JP2009508473A - 高親和性でトロンビンに結合するアプタマー - Google Patents

Abstract

本発明は、凝固関連疾患及び／又は、トロンビンが関連しているその他の疾病もしくは疾患の、治療及び診断として有用な、トロンビンに結合することができるアプタマーを提供する。本発明は、さらに、トロンビンに結合することができるアプタマーの投与のための、材料及び方法を提供する。

Description

本発明は、全般的に、核酸の分野、より具体的には、凝固関連疾患及び／又はその他の疾病又は、トロンビンが関与している疾患の治療及び診断として有用な、トロンビンに結合することができるアプタマーに関する。本発明はさらに、トロンビンに結合できるアプタマーの投与のための、材料及び方法に関する。

アプタマーは、古典的なワトソン−クリックの塩基対形成以外の相互作用を介した分子に対して非常に特異的な結合親和性を有する核酸分子である。

アプタマーは、ファージディスプレイにより生成されるペプチド又はモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）のように、選択された標的に特異的に結合し、例えば、結合アプタマーの標的が機能する能力をその結合アプタマーが阻止し得ることにより、その標的の活性を調節することができる。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロの選択プロセスにより生成されるものとして、アプタマーは、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン及び受容体を含む１００を超えるタンパク質に対して作製されてきた。典型的なアプタマーは、１０−１５ｋＤａのサイズ（３０−４５ヌクレオチド）で、ナノモラー未満の親和性でその標的に結合し、近縁の標的を区別する（例えば、アプタマーは通常、同じ遺伝子ファミリー由来のその他のタンパク質と結合しない。）。一連の構造研究から、アプタマーが、抗体−抗原複合体での親和性及び高選択性結合を推進するのと同じタイプの結合相互作用を用いることができることが分かった（例えば、水素結合、静電気相補性、疎水性接触、立体排除）。

アプタマーは、高選択性及び親和性、生物学的効果及び優れた薬物動態特性を含む、治療及び診断としての使用のための、多くの所望の特性を有する。さらに、これらは、例えば次のような、抗体及びその他のタンパク質生物学を凌ぐ、特異的な競争力のある長所を与える：

１）速度及び制御。アプタマーは、完全にインビトロのプロセスにより生成され、これにより、治療薬のリードを含む、最初のリードを迅速に生成させることが可能となる。インビトロ選択により、アプタマーの選択性及び親和性を厳格に制御することができ、毒性及び非免疫原性標的の両方に対するリードを含む、リードの生成が可能となる。

２）毒性及び免疫原性。クラスとしてのアプタマーは、治療的に許容可能な毒性であり、免疫原性を欠くことが分かっている。高レベルのアプタマーを用いた、ラット又はウッドチャックの長期間投与において（９０日間、１日に１０ｍｇ／ｋｇ）、どの臨床的、細胞又は生化学測定においても毒性は観察されない。多くのモノクローナル抗体の効率が抗体そのものに対する免疫反応によって厳しく制限され得る一方、おそらく、アプタマーが、ＭＨＣを介してＴ細胞により提示され得ず、及び、免疫反応は通常、核酸断片を認識しないようになっているために、アプタマーに対する抗体を誘発することは非常に困難である。

３）投与。最近認可された抗体治療が、静脈内点滴により投与される（通常、２−４時間にわたる。）一方で、アプタマーは、皮下注射により投与することができる（サルの実験で、皮下投与を介したアプタマーのバイオアベイラビリティーは＞８０％である（Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．７３２：２０３−２１２、１９９９））。この相違は、主に比較的溶解性が低いことによるものであり、したがって、殆どの治療用ｍＡｂの場合大きな体積が必要となる。溶解性に優れ（＞１５０ｍｇ／ｍＬ）、比較的分子量が低い（アプタマー：１０−５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）ので、アプタマーの１週間の用量は０．５ｍＬ未満の体積での注射により送達し得る。さらに、アプタマーのサイズが小さいので、抗体又は抗体断片が浸透できない立体配座のくびれの領域に浸透することができ、アプタマーに基づく治療又は予防のさらなる別の長所が与えられる。

４）拡張性及びコスト。治療用アプタマーは化学的に合成され、したがって、製造の条件に合わせるために必要なように、容易にスケールを変化させることができる。製造のスケールを変化させることにおいて困難な点があるために、現在、いくつかの生物工学製品の利用可能性が制限され、大規模タンパク質生産プラントの資本コストが莫大である一方、１つの大規模オリゴヌクレオチド合成装置は、年間１００ｋｇ以上を生産することができ、必要な初期投資はそれほど大きくはない。

５）安定性。治療用アプタマーは化学的に強固である。これらは、熱及び変性剤などの因子への曝露後、本質的に活性を復活させるようになっており、凍結乾燥粉末として室温にて長期間（＞１年）保存することができる。

トロンビン
トロンビンは、凝固促進及び抗凝固活性を有する多機能性のセリンプロテアーゼである。凝固促進酵素として、トロンビンは、フィブリノーゲンを凝固させ、凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ及びＸＩＩＩを活性化し、血小板を活性化する。トロンビンによるフィブリノーゲンの特異的な切断により、血栓形成の最初の事象であるフィブリン単体の重合が開始される。血小板血栓形成における中心的な事象は、「非結合」から「結合」状態への、血小板の活性化である。トロンビンは、血小板凝集の生理的活性化因子である。このように、凝血促進剤として、トロンビンは、出血の阻止（生理的止血）及び血管閉塞性の血栓形成（病的な血栓症）において重要な役割を果たす。

抗凝固剤として、トロンビンは、血管内皮細胞の表面上で発現される糖タンパク質であるトロンボモジュリン（ＴＭ）に結合する。ＴＭは、活性部位構造におけるアロステリックな変化及びトロンビンにおけるＴＭ及びフィブリノーゲン結合部位の重複の組み合わせを通じて、フィブリノーゲン及び血小板からプロテインＣへと基質特性を変化させる。リン脂質表面の存在下で、活性化されたプロテインＣ、Ｃａ^２＋及び第二のビタミンＫ依存性タンパク質補因子、プロテインＳは、第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子をタンパク質分解により分解することによって凝固を阻害する。このように、トロンビン−ＴＭ複合体の形成により、凝血促進剤から抗凝固性酵素へとトロンビンが変換され、これらの反対の活性の間の正常なバランスは、止血の調節に対して非常に重要である。

凝固疾患
血管損傷及び血栓形成は、アテローム性動脈硬化症を含む様々な血管疾患の病理において重要な事象を示す。様々な病的状態において、及び、冠動脈、心室及び人工心臓弁などの様々な部位で、血栓症へと導く、血小板及び／又は凝固系の活性化の病的なプロセスは様々であると思われる。したがって、閉じた血管を開き、再閉塞を予防するために、血栓溶解剤と併せて、血小板阻害剤、抗凝固剤又は両方の組み合わせの使用が必要とされ得る。

凝固カスケードの化合物によりタンパク質分解が制御されることは、止血に非常に重要である。結果として、一連の非常に特異的なプロテアーゼ阻害剤に一部基づく、様々な複合調節系が存在する。病的状況において、活性プロテアーゼの過剰産生又は阻害活性の不活性化により、機能的な阻害活性が妨害され得る。複数の外傷（組織損傷）又は感染（敗血症）に対して反応した炎症の永続化は、タンパク質分解酵素（トロンビンを含む血漿カスケード系及びライソソーム起源の両方）に依存する。これらの場合の多臓器不全（ＭＯＦ）は、プロテアーゼとそれらの阻害調節因子との間に同時に生じるアンバランスにより促進される。さらに、脳におけるトロンビン活性のアンバランスから神経変性疾患が起こり得る。

冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術
２００１年に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは、米国で推定１２４０万人の患者が、ある形態の冠動脈疾患と診断されたことを報告した。凝固プロセスにおけるトロンビンの重要性を考慮すれば、抗トロンビン剤又はトロンビン活性を低下させるかもしくは阻害する作用物質は、例えば冠動脈バイパス移植（本明細書中で以後、「ＣＡＢＧ」と呼ぶ。）手術、経皮冠動脈インターベンション（本明細書中で以後、「ＰＣＩ」と呼ぶ。）及び急性冠不全症候群中に使用される抗凝固剤である。２００１年現在、米国において年間５７０，０００例を超えるＣＡＢＧが行われ、世界中で７００，０００例を超える手術が行われていると推定される。現在、最も一般的に使用される抗凝固剤は、解毒剤プロタミンと使用しなければならないヘパリンである。しかし、ヘパリン−プロタミン処置は、無症状であることが多いが、生命を脅かす動脈又は静脈血栓症を伴い得る、出血及び血小板減少症（血小板数低下）を含む、多くの重篤な副作用を伴う。さらに、ヘパリン−プロタミン処置は、血漿タンパク質への非特異的結合（一部の患者において結果として抵抗性となる。）；ヘパリンが血栓結合トロンビンを阻害できない；ヘパリンが、投与の制御を困難にする非線形動態を有する；及び、ヘパリンがウシ又はブタ組織から製造される（これらは、ウイルス及び／又はプリオンの伝達の可能性があることから生じる安全面での固有のリスクがある。）ことを含む、多くのその他の欠点がある。結果として、低分子量ヘパリン及びＡｎｇｉｏｍａｘ^（Ｒ）などの、多くの新しい、高コストの抗凝固剤が、この市場に非常に浸透している。しかし、これらの化合物は、同様の副作用を有し、これらの抗凝固活性を迅速に逆転させることはできない。

このように、別の克服剤を必要とせず、上記で挙げた副作用及び欠点を伴わない、安全な中程度のコストの抗凝固剤に対する、未対応の医学的な大きなニーズがある。したがって、凝固関連疾患の処置における治療剤として使用するための、トロンビンの活性を低下させるか又は阻害する作用物質を持つことは有益であろう。

本発明は、例えば、急性及び慢性凝固関連疾患などの、トロンビン介在疾患の治療のための材料及び方法を提供する。本発明はさらに、対象又は患者における抗凝固のための、トロンビン調節、特にトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害するのための、治療組成物及び方法を提供する。

特定の実施形態において、トロンビン標的に結合するアプタマー（アプタマーはトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害し、このアプタマーはＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）であるか又は、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）と同じ、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する能力を実質的に有するアプタマーであり、このアプタマーは、１ｎＭ未満、好ましくは３００ｐＭ未満、より好ましくは２５０ｐＭ未満、及びさらにより好ましくは２００ｐＭ未満のＫ_ｄでヒトトロンビンに結合し、このアプタマーは、５６ヌクレオチド以下、５５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２８ヌクレオチド以下、２６ヌクレオチド以下の長さである。）が提供される。ある実施形態において、本アプタマーは、少なくとも２２ヌクレオチド長である。別の実施形態において、トロンビン標的に結合するアプタマー（このアプタマーはトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害し、このアプタマーはＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）であるか又はＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）と同じ、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する能力を実質的に有するアプタマーであり、このアプタマーは、そのチミジン又はウリジン残基の大多数において、５−ブロモデオキシウリジン修飾を含有しない。）が提供される。ある実施形態において、本アプタマーは、１ｎＭ未満のＫ_Ｄ、好ましくは３００ｐＭ未満、より好ましくは２５０ｐＭ未満、及びさらにより好ましくは２００ｐＭ未満のＫ_Ｄでヒトトロンビンに結合する。ある実施形態において、５６ヌクレオチド以下、５５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２８ヌクレオチド以下、２６ヌクレオチド以下の長さのアプタマーが提供される。ある実施形態において、本アプタマーは少なくとも２２ヌクレオチド長である。ある実施形態において、下記の実施例１に記載のようなドットブロット滴定により解離定数を調べ得る。

ある実施形態において、活性凝固時間（ＡＣＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）及び／又は活性化部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を低下させるか又は阻害するアプタマーの能力を測定することにより、本発明のアプタマーがトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する能力を評価する。好ましくは、アプタマーがＡＣＴを低下させる能力を測定することにより、トロンビン介在性凝固を評価する。好ましい実施形態において、下記実施例３に記載のように、Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ．装置（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）を用いてＡＣＴを測定することにより、本発明のアプタマーが凝固を低下させるか又は阻害する能力を評価する。ある実施形態において、本発明のアプタマーは、インビボ、特にヒト対象において、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する。ある実施形態において、本発明のアプタマーはインビトロでトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する。

特定の実施形態において、トロンビンに結合するアプタマー（このアプタマーは、配列番号９−４１、４３−１９１、１９３−２０４、２０８−３０４、３０７−３２９、３３１−３３２、３３４、３３６−３３７、３４０−３９２、３９６−３９７、４００及び４０２−４４０からなる群から選択される。）が提供される。ある実施形態において、トロンビンに結合し、次の核酸配列：ＣＣＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧを含有するアプタマーが提供される。特定の実施形態において、

からなる群から選択される配列を含有するアプタマーが提供される。

別の実施形態において、次の核酸配列：
Ｎ_１Ｎ_２Ｎ_３ＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＮ’_３Ｎ’_２Ｎ’_１（配列中、Ｎ_１、Ｎ_２又はＮ_３は、それぞれＮ’_１、Ｎ’_２又はＮ’_３と塩基対を形成する何れかのヌクレオチドであり、Ｎ_１、Ｎ_２及びＮ_３は、それぞれ、同じヌクレオチド又は異なるヌクレオチドであり得る。）を含有し、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する、アプタマーが提供される。ある実施形態において、Ｎ_１、Ｎ_２又はＮ_３はデオキシヌクレオチドである。その他の実施形態において、Ｎ_１、Ｎ_２又はＮ_３の少なくとも２個が２’ＯＭｅ修飾を含有する。

別の実施形態において、次の核酸配列：
Ｎ_１Ｎ_２Ｎ_３Ｎ_４ＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＮ’_４Ｎ’_３Ｎ’_２Ｎ’_１（配列中、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３又はＮ_４は、それぞれＮ’_１、Ｎ’_２、Ｎ’_３又はＮ’_４と塩基対を形成する何れかのヌクレオチドであり、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３及びＮ_４は、それぞれ、同じヌクレオチド又は異なるヌクレオチドであり得る。）を含有し、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する、アプタマーが提供される。ある実施形態において、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３及びＮ_４はデオキシヌクレオチドである。その他の実施形態において、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３又はＮ_４の少なくとも２個が２’ＯＭｅ修飾を含有する。

別の実施形態において、次の核酸配列：
Ｎ_１Ｎ_２Ｎ_３Ｎ_４Ｎ_５ＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＮ’_５Ｎ’_４Ｎ’_３Ｎ’_２Ｎ’_１（配列中、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４又はＮ_５は、それぞれＮ’_１、Ｎ’_２、Ｎ’_３、Ｎ’_４又はＮ’_５と塩基対を形成する何れかのヌクレオチドであり、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４及びＮ_５は、それぞれ、同じヌクレオチド又は異なるヌクレオチドであり得る。）を含有し、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する、アプタマーが提供される。ある実施形態において、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４又はＮ_５はデオキシヌクレオチドである。その他の実施形態において、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４又はＮ_５の少なくとも２個が２’ＯＭｅ修飾を含有する。

別の実施形態において、配列：
Ｎ_１Ｎ_２Ｎ_３Ｎ_４Ｎ_５Ｎ_６ＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＮ’_６Ｎ’_５Ｎ’_４Ｎ’_３Ｎ’_２Ｎ’_１（配列中、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４、Ｎ_５又はＮ_６は、それぞれ、Ｎ’_１、Ｎ’_２、Ｎ’_３、Ｎ’_４、Ｎ’_５又はＮ’_６と塩基対を形成する何れかのヌクレオチドであり、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４、Ｎ_５又はＮ_６は、それぞれ、同じヌクレオチド又は異なるヌクレオチドであり得る。）を含有し、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害するアプタマーが提供される。

ある実施形態において、上述のアプタマーにおけるＮはグアノシン又はシチジンヌクレオチド残基である。本発明のこの態様の別の実施形態において、アプタマーは、１ｎＭ未満のＫ_Ｄでトロンビンに結合する。本発明のこの態様の別の実施形態において、アプタマーは、少なくとも実質的にＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）と同じ、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する能力を有する。この態様のある実施形態において、トロンビン標的はヒトトロンビンである。

本発明のアプタマーのある実施形態において、ヌクレオチドの大部分がデオキシリボ核酸である。ある実施形態において、本発明のアプタマーはデオキシリボ核酸、特に１本鎖デオキシリボ核酸である。本発明のある実施形態において、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドがデオキシヌクレオチドである。特定の実施形態において、アプタマーは、デオキシ核酸配列ＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴを含有する。ある実施形態において、本発明のアプタマーは、少なくとも１個の化学的修飾、特に、核酸の、糖の位置での化学的置換、リン酸の位置での化学的置換及び塩基の位置での化学的置換からなる群から選択される化学修飾を含有する。ある実施形態において、この化学的修飾は、アプタマーのチミジン又はウリジン残基の大部分において５−ブロモデオキシウリジン修飾をもたらさない。ある実施形態において、この修飾は、修飾されたヌクレオチドの組み込み、３’キャッピング及び高分子量の非免疫原性化合物への共役、親油性化合物への共役からなる群から選択され、特に、高分子量の非免疫原性化合物はポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールである。

ある実施形態において、上述の本発明の抗トロンビンアプタマー、例えばＡＲＣ２１７２は、具体的には、室温にて少なくとも約３０分間、より具体的には、５μＭの濃度で、室温にて少なくとも約３０分間、停滞血液中で、凝固を低下させるか又は阻害する。

ある実施形態において、対象においてトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害するのに有効な量で、本発明の抗トロンビンアプタマーを対象、特にヒト対象、又は体外循環路に投与することを含む方法が提供される。

ある実施形態において、対象においてトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害するのに有効な量の本発明の抗トロンビンアプタマー又はその塩と、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と、を含有する組成物が提供される。ある実施形態において、本発明の組成物中に含有される抗トロンビンアプタマーは、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）である。必要とする対象、特にヒト対象に、本発明の組成物を投与することを含む方法が提供される。ある実施形態において、ヒト対象は、腎機能障害があり、本発明の方法において投与される本発明の抗トロンビンアプタマーは、ＰＥＧに共役していない。ある実施形態において、本発明の方法においてアプタマーが投与されるヒト対象は、ヘパリン誘発性血小板減少症に罹患しており、ヘパリン抵抗性であり、及び／又は肝機能障害を有する。

本発明の方法のある実施形態において、対象における外科的処置の、前、最中、後又はこれらの何らかの組み合わせで、この対象、特にヒト対象に、本発明の抗トロンビンアプタマーが投与される。ある実施形態において、外科的処置は心臓手術である。ある実施形態において、外科的処置は、心肺バイパス手術、冠動脈バイパス移植手術、経皮冠動脈インターベンション、血管形成、心臓血管及び末梢血管開放系及び血管内手術、ステント置換手術、心臓弁置換手術、冠状動脈性心臓病及び／又は静脈又は動脈における血管疾患を処置するための手術及び末梢動脈閉塞疾患を処置するための手術からなる群から選択される。本発明の方法のある実施形態において、抗トロンビンアプタマーはＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）である。本発明の方法の特定の実施形態において、アプタマーはＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）であり、外科的処置は冠動脈バイパス移植手術である。本発明の方法の別の特定の実施形態において、本発明のアプタマーはＡＲＣ２１７２であり、外科的処置は心肺バイパス手術であり、手術中に開放式非ヘパリン結合回路が使用される。本発明の方法の別の特定の実施形態において、アプタマーはＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）であり、外科的処置は経皮冠動脈インターベンションである。

下記の説明とともに、本発明の複数の実施形態の詳細を示す。本明細書中に記載のものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここで好ましい方法及び材料を述べる。本発明の、その他の特性、目的及び長所がこの記述から明らかとなろう。この明細書において、文脈で別に明確に指示されない限り、単数形はまた複数形も含む。別に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。異なる場合、本明細書での意味をとる。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法
アプタマーを作製するための適切な方法は、図１で全般的に示される、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（「ＳＥＬＥＸ^ＴＭ」）という名称のプロセスによる。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、標的分子に非常に特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願）、現在、放棄、米国特許第５，４７５，０９６号（題名、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」及び米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３も参照のこと。）題名「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」に記載されている。

例えば、アプタマーが、標的にまだ曝露されていない出発核酸ライブラリ又はプールの結合親和性よりも大きい桁で標的に対する結合親和性を含むので、アプタマーは、例えば、標的分子に非常に特異的に結合すると考えられる。ＳＥＬＥＸ^ＴＭで同定された各核酸リガンド、すなわち各アプタマーは、ある一定の標的化合物又は分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、核酸が様々な二次及び三次構造を形成するための十分な能力及び、単量体であれ多量体であれ、実質的に何らかの化学化合物とともに、リガンドとして作用する（すなわち、特異的な結合ペアを形成する）ためにそれらの単量体内で利用可能な十分な化学的多用途性を有するユニークな洞察に基づく。何れのサイズ又は組成の分子も標的となり得る。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、ランダム化配列を含有する１本鎖オリゴヌクレオチドの大型のライブラリ又はプールに出発点として依存する。このオリゴヌクレオチドは、修飾もしくは非修飾の、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。いくつかの例において、このプールは、１００％ランダム又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含有する。その他の例において、このプールは、ランダム化配列内に組み込まれる、少なくとも１つの固定配列及び／又は保存的配列を含有する、ランダム又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含有する。その他の例において、このプールは、このオリゴヌクレオチドプールの全ての分子に共通する配列を含み得る、その５’及び／又は３’末端において、少なくとも１つの固定配列及び／又は保存的配列を含有する、ランダム又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含有する。固定配列は、下記でさらに述べるＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７及びＳＰ６）、制限部位又はホモポリマー配列（ポリＡ又はポリＴトラクトなど）、触媒性コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位及び、関心のあるオリゴヌクレオチドのクローニング及び／又は配列決定を促進するためのその他の配列などの、予め選択した目的のために組み込まれたこのプールのオリゴヌクレオチドに共通する配列である。保存的配列は、既に述べた固定配列以外の、同じ標的に結合する多くのアプタマーに共通する配列である。

このプールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ランダム化配列部分ならびに効率的な増幅に必要な固定配列を含む。通常は、出発プールのオリゴヌクレオチドは、３０−５０のランダムヌクレオチドの内部領域と隣接する、固定された５’及び３’末端配列を含有する。化学合成及び無作為に切断した細胞の核酸からのサイズ選択を含む多くの方法において、ランダム化ヌクレオチドを作製することができる。選択／増幅反復の前又はその最中に、突然変異生成により、試験核酸における配列の多様性を導入又は増加させることもできる。

オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、何れの長さのものでもあり得、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含み得、修飾された、又は非天然の、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含み得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，６６０，９８５号；米国特許第５，９５８，６９１号；米国特許第５，６９８，６８７号；米国特許第５，８１７，６３５号；米国特許第５，６７２，６９５号及びＰＣＴ公開ＷＯ９２／０７０６５を参照のこと。当技術分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、ホスホジエステル連結ヌクレオチドからランダムオリゴヌクレオチドを合成することができる。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）及びＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと。トリエステル合成法などの液相法を用いて、ランダムオリゴヌクレオチドを合成することもできる。例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）及びＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、２８：２４４９（１９７８）を参照のこと。

自動ＤＮＡ合成装置で行われる通常の合成は、殆どのＳＥＬＥＸ^ＴＭ実験に十分な数である、１０^１４から１０^１６の別個の分子を生成させる。配列設計におけるランダム配列が十分に大きい領域であると、各合成分子がユニークな配列を表す可能性がある確率が増える。

ＤＮＡ合成装置での自動化学合成により、オリゴヌクレオチドの出発ライブラリを生成させ得る。ランダム化配列を合成するために、合成プロセス中に４種類全てのヌクレオチドの混合物を各ヌクレオチド付加段階に添加し、これによって、ヌクレオチドの無作為の組み込みが行われるようになる。上述のように、ある実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、完全にランダムな配列を含有するが、しかし、その他の実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、非ランダム又は部分的にランダムな配列の範囲を含有し得る。各付加段階で様々なモル比で４種類のヌクレオチドを添加することにより、部分的にランダムな配列を生成させることができる。

オリゴヌクレオチドの出発ライブラリは、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れかであり得る。ＲＮＡライブラリを出発ライブラリとして使用すべき例において、これは、通常、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ又は改変Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＤＮＡライブラリをインビトロで転写することにより作製され、精製される。次に、結合に好ましい条件下で、ＲＮＡ又はＤＮＡライブラリを標的と混合し、結合親和性及び選択性の実質的に何らかの所望の基準に到達させるために、同じ一般的選択スキームを用いて、結合、分離及び増幅の段階的反復を行う。より具体的には、核酸の出発プールを含有する混合物を用いて出発するので、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、（ａ）結合に好ましい条件下でこの混合物を標的と接触させ；（ｂ）標的分子と特異的に結合している核酸から非結合核酸を分離し；（ｃ）核酸−標的複合体を解離させ；（ｄ）リガンドが濃縮された核酸の混合物を得るために、核酸−標的複合体から解離させた核酸を増幅し；（ｅ）標的分子に対する、特異性が高い、高親和性核酸リガンドを得るのに望ましいサイクル数で、結合、分離、解離及び増幅の段階を繰り返す、段階を含む。ＲＮＡアプタマーが選択されている例において、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、（ｉ）段階（ｄ）の増幅前に、核酸−標的複合体から解離させた核酸を逆転写し;（ｉｉ）このプロセスを再開する前に、段階（ｄ）からの増幅核酸を転写する、段階をさらに含む。

多数の可能な配列及び構造を含有する核酸混合物内に、ある一定の標的に対する広範な結合親和性が存在する。例えば２０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含有する核酸混合物は、４^２０種類の候補の可能性を有し得る。標的に対してより高い親和定数を有するものが標的と結合する可能性が最も高い。分離、解離及び増幅後、より高い結合親和性候補が濃縮されている第二の核酸混合物を生成させる。選択のラウンドを重ねるにつれて、徐々に最適のリガンドに対して好都合となり、得られる核酸混合物が１種類のみ又は少数の配列から主に構成されるようになる。次に、これらをクローニングし、配列決定し、純粋なリガンド又はアプタマーとして個々に結合親和性について試験することができる。

所望の目的が達成されるまで、選択及び増幅のサイクルを繰り返す。最も一般的な場合、サイクルの反復において結合強度が顕著に向上しなくなるまで、選択／増幅を続ける。本方法は、通常、およそ１０^１４の様々な核酸種の試料に対して使用されるが、約１０^１８個におよぶ様々な核酸種の試料に使用し得る。一般に、核酸アプタマー分子は、５回から２０回のサイクル手順において選択される。ある実施形態において、最初の選択段階でのみ異成分が導入され、複製プロセスの間、生じることはない。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭのある実施形態において、選択プロセスは、選択標的に最も強力に結合する核酸リガンドを単離する際、非常に効率的であるので、選択及び増幅に必要なサイクルは１回のみである。例えば、最も高い親和性の核酸リガンドの選択及び単離がカラムによって十分に可能となり得るような形式で、核酸が、カラムに結合した標的と会合する能力が作用するクロマトグラフィー型のプロセスにおいて、このような効率的な選択を行い得る。

多くの場合、１個の核酸リガンドが同定されるまでＳＥＬＥＸ^ＴＭの反復段階を行うことは必ずしも望ましくはない。標的特異性が高い核酸リガンド溶液は、多くの保存的配列及び、標的に対する核酸リガンドの親和性に顕著に影響を与えることなく置換又は付加され得る多くの配列を有する、核酸構造又はモチーフのファミリーを含み得る。完了前にＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスを終えることにより、核酸リガンド溶液ファミリーのメンバーの多くの配列を決定することができる。

様々な核酸の一次、二次及び三次構造が存在することが知られている。非ワトソン−クリック型の相互作用に含まれることが最も一般的に示されている構造又はモチーフは、ヘアピンループ、対称又は非対称バルジ、擬似ノット及びこれらの無数の組み合わせと呼ばれる。このようなモチーフの殆ど全ての既知のケースから、３０ヌクレオチド以下の核酸配列においてこれらを形成することができることが示唆される。この理由のために、約２０から約５０ヌクレオチドの間、ある実施形態において、約３０から約４０ヌクレオチドの間のランダム化セグメントを含有する核酸配列により、連続的なランダム化セグメントを用いたＳＥＬＥＸ手法を開始することが好ましいことが多い。ある実施例において、５’−固定：ランダム：３’−固定配列は、約３０から約５０ヌクレオチドのランダム配列を含有する。

多くの具体的な目的を達成するためにコアＳＥＬＥＸ法が改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、ベントＤＮＡなど、特定の構造特性を有する核酸分子を選択するための、ゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ^ＴＭの使用を記載している。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子に対して、結合及び／又は光架橋及び／又は光不活性化することができる光反応基を含有する核酸リガンドを選択するための、ＳＥＬＥＸ^ＴＭに基づく方法を記載している。米国特許第５，５６７，５８８号及び米国特許第５，８６１，２５４号は、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと親和性が低いオリゴヌクレオチドとを非常に効率的に分離する、ＳＥＬＥＸ^ＴＭに基づく方法を記載している。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸプロセスを行った後に改善された核酸リガンドを得るための方法を記載している。米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドをその標的に共有結合させるための方法を記載している。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭはまた、標的分子の複数の部位に結合する核酸リガンドを得るために、及び、標的の特異的な部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために、使用することもできる。ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、核酸結合タンパク質及び生物学的機能の一部として核酸と結合することが知られていないタンパク質ならびに、補因子及びその他の小型の分子など、大型及び小型の生体分子を含む、何らかの想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離し、同定するための手段を提供する。例えば、米国特許第５，５８０，７３７号は、カフェイン及びその近縁類似体のテオフィリンに対して高親和性で結合することができる、ＳＥＬＥＸ^ＴＭを通して同定される核酸配列を開示する。

カウンター−ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、１以上の非標的分子に対する交差反応性がある核酸リガンド配列を削除することにより、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を向上させるための方法である。カウンター−ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、次の段階から構成される：（ａ）核酸の候補混合物を調製し；（ｂ）候補混合物を標的と接触させ（候補混合物に対して標的への親和性が高い核酸を候補混合物の残りの部分から分離し得る。）；（ｃ）親和性が高い核酸を候補混合物の残りの部分から分離し；（ｄ）親和性が高い核酸を標的から解離させ；（ｅ）非標的分子に対して非常に特異的な親和性がある核酸リガンドが除去されるように、親和性が高い核酸を１以上の非標的分子と接触させ；（ｆ）標的分子への結合に対して、相対的により高親和性及び特異性のある核酸配列が濃縮されている核酸の混合物を得るために、標的分子に対してのみ非常に特異的な親和性を有する核酸を増幅する。ＳＥＬＥＸ^ＴＭに対して上で記載のように、所望の目的が達成されるまで必要に応じて選択及び増幅のサイクルを繰り返す。

治療薬及びワクチンとしての核酸の使用において直面する潜在的な１つの問題は、所望の効果が現れる前に、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼなどの細胞内及び細胞外酵素により、ホスホジエステル型のオリゴヌクレオチドが体液中で素早く分解され得ることである。したがって、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、インビボでの安定性の向上又は送達特性の向上など、リガンドにおいて特性を改善する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基位置での化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸ^ＴＭで同定された核酸リガンドは、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号（これは、リボースの２’位、ピリミジンの５位、プリンの８位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載している。）、米国特許第５，７５６，７０３号（様々な２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載している。）及び米国特許第５，５８０，７３７号（２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基により修飾された１以上のヌクレオチドを含有する特異性の高い核酸リガンドを記載している。）に記載されている。

本発明においてもくろまれる核酸リガンドの修飾には、以下に限定されないが、さらなる電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用及び核酸リガンド塩基又は核酸リガンド全体への流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を組み込むその他の化学基を提供するものが含まれる。ヌクレアーゼに耐性のあるオリゴヌクレオチド集団を生成させるための修飾にはまた、１以上のヌクレオチド間結合の置換、糖の改変、塩基の改変又はこれらの組み合わせも含まれる。このような修飾には、以下に限定されないが、２’−位の糖修飾、５−位のピリミジン修飾、８−位のプリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換；骨格修飾、ホスホロチオエート又はアルキルホスフェート修飾、メチル化及び通常のものではない塩基対形成の組み合わせ（イソ塩基、イソシチジン及びイソグアノシンなど）が含まれる。修飾には、キャッピングなどの３’及び５’修飾も含まれ得る。

ある実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ_２（「ホルムアセタール」）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）（式中、各Ｒ又はＲ’は、独立に、Ｈ又は置換もしくは非置換アルキルである。）により置換されているオリゴヌクレオチドが提供される。−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−連結を介して、連結基を隣接するヌクレオチドに結合させることができる。オリゴヌクレオチドの全ての連結が同じである必要はない。本明細書中で使用される場合、ホスホロチオエートという用語は、１以上のイオウ原子により置換されるホスホジエステル結合中の１以上の非架橋酸素原子を包含する。

さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾された糖の基を含有し、例えば、ヒドロキシル基の１以上がハロゲン、脂肪族基で置換されているか、又はエーテルもしくはアミンとして官能化されている。ある実施形態において、フラノース残基の２’−位が、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル又はハロ基の何れかで置換されている。２’−修飾された糖の合成方法は、例えば、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；及びＨｏｂｂｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載されている。その他の修飾が当業者にとって公知である。このような修飾は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾又はＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾（既に同定されている非修飾リガンドの修飾）であり得るか、又はＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスに組み込まれることにより行われ得る。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾又はＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスに組み込まれることにより行われ得る修飾により、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ標的に対して特異性が高く、安定性（例えばインビボでの安定性）が向上している核酸リガンドが得られる。核酸リガンドに対して行われるＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾の結果、その核酸リガンドの結合能に悪影響を与えることなく安定性（例えばインビボでの安定性）を向上させ得る。

米国特許第５，６３７，４５９号及び米国特許第５，６８３，８６７号に記載のように、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、選択されたオリゴヌクレオチドをその他の選択されたオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることを包含する。例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、米国特許第６，０５１，６９８号及びＰＣＴ公開ＷＯ９８／１８４８０に記載のように、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、診断又は治療用複合体において、親油性又は非免疫原性の高分子化合物と選択された核酸リガンドを組み合わせることをさらに包含する。これらの特許及び出願は、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅及び複製特性及び、その他の分子の所望の特性を有する、多岐にわたる形状及びその他の特性の組み合わせを教示する。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭ法を介した、小型の柔軟なペプチドに対する核酸リガンドの同定も探索されてきた。小型のペプチドは、柔軟な構造を有し、通常は、複数の配座異性体の平衡状態で溶液中に存在し、したがって、最初、柔軟なペプチドの結合において失われる配座エントロピーにより結合親和性が制限され得ると考えられていた。しかし、溶液中での小型のペプチドに対する核酸リガンドの同定の実現可能性が米国特許第５，６４８，２１４号で示された。この特許において、サブスタンスＰ（１１アミノ酸ペプチド）に対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが同定された。

本発明の標的に対して高い特異性及び結合親和性を有するアプタマーは、通常、本明細書中に記載のように、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスにより選択される。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスの一部として、次に、場合によっては、所望の結合親和性を有する最小配列を決定するために、標的に結合するために選択された配列を最小化する。場合によっては、結合親和性を向上させるため、あるいは配列のどの位置が結合活性に不可欠かを調べるために、配列のランダム又は定方向突然変異誘発を行うことにより、選択配列及び／又は最小化された配列を最適化する。さらに、インビボでの分解に対してアプタマー分子を安定化させるために、修飾ヌクレオチドを組み込む配列を用いて、選択を行うことができる。

２’修飾ＳＥＬＥＸ^ＴＭ
アプタマーが治療薬としての使用に適切となるために、合成が安価であり、安全であり、インビボで安定であることが好ましい。野生型ＲＮＡ及びＤＮＡアプタマーは、通常、ヌクレアーゼにより分解されやすいので、インビボで安定ではない。２’−位に修飾基を組み込むことにより、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を大きく向上させることができる。

フルオロ及びアミノ基は、後にアプタマーが選択されるオリゴヌクレオチドプールにうまく組み込まれている。しかし、これらの修飾により、得られたアプタマーの合成コストが大きく上昇し、修飾オリゴヌクレオチドの分解及びそれに続くＤＮＡ合成に対する基質としてのヌクレオチドの使用により、その修飾ヌクレオチドがホストＤＮＡに再循環され得る可能性があるため、場合によっては安全性に問題が生じ得る。

本明細書中で与えられる場合、２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含有するアプタマーは、これらの欠点の多くを克服する。２’−ＯＭｅヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性であり、合成にかかるコストが高くない。２’−ＯＭｅヌクレオチドは生体系においてユビキタスであるが、天然のポリメラーゼは、生理的条件下で２’−ＯＭｅ ＮＴＰを基質として受け入れず、したがって、ホストＤＮＡへの２’−ＯＭｅヌクレオチドの再循環に関して安全性の問題はない。２’−修飾アプタマーを生成するために使用されるＳＥＬＥＸ^ＴＭ法は、例えば米国特許仮出願６０／４３０，７６１（２００２年１２月３日出願）、米国特許仮出願６０／４８７，４７４（２００３年７月１５日出願）、米国特許仮出願６０／５１７，０３９（２００３年１１月４日出願）、米国特許出願１０／７２９，５８１（２００３年１２月３日出願）及び米国特許出願１０／８７３，８５６（２００４年６月２１日出願）題名「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」（このそれぞれを、その全体で参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。

本発明は、酵素及び化学分解ならびに熱及び物理的分解に対して非修飾オリゴヌクレオチドよりも安定性が高いオリゴヌクレオチドを生成させるための修飾ヌクレオチド（例えば、２’位に修飾があるヌクレオチドなど）を含有する、トロンビンに結合し、トロンビンの機能を低下させるか又は阻害するアプタマーを含む。文献で２’−ＯＭｅ含有アプタマーのいくつかの例があるが（例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２、６８３−６９５、１９９５）、これらは、Ｃ及びＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換され、Ａ及びＧ残基が２’−ＯＨ置換された修飾転写産物のライブラリのインビトロ選択により作製された。機能的配列を同定した後、次に、２’−ＯＭｅ置換に対する許容性について各Ａ及びＧ残基を試験し、全てのＡ及びＧ残基が２’−ＯＭｅ残基として２’−ＯＭｅ置換を許容するアプタマーを再合成した。この２段階形式で作製されたアプタマーのＡ及びＧ残基の殆どが２’−ＯＭｅ残基での置換を許容するが、平均でおよそ２０％が許容しない。その結果、この方法を用いて作製されたアプタマーは、２個から４個の２’−ＯＨ残基を含有する傾向があり、結果として、安定性及び合成コストの面で欠点がある。ＳＥＬＥＸ^ＴＭ（及び／又は、本明細書中に記載のものを含む、その変形及び改法の何れか）によってアプタマーが選択され、濃縮されるオリゴヌクレオチドプールにおいて用いられる安定化オリゴヌクレオチドを生成する転写反応に修飾ヌクレオチドを組み込むことにより、本発明の方法は、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化する必要性がない（例えば、修飾ヌクレオチドを用いてアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することによる。）。

ある実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅ修飾の組み合わせを含有するアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ_２及び２’−メトキシエチル修飾の組み合わせを含有するアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ_２及び２’−メトキシエチル修飾の５^６の組み合わせを含有するアプタマーを提供する。

本発明の２’修飾アプタマーは、野生型ポリメラーゼよりも速い、フラノース２’位での巨大な置換基を有する修飾ヌクレオチドの組み込み速度を有する、例えば改変Ｔ７ポリメラーゼなどの改変ポリメラーゼを用いて生成される。例えば、６３９の位置のチロシン残基がフェニルアラニンに変化している単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は２’デオキシ、２’アミノ−及び２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を基質として容易に利用し、様々な用途に対して修飾ＲＮＡを合成するために広く使用されている。しかし、この突然変異Ｔ７ポリメラーゼは、報告によると、２’−ＯＭｅ又は２’−アジド（２’−Ｎ_３）置換基などの巨大な２’−置換基を有するＮＴＰを容易に利用（すなわち組み込み）できない。巨大な２’置換基の組み込みのために、Ｙ６３９Ｆ突然変異に加えて、７８４の位置のヒスチジンがアラニン残基に変更されている二重Ｔ７ポリメラーゼ突然変異（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が記載され、修飾ピリミジンＮＴＰを組み込むために限られた状況において使用されている。Ｐａｄｉｌｌａ、Ｒ．及びＳｏｕｓａ、Ｒ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００２、３０（２４）：１３８を参照のこと。７８４の位置のヒスチジンがアラニン残基に変えられている単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載されている。Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２、３０：１３８。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然変異及びＨ７８４Ａ単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼの両方において、アラニンなどのより小さいアミノ酸への変化により、２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドなど、より大きいヌクレオチド基質の組み込みが可能となる。

一般に、本明細書中に記載の条件下で、ＧＴＰ以外の全ての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの組み込みのためにＹ６９３Ｆ単一突然変異を使用することができ、ＧＴＰを含む全ての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの組み込みのためにＹ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然変異を使用することができる。Ｈ７８４Ａ単一突然変異は、本明細書中に記載の条件下で使用される場合、Ｙ６３９Ｆ及びＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ突然変異と同様の特性を保持すると予想される。

２’−修飾オリゴヌクレオチドを完全に修飾ヌクレオチドから、又は修飾ヌクレオチドのサブセットにより、合成し得る。修飾は、同じ又は異なり得る。全ヌクレオチドを修飾し得、全てが同じ修飾を含有し得る。全ヌクレオチドを修飾し得るが、様々な修飾を含有し得、例えば、同じ塩基を含有する全ヌクレオチドが修飾のある１つの型を有し得、一方、その他の塩基を含有するヌクレオチドが修飾の異なる型の修飾を有し得る。全てのプリンヌクレオチドがある１つの型の修飾を有し得る（又は非修飾である。）が、一方、全てのピリミジンヌクレオチドが修飾の別の異なる型を有する（又は非修飾である。）。このようにして、転写産物又は転写産物のプールが、例えばリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅヌクレオチドを含む修飾の何らかの組み合わせを用いて作製される。２’−ＯＭｅ Ｃ及びＵ、及び２’−ＯＨ Ａ及びＧを含有する転写混合物は、「ｒＲｍＹ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「ｒＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡ及びＧ、及び２’−ＯＭｅ Ｕ及びＣを含有する転写混合物は、「ｄＲｍＹ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「ｄＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｃ及びＵ、及び２’−ＯＨ Ｇを含有する転写混合物は、「ｒＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「ｒＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｃ、Ｕ及びＧ、及び２’−ＯＭｅ Ａ、Ｕ及びＣ、及び２’−Ｆ Ｇを代わりに含有する転写混合物は、「代替的混合物」と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「代替的混合物」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ（ここで、Ｇ’の最大１０％がリボヌクレオチドである。）を含有する転写混合物は、「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「ｒ／ｍＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｕ及びＣ、及び２’−Ｆ Ｇを含有する転写混合物は、「ｆＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「ｆＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｕ及びＣ、及びデオキシＧを含有する転写混合物は、「ｄＧｍＨ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「ｄＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡ及び２’−ＯＭｅ Ｃ、Ｇ及びＵを含有する転写混合物は、「ｄＡｍＢ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「ｄＡｍＢ」アプタマーと呼ばれ、全て２’−２Ｈヌクレオチドを含有する転写混合物は、「ｒＮ」混合物と呼ばれ、そこから選択されるアプタマーは、「ｒＮ」又は「ｒＲｒＹ」アプタマーと呼ばれる。「ｍＲｍＹ」アプタマーは、全ての２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するものであり、通常、（可能である場合は何れかの２’−ＯＨ Ｇの２’−ＯＭｅ Ｇによる）ＳＥＬＥＸ^ＴＭ後置換により、ｒ／ｍＧｍＨオリゴヌクレオチドから得られる。

好ましい実施形態には、２’−ＯＨ、２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅヌクレオチドの何らかの組み合わせが含まれる。より好ましい実施形態には、２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅヌクレオチドの何らかの組み合わせが含まれる。さらにより好ましい実施形態は、ピリミジンが２’−２Ｍｅである、２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅヌクレオチドの何らかの組み合わせを伴う（ｄＲｍＹ、ｍＲｍＹ又はｄＧｍＨなど）。

選択プロセスの前（選択プロセス前）に本発明のアプタマーへの修飾ヌクレオチドの組み込みを遂行する（例えば、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾）。場合によっては、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾により修飾ヌクレオチドが組み込まれている本発明のアプタマーをＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾によりさらに修飾することができる（すなわち、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾後のＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾）。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾により、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ標的に対して親和性が高く、インビボでの安定性も向上している修飾核酸リガンドが得られる。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾、すなわち修飾（例えば、短縮化、欠失、置換又は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾により組み込まれたヌクレオチドを有する既に同定されているリガンドのさらなるヌクレオチド修飾）の結果、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス前修飾により組み込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能に悪影響を与えることなくインビボでの安定性がさらに向上し得る。

ポリメラーゼが２’−修飾ＮＴＰを受け入れる条件で２’−修飾（例えば２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写産物のプールを生成させるために好ましいポリメラーゼは、Ｙ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然変異体又はＹ６９３Ｆ単一突然変異体である。その他のポリメラーゼ、特に、巨大な２’置換基に対して許容性が高いものを本発明において使用することもできる。本明細書中に記載の転写条件下で修飾ヌクレオチドを組み込む能力をアッセイすることにより、このようなポリメラーゼをその許容能についてスクリーニングできる。

多くの因子が、本明細書中に記載の方法において有用な転写条件に対して重要であると分かっている。例えば、得られる転写産物の少なくとも最初の約６残基が全てプリンであるようにＤＮＡ転写鋳型の５’末端の固定配列の５’末端にリーダー配列が組み込まれる場合、修飾転写産物の収率の向上が見られる。

修飾ヌクレオチドを組み込む転写産物を得る際の別の重要な因子は、２’−ＯＨ ＧＴＰの存在又は濃度である。転写を２つのフェーズに分けることができる：第一のフェーズは開始であり、この間に、ジヌクレオチドを得るために、ＮＴＰがＧＴＰ（又は別の置換グアノシン）の３’−ヒドロキシル末端に付加され、次に、このジヌクレオチドが約１０−１２ヌクレオチドまで伸び；第二のフェーズは伸長であり、この間に転写が最初の約１０−１２ヌクレオチドの付加を越えて進む。ポリメラーゼが２’−ＯＨ ＧＴＰを用いて転写を開始することを可能とするためには、２’−ＯＭｅ ＧＴＰの過剰量を含有する転写混合物に２’−ＯＨ ＧＴＰの少量を添加することで十分であるが、一旦転写が伸長フェーズに入ると、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨ ＧＴＰとの間の判別が低下すること、及び、２’−ＯＨ ＧＴＰよりも多量の２’−ＯＭｅ ＧＴＰにより、主に２’−ＯＭｅ ＧＴＰが組み込まれるようになることが知られている。

２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの転写産物への組み込みにおける別の重要な因子は、転写混合物中の二価マグネシウム及びマンガン両方の使用である。塩化マグネシウム及び塩化マンガンの濃度の様々な組み合わせが２’−Ｏ−メチル化転写産物の収率に影響を与えることが分かっており、塩化マグネシウム及び塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンと錯体を形成するＮＴＰの転写反応混合物中の濃度に依存する。最大限に（すなわち、全てのＡ、Ｃ及びＵ及び、Ｇヌクレオチドの約９０％）２’置換されたＯ−メチル化転写産物の最大収率を得るために、０．５ｍＭの濃度で各ＮＴＰが存在する場合、およそ５ｍＭ塩化マグネシウム及び１．５ｍＭ塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、およそ６．５ｍＭの塩化マグネシウム及び２．０ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、およそ９．６ｍＭの塩化マグネシウム及び２．９ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合も、これらの濃度からの乖離が２倍以下であれば、多量の修飾転写産物が得られる。

ＧＭＰ又はグアノシンによる転写のプライミングも重要である。この影響は、開始ヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性によるものである。その結果、この形式で生成された何らかの転写産物の５’−末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ Ｇであると思われる。ＧＭＰ（又はグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭ、さらにより好ましくは１ｍＭである。転写反応中にＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００が含まれることが、修飾ヌクレオチドの組み込みを最大にするのに有用であることもまた分かっている。

２’−ＯＭｅ ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）及びＧＴＰ（〜９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の転写産物への最大の組み込みのために、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２ １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、２．０ｍＭ）、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（それぞれ）５００μＭ（より好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨ ＧＴＰ ３０μＭ、２’−ＯＨ ＧＭＰ ５００μＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１５ユニット／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５ユニット／ｍＬ及び少なくとも８ヌクレオチド長の全てプリンのリーダー配列。本明細書中で使用される場合、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ突然変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（又は、本明細書中で述べられる何れかの他の突然変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）の１ユニットは、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で、転写産物に２’−ＯＭｅ ＮＴＰの１ｎｍｏｌｅを組み込むのに必要な酵素量として定義される。本明細書中で使用される場合、無機ピロホスファターゼの１ユニットは、ｐＨ７．２及び２５℃にて１分間に無機オルトホスフェートの１．０モルを遊離させる酵素量として定義される。

転写産物への２’−ＯＭｅ ＡＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰの最大の組み込み（１００％）（「ｒＧｍＨ」）のために、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２ １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（それぞれ）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１５ユニット／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５ユニット／ｍＬ及び、少なくとも８ヌクレオチド長の全てプリンのリーダー配列。

転写産物への２’−ＯＭｅ ＵＴＰ及びＣＴＰの最大の組み込み（１００％）（「ｒＲｍＹ」）のために、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２ １．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅ ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（それぞれ）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１５ユニット／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５ユニット／ｍＬ及び、少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。

転写産物へのデオキシＡＴＰ及びＧＴＰ及び２’−ＯＭｅ ＵＴＰ及びＣＴＰの最大の組み込み（１００％）（「ｄＲｍＹ」）のために、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミン２ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（それぞれ）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ １５ユニット／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５ユニット／ｍＬ及び、少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンのリーダー配列。

転写産物への２’−ＯＭｅ ＡＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰ及び２’−Ｆ ＧＴＰの最大の組み込み（１００％）（「ｆＧｍＨ」）のために、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．９ｍＭ、、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（それぞれ）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ １５ユニット／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５ユニット／ｍＬ及び、少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。

転写産物へのデオキシＡＴＰ及び２’−ＯＭｅ ＵＴＰ、ＧＴＰ及びＣＴＰの最大の組み込み（１００％）（「ｄＡｍＢ」）のために、次の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅＮＴＰ（それぞれ）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ １５ユニット／ｍＬ、無機ピロホスファターゼ ５ユニット／ｍＬ及び、少なくとも８ヌクレオチド長の全てがプリンであるリーダー配列。

上記のそれぞれに対して、（ａ）転写は、好ましくは、約２０℃から約５０℃、好ましくは約３０℃から４５℃、より好ましくは約３７℃の温度で、少なくとも２時間行い、（ｂ）２本鎖ＤＮＡ転写鋳型の５０−３００ｎＭを使用し（多様性を向上させるためにラウンド１で２００ｎＭの鋳型を使用し（ｄＲｍＹ転写において３００ｎＭの鋳型を使用する。）、続くラウンドでは、本明細書中に記載の条件を用いて、およそ５０ｎＭ、最適化ＰＣＲ反応の１／１０希釈を使用する。好ましいＤＮＡ転写鋳型は下記である（ここで、ＡＲＣ２５４及びＡＲＣ２５６は、全２’−ＯＭｅ条件下で転写し、ＡＲＣ２５５はｒＲｍＹ条件下で転写する。）。

本発明のｒＮ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）及び２’−ＯＨウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含有する。本発明のｒＮ転写混合物を用いて生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に全て、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジン及び２’−ＯＨウリジンを含有する。ｒＮ転写の好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含有する。ｒＮ転写のより好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含有する。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含有する。

本発明のｒＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸及び２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含有する。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を用いて生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に全て２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンを含有する。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。

本発明のｄＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−デオキシグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸及び２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含有する。本発明のｄＲｍＹ転写条件を用いて生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に全て２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンを含有する。好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。より好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。最も好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。

本発明のｒＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸及び２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸を含有する。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を用いて生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に全て２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジン及び２’−Ｏ−メチルアデノシンを含有する。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含有する。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含有する。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含有する。

本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸及び２’−ＯＨグアノシン三リン酸を含有する。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を用いて生成される、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に全て２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン及び２’−Ｏ−メチルウリジンであり、ここで、グアノシンヌクレオチドの集団は最大約１０％の２’−ＯＨグアノシンを有する。好ましい実施形態において、本発明の得られるｒ／ｍＧｍＨ修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全グアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含有する。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全グアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含有する。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全グアノシンヌクレオチドの約１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含有する。

本発明のｆＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸及び２’−Ｆグアノシン三リン酸を含有する。本発明のｆＧｍＨ転写条件を用いて生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に全て２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン及び２’−Ｆグアノシンを含有する。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含有する。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも全アデノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含有する。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列を含有する。

本発明のｄＡｍＢ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸及び２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含有する。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を用いて生成される修飾オリゴヌクレオチドは、実質的に全て２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン及び２’−Ｏ−メチルウリジンを含有する。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。最も好ましい実施形態において、得られる本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含有する。

各場合において、次に、アプタマーを同定するために、及び／又はある標的に対して高い結合特異性を有する配列の保存的モチーフを決定するために、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスにおいてライブラリとして転写産物を使用することができる。得られる配列は、既に部分的に安定化されているので、最適化アプタマー配列に到達するためのプロセスからこの段階を削除して、結果として安定性のより高いアプタマーが得られる。２’−ＯＭｅＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスの別の長所は、得られる配列が、配列中で必要とする２’−ＯＨヌクレオチドがより少ない、あるいは全く必要としないと思われることである。２’−ＯＨヌクレオチドが残る限り、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス後修飾を行うことにより、これらを除去することができる。

下記のように、上記の最適化条件以外の条件下で、２’置換ヌクレオチドを完全に組み込む転写産物を、低いが依然として有用な収率で得ることができる。例えば、上記の転写条件に対する変法には、以下のものが含まれる：
ＨＥＰＥＳ緩衝液濃度は、０から１Ｍの範囲であり得る。本発明はまた、例えばＴｒｉｓ−ヒドロキシメチル−アミノメタンを含む、ｐＫａが５から１０であるその他の緩衝剤の使用も意図する。

ＤＴＴ濃度は、０から４００ｍＭの範囲であり得る。本発明の方法はまた、例えばメルカプトエタノールを含む、その他の還元剤の使用も提供する。

スペルミジン及び／又はスペルミン濃度は、０から２０ｍＭの範囲であり得る。

ＰＥＧ−８０００濃度は、０から５０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、例えばその他の分子量のＰＥＧ又はその他のポリアルキレングリコールを含む、その他の親水性ポリマーの使用も提供する。

Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００濃度は、０から０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ界面活性剤を含むその他の界面活性剤を含む、その他の非イオン性界面活性剤の使用も提供する。

ＭｇＣｌ_２濃度は、０．５ｍＭから５０ｍＭの範囲であり得る。ＭｎＣｌ_２濃度は、０．１５ｍＭから１５ｍＭの範囲であり得る。ＭｇＣｌ_２及びＭｎＣｌ_２の両方が、述べた範囲内で存在しなければならず、好ましい実施形態において、約１０から約３のＭｇＣｌ_２：ＭｎＣｌ_２比、好ましくは約３−５：１の比、より好ましくは、約３−４：１の比で存在する。

２’−ＯＭｅ ＮＴＰ濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭから５ｍＭの範囲であり得る。

２’−ＯＨ ＧＴＰ濃度は、０μＭから３００μＭの範囲であり得る。

２’−ＯＨ ＧＭＰ濃度は、０から５ｍＭの範囲であり得る。

ｐＨは、ｐＨ６からｐＨ９の範囲であり得る。修飾ヌクレオチドを組み込む殆どのポリメラーゼの活性のｐＨ範囲内で本発明の方法を実施し得る。さらに、本発明の方法は、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＴを含む、転写反応条件におけるキレート剤の任意の使用を提供する。

アプタマー医薬化学
アプタマー医薬化学は、一連の変形アプタマーが化学合成される、アプタマー改善技術である。これらの一連の変形は通常、１個の置換が導入されていることで親アプタマーと異なり、この置換の位置により互いに異なる。次に、これらの変形型を互いに、及び親アプタマーと比較する。特性の向上は十分に完全であり得、特定の治療基準に到達するのに必要であるのは、１個の置換を含むことのみである。

あるいは、複数の置換基が同時に導入されるさらなる一連の変形型を設計するために、一連の単一変形型から収集される情報を使用し得る。ある設計ストラテジーにおいて、単一置換基変形型の全てに順位付けを行い、上から４個を選択し、これらの４個の単一置換基変形型の全ての可能な二重（６）、三重（４）及び四重（１）の組み合わせを合成し、アッセイする。第二の設計ストラテジーにおいて、最良の単一置換基変形型を新しい親とみなし、この最高ランクの単一置換基変形型を含む全ての可能な二重置換基変形型を合成し、アッセイする。その他のストラテジーを使用することができ、さらに改良された変形型を同定することを続けながら、多くの置換基を徐々に増加させるように、これらのストラテジーを繰り返し適用し得る。

特に、全体ではなく局所的な置換基の導入を探索するための方法として、アプタマー医薬化学を使用し得る。転写により生成されるライブラリ内でアプタマーが探索されるので、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセス中に導入される何れの置換基も全体的に導入されなければならない。例えば、ホスホロチオエート結合をヌクレオチド間に導入することが望ましい場合、それらを全てのＡ（又は全てのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）（全体的な置換）でのみ導入することができる。一部のＡ（又は一部のＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）（局所的置換）でホスホロチオエートを必要とするが、他のＡではそれを許容できないアプタマーは、このプロセスにより容易に探索することはできない。

アプタマー医薬化学プロセスにより利用できる置換基の種類は、それらを固相合成試薬として生成し、それらをオリゴマー合成スキームに導入する能力によってのみ制限される。本プロセスは、ヌクレオチドのみに制限されない。アプタマー医薬化学スキームは、立体的なかさ高さ、疎水性、親水性、親油性、疎脂性、正電荷、負電荷、中性電荷、両性イオン、分極性、ヌクレアーゼ耐性、立体配座の剛性、立体配座柔軟性、タンパク質結合特性、質量などを導入する置換基を含み得る。アプタマー医薬化学スキームは、塩基修飾、糖修飾又はホスホジエステル結合修飾を含み得る。

治療用アダプタマーの文脈内で有益と思われる置換基の種類を考慮する場合、次のカテゴリーの１以上に属する置換を導入することが望ましいものであり得る：
（１）本体に既に存在する置換基、例えば、２’−デオキシ、２’−リボ、２’−Ｏ−メチルプリン又はピリミジン又は５−メチルシトシン。

（２）既に、認可された治療の一部である置換基、例えば、ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチド。

（３）上記２つのカテゴリーの１つに加水分解又は分解する置換基、例えば、メチルホスホネート結合オリゴヌクレオチド。

本発明のトロンビンアプタマーは、本明細書中に記載のアプタマー医薬化学を通じて開発されたアプタマーを含む。

トロンビン結合アプタマー
本発明の材料は、トロンビンに結合し、ある実施形態において、インビボ及び／又は細胞に基づくアッセイにおいてトロンビンの活性を低下させるか又は阻害する、１３−５１ヌクレオチド長の一連の核酸アプタマーを含む。好ましくは、本発明のアプタマーは、トロンビンに高親和性で結合し、約３００ｐＭ未満、好ましくは２５０ｐＭ未満、より好ましくは約２００ｐＭ未満のＫ_Ｄを有する。

本発明のアプタマーは、トロンビンにより引き起こされるか、又はトロンビンと関連のあることが知られている、ある種の凝固関連疾患を治療及び／又は予防するための、低毒性で、安全で効果的な様相を提供する。本発明のアプタマーはまた、ステント留置を含む経皮冠動脈インターベンション、末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）に関連する手術及び、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術を含む心肺バイパス（ＣＰＢ）手法などの外科的処置に関連する、凝固を調節するための、特に抗凝固のための、安全で効果的な様相を提供する。本発明のアプタマーは、活性凝固時間（ＡＣＴ）及びその他の凝固の通常の測定により測定することができる抗凝固において効果を有し、例えばヘパリン投与により起こるように、血小板活性化などの望ましくない副次的効果がない。さらに、ある実施形態において、抗トロンビンアプタマーの薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）半減期は短く、その結果、迅速に抗トロンビン効果が逆転する。

本発明における治療及び／又は診断としての使用のためのトロンビン結合アプタマーの例には次の配列が含まれる：配列番号９−４１、４３−１９１、１９３−２０４、２０８−３０４、３０７−３２９、３３１−３３２、３３４、３３６−３３７、３４０−３９２、３９６−３９７、４００及び４０２−４４０。

トロンビンに結合するその他のアプタマーは、下記実施例１及び２において記載する。

これらのアプタマーは、例えば親油性又は高分子量化合物（ＰＥＧなど）への共役、キャッピング部分の組み込み、修飾ヌクレオチドの組み込み、リン酸骨格における置換及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、本明細書中に記載のような修飾を含み得る。

本発明のある実施形態において、トロンビンに結合する、単離された非天然のアプタマーを提供する。ある実施形態において、単離された非天然のアプタマーのトロンビンに対する解離定数（「Ｋ_Ｄ」）は、１００μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、好ましくは２５０ｐＭ未満、より好ましくは約２００ｐＭ未満である。下記実施例１に記載のドットブロット滴定により解離定数を決定し得る。

別の実施形態において、本発明のアプタマーは、トロンビンの機能を低下させるか又は阻害する。本発明の別の実施形態において、本アプタマーは、トロンビンの変異体に結合し、トロンビンの変異体の機能を低下させるか又は阻害する。トロンビン変異体は、本明細書中で使用される場合、トロンビン機能と基本的に同じ機能を果たす変異体を包含し、好ましくは実質的に同じ構造を含み、ある実施形態において、トロンビンのアミノ酸配列に対して、７０％配列同一性、好ましくは８０％配列同一性、より好ましくは９０％配列同一性、より好ましくは９５％配列同一性を含む。本発明のある実施形態において、下記のようにＢＬＡＳＴを用いて標的変異体の配列同一性を調べる。

２以上の核酸又はタンパク質配列の文脈における「配列同一性」という用語は、次の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は目視により調べた場合、最大の一致に対して比較し、アラインした場合、同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定された％を有する、２以上の配列又は部分配列を指す。配列比較のために、通常１つの配列が、試験配列を比較する参照配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する、試験配列の％配列同一性を計算する。例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータを利用した手段（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は、目視により（全般的に、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照。）、比較のための配列の最適アラインメントを行うことができる。

％配列同一性を決定するために適切なアルゴリズムの一例は、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（本明細書中で以後「ＢＬＡＳＴ」と呼ぶ。）において使用されるアルゴリズムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照のこと。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（本明細書中で以後「ＮＣＢＩ」と呼ぶ。）を通じて公開されている。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）及びＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いて配列同一性を決定する際に使用される初期設定パラメータは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３２：Ｗ２０−Ｗ２５（２００４）に記載されている。

本発明の別の実施形態において、本アプタマーは、次の配列番号の何れか１個を含有するアプタマーと実質的に同じである、トロビンへの結合能を有する：配列番号：４３−４４、４８−４９、５２、６３、７２、８２、８４、９２、９７、１１６、１３０、１４１、１４３、１４６、１６６、１７２、１８５、２８３、２９２−２９４、３１９−３２９、３３１−３３２、３３４、３３６−３３７、３４０−３９２、３９６−３９７、４００、４０２−４３３。本発明のその他の実施形態において、本アプタマーは、次の配列番号の何れか１個を含有するアプタマーと実質的に同じである、構造及びトロビンへの結合能を有する：４３−４４、４８−４９、５２、６３、７２、８２、８４、９２、９７、１１６、１３０、１４１、１４３、１４６、１６６、１７２、１８５、２８３、２９２−２９４、３１９−３２９、３３１−３３２、３３４、３３６−３３７、３４０−３９２、３９６−３９７、４００、４０２−４３３。

本発明の別の実施形態において、本アプタマーは、次の配列番号の何れか１個と実質的に同じである、凝固低下又は阻害能を有する：１１、１５、２１、２３、３２、３４、８４、８６、９２、９４、１１６、１９１、１９７、２００、２８３−２８５、２８７、２８９−２９０、２９２−３０４、３０７−３１８、４１１、４３４-４３８及び４４０。本発明の別の実施形態において、本アプタマーは、次の配列番号の何れか１個と実質的に同じである、凝固低下又は阻害能及び、実質的に同じ構造を有する：１１、１５、２１、２３、３２、３４、８４、８６、９２、９４、１１６、１９１、１９７、２００、２８３−２８５、２８７、２８９−２９０、２９２−３０４、３０７−３１８、４１１、４３４-４３８及び４４０。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、配列番号１９１、１９７、２８３、２９２−２９４、４１１及び４３４−４４０の何れか１個に従う配列を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは、医薬組成物において活性成分として使用される。別の実施形態において、本発明のアプタマー又は本発明のアプタマーを含有する組成物は、例えば急性及び慢性のトロンビン介在性凝固疾患などの凝固関連疾患を治療するために使用される。別の実施形態において、本発明のアプタマー又は本発明のアプタマーを含有する組成物は、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手法又は経皮冠動脈インターベンションなどの外科的処置の前、その最中、その後又はこれらの組み合わせで、抗凝固剤として使用される。

ある実施形態において、本発明のアプタマー治療薬は、それらの標的に対して高い親和性及び高い特異性を有し、同時に、患者又は対象の体内でアプタマー治療薬が分解された場合の、非天然ヌクレオチド置換からの有害な副作用を軽減する。ある実施形態において、本発明のアプタマー治療薬を含有する治療組成物は、フッ素化ヌクレオチド不含であるか、又はフッ素化ヌクレオチドの量が少ない。

当技術分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）及びＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）参照。）及びトリエステル合成法などの液相法（例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）及びＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、２８：２４４９（１９７８）を参照。）を含む、当技術分野で公知の何らかのオリゴヌクレオチド合成技術を用いて、本発明のアプタマーを合成することができる。

ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、合成により生成され、８，１５５．２４ダルトンの分子量（ＭＷ）の、Ｃ_２５６Ｈ_３１９Ｎ_１０４Ｏ_１５８Ｐ_２５（遊離酸型）の分子式を有する。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）のナトリウム塩は、Ｃ_２５６Ｈ_２９４Ｎａ_２５Ｎ_１０４Ｏ_１５８Ｐ_２５の分子式を有し、換算ＭＷは８７０４．７７ダルトンである。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）のナトリウム塩に対する化学名は、２’−デオキシシチジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシシチジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシシチジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシチミジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシアデノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシチミジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシチミジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシチミジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシアデノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシチミジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシチミジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシシチジリル−（３’→５’Ｏ，Ｏ−ホスホリル）−２’−デオキシグアノシン、２５−ナトリウム塩である。

医薬組成物
本発明はまた、トロンビンに結合するアプタマー分子を含有する医薬組成物も含む。ある実施形態において、本組成物は内服に適切であり、単独で、又は１以上の医薬的に許容可能な担体と組み合わせて、医薬的に活性のある本発明の化合物の有効量を含む。本化合物は、これらに何らかの毒性があっても、毒性が非常に低いという点で特に有用である。

患者において、疾病又は疾患などの病状を治療又は予防するために、又はこのような疾病又は疾患の症状を緩和するために、本発明の組成物を使用することができる。例えば、凝固に関与する病状、及び、特に、トロンビン関連の凝固に関与する病状を治療又は予防するために、本発明の組成物を使用することができる。本発明のアプタマーが高親和性で結合する標的に関連するか又は由来する、疾病又は疾患に罹患している、又は罹患しやすい対象に投与するために、本発明の組成物は有用である。

本発明のアプタマーが高親和性で結合する標的に関連するか又は由来する、疾病又は疾患に罹患している、又は罹患しやすい対象に投与するために、本発明の組成物は有用である。病状を有する患者又は対象を治療するための方法において、本発明の組成物を使用することができる。本方法は、病状に関与する標的タンパク質（例えば、トロンビン）に結合する、アプタマー又はアプタマーを含有する組成物を患者又は対象に投与することを含み、標的タンパク質へのアプタマーの結合によって標的、例えばトロンビンの生物学的機能を変化させ、それにより病状を治療する。

病状がある、及び／又は抗凝固の必要がある患者又は対象、すなわち、本発明の方法により治療される患者又は対象は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、サル及び／又は、ウマなどの有蹄類、より具体的にはヒトであり得る。

ある実施形態において、ＣＡＢＧ、ＰＣＩ、血管形成、血管内手術、心臓血管及び末梢血管開放系及び血管内手術、末梢／冠状動脈又は静脈におけるステントを置換するための手術、人工臓器、心臓弁、冠状動脈性心臓病及び／又は静脈又は動脈における血管疾患を処置するための手術及び末梢動脈閉塞疾患を処置するための手術、冠状動脈性心臓病及び／又は例えば腎動脈、腹大動脈における、頸動脈における、末梢動脈閉塞疾患（「ＰＡＯＤ」）における、静脈又は動脈における血管疾患を処置するための手術、などの外科的介入の前、その最中、その後又はこれらの組み合わせで、本発明のアプタマー、例えばＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を投与する。本方法のある実施形態において、例えば人工股関節置換術、膝置換術などの術後の血栓症を予防するために、本発明のアプタマーを投与する。本方法のある実施形態において、腹腔鏡検査、婦人科的処置などの、低侵襲的処置の前、その最中、その後又はこれらの組み合わせで、本アプタマーを投与する。

ヘパリン誘発性血小板減少症（「ＨＩＴ」）、ヘパリン抵抗性、腎機能障害及び／又は肝機能障害の患者の抗凝固剤治療において、本発明のアプタマー、例えばＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を使用する。さらなる実施形態において、本発明は、トロンビンを低下させるか又は阻害することが望ましい状態の、ヒト又はその他の哺乳動物における治療に関する。急性冠不全症候群、うっ血性心不全、心房細動、静脈血栓症、例えば深部静脈血栓症、肺塞栓、動脈血栓症（例えば、心筋虚血におけるものなど）、心筋梗塞、不安定狭心症、血栓症に基づく発作及び末梢動脈血栓症を含む、血液及び組織での血栓症及び／又は凝固性亢進の治療及び／又は予防において、ヒトを含む哺乳動物で本発明のアプタマーを使用し得る。さらに、冠動脈疾患、脳動脈疾患及び末梢動脈疾患などのアテローム性動脈硬化疾患（疾病）の治療及び／又は予防において本アプタマーを使用し得る。ある実施形態において、血液透析及び播種性血管内凝固症候群での抗凝固剤治療において、本発明のアプタマー、例えばＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を使用し得る。ある実施形態において、カテーテル、ステント及び、インビボで患者において使用される機械装置をすすぐ及び／又は被覆する方法において、及び、インビトロで血液、血漿及びその他の血液製品を保存するための抗凝固剤として、本発明のアプタマーを使用し得る。

またさらに、転移を含む癌、炎症性疾患（動脈炎及び糖尿病を含む。）など、血液凝固が根本的な原因プロセス又は二次的病状の原因であるその他の疾病において、本アプタマーを使用し得る。

例えば、心臓手術などの手術の、前、最中及び／又は後に、抗凝固を必要とする患者又は対象を治療するための方法において、本発明の組成物を使用することができる。本方法のある実施形態での、凝固を調節する方法において、例えばＣＡＢＧ手術の、前、最中及び／又は後に、一定の静脈点滴により、又は静脈ボーラス投与により、抗トロンビンアプタマーを投与することができる。これらの実施形態において、本発明の組成物中で、そのナトリウム塩として、等張の中性ｐＨの水性の食塩液中で、アプタマーが提供され得る。

実際には、所望の生物学的活性（例えば、フィブリノーゲン及びＰＡＲ−Ｉへのアプタマー標的、トロンビンの結合を低下させるか又は阻害する。）を与えるのに十分である量で、本アプタマー又はこれらの医薬的に許容可能な塩を投与する。

本発明のある態様は、凝固関連疾患に対するその他の治療剤と組み合わせた、本発明のアプタマー組成物を含有する。本発明のアプタマー組成物は、例えば複数のアプタマーを含有し得る。いくつかの例において、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤などの別の有用な組成物と組み合わせて、１以上の本発明の化合物を含有する本発明のアプタマー組成物を投与する。さらに、上記のような、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分裂抑制剤又は細胞毒性抗生物質などの、抗細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤又は化学療法剤と組み合わせて、本発明の化合物を投与し得る。一般に、このような組み合わせにおいて使用するための既知の治療剤の現在利用可能な形態が適切である。

「併用療法」（又は「同時療法（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）」）は、これらの治療剤の相互作用から有益な効果を提供することを意図する具体的な治療計画の一部としての、本発明のアプタマー組成物及び少なくとも第二の薬剤の投与を含む。この併用の有益な効果は、以下に限定されないが、治療剤の組み合わせによる、薬物動態又は薬力学的相互作用を含む。併用でのこれらの治療剤の投与は、通常、ある一定の期間にわたり行われる（通常、選択される組み合わせに依存して、分、時間、日又は週）。

「併用療法」は、一般にではないが、付随的に、及び適宜、結果として本発明の組み合わせとなる、別個の単剤療法計画の一部として、これらの治療剤の２以上の投与を包含するものであり得る。「併用療法」は、連続的なこれらの治療剤の投与を包含するものとし、すなわち、各治療剤が異なる時間に投与される、ならびに、これらの治療剤、又は少なくともこれらの治療剤の２つが実質的に同時に投与される。例えば、各治療剤の固定の比を有する１個のカプセルを対象へ投与することにより、又は、各治療剤に対する、複数、１個のカプセルで、実質的に同時投与を行い得る。

以下に限定されないが、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路及び粘膜組織を介した直接吸収を含む、何らかの適切な経路により、各治療剤の連続的又は実質的に同時の投与を行うことができる。同じ経路により、又は異なる経路により、本治療剤を投与することができる。例えば、選択した組み合わせの第一の治療剤を注射により投与することができ、一方、組み合わせの他方の治療剤を局所的に投与することができる。

あるいは、例えば、全ての治療剤を局所的に投与し得るか、又は、全ての治療剤を注射により投与し得る。治療剤を投与する順番は、他に示されない限り、厳密に重大ではない。「併用療法」はまた、その他の生物学的に活性のある成分とのさらなる組み合わせにおいて、上述のような治療剤の投与も包含し得る。併用療法がさらに非薬物療法を含む場合、治療剤と非薬物療法との組み合わせの相互作用からの有益な効果が達成される限り、何れかの適切な時間にこの非薬物療法を行い得る。例えば、適切なケースにおいて、非薬物療法が一時的に治療剤の投与から除かれるとき（おそらく、数日間又は数週間でも）、この有益な効果がまた達成される。

本発明の治療又は医薬組成物は通常、医薬的に許容可能な溶媒中で溶解されるか又は分散されている、治療の活性成分の有効量を含有する。医薬的に許容可能な溶媒又は担体には、何れか及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に活性のある物質に対するこのような溶媒及び物質の使用は当技術分野で周知である。補助的な活性成分も本発明の治療組成物に組み込み得る。

医薬又は薬理組成物の調製は、本開示に照らして、当業者にとって公知である。通常、溶液又は懸濁液としての何れかでの注入物質；注射前の液体中の溶液又は懸濁液として適切な固体の形態；経口投与のための、錠剤又はその他の固体として；徐放カプセルとして；又は、点眼薬、クリーム、ローション、サルブ、吸入薬などを含む、現在使用されている何らかのその他の形態として、このような組成物を調製し得る。術野の特定の領域を処置するための、執刀者、医師又は医療関係者による食塩水を基にした洗浄液などの滅菌処方物の使用もまた特に有用であり得る。組成物はまた、微小デバイス、微粒子又はスポンジを介して送達され得る。

処方において、剤形と適合する形式で、薬理学的に有効となるような量で、治療剤を投与する。上述のような注射溶液など様々な剤形で、処方物が容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用できる。

この状況において、投与される、活性成分の量及び組成物の体積は、治療を受けるホスト動物に依存する。投与に必要とされる活性化合物の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に対して固有である。

活性化合物を分散するのに必要とされる組成物の最小体積を通常利用する。投与のための適切な計画もまた様々であるが、最初に化合物を投与し、結果を監視し、次いでさらなる間隔でさらなる調節投与量を与えることにより、投与の型が決定される。

例えば、錠剤又はカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与の場合、経口の、無毒性の、医薬的に許容可能な不活性担体（エタノール、グリセロール、水など）と活性薬物成分を組み合わせることができる。さらに、望ましい又は必要な場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤を本混合物に組み込むこともできる。適切な結合剤には、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプン糊、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン、天然の糖（グルコース又はβ−ラクトースなど）、コーンシロップ、天然及び合成ガム（アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウムなど）、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの剤形で使用される潤滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコールなどが含まれる。崩壊剤には、以下に限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩又は沸騰性混合物などが含まれる。希釈剤には、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシンが含まれる。

持続放出及び徐放錠剤又はカプセル、ピル、粉末、顆粒、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁液、シロップ及びエマルジョンなどの経口投与形態において、本発明の化合物を投与することもできる。座薬は、脂肪エマルジョン又は懸濁液から有利に調製される。

医薬組成物は滅菌され得、及び／又は、保存料、安定化剤、湿潤剤又は乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩及び／又は緩衝液などのアジュバントを含有し得る。さらに、これらはまた、その他の治療上価値のある物質も含有し得る。本組成物は、従来の、混合、造粒又は被覆法に従い調製され、通常、活性成分を約０．１％から７５％、好ましくは約１％から５０％含有する。

液体、特に注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散することなどにより調製することができる。例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの医薬的に純粋な溶媒中で本活性化合物を溶解させるか又はこれと混合し、これにより、注射可能な溶液又は懸濁液を形成する。さらに、注射前に液体中で溶解させるために適切な固体形態を処方することができる。

静脈内（ボーラス及び点滴の両方）、腹腔内、皮下又は筋肉内形態及び、医薬技術分野の当業者にとって周知の全ての使用形態で、本発明の化合物を投与することができる。従来の形態で、溶液又は懸濁液の何れかとして、注入剤を調製することができる。

皮下、筋肉内又は静脈内注射及び点滴に対して、非経口の注射可能な投与を通常使用する。さらに、非経口投与のためのあるアプローチでは、米国特許第３，７１０，７９５号（参照により本明細書中に組み込む。）に従い、持続放出又は徐放系の移植を利用し、これにより、確実に投与の一定レベルを維持することができる。

さらに、適切な経鼻ビヒクル、吸入薬の局所使用を介した鼻内形態、又は経皮経路を介して、当業者にとって周知の経皮パッチの形態を用いて、本発明のための好ましい化合物を投与することができる。経皮送達系の形態で投与するために、言うまでもなく、投与計画を通して、投与は間欠的ではなく、連続である。その他の好ましい局所製剤には、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー及びジェルが含まれ、ここで活性成分の濃度は通常、０．０１％から１５％ｗ／ｗ又はｗ／ｖの範囲である。

固形組成物の場合、賦形剤には、医薬グレードの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。例えばポリアルキレングリコール、例えばプロピレングリコールを担体として使用して、上記で示した活性化合物を座薬として処方することもできる。ある実施形態において、脂肪エマルジョン又は懸濁液から座薬を有利に調製する。

小さな単層ベシクル、大きな単層ベシクル及び多重膜ベシクルなどの、リポソーム送達系の形態で、本発明の化合物を投与することもできる。コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンを含有する様々なリン脂質から、リポソームを形成することができる。ある実施形態において、米国特許第５，２６２，５６４号に記載のように、薬物を封入する脂質層を形成するために、薬物の水溶液で脂質成分のフィルムを水和する。例えば、当技術分野で公知の方法を用いて構築された、親油性化合物又は非免疫原性の高分子量化合物との複合体として、本明細書中に記載のアプタマー分子を提供することができる。核酸会合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号で提供される。

標的可能な薬物担体として、可溶性ポリマーと本発明の化合物をカップリングさせることもできる。このようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール又は、パルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが含まれ得る。さらに、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋又は両親媒性のブロックコポリマーなどの、薬物の制御放出を行うのに有用な生体分解性ポリマーのクラスに本発明の化合物をカップリングさせ得る。

必要に応じて、投与すべき医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤及びその他の物質（例えば、酢酸ナトリウム及びオレイン酸トリエタノールアミンなど）などの少量の無毒性の補助物質も含有し得る。

患者の、タイプ、種、年齢、体重、性別及び医学的状態；治療すべき状態の重症度；投与経路；患者の腎及び肝機能；使用する特定のアプタマー又はその塩を含む様々な因子に従い、アプタマーを利用した投与計画を選択する。通常技術の医師又は獣医師は、状態の進行を、予防、抑制又は阻止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。

次の投与量において与えられる分子量はアプタマーオリゴ重量のみに関係し、ＰＥＧ部分などへの共役により与えられる質量を含まない。本発明の経口投与量は、望ましい効果のために使用される場合、経口で約０．０５から７５００ｍｇ／日の間の範囲である。本組成物は、好ましくは、活性成分の、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０及び１０００．０ｍｇを含有する分割錠の形態で提供される。点滴投与量、経鼻投与量及び経皮投与量は、０．０５から７５００ｍｇ／日の範囲である。皮下、静脈内及び腹腔内投与量は、０．０５から１２，０００ｍｇ／日の範囲である。

本発明の化合物の有効血漿レベルは、０．００２ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの範囲である。

１日１回投与で本発明の化合物を投与し得るか、又は、１日に、２、３又は４回の分割投与で１日総投与量を投与し得る。

アプタマー治療薬の薬物動態及び生体内分布の調節
アプタマーを含む全てのオリゴヌクレオチドに基づく治療薬に対する薬物動態特性を所望の医薬適用に適合するように調整することが重要である。細胞外標的に向けられたアプタマーは、細胞内送達に関する問題（アンチセンス及びＲＮＡｉに基づく治療薬を用いる場合など）に直面することはないが、このようなアプタマーは、標的器官及び組織に分布することができなければならず、所望の投与計画と一致する時間にわたり身体に残存しなければならない（非修飾）。

このように、本発明は、アプタマー組成物の薬物動態、特にアプタマー薬物動態を調整するための能力に影響を与えるための材料及び方法を提供する。例えば、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）、急性冠不全症候群（ＡＣＳ）及び深部静脈血栓症（ＤＶＴ）などの様々な疾患の治療において、半減期（ｔ_１／２）がより長い、本発明のトロンビン結合アプタマー−ＰＥＧ共役物を使用し得る。これらのアプタマー共役物により示されるより長いｔ_１／２は、所望の効果を生み出すのに必要な投与量に影響を及ぼす（例えば低くする。）。慢性疾患に対して半減期がより長いアプタマー共役物を使用することもできる。血液採取、血液循環又は血液保存装置（この装置は、本発明の抗トロンビンアプタマー又は本発明の抗トロンビンアプタマーの混合物の有効量を含む。）において、抗凝固剤として、本発明の、アプタマー共役物及び／又は安定化アプタマーを含む、半減期（ｔ_１／２）がより長い本発明のアプタマーを使用することもできる。このような装置の例には、以下に限定されないが、血液採取バッグ、血液採取チューブ及び血液採取シリンジが含まれる。特定の実施形態において、血液保存装置、例えば血液バッグ（ここで、血液は約４℃で数日、好ましくは２週間保存される。）において、本発明のアプタマーの有効量を使用する。

アプタマーへの修飾部分（例えばＰＥＧポリマー）の共役及び／又は核酸の化学組成を変化させるための修飾ヌクレオチド（例えば、２’−フルオロ又は２’−Ｏ−メチル）の組み込みにより、アプタマー薬物動態が調整可能となる（すなわち、低下させるか又は阻害する能力）。既存の治療適用の改善において、あるいは、新しい治療適用の開発において、アプタマー薬物動態を調整する能力が使用される。例えば、ある治療適用において、例えば、迅速な薬物クリアランス又はターンオフが望まれ得る、抗新生物又は緊急の医療環境において、循環中のアプタマーの滞留時間を短くすることが望ましい。あるいは、その他の治療適用において、例えば、治療薬の全身的循環が望ましい維持療法において、循環中のアプタマーの滞留時間を長くすることが望ましいことがあり得る。

さらに、対象におけるアプタマー治療薬の生体内分布を変化させるために、アプタマー薬物動態の調整可能性が使用される。例えば、ある治療適用において、特定タイプの組織又は具体的な器官（又は一連の器官）を標的とすることを目的として、アプタマー治療薬の生体内分布を変化させることが望ましい場合があり得る。これらの適用において、アプタマー治療薬は特定の組織又は器官に選択的に蓄積する。その他の治療適用において、アプタマー治療薬が罹患組織で選択的に蓄積するように、ある一定の疾病、細胞損傷又はその他の異常な病状と関連する、細胞性マーカー又は症状を示す組織を標的とすることが望ましい場合があり得る。例えば、米国仮出願第６０／５５０７９０号（２００４年３月５日出願）題名「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｔａｍｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」及び米国非仮出願第１１／０７５，６４８号（２００５年３月７日出願）及び題名Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｔａｍｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」において、ＰＥＧ付加アプタマー治療薬が選択的に炎症組織に蓄積するように、炎症が起こっている組織を標的とするために、アプタマー治療薬のＰＥＧ付加（例えば、２０ｋＤａＰＥＧポリマーのＰＥＧ付加）が使用されている。

アプタマー治療薬（例えば、アプタマー共役物又は修飾ヌクレオチドなどの化学的性質が改変されたアプタマー）の薬物動態及び生体内分布プロファイルを調べるために、様々なパラメータを監視する。このようなパラメータには、例えば、アプタマー組成物の、半減期（ｔ_１／２）、血漿クリアランス（Ｃ１）、分布量（Ｖｓｓ）、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、最大観察血清又は血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）及び平均滞留時間（ＭＲＴ）が含まれる。本明細書中で使用される場合、「ＡＵＣ」という用語は、アプタマー投与後の時間に対するアプタマー治療薬の血漿濃度のプロットの下の面積を指す。あるアプタマー治療薬の、バイオアベイラビリティー（すなわち、アプタマー投与後の循環中の投与されたアプタマー治療薬の％）及び／又は総クリアランス（Ｃ１）（すなわち、アプタマー治療薬が循環から排除される速度）を推定するためにＡＵＣ値を使用する。分布量は、身体に存在するアプタマーの量に対するアプタマー治療薬の血漿濃度に関係する。Ｖｓｓが大きいほど、血漿外で見られるアプタマーが多くなる（すなわち、管外流出がより多い。）。

本発明は、小型の分子、ペプチド又はポリマー末端基などの調節部分にアプタマーを共役させることにより、又は、修飾されたヌクレオチドをアプタマーに組み込むことにより、制御された形式で、インビボで安定化アプタマー組成物の薬物動態及び生体内分布を調節するための材料及び方法を提供する。本明細書中に記載のように、修飾部分の共役及び／又はヌクレオチド化学組成を変化させることにより、循環中のアプタマー滞留時間及び組織への分布の基本的な面が変化する。

ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、腎臓濾過を介してオリゴヌクレオチド治療薬が排出される。このようなものとして、ヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドが静脈内投与されることにより、通常、濾過がブロックされ得ない限り、インビボの半減期が＜１０分となる。血流から組織への急速な分布を促進するか、又は糸球体に対する有効サイズカットオフを上回るようにオリゴヌクレオチドの見かけの分子量を高くすることにより、これを達成することができる。下記の、ＰＥＧポリマーへの小型の治療薬の共役（ＰＥＧ付加）により、循環中のアプタマーの滞留時間が劇的に長くなり、これにより、投与頻度が少なくなり、血管標的に対する有効性が促進される。

高分子量ポリマー、例えばＰＥＧ；ペプチド、例えばＴａｔ（ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質の１３−アミノ酸断片（Ｖｉｖｅｓら（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（ショウジョウバエアンテナペディアホメオティックタンパク質の第三へリックス由来の１６−アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚら（２００１）、Ｖａｃｃｉｎｅ１９（１１−１２）：１３９７−４０５））及びＡｒｇ_７（ポリアルギニン（Ａｒｇ_７）から構成される、短い、正電荷を有する細胞浸透性ペプチド（Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２０００）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ、Ｊら（２００２）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８））;及び小型の分子、例えばコレステロールなどの親油性化合物など、様々な修飾部分とアプタマーを共役させることができる。本明細書中に記載の様々な共役物の中でも、ＰＥＧ基との複合体形成により、アプタマーのインビボ特性が最も顕著に変化する。例えば、混合２’Ｆ及び２’−ＯＭｅ修飾アプタマー治療薬と２０ｋＤａ ＰＥＧポリマーとの複合体形成により、腎濾過が妨げられ、健常及び炎症組織の両方に対するアプタマー分布が促進される。さらに、２０ｋＤａ ＰＥＧポリマー−アプタマー共役物により、アプタマーの腎濾過を妨害することにおいて、４０ｋＤａＰＥＧポリマーとほぼ同程度の効果が得られる。ＰＥＧ付加の影響の１つがアプタマークリアランスにおけるものである一方、２０ｋＤａ部分の存在により可能となる全身曝露の延長によってまた、組織、特によく灌流された器官及び炎症部位でのアプタマーの分布も促進される。アプタマー−２０ｋＤａ ＰＥＧポリマー共役物は、ＰＥＧ付加アプタマーが炎症組織に選択的に蓄積するように、炎症部位へのアプタマー分布を支配する。いくつかの例において、２０ｋＤａ ＰＥＧ付加アプタマー共役物は、例えば腎臓細胞などの細胞の内部へ到達することができる。

アプタマーの血漿クリアランスを調節するために、修飾されたヌクレオチドを使用することもできる。例えば、２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅ安定化の化学的性質の両方を組み込む、共役していないアプタマー（インビトロ及びインビボでヌクレアーゼ安定性が高いため、現世代アプタマーの典型である。）は、非修飾アプタマーと比較した場合、血漿から急速に失われ（すなわち、急速な血漿クリアランス）、組織、主に腎臓に急速に分布する。

ＰＥＧ−誘導化核酸
上述のように、高分子量の非免疫原性ポリマーでの核酸の誘導化は、核酸の薬物動態及び薬力学特性を変化させ、その核酸をより効果的な治療薬とする可能性がある。活性における有利な変化には、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性の向上、腎臓を通じた濾過の低下、免疫系への曝露の減少及び身体を通じた治療薬の分布の変化が含まれ得る。

本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分により誘導化され得る。ＰＡＧ−誘導化核酸の例は、米国特許出願第１０／７１８，８３３号（２００３年１１月２１日出願）（その全体を参照により本明細書中に組み込む。）で見出される。本発明で使用される典型的なポリマーには、ポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）としても知られているポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）及びポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む。）が含まれる。さらに、多くの適用において、様々なアルキレンオキシド（例えば、エチレンオキシド及びプロピレンオキシド）のランダム又はブロックコポリマーを使用することができる。その最も一般的な形態において、ＰＥＧなどのポリアルキレングリコールは、各末端にヒドロキシル基が付加している線状ポリマーである：ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨ。このポリマー、α−、ω−ジヒドロキシルポリエチレングリコールを、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表すこともできる（式中、−ＰＥＧ−の印は、次の構造単位を表すと理解される：−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ｎは、通常、約４から約１０，０００の範囲である。））。

示されるように、ＰＥＧ分子は二官能性であり、「ＰＥＧジオール」と呼ばれることがある。ＰＥＧ分子の末端部分は比較的非反応性であるヒドロキシル部分、−ＯＨ基であり、他の化合物にその化合物の反応部位においてＰＥＧを付加するために、官能部分へと活性化又は変換することができる。このような活性化ＰＥＧジオールを本明細書中で二重活性化ＰＥＧと呼ぶ。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルからのスクシニミジル活性エステル部分で、比較的非反応性であるヒドロキシル部分、−ＯＨを置換することにより、アミノ部分との選択的反応のために、活性カーボネートエステルとして、ＰＥＧジオールの末端部分が官能化されている。

多くの適用において、ＰＥＧ分子が一官能性（又は一活性化）であるように、基本的に非反応性の部分で片方の末端においてＰＥＧ分子にキャップ付加することが望ましい。活性化ＰＥＧに対する多反応部位を一般に示すタンパク質治療薬の場合、二官能性の活性化ＰＥＧにより、機能的凝集性が乏しい、さらなる架橋が導かれる。一活性化ＰＥＧを生成させるために、ＰＥＧジオール分子の末端の１つのヒドロキシル部分を通常、非反応性メトキシ末端部分、−ＯＣＨ_３で置換する。ＰＥＧ分子の他方の非キャップ付加末端は通常、表面又はタンパク質などの分子における反応部位での結合のために活性化され得る反応性末端部分へと変換される。

ＰＡＧは、通常、水溶性及び多くの有機溶媒中での可溶性の特性を有し、毒性がなく、免疫原性がないポリマーである。ＰＡＧの使用の１つは、得られるＰＡＧ−分子を「共役」可溶性とするために、不溶性分子にこのポリマーを共有結合することである。例えば、水に不溶の薬パクリタキセルが、ＰＥＧとカップリングされた場合、水溶性になることが示されている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧ共役物は、溶解性及び安定性を促進するためだけでなく、分子の血液循環半減期を延長させるために使用されることが多い。

本発明のポリアルキル化化合物は通常、５から８０ｋＤａのサイズであるが、しかし、どのようなサイズも使用することができ、その選択は、アプタマー及び適用に依存する。本発明のその他のＰＡＧ化合物は、１０から８０ｋＤａのサイズである。さらに他の本発明のＰＡＧ化合物は、１０から６０ｋＤａのサイズである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０又は８０ｋＤａのサイズであり得る。このようなポリマーは、線状又は分枝状であり得る。ある実施形態において、このポリマーはＰＥＧである。ある実施形態において、このポリマーは分枝状のＰＥＧである。さらに他の実施形態において、図２で示されるように、このポリマーは４０ｋＤａの分枝状のＰＥＧである。ある実施形態において、図３で示されるように、４０ｋＤａの分枝状のＰＥＧはアプタマーの５’末端に結合されている。

生物学的に発現させたタンパク質治療薬に対して、核酸治療薬は通常、活性化単量体ヌクレオチドから化学合成される。同じ反復単量体合成を用いてＰＥＧを組み込むことにより、ＰＥＧ−核酸共役物を調製し得る。例えば、ホスホロアミダイト形態への変換により活性化されたＰＥＧを固相オリゴヌクレオチド合成に組み込むことができる。あるいは、反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的組み込みにより、オリゴヌクレオチド合成を完遂することができる。最も一般的には、５’−末端での遊離一級アミンの付加によってこれが行われてきた（固相合成の最終カップリング段階において修飾因子ホスホロアミダイトを用いて組み込まれる。）。このアプローチを用いて、反応性ＰＥＧ（例えば、それが反応し、アミンとの結合を形成するように活性化されるもの）を精製オリゴヌクレオチドと組み合わせ、溶液中でカップリング反応を行う。

ＰＥＧ共役物が治療薬の生体内分布を変化させる能力は、共役物の見かけのサイズ（例えば、流体力学半径に関して測定した場合）を含む多くの要因に関連する。大きな共役物（＞１０ｋＤａ）は、腎臓を介したろ過をより効率的にブロックし、結果として小さな高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を延長させることが知られている。ＰＥＧ共役物がろ過をブロックする能力が、ＰＥＧサイズに伴っておよそ５０ｋＤａまで大きくなることが示されている（半減期は、腎臓を介した排出ではなく、マクロファージを介した代謝により定められるようになるので、さらなる増加による有益な効果はわずかである。）。

高分子量ＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の生成は困難で、非効率的で、高価であり得る。高分子量ＰＥＧ−核酸共役物の合成に対する経路として、以前の研究は、より高分子量の活性化ＰＥＧの生成に焦点が当てられてきた。このような分子を生成させるためのある方法は、２以上のＰＥＧが活性化基を有する中央のコアに結合されている、分枝状の活性化ＰＥＧの形成を含む。化合物の反応部位において１以上のＰＥＧを他の化合物に結合させるために、これらのより高分子量のＰＥＧ分子の末端部分、すなわち比較的非反応性であるヒドロキシル（−ＯＨ）部分を活性化するか、又は官能部分に変換することができる。分枝状の活性化ＰＥＧは、２を超える末端を有し、２以上の末端が活性化されている場合、このような活性化されたより高分子量のＰＥＧ分子を、本明細書中で、「多活性化ＰＥＧ」と呼ぶ。あるケースにおいて、分枝状ＰＥＧ分枝の全ての末端が活性化されるわけではない。分枝状ＰＥＧ分子の何れか２つの末端が活性化される場合、このようなＰＥＧ分子を二活性化ＰＥＧと呼ぶ。分枝状ＰＥＧ分枝の１つの末端のみが活性化される場合、このようなＰＥＧ分枝を一活性化と呼ぶ。このアプローチの例として、リジンコア（反応のために続いて活性化される。）への２つのモノメトキシＰＥＧの連結により調製される活性化ＰＥＧが記載されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．２：２１４−２２１、２００３）。

本発明は、多重ＰＥＧ付加核酸を含む高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくはアプタマー）共役物の合成に対する、別の費用効果のある経路を提供する。本発明はまた、ＰＥＧ−連結多量体オリゴヌクレオチド、例えば二量体アプタマーも包含する。本発明はまた、ＰＥＧ安定化部分がアプタマーの異なる部分を分けるリンカーである、高分子量組成物にも関し、例えば、高分子量アプタマー組成物の直線的配置が例えば核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）_ｎ（ｎは１以上である。）となるように、このＰＥＧは１つのアプタマー配列内で共役されている。

本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものを含む。組成物は通常、１０から８０ｋＤａのサイズの分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０又は８０ｋＤａのサイズである。

安定化部分は、分子又は分子の一部であり、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態及び薬力学特性を向上させる。あるケースにおいて、安定化部分は、２以上のアプタマー又はアプタマードメインを近接させるか、又は本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転自由を低下させる、分子又は分子の一部である。安定化部分は、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコールであり得、これは、線状又は分枝状、ホモポリマー又はヘテロポリマーであり得る。その他の安定化部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのポリマーを含む。オリゴヌクレオチドもまた安定化部分になり得；このようなオリゴヌクレオチドには、修飾ヌクレオチド及び／又は修飾連結（ホスホチオエートなど）が含まれ得る。安定化部分は、アプタマー組成物の不可欠な部分であり得、すなわち、これはアプタマーに共有結合する。

本発明の組成物は、２以上の核酸部分が少なくとも１つのポリアルキレングリコール部分に共有結合で共役されている高分子量アプタマー組成物を含む。ポリアルキレングリコール部分は、安定化部分として働く。ポリアルキレングリコールが１つの分子において一緒に核酸部分と連結するようにポリアルキレングリコール部分がアプタマーの何れかの末端に共有結合されている組成物において、ポリアルキレングリコールは連結部分と呼ばれる。このような組成物において、共有分子の一次構造には、線状配列、核酸−ＰＡＧ−核酸が含まれる。ある１つの例は、一次構造、核酸−ＰＥＧ−核酸を有する組成物である。別の例は、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧの線状配列である。

核酸−ＰＥＧ−核酸共役物を生成させるために、核酸が１個の反応部位を有するように（例えば、これはモノ活性化である。）、最初は核酸を合成する。好ましい実施形態において、この反応部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成の最終段階として修飾ホスホロアミダイトの付加により５’−末端に導入されるアミノ基である。脱保護及び修飾オリゴヌクレオチドの精製に次いで、活性化ＰＥＧの自然な加水分解を最小限にする溶液中で高濃度でこれを再構成する。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再構成溶液は、２００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３緩衝液、ｐＨ８．３を含有する。共役物の合成は、ゆっくりと段階的に高精製度の二官能性ＰＥＧを添加することにより開始する。好ましい実施形態において、プロピオン酸スクシニミジルを用いた誘導化により、両末端でＰＥＧジオールを活性化する（二活性化）。反応後、完全、部分的及び非共役物を分離するために、ゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーでＰＥＧ−核酸共役物を精製する。様々な長さ（又は分子量）を得るために、鎖状に連結された複数のＰＡＧ分子（例えば、ランダム又はブロックコポリマーとして）又はより小さいＰＡＧ鎖を連結することができる。様々な長さのＰＡＧ鎖の間で非−ＰＡＧリンカーを使用することができる。

２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ及びその他の修飾ヌクレオチド修飾により、ヌクレアーゼに対してアプタマーが安定化され、インビボでのその半減期が延長される。３’−３’−ｄＴキャップによってもまた、エキソヌクレアーゼ耐性を向上させることができる。例えば、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号；及び同第６，２２９，００２号（これらをそれぞれ、その全体において、参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。

反応性核酸のＰＡＧ−誘導化
複数の反応部位を含有する核酸とのモノ官能性活性化ＰＥＧの反応により、高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ共役物を調製することができる。ある実施形態において、この核酸は、二反応性又は二活性化であり、従来のホスホロアミダイト合成（例えば、図４で述べられるような、３’−５’−ジ−ＰＥＧ付加）を通じてオリゴヌクレオチドに導入される２個の反応性部位：５’−アミノ基及び３’−アミノ基を含有する。代替的な実施形態において、例えば、１級アミンの結合のための部位として、ピリミジンの５位、プリンの８位又はリボースの２’位を用いて、内部の位置に反応性部位を導入することができる。このような実施形態において、核酸は、いくつかの活性化又は反応性部位を有し得、多活性化と呼ばれる。合成及び精製後、自然の加水分解を最小限に抑えながら、オリゴヌクレオチド反応性部位との選択的反応を促進する条件下で、モノ活性化ＰＥＧと修飾オリゴヌクレオチドを組み合わせる。好ましい実施形態において、プロピオン酸スクシニミジルでモノメトキシ−ＰＥＧを活性化し、ｐＨ８．３で共役反応を行う。二置換ＰＥＧの合成を動かすために、化学量論的過剰のＰＥＧをオリゴヌクレオチドに対して与える。反応後、完全、部分的及び非共役物を分離するために、ゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーによりＰＥＧ−核酸共役物を精製する。

連結ドメインは、これに結合された１以上のポリアルキレングリコール部分も有し得る。このようなＰＡＧは様々な長さであり得、組成物の所望の分子量を得るために、適切な組み合わせで使用され得る。

特定のリンカーの効果は、その化学組成及び長さの両方により影響され得る。長すぎる、短すぎる又は、トロンビンとの好ましくない立体及び／又はイオン性相互作用を形成するリンカーは、アプタマーとトロンビンとの間の複合体形成を妨げる。核酸間の距離に及ぶのに必要なものより長いリンカーは、リガンドの有効濃度を低下させることにより結合安定性を低下させ得る。このように、標的へのアプタマーの親和性を最大にするためにリンカー組成及び長さを最適化することが必要であることが多い。

本明細書中で引用される全ての刊行物及び特許文献は、このような各公表物及び文献が具体的かつ個々に参照により本明細書中に組み込まれることが示されるように、参照により本明細書中に組み込まれる。刊行物及び特許文書の引用は、何れも適切な先行技術であることの認可として意図されず、また、これらの内容又は日付に関してのいかなる認可も構成しない。本発明を明細書によりここで述べてきたが、当業者は、様々な実施形態において本発明を実施し得ること及び、前述の記載及び以下の実施例は説明目的であり、続く特許請求の範囲を限定するものでないことを認めるであろう。

（実施例１）
アプタマー選択及び配列
このプログラムの全般的な目的は、トロンビン活性を低下させるか阻害することにより強力な抗凝固剤として作用するアプタマーを発見することである。具体的には、強力なアプタマー抗−凝固剤は、トロンビンのフィブリノーゲン結合エキソサイト１に結合し、したがって、酵素への結合に対して基質（フィブリノーゲン）と競合する。

次の配列５’ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ３’（配列番号４）（ＡＲＣ１８３）を有する、既に同定されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマーと関連する、急速排出の薬力学特性を維持するために、単純なＤＮＡ組成物を用いてアプタマー選択を行った。アプタマープールからの非中和エキソサイト２を効率的にブロックするために、ヘパリンの１０−１００倍のモル濃度過剰量の添加を用いた複合体のニトロセルロースフィルター捕捉を使用して、高親和性エキソサイト１結合物質を発見した。さらに、プロトロンビン結合アプタマーを除去するように設計された最初の段階でのプロトロンビンアプタマー複合体の捕捉及び放棄及びプロトロンビン及びヒルジン／トロンビン複合体の混合物とアプタマープールとの接触、それに次ぐプロトロンビン／アプタマー及びトロンビン／ヒルジン／アプタマー複合体の捕捉及び放棄を含む、その他のストラテジーが発明者らのＳＥＬＥＸスキームに入った。トロンビン／ヒルジン複合体を含むことは、ヘパリン競合がそれだけでは効果的でない場合に、望ましくない非阻害結合物質をプールから捕捉し除去するためにエキソサイト２を効率的に提示することを目的とした。究極的に、これらの選択ストラテジーは、インビトロ及びインビボでトロンビンの活性をまた低下させるか又は阻害する、トロンビンに対する高親和性を有する一連のアプタマーの生成へとつながる。

（実施例１Ａ）：トロンビンＤＮＡ選択＃１
デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）からなるヌクレオチドプールを用いて、ヒトトロンビンに結合するアプタマーを同定するために、ニトロセルロースフィルターカラムを用いた選択を行い、これにより、ヒトトロンビンに対する高親和性アプタマーを得た。

プールの調製
ＡＢＩ−ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）、ＤＮＡ合成装置を用いて、配列：

を有するＤＮＡ鋳型を合成し、標準的方法により脱保護した。このＤＮＡ鋳型の一連のＮ’はヌクレオチドの何らかの組み合わせであり得、得られるアプタマーのユニークな配列領域を生じさせる。標準的条件下で次のプライマーを用いてこの鋳型をＰＣＲ増幅した。

増幅後、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿処理し、次いで、アルカリ加水分解に供し（３３３ｍＭ ＮａＯＨ、９０℃、１５分）、次にＨＣｌで中和し、精製前にホルムアミドローディング緩衝液を添加した。１０％変性ポリアクリルアミドゲルで鎖を分離し、より大きい移動度で移動する１本鎖ＤＮＡプールをゲルから切り出し、受動的に溶出し、イソプロパノールで沈殿させた。得られたプール配列は、ＡＲＣ１４８８の切断された逆相補体であり、５０ｎｔの長さであり、次の配列を有する。

選択
ヒトトロンビンに対して全部で１２回の選択を行った。ラウンド１で、１ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）３ｍＬ、ＡＲＣ１５３８ ＤＮＡプール２ｘ１０^１４分子及びトロンビン９００ピコモル（３００ｎＭ最終濃度）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ、ＩＮ）からなる結合反応液を調製した。この結合反応液を室温にて２時間インキュベートした。インキュベート中、Ｃｅｎｔｒｅｘニトロセルロースフィルターカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を選択のために準備した。０．５Ｍ ＫＯＨ １ｍＬで１５分間、各カラムを処理した。処理後、遠心（２０００ｒｐｍ、１分間）によりこのＫＯＨを除去し、カラムをｄｄＨ_２Ｏ１ｍＬでさらに１５分間処理した。次に、遠心（２０００ｒｐｍ、１分間）によりｄｄＨ_２Ｏを除去した。準備したフィルターカラムに選択結合反応液を添加し、遠心（２０００ｒｐｍ、１分間）により回転させて通した。次にこのカラムを１ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）１ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で洗浄し、回転させて通した。洗浄後、９０℃に予め加熱した溶出緩衝液（７Ｍ尿素、３００ｍＭ ＮａＯＡｃ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）１ｍＬでこのカラムを３分間溶出し、次に遠心（２０００ｒｐｍ、１分間）により回転させて通し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに回収した。次に、イソプロパノール１体積及びグリコーゲン１μＬを用いて溶出物を沈殿させた。

ラウンド１後の、続く全てのラウンドに対して、プールから非特異的フィルター結合物質を除去するために、ポジティブ選択の前にネガティブ選択カラムを導入した。上記で概説するようにしてネガティブ選択カラムを準備した。１ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）２００μＬ及び選択の前ラウンドからのプールの６０ｐｍｏｌｅをネガティブ選択カラムに通して、既に述べた結合反応段階に進む前に回収した。選択圧を増すために続くラウンドにおいて競合物ｔＲＮＡも添加し、エキソサイト２に結合し、アプタマーがトロンビンのエキソサイト２に結合するのを防ぐために、後のラウンドにおいてポジティブ選択段階にヘパリンを添加した。使用した選択条件は下記表１で概説する。

ＡＲＣ１５３８ＤＮＡプールの増幅には、５’−末端におけるリン酸化反応及び、それに続くその配列の５’−末端（すなわち、オリジナルのＡＲＣ１４８８合成ＤＮＡ配列の増幅のために使用される３’−プライマー）への定常領域の特異的ライゲーションと、その後の標準的ＰＣＲ増幅が必要である。このように、沈殿後、選択されたプールをｄｄＨ_２Ｏ ９μＬ及び２ｘキナーゼ適合緩衝液（１Ｍ ＤＴＴ ８μＬ＋２ｘＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）１ｍＬ）１０μＬ中で再び再懸濁し、Ｔ４ＰＮＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）１μＬを反応液に添加し、３７℃にて２０分間インキュベートした。インキュベート後、３’プライマー５’−ＴＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＴＧＴＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡｒＡ−３’（ＡＲＣ１４９０）（配列番号７）１００ｐｍｏｌｅ及び３’ライゲーションプライマー５’−ＧＧＧＡＴＴＴＡＧＣＴＴＣＣ［３Ｔ］−３’（ＡＲＣ１４９１）（配列番号１９２）１００ｐｍｏｌｅをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）１μＬとともに添加し、室温にて１０分間インキュベートした。５’プライマー５’−ＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣ−３’（ＡＲＣ１４８９）及び３’プライマー（ＡＲＣ１４９０）の両方を含有するＰＣＲ混合液中で反応液を２００μＬにした。次の条件を用いてＰＣＲ反応を繰り返した：９４℃にて１分間変性、９４℃にて３０秒、５４℃にて３０秒、７２℃にて１分間の反応を繰り返した。４％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて推定して、最終産物がおよそ１０ｎｇ／μＬになるまで、ＰＣＲを繰り返した（下記表１の一番右のカラムで「ＰＣＲ閾値」と呼ぶ。）。次に、さらなるＤＮＡ増幅のために、この産物をより大きなＰＣＲ反応に入れた（４００μＬの総ＰＣＲ体積に２０μＬを入れた。）。

増幅後、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、次いでアルカリ加水分解（３３３ｍＭ ＮａＯＨ、９０℃、１５分間）に供し、次いで、ＨＣｌで中和し、１０％ＰＡＧＥゲルでの精製前にホルムアミドローディング緩衝液を添加した。選択の次のラウンドに進む前に、精製した産物を受動的に溶出し、沈殿させ、定量した。

ラウンド７まで単一選択として選択を進め、ラウンド７では、選択を２つの枝に分けた（表１参照）。選択の一方の枝では、トロンビンタンパク質濃度を低下させることにより測定した場合、ストリンジェンシーが上昇し続けた。

選択の進行の監視
プールのタンパク質結合親和性を監視するために、選択を通してドットブロットアッセイを行った。ヒトトロンビンの希釈系列（１ｎＭから１０００ｎＭ）と微量^３２Ｐ標識ＲＮＡを組み合わせ、室温にて３０分間、１ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）＋０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（最終体積３０μＬ）中でインキュベートした。Ｍｉｎｉｆｏｌｄ Ｉドットブロット、９６ウェル真空ろ過マニホールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を用いて、ニトロセルロースろ過により結合反応を分析した。（上から下へ）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）及びＧＢ００２ゲルブロットペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）からなる３層のろ過媒体を使用した。タンパク質が結合したＲＮＡをニトロセルロースフィルター上で捕捉し、一方、非タンパク質結合ＲＮＡをナイロンフィルター上で捕捉する。ゲルブロットペーパーは、単純に他のフィルターのための支持媒体として含めた。ろ過後、フィルター層を分け、乾燥させ、蛍光体スクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で曝露し、Ｓｔｏｒｍ８６０Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ^（Ｒ）ブロットイメージングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて定量した。トロンビン非存在下に対してヒトトロンビン存在下でのＲＮＡの結合の顕著な陽性率が見られた場合、製造者の説明書に従い、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてそのプールをクローニングした。

ラウンド９及び１２ クローニング及び配列決定
プール結合に基づき、クローニング及び配列決定のために、ラウンド９及びラウンド１２プールを選択した。配列ファミリーによるスクリーニングの目的のために、本選択の両枝からのラウンド９及びラウンド１２プールを合わせた。全てのユニークなＤＮＡクローン配列を２５μｍｏｌｅ合成スケールで合成した。下記の実施例３Ａに記載のプロトロンビン時間（ＰＴアッセイ）を用いて、トロンビン活性を低下させるか阻害する能力について、ラウンド９からのクローンをスクリーニングした。ＰＴアッセイ結果を下記実施例３の表１７で報告する。ラウンド１２プールは、追跡すべき新しいユニークな配列リードがないことが示された。

合わせたラウンド９プールから得られたクローンの配列を下記表２で挙げる。各クローンに対するランダム領域は配列５’ＴＣＣＣの後始まり、ＧＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＡＴＣ３’（配列番号４２）の前で終わる。しかし、５’−ＴＣＣＣ配列はＰＣＲプライマーの一部ではないので、ＳＥＬＥＸ及び配列決定プロセス中にいくつかの突然変異が観察され得る。したがって、下記配列においてこの領域の点突然変異が観察され得る。別段の記載がない限り、下記で挙げる個々の配列は、５’から３’方向で表され、ＤＮＡ ＳＥＬＥ^ＴＭ条件下で選択され、ヌクレオチドの全てがデオキシである。

（実施例１Ｂ）：トロンビンＤＮＡ選択＃２及び＃３
１）ネガティブＳＥＬＥＸ段階でプロトロンビンを組み込むことにより、プロトロンビンよりもヒトトロンビンに対して高親和性を有するアプタマーを同定するために；及び２）ネガティブ選択段階にトロンビン／ヒルジン複合体を添加することにより、エキソサイト２結合に対して偏ったトロンビンアプタマーを同定するために、２つのさらなるニトロセルロースフィルターカラムを利用したＤＮＡ選択を行った。トロンビン／ヒルジン複合体は、効果的にエキソサイト１及びトロンビンの活性部位を塞ぎ、それにより、可能性のあるエキソサイト２結合物質が捕捉されプールから除去されるようになる。さらに、選択１でのように、エキソサイト２に結合し、アプタマーがトロンビンのエキソサイト２に結合するのを防ぐために、後のラウンドにおいてポジティブ選択段階にヘパリンを添加した。

プールの調製及び選択
新しい選択のために使用するＤＮＡプールは、上記実施例１Ａに記載のように調製した。ヒトトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ、ＩＮ）に対して全部で９ラウンドの選択を行った。ラウンド１において、結合反応液は、１ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）３ｍＬ、ＡＲＣ１５３８ ＤＮＡプール ２ｘ１０^１４分子及びトロンビン（３００ｎＭ最終濃度）９００ｐｍｏｌｅから構成された。室温にて２時間、この結合反応液をインキュベートした。インキュベート中、Ｃｅｎｔｒｅｘ Ｆｉｌｔｅｒカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を選択のために準備した。０．５Ｍ ＫＯＨ １ｍＬで１５分間、各カラムを処理した。処理後、遠心（２０００ｒｐｍ、１分間）によりこのＫＯＨを除去し、カラムをｄｄＨ_２Ｏ １ｍＬでさらに１５分間処理した。次に、遠心によりｄｄＨ_２Ｏを除去した。準備したＣｅｎｔｒｅｘに選択結合反応液を添加し、回転させて通した（２０００ｒｐｍ、１分間）。次にこのカラムを１ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）１ｍＬで洗浄し、遠心（２０００ｒｐｍ、１分間）により回転させて通した。洗浄後、９０℃に加熱した溶出緩衝液（７Ｍ尿素、３００ｍＭ ＮａＯＡｃ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）１ｍＬでこのカラムを溶出し（この溶出緩衝液を３分間カラムに置き、その後２０００ｒｐｍで１分間遠心することによる。）、エッペンドルフチューブに回収した。次に、イソプロパノール１体積及びグリコーゲン１μＬを用いて溶出物を沈殿させた。

ラウンド１後の続く全てのラウンドに対して、プールから非特異的フィルター結合物質を除去するために、ポジティブ選択の前にネガティブ選択カラムを付加した。上記で概説するようにしてこのカラムを準備し、ＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）２００μＬ及び前ラウンドからのプール６０ｐｍｏｌｅの混合物をろ過し、結合反応に進む前に回収した。選択圧を増すために続くラウンドにおいて競合物ｔＲＮＡも添加し、エキソサイト２に結合し、アプタマーがトロンビンのエキソサイト２に結合するのを防ぐために、後のラウンドにおいてポジティブ選択段階にヘパリンを添加した。使用した選択条件は下記表３で概説する。上記実施例１ＡのＳＥＬＥＸに対して述べたようにして、選択されたプールを増幅し、精製した。

ラウンド３まで単一選択として選択を進め、ラウンド３では、選択を２つの枝に分けた（表３参照）。選択の一方の枝（選択２）は、各ラウンドのネガティブ選択段階においてヒトプロトロンビン３００ｎＭを使用して前のように続けた。他方の枝（選択３）は、ネガティブ選択段階においてプロトロンビン（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）１５０ｎＭ、及びトロンビン及びヒルジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）複合体１５０ｎＭを用いて続けた。

選択の進行の監視
プールのタンパク質結合親和性を監視するために、選択を通じてドットブロットアッセイを行った。ヒトトロンビンの希釈系列（１ｎＭから１０００ｎＭ）と微量^３２Ｐ標識ＲＮＡを組み合わせ、室温にて３０分間、１ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）＋０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（最終体積３０μＬ）中でインキュベートした。Ｍｉｎｉｆｏｌｄ Ｉドットブロット、９６ウェル真空ろ過マニホールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を用いて、ニトロセルロースろ過により結合反応を分析した。（上から下へ）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ ナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）及びＧＢ００２ゲルブロットペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）からなる３層のろ過媒体を使用した。タンパク質が結合したＲＮＡをニトロセルロースフィルター上で捕捉し、一方、非タンパク質結合ＲＮＡをナイロンフィルター上で捕捉する。ゲルブロットペーパーは、単純に他のフィルターのための支持媒体として含めた。ろ過後、フィルター層を分け、乾燥させ、蛍光体スクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で曝露し、Ｓｔｏｒｍ８６２Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ^（Ｒ）ブロットイメージングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて定量した。

トロンビン非存在下に対してヒトトロンビン存在下でのＲＮＡの結合の顕著な陽性率が見られた場合、製造者の説明書に従い、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてそのプールをクローニングした。

ＤＮＡ選択＃２及び＃３からのラウンド７：配列決定及びクローンスクリーニング
上述のように選択を通じて監視したプール結合に基づき、選択＃２及び３の両方からのラウンド７プールをクローニングし、配列決定し、サンドイッチフィルター結合アッセイを用いてトロンビンへの結合能についてスクリーニングした。ＤＮＡクローンは、２５マイクロモルの合成スケールでＩＤＴにより受託合成した。１−ポイントドットブロットスクリーニングにおいてアッセイするために、両選択からのラウンド７プールから得られた６６種類の合わせた配列のうち、２０種類のユニークな配列を選択した。γ^−３２Ｐ ＡＴＰでクローン転写産物を５’末端標識し、過剰な標識を除去するためにＣｅｎｔｒｉｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ）を用いてスピン精製した。３０μＬ １ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の総体積中で微量の標識クローンを±１０ｎＭトロンビン及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡとともに３０分間インキュベートした。インキュベート後、実施例１Ａで既に述べたドットブロット結合アッセイ装置に結合反応液を添加した。選択クローンにおけるＫ_Ｄを調べるために、クローン転写産物をγ^−３２Ｐ ＡＴＰで５’末端標識した。ドットブロット結合アッセイにおいてヒトトロンビン（トロンビンに対する具体的なクローンの親和性に依存して１ｐＭから１０００ｎＭの範囲）の希釈系列を用い、得られたデータを１：１ ＲＮＡ：タンパク質複合体を述べる式に当てはめて、Ｋ_Ｄ値を決定した（アプタマー結合分画＝振幅（［トロンビン］／（Ｋ_Ｄ＋［トロンビン］）（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３．５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）。）。

ラウンド７から得られた配列を下記表４で挙げる。各クローンに対する対応する結合特性は下記表５で表にする。下記表４で挙げる配列のそれぞれに対して、各クローンに対するランダム領域は配列５’ＴＣＣＣの後始まり、ＧＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＡＴＣ３’（配列番号４２）の前で終わる。別段の記載がない限り、下記で挙げる個々の配列は、５’から３’方向で表され、ＤＮＡ ＳＥＬＥ^ＴＭ条件下で選択され、ヌクレオチドの全てがデオキシである。

ＤＮＡ選択＃２及び＃３からのラウンド９：配列決定及びクローンスクリーニング
上述のように選択を通じて監視したプール結合に基づき、選択＃２及び＃３の両方からのラウンド９プールも、製造者の説明書に従い、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてクローニングし、配列決定を行った。トロンビンへの選択的結合に対する試験を行うためのトロンビン及びプロトロンビンに対する１−ポイントドットブロットスクリーニングにおいてアッセイするために、両選択のラウンド９から得られた１３６種類の配列のうち、１３０種類のユニークな配列を選択した。クローンは、２５マイクロモルの合成スケールでＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）に委託した。γ^−３２Ｐ ＡＴＰでクローン転写産物を５’末端標識し、過剰な標識を除去するためにＣｅｎｔｒｉｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ）を用いてスピン精製した。３０μＬ １ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の総体積中で微量の標識クローンを±１０ｎＭトロンビン（又は±５０ｎＭプロトロンビン）及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡとともに３０分間インキュベートした。インキュベート後、既に述べたドットブロット結合アッセイ装置に結合反応液を添加した。選択クローンにおけるＫ_Ｄを調べるために、クローン転写産物をγ^−３２Ｐ ＡＴＰで５’末端標識した。ドットブロット結合アッセイにおいてヒトトロンビン（トロンビンに対する具体的なクローンの親和性に依存して１ｐＭから１０００ｎＭの範囲）の希釈系列を用いて、得られたデータを１：１ ＲＮＡ：タンパク質複合体で述べられる式に当てはめることにより、Ｋ_Ｄ値を調べた（アプタマー結合分画＝振幅^＊（［トロンビン］／（Ｋ_Ｄ＋［トロンビン］）（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３.５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）。）。

ＤＮＡ選択＃２及び＃３のラウンド９から得られた配列を下記表６に挙げる。各クローンに対する対応する結合特性は下記表７で表にする。表６で下記に挙げる配列のそれぞれに対して、各クローンに対するランダム領域は配列５’ＴＣＣＣの後始まり、ＧＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＡＴＣ３’（配列番号４２）の前で終わる。別段の記載がない限り、下記で挙げる個々の配列は、５’から３’方向で表され、ＤＮＡ ＳＥＬＥＸ^ＴＭ条件下で選択され、ヌクレオチドの全てがデオキシである。

（実施例２）
組成物及び配列最適化及び配列
（実施例２Ａ）：ＤＮＡ選択＃２及び＃３トロンビンアプタマーの最小化
ラウンド７ＤＮＡ選択＃２及び＃３からのクローンの最小化
ＲＮＡフォールディングプログラム（ＲＮＡＳｓｔｒｕｃｔｕｒｅ^（ｃ）（１９９６−２００４）Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚｕｋｅｒ＆Ｄｏｕｇｌａｓ Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ）を使用して、上述の実施例１ＢのようにＫ_Ｄが決定されたラウンド７クローンに対する推定二次フォールディングを決定した。高親和性クローンは、関連配列由来であり、クローンＡＭＸ（３９５）＿Ｃ１（配列番号４９）のフォールディングに基づいており、最小化アプタマー配列を設計し、合成した。実施例１Ａで既に述べたドットブロット結合アッセイにおいて、ヒトトロンビンの希釈系列（トロンビンに対する具体的なクローンの親和性に依存して１ｐＭから１０００ｎＭの範囲）を用い、得られたデータを１：１ ＲＮＡ：タンパク質複合体を述べる式に当てはめることにより、各最小化コンストラクトのＫ_Ｄ値を決定した（アプタマー結合分画＝振幅^＊（［トロンビン］／（Ｋ_Ｄ＋［トロンビン］）（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖ．３.５１、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）。）。親アプタマーＡＭＸ（３９５）＿Ｃ１（配列番号４９）に基づく最小化コンストラクトの配列及び対応するＫ_Ｄを下記表８で挙げる。示されるように、ＡＲＣ１９８５、最小化中に同定された、得られた２７マーは、ＤＮＡ選択＃２及び＃３のラウンド７から同定され最小化された全クローンのうち、トロンビンに対する結合親和性が最大であった。

下記表８で述べる最小化ＤＮＡアプタマーに対して、全ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）はデオキシである。別段の記載がない限り、個々の配列は、５’から３’方向で表す。

ラウンド９ＤＮＡ選択＃２及び＃３からのクローンの最小化
実施例１Ａで上記で述べたドットブロット結合アッセイにおいて最大結合親和性を示した、ならびに、下記実施例３Ａで述べるＰＴアッセイにおいて最大抗凝固能を示した、ＤＮＡ選択＃２及び＃３のラウンド９で同定されたクローンから、上述のように最小化コンストラクトを設計した。最小化コンストラクト及び各コンストラクトに対する関連する親アプタマーの配列を下記表９に記載する。下記実施例３Ａで述べるＰＴアッセイにおいて、各最小化コンストラクトの機能活性を関連親アプタマーと比較した。設計した短縮型コンストラクトのうち、ＡＲＣ２０９１（配列番号１９７）は、ＰＴアッセイにおいて親クローンに匹敵する効力を示した（下記実施例３Ａ参照）。ＡＲＣ２０９１（配列番号１９７）は、ＤＮＡ選択＃２及び＃３のラウンド９から同定され、最小化された全クローンのうち、最大の機能活性を示し、下記実施例２Ｂに記載のドープ再選択に対する基礎となった。

下記表９に記載の最小化ＤＮＡアプタマーに対して、全ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）はデオキシである。別段の記載がない限り、個々の配列は、５’から３’方向で表す。

（実施例２Ｂ）：ＡＲＣ２０９１ドープ再選択
トロンビンに対してより親和性が高い結合物質を同定するために、最小化ヒトトロンビン結合配列ＡＲＣ２０９１（配列番号１９７）（実施例２Ａに記載）に基づく、ドーププールを用いて選択を行った。活性クローン又はミニマー内で配列条件を探索するために、ドープ再選択が使用される。１つの配列に基づき設計されている合成の縮重プールを用いて選択を行う。縮重のレベルは、通常、７０％から８５％野生型ヌクレオチドまで様々である。一般には、中立突然変異が観察されるが、ある場合では、配列変化の結果、親和性が向上し得る。次に、最小の結合モチーフを同定し、最適化を促進するために、合成配列情報を使用することができる。

プールの調製：
ＡＢＩ−ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を用いて、配列：

を有するＤＮＡ鋳型を合成し、標準的方法により脱保護した。太字のヌクレオチドは、指示される残基である可能性が８５％であり、その他の３ヌクレオチドの１つである可能性が５％である。

を用いてこの鋳型を増幅した。増幅後、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、次いでアルカリ加水分解に供し（３３３ｍＭ ＮａＯＨ、９０℃、１５分）、次いでＨＣｌで中和し、１０％ＰＡＧＥゲルでの精製前にホルムアミドローディング緩衝液を添加した。

選択
トロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ、ＩＮ）に対して、ドープ再選択に基づくニトロセルロースカラムを全３ラウンド行った。実施例１Ａで既に述べたようにしてＣｅｎｔｒｅｘカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎ、ＮＨ）を準備した。次のように、プールからの非特異的フィルター結合物質を除去するために、ラウンド１での開始にネガティブ選択段階を含めた。各ラウンドに対して、実施例１で既に述べたようにネガティブフィルターを準備し、１ｘＤＰＢＳ（５００ｎＭプール濃度）２００μＬ中のＡＲＣ２０８２ １００ｐｍｏｌｅを回転させて通し、回収した。ネガティブ選択段階後、トロンビン（１００ｎＭ最終濃度）２０ｐｍｏｌｅ、競合物質tＲＮＡ ０．１ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬ ヘパリンをろ過したプールに添加し、室温にて１時間インキュベートした。選択圧を増すために競合物ｔＲＮＡを添加し、エキソサイト２に結合し、アプタマーがトロンビンのエキソサイト２に結合するのを防ぐために、ポジティブ選択段階にヘパリンを添加した。

各ラウンドに対する選択条件は下記表１０で概説する。各ラウンドに対して、準備したＣｅｎｔｒｅｘに選択結合反応液を添加し、回転させて通した（２０００ｒｐｍで１分間）。次に、カラムを１ｘＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋）１ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で洗浄し、遠心により回転させて通した（２０００ｒｐｍで１分間）。洗浄後、９０℃に加熱した溶出緩衝液（７Ｍ尿素、３００ｍＭ ＮａＯＡｃ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）１ｍＬでこのカラムを溶出し（この溶出緩衝液を３分間カラムに置き、その後２０００ｒｐｍで１分間遠心することによる。）、エッペンドルフチューブに回収した。イソプロパノール１体積及びグリコーゲン１μＬを用いて溶出物を沈殿させた。

を含有するＰＣＲ混合液中で２００μＬに反応液をメスアップした。次の条件を用いてＰＣＲ反応を繰り返した：９４℃にて１分間変性、９４℃にて３０秒、５４℃にて３０秒、７２℃にて１分間を繰り返し；４％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により測定して最終産物がおよそ１０ｎｇ／μＬになるまで、ＰＣＲを繰り返した（下記表１０の一番右のカラムで「ＰＣＲ閾値」と呼ぶ。）。次に、さらなる増幅のために、この産物をより大きなＰＣＲ反応に入れた（４００μＬの総ＰＣＲ体積に２０μＬを入れた。）。増幅後、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、次いでアルカリ加水分解（３３３ｍＭ ＮａＯＨ、９０℃、１５分間）に供し、次いで、ＨＣｌで中和し、１０％ＰＡＧＥゲルでの精製前にホルムアミドローディング緩衝液を添加した。選択の次のラウンドに進む前に、精製産物を溶出し、濃縮し、定量した。既に述べたようにして続く沈殿及びゲル精製を行った。

配列決定及びスクリーニング
選択の３回のラウンド後、製造者の推奨に従い、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてドーププールをクローニングし、配列決定を行った。下記表１１で示されるように、全部で７５種類のユニークな配列が同定された。ドープ再選択の終了前に、ＡＲＣ２０９１（配列番号１９７）のトロンビン結合親和性全てを保持する、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）と呼ばれるＡＲＣ２０９１（配列番号１９７）の３０マーの誘導体を設計し、合成した。ドープ再選択からの配列には、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）の配列により定められるアプタマーに対するコア機能モチーフ内外の、両方の突然変異が含まれた。このコア外の突然変異体は廃棄し、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）配列との関連において、このコア内の突然変異体を試験した。このように、アプタマー機能における、さらなる最小化の影響及びドープ再選択から得られた最も有力な突然変異の影響を調べるために、ドープ再選択から得られたデータを用いて（表１２参照）、下記表１１で示される配列から、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）に基づくクローンのパネルを設計した。ＰＴアッセイを用いてアプタマー機能における突然変異の影響を測定し、下記実施例３で記載する。

下記表１１及び表１２で述べるＤＮＡアプタマーに対して、全ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）はデオキシである。別段の記載がない限り、個々の配列は、５’から３’方向で表す。

ＡＲＣ２０９１（配列番号１９７）及びドープ再選択データを用いて、下記表１３で示されるように、トロンビンに対する結合親和性に欠陥を生じさせずに、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）と呼ばれる２６ヌクレオチドアプタマーへのＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）のさらなる最小化を行った。下記表１３に記載のＤＮＡアプタマーに対して、全ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）はデオキシである。ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）、ＡＲＣ２１７１（配列番号２９３）及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）に対する推定二次構造（ＲＮＡＳｓｔｒｕｃｔｕｒｅ^（ｃ）（１９９６−２００４）Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚｕｋｅｒ＆Ｄｏｕｇｌａｓ Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ）を用いて）を図５で示す。別段の記載がない限り、個々の配列は５’から３’方向で表す。

実施例１Ａで既に述べたニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて、既に同定されているトロンビン結合ＤＮＡアプタマー、ＡＲＣ１８３と、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の結合親和性を比較した。図６で見ることができるように、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、ＡＲＣ１８３と比較して、トロンビンに対する親和性が顕著に向上している。

ニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて、ヒト、ブタ及びラットトロンビンに対する種の交差反応性についてもＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を試験した（それぞれ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ、ＩＮより。）。図７で示されるように、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、ヒトトロンビンに加えて、ブタ及びラットトロンビンに結合する。

（実施例２Ｃ）：最小化クローンＡＲＣ１９８５及びＡＲＣ２１６９の最適化
最小化の取り組み時にアプタマーのサイズが小さくなるにつれてＡＣＴアッセイ（実施例３Ｂ参照）により測定した場合のアプタマー機能が低下するという、わずかな全般的低下傾向が見られた。したがって、最初の最適化の取り組みには、推定のステム構造にさらなる塩基対又はポリ−Ｔテールを付加することにより分子を長くすることが含まれる。表１４で下記に配列が挙げられる次の分子は、ＡＲＣ１９８５（配列番号１９１）及びＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）の何れかを基とした：１から５個のさらなる塩基対が付加されたＡＲＣ２１７３−ＡＲＣ２１８４を設計し；５’又は３’末端の何れかに３個又は６個何れかの「Ｔ」付加が加えられたＡＲＣ２１８５−ＡＲＣ２１９６を設計し；ＡＲＣ２１８３及びＡＲＣ２１８４は、既に選択されている抗トロンビンアプタマー、ＡＲＣ１８３（配列番号４）と分子の本セットとの間の何らかの類似性を調べるために、ＡＲＣ１８３上へ、ＡＲＣ１９８５（ＡＲＣ２１８３に対する。）又はＡＲＣ２１６９（ＡＲＣ２１８４に対する）のステムエレメントを組み込んでいる、既に選択されている抗トロンビンアプタマー（ＡＲＣ１８３）（配列番号４）に基づくアプタマーである。下記実施例３Ｂに記載のＡＣＴアッセイにおいて、１ポイントスクリーニングを用いて（１０μＭアプタマー濃度）、機能性についてこれらの最適化アプタマーを試験した。

下記表１４に記載のＤＮＡアプタマーに対して、全ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）はデオキシである。別段の記載がない限り、個々の配列は５’から３’方向で表す。

さらなる最適化において、ベース分子としてＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）を用い、全ての塩基を個々に２’−ＯＭｅ又はホスホチオエート塩基の何れかで置き換えるために、１μｍｏｌｅで一連の誘導体を合成した。全てのｄＧ（デオキシグアノシン）塩基を個々に、ｄＩ（デオキシノシン）又はｍＩ（２’−ＯＭｅ）塩基で置換した。ＰＡＧＥゲルで各分子を精製し、実施例１で既に述べた条件下でドットブロット結合アッセイを用いてトロンビンへの結合についてアッセイした。これらのＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）誘導体の配列及び結合特性を下記表１５で挙げる。表１５で示される結合データに基づき、１個の置換ではトロンビンへの結合を大きく向上させないことが分かった。

下記表１５に記載のアプタマーに対して、「ｄ」はデオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は２’−ＯＭｅヌクレオチドを示し、「Ｉ」はイノシンを示し、「ｓ」はホスホチオエートヌクレオチド間結合を示す。別段の記載がない限り、個々の配列は５’から３’方向で表す。

（実施例２Ｄ）：ＡＲＣ２１６９、ＡＲＣ２１７０、ＡＲＣ２１７１及びＡＲＣ２１７２のフェーズ２
主にインビボでのリードアプタマーの活性の持続時間を調節するために、最適化のさらなるフェーズを行った（この化合物に対して、迅速なオン／迅速なオフプロファイルが望まれるので。）。この目的のために、ステム領域で２’−ＯＭｅ塩基が許容される一連のコンストラクトを設計した。塩基対形成を弱め、できるならば分子の安定性を低下させ、より素早く分解させるために、いくつかのＧ−Ｃ塩基対をＡ−Ｔ塩基対に変換するため、ステムも変化させた。２’−ＯＭｅ置換及びＧ−ＣからＡ−Ｔ塩基対変換の形態における突然変異について、親分子としてＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）、ＡＲＣ２１７０（配列番号２９２）、ＡＲＣ２１７１（配列番号２９３）及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を用いて下記で概説する。１μｍｏｌｅ合成スケールで各アプタマーを合成し、ＰＡＧＥ精製し、その後、実施例１で既に述べたドットブロットアッセイによりトロンビンへの結合についてアッセイした。

この一連の最適化コンストラクトに対する配列及び結合特性を下記表１６で挙げる。下記表１６に記載のアプタマーに対して、「ｄ」はデオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は２’−ＯＭｅヌクレオチドを示す。別段の記載がない限り、個々の配列は５’から３’方向で表す。

（実施例２Ｅ）：アプタマー−５’−ＰＥＧ共役物の合成
ステム延長を用いた上述の最初の最適化からの予備的結果に基づき、抗トロンビンアプタマー、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の小型の５’−ＰＥＧ共役物を調製した。この構想は、小さなＰＥＧが、インビボでの機能活性の持続時間を顕著に延長することなく、アプタマーの有効性を向上させ得るというものであった（この化合物に対して、迅速なオン／迅速なオフプロファイルが望まれるので。）。化学カップリングを促進するために最初にアプタマーの５’−アミン修飾型を合成することにより、アプタマーを調製し、推奨される製造者の手法に従い、標準的な市販のＤＮＡホスホロアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）及び次のように示される支持体を用いて（ＡＲＣ２３２７（配列番号４３９）及び２３３８（配列番号４３８）に対してＰｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ ２００ｄＧ（カタログ番号１７−５２６２−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）；ＡＲＣ２３２９（配列番号４４０）に対してｉＢｕ ＤＭＴデオキシグアノシン ＣＰＧ支持体（カタログ番号ＣＰＧ６０Ｎ１１ＤＧＶＮ、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ）、ＡＲＣ２３２３（配列番号４３７）に対してＤＭＴデオキシチミジンＣＰＧ支持体（カタログ番号ＣＰＧ６０Ｎ１１ＤＴＮ、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ））、ＡＫＴＡ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００合成装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）において、

を合成した。

５’−アミンＯ−修飾物質 ＴＦＡアミノＣ−６ ＣＥＤ Ｐｈｏｓｐｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）により末端アミン官能基を連結させた。脱保護した後、ＳｕｐｅｒＱ ５ＰＷ（３０）レジン（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）でのイオン交換クロマトグラフィー及びエタノール沈殿によりオリゴヌクレオチドを精製した。

合成後、５’−アミン修飾アプタマーのアリコートをＰＥＧ部分に共役させた（例えば、２、５及び１０ｋＤａ ＰＥＧ部分）。１．５から３ｍＭの間の濃度まで、水／ＤＭＳＯ（１：１）溶液中でアプタマーを溶解させた。１００ｍＭの最終濃度まで炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８.５を添加し、アセトニトリルの等体積中で溶解させた所望のＰＥＧ試薬（１０ｋＤａ Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＧＬ２−４００ＮＰ ｐ−ニトロフェニルカーボネートエステル（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ、Ｊａｐａｎ））の１．７−３倍モル過剰量とオリゴを一晩反応させた。得られたＰＥＧ付加産物をＳｕｐｅｒＱ ５ＰＷ（３０）レジン（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）上でイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ３００−Ｓレジン（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）上で行う逆相クロマトグラフィーを用いて脱塩し、凍結乾燥した。

得られたＰＥＧ付加アプタマー配列を下記で挙げる。これらのアプタマーをその５’アミン対応物とともに、ヒト全血中のアプタマーの様々な濃度でＡＣＴアッセイにおいて試験した（実施例３Ｂ参照）。

下記で挙げる各配列に対して、「ｄ」はデオキシヌクレオチドを示し（注意、下記に挙げる配列中の全てのヌクレオチドは、「Ｔ」（これは、「ｄＴ」としてではなく「Ｔ」として表される。）を含め、デオキシであり、「ＮＨ」は、化学カップリングを促進するためのヘキシルアミンを示す。

ＡＲＣ２３２３（配列番号４３７）（ＡＲＣ２１６９＋５’−アミン＋１０ｋＤａ ＰＥＧ）

（これは、次の構造を含有する：

（式中、アプタマー＝

））。

ＡＲＣ２３３８（配列番号４３８）（ＡＲＣ２１７２＋５’−アミン＋２ｋＤａ ＰＥＧ）

（これは、次の構造を含有する：

（式中、アプタマー＝

））。

ＡＲＣ２３２７（配列番号４３９）（ＡＲＣ２１７２＋５’−アミン＋５ｋＤａ ＰＥＧ）

（これは、次の構造を含有する：

（式中、アプタマー＝

））。

ＡＲＣ２３２９（配列番号４４０）（ＡＲＣ２１７２＋５’−アミン＋１０ｋＤａ ＰＥＧ）

（これは、次の構造を含有する：

（式中、アプタマー＝

））。

（実施例３）
インビトロ機能アッセイ
（実施例３Ａ）：プロトロンビンアッセイ
組織因子は、損傷部位で放出される、凝固の「外因系」経路の強力な誘導因子である。プロトロンビン時間（「ＰＴ」）は、血漿に対する過剰の組織因子の添加における凝固時間を評価するものであり、外因系第ＶＩＩ因子のレベル及び「共通系」経路第Ｉ（フィブリノーゲン）、第ＩＩ（プロトロンビン）、第Ｖ及び第Ｘ因子に対して最も感度が高い。トロンボプラスチンと呼ばれるＰＴ試薬は、リン脂質及びカルシウム（これらは、いくつかの凝固因子の活性化のために必要な補因子である。）と混合された組織因子からなる。因子欠失の診断とは別に、経口抗凝固剤ワーファリン（ビタミンＫアンタゴニスト）を監視するために、臨床ＰＴが最も一般的に使用される。ヘパリンの臨床での監視のためにＰＴは使用されないが、ＣＡＢＧに対して使用される高へパリン濃度に対して感度が高く、５Ｕ／ｍＬ以下の範囲である（例えば、１Ｕ／ｍＬヘパリンでのＰＴ時間は正常対照の１４２％である；データは示さない。）。

ＰＴアッセイは、Ｃｏａｇ−ａ−ｍａｔｅ凝固分析装置（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）、凍結乾燥トロンボプラスチン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、クエン酸ヒト血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）及び既知の濃度のアプタマーを利用する。試験トレイ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）中で、クエン酸血漿とともに、３７℃にて３分間、既知の濃度のアプタマーをプレインキュベートした。次に、トロンボプラスチン−Ｄ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ、ＶＡ）２００μＬ（ｄｄＨ_２Ｏ １０ｍＬ中で凍結乾燥形態から再懸濁）を用いて凝固を開始させ、Ｃｏａｇ−ａ−ｍａｔｅで試験試料を分析して凝固時間を調べた。試料をデュプリケートで採り、１つのＰＴ時間に対して平均した。阻害剤／アプタマー非存在下で〜１３秒の凝固時間を測定したが、これは、１２から１４秒の臨床「正常」対照範囲内である。３００秒の値が本装置により測定される最大値である。

記載のＰＴアッセイを用いて、トロンビン活性を低下させるか又は阻害する能力について、トロンビンＤＮＡ選択＃１（実施例１Ａ参照）のラウンド９から同定されたアプタマーをスクリーニングした。フィブリン重合体の形成を光学的に検出するためにＣｏａｇ−ａ−ｍａｔｅ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を用いて、クエン酸ヒト血漿にウサギトロンボプラスチン（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ、ＶＡ）を添加することにより、３又は１０マイクロモラーアプタマーの存在下でＰＴ値を測定した。ＤＮＡ選択＃１のラウンド９から同定されたトロンビン結合アプタマーの１０μＭに対するＰＴ値を下記表１７で挙げる。表１７で挙げるＰＴ値からバックグラウンド値が差し引かれていないことに注意。

上述のＰＴアッセイにおいて、１０μＭアプタマーを用いてトロンビン活性を低下させるか又は阻害する能力について、ＤＮＡ選択＃２及び＃３のラウンド７（実施例２Ａ参照）中に同定されたトロンビン結合アプタマーの最小化コンストラクトもスクリーニングした。最小化コンストラクトＡＲＣ１９８５に対するＰＴ値（バックグラウンドを含む。）を下記表１８で挙げる。

上述のＰＴアッセイにおいて、１０μＭアプタマーを用いてトロンビン活性を低下させるか又は阻害する能力について、トロンビンに対して高い結合親和性を示す、ＤＮＡ選択＃２及び＃３のラウンド９（実施例２Ａ参照）の間に同定された、選択されたトロンビン結合アプタマーもスクリーニングした。結果を下記表１９で示す。下記表１９の「Ｎ／Ａ」はＰＴ値を測定しなかったことを示すことに注意。

上述のＰＴアッセイにおいて、１０μＭアプタマーを用いてトロンビンを低下させるか又は阻害する能力について、ＤＮＡ選択＃２及び＃３のラウンド９（実施例２Ａ参照）の間に同定された、トロンビン特異性が高いアプタマーの最小化コンストラクトもスクリーニングした。最小化コンストラクトの由来である親アプタマーに対する、これらの最小化アプタマーのＰＴ値（バックグラウンドを含む。）の比較を下記表２０で挙げる。

上述のＰＴアッセイにおいて、トロンビン活性を低下させるか又は阻害する能力について、実施例２Ｂに記載のドープ再選択に基づいて設計した最小化コンストラクトもスクリーニングした。結果を下記表２１で示す。

上述のＰＴアッセイを用いて、ＡＲＣ１８３と比較した場合の、トロンビン活性を低下させるか又は阻害する能力についてＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）もスクリーニングした。図８で示されるように、同じモル濃度で、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）はＡＲＣ１８３よりも効力が高い。

（実施例３Ｂ）：活性凝固時間アッセイ
ＡＣＴは、内在の経路活性化因子の添加時の、非クエン酸全血における凝固時間を評価する。ＰＴＴよりもヘパリンに対して感度が低いので（例えば、１Ｕ／ｍＬヘパリンでのＡＣＴ時間が正常対照の１８１％である；データを示さない。）、ＣＡＢＧ中の高ヘパリン用量を監視するために、ＡＣＴはベッドサイド試験として一般に使用される。他の凝固試験とは異なり、ＡＣＴは標準化されず；このゆえに、ＡＣＴの結果は、使用する活性化因子及び検出方法のタイプによって様々である。この機器に対する、公表されている標的凝固時間は、バイパス手術でのヘパリン抗凝固に対して、＞４２０秒である（３から５Ｕ／ｍＬの濃度に相当する。）。

ＡＣＴ＋キュベット（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）を用いて、光学検出を利用する凝固分析装置（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ.、ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）において次の測定を行った。ＡＣＴアッセイを用いて、トロンビン活性を低下させるか又は阻害する能力について、トロンビンに対する高い結合親和性及び上述のＰＴアッセイにおいて優れたＰＴ値を示す、実施例１及び２に記載の選択アプタマーをスクリーニングした。簡潔に述べると、選択アプタマーの既知の濃度範囲（０−１０μＭ）（室温にて３０秒間、７μＬ体積で血液に添加した。）とともに新鮮な全血７０μＬをプレインキュベートした。直後に、２５ｍＭ ＣａＣｌ_２ ３０μＬを血液／アプタマー混合物に添加し、次いで、Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ．凝固分析装置（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ．、ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）で分析するために、３７℃に予め温めたＡＣＴ＋キュベット（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ．、ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）に試料を入れた。１２５から１５０秒の測定時間をＡＣＴアッセイに対するバックグラウンドとみなした。ＡＣＴアッセイにおける選択アプタマーの結果を下記表２２で示す。下記表２２で挙げるＡＣＴ値からバックグラウンド値が差し引かれていないことに注意すること。

上述のようにＡＣＴアッセイを用いてトロンビンＤＮＡアプタマー、ＡＲＣ１８３と比較した場合の、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）がトロンビン活性を低下させるか又は阻害する能力も測定した。図９で示されるように、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）では、＞４００秒の目標凝固時間に到達するのに必要とされる≧２μＭアプタマーで、ＡＣＴの濃度相関延長が起こった。２−１０μＭの濃度範囲にわたり、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、ＡＲＣ１８３よりも顕著に高い効力を示した。

上述のＡＣＴアッセイを用いて、１０μＭアプタマーでトロンビン活性を低下させるか又は阻害する能力について、実施例２Ｃの上述の最適化アプタマーもスクリーニングした。これらの結果を下記表２３で示す。

ＡＲＣ１８３の配列と対応するように、ＡＲＣ２１６９及びＡＲＣ１９８５のループ領域に突然変異を生じさせ、結果として、それぞれＡＲＣ２１８３及びＡＲＣ２１８４を得た。これらの分子は、下記表２３で見ることができるように、ＡＲＣ１８３よりも強くはなかった。

上述のＡＣＴアッセイにおいて、アプタマー（０−１０μＭ）の濃度範囲を用いて、上記実施例２Ｅに記載のＰＥＧ付加アプタマー及びその５’−アミン共役中間体のＡＣＴ値も測定した。結果を下記表２４で示す。

（実施例３Ｃ）：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）
負電荷を有する面を有する接触面（例えば、ガラス、シリカ、コラーゲン）は、「内因系」凝固経路を活性化する。ａＰＴＴは、負電荷を有する活性化因子を血漿に添加した時の凝固時間を評価し、第ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン及び共通系の経路成分に感受性がある。ａＰＴＴ試薬は、活性化因子に加えてリン脂質（部分トロンボプラスチン）を含有しており、クエン酸血漿とともにプレインキュベートした後（活性化段階）、ＣａＣｌ_２を添加することにより、凝固が開始される。ヘパリン（抗トロンビンと複合して）は、内在の経路及び共通経路の両方でいくつかの因子を標的とするので、ａＰＴＴは、ＰＴよりもヘパリンに対してかなり感度が高く（例えば、１Ｕ／ｍＬ ヘパリンでのａＰＴＴ時間は正常対照の＞１００％である；データは示さない。）、低用量での治療用ヘパリンを監視するために使用することができる。

凝固を開始させるために２０ｍＭ ＣａＣｌ_２ １００μＬの添加前にＰＴＴ−ＬＳ試薬（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ、ＶＡ）１００μＬを用いて血漿／阻害剤混合物を３分間活性化したことを除き、基本的にＰＴアッセイに対して述べたようにして、Ｃｏａｇ−ａ−ｍａｔｅ装置（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を用いて、ヒト血漿において、ａＰＴＴにおける、ＡＲＣ１８３と比較した場合のＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の効果を測定した。アプタマー非存在下で測定された、〜２０秒の凝固時間は、臨床的に正常な範囲内（２０−４０秒）である。

図１０で示されるように、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）に対するａＰＴＴの感度がＰＴと比較して幾分低下し；それにもかかわらず、ａＰＴＴアッセイにおける凝固時間がＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の抗−凝固活性により顕著に長くなった。さらに、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）が、ＡＲＣ１８３よりもＰＴＴアッセイにおいて顕著に強力であることが再び示された。

（実施例３Ｄ）：停滞血液の凝固
ＡＲＣ１８３と比較して、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）が、停滞血液における凝固を防ぐのに十分な時間にわたり抗凝固効果を維持する能力を次のように測定した。

ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）又はＡＲＣ１８３の等モル濃度（５μＭ）をヒト全血中で３７℃にて１．５時間までインキュベートし、凝固カスケードの活性化に対する時間にわたり、試料を監視した。時間点を取ることができるように、重合化フィブリンの分解を促進し、試料の流動性を維持するために、組織プラスミノーゲン活性化因子（５ｋＵ／ｍＬ）を添加した。プロトロンビンタンパク質分解分画１．２のＥＬＩＳＡにより各時間点でアッセイしたトロンビン生成を凝固カスケード活性化のマーカーとして使用した。簡潔に述べると、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ^（Ｒ）ＴＡＴ ｍｉｃｒｏＥＬＩＳＡ（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ；カタログ番号ＯＷＭＧ１５）の予めコーティングしたウェルに試料を直接添加した。続いて、製造者のプロトコールに従い、ＥＬＩＳＡを行った。これらの条件下での抗凝固効力の指標を得るために、実施例３Ｂで既に述べたように、インキュベートの開始時にＡＣＴを測定し、各化合物に対してそれぞれ３８８及び２６６秒の凝固時間が観察された。

図１１で示されるように、停滞血液において３０分間、５μＭのＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）が凝固カスケードの活性化を防いだ。この効果は、ＡＲＣ１８３を上回る顕著な向上を表し、このために、同様の条件下で抗凝固剤効果の持続時間はわずか約１０分であり、ＡＣＴ値の延長を測定した場合のＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の効力の向上とほぼ平行である。

（実施例４）
薬力学及び薬物動態実験
実施例４及び５において、全ての質量ベースの濃度アプタマーデータは、ＰＥＧ共役により与えられる質量に関わらず、アプタマーのオリゴヌクレオチド部分の分子量のみ指す。

（実施例４Ａ）：抗トロンビンアプタマーのラットＩＶボーラス実験
所望のインビトロ特性を有するトロンビン結合アプタマー（上記実施例１及び２に記載の、ＡＲＣ２９４９（配列番号４３４）、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）、ＡＲＣ２３２４（配列番号４３６）、ＡＲＣ２３２７（配列番号４３９）、ＡＲＣ２３３８（配列番号４３８）、ＡＲＣ２３２９（配列番号４４０）、ＡＲＣ２８４０（配列番号４２３）、ＡＲＣ２３２１（配列番号４３５）、ＡＲＣ２３２３（配列番号４３７）、ＡＲＣ２８２８（配列番号４１１））の１０種類をその抗凝固薬力学特性について順位付けし、Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにＩＶボーラスとして投与した後、ＡＲＣ１８３と比較した。凍結乾燥アプタマーを通常の食塩水中に溶解させ、分光光度分析で測定した場合に適切な濃度が得られるまで通常の食塩水で投与溶液の濃度を調整し、得られた溶液を０．２２μｍフィルターに通してろ過滅菌し、滅菌試料バイアルに回収することによりアプタマー投与溶液を前もって調製し、次いで使用まで−２０℃で凍結した。投与中、凍結融解したバイアルを湿った氷の上で維持し、投与に使用しない場合は使用バイアルを４℃で保存した。

ＡＲＣ１８３を除く全てのアプタマーを１．５μｍｏｌｅ／ｋｇ（３００−７００秒の範囲で最大ＡＣＴが得られる用量）で投与した。ＡＲＣ１８３を６．３５μｍｏｌｅ／ｋｇで投与した。大腿静脈及び頸静脈にカニューレを取り付けた意識のある雄ナイーブＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対して、留置した頸静脈カニューレを介してアプタマーを静脈内投与した。予め定めた時間点（投与前；投与後０．８３、１．８３、２．８３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０及び６０分；ベースラインＡＣＴに投与後６０分までに到達しなかった場合は、投与後９０及び１２０分のさらなる時間点も使用した。）で、血液の３００μＬの試料を大腿静脈カニューレから採取した。上記実施例３Ｂに記載のＡＣＴアッセイを用いて、リアルタイムでＡＣＴを測定した。

実験計画及び結果を図１２でまとめる。それぞれ２４、２６又は３２オリゴヌクレオチドからなる、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）の全ての非ＰＥＧ付加型、ＡＲＣ２９４９（配列番号４３４）、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ２３２１（配列番号４３５）、は、顕著により低い用量でＡＲＣ１８３よりも強力であった（ＡＲＣ１８３投与、ｍｇ／ｋｇの３８−４８％及びｍｏｌｅ／ｋｇの２４％）。サイズに基づいてこれらの３種類のアプタマーを比較した場合、最大ＡＣＴにより測定した場合、効力が向上する強い傾向が注目された。１７０秒のＡＣＴに対する時間により示されるような、アプタマー活性の延長とのサイズの上昇の相関も注目された。最大ＡＣＴにより示されるように、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、ＡＲＣ２９４９（配列番号４３４）との比較において、効力が向上した。

ＡＲＣ２８４０（配列番号４２３）、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）のような２６マー（ＡＵリッチな２’−ＯＭｅステムを弱めることで調製）が、新しいアプタマーの中で最も効力が弱いことが分かった。ＡＲＣ２３２１（配列番号４３５）の３０−マー型であるＡＲＣ２８２８（配列番号４１１）（ＡＴリッチな２’−ＯＭｅステムを弱めることで調製）が、ＡＲＣ２３２１（配列番号４３５）と同等であることが分かった。試験した残りのアプタマーは、５’アミンリンカー±２−１０Ｋ ＰＥＧ基の何れかの付加がある、上記の、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ２３２１（配列番号４３５）の修飾型であった。これらの修飾型では、効力がある程度向上したが、薬力学効果の延長も促進された（図１３参照）。

このように、試験したこの１０種類のアプタマーは、サイズの上昇とＰＤ効果の延長（ＡＣＴにより測定した場合）の間の相関があり、効力向上に対する傾向により補われる、様々な薬力学特性を示した。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、ＡＲＣ１８３と比較して、より高い効力を示した。

（実施例４Ｂ）：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける静脈内ボーラス投与
図１４で示される実験計画で述べられるような留置頸静脈カニューレを介してＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３を静脈内（ＩＶ）投与した。ＩＶボーラス注射に加えて、これらの化合物の腎排出を調べるために研究の一部として、これらのラットに対して擬似腎結紮を行った；擬似手術の説明及び腎結紮の効果に関するＰＫ／ＰＤの結果は下記実施例４Ｃで述べる。注入後２時間まで定められた時間点でＡＣＴ測定のために、留置した大腿静脈カテーテルを介して血液を回収した。実施例３Ｂで既に述べたようにＡＣＴ（＋）キュベットを使用して、Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ^（Ｒ）Ｊｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ＋装置を用いてＡＣＴ値を測定した。

ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の投与のＡＣＴにおける効果を図１５で示し、関連するパラメータを図１６でまとめる。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）のＩＶボーラスによる投与により、４１８の平均最大ＡＣＴ値となった。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の２．５倍ｍｇ／ｋｇ（４．２倍ｍｏｌｅ／ｋｇ）用量でのＡＲＣ１８３の投与の結果、平均最大ＡＣＴは３２８秒と、より低かった。ＡＲＣ１８３の排出速度は速く、２００又は１７０秒ＡＣＴに対する平均時間はそれぞれ、２．７及び４．１分であった。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、それぞれ９．５及び１２．２分という、２００又は１７０秒のＡＣＴに対する平均時間を示した。結論として、擬似手術ラットでのボーラスＩＶ投与後、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）はＡＲＣ１８３よりも強力であることが分かった。

（実施例４Ｃ）：腎結紮及び擬似手術Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＡＲＣ２１７２及びＡＲＣ１８３
この実験の目的は、腎排出及び、腎結紮及び擬似手術の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットでのＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の薬力学活性におけるその影響を測定し、比較することである。完全な腎結紮手術又は擬似手術の何れかを行った雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにＡＲＣ１８３及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）をＩＶボーラスにより投与した。この実験計画を図１７で示す。

ＡＣＴ測定及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）又はＡＲＣ１８３の濃度分析のために、投与前及び指定した時間点で血液を採取した。実施例３Ｂに記載のようにＡＣＴを測定した。それぞれ０．０５μｇ／ｍＬ及び０．１６μｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）で、ＨＰＬＣアッセイによりＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の血漿濃度を調べた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＴＭ、バージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて、それぞれ、非コンパートメント及びＥｍａｘモデル（Ｅ＝Ｅ０＋（Ｅｍａｘ−Ｅ０）^＊（Ｃ_γ／（Ｃ_γ＋ＥＣ５０_γ））により、個々の血漿濃度−時間プロファイルを用いてＰＫ及びＰＫ／ＰＤ分析を行った。腎結紮及び擬似手術ラットの、Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ_ｌａｓｔ及びＭＲＴ_ｌａｓｔに対して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ、α＝０．０５）統計解析を使用した。

腎結紮及び擬似手術群での、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３に対する薬力学プロファイル（ＡＣＴ）を図１８及び図１９でそれぞれ示す。擬似手術及び腎結紮ラットでのＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）により得られた平均最大ＡＣＴは、それぞれ４２２秒及び４１９秒であり、一方、ＡＲＣ１８３に対して、平均最大ＡＣＴはそれぞれ、３２５秒及び３６３秒であった。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の平均ＡＣＴは、その最大値から１７０秒に１５分以内に下落し、一方、ＡＲＣ１８３の場合、その平均ＡＣＴは、５から１０分以内に１７０秒に低下した。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の全体的ＰＤプロファイルは、擬似手術ラットと比較した場合、ラットにおける腎結紮により有意に影響を受けなかった（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用。）。しかし、初期の時間点（ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３に対してそれぞれ、ｔ＝５−２０及びｔ＝０．８３−５分）では、擬似手術ラットと比較した場合、ラットにおける腎結紮の影響は小さいが統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用。）。

腎結紮及び擬似手術ラットの両方でのＩＶ投与後、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の両方に対する血漿濃度−時間プロファイルは二相性であった。両化合物に対して腎結紮群では、擬似手術群と比較した場合、殆どの試料採取時間において、血漿濃度の上昇が見られた。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３のＣ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{０−ｌａｓｔ}の上昇は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であることが分かった。

まとめると、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の全体的ＰＤプロファイルは、擬似手術ラットと比較した場合、ラットにおける腎結紮により有意な影響を受けなかった（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用）。しかし、初期の時間点（ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３に対してそれぞれ、ｔ＝５−２０及びｔ＝０．８３−５分）では、擬似手術ラットと比較した場合、ラットにおける腎結紮の影響は小さいが統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用。）。擬似手術ラットと比較した場合、腎結紮ラットでの単回ＩＶボーラス後、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の両方の全体的曝露において小さいが統計的に有意な影響があった。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）に対して、腎結紮ラットにおける平均Ｃ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{０−ｌａｓｔ}値は、擬似手術ラットよりも〜１．５倍及び２倍大きかった。ＡＲＣ１８３の場合、腎結紮ラットにおける平均Ｃ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{０−ｌａｓｔ}値は、擬似手術ラットよりも〜２．４倍及び２．９倍大きかった。統計解析から、ＡＲＣ１８３及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の両方に対して、擬似手術ラットと比較した場合、腎結紮ラットのＭＲＴ_{０−ｌａｓｔ}に対して有意差は示されなかった。このデータから、腎機能障害の最も重症な型の腎結紮ラットモデルにおいて、ＡＲＣ２１７２の薬力学的影響が少ないことが分かる。何らかの理論により束縛されることを望まないが、ＡＲＣ２１７２がその薬力学的可逆性で変化が小さく（平均ＡＣＴ値に戻る時間は２００秒）、重症の腎機能障害を表すこのラットモデル（両側結紮）での薬物動態の変化が中程度であるので、腎排出は、ＡＲＣ２１７２に対するクリアランスの主な機構ではないと思われる。さらに、総合すれば、何らかの理論により束縛されることを望まないが、これらのデータから、腎機能障害のある患者においてＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）に対して用量調整の必要がないことが示唆される。

（実施例４Ｄ）：（実施例４Ｆ）：抗トロンビンアプタマーを順位付けするためのサルＩＶボーラス実験
実施例４Ａに記載のラット実験で比較したトロンビン結合アプタマーの４種類（ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）、ＡＲＣ２９４９（配列番号４３４）、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）及びＡＲＣ２８４０（配列番号４２３））をサルでのＩＶボーラス実験で評価した。（ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）は、５’アミンのない３０オリゴヌクレオチドＡＲＣ２３２１（配列番号４３５）バージョンである。凍結乾燥アプタマー又はペプチドを通常の食塩水中に溶解させ、分光光度分析で測定した場合に適切な濃度が得られるまで通常の食塩水で投与溶液の濃度を調整し、得られた溶液を０．２２μｍフィルターに通してろ過滅菌して滅菌試料バイアルに回収することにより、アプタマー投与溶液を調製し、次いで使用まで−２０℃で凍結した。投与中、凍結融解したバイアルを湿った氷の上で維持し、投与に使用しない場合は使用バイアルを４℃で保存した。

カニクイザルでの次のＩＶボーラス実験において、０．４６μｍｏｌｅ／ｋｇで全アプタマーを投与した。麻酔したカニクイザルの橈側皮静脈にＩＶカテーテルを留置し、ボーラスを介してアプタマーを投与するために使用した。流動性を維持しカテーテルを開通させるために約５−１０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度でこの橈側皮静脈カテーテルを介して乳酸加リンガー溶液を与えた。ボーラス注射後１時間の間、定められた時間点で既に述べたようにして血管アクセスポートから血液を採取した（総体積＝〜３ｍＬ）。全アプタマーに対して、時間点は、投与前及び投与後０．８３、１．８３、２．８３、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０分であり；ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）の場合は、投与後さらに９０及び１２０分の時間点も使用した。実施例３Ｂで既に述べたようにＡＣＴ＋（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）カートリッジを用いてＨｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ＋装置（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）によりリアルタイムで活性化ＡＣＴを測定した。

図２０及び図２１でこの結果をまとめる。サルにおいてｍｏｌｅ／ｋｇ用量（ラットで使用したものの３１％であった。）を用いて得られた最大ＡＣＴから分かるように、全てのアプタマーが、ラットでのＩＶボーラスモデルにおいてそれらを用いて得られた結果（実施例４Ａ）と比較して、サルでは効力が上昇していた。ＡＵリッチな２’−ＯＭｅステムを有する２６−マーであるＡＲＣ２８４０（配列番号４２３）は、最大ＡＣＴがわずか２２３．３秒であり、１７０秒ＡＣＴに対する時間が２．２分であり、効力が最低であった。ＡＲＣ２９４９（配列番号４３４）では、最大ＡＣＴが４０２．７秒、１７０秒のＡＣＴに対する時間が１４．９分となった。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）は、最大ＡＣＴ（それぞれ５２６．８及び５４１．７秒）が非常に近かったが、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）の場合の１７０秒のＡＣＴに対する時間は、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の場合のほぼ２倍であった（２４．９分に対して５４．６分）。

（実施例４Ｅ）：カニクイザルにおける、ＡＲＣ２１７２及びＡＲＣ１８３の静脈内ボーラス＋点滴投与
カニクイザルにおいて、次の単回ＩＶボーラス＋連続１時間ＩＶ点滴実験において、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３を評価した。図２２での実験計画により示されるように、ＩＶボーラスを行い、その直後に１時間の連続点滴を開始して、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）又はＡＲＣ１８３をカニクイザルに投与した。

上述のように血管アクセスポートから血液を採取し、実施例３Ｂで既に述べたようにＡＣＴ＋（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）カートリッジを用いてＨｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ＋装置（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）によりＡＣＴ値を測定した。

ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）又はＡＲＣ１８３のＩＶボーラス＋１時間点滴投与後のＡＣＴにより測定した場合の効果を図２３で示し、関連パラメータについて図２４でまとめる。５μＭの血漿濃度を目標とする、ＩＶボーラス＋１時間点滴によるＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の投与により、平均最大ＡＣＴが３９７秒となり、２００又は１７０秒のＡＣＴに対する平均時間は、それぞれ２２．２及び２６．５分となった。７．５μＭの目標血漿濃度に到達させるために、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の用量を増加させることにより、平均の最大ＡＣＴが４１４秒に延び、一方、２００又は１７０秒のＡＣＴに対する平均時間が、それぞれ１３．９及び１８．０分となった（この２種類のＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）投与計画の間のこれらの後の時間の相違は実験誤差内である。）。１５μＭの血漿濃度にするためにＩＶボーラス＋１時間点滴として投与した場合、ＡＲＣ１８３は、結果として平均最大ＡＣＴが３４３秒となり、２００又は１７０秒のＡＣＴに対する平均時間がそれぞれ４．９及び７．３分となった。このように、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の低用量計画で観察される結果とＡＲＣ１８３を用いた結果との比較において（この場合、投与される総用量は、ＡＲＣ１８３を用いて投与されるｍｇ／ｋｇ用量の７％であった。）、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を用いた治療により、点滴中、約４００秒の安定したＡＣＴを得ることができた。排出速度は、ＡＲＣ１８３と比較して、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）では約４倍遅かった。

（実施例４Ｆ）：薬力学的薬物相互作用
血小板凝集におけるＡＲＣ２１７２の影響
フィブリン生成だけではなく、血小板を活性化することにより、トロンビンはさらに、血栓形成を刺激する。インビトロで、トロンビン、コラーゲン及びＡＤＰを含む様々なアゴニストにより血小板が活性化される。活性化されると、血小板は形態、受容体発現及び因子放出において顕著に変化する。これらの変化は、ある一定の条件下で、血小板の凝集を誘導し、この凝集は、その他の細胞の存在に依存しない。全血の低速遠心により、多血小板血漿（ＰＲＰ）が得られる。ＰＲＰに血小板アゴニストを添加することにより、血小板活性化及び凝集を誘導することができる。血小板凝集及び溶液の脱落につれて通常は混濁したＰＲＰが透明になる際の光吸収の程度により、ＰＲＰでの血小板凝集を監視することができる。この実験の目的は、ヒトＰＲＰでの血小板凝集におけるＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の効果を評価することであった。

様々な濃度でのＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の存在下及び非存在下で、α−トロンビン（０．２５ユニット／ｍＬ）又はＡＤＰ（１０μＭ）とＰＲＰを混合した。光学的血小板凝集計を用いて血小板凝集を評価した。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、トロンビンにより誘導される血小板凝集（すなわち、受容体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性化）を阻害したが、ＡＤＰによる凝集は阻害しなかった（図２５）。これらのデータから、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）が、高親和性でトロンビンに結合するトロンビンアンタゴニストであることが示される。

アスピリン及びインテグリンの活性におけるＡＲＣ２１７２のインビトロでの効果
インビトロにおいて、トロンビン、コラーゲン及びＡＤＰを含む様々なアゴニストにより血小板が活性化されるか、又はアスピリンもしくは血小板ＩＩｂ／ＩＩａ阻害剤などのアンタゴニストにより阻害される。この研究の目的は、ヒトＰＲＰでの血小板凝集における、アスピリン又はジスルフィド結合ヘプタペプチドＧＰＩＩｂ／ＩＩａ阻害剤、インテグリンの活性に対するＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の効果を評価することであった。

アスピリン（６ｍｇ／Ｌ）の存在下及び非存在下で、及び様々な濃度のＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の存在下及び非存在下で、インテグリン（１μＭ）とともに、ＰＲＰを室温にて２０分間、プレインキュベートした。血小板混合物を予め３７℃へと３分間加熱し、その後、光学的血小板凝集計を用いて、ＡＤＰ（３μＭ）による血小板凝集を評価した。ヒトＰＲＰにおいてアスピリンによりＡＤＰ−誘発性血小板凝集が低下したが、一方で、アスピリン添加及び非添加で、ヒトＰＲＰにおけるＡＤＰ−誘発性血小板凝集がインテグリンにより完全にブロックされた。ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、アスピリン又はインテグリンの何れの活性も、低下させるか又は阻害しなかった（図２６）。

（実施例５）
機能的動物実験
（実施例５Ａ）：開放式非へパリン結合バイパス回路におけるＡＲＣ２１７２
開放式非へパリン結合バイパス回路を用いて、ブタ心肺バイパスモデルにおいてＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を評価した。バイパスの開始前に４００秒の目標ＡＣＴを達成するために、ボーラス又はボーラス＋点滴により、食塩水（ｎ＝２）、ヘパリン（ｎ＝５）及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）（ｎ＝５、動物３８及び３９は統計解析に含めなかった。）で動物を処置した。動物の第３群（ｎ＝２）には、抗凝固剤処置を行わず、心停止及び大動脈遮断を行わなかった。この実験計画を図２７で示す。

２０２ｍｍｏｌ／ｇのローディングで、Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ２００において、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を合成した。標準合成サイクルでは、アミダイト１．８当量及び酸化剤３当量を使用した。アセトニトリル中の２０％ジメチルアミンを用いて合成後塩基洗浄を行い、アンモニアを用いて一晩脱保護した後、分取ＳＡＸ−ＨＰＬＣを行った。その後アプタマーを凍結乾燥し、次いで２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で滅菌食塩水中で再懸濁した。この実験において、ブタ膵臓から調製されたヘパリンナトリウムを使用した。

ブタバイパスモデル
図２７で示されるように、雄及び雌ブタを無作為に様々な処置群に分けた。動物３８及び３９は統計解析に含めなかった。

手術前に、アトロピンＳＯ_４／テラゾール^（Ｒ）／キシラジン（それぞれ、筋肉内（ＩＭ）で０．０４ｍｇ／ｋｇ／４から６ｍｇ／ｋｇ／２ｍｇ／ｋｇ）で動物に予め麻酔をかけた。次に、動物に挿管し、体積制御された人工呼吸装置を通じて送達するために、イソフラン吸入麻酔を維持した。

麻酔開始後、血圧を監視し、血液試料を採取するために、それぞれ大腿動脈及び静脈にカニューレを挿入た。食塩水をゆっくりと滴下するか、又はＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の点滴を介して、の何れかで、大腿静脈カニューレの開通性を維持した。

胸骨の全長にわたり、皮膚の切開を行った。次に胸骨を切開し、胸腔を開いた。Ｂｏｖｉ電気焼灼器プローブを用いて止血した。心膜を開き、心臓に到達できるようにした。周囲組織から大動脈を切り離し、５．０ポリエステル糸を用いて心臓から４ｃｍ離れた上行大動脈において巾着縫合を行った。同様に、５．０ポリエステル糸を用いて右心耳において巾着縫合を行った。縫合後、ヘパリン又はＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の何れかで動物を処置した。ＡＣＴ Ｐｌｕｓシステム（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）により測定した場合にＡＣＴが４００以上になり、実施例３ｂで述べたようにＡＣＴ＋テストキュベット（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）を用いてＨｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｕｎｉｏｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ＋マイクロ凝固装置（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）において約１０００となるように、ヘパリン（４０，０００から６０，０００ユニット）を複数回のＩＶボーラスとして投与した。ヘパリン用量を調整し、ＡＣＴが適切な範囲となるのに、通常、１０から２０分要した。実施例３ｂに記載のようにＡＣＴ＋テストキュベット（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）を用いてＨｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｕｎｉｏｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ＋マイクロ凝固装置（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）において約４００秒のＡＣＴとなるように、ボーラス＋連続静脈内点滴により（０．１３９）、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を投与した（図２７参照）。薬物を投与し、ＡＣＴが適切な範囲となるのに、通常、１０から２０分要した。

抗凝固剤の適切な用量の投与後、動脈及び静脈カニューレを留置した。連結前に泡を排除するために、大動脈カニューレ及び動脈ラインの両方が食塩水で満たされるように注意して、人工心肺装置の、予め使用できる状態にしておいた動脈ラインに大動脈カニューレを迅速に取り付けた。動脈ラインをすぐに締め付けた。同様の技術を用いて、右心耳において静脈カニューレ（２９／３７ ２段階静脈カニューレ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を留置し、締め、次いで、人工心肺装置の静脈ラインにこのカニューレを装着した。全体のバイパス回路は、非ヘパリン結合コンポーネント（アフィニティーＣＶＲ心臓切開術／静脈リザーバー及び血漿耐性繊維の膜型人工肺、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で構成されていた。続いて、動物を３時間心肺バイパスに置いた。人工心肺装置の動脈及び静脈ラインには、血栓塞栓の存在について監視するために動物と装置との間の通路にドップラー超音波プローブを装着した。この手順の間、直接血圧を監視し、ａ）バイパス血流速度を調整することにより、ｂ）静脈内輸液の投与により、及びｃ）静脈内注入を介した、ネオシネフィリン、ドーパミン、エピネフィリン及びカルシウムを含む様々な薬物の投与により、バイパス中、血圧を維持した。イソフルラン吸入器の流速を調整し、場合によっては必要に応じてＩＶペントバルビタールボーラスを投与することにより、麻酔の手術水準に動物を維持した。

３時間のバイパス完了後、動物からバイパスを取り去り、血圧が安定したらカニューレを除去し、次いで、プロタミンで処置するか（ヘパリン処置群）又はアプタマー点滴を停止するか（ＡＲＣ２１７２処置群）の何れかにより、抗凝固剤活性を停止させた。薬物点滴の停止後さらに１時間、動物を維持した。Ｉ．Ｖ．ネオシネフリン及び／又はＩ．Ｖ．輸液投与の組み合わせを用いて、バイパス後、血圧を維持した。ＣＰＢ実験プロトコールの概略を図２８で示す。

肉眼で見える血栓又はフィブリン蓄積の所見に対する、ＡＣＴアッセイ及び心肺バイパス回路の試験：
予定した試料回収の時間点で、新鮮な全血の試料を得て、実施例３Ｂで述べたように、ＡＣＴ＋テストキュベット（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）を用いたＨｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｕｎｉｏｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ＋マイクロ凝固装置（ＩＴＣ Ｍｅｄ、Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪ）及びＡＣＴ Ｐｌｕｓシステム（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の両方を使用して、すぐに測定した。各実験終了後、心肺バイパス回路に食塩水をフラッシュし、肉眼で見える血栓形成の所見について、リザーバー、膜型人工肺及び動脈フィルターを調べ、写真撮影した。

対照動物ＡＣＴ値は、この手法中、比較的一定のままであったが、バイパス後、上昇した（図２９）。バイパス開始１５分以内にバイパス回路において、大きな肉眼で見える血栓が見られ、バイパス３時間後、バイパス回路を介した流れがほぼ停止する程に大きくなった。

ヘパリン投与後、この処置群の動物のＡＣＴ値は非常に高くなり、通常、上限を超えていた（１０００秒以上）（図３０参照）。この上昇レベルにＡＣＴを維持するために、動物に繰り返しボーラス投与を行った。この実験終了時にプロタミンを投与することにより、ＡＣＴ値がベースラインに戻った。バイパス回路において、肉眼で見える血栓はなかった。

ボーラス＋点滴によりＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）で処置した動物において、バイパス中、ＡＣＴは比較的狭い範囲内に維持され、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）投与を停止してから２０分以内にＡＣＴがベースラインに戻った（図３１）。バイパス回路において、肉眼で見える血栓は見られなかった。使用した各抗凝固剤との、バイパス中のＡＣＴ値の比較を図３２で示す。

全血ＡＣＴとＴ／ＡＴＩＩＩ複合体形成との間の相関：
バイパス中、凝固カスケード活性化の間接的測定としてトロンビン／抗トロンビンＩＩＩ（ＴＡＴ）複合体の存在を監視するために、クエン酸血漿の試料を回収した。簡潔に述べると、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ^（Ｒ）ＴＡＴマイクロＥＬＩＳＡ（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ；カタログ番号ＯＷＭＧ１５）の予め被覆したウェルに、希釈していない血漿試料を直接添加した。続いて、製造者のプロトコールに従い、ＥＬＩＳＡを行った。洗浄段階は全て、自動プレート洗浄装置（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、Ｖｅｒｍｏｎｔ；カタログ番号ＥＬｘ４０５Ｍａｇｎａ ＭＶＲ）を用いて行った。Ｖｅｒｓａｍａｘ Ｔｕｎａｂｌｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、吸収値を検出した。全ての動物において、ベースラインにおいて１０ｎｇ／ｍＬ未満で、血漿ＴＡＴ複合体の濃度を測定した。抗凝固剤で処置しなかった対照動物において、バイパスに置いてから数分以内に、血漿中でＴＡＴ複合体が蓄積し始め、バイパス停止直前に、１５０±８７ｎｇ／ｍＬの最大値になった。血漿ＴＡＴ複合体の濃度は、バイパス後観察期間中、これらの動物において低下したが、ベースラインには戻らなかった（図３３参照）。一方、ヘパリン処置群では、比較的低い血漿ＴＡＴ複合体濃度（＜５０ｎｇ／ｍＬ）により示されるように、バイパス中に凝固カスケードの活性化が抑制された（図３４参照）。ヘパリンは、トロンビンの活性を阻害することに加え、内在の凝固カスケードにおいて上位の複数の凝固因子の活性を阻害した。

ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、バイパス回路中の肉眼で見える血栓の形成を防いだが、バイパス開始後の血漿ＴＡＴ複合体濃度の急速な上昇により示されるように、凝固カスケードの活性化を阻害しなかった（図３５参照）。しかし、ＴＡＴ複合体濃度は、対照動物で見られるほど高くはなかった。何らかの理論に縛られることを望まないが、この結果から、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、トロンビンを低下させるだけであり、内在の凝固カスケードにおいて上位のその他の活性化された凝固因子の活性を低下させないものと予想される。

要約すると、開放式非へパリン結合バイパス回路を用いて、ブタ心肺バイパスモデルにおいてＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を評価した。バイパス開始前に目標ＡＣＴが４００秒（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｎ Ｊｒ．装置により測定した場合）となるように、ボーラス又はボーラス＋点滴により、食塩水（ｎ＝２）、ヘパリン（ｎ＝５）及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）（ｎ＝５）で動物を処置した。これらの各群に対するバイパス中の平均ＡＣＴ値は、１２３±３９秒（対照）、９５０±１５８秒（ヘパリン）及び４３３±６１秒（ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４））であった。ヘパリン及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）は、バイパス中の肉眼で見える血栓形成を減少させた。さらに、バイパス中に、ヘパリンのみがＴＡＴ複合体の蓄積を阻害した。何らかの理論に縛られることを望まないが、これにより、他の処置が内在の凝固カスケードの活性化を阻害しなかったことが示されると考えられる。

書面による明細書及び実施例によりここで本発明を説明してきたが、当業者は、様々な実施形態において本発明を実施することができること及び上記の明細書及び実施例が説明を目的とするものであり、次の特許請求の範囲を限定するものでないことを認識するであろう。

図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロアプタマー選択（ＳＥＬＥＸ^ＴＭ）プロセスの略図である。 図２は、４０ｋＤａ分枝ＰＥＧの説明図である。 図３は、アプタマーの５’末端に結合している４０ｋＤａ分枝ＰＥＧの説明図である。 図４は、標準的な一ＰＥＧ付加、多重ＰＥＧ付加及びＰＥＧ付加を介した二量体形成を表す、様々なＰＥＧ付加ストラテジーを示す説明図である。 図５は、トロンビンアプタマーＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）、ＡＲＣ２１７１（配列番号２９３）及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）に対する、予想される二次構造を示す。 図６は、ニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて測定した場合の、ヒトトロンビンへのＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の結合曲線を示すグラフである。 図７は、ニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて測定した場合の、ヒト、ブタ及びラットトロンビンへのＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の結合曲線を示すグラフである。 図８は、ヒトクエン酸血漿を用いてインビトロでアッセイした場合の、プロトロンビン時間（ＰＴ）の効果における、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の効果の比較を示すグラフである。 図９は、ヒト全血を用いてインビトロでアッセイした場合の、活性凝固時間（ＡＣＴ）におけるＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の効果の比較を示すグラフである。 図１０は、ヒト血漿を用いてインビトロでアッセイした場合の、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）におけるＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の効果の比較を示すグラフである。 図１１は、ヒト全血を用いてアッセイした場合の、停滞血液の凝固におけるＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８３の効果の比較を示すグラフである。 図１２は、実施例４Ａに記載の抗トロンビンアプタマーのラットＩＶボーラス実験に対する実験研究計画を示す表である。 図１３は、１．５μｍｏｌｅ／ｋｇのＩＶボーラス注射を介してアプタマーを投与されたラットでの活性凝固時間（ＡＣＴ）に対する、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）に結合した様々なサイズのＰＥＧ基の効果の比較を示すグラフである。 図１４は、実施例４Ｂに記載の抗トロンビンアプタマーのラットＩＶボーラス実験に対する実験研究計画を示す表である。 図１５は、１２．２ｍｇ／ｋｇ（ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４））又は３０ｍｇ／ｋｇ（ＡＲＣ１８３）のＩＶボーラス注射を介してアプタマーを投与されたラットでの、活性凝固時間（ＡＣＴ）に対する、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８６の効果の比較を示すグラフである。 図１６は、１２．２ｍｇ／ｋｇ（ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４））又は３０ｍｇ／ｋｇ（ＡＲＣ１８３）のＩＶボーラス注射を介してアプタマーを投与されたラットでの、活性凝固時間（ＡＣＴ）に対する、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びＡＲＣ１８６の効果をまとめた表である。 図１７は、実施例４Ｃに記載の、ラット腎臓結紮モデルにおける抗トロンビンアプタマーの実験研究計画を示す表である。 図１８は、１２．２ｍｇ／ｋｇ（ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４））でのＩＶボーラス注射を介して投与した場合の、両側腎臓結紮及び擬似手術ラットにおける、活性凝固時間（ＡＣＴ）に対する、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の効果の比較を示すグラフである。 図１９は、３０ｍｇ／ｋｇ（ＡＲＣ１８３）のＩＶボーラス注射を介してを投与した場合の、両側腎臓結紮及び擬似手術ラットにおける、活性凝固時間（ＡＣＴ）に対するＡＲＣ１８３の効果の比較を示すグラフである。 図２０は、０．４６μｍｏｌｅ／ｋｇのＩＶボーラス注射を介してアプタマーを投与されたカニクイザルでの、活性凝固時間（ＡＣＴ）に対する、抗トロンビンアプタマーＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）、ＡＲＣ２９４９（配列番号４３４）、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）及びＡＲＣ２８４０（配列番号４２３）の効果をまとめた表である。 図２１は、０．４６μｍｏｌｅ／ｋｇのＩＶボーラス注射を介してアプタマーを投与されたカニクイザルでの、活性凝固時間（ＡＣＴ）に対する、抗トロンビンアプタマーＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）、ＡＲＣ２９４９（配列番号４３４）、ＡＲＣ２１６９（配列番号２８３）及びＡＲＣ２８４０（配列番号４２３）の効果の比較を示すグラフである。 図２２は、実施例４Ｅに記載の、抗トロンビンアプタマーの、サルＩＶボーラス＋点滴実験に対する実験計画を示す表である。 図２３は、単回ＩＶボーラスを介して投与し、次いで連続１時間点滴した場合の、カニクイザルでの、活性凝固時間（ＡＣＴ）に対する、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）（２種類の用量）及びＡＲＣ１８３の効果の比較を示すグラフである。 図２４は、単回ＩＶボーラスを介して投与し、次いで連続１時間点滴した場合の、カニクイザルでの、活性凝固時間（ＡＣＴ）に対する、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）（２種類の用量）及びＡＲＣ１８３の効果をまとめた表である。 図２５は、トロンビン誘発性血小板凝集及びＡＤＰ−誘発性血小板凝集における、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）３の効果を比較するグラフである。 図２６は、血小板凝集のアスピリン及びインテグリリン−依存性阻害における、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の効果を比較するグラフである。 図２７は、実施例５Ａに記載の、ブタ心肺バイパスモデルにおける、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）及びヘパリンの実験の実験計画を示す表である。 図２８は、ブタ心肺バイパス実験プロトコールの概略である。 図２９は、実施例５Ａに記載の、開放式非−ヘパリン結合ブタ心肺バイパス実験で使用した対照動物（抗凝固剤処置なし）における活性凝固時間（ＡＣＴ）を示すグラフである。 図３０は、実施例５Ａに記載の開放式非−ヘパリン結合心肺バイパス実験においてＡＣＴ＞４００秒を維持するようにＩＶボーラス注射を介してヘパリンを投与したブタにおける活性凝固時間（ＡＣＴ）を示すグラフである。 図３１は、実施例５Ａに記載の開放式非−ヘパリン結合心肺バイパス実験においてＡＣＴ＞４００秒を維持するようにＩＶボーラス＋点滴を介してＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を投与したブタにおける活性凝固時間（ＡＣＴ）を示すグラフである。 図３２は、実施例５Ａに記載の開放式非−ヘパリン結合バイパス回路を用いた心肺バイパスモデルでの、活性凝固時間（ＡＣＴ）（縦軸で秒でプロット）における、ヘパリン及びＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）の効果の比較を示すグラフである。 図３３は、実施例５Ａに記載の開放式非−ヘパリン結合ブタ心肺バイパス実験を用いた対照動物（抗凝固剤処置なし）での、血漿ＴＡＴ複合体の濃度を示すグラフである。 図３４は、実施例５Ａに記載の開放式非−ヘパリン結合心肺バイパス実験においてＡＣＴ＞４００秒を維持するようにＩＶボーラス注射を介してヘパリンを投与したブタでの、血漿ＴＡＴ複合体の濃度を示すグラフである。 図３５は、実施例５Ａに記載の開放式非−ヘパリン結合心肺バイパス実験においてＡＣＴ＞４００秒を維持するようにＩＶボーラス＋点滴を介してＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）を投与したブタでの、血漿ＴＡＴ複合体の濃度を示すグラフである。

Claims (39)

1. トロンビン標的に結合するアプタマー（該アプタマーは、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害し、該アプタマーは、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）であるか又はＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）と同じ、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する能力を実質的に有するアプタマーであり、該アプタマーは、１ｎＭ未満のＫ_Ｄでヒトトロンビンに結合し、該アプタマーは、５５ヌクレオチド以下の長さである。）。
2. トロンビン標的に結合するアプタマー（該アプタマーは、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害し、該アプタマーは、ＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）であるか又はＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）と同じ、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する能力を実質的に有するアプタマーであり、該アプタマーは、そのチミジン又はウリジン残基の大部分において５−ブロモデオキシウリジン修飾を含有しない。）。
3. トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害するアプタマーの能力が、活性凝固時間又はプロトロンビン時間を低下させるか又は阻害するアプタマーの能力を測定することにより評価される、請求項１から請求項２の何れか一項に記載のアプタマー。
4. インビボでトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する、請求項３に記載のアプタマー。
5. ヒト対象においてトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する、請求項４に記載のアプタマー。
6. 配列番号９−４１、４３−１９１、１９３−２０４、２０８−３０４、３０７−３２９、３３１−３３２、３３４、３３６−３３７、３４０−３９２、３９６−３９７、４００及び４０２−４４０からなる群から選択される、トロンビンに結合するアプタマー。
7. 次の核酸配列：
   

   

   を含有する、トロンビンに結合するアプタマー。
8. 

   からなる群から選択される核酸配列を含有する、請求項１から請求項７の何れか一項に記載のアプタマー。
9. 次の核酸配列：
   

   

   を含有するアプタマー（配列中、Ｎ_１、Ｎ_２又はＮ_３は、それぞれＮ’_１、Ｎ’_２又はＮ’_３と塩基対を形成する何れかのヌクレオチドであり、Ｎ_１、Ｎ_２及びＮ_３は、それぞれ、同じヌクレオチド又は異なるヌクレオチドであり得、該アプタマーは、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する。）。
10. Ｎ_１、Ｎ_２又はＮ_３が、デオキシヌクレオチドである、請求項９に記載のアプタマー。
11. Ｎ_１、Ｎ_２又はＮ_３の少なくとも２個が、２’ＯＭｅ修飾を含有する、請求項９に記載のアプタマー。
12. 配列：
    

    

    をさらに含有する、請求項９、１０又は１１の何れか一項に記載のアプタマー（配列中、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４、Ｎ_５又はＮ_６は、それぞれＮ’_１、Ｎ’_２、Ｎ’_３、Ｎ’_４、Ｎ’_５又はＮ’_６と塩基対を形成する何れかのヌクレオチドであり、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_４、Ｎ_５又はＮ_６は、それぞれ、同じヌクレオチド又は異なるヌクレオチドであり得、該アプタマーは、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する。）。
13. Ｎがグアノシン又はシチジンヌクレオチド残基である、請求項９、１０、１１又は１２に記載のアプタマー。
14. １ｎＭ未満のＫ_Ｄでトロンビンに結合する、請求項７から請求項１３の何れか一項に記載のアプタマー。
15. 少なくとも実質的にＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）と同じ、トロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する能力を有する、請求項７から請求項１４の何れか一項に記載のアプタマー。
16. トロンビン標的がヒトトロンビンである、請求項１から請求項１５の何れか一項に記載のアプタマー。
17. デオキシリボ核酸である、請求項１から請求項１６の何れか一項に記載のアプタマー。
18. １本鎖デオキシリボ核酸である、請求項１から請求項１７の何れか一項に記載のアプタマー。
19. 少なくとも１個の化学修飾を含有する、請求項１から請求項１８の何れか一項に記載のアプタマー。
20. 修飾が、核酸の、糖の位置での化学的置換、リン酸の位置での化学的置換及び塩基の位置での化学的置換からなる群から選択される、請求項１９に記載のアプタマー。
21. 修飾が、修飾されたヌクレオチドの組み込み、３’キャッピング及び高分子量の非免疫原性化合物への共役、親油性化合物への共役からなる群から選択される、請求項１９又は請求項２０に記載のアプタマー。
22. 修飾が、非免疫原性の高分子量化合物への共役であり、該化合物がポリアルキレングリコールである、請求項１９に記載のアプタマー。
23. ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項２２に記載のアプタマー。
24. インビトロでトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害する、請求項１から請求項３及び請求項５から請求項２３の何れか一項に記載のアプタマー。
25. 対象においてトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害するのに有効な量で、対象又は体外循環路に、請求項１から請求項２４の何れか一項に記載のアプタマーを投与することを含む、方法。
26. 対象がヒトである、請求項２５に記載の方法。
27. 対象においてトロンビン介在性凝固を低下させるか又は阻害するのに有効な量の請求項１から請求項２６の何れか一項に記載のアプタマー又はそれらの塩と、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と、を含有する組成物。
28. 必要とする対象に、請求項２７に記載の組成物を投与することを含む、方法。
29. 対象がヒトである、請求項２８に記載の方法。
30. ヒト対象が腎機能障害を有し、この方法での使用のためのアプタマーがＰＥＧに共役されていない、請求項２５、２６、２８又は２９に記載の方法。
31. ヒト対象がヘパリン誘発性血小板減少症に罹患している、請求項２５、２６、２８、２９又は３０に記載の方法。
32. ヒト対象がヘパリン抵抗性である、請求項２５、２６、２８、２９、３０又は３１に記載の方法。
33. 対象が、肝機能障害を有する、請求項２５、２６、２８、２９、３０、３１又は３２に記載の方法。
34. 対象における外科的処置の、前、最中、後又はこれらの何らかの組み合わせで、アプタマーが対象に投与される、請求項２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２又は３３に記載の方法。
35. 外科的処置が、心肺バイパス手術、冠動脈バイパス移植手術、経皮冠動脈インターベンション、血管形成、心臓血管及び末梢血管開放系及び血管内手術、ステント置換手術、心臓弁置換手術、冠状動脈性心臓病及び／又は静脈又は動脈における血管疾患を処置するための手術及び末梢動脈閉塞疾患を処置するための手術からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
36. アプタマーがＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）である、請求項２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５の何れか一項に記載の方法。
37. アプタマーがＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）であり、外科的処置が冠動脈バイパス移植手術である、請求項３５に記載の方法。
38. アプタマーがＡＲＣ２１７２（配列番号２９４）であり、外科的処置が経皮冠動脈インターベンションである、請求項３５に記載の方法。
39. 外科的処置が心肺バイパス手術であり、手術中に開放式及び非ヘパリン結合回路が使用される、請求項３５に記載の方法。

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