닝하였다. 도 8 에 제시된 바와 같이, ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 동일 몰 농도에서 ARC183 에 비해 더욱 강력한 효능을 가지고 있다.

실시예 3B ; 활성 응혈 시간 분석

ACT 는 내인성 경로 활성인자(activator)를 첨가하였을 때, 비-시트레이트화된 전혈 내 응혈 시간을 측정한 것이다. aPTT 에 보다는 헤파린에 대한 민감도가 떨어지는 관계로(예, 1 U/mL 의 헤파린에서의 ACT 시간은 정상 제어상태의 181 % 임 ; 데이타는 미제시), ACT 는 CABG 중에 고 헤파린 용량을 모니터링하기 위한 목적으로, 침대 옆 시험(bedside test)으로서 보편적으로 사용된다. 다른 응혈 시험과 달리, ACT 는 표준화되어 있지 않으므로 ; ACT 결과는 활성인자의 유형 및 사용 검출 방법에 따라 달라진다. 이 기구에 대한 공개된 표적 응혈 시간은 3-5 U/mL 의 농도에 대응하여, 우회 수술에서 헤파린 항응혈의 경우 > 420 초이다.

ACT + 큐벳(ITC Med, Edison, NJ)을 사용한 광학적 검출을 이용하는 응혈 분석기(Hemochron Jr., ITC Med, Edison, NJ) 상에서 다음의 측정을 실시하였다. 전술한 PT 분석에서 트롬빈에 대한 고 결합 친화도 또는 우수한 PT 값을 나타낸, 실시예 1 및 2 에 개시된 선별 앱타머를, ACT 분석법을 이용하여 트롬빈 활성 감소 또는 저해 능력에 대해 스크리닝하였다. 간략히 설명하면, 70 ㎕ 의 신선 전혈을 기지 농도 범위(0-10 μM)의 선별 앱타머와 함께 예비-항온처리하고, 이를 실온에서 30 초 동안 7 ㎕ 용적으로 혈액에 첨가하였다. 직후, 30 ㎕ 의 25 mM CaCl₂ 를 혈액/앱타머 혼합물에 첨가한 다음, 헤모크론 주니어 응혈 분석기(Hemochron Jr., ITC Med, Edison, NJ)에서 분석하기 위해 37 ℃ 로 예열된 ACT + 큐벳(Hemochron Jr., ITC Med, Edison, NJ) 상으로 상기 샘플을 로딩하였다. 125-150 초의 측정 시간이 ACT 분석에 대한 배경값으로 간주된다. ACT 분석법에 의한 선별 앱타머의 결과가 하기 표 22 에 제시되어 있다. 하기 표 22 에 기재된 ACT 값은 배경값을 공제하지 않은 것이다.

전술한 바와 같이 ACT 분석법을 이용하여, 트롬빈 DNA 앱타머 ARC183 대비, ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 트롬빈 활성 감소 또는 저해 능력을 측정하였다. 도 9 에 제시된 바와 같이, ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 >400 초의 표적 응혈 시간에 도달하는데 ≥ 2 μM 의 앱타머를 필요로 하는 농도-관련 ACT 연장관계를 나타냈다. 2-10 μM 의 농도 범위에서, ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 ARC183 에 비해 현저히 큰 효능을 나타냈다.

전술한 ACT 분석법을 이용하여 10 μM 앱타머 농도에서 트롬빈 활성을 감소 또는 저해하는 능력에 대해, 상기 실시예 2C 에 개시된 최적화 앱타머를 또한 스크리닝하였다. 그 결과가 하기 표 23 에 제시되어 있다.

ARC2169 및 ARC1985 의 루프 영역은 ARC183 의 서열에 대응하도록 돌연변이되어 각각 ARC2183 및 ARC2184 이 산출되었다. 이들 분자들은 하기 표 23 에서 알 수 있는 바와 같이, ARC183 에 비해 효능이 크지 않았다.

전술한 ACT 분석법으로 농도 범위(0-10 μM)의 앱타머를 사용하여, 상기 실시예 2E 에서 개시된 PEG 화 앱타머와 이것의 5'-아민 콘쥬게이트화된 중간체의 ACT 값을 측정하였다. 그 결과가 하기 표 24 에 제시되어 있다.

실시예 3C : 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간( aPTT )

음 전하를 띄는 표면(예, 유리, 실리카, 콜라겐)과의 접촉은 "내인성" 응혈 경로를 활성화시킨다. aPTT 는 음전하 활성인자를 혈장에 첨가하였을 때 응혈되는 시간을 나타낸 것으로, 인자 VIII, IX, XI, XII, 프리칼리크레인, 고 분자량 키니노겐 및 보편적인 경로 성분에 민감하다. 활성인자 이외에 인지질(부분 트롬보플라스틴)을 함유하는 aPTT 시약을, CaCl₂ 첨가를 통한 응혈 개시에 앞서 시트레이트화된 혈장(활성화 단계)과 함께 예비-항온처리하였다. 헤파린(항트롬빈과의 복합체로서)은 내인성 경로와 보편적인 경로 둘 다에서 여러 인자들을 표적화하기 때문에, aPTT 는 PT 에 비해 헤파린에 대한 민감도가 훨씬 더 높으며(예, 1 U/mL 헤파린에서의 aPTT 시간은 정상 제어상태의 >1000 % 임 ; 데이타는 미제시), 이는 저 용량에서 치료용 헤파린을 모니터링하는데 사용할 수 있다.

응혈 개시를 위해 100 ㎕ 의 20 mM CaCl₂ 를 첨가하기에 앞서 혈장/저해제 혼합물을 100 ㎕ 의 aPTT-LS 시약(Pacific Hemostasis, Fisher Diagnostics, Middletown, VA)과 함께 3 분 동안 활성화시킨다는 점만 제외하고는, PT 분석에 대해 기술된 바와 본질적으로 동일한 방법으로, 코아가메이트 기구(Biomerieux, Durham, NC)를 사용하여 인체 혈장에서 aPTT 에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 효과를 ARC183 과 비교하여 측정하였다. 앱타머의 부재 하에서 측정된 ~20 초의 응혈 시간은 임상적으로 정상 범위(20-40초) 이내에 속한다.

도 10 에 제시된 바와 같이, ARC2172 (SEQ ID NO 294)에 대한 aPTT 의 민감도는 PT 에 비해 다소 저하되었으며 ; 그럼에도 aPTT 분석에서의 응혈 시간은 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 항-응혈 활성에 의해 현저히 연장되었다. 더 나아가, ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 aPTT 분석 결과, ARC183 에 비해 현저히 더욱 강력한 효능을 가지고 있음이 재차 밝혀졌다.

실시예 3D ; 어혈의 응고

ARC183 과 비교하여, 어혈의 응고를 차단하기 위해 충분한 시간에 걸쳐 항응혈 효과를 유지하는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 능력을 다음과 같이 측정하였다.

동몰량 농도(5 μM)의 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 또는 ARC183 을 최대 1.5 시간 동안 37 ℃ 에서 인체 전혈 중에 항온처리하고, 응혈 다단과정의 활성화에 대해 시간별로 샘플을 모니터링하였다. 중합된 피브린의 분해를 용이하게 하고, 샘플 유동성을 유지하여 해당 시점을 취할 수 있도록 조직 플라스미노겐 활성인자(5 kU/mL)를 첨가하였다. 프로트롬빈 단백질분해성 단편 1.2 의 ELISA 에 의해 각 시점마다 트롬빈 생성을 분석하고, 이를 응혈 다단과정 활성화의 마커로 사용하였다. 간략히 설명하자면, 샘플을 엔자이그노스트®(Enzygnost®) TAT 마이크로 ELISA(Dade Behring; Deerfield, Illinois ; cat. #OWMG15)의 사전-코팅된 웰에 직접 첨가하였다. 이후, 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA 를 완료하였다. 이들 조건 하에서 항응혈 효능의 증거를 얻고자, 항온처리 개시 시점에 상기 실시예 3B 에 기술된 바와 같이, ACT 를 측정한 결과, 각 화합물별로, 각각 388 초와 266 초의 응혈 시간이 관찰되었다.

도 11 에 제시된 바와 같이, 5 μM 의 ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 어혈에서 30 분 동안 응혈 다단과정의 활성화를 차단하였다. 이러한 효과는 항응혈 효과의 지속시간이 유사 조건 하에서 약 10 분에 불과한 ARC183 을 능가하는 현저한 개선을 나타내는 것으로, ACT 값의 연장이 측정된 ARC2172 (SEQ ID 294)의 효능 개선효과와 대략적으로 일치한다.

실시예 4 : 약력학 및 약동학적 연구

실시예 4 및 5 에 있어서, 모든 질량-의거 농도 앱타머 데이타는 PEG 콘쥬게이트화에 의해 부여되는 질량과는 상관없이, 앱타머의 올리고뉴 클레오티드 부분의 분자량만을 지칭한 것이다.

실시예 4A : 항- 트롬빈 앱타머에 대한 랫 정맥내 일시투여 연구

원하는 생체외 특성을 가진 10 종의 트롬빈 결합 앱타머(ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2172 (SEQ ID NO 294), ARC2324 (SEQ ID NO 436), ARC2327 (SEQ ID NO 439), ARC2338 (SEQ ID NO 438), ARC2329 (SEQ ID NO 440), ARC2840 (SEQ ID NO 423), ARC2321 (SEQ ID NO 435), ARC2323 (SEQ ID NO 437), ARC2828 (SEQ ID NO 411))를, 스프래그-돌래이(Sprague-Dawley) 랫에게 정맥내 일시 투여한 후, 항응혈 약동학적 특징과 관련하여 순위를 지정하고, ARC183 과 비교하였다. 동결건조된 앱타머를 정상적인 염수 중에 용해시키고, 분광 분석에 의해 측정시 제대로 된 농도가 얻어질 때까지 투여 용액의 농도를 정상적인 염수로 조정하며, 결과된 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 샘플 바이알 내로 멸균 여과하여, 이후 사용 시점까지 이를 -20 ℃ 에서 동결시킴으로써, 앱타머 투여 용액을 사전 제조하였다. 해동된 바이알은 투여 중에 습빙(wet ice) 상에서 유지하고, 사용된 바이알은 투여에 사용하지 않을 때에는 4 ℃ 에서 보관하였다.

ARC183 을 제외한 모든 앱타머를 300-700 초의 범위에서 최대 ACT 를 나타내는 용량인 1.5 μmole/kg 으로 투여하였다. ARC183 은 6.35 μmole/kg 으로 투여하였다. 대퇴 및 경정맥에 캐뉼러 삽입된 의식있는 수컷의 스프래그-돌래이 랫에게 유치 경정맥 캐뉼러를 통해 앱타머를 정맥내 투여하였다. 소정의 시점(투여 전 ; 투여 후 0.83, 1.83, 2.83, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 및 60 분 ; 투여 후 60 분까지 기준선 ACT 가 얻어지지 않을 경우에는 투여 후 90 분 및 120 분의 시점이 추가로 사용되기도 하였음)에서, 경정맥 캐뉼러로부터 300 ㎕ 의 혈액 샘플을 채취하였다. 상기 실시예 3B 에 기술된 ACT 분석법을 이용하여 ACT 를 실시간으로 측정하였다.

연구 디자인 및 결과는 도 12 에 요약되어 있다. 모두 ARC2169 (SEQ ID NO 283)의 비-PEG 화된 변형체로서, 각각 24, 26 또는 30 개의 올리고뉴클레오티드로 구성된 ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC2321 (SEQ ID NO 435)은 현저히 낮은 용량에서도 ARC183 에 비해 더욱 강력한 효능을 나타냈다(mole/kg ARC183 투여량의 38-48 % 및 24 %). 이들 3 종의 앱타머를 크기 기준으로 비교하였을 때, 최대 ACT 에 의해 측정한 효능이 증가하는 강력한 추세가 관찰되었다. 또한, 크기 증가와 170 초의 ACT 시간에 의해 표시된 바와 같이 앱타머 활성의 연장 간의 상관관계도 나타났다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 최대 ACT 로 표시된 바와 같이, ARC2949 (SEQ ID NO 434)와 비교하여 효능의 증가를 나타냈다.

미약해진 AU-풍부 2'-OMe 스템을 사용하여 제조한, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 유사 26-합체인 ARC2840 (SEQ ID NO 423)은 신규 앱타머 중에서 최하의 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미약해진 AT-풍부 2'-OMe 스템을 사용하여 제조한, ARC2321 (SEQ ID NO 435)의 30-합체 변형체인 ARC2828 (SEQ ID NO 411)은 ARC2321 (SEQ ID NO 435)와 구분 불가능한 것으로 밝혀졌다. 시험했던 나머지 앱타머들은 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC2321 (SEQ ID NO 435)에 5' 아민 링커 ± 2-10K PEG 기를 첨가한 이들의 변형체이었다. 이들 변형체들은 중간 정도의 효능 증가를 나타냈으나, 또한 약동학적 효과의 연장 면에서는 증가를 나타냈다(도 13 참조).

즉, 시험했던 10 종의 앱타머들은 크기 증가와 PD 효과의 연장(ACT 에 의해 측정)간에 상관관계를 보이며, 효능 증가 방향의 추세에 의해 균형된 약동학적 특성의 범주를 나타냈다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 ARC183 과 비교하여 더 높은 효능을 나타냈다.

실시예 4B ; 스크래그 - 돌래이 랫에서의 정맥내 일시 투여

도 14 에서 제시된 연구 디자인에서 간략히 설명한 바와 같이, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 을 유치 경정맥 캐뉼러를 통해 정맥내(IV) 투여하였다. 정맥내 일시 주사에 추가로, 이들 화합물의 신장 제거를 측정하고자 연구의 일환으로 상기 랫에 샴(sham) 신장 결찰을 시행하였으며 : 신장 결찰 효과와 관련된 샴 수술과 PK/PD 결과에 대한 설명은 하기 실시예 4C 에 기술되어 있다. 주사 후 2 시간까지 정해진 시점에 ACT 측정용으로, 유치 경정맥 카테터를 통해 혈액을 채취하였다. 상기 실시예 3B 에 기술된 바와 같이, ACT(+) 큐벳이 구비된 헤모크론® 주니어 시그내쳐 + 기구를 사용하여 ACT 값을 측정하였다.

ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 투여가 ACT 에 미치는 효과는 도 15 에 제시되어 있으며 관련 매개변수들은 도 16 에 요약되어 있다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 정맥내 일시 투여 결과, 평균 최대 ACT 값이 418 로 나타났다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 2.5-배 mg/kg(4.2-배 mole/kg) 용량으로 ARC183 을 투여한 결과, 평균 최대 ACT 가 328 초로 좀 더 낮게 나왔다. ARC183 의 소멸-속도(off-rate)는 200 초 또는 170 초의 ACT 에 이르는 평균 시간이 각각 2.7 분 및 4.1 분으로 빠르게 나타났다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 200 초 또는 170 초의 ACT 에 이르는 평균 시간이 각각 9.5 분 및 12.2 분을 나타났다. 결론적으로, 샴 수술한 랫에서는 정맥내 일시 투여 후, ARC2172 (SEQ ID NO 294)가 ARC183 에 비해 더욱 강력한 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4C : 신장 결찰된 스프래그 - 돌래이 랫 및 샴-수술 스프래그 - 돌래이 랫에서의 ARC2172 및 ARC183

본 연구의 목적은 신장 결찰된 수컷의 스프래그-돌래이 랫 및 샴-수술한 수컷의 스프래그-돌래이 랫에 있어서, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 약력학적 활성에 미치는 신장 제거 및 그 효과를 측정하고 비교하기 위한 것이다. 완벽한 신장 결찰 수술 또는 샴 수술을 시행한 수컷의 스프래그-돌래이 랫에게 정맥내 일시 투여에 의해 ARC183 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 투여하였다. 이 연구에 대한 디자인이 도 17 에 제시되어 있다.

ACT 측정 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 또는 ARC183 농도 분석을 위해 투여-전 그리고 특정 시점에 혈액을 채취하였다. 실시예 3B 에 기술된 바와 같이 ACT 를 측정하였다. ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 혈장 내 농도는 HPLC 분석법에 의해 측정한 결과, 최저 정량 한계(LLOQ)가 각각 0.05 ㎍/mL 및 0.16 ㎍/mL 로 나타났다. 윈논린™(WinNonlin™), 버젼 5.1(Pharsight Corporation, Mountainview, CA)을 사용하는, 비-구획 및 Emax 모델(E=E0+(Emax-E0)*(Cγ/(Cγ+EC50γ))에 의해 개별 혈장 내 농도-시간 프로필을 사용함으로써, 각각 PK 및 PK/PD 분석을 수행하였다. 신장-결찰 랫과 샴-수술 랫의 C_max, AUC_last 및 MRT_last 와 관련하여 변수(ANOVA, α=0.05) 통계학적 분석의 원-웨이 분석법을 이용하였다.

신장-결찰군 및 샴-수술군에 대한 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183의 약력학적 프로필(ATC)이 도 18 및 도 19 에 각각 제시되어 있다. 샴 랫 및 신장-결찰 랫에서 ARC2172 (SEQ ID NO 294)에 의해 도달된 평균 최대 ACT 는 각각 422 초 및 419 초인 반면, ARC183 에 대한 최대 ACT 평균은 각각 325 초 및 363 초이었다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 평균 ACT 는 15 분 이내에 최대 수치에서 170 초로 떨어진 반면에, ARC 183 의 경우, 평균 ACT 는 5 내지 10 분 이내에 170 초로 급락하였다. ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 전반적인 PD 프로필은 샴-수술 랫과 비교하였을 때, 랫의 신장 결찰에 의해 크게 영향받지 않았다(P > 0.05, Mann-Whitney test 이용). 그러나, 초기 시점(ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 경우 t=5-20 분 및 ARC183 의 경우 t=0.83-5분)에서는 샴-수술 랫과 비교하였을 때, 작지만 통계학적으로 유의한, 랫의 신장 결찰 효과가 있었다(P < 0.05, Mann Whitney test 이용).

신장-결찰 랫 및 샴-수술 랫 둘 다에 있어서 정맥내 투여 후, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 둘 다에 대한 혈장 내 농도-시간 프로필은 이상형태(biphasic)를 나타냈다. 신장-결찰군은 샴-수술군과 비교하여, 양 화합물에 대해 대다수 샘플링 시점에서 혈장 내 농도 증가를 나타냈다. ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 C_max 및 AUC_{0 -last} 의 증가는 P < 0.05 로, 통계학적으로 유의한 것으로 나타났다.

요약하면, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 의 전반적인 PD 프로필은 샴-수술 랫과 비교하여, 랫의 신장 결찰에 의해 크게 영향받지 않았다(P > 0.05, Mann-Whitney test 이용). 그러나, 초기 시점(ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 경우 t=5-20 분 및 ARC183 의 경우 t=0.83-5분)에서는 샴-수술 랫과 비교하여, 작지만 통계학적으로 유의한, 랫의 신장 결찰 효과가 있었다(P < 0.05, Mann-Whitney test 이용). 1 회 정맥내 일시 투여 후 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 둘 다의 전반적 노출에 대해 신장-결찰 랫은 샴-수술 랫에 비해 작지만 통계학적으로 유의한 효과를 나타냈다. 신장-결찰 랫에서 ARC2172 (SEQ ID NO 294)에 대한 평균 C_max 및 AUC_{0 - last} 값은 샴-수술 랫에 비해 ~1.5- 배 및 2-배 더 높았다. ARC183 의 경우는 신장-결찰 랫에서의 평균 C_max 및 AUC_{0 - last} 값이 샴-수술 랫에 비해 ~2.4-배 및 2.9-배 더 높았다. 통계학적 분석에 따르면, 신장-결찰 랫에 대한 MRT_{0 - last} 는 ARC183 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 둘 다에 대해 샴-수술 랫과 비교하여 유의적 차이를 나타내지 않았다. 이 데이타는 신장 손상의 가장 심각한 형태인 신장 결찰 랫 모델에서, ARC2172 의 약력학적 효과가 최소의 영향만을 받음을 나타낸다. 어떠한 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 극심한 신장 손상(양측성 결찰)을 나타내는 이러한 랫 모델에서 ARC2172 가 미미한 약력학적 가역성(200 초의 평균 ACT 값으로 복귀하기 위한 시간)의 변화 및 단지 중간 정도의 약력학적 변화를 나타낸 것으로 보아, 신장 제거는 ARC2172 에 대한 소멸의 1 차적 메카니즘으로 보이지 않는다. 또한, 어떠한 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 데이타를 함께 고려할 때, 신장 손상 환자에 있어서는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)에 대한 용량 조정이 반드시 필요하지는 않다고 제안된다.

실시예 4D : 항- 트롬빈 앱타머 순위 결정을 위한 원숭이 정맥내 일시 투여 연구

실시예 4A 에 기술된 랫 연구에서 비교했던 4 종의 트롬빈 결합 앱타머(ARC2172 (SEQ ID NO 294), ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2169 (SEQ ID NO 283) 및 ARC2840 (SEQ ID NO 423))를 원숭이에서 정맥내 일시 투여 연구로 평가하였다(ARC2169 (SEQ ID NO 283)는 30 뉴클레오티드 ARC2321 (SEQ ID NO 435)에서 5' 아민이 없는 변형체이다). 동결건조된 앱타머 또는 펩티드를 정상적인 염수 중에 용해시키고, 분광 분석에 의해 측정시 제대로 된 농도가 수득될 때까지, 투여 용액의 농도를 정상적인 염수로 조정하며, 결과된 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 샘플 바이알 내로 멸균 여과하여, 이후 사용 시점까지 이를 -20 ℃ 에서 동결시킴으로써, 앱타머 투여 용액을 제조하였다. 해동된 바이알은 투여 중에 습빙 상에서 유지하고, 사용된 바이알은 투여에 사용하지 않을 때 4 ℃ 에서 보관하였다.

사이노몰구스 원숭이에 대한 다음과 같은 정맥내 일시 투여 연구에 있어서, 모든 앱타머는 0.46 μmole/kg 으로 투여하였다. 마취한 사이노몰구스 원숭이의 두부 정맥 내에 정맥내 카테터를 위치시키고, 이를 사용하여 앱타머를 일시 투여하였다. 유체 유지와 카테터 개방을 위해 대략 5-10 mL/kg/hr 의 속도로 상기 두부 정맥 카테터를 통해 락테이트화된 링거 용액을 제공하였다. 전술한 바와 같이, 일시 주사(총 용량 = ~3 mL) 후 1 시간 동안 정해진 시점에, 혈관 접근구로부터 혈액을 채취하였다. 모든 앱타머에 대해, 시점은 투여 전 및 투여 후 0.83, 1.83, 2.83, 5, 10, 15, 20, 30, 45 및 60 분으로 하였으며 ; ARC2169 (SEQ ID NO 283)의 경우는 투여 후 90 분 및 120 분의 시점을 추가로 실시하였다. 상기 실시예 3B 에 기술된 바와 같이, ACT+(ITC Med Edison, NJ)를 사용한 헤마크론 주니어 시그내쳐 + 기구(ITC Med, Edison, NJ)로 활성화된 ACT 를 실시간 측정하였다.

도 20 및 도 21 은 그 결과를 요약한 것이다. 모든 앱타머는 랫에서 사용했던 용량의 31 % 에 해당하는 molg/kg 용량을 원숭이에 사용하여 달성한 최대 ACT 에 의해 입증된 바와 같이, 랫의 정맥내 일시 투여 모델(실시예 4A)에서 얻었던 결과와 비교하여 원숭이에서는 효능 증대가 나타났다. AU-풍부 2'-OMe 스템을 보유한 26-합체인 ARC2480 (SEQ ID NO 423)은 최대 ACT 가 단지 223.3 초이고, 170 초의 ACT 에 이르는 시간이 2.2 분으로, 최하의 효능을 나타냈다. ARC2949 (SEQ ID NO 434)의 경우, 최대 ACT 는 402.7 초이고, 170 초의 ACT 에 이르는 시간은 14.9 분으로 나타났다. ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC2169 (SEQ ID NO 283)은 최대 ACT(각각 526.8 및 541.7 초) 면에서 아주 유사한 결과를 나타냈지만, 170 초의 ACT 에 이르는 시간은 ARC2169 (SEQ ID NO 283)의 경우 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 거의 2 배 길게 나타났다(54.6 분 대 24.9 분).

실시예 4E : 사이노몰구스 원숭이에 있어서 ARC2172 및 ARC183 의 정맥내 일시 + 점적 투여

ARC2172 (SEQ ID NO 294) 및 ARC183 를 사이노몰구스 마카큐에서 다음의 1 회 정맥내 일시 + 연속 1 시간 정맥내 점적 투여 연구로 평가하였다. 도 22 에 연구 디자인에 의해 제시된 바와 같이, 사이노몰구스 원숭이에게 정맥내 일시 투여 직후, 1 시간 동안 연속 점적 투여를 시작으로 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 또는 ARC183 을 투여하였다.

전술한 바와 같이, 혈관 접근구로부터 혈액을 채취하고, 상기 실시예 3B 에 기술된 바와 같이, ACT+ (ITC Med, Edison, NJ) 카트리지를 사용하는 헤마크론 주니어 시그내쳐 + 기구(ITC Med, Edison, NJ)로 ACT 값을 측정하였다.

ARC2172 (SEQ ID NO 294) 또는 ARC183 의 정맥내 일시 + 1 시간 점적 투여 후 ACT 에 의해 측정한 효과는 도 23 에 제시되어 있으며, 관련 매개변수들은 도 24 에 요약되어 있다. 5 μM 의 혈장 내 농도를 목표로 하여, ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 정맥내 일시 + 1 시간 점적 투여한 결과, 평균 최대 ACT 값이 397 초이고, 200 초 또는 170 초의 ACT 에 이르는 평균 시간이 각각 22.2 분 및 26.5 분으로 나타났다. 7.5 μM 의 혈장 내 목표 농도를 달성하고자 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 용량을 증가시킴에 따라, 평균 최대 ACT 가 414 초로 연장된 반면, 200 초 또는 170 초의 ACT 에 이르는 평균 시간은 각각 13.9 분 및 18.0 분으로 나타났다(ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 두 투여 방식 간의 후자 시간에서 나타나는 차이는 실험적 오류 범위 내에 속함). 15 μM 의 혈장 내 농도를 달성하고자 ARC183 을 정맥내 일시 + 1 시간 점적 투여한 결과, 평균 최대 ACT 는 343 초로, 200 초 또는 170 초의 ACT 에 이르는 평균 시간은 각각 4.9 분 및 7.3 분으로 나타났다. 즉, ARC183 의 결과를, 전체 투여 용량이 ARC183 의 mg/kg 투여 용량의 7 % 에 이르는 저 용량 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 투여에서 관찰된 결과와 비교한 결과, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 처치는 점적 투여 중에 대략 400 초의 안정된 ACT 를 나타낼 수 있었다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)에 대한 소멸-속도는 ARC183 과 비교하여 대략 4 배 정도 느리게 나타났다.

실시예 4F : 약력학적 약물 상호작용

혈소판 응집에 미치는 ARC2172 의 효과

피브린 생성과는 별도로, 트롬빈은 혈소판을 활성화시킴으로써 혈병 형성을 추가 자극한다. 생체외에서, 혈소판은 트롬빈, 콜라겐 및 ADP 를 비롯한 다양한 작용제에 의해 활성화된다. 일단 활성화되면, 혈소판은 형태, 수용체 발현 및 방출 인자 면에서 극심한 변화를 겪게 된다. 이러한 변화들은 특정 조건 하에서 혈소판 응집을 유도하며, 이러한 응집은 기타 세포의 존재에 따라 좌우되지 않는다. 전혈의 저속 원심분리에 의해 혈소판 풍부 혈장(PRP)이 생성된다. 이 PRP 에 혈소판 작용제를 첨가하면 혈소판 활성화와 응집을 유도할 수 있다. PRP 에서의 혈소판 응집은 정상적으로는 혼탁했던 PRP 가 혈소판이 응집되어 용액으로부터 침전됨에 따라 맑게 되는 것을 흡광도 조사에 의해 모니터링할 수 있다. 본 연구의 목적은 인체 PRP 에서 혈소판 응집에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 효과를 평가하고자 하는 것이었다.

PRP 를 다양한 농도의 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 존재 및 부재 하에서 α-트롬빈(0.25 유닛/mL) 또는 ADP(10 μM)과 혼합하였다. 광학적 응집측정기를 사용하여 혈소판 응집을 평가하였다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 ADP 에 의해서가 아닌, 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집(즉, 수용체 GPIIb/IIIa 의 활성화)을 저해하였다(도 25). 이들 데이타는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)가 트롬빈에 고 친화도로 결합하는 트롬빈 작용제임을 입증한다.

아스피린 및 인테그릴린의 활성에 미치는 ARC2172 의 생체외 효과

생체외에서, 혈소판은 트롬빈, 콜라겐 및 ADP 를 비롯한 다양한 작용제에 의해 활성화되거나, 또는 아스피린 또는 혈소판 IIb/IIa 저해제 같은 길항제에 의해 저해된다. 본 연구의 목적은 인체 PRP 에서 혈소판 응집에 대한 아스피린, 디술피드-결합된 헵타펩티드 GPIIb/IIIa 저해제인, 인테그릴린의 활성에 미치는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 효과를 평가하고자 하는 것이다.

PRP 를 아스피린(6 mg/L)의 존재 및 다양한 농도의 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 존재 및 부재 하에서 인테그릴린(1 μM)과 함께 실온에서 20 분 동안 예비 항온처리하였다. 광학적 응집측정기를 사용하여 ADP(3 μM)에 의한 혈소판 응집에 대해 평가하기에 앞서, 이 혈소판 혼합물을 37 ℃ 에서 3 분 동안 예열하였다. 아스피린은 인체 PRP 에서 ADP-유도된 혈소판 응집을 저하시키는 반면에, 인테그릴린은 아스피린 존재 및 부재 중에, 인체 PRP 에서 ADP-유도된 혈소판 응집을 완전히 차단하였다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 아스피린 또는 인테그릴린의 활성을 감소 또는 저해하지 않았다(도 26).

실시예 5 : 기능적 동물 연구

실시예 5A : 개방, 비-헤파린 결합된 우회 순환로에서의 ARC2172

개방, 비-헤파린-결합된 우회 순환로를 이용한 돼지의 심폐 우회 모델에서 ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 평가하였다. 우회 개시에 앞서 목표 ACT 인 400 초를 달성하고자, 일시 투여 또는 일시 + 점적 투여에 의해 염수(n=2), 헤파린(n=5) 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)(n=5, 동물 38 및 39 는 통계 분석에서 제외시킴)로 동물을 처치하였다. 제 3 군의 동물(n=2)에게는 항응혈제 처치를 하지 않았으며, 심장정지 및 대동맥 교차 차단을 시행하지 않았다. 이에 대한 연구 디자인이 도 27 에 도시되어 있다.

ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 202 mmol/g 을 로딩하면서 프라이머서포트 200 상에서 합성하였다. 표준 합성 사이클에서 1.8 당량의 아미다이트 및 3 당량의 산화제를 사용하였다. 아세토니트릴 중 20 % 디에틸아민으로 사후 합성 염기 세척을 실시하고, 밤새 암모니아로 탈보호시킨 다음, 제조용 SAX-HPLC 를 수행하였다. 이후, 앱타머를 동결건조한 후, 20.0 mg/ml 농도의 멸균 염수 중에서 재현탁시켰다. 돼지 췌장으로부터 준비한 나트륨 헤파린을 본 연구에서 사용하였다.

돼지 우회 모델

도 27 에 도시한 바와 같이, 수컷 및 암컷 돼지들을 다양한 처치군으로 랜덤하게 분류하였다. 동물 38 및 39 는 통계 분석에서 제외시켰다.

외과적 준비에 앞서 아트로핀 SO4/텔라졸®/크실라진(각각 0.04 mg/kg/4-6 mg/kg/2 mg/kg 근육내[IM] 투여)으로 동물을 사전-마취시켰다. 동물을 삽관 처치하고, 용량-조절형 호흡기를 통해 이소플루란 흡입 마취제를 전달하여 마취 상태로 동물을 유지시켰다.

마취 개시 후, 대퇴 동맥 및 정맥에 캐뉼러를 삽입하여 혈압을 모니터링하고 각각 혈액 샘플을 채취하였다. 염수를 서서히 흘리거나 또는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 점적하면서 대퇴 동맥 캐뉼러를 개방상태로 유지하였다.

흉골 길이를 따라 피부를 절개하였다. 흉골을 절개한 후, 흉강을 개방하였다. 보비(Bovi) 전기소작기 탐침을 사용하여 지혈을 실시하였다. 심막을 개방시켜 심장으로 접근하였다. 주변 조직으로부터 대동맥을 절단하고, 5.0 폴리에스테르 봉합사를 사용하여 심장으로부터 4 cm 떨어진 상행 대동맥에 쌈지 봉합사(purse string suture)를 위치시켰다. 마찬가지로, 5.0 폴리에스테르 봉합사를 사용하여 우측 심방이에 쌈지 봉합사를 위치시켰다. 봉합사 설치 후, 동물을 헤파린 또는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)로 처치하였다. 헤파린(40,000 내지 60,000 유닛)을 수회 정맥내 일시 투여하여 ACT 플러스 시스템(Medtronic, Minneapolis, MN)으로 측정시 400 이상의 ACT 를 그리고 실시예 3B 에 기술된 ACT + 시험 큐벳(ITC Med, Edison, NJ)이 구비된 헤모크론 주니어 시그내쳐 + 미세응혈 기구(ITC Med, Edison, NJ) 상에서 약 1000 의 ACT 를 달성하였다. 일반적으로 헤파린 용량을 조정하고, ACT 가 제대로 된 범위에 있음을 확인하는데에 10 내지 20 분이 소요되었다. ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 일시 + 연속 정맥내 점적(0.139) 방식으로 투여하여 실시예 3B 에 기술된 ACT + 시험 큐벳(ITC Med, Edison, NJ)이 구비된 헤모크론 주니어 시그내쳐 + 미세응혈 기구(ITC Med, Edison, NJ) 상에서 대략 400 초의 ACT 를 달성하였다. 일반적으로, 약물을 투여하고, ACT 가 제대로 된 범위에 있음을 확인하는데에 10 내지 20 분이 소요되었다.

적당한 용량의 항응혈제를 투여한 후, 동맥 및 정맥 캐뉼러를 위치시켰다. 연결에 앞서 조심스럽게 대동맥 캐뉼러와 동맥 라인 둘 다를 염수로 채워 기포를 제거하고, 대동맥 캐뉼라를 심장/폐 기계의 사전-프라이밍된 동맥 라인에 신속하게 부착하였다. 동맥 라인을 급속 차단하였다. 유사 기술에 의해, 우측 심방이에 정맥 캐뉼러(29/37 2 단계 정맥 캐뉼러, Medtronic, Minneapolis, MN)를 위치시키고 봉합한 후, 이 캐뉼러를 심장/폐 기계의 정맥 라인에 부착하였다. 비-헤파린-결합된 부품들(친화성 CVR 심장절개기/정맥 저장소 및 혈장 내성 화이버를 포함한 막형 산화기, Medtronic, Minneapolis, MN)로 전체 우회 순환로를 구성하였다. 계속해서, 동물을 3 시간 동안 심폐 우회기 상에 위치시켰다. 심장/폐 기계의 동맥 및 정맥 라인에는 혈전의 존재를 모니터링하기 위해 동물과 기계 사이 중간에 도플러 초음파 탐침기를 부착시켰다. 시술 중에 직접 혈압을 모니터링하고, a) 우회 혈류 속도의 조정, b) 정맥내 체액의 투여 및 c) 정맥내 주사를 통한 각종 약물, 예를 들면 네오시네프린, 도파민, 에피네프린 및 칼슘의 투여에 의해 우회 중에 혈압을 실효상태로 유지하였다. 이소플루란 기화기 유속 및 필요에 따라서는 펜토바르비탈의 정맥내 일시 투여를 조정함으로써, 동물을 마취 수술 면에서 유지하였다.

3 시간 우회를 완료한 후, 동물을 우회기에서 분리시키고, 혈압이 안정되었을 때 캐뉼러를 제거한 후, 프로타민으로 처치하거나(헤파린 처치군) 또는 앱타머 주입을 중단함으로써(ARC2172 처치군), 항응혈제 활성을 중지시켰다. 약물 주입 중단 후 추후 1 시간 동안 동물을 유지시켰다. 정맥내 네오시네프린 및/또는 정맥내 체액 투여를 병합하여 우회-후 혈압을 실효상태로 유지하였다. CPB 연구 프로토콜에 대한 개요가 도 28 에 제시되어 있다.

거대 혈병 또는 피브린 침착의 증거를 위한 심폐 우회 순환로의 ACT 분석 및 검사

스케쥴 상의 샘플 수집 시점에 신선 전혈의 샘플을 수득하고, 즉시 실시예 3B 에 기술된, ACT + 시험 큐벳(ITC Med, Edison, NJ)이 구비된 헤모크론 주니어 시그내쳐 + 미세응혈 기구(ITC Med, Edison, NJ)와 ACT 플러스 시스템(Medtronic, Minneapolis, MN)을 둘 다 사용하여 이를 측정하였다. 각 실험 종결 후, 심폐 우회 순환로를 염수로 세척하고(flush), 거대 혈병 형성에 대한 증거를 위해 저장소, 산화기 막 및 동맥 필터를 검사하고 촬영하였다.

대조군 동물의 ACT 값은 시술 중에는 비교적 일정하게 유지되었으나, 우회 후 난조를 보였다(도 29). 우회 개시 15 분 이내에 우회 순환로에서 대형 거대 혈병이 관찰되었으며, 그 크기가 너무 커서, 우회 3 시간 후 우회 순환로를 통과하는 흐름이 거의 중단되었다.

헤파린 투여 후, 본 처치군의 동물은 보통 기준을 벗어난(1000 초 이상)의 높은 ACT 값을 예외적으로 나타냈다(도 30 참조). 이렇게 상승된 값으로 ACT 를 유지하고자 동물에게 반복적으로 일시 투여를 실시하였다. 실험 말기에 프로타민을 투여한 결과 ACT 값이 기준선으로 복귀되었다. 우회 순환로에서 거대 혈병이 관찰되지 않았다.

일시 + 점적 투여에 의해 ARC2172 (SEQ ID NO 294)로 처치한 동물에서는, 우회 중에 ACT 가 비교적 좁은 범위 내에서 유지되었으며, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 투여를 중단한 지 20 분 이내에 기준선으로 ACT 가 복귀되었다(도 31). 우회 순환로에서 거대 혈병이 관찰되지 않았다. 사용한 각 항응혈제별로 우회 중의 ACT 를 비교한 결과가 도 32 에 제시되어 있다.

전혈 ACT 및 T/ ATIII 복합체 형성간의 상관관계 :

우회 중에, 응혈 다단과정 활성화의 간접 측정으로서, 트롬빈/항-트롬빈 III(TAT) 복합체의 존재를 모니터링하고자, 시트레이트화된 혈장 샘플을 수집하였다. 간략히 설명하면, 비희석 혈장 샘플을 엔자이그노스트® TAT 마이크로 ELISA(Dade Behring ; Deerfield, Illinois ; cat. #OWMG15)의 사전-코팅된 웰에 직접 첨가하였다. 이후, 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA 를 완료하였다. 자동화 플레이트 세척기(Bio-Tek ; Winooski, Vermont ; cat. #ELx405 Magna MVR)를 사용하여 모든 세척 단계들을 완료하였다. 버사맥스(Versamax) 동조식 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices ; Sunnyvale, Califormia)를 사용하여 흡광도 수치를 측정하였다. 모든 동물에서, 혈장 내 TAT 복합체 농도를 기준선 10 ng/ml 미만에서 측정하였다. 항응혈제를 처치하지 않은 대조군 동물에서, TAT 복합체는 우회기 상에 위치시키고 수분 이내에 혈장 내에서 축적되기 시작하여, 우회 중단 직전에는 최대 150+/-87 ng/ml 에 도달하였다. 이들 동물에서는 혈장 내 TAT 복합체 농도가 우회 후 관찰 기간 중에 감소되었으나, 기준선으로 복귀되지는 않았다(도 33 참조). 대조적으로, 헤파린 처치군은 비교적 낮은 혈장 내 TAT 복합체 농도(< 50 ng/ml)로 나타난 바와 같이 우회 중에 응혈 다단과정의 활성화를 저해하였다(도 34 참조). 헤파린은 트롬빈 활성의 저해 이외에도, 내인성 응혈 다단과정 상에서 다수 응혈 인자들의 활성이 더욱 높아지는 것을 저해한다.

ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 우회 순환로에서 거대 혈병의 형성을 방해하지만, 이는 우회 개시 이후 혈장 내 TAT 복합체 농도의 급속한 상승으로 알 수 있는 바와 같이, 응혈 다단과정의 활성화를 저해하지는 않았다. 그러나, TAT 복합체 농도는 대조군 동물에서와 같이 그렇게 높지 않았다. 어떠한 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 결과는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)가 단지 트롬빈의 활성을 감소시킬 뿐, 내인성 응혈 다단과정에서 기타 다른 활성화된 응혈 인자들의 활성이 더욱 높아지는 것을 감소시키지는 않는 것으로 예측된다.

요약하자면, 개방, 비-헤파린-결합된 우회 순환로를 이용한 돼지의 심폐 우회 모델에서 ARC2172 (SEQ ID NO 294)를 평가하였다. 우회 개시에 앞서, 목표 ACT 인 400 초를 달성하고자(헤마크론 주니어 기구에 의해 측정), 일시 투여 또는 일시 + 점적 투여에 의해 염수(n=2), 헤파린(n=5) 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)(n=5)로 동물을 처치하였다. 우회 중에 평균 ACT 값은 각 군별로 123+/-39 초(대조군), 950+/-158 초(헤파린) 및 433+/-61 초(ARC2172 (SEQ ID NO 294))로 나타났다. 헤파린 및 ARC2172 (SEQ ID NO 294)는 우회 중에 거대 혈병의 형성을 감소시켰다. 더 나아가, 헤파린만이 우회 중에 TAT 복합체의 축적을 저해하였다. 어떠한 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 결과는 다른 처치가 내인성 응혈 다단과정의 활성화를 저해하지 않았음을 나타내는 것으로 간주된다.

발명의 상세한 설명과 실시예를 통하여 기술된 본 발명은 다양한 실시형태로서 실시될 수 있으며, 상기 상세한 설명과 실시예는 이하의 청구항들을 예시하기 위한 것이지, 이를 한정하기 위한 목적으로 기술된 것이 아니라는 사실을 해당 업계의 전문가들은 알게 될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Archemix Corp. <120> Aptamers That Bind Thrombin With High Affinity <130> 23239-589-061 <140> PCT/US2006/033092 <141> 2006-08-23 <150> 60/711,768 <151> 2005-08-26 <150> 60/808,590 <151> 2006-05-26 <160> 440 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (25)..(54) <223> Wherein n is a, t, c, or g. <400> 1 catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa 60 cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta 93 <210> 2 <211> 92 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> Wherein n is a, t, c, or g. <400> 2 catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 3 <211> 92 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> Wherein n is a, t, c, or g. <400> 3 catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn 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<220> <223> synthetic aptamer <400> 303 actaactgcc taggttgggt agggtggtgg cagttagt 38 <210> 304 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 304 gactaactgc ctaggttggg tagggtggtg gcagttagtc 40 <210> 305 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 305 cctcagggtt ggtgtggttg gctgagg 27 <210> 306 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 306 actgcctagg ttggtgtggt tggtggcagt 30 <210> 307 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 307 cctcagggat ggtgtgggtg gctgaggttt 30 <210> 308 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 308 cctcagggat ggtgtgggtg gctgaggttt ttt 33 <210> 309 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 309 tttcctcagg gatggtgtgg gtggctgagg 30 <210> 310 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 310 ttttttcctc agggatggtg tgggtggctg agg 33 <210> 311 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 311 tttcctcagg gatggtgtgg gtggctgagg ttt 33 <210> 312 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 312 ttttttcctc agggatggtg tgggtggctg aggtttttt 39 <210> 313 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 313 ctgcctaggt tgggtagggt ggtggcagtt t 31 <210> 314 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 314 ctgcctaggt tgggtagggt ggtggcagtt tttt 34 <210> 315 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 315 tttctgccta ggttgggtag ggtggtggca g 31 <210> 316 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 316 ttttttctgc ctaggttggg tagggtggtg gcag 34 <210> 317 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 317 tttctgccta ggttgggtag ggtggtggca gttt 34 <210> 318 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 318 ttttttctgc ctaggttggg tagggtggtg gcagtttttt 40 <210> 319 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> wherein adenosine at position 1 is 2'-O-methyl adenosine <400> 319 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 320 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> Wherein cytidine at position 2 is 2'-O-methyl cytidine. <400> 320 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 321 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> Wherein uridine at position 3 is 2'-O-methyl uridine. <400> 321 acugcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 322 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> Wherein guanosine at position 4 is 2'-O-methyl. <400> 322 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 323 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> Wherein cytidine at position 5 is 2'-O-methyl. <400> 323 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 324 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Wherein cytidine at position 6 is 2'-O-methyl. <400> 324 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 325 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> Wherein uridine at position 7 is 2'-O-methyl. <400> 325 actgccuagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 326 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> Wherein adenosine at position 8 is 2'-O-methyl. <400> 326 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 327 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> Wherein guanosine at position 9 is 2'-O-methyl. <400> 327 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 328 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> Wherein guanosine at position 10 is 2'-O-methyl. <400> 328 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 329 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> Wherein uridine at position 11 is 2'-O-methyl. <400> 329 actgcctagg utgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 330 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> Wherein uridine at position 12 is 2'-O-methyl. <400> 330 actgcctagg tugggtaggg tggtggcagt 30 <210> 331 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> Wherein guanosine at position 13 is 2'-O-methyl. <400> 331 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 332 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> Wherein guanosine at position 14 is 2'-O-methyl. <400> 332 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 333 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> Wherein guanosine at position 15 is 2'-O-methyl. <400> 333 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 334 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> Wherein uridine at position 16 is 2'-O-methyl. <400> 334 actgcctagg ttggguaggg tggtggcagt 30 <210> 335 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> Wherein adenosine at position 17 is 2'-O-methyl. <400> 335 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 336 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> Wherein guanosine at position 18 is 2'-O-methyl. <400> 336 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 337 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> Wherein guanosine at position 19 is 2'-O-methyl. <400> 337 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 338 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> Wherein guanosine at position 20 is 2'-O-methyl. <400> 338 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 339 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> Wherein uridine at position 21 is 2'-O-methyl. <400> 339 actgcctagg ttgggtaggg uggtggcagt 30 <210> 340 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> Wherein guanosine at position 22 is 2'-O-methyl. <400> 340 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 341 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> Wherein guanosine at position 23 is 2'-O-methyl. <400> 341 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 342 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> Wherein uridine at position 24 is 2'-O-methyl. <400> 342 actgcctagg ttgggtaggg tgguggcagt 30 <210> 343 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> Wherein guanosine at position 25 is 2'-O-methyl. <400> 343 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 344 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> Wherein guanosine at position 26 is 2'-O-methyl. <400> 344 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 345 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> Wherein cytidine at position 27 is 2'-O-methyl. <400> 345 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 346 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (28)..(28) <223> Wherein adenosine at position 28 is 2'-O-methyl. <400> 346 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 347 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> Wherein guanosine at position 29 is 2'-O-methyl. <400> 347 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 348 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> Wherein uridine at position 30 is 2'-O-methyl. <400> 348 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagu 30 <210> 349 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Wherein adenosine at position 1 is linked to cytidine at position 2 via a phosphorothioate linkage. <400> 349 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 350 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Wherein cytidine at position 2 is linked to thymidine at position 3 via a phosphorothioate linkage. <400> 350 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 351 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Wherein thymidine at position 3 is linked to guanosine at position 4 via a phosphorothioate linkage. <400> 351 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 352 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Wherein guanosine at position 4 is linked to cytidine at position 5 via a phosphorothioate linkage. <400> 352 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 353 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Wherein cytidine at position 5 is linked to cytidine at position 6 via a phosphorothioate linkage. <400> 353 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 354 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Wherein cytidine at position 6 is linked to thymidine at position 7 via a phosphorothioate linkage. <400> 354 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 355 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Wherein thymidine at position 7 is linked to adenosine at position 8 via a phosphorothioate linkage. <400> 355 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 356 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Wherein adenosine at position 8 is linked to guanosine at position 9 via a phosphorothioate linkage. <400> 356 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 357 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Wherein guansine at position 9 is linked to guanosine at position 10 via a phosphorothioate linkage. <400> 357 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 358 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Wherein guanosine at position 10 is linked to thymidine at position 11 via a phopshorothioate linkage. <400> 358 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 359 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Wherein thymidine at position 11 is linked to thymidine at position 12 via a phosphorothioate linkage. <400> 359 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 360 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Wherein thymidine at position 12 is linked to guanosine at position 13 via a phosphorothioate linkage. <400> 360 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 361 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Wherein guanosine at position 13 is linked to guanosine at position 14 via a phosphorothioate linkage. <400> 361 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 362 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Wherein guanosine at position 14 is linked to guanosine at position 15 via a phosphorothioate linkage. <400> 362 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 363 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Wherein guanosine at position 15 is linked to thymidine at position 16 via a phosphorothioate linkage. <400> 363 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 364 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> Wherein thymidine at position 16 is linked to adenosine at position 17 via a phosphorothioate linkage. <400> 364 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 365 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Wherein adenosine at position 17 is linked to guanosine at position 18 via a phosphorothioate linkage. <400> 365 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 366 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> Wherein guanosine at position 18 is linked to guanosine at position 19 via a phosphorothioate linkage. <400> 366 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 367 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Wherein guanosine at position 19 is linked to guanosine at position 20 via a phosphorothioate linkage. <400> 367 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 368 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Wherein guanosine at position 20 is linked to thymidine at position 21 via a phosphorothioate linkage. <400> 368 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 369 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Wherein thymidine at position 21 is linked to guanosine at position 22 via a phosphorothioate linkage. <400> 369 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 370 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> Wherein guanosine at position 22 is linked to guanosine at position 23 via a phosphorothioate linkage. <400> 370 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 371 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> Wherein guanosine at position 23 is linked to thymidine at position 24 via a phosphorothioate linkage. <400> 371 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 372 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> Wherein thymidine at position 24 is linked to guanosine at position 25 via a phosphorothioate linkage. <400> 372 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 373 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> Wherein guanosine at position 25 is linked to guanosine at position 26 via a phosphorothioate linkage. <400> 373 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 374 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> Wherein guanosine at position 26 is linked to cytidine at position 27 via a phosphorothioate linkage. <400> 374 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 375 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> Wherein cytidine at position 27 is linked to adenosine at position 28 via a phosphorothioate linkage. <400> 375 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 376 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> Wherein adenosine at position 28 is linked to guanosine at position 29 via a phosphorothioate linkage. <400> 376 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 377 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> Wherein guanosine at position 29 is linked to thymidine at position 30 via a phosphorothioate linkage. <400> 377 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 378 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Wherein n at position 4 is deoxy inosine. <400> 378 actncctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 379 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Wherein n at position 9 is deoxy inosine. <400> 379 actgcctang ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 380 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Wherein n at position 10 is deoxy inosine. <400> 380 actgcctagn ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 381 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Wherein n at position 13 is deoxy inosine. <400> 381 actgcctagg ttnggtaggg tggtggcagt 30 <210> 382 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Wherein n at position 14 is deoxy inosine. <400> 382 actgcctagg ttgngtaggg tggtggcagt 30 <210> 383 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Wherein n at position 15 is deoxy inosine. <400> 383 actgcctagg ttggntaggg tggtggcagt 30 <210> 384 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Wherein n at position 18 is deoxy inosine. <400> 384 actgcctagg ttgggtangg tggtggcagt 30 <210> 385 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Wherein n at position 19 is deoxy inosine. <400> 385 actgcctagg ttgggtagng tggtggcagt 30 <210> 386 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Wherein n at position 20 is deoxy inosine. <400> 386 actgcctagg ttgggtaggn tggtggcagt 30 <210> 387 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Wherein n at position 22 is deoxy inosine. <400> 387 actgcctagg ttgggtaggg tngtggcagt 30 <210> 388 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Wherein n at position 23 is deoxy inosine. <400> 388 actgcctagg ttgggtaggg tgntggcagt 30 <210> 389 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Wherein n at position 25 is deoxy inosine. <400> 389 actgcctagg ttgggtaggg tggtngcagt 30 <210> 390 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Wherein n at position 26 is deoxy inosine. <400> 390 actgcctagg ttgggtaggg tggtgncagt 30 <210> 391 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Wherein n at position 29 is deoxy inosine. <400> 391 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcant 30 <210> 392 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Wherein n at position 4 is 2'-O-methyl inosine. <400> 392 actncctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 393 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Wherein n at position 9 is 2'-O-methyl inosine. <400> 393 actgcctang ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 394 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Wherein n at position 10 is 2'-O-methyl inosine. <400> 394 actgcctagn ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 395 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Wherein n at position 13 is 2'-O-methyl inosine. <400> 395 actgcctagg ttnggtaggg tggtggcagt 30 <210> 396 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Wherein n at position 14 is 2'-O-methyl inosine. <400> 396 actgcctagg ttgngtaggg tggtggcagt 30 <210> 397 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Wherein n at position 15 is 2'-O-methyl inosine. <400> 397 actgcctagg ttggntaggg tggtggcagt 30 <210> 398 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Wherein n at position 18 is 2'-O-methyl inosine. <400> 398 actgcctagg ttgggtangg tggtggcagt 30 <210> 399 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Wherein n at position 19 is 2'-O-methyl inosine. <400> 399 actgcctagg ttgggtagng tggtggcagt 30 <210> 400 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Wherein n at position 20 is 2'-O-methyl inosine. <400> 400 actgcctagg ttgggtaggn tggtggcagt 30 <210> 401 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Wherein n at position 22 is 2'-O-methyl inosine. <400> 401 actgcctagg ttgggtaggg tngtggcagt 30 <210> 402 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Wherein n at position 23 is 2'-O-methyl inosine. <400> 402 actgcctagg ttgggtaggg tgntggcagt 30 <210> 403 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Wherein n at position 25 is 2'-O-methyl inosine. <400> 403 actgcctagg ttgggtaggg tggtngcagt 30 <210> 404 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Wherein n at position 26 is 2'-O-methyl inosine. <400> 404 actgcctagg ttgggtaggg tggtgncagt 30 <210> 405 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Wherein n at position 29 is 2'-O-methyl inosine. <400> 405 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcant 30 <210> 406 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Wherein nucleotides from positions 1-7 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(23) <223> Wherein nucleotides from positions 8-23 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (24)..(30) <223> Wherein nucleotides from positions 24-30 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 406 acugccuagg ttgggtaggg tgguggcagu 30 <210> 407 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Wherein nucleotides from positions 1-6 are 2-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 7-24 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (25)..(30) <223> Wherein nucleotides from positions 25-30 are 2-O-methyl modified nucleotides. <400> 407 acugcctagg ttgggtaggg tggtggcagu 30 <210> 408 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Wherein nucleotides from positions 1-5 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(26) <223> Wherein nucleotides from positions 6-26 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (27)..(30) <223> Wherein nucleotides from positions 27-30 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 408 acugcctagg ttgggtaggg tggtggcagu 30 <210> 409 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 409 aatgattagg ttgggtaggg tggtatcatt 30 <210> 410 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Wherein nucleotides from positions 1-7 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(23) <223> Wherein nucleotides 8-23 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (24)..(30) <223> Wherein nucleotides 24-30 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 410 aaugauuagg ttgggtaggg tgguaucauu 30 <210> 411 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Wherein nucleotides from positions 1-6 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 7-24 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (25)..(30) <223> Wherein nucleotides from positions 25-30 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 411 aaugautagg ttgggtaggg tggtaucauu 30 <210> 412 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Wherein nucleotides from positions 1-5 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(25) <223> Wherein nucleotides from positions 6-25 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> Wherein nucleotides from positions 26-30 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 412 aaugattagg ttgggtaggg tggtaucauu 30 <210> 413 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Wherein nucleotides from positions 1-6 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(22) <223> Wherein nucleotides from positions 7-22 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (23)..(28) <223> Wherein nucleotides from positions 23-28 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 413 cugccuaggt tgggtagggt gguggcag 28 <210> 414 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Wherein nucleotides from positions 1-5 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(23) <223> Wherein nucleotides from positions 6-23 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> Wherein nucleotides from positions 24-28 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 414 cugcctaggt tgggtagggt ggtggcag 28 <210> 415 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Wherein nucleotides from positions 1-4 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(25) <223> Wherein nucleotides from positions 5-25 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (26)..(28) <223> Wherein nucleotides from positions 26-28 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 415 cugcctaggt tgggtagggt ggtggcag 28 <210> 416 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 416 atgattaggt tgggtagggt ggtatcat 28 <210> 417 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Wherein nucleotides from positions 1-6 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(22) <223> Wherein nucleotides from positions 7-22 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (23)..(28) <223> Wherein nucleotides from positions 23-28 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 417 augauuaggt tgggtagggt gguaucau 28 <210> 418 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Wherein nucleotides from positions 1-5 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(23) <223> Wherein nucleotides from positions 6-23 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> Wherein nucleotides from positions 24-28 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 418 augautaggt tgggtagggt ggtaucau 28 <210> 419 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Wherein nucleotides from positions 1-4 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 5-24 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (25)..(28) <223> Wherein nucleotides from positions 25-28 are 2-O-methyl modified nucleotides. <400> 419 augattaggt tgggtagggt ggtaucau 28 <210> 420 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Wherein nucleotides from positions 1-5 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(21) <223> Wherein nucleotides from positions 6-21 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> Wherein nucleotides from positions 22-26 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 420 ugccuaggtt gggtagggtg guggca 26 <210> 421 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Wherein nucleotides from positions 1-4 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(22) <223> Wherein nucleotides from positions 5-22 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (23)..(26) <223> Wherein nucleotides from positions 23-26 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 421 ugcctaggtt gggtagggtg gtggca 26 <210> 422 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Wherein nucleotides from positions 1-3 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 4-24 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> Wherein nucleotides from positions 25-26 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 422 ugcctaggtt gggtagggtg gtggca 26 <210> 423 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 423 tgattaggtt gggtagggtg gtatca 26 <210> 424 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Wherein nucleotides from positions 1-5 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(21) <223> Wherein nucleotides from positions 6-21 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> Wherein nucleotides from positions 22-26 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 424 ugauuaggtt gggtagggtg guauca 26 <210> 425 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Wherein nucleotides from positions 1-4 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(22) <223> Wherein nucleotides from positions 5-22 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (23)..(26) <223> Wherein nucleotides from positions 23-26 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 425 ugautaggtt gggtagggtg gtauca 26 <210> 426 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Wherein nucleotides from positions 1-3 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(23) <223> Wherein nucleotides from positions 4-23 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (24)..(26) <223> Wherein nucleotides from positions 24-26 are 2'-O-methyl modified ucleotides. <400> 426 ugattaggtt gggtagggtg gtauca 26 <210> 427 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Wherein nucleotides from positions 1-4 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(20) <223> Wherein nucleotides from positions 5-20 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (21)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 21-24 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 427 gccuaggttg ggtagggtgg uggc 24 <210> 428 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Wherein nucleotides from positions 1-3 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(21) <223> Wherein nucleotides from positions 4-21 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (22)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 22-24 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 428 gcctaggttg ggtagggtgg tggc 24 <210> 429 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Wherein nucleotides from positions 1-2 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 3-24 are deoxy nucleotides. <400> 429 gcctaggttg ggtagggtgg tggc 24 <210> 430 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <400> 430 gattaggttg ggtagggtgg tatc 24 <210> 431 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Wherein nucleotides from positions 1-4 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(20) <223> Wherein nucleotides from positions 5-20 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (21)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 21-24 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 431 gauuaggttg ggtagggtgg uauc 24 <210> 432 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Wherein nucleotides from positions 1-3 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(21) <223> Wherein nucleotides from positions 4-21 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (22)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 22-24 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 432 gautaggttg ggtagggtgg tauc 24 <210> 433 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Wherein nucleotides from positions 1-2 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(22) <223> Wherein nucleotides from positions 3-22 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 23-24 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 433 gattaggttg ggtagggtgg tauc 24 <210> 434 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Wherein nucleotides from positions 1-2 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(22) <223> Wherein nucleotides from positions 3-22 are deoxy nucleotides. <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> Wherein nucleotides from positions 23-24 are 2'-O-methyl modified nucleotides. <400> 434 cgctaggttg ggtagggtgg tgcg 24 <210> 435 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Wherein adenosine at position 1 has an amine linker attached to the 5' end. <400> 435 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 436 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Wherein cytidine at position 1 has an amine linker attached to the 5' end. <400> 436 cgcctaggtt gggtagggtg gtggcg 26 <210> 437 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Wherein adenosine at position 1 has a 10 kDa PEG group attached to the 5' end via an amine linker. <400> 437 actgcctagg ttgggtaggg tggtggcagt 30 <210> 438 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Wherein cytidine at position 1 has a 2 kDa PEG group attached to the 5' end via an amine linker. <400> 438 cgcctaggtt gggtagggtg gtggcg 26 <210> 439 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Wherein cytidine at position 1 has a 5 kDa PEG group attached to the 5' end via an amine linker. <400> 439 cgcctaggtt gggtagggtg gtggcg 26 <210> 440 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Wherein cytidine at position 1 has a 10 kDa PEG group attached to the 5' end via an amine linker. <400> 440 cgcctaggtt gggtagggtg gtggcg 26

Claims (39)

1. 트롬빈 표적에 결합하는 앱타머이되, 상기 앱타머는 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 것으로서, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 이거나 또는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 트롬빈 매개된 응혈의 감소 또는 저해 능력과 실질적으로 동일한 능력을 가진 앱타머이며, 상기 앱타머는 1 nM 미만의 K_D 값으로 인체 트롬빈에 결합하며, 상기 앱타머의 길이는 55 뉴클레오티드 또는 그 미만인 것임을 특징으로 하는 앱타머.
2. 트롬빈 표적에 결합하는 앱타머이되, 상기 앱타머는 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 것으로서, ARC2172 (SEQ ID NO 294) 이거나 또는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 트롬빈 매개된 응혈의 감소 또는 저해 능력과 실질적으로 동일한 능력을 가진 앱타머이며, 상기 앱타머는 티미딘 또는 우리딘 잔기의 대부분에서 5-브로모데옥시우리딘 변형을 포함하지 않음을 특징으로 하는 앱타머.
3. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머의 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 능력은 이 앱타머의 활성화 응혈 시간 또는 프로트롬빈 시간을 감소 또는 저해하는 능력을 측정함으로써 평가되 는 것임을 특징으로 하는 앱타머.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 앱타머는 생체내에서 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 것임을 특징으로 하는 앱타머.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 앱타머는 인체내에서 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 것임을 특징으로 하는 앱타머.
6. SEQ ID NOs 9-41, 43-191, 193-204, 208-304, 307-329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400 및 402-440 중에서 선택한, 트롬빈에 결합하는 앱타머.
7. 다음의 핵산 서열을 포함하는, 트롬빈에 결합하는 앱타머

   CCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGG.
8. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머는 다음의 핵산 서열들 중에서 선택한 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머

   ACTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGT (ARC2169(SEQ ID NO 283)),

   GCTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGC (ARC2170(SEQ ID NO 292)),

   CTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAG (ARC2171(SEQ ID NO 293)) 및

   CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (ARC2172(SEQ ID NO 294)).
9. 다음의 핵산 서열을 포함하며, 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 앱타머

   N₁N₂N₃TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'₃N'₂N'₁

   여기에서, N₁, N₂ 또는 N₃ 은 N'₁, N'₂ 또는 N'₃ 과 각각 염기쌍을 형성하는 임의의 뉴클레오티드이고, 각각의 N₁, N₂ 및 N₃ 은 동일한 뉴클레오티드이거나 또는 상이한 뉴클레오티드일 수 있다.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 N₁, N₂ 또는 N₃ 은 데옥시 뉴클레오티드임을 특징으로 하는 앱타머.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 N₁, N₂ 및 N₃ 중 적어도 두 개는 2'OMe 변형을 포함하는 것임을 특징으로 하는 앱타머.
12. 제 9 항, 제 10 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머는 다음의 서열을 추가로 포함하며, 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 것임을 특징으로 하는 앱타머

    N₁N₂N₃N₄N₅N₆TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'₆N'₅N'₄N'₃N'₂N'₁

    여기에서, N₁, N₂, N₃, N₄, N₅ 또는 N₆ 은 N'₁, N'₂, N'₃, N'₄, N'₅ 또는 N'₆ 과 각각 염기쌍을 형성하는 임의의 뉴클레오티드이며, 각각의 N₁, N₂, N₃, N₄, N₅ 또는 N₆ 은 동일한 뉴클레오티드이거나 또는 상이한 뉴클레오티드일 수 있다.
13. 제 9 항, 제 10 항, 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 N 은 구아노신 또는 시티딘 뉴클레오티드 잔기임을 특징으로 하는 앱타머.
14. 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머는 1 nM 미만의 K_D 값으로 트롬빈에 결합함을 특징으로 하는 앱타머.
15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머는 ARC2172 (SEQ ID NO 294)의 트롬빈 매개된 응혈의 감소 또는 저해 능력과 적어도 실질적으로 동일한 능력을 가짐을 특징으로 하는 앱타머.
16. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬빈 표적은 인체 트롬빈임을 특징으로 하는 앱타머.
17. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머는 데옥시리보핵산임을 특징으로 하는 앱타머.
18. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머는 단일 가닥형 데옥시리보핵산임을 특징으로 하는 앱타머.
19. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 것임을 특징으로 하는 앱타머.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 변형은 핵산내에서 당 위치에서의 화학적 치환, 인산염 위치에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 앱타머.
21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 상기 변형은 변형된 뉴클레오티드의 혼입(incorporation), 3' 캡핑, 고 분자량의 비-면역원성 화합물로의 콘쥬게이트화(conjugation) 및 친유성 화합물로의 콘쥬게이트화 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 앱타머.
22. 제 19 항에 있어서, 상기 변형은 고 분자량의 비-면역원성 화합물로의 콘쥬게이트화이고, 그 화합물이 폴리알킬렌 글리콜임을 특징으로 하는 앱타머.
23. 제 22 항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜이 폴리에틸렌 글리콜임을 특징으로 하는 앱타머.
24. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앱타머는 생체외에서 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는 것임을 특징으로 하는 앱타머.
25. 실험대상이나 또는 체외순환로에 상기 청구항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를, 상기 실험대상 내의 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는데 효과적인 양으로 투여함을 포함하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 실험대상은 인체임을 특징으로 하는 방법.
27. 실험대상내에서 트롬빈 매개된 응혈을 감소 또는 저해하는데 효과적인 양으로, 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 앱타머 또는 이의 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
28. 제 27 항의 조성물을, 이를 필요로 하는 실험대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 상기 실험대상이 인체임을 특징으로 하는 방법.
30. 제 25 항, 제 26 항, 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 상기 인체는 신장 손상 환자이고, 사용된 앱타머는 PEG 에 콘쥬게이트화되지 않음을 특징으로 하는 방법.
31. 제 25 항, 제 26 항, 제 28 항, 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 인체는 헤파린 유도된 혈소판감소증 환자임을 특징으로 하는 방법.
32. 제 25 항, 제 26 항, 제 28 항, 제 29 항, 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 인체는 헤파린 내성을 가진 환자임을 특징으로 하는 방법.
33. 제 25 항, 제 26 항, 제 28 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 상기 실험대상은 간 기능 손상 환자임을 특징으로 하는 방법.
34. 제 25 항, 제 26 항, 제 28 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 31 항, 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서, 상기 앱타머는 실험대상에 대한 외과적 처치의 이전, 도중, 이후 또는 이를 병합한 임의의 시기에 상기 실험대상에게 투여함을 특징으로 하는 방법.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 외과적 처치는 심폐 우회술, 관상동맥 우회이식술, 경피적 관상동맥 중재술, 혈관형성술, 심혈관 및 말초 혈관 절개 및 혈관 내 수술, 스텐트 설치술, 심장판막 치환술, 정맥 또는 동맥의 관상 질환 및/또는 혈관 질환 치료를 위한 수술 및 말초 동맥 폐색성 질환 치료를 위한 수술 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법.
36. 제 25 항, 제 26 항, 제 28 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 31 항, 제 32 항, 제 33 항, 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, 상기 앱타머는 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 임을 특징으로 하는 방법.
37. 제 35 항에 있어서, 상기 앱타머는 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 이고, 상기 외과적 처치는 관상동맥 우회이식술임을 특징으로 하는 방법.
38. 제 35 항에 있어서, 상기 앱타머는 ARC2172 (SEQ ID NO 294) 이고, 상기 외과적 처치는 경피적 관상동맥 중재술임을 특징으로 하는 방법.
39. 제 35 항에 있어서, 상기 외과적 처치는 심폐 우회술이고, 이러한 시술 중에 개방형의 비-헤파린 결합된 순환로(open and non-heparin bonded circuit)가 사용됨을 특징으로 하는 방법.

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